Tumorcel exosoombiogenese en het actine cytoskelet ......Academiejaar 2015 – 2016 Tumorcel...

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2015 – 2016

Tumorcel exosoombiogenese en het actine cytoskelet:

verkenning van de interconnectie gebruikmakend van

cortactine nanobodies

Delphine Devriese

Promotor: Prof. dr. Jan Gettemans

Prof. dr. Els Van Damme

Tutor: Prof. dr. Jan Gettemans

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van

Master in de bio-ingenieurswetenschappen: cel- en genbiotechnologie

De auteur en promotors geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te

stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder

de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.

Gent, juni 2016

De promotors,

Prof. dr. Jan Gettemans Prof. dr. Els Van Damme

De auteur,

Delphine Devriese

Woord vooraf Dit voorwoord zou ik willen richten aan alle mensen die mij bijgestaan hebben en een

steentje bijgedragen hebben om deze thesis tot een goed einde te brengen. Met dit werk

rond ik mijn opleiding als bio-ingenieur af en door hun hulp kon ik dit met een goede ervaring

afsluiten.

Ik had graag mijn promotors prof. dr. Jan Gettemans en prof. dr. Els Van Damme willen

bedanken om mij de kans te geven een stap in het wetenschappelijk onderzoek te zetten. Zo

kon ik een jaar lang proeven van de onderzoekswereld binnen het boeiende labo van prof.

dr. Jan Gettemans.

Els Beghein wil ik uitgebreid bedanken voor alle hulp doorheen het jaar. Ze leerde me de

technieken aan die ik nodig had in het labo en ook daarbuiten was ze van grote hulp. Ze was

altijd bereid mijn vragen te beantwoorden en problemen op te lossen. Bovendien stond ze

steeds paraat om de thesis na te lezen en feedback te leveren. Mede door deze goede

begeleiding kon ik afgelopen jaar als een positieve ervaring beleven. Daarnaast richt ik ook

een dankwoord aan Isabel, Laurence, Adriaan, Anneleen, Olivier, Thijs en Tim die me goed

opgevangen hebben in de groep. Ze vormden allen samen een toffe bende en er heerste

een aangename sfeer. Hiertoe droegen ook mede-thesisstudenten Jasmien en Lien bij.

Een dankjewel gaat ook uit naar mijn ouders. Ze steunden me niet alleen dit jaar maar

doorheen elk studiejaar. Mijn zus Joke verdient hier zeker ook een plaatsje. Bij haar kon ik

steeds terecht en ze nam de moeite om mijn thesis na te lezen. Als laatste had ik mijn vriend

Toon graag bedankt. Doorheen het jaar heeft hij altijd een luisterend oor geboden en

klaargestaan voor mij. Hij wist me steeds te motiveren en tot rust te brengen bij stress

momenten.

Bedankt iedereen!

4

Inhoudsopgave Samenvatting ........................................................................................................................ 8

Inleiding ................................................................................................................................. 9

1 Literatuurstudie .............................................................................................................10

1.1 Kanker: globaal overzicht .......................................................................................10

1.2 Exosomen ..............................................................................................................12

1.2.1 Inleiding ...........................................................................................................12

1.2.2 Endocytotische pathway ..................................................................................12

1.2.3 Intraluminale vesikel-/exosoomvorming ...........................................................13

1.2.3.1 ESCRT-afhankelijk ...................................................................................13

1.2.3.2 ESCRT-onafhankelijk ...............................................................................16

1.2.3.3 Gemengd model .......................................................................................16

1.2.4 Exosoomsecretie .............................................................................................17

1.2.5 De rol van exosomen in kanker .......................................................................18

1.3 Het actinecytoskelet ...............................................................................................19

1.3.1 Algemeen ........................................................................................................19

1.3.1.1 Inleiding....................................................................................................19

1.3.1.2 Actine .......................................................................................................19

1.3.1.3 Actinebindende proteïnen ........................................................................19

1.3.1.4 Actinerijke protrusies ................................................................................20

1.3.2 Cortactine ........................................................................................................21

1.3.3 Invadopodia ....................................................................................................22

1.3.3.1 Inleiding....................................................................................................22

1.3.3.2 Precursorvorming .....................................................................................22

1.3.3.3 Actinepolymerisatie ..................................................................................23

1.3.3.4 Rekrutering proteasen ..............................................................................25

1.3.3.5 Verband tussen invadopodia en exosomen ..............................................26

1.4 Nanobodies ............................................................................................................27

2 Materialen en methoden ................................................................................................29

2.1 Verband tussen cortactine en exosomen ................................................................29

2.1.1 Exosoomsecretie na inhibitie cortactine met nanobodies ................................29

2.1.1.1 Celcultuur .................................................................................................29

2.1.1.2 Antilichamen ............................................................................................29

2.1.1.3 OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie ...........................................29

2.1.1.4 Western blot .............................................................................................30

2.1.1.5 Exosoomkwantificatie via nanoparticle tracking analysis ..........................31

2.1.1.6 Statistische analyse .................................................................................31

2.1.2 Exosoomsecretie na expressie neerregulatie cortactine met shRNA ...............31

2.1.2.1 Celcultuur .................................................................................................31

2.1.2.2 Transfectie ...............................................................................................31

2.1.2.3 Cellen lyseren en eiwitconcentratie bepalen .............................................31

2.1.2.4 Antilichamen ............................................................................................32

2.1.2.5 Western blot .............................................................................................32

2.1.2.6 Immunostaining en fluorescentiemicroscopie ...........................................32

5

2.2 Verband tussen invadopodia en exosomen ............................................................33

2.2.1 Celcultuur ........................................................................................................33

2.2.2 Antilichamen ...................................................................................................33

2.2.3 Immunostaining en fluorescentiemicroscopie ..................................................33

2.2.4 Kwantificatie en statistische analyse ...............................................................34

3 Resultaten .....................................................................................................................35



3.1.1.1 OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie ...........................................35

3.1.1.2 Western blot ter detectie zuiverheid OptiPrep densiteitsgradiënt

ultracentrifugatie ........................................................................................................37


3.1.2.1 Western blot na cotransfectie ...................................................................38

3.1.2.2 Immunostaining na cotransfectie ..............................................................39

3.1.2.3 Western blot na enkele transfectie ...........................................................40


3.2.1 Nabijheid invadopodia en exosomen na immunostaining ................................42

3.2.1.1 Parentale MDA cellen...............................................................................42

3.2.1.2 CRN Nb expressie ...................................................................................42

3.2.2 MT1-MMP, invadopodia en exosomen ............................................................45

3.2.2.1 Nabijheid MT1-MMP, invadopodia en exosomen .....................................45

3.2.2.2 Degradatie assay .....................................................................................46

3.2.3 Controles .........................................................................................................46

3.2.3.1 Andere merkers ........................................................................................46

3.2.3.2 CD63 en het Golgi-apparaat .....................................................................46

3.2.3.3 Immunostaining met secundair antilichaam ..............................................47

3.2.4 Invadopodiavorming op polystyreen ................................................................47

4 Discussie .......................................................................................................................50





5 Algemene conclusie ......................................................................................................56

6 Ideeën voor verder onderzoek .......................................................................................57

Referenties ...........................................................................................................................58

Addendum.........................................................................................(elektronisch beschikbaar)

6

Lijst met afkortingen AAA ATPases associated with diverse cellular activities

ABP actinebindende proteïnen

ADAM A disintegrin and metalloproteinase

ADF actin-depolymerizing factor

ALIX apoptosis-linked gene 2-interacting protein X

AMSH associated molecule with the SH3 domain of STAM

ARF6 ADP ribosylation factor 6

Arg Abl-related gene

Arp2/3 actin-related protein 2 and 3

CD cluster of differentiation

CH constant domain of heavy chain

CHMP charged multivesicular body protein

CL constant domain of light chain

CIP4 Cdc42 interacting protein 4

CRN cortactine

dox doxycycline

DRF diaphanous-related formin

EAP ELL-associated protein

ECM extracellulaire matrix

EGFR epidermal growth factor receptor

EMT epitheel-mesenchym transitie

Ena/VASP enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein

ER endoplasmatisch reticulum

ESCRT endosomal sorting complex required for transport

EV extracellulaire vesikels

Fab fragment antigen-binding

F-actine filamenteus actine

FC fragment crystallizable

FH2 formin homology 2

FSN fascine

G-actine globulair actine

GAP GTPase activating protein

GEF guanine exchange factors

GLUE GRAM-like ubiquitin-binding motif in EAP45

GSN gelsoline

HB-EGF heparin binding epidermal growth factor

HDAC6 histon deacetylase 6

HPV humaan papillomavirus

HRS hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate

IARC International Agency for Research on Cancer

ILV intraluminale vesikels

MMP matrix metalloproteïnase

MT1-MMP membrane type 1 matrix metalloproteinase

MV microvesikels

MVB multivesicular body sorting factor

MVE multivesikulair endosoom

7

Nb Nanobody

Nck1 non-catalytic region of tyrosine kinase 1

NHE-1 sodium/hydrogen exchanger 1

NTA amino-terminal acidic

N-WASP neuraal WASP

NZF Npl4-type zinc finger

PA fosfatidezuur

PDGFR platelet-derived growth factor receptor

PET positron emissive tomografie

PI fosfatidylinositol

PLD2 fosfolipase D2

PX phox homoloog

RAB RAS-related in brain

Rb retinoblastoma proteïne

RNAi RNA interference

SCAR/WAVE suppressor of cAMP receptor/WASP family verprolin homologous

SH3 Src homoloog 3

SHIP2 SH2 domain-containing inositol 5-phosphatase 2

SNARE soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion attachment protein receptors

STAM signal transducing adaptor molecule

Tspan8 tetraspanine 8

TGF transforming growth factor

TGN trans-Golgi netwerk

TSG101 tumor susceptibility gene 101

TTP trombotische trombocytopenische purpura

USP8/UBPY ubiquitin specific peptidase 8

VAMP vesicle-associated membrane protein

VH variable domain of heavy chain

VHH variable domain of heavy chain of heavy chain antibodies

VL variable domain of light chain

VPS vacuolar protein sorting

vWF von Willebrand factor

WASH Wiskott-Aldrich syndrome protein and Scar homolog

WASP Wiskott-Aldrich syndrome protein

WHO World Health Organisation

WIP WASP-interacting protein

8

Samenvatting Exosomen zijn extracellulaire vesikels die endosomaal van oorsprong zijn en een grootte

hebben van 30 tot 100 nm. Er wordt hen een functie in intercellulaire communicatie

toegeschreven. Zo dragen ze in de ontwikkeling van kanker bij aan de wederzijdse

communicatie tussen de verschillende cellen aanwezig in de tumor micro-omgeving. De

belangrijkste doodsoorzaak van kanker is metastase. Hierbij zijn actinerijke protrusies,

invadopodia genaamd, belangrijke mediatoren. Zij zorgen voor de afbraak van de

extracellulaire matrix (ECM) en het doorbreken van de basale membranen. Het protease

MT1-MMP speelt hierin een prominente rol. Er werd een mogelijk verband gesuggereerd

tussen invadopodia en voornoemde exosomen. Exosomen zouden preferentieel ter hoogte

van invadopodia gesecreteerd worden en zouden actief MT1-MMP bevatten dat bijdraagt

aan ECM degradatie en afbraak van de basale membranen. Dit mogelijk verband werd

verder onderzocht waarbij gebruikgemaakt werd van nanobodies (Nbs). Dit zijn geïsoleerde

antigeenbindende domeinen van Camelidae zware keten antilichamen. Nbs gericht tegen

functionele domeinen van cortactine (CRN), een essentiële component in invadopodia-

vorming en –functie, werden hiervoor aangewend.

