REGULATIE VAN SEIZOENSGEBONDEN VOORTPLANTING BIJ DE...
36
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2015-2016 REGULATIE VAN SEIZOENSGEBONDEN VOORTPLANTING BIJ DE GROTE HUISDIEREN (HENGST EN RAM) MET NADRUK OP DE LANGE TERMIJN EFFECTEN VAN HET TIJDELIJK ONDERDRUKKEN VAN SPERMATOGENESE Door Emily CAPPELLE Promotoren: Prof. Dr. Peter Daels Literatuurstudie in het kader Dr. Eline Wydooghe van de Masterproef © 2016 Emily Cappelle
Transcript of REGULATIE VAN SEIZOENSGEBONDEN VOORTPLANTING BIJ DE...
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2015-2016
REGULATIE VAN SEIZOENSGEBONDEN VOORTPLANTING BIJ DE GROTE HUISDIEREN (HENGST EN RAM) MET NADRUK OP DE LANGE
TERMIJN EFFECTEN VAN HET TIJDELIJK ONDERDRUKKEN VAN SPERMATOGENESE
Door
Emily CAPPELLE
Promotoren: Prof. Dr. Peter Daels Literatuurstudie in het kader
Dr. Eline Wydooghe van de Masterproef
© 2016 Emily Cappelle
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of
volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen
inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor
enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig
vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2015-2016
REGULATIE VAN SEIZOENSGEBONDEN VOORTPLANTING BIJ DE GROTE HUISDIEREN (HENGST EN RAM) MET NADRUK OP DE LANGE
TERMIJN EFFECTEN VAN HET TIJDELIJK ONDERDRUKKEN VAN SPERMATOGENESE
Door
Emily CAPPELLE
Promotoren: Prof. Dr. Peter Daels Literatuurstudie in het kader
Dr. Eline Wydooghe van de Masterproef
© 2016 Emily Cappelle
VOORWOORD
Graag zou ik mijn hoofdpromotor Prof. Dr. Peter Daels willen bedanken voor de kans die hij mij bood
om dit onderwerp uit te werken. Ondanks zijn drukke agenda was hij steeds bereid mij te helpen om
alles tot een goed einde te kunnen brengen. Eveneens zou ik mijn copromotor Dr. Eline Wydooghe
willen bedanken voor haar bijdrage en interesse in deze literatuurstudie.
Grote dank ook aan mijn zus Cynthia die, ondanks de vele uren werk die ik haar soms bezorgde met
het nalezen van mijn literatuurstudie, altijd paraat bleef staan om mij te helpen. Mijn ouders zou ik ook
willen bedanken omdat ze, hoewel ze aangaven niet te begrijpen waarover ik schreef, steeds bereid
waren hulp te bieden en mij te steunen. Als laatste zou ik mijn vrienden willen bedanken voor de vele
peptalks en morele steun tijdens de soms lange dagen (en nachten) werk aan deze literatuurstudie.
VOORBLAD
TITELBLAD
VOORWOORD
INHOUDSOPGAVE
SAMENVATTING ..................................................................................................................... 1
INLEIDING ............................................................................................................................... 2
LITERATUURSTUDIE .............................................................................................................. 3
1 SPERMATOGENESE BIJ HENGST EN RAM ................................................................ 3 1.1 INWENDIGE STRUCTUUR VAN DE TESTES .................................................................................... 3
1.2 VAN SPERMATOGONIA TOT SPERMATOZOA ................................................................................. 4
2 FYSIOLOGIE VAN HET GESSLACHTSAPPARAAT BIJ HENGST EN RAM ................. 4 2.1 PARACRIENE EN AUTOCRIENE REGULATIE ................................................................................... 5
2.1.1 Testosteron .................................................................................................................................... 5 2.1.2 Oestrogenen .................................................................................................................................. 6 2.1.3 Inhibine ........................................................................................................................................... 7
2.2 ENDOCRIENE REGULATIE ................................................................................................................. 7 2.2.1 Gonadotropin-releasing hormone (GnRH) ..................................................................................... 7 2.2.2 Luteïniserend hormoon (LH) .......................................................................................................... 8 2.2.3 Follikelstimulerend hormoon (FSH) ................................................................................................ 8
2.3 SEIZOENSGEBONDEN VOORTPLANTING ....................................................................................... 8 2.3.1 Seizoensgebonden verschillen ...................................................................................................... 8 2.3.2 Fotoperiodische controle van de voortplanting ............................................................................ 10
3 TIJDELIJKE ONDERDRUKKINGSMECHANISMEN VAN DE SPERMATOGENESE BIJ
DE HENGST ....................................................................................................................... 11 3.1 WAAROM GONADALE SUPPRESSIE BIJ DE HENGST? ................................................................ 12 3.2 PROGESTAGENEN ........................................................................................................................... 12 3.3 GNRH AGONISTEN ........................................................................................................................... 15 3.4 GNRH ANTAGONISTEN .................................................................................................................... 16 3.5 VACCINATIE TEGEN GNRH ............................................................................................................. 17 3.6 KISS1 GEN ALS MOGELIJK DOELWIT VOOR EEN DNA-IMMUNOCASTRATIE VACCIN ............. 20
3.6.1 Wat is het KISS1 gen? ................................................................................................................. 20 3.6.2 Vaccinatie tegen KISS1 gen bij de ram ........................................................................................ 20
3.7 KRUIDENPREPARATEN ................................................................................................................... 22 3.7.1 Epigallocatechine-3-gallaat .......................................................................................................... 22
BESPREKING ........................................................................................................................ 24
REFERENTIELIJST ............................................................................................................... 25
1
SAMENVATTING
Alsmaar meer stijgt de vraag naar het gebruik van technieken voor het tijdelijk onderdrukken van de
spermatogenese bij de hengst. Via deze technieken kan immers een gonadale suppressie, met
bijhorende verminderde seksuele activiteit en agressief gedrag, bekomen worden die reversibel is in
tegenstelling tot bij het toepassen van chirurgische castratie.
De fysiologie van de voortplanting bij de grote huisdieren (hengst en ram) kan als model gebruikt
worden voor de artificiële tijdelijke onderdrukkingsmechanismen. Hengst en ram kennen namelijk van
nature uit een seizoensgebonden voortplanting, beperkt tot een bepaalde periode van het jaar, met
een gedaalde gonadale activiteit buiten hun voortplantingsseizoen. Deze gonadale suppressie herstelt
zich volledig bij aanzet van hun volgende voortplantingsseizoen. Het gebruik van progestagenen,
GnRH agonisten, GnRH antagonisten en vaccins tegen GnRH zijn reeds onderzochte technieken om
op een artificiële manier een tijdelijke gonadale suppressie te bewerkstelligen bij de hengst.
Vaccinatie tegen het KISS1 gen en het gebruik van het natuurlijke groene thee extract
epigallocatechine-3-gallaat hebben reeds een gelijkaardige suppressieve werking bij andere dieren
bewezen. Deze laatst vermelde technieken zijn tot op de dag van vandaag nog niet toegepast bij de
hengst, maar zouden als mogelijk alternatief kunnen onderzocht worden voor de reeds bestaande
tijdelijke gonadale onderdrukkingsmechanismen.
