Dia 1

Susceptibiliteitsbepaling van planktonische en sessiele Burkholderia cepacia complex cellen Katrien De Visschere

Dia 2

Inleiding Burkholderia cepacia complex: Burkholderia cepacia complex: 17 nauw verwante species 17 nauw verwante species Gram-negatieve bacterin Gram-negatieve bacterin Kunnen ernstige infecties veroorzaken bij mucoviscidosepatinten Kunnen ernstige infecties veroorzaken bij mucoviscidosepatinten Behandeling moeilijk door grote resistentie Behandeling moeilijk door grote resistentie stammen vormen goed biofilms verhoogde resistentie stammen vormen goed biofilms verhoogde resistentie

Dia 3

Inleiding Mucoviscidose Mucoviscidose Autosomaal recessieve aandoening Autosomaal recessieve aandoening Ongeneeslijk Ongeneeslijk Secreties van kliercellen zijn minder vloeibaar o.a. problemen met luchtwegen en spijsvertering Secreties van kliercellen zijn minder vloeibaar o.a. problemen met luchtwegen en spijsvertering Infectie met B. cepacia complex bacterin: cepacia syndroom : dodelijk geleidelijk achteruitgang in longfunctie Infectie met B. cepacia complex bacterin: cepacia syndroom : dodelijk geleidelijk achteruitgang in longfunctie

Dia 4

Inleiding Biofilms Biofilms Microbile gemeenschap van sessiele cellen Microbile gemeenschap van sessiele cellen Vastgehecht op een substraat, een oppervlak of aan elkaar Vastgehecht op een substraat, een oppervlak of aan elkaar Ingebed in een extracellulaire matrix Ingebed in een extracellulaire matrix Sessiele cellen vertonen in het algemeen een grotere resistentie tegen antimicrobile agentia dan planktonische cellen Sessiele cellen vertonen in het algemeen een grotere resistentie tegen antimicrobile agentia dan planktonische cellen

Dia 5

Onderzoek Wat? Wat? Gevoeligheid van planktonische cellen en sessiele cellen (biofilms) van 33 Burkholderia cepacia complex stammen t.o.v. 6 antibiotica bepalen ceftazidime, ciprofloxacine, meropenem, minocycline, tobramycine, trimethoprim-sulfamethoxazole (1-19) Gevoeligheid van planktonische cellen en sessiele cellen (biofilms) van 33 Burkholderia cepacia complex stammen t.o.v. 6 antibiotica bepalen ceftazidime, ciprofloxacine, meropenem, minocycline, tobramycine, trimethoprim-sulfamethoxazole (1-19) Experimenten op jonge en oude culturen Experimenten op jonge en oude culturen Planktonische cellen Planktonische cellen Jonge culturen: minimaal inhiberende concentratie (MIC) Jonge culturen: minimaal inhiberende concentratie (MIC) Oude culturen: afdoding stationaire fase cultuur Oude culturen: afdoding stationaire fase cultuur Sessiele cellen Sessiele cellen Jonge culturen: minimaal biofilm inhiberende concentratie (MBIC) Jonge culturen: minimaal biofilm inhiberende concentratie (MBIC) Oude culturen: afdoding mature biofilm Oude culturen: afdoding mature biofilm

Dia 6

Onderzoek Waarom? Waarom? Vergelijken groei-inhibitie bij jonge planktonische cellen en biofilms door antibiotica Vergelijken groei-inhibitie bij jonge planktonische cellen en biofilms door antibiotica Vergelijken afdoding van planktonische cellen in de stationaire fase en mature biofilms door antibiotica Vergelijken afdoding van planktonische cellen in de stationaire fase en mature biofilms door antibiotica

Dia 7

Methoden Jonge planktonische cellen: Verse reincultuur kiemsuspensie (OD: 0,05) in MH 1x 50x verdunnen Kuipjes van antibiotica-microtiterplaat (96 kuipjes, bodem: plat) vullen met MH 1x en verdunde kiemsuspensie 20u incubatie (37C) Absorptie in elk kuipje meten met VICTOR 2TM Bepaling minimaal inhiberende concentratie (MIC) Kuipjes zonder groei 100L uitplaten (strijkplaatmethode) Na 48u incubatie (37C): groei nagaan Bepaling minimaal bactericide concentratie (MBC)

Dia 8

Methoden Jonge biofilms: Verse reincultuur startsuspensie in MH 1x Nacht incubatie in warmwaterbad (37C) Startsuspensie werksuspensie (OD: 0,05) Kuipjes van microtiterplaat (96 kuipjes, bodem: rond) vullen met MH 1x en werksuspensie (100L) 4u incubatie (37C) 3x spoelen met fysiologisch water Kuipjes vullen met 100L MH 2x Antibiotica toevoegen (100L)

Dia 9

Methoden Jonge biofilms: 20u incubatie (37C) Spoelen met fysiologisch water CellTiterBlue toevoegen (detectie levende cellen) 1u incubatie (37C) Fluorescentie meten met VICTOR 2TM Bepalen minimaal biofilm inhiberende concentratie (MBIC)

Dia 10

Methoden Mature biofilms: Verse reincultuur kiemsuspensie in MH 1x Nacht incubatie in warmwaterbad (37C) Kiemsuspensie startsuspensie (OD: 0,05) Siliconeschijfjes in microtiterplaat (24 kuipjes) brengen Kuipjes vullen met MH 1x en startsuspensie 4u incubatie (37C) 3x spoelen met fysiologisch water Kuipjes vullen met MH 1x 20u incubatie (37C) 3x spoelen met fysiologisch water