In een eerste reeks van experimenten werd aangetoond dat interferentie met het CRN NTA

domein enerzijds en met het CRN SH3 domein anderzijds via Nbs leidde tot een daling van

het aantal vrijgestelde exosomen. Aangezien CRN essentieel is voor invadopodia en voor de

gebruikte Nbs reeds bewezen werd dat deze interfereren met invadopodiavorming en –

functie, versterkte deze waargenomen daling het vermoeden van een mogelijk verband

tussen invadopodia en exosomen. Later zullen deze resultaten geverifieerd worden via

RNAi. Hiervoor werden gepaste shRNA-constructen geselecteerd.

Een CRN effect op het gereduceerd aantal vrijgestelde exosomen, onafhankelijk van zijn

functie in context van invadopodia, kon door bovenstaande experimenten niet uitgesloten

worden. Daarom werd het verband ook meer rechtstreeks benaderd. Er werd aangetoond

dat CD63-positieve exosomen steeds terug te vinden zijn in de nabijheid van invadopodia.

De twee CRN Nbs leidden tot een toename in het spreidingsoppervlak van de invadopodia

overheen de cel. Na expressie van deze Nbs werd ook een spreiding van de CD63-positieve

exosomen waargenomen waarbij deze nog steeds gelegen waren binnen de invadopodia-

zone. Een extra argument voor het gepostuleerde verband tussen invadopodia en exosomen

werd zo aangeleverd.

Wat betreft de functionaliteit van de exosomen in context van invadopodia, werd onderzocht

hoe MT1-MMP zich lokaliseerde t.o.v. invadopodia enerzijds en CD63-positieve exosomen

anderzijds. In beide gevallen kon colokalisatie waargenomen worden. Bovendien werd

aangetoond dat exosomen MT1-MMP bevatten en dat dit in staat is bij te dragen aan ECM

degradatie.

Deze resultaten sterken de hypothese van een mogelijk verband tussen invadopodia en

exosomen en dienen als basis voor verder onderzoek naar deze interconnectie.

9

Inleiding Kanker is één van de grootste oorzaken van ziekte en dood wereldwijd. Normale cellen

zullen zich hierbij omvormen tot kankercellen die gekenmerkt worden door een abnormale,

buitensporige groei. In een tumor zijn naast kankercellen ook verschillende andere celtypes

aanwezig die bijdragen tot de ontwikkeling van een tumor. Wederzijdse communicatie tussen

kankercellen en hun tumor micro-omgeving wordt onder andere door exosomen

bewerkstelligd. Exosomen zijn extracellulaire vesikels met een grootte van 30 tot 100 nm en

hebben een endosomale oorsprong. Ze worden gevormd als intraluminale vesikels (ILV’s)

tijdens maturatie van vroege tot late endosomen. De aanwezigheid van ILV’s zorgt ervoor

dat het late endosoom ook aangeduid wordt als multivesikulair endosoom (MVE). ILV’s

kunnen enerzijds gevormd worden met behulp van de endosomal sorting complex required

for transport (ESCRT) complexen. Anderzijds bestaan ook mechanismen onafhankelijk

hiervan. MVE’s kunnen zich naar het plasmamembraan begeven en hiermee fusioneren.

Daarbij worden de ILV’s vrijgesteld in het extracellulair milieu en worden dan exosomen

genoemd.

Na bepaalde tijd zullen kankercellen uit de primaire tumor breken en zich via het bloed- of

lymfevatenstelsel verspreiden naar andere organen, wat aangeduid wordt als metastase. Dit

is de belangrijkste doodsoorzaak van kanker. Voor metastase is afbraak van de basale

membranen en de extracellulaire matrix (ECM) nodig. Dit wordt bewerkstelligd met behulp

van actinerijke protrusies die gevormd worden door invasieve kankercellen en aangeduid

worden als invadopodia. Deze bestaan uit een actinekern omgeven door verschillende

eiwitten die bijdragen tot hun vorming en maturatie, zoals cortactine, cofiline, N-WASP, het

Arp2/3 complex en Tks5. Gematureerde invadopodia zijn in staat de ECM af te breken

waarbij het matrix metalloproteïnase MT1-MMP een belangrijke rol vervult. Reeds

verschillende routes voor het rekruteren van MT1-MMP ter hoogte van het plasmamembraan

van invadopodia werden beschreven. Recent werd gesuggereerd dat MT1-MMP-bevattende

exosomen vrijgesteld worden ter hoogte van invadopodia en dat deze bijdragen tot

invadopodiamaturatie en ECM degradatie.

Nanobodies zijn geïsoleerde antigeenbindende domeinen van Camelidae zware keten

antilichamen. Hiermee werd de interconnectie tussen deze actinerijke protrusies en

exosomen verder onderzocht. Twee nanobodies gericht tegen verschillende functionele

domeinen van cortactine, een cruciale component binnen invadopodiavorming en –functie,

werden hiervoor aangewend.

10

1 Literatuurstudie

1.1 Kanker: globaal overzicht

Kanker behoort tot één van de grootste oorzaken van ziekte en dood wereldwijd. In 2012

waren er ongeveer 14 miljoen gevallen van kanker bekend en zorgde deze ziekte nog voor

8,2 miljoen doden [1]. Kanker houdt in dat normale (meestal epitheliale) cellen zich

omvormen tot kankercellen die gekenmerkt worden door een abnormale, buitensporige

groei. Dit leidt tot een grote massa aan kankercellen, anders gezegd een tumor. Deze

abnormale groei kan op elke plaats in het lichaam voorkomen. Een tumor blijft groeien en zal

naburige weefsels binnendringen. Cellen uit deze tumor zullen zich na verloop van tijd ook

verspreiden via het bloed- of lymfevatenstelsel naar andere organen om daar aanleiding te

geven tot een secundaire tumor. Dit laatste wordt metastase genoemd en is de belangrijkste

doodsoorzaak van kanker. Het type kanker wordt steeds bepaald aan de hand van waar hij

oorspronkelijk is ontstaan, ongeacht de plaats van deze secundaire tumoren [1], [2]. De

meest voorkomende kankers in 2012 waren: long- (1,59 miljoen doden), lever- (745 000

doden), maag- (723 000 doden), darm- (694 000 doden), borst- (521 000 doden) en

slokdarmkanker (400 000 doden) [1].

Het proces waarbij normale cellen zich omvormen tot kankercellen, bestaat uit meerdere

stappen. Deze omvorming gebeurt onder invloed van een samenspel tussen interne

genetische factoren en externe factoren. Bewezen risicofactoren zijn: UV-straling,

ioniserende straling, asbest, roken, alcohol, bepaalde chronische infecties, hepatitis, humaan

papillomavirus (HPV), obesitas, onvoldoende beweging en leeftijd [2]. Voor een volledig

overzicht van mogelijke risicofactoren wordt verwezen naar de classificatie van de

organisatie International Agency for Research on Cancer (IARC), de afdeling binnen de

World Health Organisation (WHO) die instaat voor kankeronderzoek. Hierbij worden

risicofactoren ingedeeld als bewezen carcinogeen, waarschijnlijk carcinogeen, mogelijks

carcinogeen, waarschijnlijk niet carcinogeen en niet classificeerbaar [3].

Omvorming van een normale cel tot kankercel gaat gepaard met genetische veranderingen.

Mutaties zorgen enerzijds voor oncogenen die een dominerende functie verkrijgen en

anderzijds voor het verlies van functie van tumorsuppressor genen. Hanahan en Weinberg

beschrijven zes essentiële veranderingen die plaatsvinden bij de ontwikkeling van kanker.

Een eerste verandering houdt in dat kankercellen minder afhankelijk worden van

groeisignalen uit hun omgeving door zelf in hun groeisignalen te voorzien. Enerzijds kunnen

ze zelf groeifactoren aanmaken (autocriene stimulatie) en anderzijds kunnen ze stromale

cellen aanzetten tot secretie van groeifactoren (paracriene stimulatie). Een tweede

verandering in kankercellen is de ongevoeligheid voor antigroeisignalen. Groei in normale

cellen wordt op verschillende manieren geblokkeerd, bijvoorbeeld via de retinoblastoma

proteïne (Rb)-pathway wat een rol speelt bij de overgang van een delende cel naar een

rustfase G0 of bij contact-inhibitie. Deze mechanismen zijn op één of andere manier

verstoord in kankercellen. Een derde verandering zorgt ervoor dat apoptose of

geprogrammeerde celdood vermeden wordt. Naast apoptose blijken ook autofagie en

necrose een rol te hebben in de ontwikkeling van een tumor. Een vierde verandering die

cellen ondergaan is het verkrijgen van het vermogen om oneindig te vermenigvuldigen. Om

een snelle klonale expansie mogelijk te maken dat leidt tot een macroscopische tumor, is

angiogenese noodzakelijk. Dit is de vijfde verandering in de vorming van kanker. Tumoren

activeren een zogenaamde angiogenic switch door het evenwicht te veranderen tussen

11

enerzijds induceerders en anderzijds inhibitoren. Een zesde en laatste verandering is de

invasie van het omliggende weefsel en uiteindelijk metastase. Deze laatste verandering

bestaat uit verschillende stappen waarbij er eerst een lokale invasie plaatsvindt, waarna

intravasatie van de kankercellen in bloed- of lymfevaten gebeurt. Extravasatie in een nieuw

weefsel zal dan aanleiding geven tot micrometastasen waarbij kankercellen eerst kleine

nodules vormen. Deze kunnen uitgroeien tot macroscopische tumoren wat aangeduid wordt

als kolonisatie [4], [5].

Naast deze zes veranderingen worden twee hallmarks gedefinieerd die voorgaande

veranderingen in staat stellen te ontwikkelen. Enerzijds zal het genoom instabieler worden

waardoor DNA gevoeliger wordt voor mutaties. Anderzijds kunnen immuuncellen

tumorigenese promoten via ontstekingsreacties die bijvoorbeeld groeifactoren en andere

moleculen aanleveren. Twee bijkomende veranderingen sinds de eerste review van

Hanahan en Weinberg worden ook als essentieel gezien. De eerste houdt een verandering

van het energiemetabolisme in, waarbij kankercellen hun energieproductie grotendeels

beperken tot glycolyse, zelfs in de aanwezigheid van zuurstof. In een tweede verandering

wordt de destructie van de kankercellen door het immuunsysteem vermeden, dit door

bijvoorbeeld immunosuppressieve factoren te secreteren [5].