SLEUTELWOORDEN: Gonadale suppressie - Hengst - Ram - Seizoen - Voortplanting
2
INLEIDING
Seizoensgebonden voortplanting is een natuurlijk gebeuren waarbij de reproductieactiviteit plaatsgrijpt
tijdens een bepaalde periode van het jaar. Voor veel in het wild levende dieren verzekert dit
mechanisme dat hun jongen geboren worden in de lente of de zomer wanneer de
omgevingsomstandigheden optimaler zijn voor de overleving van hun nakomelingen (21). Zowel de
ram als de hengst kennen een dergelijke seizoensgebonden voortplanting. Bij de hengst zal het
voortplantingsseizoen zich situeren in de lente, bij de ram in de herfst (7). Beide dieren baseren de
duur van hun voortplantingsseizoen op waarnemingen van de fotoperiode in combinatie met de
fotoperiodische geschiedenis (37). Lichtsignalen, die door de retina in het oog ontvangen worden,
onderdrukken het neurogeen signaal dat de pijnappelklier aanstuurt tot de productie en secretie van
het hormoon melatonine (29). Deze pijnappelklier is het orgaan bij uitstek dat, via de secretie van het
melatonine, de hele hormonale cascade van de spermatogenese zal sturen door controle op de
secretie van het gonadotropin-releasing hormone (GnRH) in de hypothalamus (7).
Buiten het voortplantingsseizoen vindt er zowel bij de hengst als bij de ram een tijdelijke reductie in
testikelgrootte, spermaproductie en reproductiegedrag plaats, alsook een dalende concentratie in de
hormonen die betrokken zijn bij de spermatogenese (23, 24).
Het artificieel nabootsen van de reversibele gonadale suppressie bij de hengst kan worden ingezet
met als doel eventueel ongewenst seksueel en agressief gedrag te onderdrukken, zonder hierbij te
moeten overgaan tot de onomkeerbare chirurgische castratie (46). De reeds onderzochte technieken
met een dergelijk effect bij de hengst werken allen in op het GnRH, of de doelwitcellen van dit
hormoon, om de verdere hormonale cascade voor aansturing van de spermatogenese te
onderdrukken. Tot deze technieken behoren het gebruik van progestagenen, GnRH agonisten, GnRH
antagonisten en vaccinatie tegen het GnRH (53). Mogelijke alternatieven voor deze reeds bestaande
technieken zijn vaccinatie tegen het KISS1 gen of het gebruik van het natuurlijke groene thee extract
epigallocatechine-3-gallaat.
Vaccinatie tegen het KISS1 gen met het oog op gonadale suppressie werd reeds onderzocht bij de
ram (78). Dit KISS1 gen, coderende voor kisspeptiden, blijkt immers mede verantwoordelijk te zijn
voor het aansturen van de GnRH secretie alsook voor de aanzet van de puberteit en controle op de
volwassen vruchtbaarheid (70). Onderzoeken bij de rat naar het effect van intraperitoneale injecties
met epigallocatechine-3-gallaat, toonden een werkzaamheid aan van dit gallaat als onderdrukkend
middel voor de gonadale activiteit (80).
In deze literatuurstudie wordt na een overzicht over de werking van de spermatogenese ingegaan op
de specifieke mechanismen waarmee hengst en ram het seizoen kunnen waarnemen om hierop hun
voortplantingsseizoen te baseren. De artificiële toepassingsmogelijkheden voor het onderdrukken van
de spermatogenese bij de hengst worden beschreven alsook hun werking en de mogelijke effecten op
lange termijn.
3
LITERATUURSTUDIE
1 SPERMATOGENESE BIJ HENGST EN RAM
1.1 INWENDIGE STRUCTUUR VAN DE TESTES
De spermatogenese bij hengst en ram is een proces dat plaatsgrijpt in de testes van deze dieren.
Zoals uit figuur 1 blijkt, bestaat de inwendige structuur van de testes vnl. uit tubuli seminiferi. Dit zijn
buisjes die grotendeels opgebouwd zijn uit 3 celtypes; de peritubulaire spiercellen, de Sertoli cellen en
de germinale cellen (1).
De peritubulaire spiercellen omvatten de externe laag van de tubuli seminiferi en zorgen bij contractie
dat het sperma door de buisjes wordt geduwd. De Sertoli cellen bevinden zich onder de peritubulaire
spiercellen, waarbij hun cytoplasma reikt tot aan het lumen van de tubuli seminiferi. De Sertoli cellen
omgeven de zich ontwikkelende germinale cellen en voorzien deze van de nodige voedingsstoffen en
groeifactoren. De germinale cellen ontwikkelen zich van spermatogonische stamcellen, die zich aan
de basaalmembraan bevinden, tot de uiteindelijke spermatozoa die in het lumen van de tubuli
seminiferi terechtkomen (2).
Tussen de verschillende tubuli seminiferi bevindt zich de interstitiële ruimte waarin onder andere
bloedvaten, immuuncellen, fibroblasten en ook Leydig cellen voorkomen (2). De Leydig cellen staan in
voor de productie van testosteron. Zoals in figuur 2 aangegeven, diffundeert dit androgeen zowel in de
nabijgelegen bloedvaten alsook in de tubuli seminiferi. Testosteron draagt bij tot vier kritische
processen; het onderhouden van de bloed testis barrière, het vervolledigen van de meiose die de
spermatocyten doormaken, het adhereren en elongeren van de spermatiden aan de sertoli cellen en
het loslaten van mature spermatozoa in het lumen van de tubuli seminiferi. Testosteron is met andere
woorden noodzakelijk om het proces van de spermatogenese tot een goed einde te brengen (1).
Fig. 1 Schematische voorstelling van de anatomie en celbiologie van zoogdiertestes (uit Schlatt en Ehmcke, 2014)
4
1.2 VAN SPERMATOGONIA TOT SPERMATOZOA
In figuur 2 wordt eveneens het proces van de spermatogenese geïllustreerd. Dit proces begint met
een proliferatie van de spermatogonische stamcellen ter hoogte van de basaalmembraan van de
tubuli seminiferi. Dit resulteert in de productie van 2 nieuwe stamcellen, enerzijds om de groep van
stamcellen te onderhouden en anderzijds om ongedifferentieerde spermatogonia te vormen die
voorbestemd zijn om zich verder te differentiëren tot spermatozoa (1, 3). De nog ongedifferentieerde
spermatogonia ondergaan heel wat mitotische delingen, met incomplete cytokinese, waarbij ze ketens
van spermatogonia vormen. Eens de ketens een lengte van 16 of 32 verbonden spermatgonia hebben
bereikt, vormen ze zich om tot gedifferentieerde spermatogonia die later zullen ontwikkelen tot
spermatozoa (1). De gedifferentieerde spermatogonia ondergaan een serie van delingen met finaal
een mitose die resulteert in de productie van preleptotene spermatocyten. Deze preleptotene
spermatocyten initiëren het proces van de meiose. Aan het einde van de meiose worden er ronde
haploïde spermatiden gevormd (1, 3). Deze ondergaan een differentiatie naar uitgerekte spermatiden
en uiteindelijk spermatozoa die zich losmaken en in het lumen van de tubuli seminiferi terecht komen
(1).
2 FYSIOLOGIE VAN HET GESSLACHTSAPPARAAT BIJ HENGST EN RAM
Om de productie van spermatozoa en testosteron op een zo efficiënt mogelijke manier te laten
verlopen, maakt het lichaam gebruik van een complex communicatiesysteem tussen allerlei organen
en celtypes. Hiertoe behoren de endocriene, paracriene en autocriene regulatie. De endocriene
regulatie is verantwoordelijk voor het synchroniseren van de reproductie processen met fysiologische
gebeurtenissen zoals de puberteit, omgevingsfactoren, seizoen en voeding. Hierbij staan de
pijnappelklier, de hypothalamus en de hypofyse centraal als modulerende organen.
De paracriene en autocriene regulatie grijpen plaats op lokaal niveau in de testes. Paracriene factoren
worden geproduceerd door een bepaald celtype en lokken respons uit bij een ander celtype in
hetzelfde orgaan. Autocriene factoren daarentegen worden geproduceerd door een bepaald celtype
en hebben effect op hetzelfde celtype (4).