Dia 11

Methoden Mature biofilms: Overbrengen in antibiotica-microtiterplaat concentraties antibiotica: 10 x MIC, tobramycine: 4 x MIC 20u incubatie (37C) 3 x wassen met fysiologisch water Schijfjes overbrengen in falconbuisjes Buisjes 3 x vortexen en soniceren (cellen losmaken) Kiemsuspensie wordt 7 maal 1:10 verdund 1mL per verdunning uitplaten (plaatgietmethode) Kolonies tellen na 48u incubatie Bepalen reducties in log(KVE)/schijfje

Dia 12

Resultaten: MIC MIC vs. de klinisch haalbare antibioticaconcentratie in het sputum van mucoviscidosepatinten (KHCS) MIC vs. de klinisch haalbare antibioticaconcentratie in het sputum van mucoviscidosepatinten (KHCS) MIC KHCS MIC > KHCS ceftazidime63,7%36,4% ciprofloxacine50,0%50,0% meropenem63,6%36,4% minocycline87,9%12,1% tobramycine92,4%7,6% TMP-SMX (1-19) 21,278,8%

Dia 13

Resultaten: MBC Hoe verhoudt de MBC zich tot de MIC? Hoe verhoudt de MBC zich tot de MIC? Grote spreiding MBC t.o.v. MIC Grote spreiding MBC t.o.v. MIC uitzondering: tobramycine (kleine spreiding) mediaanspreiding ceftazidime4 1 - 64 ciprofloxacine2 1 - 32 meropenem 2 - 4 1 - 64 minocycline32 1 - 512 tobramycine2 1 - 4 TMP-SMX (1-19) 8 1 - 64

Dia 14

Relatie MBIC vs. MIC: Relatie MBIC vs. MIC: De MBICs zijn vergelijkbaar met de MICs voor het grootste deel van de stammen De MBICs zijn vergelijkbaar met de MICs voor het grootste deel van de stammen MBIC vergeleken met MIC MBIC < 1/2 x MIC 1/2 x MIC MBIC 2 x MIC MBIC > 2 x MIC ceftazidime21,2%75,8%3,0% ciprofloxacine0,0%84,8%15,2% meropenem9,1%78,8%12,1% minocycline1,5%77,3%21,2% tobramycine6,1%80,3%13,6% TMP-SMX (1-19) 9,1%71,2%29,7%

Dia 15

Reductie in aantal cellen bij mature biofilms De onderzochte antibiotica veroorzaken bij alle stammen reductie De onderzochte antibiotica veroorzaken bij alle stammen reductie Mate van reductie: vertoont een grote variatie Mate van reductie: vertoont een grote variatie Tobramycine is het meest werkzame antibioticum met een paar uitzonderingen Tobramycine is het meest werkzame antibioticum met een paar uitzonderingen Mate van biofilmvorming , cellen die overblijven na behandeling met antibiotica Mate van biofilmvorming , cellen die overblijven na behandeling met antibiotica B. multivorans LMG 13010 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 groeicontrole ceftazidime ciprofloxacine meropenem minocycline tobramycine TMP-SMX aantal cellen (log(KVE)/schijfje) B. pyrrocinia LMG 14191 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 groeicontrole ceftazidime ciprofloxacine meropenem minocycline tobramycine TMP-SMX aantal cellen (log(KVE)/schijfje)

Dia 16

Conclusie Jonge culturen Jonge culturen MIC: vergelijking met klinisch haalbare antibioticaconcentratie in het sputum van mucoviscidosepatinten: voor veel antibiotica is deze concentratie onvoldoende om groei-inhibitie te veroorzaken MIC: vergelijking met klinisch haalbare antibioticaconcentratie in het sputum van mucoviscidosepatinten: voor veel antibiotica is deze concentratie onvoldoende om groei-inhibitie te veroorzaken MBC: variabel t.o.v. MIC (uitzondering: tobramycine) MBC: variabel t.o.v. MIC (uitzondering: tobramycine) MBIC: vergelijkbaar met MIC bijna alle MBICs liggen binnen de range [1/2 2] x MIC MBIC: vergelijkbaar met MIC bijna alle MBICs liggen binnen de range [1/2 2] x MIC

Dia 17

Conclusie Oude culturen Oude culturen Reductie in aantal cellen bij mature biofilms: vertoont een grote variatie tobramycine is het meest werkzame antibioticum mate van biofilmvorming , cellen die overblijven na behandeling met antibiotica Reductie in aantal cellen bij mature biofilms: vertoont een grote variatie tobramycine is het meest werkzame antibioticum mate van biofilmvorming , cellen die overblijven na behandeling met antibiotica

Dia 18

Toekomstperspectieven Experimenten op planktonische cellen in een stationaire fasecultuur moeten nog uitgevoerd worden: Experimenten op planktonische cellen in een stationaire fasecultuur moeten nog uitgevoerd worden: Antibioticaconcentraties: 10 x MIC, behalve tobramycine: 4 x MIC Antibioticaconcentraties: 10 x MIC, behalve tobramycine: 4 x MIC

Dia 19

Met dank aan: Prof. Nelis en Prof. Coenye Apr. E. Peeters Apr. B. Quartier

Dia 20

Zijn er nog vragen?