Zoals blijkt uit de veranderingen, zijn niet enkel de kankercellen zelf van belang bij de

ontwikkeling van een tumor maar ook omliggende cellen. Hanahan en Weinberg spreken van

een tumor micro-omgeving (Figuur 1) [5]. Kankerontwikkeling bestaat dus uit veel

verschillende aspecten die samen een complex geheel vormen.

Figuur 1: Tumor micro-omgeving. Een tumor bestaat uit kankercellen die de basis vormen van de ziekte

en de specifieke oncogene en tumorsuppressor mutaties dragen. Daarnaast zijn ook kanker stamcellen,

endotheelcellen (cfr. angiogenese als een essentiële verandering), pericyten, immuuncellen (zowel tumor

antagoniserende als tumor stimulerende leukocyten), kanker-geassocieerde fibroblasten, stamcellen en

progenitorcellen aanwezig in de tumor micro-omgeving [5].

12

1.2 Exosomen

1.2.1 Inleiding

Exosomen zijn extracellulaire vesikels met een diameter van 30 tot 100 nm en zijn van

endosomale oorsprong. Ze worden gevormd als intraluminale vesikels (ILV) in het

multivesikulair endosoom (MVE) en komen in het extracellulair milieu door fusie van dit MVE

met het plasmamembraan. Zo mediëren exosomen intercellulaire communicatie. Eiwitten

afkomstig van endosomen, het plasmamembraan en het cytosol worden teruggevonden in

exosomen. Voorbeelden van eiwitten die voorkomen in exosomen zijn componenten van de

endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) complexen, adhesiemoleculen

zoals tetraspaninen en integrinen, eiwitten van het cytoskelet en eiwitten met een rol in

antigeenpresentatie. Daarnaast bevatten ze ook mRNA en miRNA. Hun membraan is

aangerijkt in sfingomyeline, fosfatidylserine, cholesterol en ceramide [6], [7]. Enkele van deze

componenten spelen een rol in de exosoomvorming en –secretie en komen verder aan bod.

Exosomen zijn slechts één van de voorkomende extracellulaire vesikels (EV). Ook

microvesikels (MV) en apoptotic blebs behoren tot deze groep. MV’s zijn vesikels met een

diameter van 150 tot 1000 nm. Ze ontstaan door knopvorming van het plasmamembraan en

afscheiding in het extracellulair milieu. Apoptotic blebs zijn blaasjes afgescheiden door een

apoptotische cel en hebben een diameter van 1 tot 5 µm [6], [7]. Er dient opgemerkt te

worden dat isolatie van een bepaald EV subtype soms resulteert in een aanrijking i.p.v. een

volledige isolatie van het subtype en dat bij de isolatie van EV’s het moeilijk is een

onderscheid te maken tussen de verschillende subtypes [7].

1.2.2 Endocytotische pathway

De endocytotische pathway start met endocytose, waarbij het celmembraan naar binnen toe

plooit en er een vesikel afgescheiden wordt in het cytoplasma. Verschillende pathways voor

endocytose zijn bekend, waarvan de clathrinegemedieerde pathway de meest gekende is.

Andere pathways die endocytose bewerkstelligen, zijn caveolair-type endocytose,

CLIC/GEEC-type endocytose en ARF6-afhankelijke endocytose [8]. De cargo van een

endocytotisch vesikel bestaat uit o.a. nutriënten, receptor-ligand complexen, lipiden,

membraanproteïnen, componenten van de extracellulaire matrix (ECM), virussen, enz. [9].

Deze endocytotische vesikels fusioneren met vroege endosomen. Een endosoom bestaat uit

tubulaire en vacuolaire domeinen. Op het membraan van dit endosoom, vooral in het

tubulaire gedeelte, zijn microdomeinen aanwezig die voor sortering zorgen. Vesikels worden

ter hoogte van deze microdomeinen gecreëerd die de cargo, gerekruteerd aan dit

microdomein, naar zijn specifieke bestemming brengen. Het grootste deel van de cargo

wordt gerecycleerd. Dit is bijvoorbeeld het geval voor componenten van het plasma-

membraan en housekeeping receptoren. Vesikels kunnen ook uitgewisseld worden met het

trans-Golgi netwerk (TGN) [9], [10]. Het vacuolair domein van het vroege endosoom

matureert tot het late endosoom. Deze maturatie gaat gepaard met veranderingen, o.a. de

overschakeling van RAB5 naar RAB7, het vormen van intraluminale vesikels (ILV’s),

verzuring en fosfatidylinositol (PI) conversie. Tijdens maturatie zullen de endosomen ook een

nettobeweging ondergaan van de periferie naar de perinucleaire regio [9]. Door de

vesikelvorming in het lumen worden late endosomen ook wel multivesikulaire endosomen

(MVE) genoemd. MVE’s kunnen samensmelten met lysosomen waarbij de inhoud van de

vesikels afgebroken wordt. Daarnaast kunnen MVE’s migreren naar het plasmamembraan

en ermee fusioneren. ILV’s worden zo vrijgesteld en worden dan exosomen genoemd [7].

13

1.2.3 Intraluminale vesikel-/exosoomvorming

1.2.3.1 ESCRT-afhankelijk

ILV’s kunnen enerzijds gevormd worden met behulp van de endosomal sorting complex

required for transport (ESCRT) complexen. Anderzijds bestaan ook mechanismen

onafhankelijk hiervan en worden verderop besproken (sectie 1.2.3.2). De ESCRT-

afhankelijke pathway start met ESCRT-0. Dit complex bindt en clustert geübiquitinileerde

cargo componenten [7]. Vervolgens bindt ESCRT-I enerzijds aan ESCRT-0, anderzijds aan

de geübiquitinileerde componenten. ESCRT-I interageert met ESCRT-II en samen induceren

ze knopvorming in het endosoom. Deze twee complexen zijn gelokaliseerd aan de nek van

de gevormde knop en zorgen voor stabilisatie van de nek (Figuur 2). Vervolgens zal ESCRT-

III het gevormde vesikel klieven (Figuur 2b). Vacuolar protein sorting 4 (VPS4) zorgt in een

finale stap voor de disassemblage en recyclage van ESCRT-III. Om deze pathway te

ontrafelen werd en wordt nog steeds de gist Saccharomyces cerevisiae gebruikt als model.

De gist vacuole is het equivalent van het lysosoom en zijn biogenese is gelinkt aan deze van

MVE’s [11]. De basisfuncties van de ESCRT-0, -I, -II en –III complexen in deze biogenese

zijn geconserveerd en dus gelijkaardig voor alle eukaryoten [7], [12]. ESCRTs zijn niet enkel

belangrijk bij de sortering van geübiquitinileerde cargo naar het lysosoom en bij de vorming

van exosomen, maar spelen ook een rol tijdens de cytokinese, bij knopvorming van virussen

ter hoogte van het plasmamembraan en bij enkele andere processen [13]. In de volgende

beschrijving worden de benamingen van de humane eiwitten gebruikt. De verschillende

componenten worden opgelijst in Tabel 1 waarbij ook hun overeenkomstige benaming in gist

wordt gegeven.

Figuur 2: (a) ESCRT-I en –II met zijn verschillende componenten. (b) Hoe ESCRT-I en –II als supercomplex

gelokaliseerd zijn aan de nek tijdens de vorming van een ILV en hoe ESCRT-III de membranen naar elkaar

toe brengt (figuur aangepast uit [11]).

14

Tabel 1: Componenten ESCRT complexen – humaan en gist homologen

Humane eiwitten Gist eiwitten

ESCRT-0 HRS Vps27 STAM Hse1

ESCRT-I TSG101 Vps23 VPS28 Vps28 VPS37 Vps37 MVB12 Mvb12

ESCRT-II EAP30 Vps22 EAP45 Vps36 EAP20 Vps25

ESCRT-III CHMP6 Vps20 CHMP4 Snf7 CHMP3 Vps24 CHMP2 Vps2

Andere VPS4 Vps4

ESCRT-0 is een complex dat bestaat uit hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase

substrate (HRS) en signal transducing adaptor molecule (STAM). Beide componenten

bevatten ubiquitinebindende domeinen. De affiniteit van HRS voor ubiquitine is groter dan

deze van STAM, waaruit kan verondersteld worden dat HRS de belangrijkste rol speelt bij de

functie van ESCRT-0 en STAM eerder een accessorisch eiwit is [14]. Zoals eerder

aangehaald, zijn er verschillende microdomeinen terug te vinden op het membraan van de

vroege endosomen. Zo zijn er in het vacuolaire domein clathrinebevattende microdomeinen

aanwezig. HRS bindt en rekruteert geübiquitinileerde eiwitten ter hoogte van deze

clathrinebevattende microdomeinen en verhindert zo recyclage van de cargo naar het

plasmamembraan [15]. STAM zal naast het binden van ubiquitine, ook deübiquitinilatie-

enzymen rekruteren, wat een regulerende functie heeft bij sortering [11], [14].

Deübiquitinilasen belangrijk in deze context zijn het associated molecule with the SH3

domain of STAM (AMSH) [16] en ubiquitin specific peptidase 8 (USP8/UBPY) [17] (zie

verder).

Tumor susceptibility gene 101 (TSG101) is een eiwit behorende tot het ESCRT-I complex. Er

werd aangetoond dat interactie tussen TSG101 en HRS nodig is om geübiquitinileerde

moleculen te sorteren in de ILV’s van het MVE. HRS rekruteert TSG101 en TSG101 zal

vervolgens binden met het ubiquitine label [18]. Het ESCRT-I complex bestaat daarnaast

nog uit de subunits VPS28, VPS37 en multivesicular body sorting factor 12 (MVB12) [19]. De

mens heeft twee isovormen voor VPS28, vier isovormen voor VPS37 en minstens drie

isovormen voor MVB12 [20]. Dit complex vormt samen een structuur met een 13 nm-lange

steel en 5 nm-lang hoofd (Figuur 2a, stalk en head, respectievelijk) [19]. ESCRT-II, een

volgend complex belangrijk in ILV-vorming, bestaat ook uit vier subunits, meer bepaald ELL-

associated protein 30 (EAP30), EAP45 en tweemaal EAP20. Deze vormen samen een Y-

vormige structuur (Figuur 2a) [21]. ESCRT-I en ESCRT-II zullen samen knopvorming

induceren in het membraan van het endosoom en er werd aangetoond dat deze complexen

gelokaliseerd zijn aan de nek van de knop [22]. Voor knopvorming zullen ze samen één

supercomplex vormen (Figuur 2b). Hierbij zal de C-terminus van VPS28 binden aan

ESCRT-II. De N-terminus van EAP45 bevat een zogenaamd GRAM-like ubiquitin-binding

motif in EAP45 (GLUE)-domein. In dit domein zijn twee Npl4-type zinc fingers (NZF1 en

NZF2) aanwezig. Specifiek gebeurt de binding van de C-terminus van VPS28 met NZF1

(Figuur 2a) [23]. Er werd gezien dat dit supercomplex een evenwicht heeft tussen open en

15

gesloten conformatie. Hieruit werd een model gesuggereerd voor cargo transport. Wanneer

het complex van een open naar gesloten conformatie overgaat, zou dit de cargo langs het

membraan richting de nek van de knop brengen [24].