Fig. 2 De anatomie van de testes en het proces van de spermatogenese (uit Smith en Walker, 2014)
5
2.1 PARACRIENE EN AUTOCRIENE REGULATIE
2.1.1 Testosteron
Testosteron wordt geproduceerd door de Leydig cellen en draagt bij tot het onderhouden van een
adequate bloed-testis barrière. Door binding op zijn receptoren lokt dit androgeen eveneens een
respons uit bij de volgende cellen (5):
Germinale cellen: Testosteron is essentieel voor zowel de mitose als de meïose van deze cellen (6).
Sertoli cellen: De mannelijke geslachtshormonen moduleren de genexpressie, proliferatie en
differentiatie van deze cellen (5).
Leydig cellen: Testosteron blijkt terug te acteren op de Leydig cellen om de werking van de
steroïdogenetische enzymen te reguleren. Hierbij heeft testosteron dus een autocriene functie waarbij
het zijn eigen secretie in de hand heeft (5).
Mannelijk fenotype: Het androgeen zorgt voor een inductie en behoudt van het mannelijk fenotype en
stimuleert de seksuele organen (2).
Spermatogenese: Testosteron is samen met het follikelstimulerend hormoon (FSH) verantwoordelijk
voor de ontwikkeling en het onderhoud van de spermatogenese (1). De concentraties aan testosteron
zijn veel hoger in de testes dan in het bloed, omdat een substantiële portie van dit hormoon
vastgehouden wordt in het intralobulair vocht door complexatie met androgeen bindingsproteïnen
gesecreteerd door de Sertoli cellen. Alleen deze hoge concentraties van testiculair testosteron zijn
adequaat voor het behouden van de spermaproductie (6).
Gonadotropin releasing hormone (GnRH): Het androgeen heeft een inhiberend effect op de productie
en secretie van GnRH in de hypothalamus (Fig. 3). Dit zorgt op zijn beurt voor een afname in de
vrijstelling van het luteïniserend hormoon (LH) dat een stimulerend effect heeft op de
testosteronproductie (zie verder). Door deze negatieve feedback houdt testosteron zijn eigen
productie deels in de hand (2, 7). Testosteron acteert ook terug op het anterieure deel van de
hypofyse om de responsiviteit van de LH secreterende cellen op het GnRH te verminderen (6).
Fig. 3 Schematische voorstelling van de hormonale controle op de testiculaire functie (Uit Animal Physiology: From Genes to Organisms, 2012)
6
2.1.2 Oestrogenen
Oestrogenen maken een belangrijk deel uit van de paracriene-autocriene as. Dit hormoon ontwikkelt
zich vanuit de enzymatische conversie van androgenen tot oestrogenen, gereguleerd door het
aromatase enzyme (5). Oestrogenen spelen een rol in de vroege ontwikkeling van de
spermatogenese en zullen deze ook beïnvloeden (8).
Verschillende onderzoeken bewijzen de bovenvermelde stelling. Zo toonden Siphatur et al. (2003) aan
dat de aromatase expressie bij de hengst afhankelijk is van de leeftijd. De Leydig en Sertoli cellen zijn
namelijk positief aan aromatase voor en tijdens de puberteit. Bij de volwassen hengst vertonen de
Sertoli cellen in mindere mate een aromatase activiteit, in tegenstelling tot bij de Leydig cellen waar
deze gelijkaardige blijft (9). Dit zorgt ervoor dat er veranderingen plaatsvinden in de intra-testiculaire
concentraties van oestradiol en oestrogeen conjugaten (nl. verhoging tijdens de testiculaire rijping),
terwijl er geen leeftijdsafhankelijk effect te zien is in de testosteronconcentraties (10).
Het feit dat verschillende celtypes in de testis, inclusief de germinale cellen, kern
oestrogeenreceptoren tot expressie brengen bewijst eveneens dat oestrogenen een rol spelen in de
spermatogenese (11). Hoewel er twee verschillende oestrogeen receptoren geïdentificeerd zijn, een
oestrogeen receptor alfa (ERα) en een oestrogeen receptor bèta (ERβ), blijft een gedeelte van hun
werkingsmechanisme onduidelijk (5). Uit een onderzoek van O’Donnell et al. (2001) blijkt dat zowel
ERα en ERβ voorkomen in de Leydig cellen terwijl in de Sertoli cellen en de zich ontwikkelde
kiemcellen enkel ERβ werd gevonden (12). De oestrogeen afhankelijke ERα signalering is onder
andere vereist tijdens de neonatale periode om een normale volwassen spermatogenese en
vruchtbaarheid te verzekeren. Oestrogenen reguleren ook de vochtabsorbtie ter hoogte van de
epididymis en concentreren op die manier het sperma (13).
Lubahn et al. (1993) voerden een experiment uit met mannelijke muizen knock-out voor het gen van
de oestrogeen receptor en toonden hiermee nog eens aan dat oestrogenen nodig zijn voor de
functionele rijping van de spermatozoa en de vruchtbaarheid. De muizen waar de oestrogeen receptor
niet tot expressie werd gebracht vertoonden immers een slechte vruchtbaarheid (14).
Buiten dit alles nemen de oestrogenen, net zoals de androgenen, deel aan de negatieve
feedbackmechanismen op de LH secretie buiten het voortplantingsseizoen (15). Bijkomende
onderzoeken zijn noodzakelijk om de exacte rol van oestrogenen in het voortplantingsproces bij adulte
dieren te bepalen, alsook het werkingsmechanisme van dit hormoon dient nog verder opgehelderd te
worden (8).
7
2.1.3 Inhibine
Voorlopig ontbreekt het nog aan concrete informatie over de specifieke functie van inhibine bij de
hengst en ram. Uit verschillende onderzoeken bij de rat blijkt dat de productie van dit glycoproteïne
zich hoofdzakelijk lokaliseert ter hoogte van de Sertoli cellen. De reeds aangetoonde subunits van dit
inhibine in de Leydig en de germinale cellen wijzen erop dat dit hormoon mogelijks ook in deze cellen
wordt geproduceerd (5).
Inhibine heeft een onderdrukkende werking op de secretie van het follikelstimulerend hormoon (FSH)
in de hypofyse (2, 7). FSH is een hormoon dat de Sertoli cellen aanspoort tot het vormen van
spermatozoa (5). De hersenen meten de plasma inhibine concentraties en gebruiken deze als
informatie voor de maximale potentiële spermaproductie. Wanneer er een hoge concentratie aan
inhibine gemeten wordt, zal dit zorgen voor een inhibitie van de FSH secretie (2).
2.2 ENDOCRIENE REGULATIE
De lokale processen en feedback mechanismen vanuit de testes staan zelf onder controle van een
meer omvattend mechanisme: de endocriene regulatie. De belangrijkste hormonen hierbij betrokken
zijn het gonadotropin-releasing hormone (GnRH), het follikelstimulerend hormoon (FSH) en het
luteïniserend hormoon (LH). GnRH wordt geproduceerd in de hypothalamus, LH en FSH in de
hypofyse (Fig. 3). De endocriene regulatie werkt dus over de hypothalamo-hypofysaire-testes as
(HPT-as) (5).
2.2.1 Gonadotropin-releasing hormone (GnRH)
De hypothalamus secreteert op een pulsatieve wijze GnRH en stimuleert op die manier de
episodische productie en secretie van FSH en LH vanuit de hypofyse (4). Dit FSH en LH vormen de
overgang tussen de endocriene en de paracriene regulatie en zijn nodig om een dissociatie te kunnen
maken tussen het aansturen van de spermatogense of de steroïdogenese ter hoogte van de testes (2,
5).
GnRH is een decapeptide dat geproduceerd wordt in de GnRH neuronen van de hypothalamus (16,
17). Excitatie van deze hypothalamische neuronen leidt tot het vrijkomen van de GnRH peptiden uit
hun secretorische granulen (18).