Na knopvorming gebeurt afscheiding van het ILV door het ESCRT-III complex. Het complex

heeft een kern bestaande uit charged multivesicular body protein 6 (CHMP6), CHMP4,

CHMP3 en CHMP2 [25]. De mens heeft drie isovormen voor CHMP4 en twee isovormen

voor CHMP2 [11]. Dit is een dynamisch complex, in tegenstelling tot voorgaande complexen,

en zal zich pas vormen wanneer nodig in het endosoom [25]. In een eerste stap zal CHMP6

binden aan ESCRT-II, meer bepaald aan de EAP20 subunit [26]. CHMP6 doet dienst als

startplaats om oligomerisatie van CHMP4 op endosomen te bewerkstelligen. Oligomerisatie

wordt beëindigd door binding van CHMP3. In een laatste assemblagestap zal CHMP2

binden. Deze laatste rekruteert dan VPS4. CHMP4 is het meest aanwezig en het meest

noodzakelijk voor de fissie [27]. Een model wordt voorgesteld waarbij CHMP4-eenheden een

steeds smaller wordende spiraal vormen rond de nek totdat de membranen dicht genoeg bij

elkaar gebracht zijn om fissie te bewerkstelligen [28]. Zoals vermeld, wordt in een laatste

stap VPS4, een ATPase associated with diverse cellular activities (AAA) ATPase,

gerekruteerd. Door energietoevoer zal disassemblage van het ESCRT-III complex gebeuren

en is de vesikelvorming beëindigd [29].

Voordat het vesikel volledig afgesloten wordt, zal de cargo ontdaan worden van zijn

ubiquitine label. In de gist Saccharomyces cerevisiae gebeurt dit door het deübiquitinilase

Doa4, wat wordt gerekruteerd door Bro1 [30]. Bro1 is geassocieerd met het ESCRT-III

complex en is vooral afhankelijk van Snf7 (CHMP4 homoloog in gist). Bij disassemblage van

het ESCRT-III complex door Vps4 (VPS4 homoloog in gist), zal ook Bro1 door Vps4

gerecycleerd worden [31]. Het menselijke homoloog voor Bro1 is het apoptosis-linked gene

2-interacting protein X (ALIX). ALIX bindt met CHMP4. In tegenstelling tot voorgaande

homologen, zal ALIX niet dezelfde functie uitoefenen bij de mens als Bro1 in gist [12]. ALIX

is in staat het ESCRT-III complex te assembleren, onafhankelijk van voorgaande ESCRT

complexen en cargo ubiquitinilatie, en werkt zo als een tweede mechanisme voor sortering

[32]. De humane tegenhangers van Doa4 zijn de deübiquitinilasen AMSH en UBPY. AMSH

interageert met verschillende subunits van het ESCRT-III complex en verwijdert het

ubiquitine label van de cargo voordat ze volledig geïsoleerd worden in het ILV.

Deübiquitinilatie wordt stopgezet wanneer VPS4 gerekruteerd wordt [16]. UBPY werkt

volgens een ander mechanisme [17].

Aangezien ILV’s niet enkel aanleiding geven tot exosomen maar ook een rol spelen in cargo

degradatie, werd nagegaan of dit mechanisme effectief leidt tot exosoomvorming. Dit

gebeurde door silencing via RNA interference (RNAi) van verschillende componenten van de

ESCRT complexen. Wanneer HRS en STAM1 uitgeschakeld werden, resulteerde dit in

minder gesecreteerde exosomen. Ook bij het uitschakelen van TSG101 werden minder

exosomen gesecreteerd, wat wijst op een ESCRT-afhankelijkheid. Enkele eigenaardigheden

werden gezien in de studie, meer bepaald een stijging in exosoomsecretie bij uitschakeling

van VPS4 en ALIX [33]. Baietti et al. bewezen eerder nochtans dat ALIX essentieel is in

exosoombiogenese. Hierbij zou de connectie tussen ALIX en syndecaan via syntenine een

rol spelen. Bovendien toonden ze aan dat VPS4 silencing wel leidt tot een reductie in

exosoomsecretie [34].

16

1.2.3.2 ESCRT-onafhankelijk

Naast exosoomvorming via de ESCRT-afhankelijke pathway, werden ook onafhankelijke

pathways beschreven. Een eerste onafhankelijke pathway is de inductie van knopvorming

door ceramide in oligodendrogliale cellen. Hierbij zal cargo, bestemd voor exosomen,

gerekruteerd worden ter hoogte van microdomeinen analoog aan lipid rafts. Een model wordt

voorgesteld waarbij sfingolipiden, aanwezig aan een hoge concentratie in deze lipid rafts,

worden omgezet naar ceramide door neutraal sfingomyelinase. Ceramide veroorzaakt

vervolgens een spontane kromming in het membraan en induceert zo knopvorming [35]. Een

tweede pathway waarbij een lipide een rol speelt in de spontane knopvorming werd

beschreven door Ghossoub et al.. Het GTPase ADP ribosylation factor 6 (ARF6) activeert

fosfolipase D2 (PLD2). Vervolgens metaboliseert PLD2 fosfatidylcholine tot fosfatidezuur

(PA). Net zoals ceramide induceert PA een kromming in het membraan, met spontane

knopvorming tot gevolg. Bij ARF6-negatieve cellen werden niet alle ESCRT-afhankelijke

processen geblokkeerd waardoor onafhankelijkheid van deze pathway werd verondersteld.

Er dient echter opgemerkt te worden dat syntenine kan interageren met PA en op genniveau

ook interageert met ARF6. Wegens de eerder aangetoonde interactie tussen syntenine en

ALIX, kon ESCRT-afhankelijkheid hier niet volledig uitgesloten worden [36].

Een tweede groep van ESCRT-onafhankelijke pathways blijken afhankelijk van

tetraspaninen. Zo werd in melanomacellen aangetoond dat, naast de ESCRT-afhankelijke

weg, een tweede mechanisme aanwezig is, waarbij de ILV-vorming afhankelijk is van cluster

of differentiation 63 (CD63) [37]. CD82 en CD9 zijn twee tetraspaninen die in de context van

β-catenine secretie via exosomen vernoemd werden. Deze eiwitten zouden

exosoomvrijstelling stimuleren via de ceramide-afhankelijke pathway [38]. Voor de vorming

van exosomen afkomstig van tumorcellen (rat adenocarcinoma cellen) werd gezien dat het

tetraspanine 8 (Tspan8) instaat voor de sortering van welbepaalde eiwitten en mRNA [39].

Verder werd ook het tetraspanine CD81 gerapporteerd als zijnde belangrijk in de sortering

van specifieke componenten in exosomen. Eiwitten die interageren met CD81 werden niet

waargenomen in de exosomen van CD81-deficiënte cellen [40]. Een overzicht van

exosoomvorming wordt schematisch weergegeven in Figuur 3.

1.2.3.3 Gemengd model

Markus Babst stelde een model voor waarbij zowel de ESCRT complexen, als de lipide-

afhankelijke knopvorming samenwerken in ILV-vorming. ESCRT-0 zou geübiquitinileerde

eiwitten binden en clusteren ter hoogte van lipid rafts. De lipid rafts hebben een specifieke

lipidesamenstelling die voor vervorming en invaginatie van het membraan zorgt. Door de

aanwezigheid van de gerekruteerde geübiquitinileerde eiwitten en de lipiden (bv. ceramide)

die voor vervorming van het membraan zorgen, worden ESCRT-I en ESCRT-II gerekruteerd.

Deze complexen stabiliseren de nek van de gevormde invaginatie. Verder volgt de ILV-

vorming de pathway beschreven onder ESCRT-afhankelijke ILV-vorming [41].

17

Figuur 3: Overzicht exosoomvorming en –secretie. ILV’s worden gevormd door knopvorming in het

vroege endosoom. Dit kan via de ESCRT-afhankelijke pathway en/of onafhankelijk hiervan, m.b.v. lipiden

(ceramide, fosfatidezuur) en/of tetraspaninen (CD63, CD82, CD9, Tspan8, CD81). Bij exosoomsecretie

spelen de RAB GTPasen en de SNARE proteïnen een rol. Daarnaast kan het MVB samensmelten met het

lysosoom voor degradatie van de cargo. Ook microvesikels, een tweede EV subtype, wordt hier

weergegeven [42].

1.2.4 Exosoomsecretie

Om de exosomen te secreteren, dienen de MVE’s zich eerst naar het plasmamembraan te

begeven waar vervolgens fusie plaatsvindt en de ILV’s vrijgesteld worden als exosomen.

Twee groepen moleculen worden geassocieerd met dit proces, enerzijds de RAB GTPasen

en anderzijds de SNARE proteïnen (Figuur 3).

RAS-related in brain (RAB) eiwitten spelen een belangrijke rol in intracellulair

vesikeltransport tussen verschillende compartimenten. Elk lid van deze familie zal

preferentieel associëren met een bepaald intracellulair compartiment [7]. RAB5 en RAB7

werden eerder ook al aangehaald als zijnde belangrijk in de conversie van een vroeg naar

een laat endosoom (sectie 1.2.2). RAB11 werd als eerste geassocieerd met exosomen door

Savina et al. [43]. Concreet werd hier aangetoond dat overexpressie van een dominant

negatieve mutant van RAB11 resulteerde in de inhibitie van exosoomsecretie in K562 cellen.

Later werd een tweede RAB proteïne, namelijk RAB35, een rol toegeschreven in

exosoomsecretie. Meer specifiek zou dit een rol hebben in docking van het MVE aan het

plasmamembraan [44]. Ook geassocieerd met het docken van het MVE aan het

plasmamembraan is RAB27. Twee isovormen werden geïdentificeerd. Silencing van zowel

Rab27a als RAB27b leidde tot verminderde exosoomsecretie. Rab27a RNAi induceerde

daarenboven een vergroting van het MVE, terwijl RAB27b RNAi leidde tot een herdistributie

van MVE’s in de perinucleaire regio [45]. RAB11 en RAB35 zijn vooral terug te vinden bij

vroege endosomen en in de recyclage pathway terwijl RAB27 dan weer gelokaliseerd is bij

de late endosomen en de secretorische pathway. Een hypothese wordt vooropgesteld

waarbij of de ene of de andere RAB pathway gevolgd wordt en zo aanleiding geeft tot

verschillende subtypes van exosomen afkomstig van verschillende stadia in de endosoom-

maturatie [7].

18

Soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion attachment protein receptors (SNARE) proteïnen

zijn gekend als mediatoren van membraanfusie [7]. Specifiek voor de fusie tussen het MVE

en het plasmamembraan werd gesuggereerd dat het vesicle-associated membrane protein 7

(VAMP7) hierin belangrijk zou zijn. Dit werd aangetoond voor de vrijstelling van

acetylcholinesterase-bevattende exosomen in K562 cellen [46]. Een ander SNARE proteïne,

meer bepaald de R-SNARE YKT6, werd gerapporteerd als een component nodig voor de

secretie van Wnt-bevattende exosomen tijdens de ontwikkeling van Drosophila. Dit werd ook

aangetoond in humane cellen (HEK293) [47]. Er wordt gesteld dat verschillende celtypes

andere SNARE’s gebruiken voor exosoomsecretie. Anderzijds zou het ook kunnen dat

binnen hetzelfde celtype verschillende subtypes van MVE’s andere SNARE’s gebruiken [7].

1.2.5 De rol van exosomen in kanker

Zoals reeds aangehaald, spelen exosomen een rol in intercellulaire communicatie. Bij de

ontwikkeling van kanker zullen kankercellen communiceren met hun tumor micro-omgeving,

o.a. door middel van exosomen, en vice versa (sectie 1.1). Een eerste celtype zijn de

immuuncellen. Immuuncellen, meer bepaald dendritische cellen, produceren exosomen voor

antigeenpresentatie. Een cellulaire immuunrespons wordt zo teweeg gebracht tegen de

vormig van tumoren. Ook exosomen afkomstig van kankercellen kunnen een dergelijke

cellulaire immuunrespons uitlokken. Daarnaast zijn er echter exosomen die net het

immuunsysteem zullen onderdrukken. Dit laatste wordt door Hanahan en Weinberg als een

essentiële verandering beschouwd in de ontwikkeling van kanker (sectie 1.1). Tumorcel

exosomen kunnen ook differentiatie van fibroblast tot myofibroblast stimuleren. Deze

myofibroblasten secreteren groeifactoren, matrixcomponenten en proteasen die

tumorigenese stimuleren. Endotheelcellen in de micro-omgeving worden geactiveerd door

stimulerende angiogenetische factoren afkomstig van kankercel exosomen. Dit geeft

aanleiding tot angiogenese, een essentiële verandering in de ontwikkeling van kanker

(sectie 1.1). Tussen kankercellen onderling wordt ook gecommuniceerd. Kankercellen

binnen eenzelfde tumor zijn namelijk niet homogeen, ze brengen verschillende oncogenen

tot expressie. Exosomen zullen een horizontale propagatie van oncogenen mediëren. Als

laatste celtype dat wordt beïnvloed door kankercel exosomen worden de beenmergcellen

vermeld. Exosomen afkomstig van primaire tumoren stimuleren migratie van deze cellen

naar andere organen, waar ze vervolgens de basis zullen vormen voor metastasen

(premetastatische niches). Kennis van de rol van exosomen in kankerontwikkeling en hoe

deze exosomen tot stand komen kan leiden tot nieuwe diagnostische en therapeutische

invalshoeken [48].

19

1.3 Het actinecytoskelet

1.3.1 Algemeen

1.3.1.1 Inleiding

Drie vezelige componenten behoren tot het cytoskelet, meer bepaald actinefilamenten,

microtubuli en intermediaire filamenten. Hierbij zijn de microtubuli belangrijk bij celtransport

en celdeling en dienen intermediaire filamenten vooral als weerstand tegen mechanische

stress. Het actinecytoskelet zorgt voor de celmorfologie en polariteit. Daarnaast is het ook

belangrijk bij endocytose, contractiliteit, celbeweging en celdeling [49]–[51]. Op het

actinecytoskelet wordt verder ingegaan.

1.3.1.2 Actine

Actine is het meest voorkomende eiwit in de eukaryote cel. Enerzijds is actine aanwezig in

een monomere globulaire vorm (G-actine), anderzijds in de polymere filamenteuze vorm

(F-actine). Er bestaan verschillende actine isovormen, namelijk de α-, β- en γ-isovormen.

Actine bevat twee groeven. In de ene groef zal ATP of ADP gebonden zijn en de andere

groef bevat een bindingsplaats voor actinebindende proteïnen (ABP’s). Schroefvormige

filamenten (F-actine) worden gevormd uit de actinemonomeren. Het actinefilament is

gepolariseerd. Hierbij is er sprake van een positief (barbed) en negatief (pointed) uiteinde.

Monomeren worden hoofdzakelijk toegevoegd aan het positieve einde waardoor deze zijde

veel sneller aangroeit. Nadat het monomeer toegevoegd is, zal hydrolyse van ATP

plaatsvinden. De ADP-gebonden vorm is minder stabiel dan de ATP-gebonden vorm en zal

aan het negatieve uiteinde dissociëren. Ook aan de positieve zijde kunnen monomeren

dissociëren maar additie van een monomeer gebeurt sneller dan hydrolyse. De toevoeging

van monomeren aan de negatieve zijde is ook mogelijk maar dit gebeurt hier trager en de

hydrolyse haalt de associatie in waardoor netto meer dissociatie gebeurt. Dit steady-state

mechanisme van associatie en dissociatie wordt treadmilling genoemd [51], [52].

1.3.1.3 Actinebindende proteïnen

Naast het proces van treadmilling zijn ook actinebindende proteïnen (ABP’s) betrokken in de

dynamiek van actine. Naast associatie en dissociatie van actine monomeren, helpen ze in de

organisatie van actine in hogere-orde netwerken.

Polymerisatie is energetisch ongunstig tot wanneer een kern van drie monomeren gevormd

wordt. Actin-related protein 2 and 3 vormen samen het Arp2/3 complex en hebben een

gelijkaardige structuur als een actine dimeer. Wanneer ze G-actine binden, wordt een kern

van drie monomeren nagebootst waardoor polymerisatie geïnitieerd wordt. Dit complex blijft

aan het negatieve uiteinde en stimuleert zo aangroei van het filament aan het positieve eind.

Het Arp2/3 complex kan bovendien associëren met een reeds gevormd filament en zorgt zo

voor een vertakking in een hoek van 70°. Herhaaldelijke vertakking resulteert in dendritische

netwerken. In vivo wordt de activiteit van Arp2/3 gestimuleerd door andere eiwitten. Hierbij

zijn o.a. de Wiskott–Aldrich syndrome protein (WASP) en de suppressor of cAMP receptor /

WASP family verprolin homologous (SCAR/WAVE) proteïnen belangrijk. Een andere

activator van Arp2/3 is cortactine (CRN) waar verder op wordt ingegaan (sectie 1.3.2). Een

tweede groep eiwitten die een rol spelen in nucleatie zijn de formines. Ze vormen dimeren.

Via hun formin homology 2 (FH2) domein blijven ze gebonden aan het positieve uiteinde en

verhinderen zo de binding van capping proteïnen (zie verder) [52], [53].

20

Naast nucleatie zijn er ook andere functies voor ABP’s. Zo zal profiline binden aan G-actine

wat o.a. de uitwisseling van ADP voor ATP katalyseert en zo polymerisatie stimuleert.

Daarnaast zorgt profiline ervoor dat monomeren enkel toegevoegd worden aan het barbed

end. Thymosine bindt eveneens aan G-actine maar zal ervoor zorgen dat dit monomeer niet

meer beschikbaar is voor polymerisatie. Capping proteïnen verhinderen actine uitwisseling

aan barbed of pointed ends. Gelsoline (GSN) bijvoorbeeld bindt aan het positieve uiteinde

om er monomeerbinding te verhinderen. Daarnaast kan GSN het filament ook klieven. ABP’s

die zorgen voor depolymerisatie zijn de actin-depolymerizing factor (ADF)/cofiline eiwitten.

Actinefilamenten kunnen ook georganiseerd worden in hogere-orde netwerken, waarbij de

filamenten parallel aan elkaar gebundeld worden of waarbij vertakkingen gevormd worden

tussen de verschillende filamenten. Een voorbeeld van zo’n ABP dat helpt bij bundeling is

fascine (FSN). In andere gevallen doet actine dienst als mechanische ondersteuning. Zo

gebruikt myosine, een motorproteïne, actinefilamenten als een spoor waarover het beweegt

naar zijn doelorganel [53].

1.3.1.4 Actinerijke protrusies

Niet alleen de vorming van individuele filamenten maar ook van hogere-orde netwerken

wordt bewerkstelligd door ABP’s, zoals reeds aangehaald in voorgaand onderdeel.

Actinefilamenten vormen de basis voor verschillende celprotrusies, elk met hun eigen

functies.

Figuur 4: Actinerijke protrusies (figuur aangepast uit [52], [54]).

Lamellipodia en het lamellum bijvoorbeeld (Figuur 4, links) zijn bladvormige actinestructuren

die gevormd worden aan de zijde van de cel waar ze zich voortbeweegt (leading edge). Ze

bestaan elk uit een autonoom dendritisch netwerk van vertakte actinefilamenten. De

lamellipodia bevinden zich het meest distaal en het lamellum vormt de overgang naar de cel.

Een ander voorbeeld zijn de filopodia (Figuur 4, midden). Dit zijn vingervormige

actinestructuren die uitsteeksels vormen en zich ook ter hoogte van de leading edge

bevinden. Ze zijn vaak te vinden in de lamellipodiaregio. Ze zouden er functioneren als

directionele sensoren. Filopodia bestaan uit parallelgebundelde actinefilamenten. Een laatste

voorbeeld zijn de podosomen en invadopodia (Figuur 4, rechts). Deze structuren worden

samen vermeld omdat deze moeilijk van elkaar te onderscheiden zijn. Beide structuren

zorgen voor degradatie van de ECM en komen voor aan de ventrale zijde van de cel. Naast

deze zelfde functionaliteit, hebben ze ook een gelijkaardige compositie. Sommigen

argumenteren dan ook dat dit eigenlijk één en dezelfde structuren zijn. Podosomen zijn de

degraderende protrusies voorkomend in normale cellen (bv. macrofagen, dendritische cellen,

endotheelcellen en osteoclasten). Invadopodia zijn protrusies voorkomend in kankercellen

(sectie 1.3.3). Verschillen werden waargenomen in hun dynamiek. Podosomen hebben een

snelle turnover terwijl invadopodia uren stabiel blijven. Daarnaast zijn invadopodia ook langer

dan podosomen. Een lengte beperkt tot 2 µm is geldig voor podosomen terwijl invadopodia

langer dan 2 µm zijn. Er werd ook gesuggereerd dat invadopodia deel uitmaken van een

superstructuur waarbij vanuit een kern verschillende filamentachtige invadopodia

voortkomen. Dit werd niet gezien bij podosomen [52], [54].

21

1.3.2 Cortactine

Cortactine (CRN) is een activator van het Arp2/3 complex, zoals reeds aangehaald in sectie

1.3.1.3, en is o.a. hierdoor een regulator in de vorming van vertakte actinenetwerken. Deze

actinenetwerken zijn belangrijk in celbeweging en invasie via de vorming van actinerijke

protrusies (sectie 1.3.1.4).

Het aminoterminaal uiteinde van CRN (Figuur 5) bestaat uit een aminoterminaal zuur domein

(amino-terminal acidic, NTA) gevolgd door een tandem repeat domein, waaraan F-actine zal

binden. Aan het NTA domein bindt het Arp2/3 complex. Het carboxyterminaal uiteinde van

CRN (Figuur 5) bezit enkele fosforyleringsplaatsen en een Src homoloog 3 (SH3) domein.