Na deze secretie kent GnRH een transport door de axonen van de GnRH neuronen naar de terminale
uiteinden, welke synapsen vormen met de bloedvaten van de primaire capillaire plexus in de
eminentia mediana van de hypofyse (17). De peptiden diffunderen er in het capillaire bloed en gaan
vervolgens via het hypofysaire portaal systeem naar de sinusoïde capillaire plexus in de
adenohypofyse. Daar verlaat een gedeelte van het GnRH de capillairen om er te binden op de GnRH
receptoren van zijn target cellen, de gonadotrope cellen (18). Stimulatie van de gonadotrope cellen
resulteert in de synthese en secretie van de gonadotropinen: LH en FSH (16).
8
De activiteit van de GnRH neuronen is niet continu, maar kent een episodisch verloop (19). Als gevolg
hiervan wordt GnRH pulserend gesecreteerd in het vaatstelsel en hebben de gonadotropinen de
neiging om hetzelfde episodische patroon te volgen. De episodische aard van de endogene GnRH
secretie is vereist voor een aanhoudende, consequente gonadotrope functie (20).
2.2.2 Luteïniserend hormoon (LH)
Het gesecreteerde LH bindt op zijn receptoren ter hoogte van de testiculaire Leydig cellen om deze te
stimuleren tot de productie en secretie van het androgeen testosteron. Hierdoor fluctueren de plasma
testosteron concentraties in de gonaden van hengst en ram parallel met de LH pulsaties (7).
2.2.3 Follikelstimulerend hormoon (FSH)
FSH speelt een kritieke rol in het controleren van de spermatogenese. Dit hormoon oefent een invloed
uit op de sertoli cellen door deze te stimuleren tot de productie van onder andere oestrogenen,
inhibine en activine (8). Bovendien is FSH, net als testosteron, vereist voor het initiëren van de
spermatogenese voor de pubertijd alsook voor het remodelleren van de spermatiden (5). Testosteron
en FSH stimuleren ook de ontwikkeling van de germinale cellen en werken synergetisch om het aantal
germinale cellen te maximaliseren (8).
2.3 SEIZOENSGEBONDEN VOORTPLANTING
Bij heel wat diersoorten (zo ook bij ram en hengst) vindt de reproductie activiteit plaats tijdens een
bepaalde periode van het jaar. Seizoensgebonden voortplanting is een natuurlijk proces dat veel in
het wild levende dieren ervan verzekert dat hun jongen in de lente of de zomer geboren worden. Dit
omdat bepaalde omgevingsfactoren, zoals de temperatuur en de aanwezigheid van voedsel, dan
optimaler zijn voor overleving van de nakomelingen (21). Door timing van hun paringsgedrag
verhogen heel wat diersoorten dus de kans op nageslacht en overleving van deze nakomelingen (22).
2.3.1 Seizoensgebonden verschillen
Hengst en ram kennen beiden een seizoensgebonden voortplanting. Aangezien de merrie een lange
dracht kent (320-350 dagen), situeert haar voortplantingsseizoen zich tijdens het voorjaar. Dit om te
verzekeren dat de partus plaatsgrijpt tijdens de lente of de zomer, wanneer de omstandigheden
optimaler zijn voor overleving van het veulen. Het voortplantingsseizoen van de hengst is hieraan
aangepast waardoor hij zijn grootste gonadale activiteit kent tijdens de lente en de zomer, dus bij
toenemende daglichtlengte. De ooi heeft daarentegen een korte dracht (gemiddeld 145 dagen),
waardoor het voortplantingsseizoen zich tijdens de herfst situeert. De ram kent daardoor zijn grootste
gonadale activiteit bij een afnemende daglichtlengte (7).
9
Wanneer hengst en ram zich buiten het voortplantingsseizoen bevinden zal dit zich vertalen in een
verminderde testikelgrootte, spermaproductie en reproductie gedrag alsook een dalende hormonale
concentratie van testosteron, LH en FSH. Deze dieren zullen echter geen volledige stopzetting van
spermaproductie kennen buiten hun voortplantingsseizoen alhoewel er wel een significante reductie
zal zijn (23, 24). Zoals uit figuur 4 en 5 blijkt zullen deze seizoensgebonden verschillen groter zijn bij
de ram dan bij de hengst.
Fig. 4 Seizoensgebonden verschillen bij de Black Racka ram geobserveerd gedurende 1 jaar van december tot en met november (uit Sarlos et al., 2013) Fig. 5 Seizoensgebonden verschillen geobserveerd bij 8 fertiele hengsten (uit Roser, 2012)
10
2.3.2 Fotoperiodische controle van de voortplanting
Heel wat stimuli zoals de fotoperiode, temperatuur, body condition score, voeding en leeftijd oefenen
een effect uit op de reproductiecyclus (25). De fotoperiode kan hierbij als een van de belangrijkste
stimuli aangegeven worden (26).
Lichtsignalen worden door de retina ontvangen en hoofdzakelijk verwerkt door het fotopigment
melanopsine dat zich lokaliseert in de intrinsieke fotosensitieve retinale ganglioncellen (27). Deze
ganglioncellen vormen de retino-hypothalamische weg naar de suprachiasmatische nucleus (SCN) in
de hypothalamus (28). Outputs van de suprachiasmatische nucleus worden via de paraventriculaire
nucleus van de hypothalamus (PVN) door de intermediolaterale cellen van het bovenste ruggenmerg
(IML) naar het superieure cervicale ganglion (SCG) getransporteerd dat via zijn postganglionaire
zenuwvezels een neurogeen signaal stuurt naar de pinealocyten in de pijnappelklier (Fig. 6) (29).
Neuronogene stimulatie van de pinealocyten in de pijnappelklier leidt tot de productie en secretie van
het hormoon melatonine via activatie van het snelheidsbeperkende enzyme N-acetyltransferase (NAT)
(30). Fotosignalen (licht) inhiberen het vrijkomen van de neurotransmitter norepinefrine, waardoor het
neurogeen signaal niet kan worden doorgegeven en de pinealocyten niet worden aangespoord tot het
secreteren van melatonine (31). Onderzoeken tonen aan dat licht met een spectrum in de korte
golflengtes (465 - 485nm) het meest effectief is om de melatoninesecretie te inhiberen aangezien het
melanopsine vooral gevoelig is aan de korte golflengtes, namelijk deze van blauw licht (32, 33).
De pijnappelklier zorgt dus voor een omzetting van het neurogeen signaal naar een hormonaal signaal
in de vorm van melatonine. Door de inhiberende werking van licht op de melatonine secretie, kent de
melatonineconcentratie een circadiaan ritme en zal de productie van dit hormoon het hoogste zijn
tijdens de uren van duisternis. De duur van de dagelijkse melatonine secretie is met andere woorden
negatief gecorreleerd met de tijd dat het dier vrijgesteld is aan daglicht (34).
De verkorting van het melatonine signaal tijdens de korte zomernachten en de uitbreiding ervan
tijdens de lange winternachten geeft een endocriene voorstelling van het aantal uren licht en donker
op een dag (35).
Fig. 6 Route van het neurogeen signaal voor stimulatie van de melatonineproductie
(uit Walton et al., 2011)
11
Twee keer per jaar, eens tijdens het voorjaar en eens tijdens het najaar, komt eenzelfde duur aan
daglichtlengte voor (behalve deze van de zonnewenden) met als gevolg dat een eendagsbeleving van
het melatoninepatroon niet voldoende is voor het dier om een onderscheid te kunnen maken tussen
voor-en najaar en zijn reproductiecyclus hierop te baseren. Om dit probleem op te lossen slaan de
dieren informatie op over de voorgaande fotoperiodiciteit die ze dan vergelijken met de huidige
daglichtlengte (36). Het melatonine signaal in combinatie met de fotoperiodische geschiedenis geeft
het dier nauwkeurige en eenduidige informatie over het seizoen (37). Het gesecreteerde melatonine
regelt op zijn beurt de productie en secretie van het gonadotropin-releasing hormone (GnRH) in de
hypothalamus. Bij de hengst veroorzaakt het melatonineprofiel een stijgende GnRH secretie in de
lente en de zomer met een bijhorende verhoogde spermatogenese. Tijdens de herfst wordt er een
daling in de GnRH secretie en spermatogese genoteerd. De ram daarentegen reageert omgekeerd op
hetzelfde melatonineprofiel en kent een stijgende GnRH secretie in de herfst (5, 7).