Aan het SH3 domein binden verschillende cytoskelet eiwitten, membraantransport eiwitten

en signalisatie eiwitten. CRN doet zo dienst als scaffold tussen deze SH3 domeinbindende

eiwitten en het actinecytoskelet. CRN is een belangrijke regulator bij het vormen van vertakte

actinenetwerken. Het scaffold eiwit bindt Arp2/3 en F-actine en brengt zo beide eiwitten

samen. CRN kan op zich Arp2/3 activeren, maar er gebeurt ook regulatie door andere

actineregulerende eiwitten die aan het CRN SH3 domein binden [55]. Voor het WASP

interacting protein (WIP) bijvoorbeeld werd aangetoond dat dit tot een verhoogde activatie

van het Arp2/3 complex door CRN leidde wanneer gebonden aan het CRN SH3 domein [56].

In een andere studie werd ook bij binding van neuraal WASP (N-WASP, een lid van de

WASP familie) aan het CRN SH3 domein een verhoogde activiteit van het Arp2/3 complex

waargenomen. CRN en N-WASP zijn dus op zichzelf activators maar zullen elkaar

versterken wanneer N-WASP gebonden is aan CRN [57]. Daarbovenop zorgt CRN voor

stabilisatie van actinevertakkingen. CRN heeft dus via meerdere mechanismen een

regulerende rol bij het vormen van vertakte actinenetwerken [55].

Figuur 5: Schematische voorstelling van CRN met belangrijke domeinen. Enkele interactiepartners

belangrijk bij invadopodia (sectie 1.3.3) worden weergegeven. Opmerking: Y470 en Y486 corresponderen

met Y466 en Y482 in de muis. (Figuur aangepast uit [55]).

Een voorbeeld van actinerijke protrusies waarin CRN een belangrijke regulator is, zijn de

invadopodia. Op twee manieren is CRN essentieel tijdens invadopodiavorming. Enerzijds

helpt CRN bij het vormen van de initiële kern en bij actinepolymerisatie. Anderzijds reguleert

CRN membraantransport tijdens de rekrutering van proteasen [55]. Dit wordt verder

toegelicht in de volgende sectie.

22

1.3.3 Invadopodia

1.3.3.1 Inleiding

Invadopodia zijn actinerijke protrusies die gevormd worden door kankercellen. Deze

structuren bewerkstelligen metastase door afbraak van de ECM en basale membraan.

Hierdoor gebeurt intrede in de bloedvaten, wat intravasatie genoemd wordt. Op die manier

kunnen de kankercellen zich over het volledige lichaam verspreiden [58].

1.3.3.2 Precursorvorming

Om de vorming van invadopodia te initiëren is een stimulus nodig. Verschillende stimuli

kunnen initiatie bewerkstelligen:

- Inductie van de epitheel-mesenchym transitie (EMT): EMT is een belangrijk proces

tijdens de embryogenese. In dit proces zullen cellen mobieler worden, cel-cel contacten

verliezen en veranderen in hun binding met matrix componenten. Deze eigenschappen

zijn ook nodig voor invasie en metastase door tumorcellen en transcriptiefactoren die

EMT induceren, zijn eveneens belangrijk en actief in de inductie van invasie en

metastase. Twist1, een transcriptiefactor die EMT induceert, zal de transcriptie van

platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) induceren. Dit op zijn beurt resulteert in

Src (non-receptor tyrosine kinase)-activatie, wat leidt tot de vorming van invadopodia

[59]. Transforming growth factor (TGF)-β werd gerapporteerd als oncogeen waarbij het

EMT induceert en leidt tot een invasiever karakter van kankercellen. Het focaal

adhesieproteïne Hic-5 zou hierbij een belangrijke rol spelen en zijn fosforylering zou

afhankelijk zijn van Src [60].

- Hypoxie: Er werd aangetoond dat hypoxie invadopodiavorming induceert. Hypoxie zou

de epidermal growth factor receptor (EGFR)-pathway activeren waardoor op zijn beurt

histon deacetylase 6 (HDAC6) geactiveerd wordt. Deze activatie leidt tot hypoxie-

geïnduceerde invadopodiavorming [61]. In een andere studie werd aangetoond dat

hypoxie Notch-signalisatie induceert. Dit leidt tot heparin binding epidermal growth factor

(HB-EGF) vrijstelling via het metalloproteïnase ADAM12, wat op zijn beurt tot

invadopodiavorming leidt [62].

- Matrix metalloproteïnase (MMP) activiteit: Er is een positieve feedback-loop waarbij

afbraakproducten van de ECM de vorming van nieuwe invadopodia stimuleert [63].

- Groeifactoren: Uit voorgaande stimuli is duidelijk dat groeifactoren een belangrijke rol

spelen in het stimuleren van invadopodiavorming. Deze groeifactoren kunnen evenwel

autocrien vrijgesteld worden [64]. De EGFR-liganden zijn de best gekarakteriseerde

groeifactoren. Deze induceren precursorvorming en activeren pathways naar

actinepolymerisatie en matrixdegradatie. TGF-β en liganden van PDGFR daarentegen

induceren invadopodiavorming in normale cellen [65].

Ondanks de verschillende stimuli, lijken alle pathways te convergeren naar Cdc42, een

GTPase van de Rho familie. Verschillende guanine exchange factors (GEFs) die Cdc42

activeren werden gerapporteerd in context van invadopodiavorming, meer bepaald Vav1, β-

PIX en Fgd1. Elk van deze GEFs kan geactiveerd worden door het non-receptor tyrosine

kinase Src [65]. Dit en volgende stappen worden schematisch weergegeven in Figuur 6.

23

De initiële kern van het invadopodium bestaat uit actine, CRN, cofiline, N-WASP en het

Arp2/3 complex. Actine en CRN arriveren eerst op de plaats van initiatie waarbij CRN dienst

doet als scaffold waarop cofiline en N-WASP binden. Na vorming van deze initiële kern, bindt

het adaptoreiwit tyrosine kinase substraat met vijf SH3 domeinen Tks5 [66]. Tks5 bevat een

phox homoloog (PX) domein en vijf SH3 domeinen. Het derde SH3 domein zal interageren

met N-WASP [67]. Het PX domein bindt aan fosfatidylinositol lipiden, meer specifiek

fosfatidylinositol 3-fosfaat (PI(3)P) en fosfatidylinositol 3,4-bifosfaat (PI(3,4)P2). Het vijfde

SH3 domein interageert met enkele ADAM metalloproteïnasen [68]. 3 tot 4 minuten na

initiatie van de precursorvorming, is er een aanrijking van PI(3,4)P2 aan het plasma-

membraan. Hieraan zal Tks5 binden met zijn PX domein, wat zorgt voor stabilisatie van de

precursor [66], [69]. Er dient opgemerkt te worden dat Tks5 eerst als een scaffold

beschouwd werd dat de andere proteïnen, nodig voor precursorvorming, rekruteerde. In

plaats van deze rol in initiatie, toonde Sharma et al. echter aan dat Tks5 pas arriveerde na

vorming van de initiële kern, zoals hierboven beschreven [66], [70]. De aanrijking in PI(3,4)P2

is ten gevolge van de rekrutering van het fosfatase SH2 domain-containing inositol 5-

phosphatase 2 (SHIP2) of synaptojanin 2 aan de precursor, wat PI(3,4,5)P3 defosforyleert tot

PI(3,4)P2 [66], [69]. PI(3,4,5)P3 op zijn beurt zou het resultaat zijn van de fosforylering van

PI(4,5)P2 door fosfatidylinositol 3-kinase (PI-3K). Dit kinase zou geactiveerd worden door

groeifactoren [69]. In een volgende stap zal β1-integrine gerekruteerd worden, wat

geactiveerd werd doorheen de precursorvorming. Het zorgt voor verdere stabilisatie van de

precursor en triggert maturatie [71].

Figuur 6: Schematische voorstelling van de betrokken moleculen in precursorvorming.

1.3.3.3 Actinepolymerisatie

Het β1-integrine triggert maturatie via interactie met de nonreceptor tyrosine kinase Arg (Abl-

related gene). Voor de activatie van Arg is cross-talk met de EGFR nodig. Een model wordt

voorgesteld waarbij in een eerste stap β1-integrine bindt met Arg, waardoor deze laatste een

conformationele verandering ondergaat en een autofosforylering uitvoert van zijn

tyrosineresidue 272 (Y272). Arg verbreekt zo zijn inactieve conformatie. In een tweede stap

zal EGFR-activatie een Src-gemedieerde fosforylering van Arg op Y439 induceren waardoor

Arg volledig actief wordt [71]. Arg fosforyleert CRN op drie tyrosineresiduen (Y421, Y466,

Y482). De fosforylering van Y421 en Y466 in CRN leidt tot de rekrutering van het

adaptoreiwit non-catalytic region of tyrosine kinase 1 (Nck1), wat op zijn beurt N-WASP bindt

en zo helpt bij de activatie van het Arp2/3 complex door N-WASP [72]. Daarnaast zal de

fosforylering van CRN ervoor zorgen dat cofiline, gebonden aan CRN, vrijgesteld wordt.

Cofiline wordt op die manier geactiveerd en zal door zijn knipactiviteit vrije positieve

uiteinden creëren. Hierdoor zal Arp2/3-gemedieerde actinepolymerisatie gefaciliteerd

worden. CRN wordt nadien terug gedefosforyleerd zodanig dat cofiline opnieuw inactief

24

wordt, wat nodig is voor de stabilisatie van de invadopodium precursor [73] (Figuur 7).

Recenter werd een ander model voorgesteld voor de verbreking van de interactie tussen

cofiline en CRN. Het focale adhesieproteïne talin zou actine binden tijdens de vorming van

de precursor. Bij de start van de maturatie zal talin ook binden aan β1-integrine, wat leidt tot

een bijkomende stabilisatie. Deze binding leidt bovendien tot een sterke interactie tussen

talin en moesin. Moesin zal op zijn beurt sodium/hydrogen exchanger 1 (NHE-1) rekruteren.

Protonen worden getransporteerd naar buiten wat leidt tot verzuring van de ECM en in het

cytoplasma zal de pH stijgen. Deze stijging zorgt voor een verbreking van de inhibitorische

interactie tussen cofiline en CRN, waardoor cofiline vrije positieve uiteinden kan creëren [74]

(Figuur 7). Een derde mechanisme dat voor de regulatie van cofiline instaat, is via het Rho

GTPase RhoC. RhoC activeert LIMK via ROCK, waarbij LIMK cofiline zal fosforyleren.

Fosforylering inactiveert cofiline. De gefosforyleerde vorm is niet langer in staat om actine te

binden en dus om barbed ends te creëren. RhoC staat op zijn beurt onder de regulatie van

p190RhoGEF en p190RhoGAP (GTPase activating protein, GAP), een RhoC activator en

inactivator respectievelijk (Figuur 7). p190GEF is terug te vinden rondom het invadopodium,

terwijl p190GAP in de kern van het invadopodium aanwezig is. Buiten het invadopodium zal

RhoC dus geactiveerd worden waardoor cofiline hier niet actief zal zijn. In de kern van het

invadopodium daarentegen, is RhoC niet actief [75]. Aangezien in bepaalde cellijnen gezien

werd dat Arg p190RhoGAP kan fosforyleren/activeren onder de regulatie van β1-integrine,

wordt gesuggereerd dat β1-integrine een master regulator is van cofiline activiteit [65].

Figuur 7: Schematische voorstelling van de betrokken moleculen in actinepolymerisatie.

Naast het Arp2/3 complex, zijn ook eiwitten van de formine familie belangrijk in

actinepolymerisatie. Diaphanous-related formins (DRFs) werden gerapporteerd als zijnde

essentieel in de invadopodiavorming. Er wordt gesteld dat deze instaan voor de elongatie

van invadopodia [76]. Het actinebundelend eiwit fascine (FSN) is ook aanwezig in

invadopodia en heeft er o.a. een stabiliserende rol [77], [78]. Mena, een lid van de

enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) eiwitten, is een ander eiwit dat

met regulatie van actinepolymerisatie geassocieerd wordt. Een opregulatie van Mena werd

gezien bij invasieve kankercellen. Ook een splice isovorm van Mena (MenaINV) werd

teruggevonden bij een invasief karakter. Uit de studie blijkt dat vooral MenaINV een

belangrijke regulator is in invadopodiavorming. Het zorgt voor stabilisering van invadopodia,

reguleert de respons op EGF signalisatie en verhoogt beweeglijkheid [79].

25

Vanaf dat invadopodia een bepaalde lengte bereiken door actinepolymerisatie, werd gezien

dat ook microtubuli aanwezig zijn in invadopodia. Door hun rol in intracellulair transport en

ook door de aanwezigheid van vesikels in mature invadopodia, wordt gesteld dat deze

microtubuli specifieke eiwitten aanbrengen, zoals de MMP’s. In de latere stadia van mature

invadopodia werden ook intermediaire filamenten waargenomen. Deze zouden mechanische

stabiliteit verlenen [80].

1.3.3.4 Rekrutering proteasen

Een eerste groep belangrijk in invadopodiagemedieerde ECM degradatie zijn de matrix

metalloproteïnasen (MMP’s). Hierbij speelt het membrane type 1 matrix metalloproteinase

(MT1-MMP), ook wel aangeduid als MMP14, een centrale rol [81]. Enerzijds staat dit

protease zelf in voor degradatie van de ECM [82], anderzijds zal MT1-MMP twee andere

leden van de MMP’s activeren, namelijk MMP2 [83] en MMP9 [84]. Het is een

membraangebonden eiwit (cfr. membrane type) in tegenstelling tot MMP2 en MMP9, die

gesecreteerd worden in het extracellulaire milieu [81]. In de literatuur worden verschillende

routes beschreven waarlangs MT1-MMP wordt aangebracht. Bij een eerste route zal

interactie tussen IQGAP en het membraangebonden exocyst complex leiden tot rekrutering

van MT1-MMP vesikels. Deze interactie staat onder de controle van de Rho GTPasen Cdc42

en RhoA [85] (Figuur 8a). Het exocyst complex interageert ook met het Wiskott-Aldrich

syndrome protein and Scar homolog (WASH) eiwit, behorend tot de familie van Arp2/3

activators. WASH is aanwezig in welbepaalde subdomeinen van MT1-MMP-bevattende late

endosomen. WASH en het exocyst complex zouden samenwerken in de controle van de

verbinding tussen late endosomen en het plasmamembraan. Op die manier zou MT1-MMP

getarget worden naar het plasmamembraan ter hoogte van de invadopodia [86] (Figuur 8b).

Vervolgens zou het SNARE eiwit VAMP7 nodig zijn voor de fusie tussen de membranen [86],

[87]. CRN is ook betrokken in de regulatie en lokalisatie van MT1-MMP secretie ter hoogte

van invadopodia. Het eiwit is dus niet enkel belangrijk tijdens de vorming van invadopodia

maar ook voor hun functionaliteit. Bovendien speelt CRN een rol in de secretie van MMP2 en

MMP9 [63], [78] (Figuur 8c). Daarnaast wordt MT1-MMP activiteit geregeld door endocytose.

Cdc42 interacting protein 4 (CIP4) stimuleert endocytose en zal dus zorgen voor

verminderde ECM degradatie. CIP4 (en bijgevolg ook endocytose) wordt geïnhibeerd door

Src-gemedieerde fosforylering van CIP4 [88]. Endocytose van MT1-MMP wordt ook

verhinderd door β1-integrine [89]. Integrinen spelen eveneens mee in een laatste route voor

rekrutering van MT1-MMP. Door adhesie van integrinen aan collageen zou MT1-MMP

gemobiliseerd worden via een RAB8-afhankelijke secretorische pathway [90] (Figuur 8d).

Naast de MMP’s spelen ook andere proteasen mee in ECM degradatie. A disintegrin and

metalloproteinase (ADAM) familie proteasen dragen hiertoe bij [82]. Naast de protease

activiteit, kan ADAM binden aan Tks5 en werd ADAM12 reeds vermeld met een rol in

precursorvorming onder invloed van hypoxie (sectie 1.3.3.2). Een laatste groep die bijdraagt

tot ECM degradatie zijn de serine proteasen, waaronder seprase [82].

26

Figuur 8: Schematische voorstelling van de betrokken moleculen in rekrutering proteasen.

1.3.3.5 Verband tussen invadopodia en exosomen

Hoshino et al. suggereerde een nauw verband tussen invadopodia en exosomen. Eerst werd

aangetoond dat MVE’s dynamisch associëren met invadopodia [91]. Dat MVE’s (of anders

late endosomen) associëren met invadopodia, werd terzelfdertijd ook aangetoond door

Monteiro et al. [86] (sectie 1.3.3.4). Vervolgens werd de invloed van exosomen op

invadopodia bekeken. Hierbij werd aangetoond dat exosoomsecretie essentieel is voor zowel

vorming als functie van de invadopodia. Er werd gepostuleerd dat invadopodiamaturatie en

ECM degradatie afhankelijk zijn van de aanvoer van MT1-MMP (en mogelijks ook andere

proteasen) via exosomen, waarbij het MT1-MMP zich in het membraan van het exosoom

bevindt. Bovendien werd waargenomen dat toevoeging van opgezuiverde exosomen de

vorming van invadopodia kan induceren. Daarnaast werd de invloed van invadopodia op

exosoomsecretie bestudeerd. Hierbij werd verondersteld dat invadopodia essentiële docking

sites zijn voor MVE’s en dat de aanwezigheid van invadopodia nodig is voor

exosoomsecretie [91]. Dit alles leidde tot de conclusie dat er een mogelijk verband bestaat

tussen invadopodia en exosomen.

27

1.4 Nanobodies

Figuur 9: Conventioneel antilichaam (links), zware keten antilichaam (midden) en nanobody met

bijhorende eigenschappen (rechts) (figuur aangepast uit [92]).

Leden van de Camelidae-familie (bv. kamelen, lama’s en alpaca’s) bezitten naast

conventionele antilichamen, zoals ook bij de mens aanwezig, antilichamen zonder een lichte

keten (of zware keten antilichamen). Conventionele antilichamen (Figuur 9, links) bestaan

enerzijds uit een zware keten met vier domeinen waarvan één domein (N-terminus) variabel

is (VH) en de drie andere constant zijn (CH). Anderzijds bezit het antilichaam ook een lichte

keten bestaande uit twee domeinen, waarvan één variabel (VL) en één constant domein (CL).

De variabele domeinen van beide ketens samen met het eerste constante domein van de

zware keten en het constante domein van de lichte keten vormen samen het

antigeenbindend fragment (Fab-fragment). De twee overige constante domeinen van de

zware keten zijn belangrijk in het rekruteren van de immuuncellen en voor effector functies

(FC-fragment). Zware keten antilichamen (Figuur 9, midden) bestaan uit tweemaal één

variabel (variable domain of heavy chain of heavy chain antibodies, VHH) en twee constante

domeinen (CH). Deze eenvoudigere structuren zijn ook volledig functioneel waarbij het

variabele domein equivalent is aan Fab in het conventionele antilichaam. Wanneer deze

variabele domeinen geïsoleerd worden, blijven ze stabiel en behouden ze hun

antigeenbindend vermogen. Deze geïsoleerde variabele domeinen worden nanobodies

(Nbs) (Figuur 9, rechts) genoemd. Ablynx is een biofarmaceutisch bedrijf dat deze Nbs

ontwikkelt [92], [93].

Het screeningsproces start met het immuniseren van kamelen of lama’s met antigenen.

Bloed wordt afgenomen en de lymfocyten worden hieruit geïsoleerd. Hierna wordt het mRNA

uit de lymfocyten geëxtraheerd om te vermenigvuldigen en om te zetten naar cDNA via RT-

PCR. Dit cDNA wordt dan gekloneerd in een faagdisplay vector om hiermee E. coli te

transformeren en een bank aan te maken (tot ca. 107 transformanten). Deze bank wordt

vervolgens gescreend op binding tussen Nb en zijn ligand (antigeen) via panning. Na twee of

drie rondes van panning zijn de antigeenspecifieke klonen voldoende aangerijkt om

hieropvolgend een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uit te voeren. Met behulp

van ELISA worden de individuele klonen gescreend op de productie van antigeenspecifieke

Nbs. Op dit punt kan overgegaan worden tot productie van de Nbs. Hiervoor worden de Nbs

gekloneerd in een microbieel systeem voor fermentatie [93], [94].

28

Nbs kunnen gemakkelijk in microbiële systemen geproduceerd worden (milligram

hoeveelheden). Andere voordelen zijn de kleine omvang die ervoor zorgt dat ze op moeilijk

bereikbare plaatsen kunnen raken en hun hoge affiniteit en specificiteit voor hun doelwit. Ze

zijn robuust en kunnen lange tijd bewaard worden zonder hun antigeenbindend vermogen te

verliezen (enkele weken bij 37°C, enkele maanden bij 4°C en langer bij -20°C). Daarnaast

zijn ze niet-immunogeen o.a. door homologie met het variabele domein van de zware keten

van het humane antilichaam [92]–[94].

Eigenschappen van Nbs kunnen aangepast worden naar wens. Zo kunnen bijvoorbeeld

meerdere Nbs gecrosslinked worden om de specificiteit te verhogen of de kritieke

concentratie, nodig voor het gewenste effect, te verlagen. Deze samenvoeging gebeurt via

glycine-serine linkers van de C-terminus naar de N-terminus [95]. Ook kunnen aanpassingen

gemaakt worden om de halfwaardetijd te veranderen. Zo kunnen Nbs bijvoorbeeld gebonden

worden aan albumine [96].