Samengevat heeft de stimulus van de fotoperiode dus een verschillend effect op de reproductie
activiteit bij hengst en ram (25). Toch zijn beide mechanismen in zeker zin te vergelijken. Bij de ram
worden namelijk al tekenen van de reproductieactiviteit gedetecteerd in de lente, maar wordt het nog
effectief onderdrukt tot in de herfst (38).
De redenen voor het verschillend effect van melatonine bij hengst en ram zijn niet specifiek
onderzocht, maar kunnen een variabiliteit bevatten van de anatomische plaatsen waar melatonine op
inwerkt bij de verschillende species (39). Zo is de expressie van melatonine receptoren erg species
specifiek; de pars tuberalis van de hypofyse wordt beschouwd als het enige doelwitweefsel van
melatonine dat alle zoogdieren gemeenschappelijk hebben (40). Bij de ram bevindt er zich een hoge
concentratie aan melatonine receptoren dicht bij het mediobasale deel van de hypothalamus (41).
Nonno et al. (1995) vonden daarentegen geen melatonine receptoren in de hypothalamus van het
paard, maar wel in de pars distalis en de pars tuberalis van de hypofyse (42). In een studie van
Stankov et al. (1991) werd dan weer een extreem lage densiteit aan melatonine receptoren in de
hypothalamus gevonden bij het paard (43). Het is dus niet exact geweten of de hersenregio’s die
betrokken zijn bij de fotoperiodische controle van de reproductie dezelfde zijn bij hengst en ram.
Verder onderzoek is hiervoor vereist (39).
3 TIJDELIJKE ONDERDRUKKINGSMECHANISMEN VAN DE SPERMATOGENESE BIJ DE HENGST
Uit de voorgaande bespreking blijkt dat de tijdelijke onderdrukking van de spermatogenese bij hengst
en ram een natuurlijk gebeuren is dat zich bij de aanzet van het volgend voortplantingsseizoen
volledig herstelt. De fysiologie achter deze gonadale suppressie kan ons inzichten verschaffen over de
mogelijkheid tot het artificiële toepassing van een tijdelijke onderdrukking van de spermatogenese,
zonder hierbij schade te berokken aan de latere vruchtbaarheid van het dier.
12
3.1 WAAROM GONADALE SUPPRESSIE BIJ DE HENGST?
De expressie van seksueel of agressief gedrag bij hengsten buiten de fokkerijomstandigheden is vaak
ongewenst omdat het de goede prestaties van de hengst tijdens training of wedstrijden negatief kan
beïnvloeden (44). Ook kan het de eigenaar, berijder of anderen in gevaar brengen (45). Vroeger was
chirurgische castratie de klassieke benadering voor het verwijderen van de bron aan testosteron in de
hoop zo dit ongewenst seksueel en agressief gedrag te onderdrukken. Dit is echter niet wenselijk
wanneer het dier later als dekhengst dienst moet doen en bovendien brengt het een zeker risico (op
bijvoorbeeld bloedingen) met zich mee, vooral dan bij oudere dieren. Bovendien is chirurgische
castratie niet altijd even succesvol als middel om seksueel en agressief gedrag te reduceren bij
paarden (46).
Gonadale suppressie zou buiten dit alles ook bijdragen tot het elimineren van het Equine Virale
Arteritis-virus (EVA-virus). Hengsten vormen namelijk een belangrijk reservoir voor dit virus,
aangezien de mogelijkheid bestaat tot persistentie hiervan ter hoogte van hun accessorische
geslachtsklieren. Tijdens de zaadlozing kan dit virus in het sperma terecht komen en zo een mogelijke
besmettingsbron vormen voor de merries (47).
Uit onderzoek is gebleken dat het persisteren van het EVA-virus testosteron afhankelijk is (48). Reeds
verschillende studies onderzochten of langdurige behandelingen met GnRH vaccins of antagonisten,
die een suppressie van de testosteronproductie veroorzaken, ook een effectieve behandeling zouden
kunnen zijn voor het elimineren van het EVA-virus.
Fortier et al. (2002) onderzochten het effect van een korte termijnbehandeling (35-38 dagen) met een
GnRH antagonist bij 5 hengsten met het EVA-virus. Slechts 2 van de 5 onderzochte hengsten bleven
negatief voor het virus na de behandeling (49).
Burger et al. (2005) voerden daarentegen een immunisatie uit tegen GnRH bij adulte hengsten met
het EVA-virus en vonden daarbij een positief verband tussen immunisatie en het virusvrij worden van
al de behandelde hengsten (50).
3.2 PROGESTAGENEN
Werking: Een niet invasief alternatief voor de chirurgische castratie is het gebruik van progestagenen
(zoals altrenogest) die de LH secretie ter hoogte van de hypofyse onderdrukken en op die manier een
suppressie van de testiculaire testosteron secretie veroorzaken (51).
Squires et al. (1997) voerden een onderzoek uit bij 20 hengsten (tussen de 3 en de 18 jaar oud) naar
de effecten van het eenmaal daags toedienen van een hoge dosis (0,088mg/kg lichaamsgewicht)
altrenogest. In deze studie werden de hengsten onderverdeeld in 5 groepen van telkens 4 hengsten.
Hiertoe behoorde een controle groep (Controle), een groep die gedurende 150 dagen eenmaal daags
behandeld werd met de hoge dosis altrenogest (Alt-150), een andere groep die een behandeling aan
dezelfde dosis onderging, maar dan gedurende 240 dagen (Alt-240) en als laatste nog een groep die
13
deze dosis altrenogest eveneens gedurende 240 dagen toegediend kreeg met supplementair nog elke
4 uur 80 µgram GnRH subcutane injecties van dag 151 tot dag 240 (Alt-240 + GnRH).
Uit de resultaten van dit onderzoek bleek dat altrenogest de serum concentraties van LH en
testosteron, de totale scrotum omtrek, de dagelijkse spermatozoa output, het percentrage van
normale spermatozoa en het libido deed dalen. Een significante afname in sperma motiliteit was
eveneens merkbaar in de groepen die gedurende 240 dagen behandeld werden, maar niet in de
groep die de behandeling gedurende 150 dagen ondergingen.
Verondersteld wordt dat de onderdrukkende effecten van altrenogest hoofdzakelijk gemedieerd
worden door een negatieve feedback remming op de LH uitscheiding. Bijgevolg dalen de
testosteronconcentraties wat een verminderde spermaproductie en reductie in seksueel gedrag met
zich meebrengt (51).
Fig. 7 Wijzigingen in de totale scrotum Fig. 8 Wijzigingen in de dagelijkse sperma omtrek van de verschillende groepen output van de verschillende groepen (uit Squires et al., 1997) (uit Squires et al., 1997)
Fig. 9 Wijzigingen in serum testosteron Fig. 10 Wijzigingen in het percentage concentraties en serum LH concentraties van normale spermatozoa (uit Squires et al., 1997) (uit Squires et al., 1997)
14
Miller et al. (1997) behandelden hengsten ouder dan 5 jaar met 0,044mg/kg lichaamsgewicht
altrenogest (de dosis die nodig is voor het onderdrukken van de oestrus bij de merrie) gedurende 30
dagen en bemerkten hierbij geen verschil tussen dagelijkse sperma output, spermatozoa morfologie
en motiliteit en plasma FSH concentraties voor en na de behandeling met altrenogest.
Een vermindering qua seksueel gedrag werd eveneens niet geregistreerd al kan het zijn dat er hogere
dosissen nodig zijn om een respons te krijgen en verminderd seksueel gedrag te bekomen aangezien
dit gedrag bij oudere hengsten meestal dieper ingeworteld is.
Daartegenover stelden de onderzoekers op het einde van de behandeling wel een suppressie vast in
de concentraties van LH (daling met 3,2 ng/ml) , testosteron (daling met 0,79 ng/ml), oestrogeen
conjugaten (daling met 118,6 ng/ml) en inhibine (daling met 1,7 ng/ml) in vergelijking met de waarden
voor de behandeling (52).
Een nadeel van progestagenen gebruik is de noodzaak ervan om dagelijks in hoge dosissisen
toegediend te worden om het seksueel gedrag onder controle te krijgen. Best wordt er ook rekening
mee gehouden dat de progestageen toediening aan hengsten in vele sporten als doping wordt
beschouwd. Als laatste zijn er vaak ook bijkomende regels in landen waar paarden als
voedselproducerende dieren geclassificeerd worden en is het mogelijk dat het gebruik van
progestagenen bij de hengst verboden is (53).
Lange termijn effecten: Het gebruik van lage dosissen altrenogest gedurende een korte periode (30
dagen) veroorzaakten na afloop geen nadelige effecten op de sperma kwaliteit en kwantiteit alsook de
testosteronconcentraties herstelden zich uiteindelijk 60 dagen na stopzetting van de therapie. LH,
oestrogeen conjugaten en inhibine concentraties namen 30 dagen na stopzetting van de behandeling
opnieuw hun oorspronkelijke waarde aan van voor de behandeling (52).
Negentig dagen na het beëindigen van een langdurige behandeling (150 of 240 dagen) met
altrenogest aan hoge dosissen (0,088 mg/kg lichaamsgewicht) noteerden de onderzoekers een
gedeeltelijke reversie van de gonadale suppressie. Er werden niet langer negatieve effecten op de
totale scrotum omtrek, de dagelijkse sperma output en de progressieve beweeglijkheid van
spermatozoa gevonden. De concentraties aan LH, testosteron en het percentage aan normale
zaadcellen in het ejaculaat hadden echter nog niet dezelfde waarden aangenomen als voor de
toediening van altrenogest. Hiervoor zal wellicht meer dan 90 dagen vereist zijn (51).
Aangezien de lange termijn effecten van de toediening van altrenogest bij de hengst nog niet volledig
gekend zijn, is enige voorzichtigheid vereist bij het gebruik hiervan bij hengsten die later nog in de
fokkerij dienen ingezet te worden.
15
3.3 GNRH AGONISTEN
Werking: Zoals eerder vermeld is de activiteit van de GnRH neuronen niet continu, maar kent het een
episodisch verloop (19). Hierdoor wordt het GnRH pulserend gesecreteerd in de bloedsomloop en
heeft de gonadotropinesecretie de neiging om hetzelfde episodische patroon te volgen (20).
Wanneer er continu GnRH agonisten of langwerkende GnRH agonisten worden toegediend, zullen
deze met een hoge affiniteit binden aan de GnRH receptoren en bootsen op die manier de cellulaire
respons na die geïnduceerd wordt door het GnRH zelf (54). Deze reactie omvat een verhoging van
second messenger signalering in de doelcellen en leidt in eerste instantie tot een verhoogde synthese
en uitscheiding van de gonadotropinen. Deze stimulerende respons is echter van voorbijgaande aard,
want zo zal een voortdurende blootstelling aan de agonist uiteindelijk de synthese en secretie van de
gonadotropinen doen dalen met als gevolg een onderdrukking in de secretie van testosteron. Dit wordt
verklaard door het feit dat door de continue bezetting van de GnRH receptoren een versnelde
internalisatie en degradatie van de receptor zal plaatsvinden zonder een daarbij compenserende
toename in de GnRH receptor synthese (20). Bovendien kan door de continue stimulatie een
ontkoppeling plaatsvinden van de receptor met de intracellulaire second messenger wegen in
gonadotrope cellen (55).
Bij een aantal diersoorten blijkt de continue toediening van hoge dosissen GnRH agonisten de
hypofyse ongevoelig te maken voor GnRH, en zo een effectief middel te zijn om de gonadotropine
afgifte te doen dalen. Er zijn echter duidelijke diersoortverschillen qua gevoeligheid voor het down-
regulerende effect van GnRH agonisten. De reden voor deze differentiële respons op de GnRH
agonisten tussen de diersoorten is niet bekend (56).
Uit onderzoeken bij de hengst bleek dat het gebruik van agonisten ofwel geen of slecht een beperkt
onderdrukkend effect had (57, 58, 59). Soms werd er zelfs een verbeterde gonadotropine secretie
waargenomen (60, 61). Hieruit kan besloten worden dat de meeste paarden relatief bestand zijn tegen
langdurige, diepe reproductieve onderdrukking van deze agonisten. De toediening van een hoge dosis
GnRH agonisten lijkt dus geen zinvolle manier te zijn in het onderdrukken van het
voortplantingsgedrag bij de hengsten (53).
Lange termijn effecten: Een significante vermindering in serum testosteronconcentraties, in
testiculair volume en spermatogenese door langdurige blootstelling aan GnRH agonisten werd onder
andere reeds beschreven bij volwassen mannelijk rhesusapen en honden (62, 63). Bij deze dieren
wordt het suppressieve effect van de agonisten volledig omgekeerd na stopzetting van het toedienen
van de agonisten (16). Aangezien bij deze dieren de reproductie activiteit volledig herstelt na het
stopzetten van de therapie, en uit de meeste studies bij de hengst blijkt dat bij toediening van GnRH
agonisten de testosteronconcentraties nauwelijks dalen en de spermatogenese vaak behouden blijft,
zou kunnen besloten worden dat de fertiliteit van de hengsten niet nadelig verandert na het gebruik
van GnRH agonisten. Toch is enige voorzichtigheid nodig bij het stellen van deze hypothese,
vanwege de extreme variabiliteit tussen de diersoorten. Verder onderzoek bij de hengst is hiervoor
vereist.
16
3.4 GNRH ANTAGONISTEN
Werking: Een alternatief voor het gebruik van hoge dosissen agonisten voor het onderdrukken van de
gonadotropine afgifte is het gebruik van GnRH antagonisten die competitief de GnRH receptoren
bezetten. De antagonisten zorgen voor een snelle en ingrijpende onderdrukking van de gonadotropine
secretie door het bezetten en stabiliseren van de GnRH receptoren in een inactieve configuratie. Het
voordeel ten opzichte van GnRH agonisten is dat de antagonisten sneller werkzaam zijn en geen
initiële hyperstimulatie veroorzaken van de gonadotropinesecretie. Hoewel ze vaak moeten worden
toegediend, wordt het effect van de antagonisten snel gemanipuleerd en omgekeerd (64). Nadeel van
de GnRH antagonisten is de hoge kostprijs die verbonden is met de werkzame dosissen (44).
Hinojosa et al. (2001) onderzochten het effect van antarelix, een potente GnRH antagonist, die aan de
dosis van 100 µg/kg lichaamsgewicht aan 4 Shetland pony hengsten werd teogediend. Uit hun
onderzoek bleek dat bij het gebruik van deze antagonist de serumconcentraties van LH, FSH,
testosteron en oestrogenen significant daalden. De totale sperma output nam bijna met 50% af,
alsook een daling in libido werd waargenomen. De spermatozoa motiliteit en morfologie werden niet
significant aangetast door de behandeling (65).