Nbs vinden toepassingen als geneesmiddel maar kunnen ook gebruikt worden in diagnostiek

en onderzoek. Als geneesmiddel vinden Nbs toepassingen in heel wat verschillende takken

zoals hematologie, ademhalingsziekten, immunologie, oncologie en botziekten. Reeds in

klinische trial is Caplacizumab (anti-vWF Nanobody), dat een toepassing heeft in

trombotische trombocytopenische purpura (TTP) [94]. TTP is een zeldzame bloedziekte

waarbij microthrombie gevormd worden, wat kan leiden tot verstopping van kleine

bloedvaten en onvoldoende bloedtoevoer naar organen. De von Willebrand factor (vWF)

speelt hierin een belangrijke rol. Deze vormt multimeren (Ultra-Large vWF) en zal vervolgens

bloedplaatjes binden aan zijn A1-domein, wat leidt tot bloedklontervorming. In gezonde

individuen worden deze multimeren geknipt door het enzym ADAMTS13. Bij individuen die

leiden aan TTP is dit enzym defect. Caplacizumab bindt aan het A1-domein waardoor

binding van bloedplaatjes en aggregaatvorming verhinderd wordt [97]. Een toepassing van

Nbs binnen de diagnostiek is radiolabeling van een Nb voor gebruik in positron emissie

tomografie (PET). Dit werd onderzocht voor de niet-invasieve detectie van aderverkalking

[98]. Ook als biosensor of koppeling aan magnetische nanopartikels zijn toepassingen

bekend [93]. Als laatste kunnen Nbs een handige tool zijn in fundamenteel onderzoek. Zo

kunnen Nbs aangewend worden om functies van structurele eiwitten te onderzoeken, een

techniek complementair met RNAi [99]. Zo werden recent Nbs gebruikt om de functie van

actinebindende eiwitten te onderzoeken [78], [100]. In deze thesis worden gekarakteriseerde

CRN Nbs aangewend om de rol van CRN in exosoomvorming te bestuderen.

29

2 Materialen en methoden

2.1 Verband tussen cortactine en exosomen

2.1.1 Exosoomsecretie na inhibitie cortactine met nanobodies

2.1.1.1 Celcultuur

MDA-MB-231 parentale humane borstkankercellen werden gebruikt. Daarnaast werd ook

gebruikgemaakt van stabiele CRN NTA Nb2-EGFP en CRN SH3 Nb2-EGFP MDA-MB-231

borstkankercellen. De genen, coderend voor deze EGFP-getaggeerde Nbs, werden

binnengebracht in MDA cellen via transductie. Expressie van de Nbs wordt geïnduceerd door

toevoeging van doxycycline (dox, Addendum Figuur 1). Alle cellijnen werden opgegroeid in

DMEM waaraan 10% foetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL

streptomycine werd toegevoegd. De cellen werden geïncubeerd bij 37 °C en 10% CO2.

2.1.1.2 Antilichamen

Voor Western blot werd gebruikgemaakt van de volgende primaire antilichamen: konijn

monoklonaal anti-CD63 (1:1000, ab134045, Abcam), konijn polyklonaal anti-golgin 245

(1:1000, sc-102565, Santa Cruz), muis monoklonaal anti-cytochroom C (1:1000, ab13575,

Abcam), konijn polyklonaal anti-calnexine (1:1000, sc-11397, Santa Cruz) en konijn

polyklonaal anti-PMP70 (1:1000, ab85550, Abcam). Als secundaire antilichamen werden

horseradish peroxidase-linked anti-muis en anti-konijn van GE Healthcare aan een

verdunning van 1:2000 gebruikt. Alle verdunningen gebeurden in 5% melkoplossing (5%

mager melkpoeder in Tris buffered saline met 1% Tween20, afgekort TBS-T).

2.1.1.3 OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie

Ter voorbereiding werd een grote hoeveelheid cellen opgegroeid. Hiervoor werden vijf T175

celcultuurflessen per conditie aangelegd.

- Dag 1: Exosomen afkomstig van FBS werden weggewassen. Hiervoor werden de T175

celcultuurflessen driemaal gewassen met serumvrij medium (DMEM met 100 U/mL

penicilline en 100 µg/mL streptomycine). Vervolgens werd 10 mL serumvrij medium

toegevoegd aan elke cultuurfles. Twee condities werden meegenomen. Enerzijds bleven

vijf T175 celcultuurflessen onbehandeld (- dox). Anderzijds werd er aan vijf andere

doxycycline toegevoegd aan een verdunning van 1:4000 (+ dox). De cellen werden

daarna gedurende 24 h geïncubeerd bij 37 °C en 10% CO2.

- Dag 2: Na 24 h werd het medium, dat de exosomen bevat, afgenomen en verzameld per

conditie (- dox, + dox). Vers serumvrij medium (- dox of + dox) werd toegevoegd. Het

afgenomen medium werd gecentrifugeerd gedurende 4 min aan 800 rpm ter verwijdering

van cellen en debris. Daarna werd het medium achtereenvolgens gefilterd doorheen een

0,45 µm en 0,22 µm filtermembraan, ter verwijdering van grotere vesikels en het overige

debris.

- Dag 3: Na 48 h werd het medium met de exosomen een tweede maal afgenomen waarna

dezelfde centrifugatie en tweevoudige filtratie werd uitgevoerd. Na het medium

afgenomen te hebben, werden de cellen getrypsiniseerd en geteld met een Bürker

telkamer. De exosomen werden na filtratie opgeconcentreerd waarvoor de Amicon Ultra-

15 Centrifugal Filter Unit (Millipore) met een nominaal moleculair gewicht limiet van

10 kDa gebruikt werd. Het gefilterde medium werd gediafiltreerd (4000 x g bij 4 °C) tot een

volume kleiner dan 500 µL bekomen werd. Deze opgeconcentreerde exosomen werden

30

vervolgens geladen op een discontinue iodixanolgradiënt. Deze gradiënt bestond uit 3 mL

40% iodixanoloplossing, 3 mL 20% iodixanoloplossing, 3 mL 10% iodixanoloplossing en

2,5 mL 5% iodixanoloplossing aangebracht in een 12 mL polyallomeer tube (Beckman

Coulter). Deze oplossingen werden bekomen door het mengen van een iodixanol working

solution met een homogenization buffer (0,25 M sucrose, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCL

pH 7,4). De working solution bestond uit een working buffer (0,25 M sucrose, 6 mM,

EDTA, 60 mM Tris-HCl pH 7,4) en een stockoplossing OptiPrep (60% (w/v) iodixanol

oplossing). Na het laden van de exosomen op de gradiënt werd dit gecentrifugeerd

gedurende 18 h aan 100 000 x g bij 4 °C (SW41Ti rotor, Beckman Coulter).

- Dag 4: Fracties van 1 mL werden afgenomen en opgelost in 10 mL phosphate buffered

saline (PBS, zonder Ca2+ en Mg2+) in een 12 mL polyallomeer tube (Beckman Coulter). De

fracties werden daarna gedurende 3 h gecentrifugeerd aan 100 000 x g bij 4 °C (SW41Ti

rotor, Beckman Coulter). De verkregen pellet werd geresuspendeerd in 50 µL PBS en

uitverdeeld over drie volumes, meer bepaald 5 µL, 20 µL en 25 µL. Dit werd bewaard

bij - 80 °C.

2.1.1.4 Western blot

Om te weten in welke fracties, verkregen na de OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie,

exosomen aanwezig waren, werd aan de 5 µL fracties 1,5 µL 5x sample buffer (5% SDS,

20% glycerol, 0,2% broomfenolblauw, 5% -mercapto-ethanol, 65 mM Tris-HCl) toegevoegd.

De fracties werden geladen op een 10% polyacrylamidegel. Ook werd er 60 µg ruw extract

(gelyseerde parentale MDA cellen) waaraan 5x sample buffer werd toegevoegd, geladen.

Vervolgens werd SDS-PAGE (40 mA) uitgevoerd waarbij gebruikgemaakt werd van een Tris-

glycine running buffer. Na scheiding werden de eiwitten getransfereerd naar een

nitrocellulosemembraan. Het blotten werd gedurende 3 h aan 45 V of overnacht aan 25 V

uitgevoerd. Dan werden de membranen gedurende 1 h geblokkeerd in 5% melkoplossing

waarna overnacht geïncubeerd werd met het primair antilichaam (anti-CD63) op een rotor bij

4 °C. Incubatie met het secundaire antilichaam gebeurde gedurende 1 h op een rotor bij

kamertemperatuur nadat de membranen eerst gewassen werden met TBS-T (3 x 4 min). Na

de incubatie werd opnieuw een wasstap met TBS-T (3 x 4 min) uitgevoerd en werden de

membranen ontwikkeld. Hiervoor werden de membranen gedurende 1 min geïncubeerd met

een oplossing van 50% peroxide solution (detection reagent 1, Thermo Scientific) en 50%

luminol enhancer solution (detection reagent 2, Thermo Scientific). De detectiereagentia

reageren met behulp van het horseradish peroxidase gelinkt aan het secundaire antilichaam

en geven daarbij licht vrij. Dit lichtsignaal werd vastgelegd op een chemiluminescentie

detectiefilm (Amersham Hyperfilm ECL).

Voor het nagaan van de zuiverheid van de exosoombevattende fracties, werden alle 25 µL

fracties van één OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie-reeks onderworpen aan

badsonicatie gedurende 1 h voorafgaand aan SDS-PAGE. Aan de fracties werd 7 µL 5x

sample buffer toegevoegd. Ook hier werd ruw extract meegenomen. Voor het blotten werd

het programma van 3 h (45 V) gebruikt. Het nitrocellulosemembraan werd geknipt ter hoogte

van 25 kDa alvorens te incuberen met de primaire antilichamen. Incubatie van de bovenste

helft (>25 kDa) gebeurde met anti-golgin 245 en incubatie van de onderste helft (

31

2.1.1.5 Exosoomkwantificatie via nanoparticle tracking analysis

Aan de hand van een Western blot werd bepaald in welke fracties exosomen aanwezig

waren. In deze fracties werd het aantal exosomen bepaald via nanoparticle tracking analysis

(NTA). NTA werd uitgevoerd gebruikmakend van de NanoSight LM10-HS met een violet

(405 nm) lasersysteem. De exosoomfracties werden verdund in PBS opdat de concentratie

binnen het lineaire gebied van de standaardcurve zou vallen (3 x 108 – 1 x 109 partikels/mL).

Per staal werden drie video’s van 30 s opgenomen waarbij de temperatuur telkens

bijgehouden werd. De video’s werden vervolgens geanalyseerd (concentratie partikels per ml

en grootte) met de NTA software. Uit de concentratie partikels per ml kon dan het aantal

exosomen per cel berekend worden.

2.1.1.6 Statistische analyse

Voor elke cellijn werden drie herhalingen uitgevoerd. Normaliteit werd nagegaan met de

Kolmogorov-

Tumorcel exosoombiogenese en het actine cytoskelet ......Academiejaar 2015 – 2016 Tumorcel...

Documents

Transcript of Tumorcel exosoombiogenese en het actine cytoskelet ......Academiejaar 2015 – 2016 Tumorcel...