Fig. 11 Sperma karakteristieken van 4 hengsten 2 weken voor en 2 weken na het toedienen van een GnRH antagonist (antarelix) (uit Hinojosa et al., 2001)
Een gelijkaardig onderzoek werd uitgevoerd door Fortier et al. (2002) waarbij ze 6 volwassen
hengsten gedurende 35 tot 38 dagen behandelden met een GnRH antagonist. Vier ervan werden
behandeld met 0,01 mg/kg lichaamsgewicht antarelix en twee met cetrorelix aan dezelfde dosis. Het
testosteronlevel daalde tot op basaal niveau binnen de week van de behandeling, behalve bij 1
hengst. Spermaconcentratie en spermamotiliteit daalden eveneens en het aantal afwijkende
spermatozoa nam toe. Een effect op het libido werd niet bekomen (49).
Fig. 12 Effect na toediening van een GnRH antagonist op de testosteronconcentratie. Dag 0 = einde van de behandeling (uit Fortier et al., 2002)
17
Fig. 13 spermakarakteristieken bij de behandeling met een GnRH-antagonist. Dag 0 = einde van de behandeling (uit Fortier et al., 2002)
Lange termijn effecten: Hinojosa et al. (2001) onderzochten de reversibiliteit van het effect op het
libido en de testiculaire veranderingen niet, maar uit de waarden van hun metingen kan er worden
opgemaakt dat naarmate de behandeling vorderde er opnieuw een stijging in de LH, FSH, testosteron
en oestradiol concentraties kon worden waargenomen (65). Dit gegeven suggereert enige vorm van
reversibiliteit.
Fortier et al. (2002) merkten in hun onderzoek een volledig herstel op qua testosteronniveau, sperma
kwaliteit en kwantiteit tussen de 75 en de 110 dagen na het beëindigen van de behandeling (49).
Beide onderzoeken tonen aan dat het gebruik van GnRH antagonisten een effectief middel is voor het
onderdrukken van de spermatogenese en hierbij geen permanente schade berokkent aan de fertiliteit.
De hoge kostprijs van de GnRH antagonisten is echter een groot nadeel waardoor hun gebruik in de
praktijk beperkt blijft (44).
3.5 VACCINATIE TEGEN GNRH
Werking: De korte afstand (en tijd) dat GnRH onderweg is in de capillairen, is waar het mogelijk kan
aangevallen worden door antistoffen. Als er voldoende antistoffen aanwezig zijn in de bloedcirculatie
die de eminentia mediana binnengaat, zal vrijwel alle GnRH die afgescheiden werd in de primaire
plexus stevig gebonden worden aan antilichamen. Deze binding met antistoffen neutraliseert het
GnRH, hetzij door zijn diffusie doorheen de capillaire wanden te verhinderen door de omvang van het
complex, of hetzij door het maskeren van de receptorbindingsplaatsen op de GnRH molecule zelf,
waardoor deze niet kan binden op zijn receptoren ter hoogte van de hypofyse. Dit resulteert in een
verlies van gonadale stimulatie met daaropvolgend een daling in de productie van steroïde hormonen
en een vermindering in seksueel gedrag en spermatogenese (18).
Aangezien een GnRH molecule zelf te klein is om een immuunreactie uit te lokken, wordt bij de
bereiding van een vaccin het GnRH (of een gemodificeerde vorm van het hormoon) geconjugeerd aan
een vreemd eiwit dat de antigeniciteit verleent. Ook een adjuvans wordt toegevoegd om de vorming
van antilichamen te verbeteren (18).
18
Turkstra et al. (2005) onderzochten het effect van vaccinatie tegen GnRH op 12 4-jarige Shetland
pony’s gebruik makende van 2 verschillende GnRH vaccins bestaande uit een niet-minerale olie
adjuvans. Ze verdeelden de hengsten in 3 groepen (elk bestaande uit 4 hengsten), waarbij groep 1
geïnjecteerd werd met 2 ml van een GnRH/CoVaccine (bevattende GnRH antigenen en CoVaccine
als adjuvans), groep 2 met 2 ml GnRH/Carbopol (bevattende GnRH antigenen en Carbopol als
adjuvans) en groep 3 dat geïnjecteerd werd met CoVaccine HT adjuvans zonder antigenen
(controlegroep). Alle groepen kregen na 6 weken een booster immunisatie. Uit dit onderzoek bleek dat
het GnRH/Covaccine de meest effectieve resultaten gaf. De titers aan antilichamen tegen het GnRH
stegen snel bij alle dieren 2 weken na de tweede vaccinatie. Op hetzelfde moment daalde het serum
testosteronniveau maximaal voor de verdere duur van het experiment alsook de spermamotiliteit,
scrotum omtrek en aantal spermatozoa daalden duidelijk. Bij de GnRH/Carbopol groep konden
dezelfde resultaten slechts bij een minderheid (meestal slechts bij één) van de behandelde hengsten
worden waargenomen (66).
Fig. 15 Antilichaamtiters tegen GnRH bij de hengsten geïnjecteerd met verschillende GnRH vaccins op dag 0 en 6 weken later (uit Turkstra et al., 2005)
Fig. 14 Serum testosteronconcentratie van hengsten geïnjecteerd op dag 0 en 6 weken later met het GnRH/CoVaccin (bovenste grafiek), GnRH/Carbopol (middelste grafiek) en Fig. 16 Spermakarakteristieken van hengsten met de controle emulsie (onderste grafiek) gevaccineerd op week 0 en week 6 met (uit Turkstra et al., 2005) verschillende GnRH vaccins (uit Turkstra et al., 2005) Vanzelfsprekend is de effectiviteit van de vaccinatie afhankelijk van de titers aan anti-GnRH-
antistioffen die bereikt worden en de precieze samenstelling van het vaccin. Vaccins gemaakt op een
oliebasis lokken ernstigere reacties uit ter hoogte van de injectieplaats met als gevolg dat deze
vaccins niet altijd geschikt zijn voor commerciële doeleinden. Een water oplosbare formulering van
hetzelfde vaccin zorgt voor een aanzienlijke reductie in weefselreacties, maar de anti-GnRH-
antistoffentiters zijn hierbij wel lager (67). Uit verschillende studies blijkt er ook een individuele
variabiliteit te bestaan qua responsiviteit. Bij de volwassen hengst is er een hogere incidentie van
lokale weefselreacties ter hoogte van de injectieplaats dan bij jongere dieren, hoewel dit gedeeltelijk
een factor is die bepaald wordt door het aantal toegediende injecties (44).
19
Bij jonge hengsten blijken de vaccinaties over het algemeen ook vrij betrouwbaar te zijn en leiden ze
tot een stijging in de circulerende anti-GnRH-antistoffentiters, gevolgd door een vermindering in
testosteronconcentratie met een verminderde kwaliteit van sperma en daling in het libido tot gevolg
(53). Bij volwassen hengsten is de respons op de vaccinaties minder betrouwbaar en
boostervaccinaties zijn regelmatig nodig om een duidelijk onderdrukking van testosteronconcentraties
in het bloed en spermaproductiecapaciteit te bereiken (44).
Deze individuele variabiliteit kwam onder andere naar voor in de studie van Malmgren et al. (2001). Zij
voerden een test uit met een vaccin tegen GnRH bestaande uit 1 ml GnRH-BSA conjugaat en als
adjuvans 1 ml Equimune en 0,1 ml aluminium hydroxide. Hiervoor gebruikten ze 4 hengsten, waarvan
3 experimentele (4-5 jaar oud) en 1 controle hengst (23 jaar oud). De 3 experimentele hengsten
werden elk vijfmaal geïnjecteerd, de eerste 4 vaccinaties werden toegediend met telkens 2 weken
interval, de laatste vaccinatie werd met 4 weken interval gegeven. Alle geïmmuniseerde hengsten
produceerden antistoffen tegen het GnRH, al was er een verschil in effect van de immunisatie
merkbaar tussen de hengsten. Zo werd er bij 2 van de 3 experimentele hengsten hoge levels aan
antilichamen gevonden terwijl er bij de 3de een matige antilichaamconcentratie werd bekomen. Bij alle
hengsten van de experimentele groep werd een verminderd libido (maar geen volledige
onderdrukking) waargenomen 4 weken na de eerste immunisatie alsook een afname in testikelomtrek.
Twee maand na de eerste immunisatie werd er ook een opmerkelijke verandering in spermakwaliteit
geobserveerd bij de 2 hengsten met hoge antilichaamconcentraties (68).
Janett et al. (2009) voerden een gelijkaardig experiment uit met 200 µgram van een GnRH-proteïne
conjugaat (Equity™) die ze driemaal injecteerden bij 5 hengsten (tussen 6 en 15 jaar) met een interval
van 4 en 8 weken (69). De resultaten uit deze studie waren vergelijkbaar met deze uit de studie van
Malmgren et al. (2001).
Fig. 17 GnRH antilichaamconcentratie bij experimentele hengst A-C en controle hengst D voor en na immunisatie tegen GnRH (Uit Malmgren et al., 2001)
Fig. 19 Totaal aantal spermatozoa per ejaculaat (TNS), totale spermamotiliteit (TSM) en morfologie van normala spermatozoa (MNS) bij de experimentele hengsten A-C en de controle hengst D voor en na immunisatie tegen GnRH (uit Malmgren et al., 2001)
Fig. 18 Plasma testosteron concentratie (T) en plasma oestogeensulfaat concentratie (ES) bij de experimentele hengsten A-C en bij de controle hengst D voor en na immunisatie tegen GnRH (uit Malmgren et al., 2001)
20
Lange termijn effecten: Malmgren et al. (2001) onderzochten de lange termijn effecten van hun
immunisatie niet, maar uit gegevens van de studie van Trukstra et al. (2005) blijkt dat bij de vaccinatie
van 2-4 jarige hengsten deze nog volledige seksuele rijpheid bereiken na stopzetting van de
vaccinatie. Ook herstelt het vermogen tot spermatogense zich tot op het niveau van voor de
vaccinaties binnen de 4 maanden nadat GnRH-anitistoffentiters waren afgenomen (66).
3.6 KISS1 GEN ALS MOGELIJK DOELWIT VOOR EEN DNA-IMMUNOCASTRATIE VACCIN
3.6.1 Wat is het KISS1 gen?
Bij verschillende diersoorten waaronder bij schapen, hamsters, apen, mensen en de merrie werd
reeds het hypothalamus kisspeptide ontdekt (70, 71, 72, 73, 74).
Het KISS1 gen codeert voor de kisspeptiden en situeert zich ter hoogte van de nucleus arcuatus
(ARC) in de mediobasale hypothalamus. De kisspeptiden oefenen hun biologische activiteit uit door te
binden aan de Orphan G-Protein Gekoppelde Receptor genaamd GPR54, nu aangeduid als de
kisspeptide receptor (KISS1R) (70, 75). Deze kisspeptiden zijn cruciaal voor het begin van de
puberteit en de controle van de volwassen vruchtbaarheid (70). Studies van Topaloglu et al. (2014)
toonden namelijk aan dat inactivitie en mutatie van het KISS1 gen het falen van de puberale
progressie veroorzaakt, alsook een verminderde gonadale afmeting en een laag testosterongehalte en
onvruchtbaarheid (76). Dit omdat de kisspeptiden ook verantwoordelijk zijn voor het stimuleren van de
GnRH secreties (77).
3.6.2 Vaccinatie tegen KISS1 gen bij de ram
Han et al (2015) onderzochten de hypothese of het KISS1 gen gebruikt kan worden als doelwit voor
de ontwikkeling van een DNA-immunocastratie vaccin. Het immunocastratie effect van een KISS1-
antagonische DNA-vaccin bij ram lammeren werd geëvalueerd op basis van identificatie van een
specifiek KISS1 antilichamen respons en het beoordelen van het effect op serum testosteron niveau,
veranderde gonadale functie en seksueel gedrag. Voor dit onderzoek verdeelden ze 6 mannelijke Hu
schapenlammeren in een behandelings- en een controlegroep. Het vaccin (1 mg/mannelijk lam) werd
geïnjecteerd in de lammeren tijdens week 0, 3 en 6 van het experiment. Werkzaamheid van het vaccin
werd geëvalueerd in termen van KISS1-specifieke IgG-antilichaam reactie, serum testosteron
concentraties, scrotum omtrek, testis gewicht, lengte en breedte, de omvang van weefselschade aan
de testikels en verandering qua seksueel gedrag.
21
Uit dit onderzoek bleek dat de specifieke anti-KISS1 antilichaamtiter bij gevaccineerde dieren
significant hoger was dan die in de controlegroep. Bovendien vertoonden de gevaccineerde dieren
lagere serum testosteronspiegel, verminderd testiculair gewicht en lengte en een kleinere scrotum
omtrek dan de dieren van de controle groep (78).
Fig. 20 Serum testosteronlevels (ng/ml) bij ram lammeren Fig. 21 Testikel gewicht, lengte en breedte bij die de immunisatie behandeling ondergingen (groep T) gevaccineerde (groep T) en controle (groep C) en de contole groep lammeren (groep C) op 0, 2, 4, 6, 10 lammeren 14 weken na immunisatie en 14 weken na immunisatie (uit Han et al., 2015) (uit Han et al., 2015)
Ook het seksueel gedrag was significant lager bij de gevaccineerde dieren. De gevaccineerde groep
(groep T) vertoonde een grotere suppressie van de spermatogenese in het lumen van de tubuli
seminiferi, gekarakteriseerd door een reductie van spermatogonia, spermatocyten en spermatiden
concentratie en een afname in epitheelhoogte van de tubuli seminiferi in vergelijking met de
controlegroep (groep C) (78).
Fig. 22 Microscopische evaluatie van groep T (a) en groep C (b) ram lammeren testes. vergroting 20x (uit Han et al., 2015)
Uit het onderzoek van Han et al. (2015) kan er geconcludeerd worden dat immunisatie met dit DNA-
vaccin tegen het KISS1 gen een sterke antilichamenrespons induceert, met als resultaat een
onderdrukking van de gonadale functie en seksueel gedrag bij de dieren. Dit toont aan dat het KISS1
gen kan gebruikt worden als nieuw doelwit voor de ontwikkeling van een DNA immunocastratie vaccin
bij rammen (78).
22
Er werd nog onvoldoende onderzoek gedaan naar de aanwezigheid en de rol van het KISS1 gen bij
de hengst. Bij de merrie werd dit reeds ontdekt (74), wat doet vermoeden dat de kans op
aanwezigheid van dit gen bij de hengst groot is en de kisspeptiden daar een gelijkaardige functie
zouden kunnen vervullen als bij de merrie. Verder onderzoek naar het KISS1 gen en het gebruik als
mogelijk doelwit voor vaccintatie bij de hengst is dus vereist.
Lange termijn effecten: Aangezien de reeds uitgevoerde studie met het KISS1 gen als mogelijk
doelwit voor immunocastratie erg recent is, ontbreekt het nog aan concrete informatie over de lange
termijn effecten bij toepassing van de vaccinatietherapie alsook over de mogelijke reversibiliteit van de
gonadale suppressie. Hiervoor is nog verder onderzoek vereist.
3.7 KRUIDENPREPARATEN
3.7.1 Epigallocatechine-3-gallaat
Testosteron, het belangrijkste androgeen geproduceerd in de testis en circulerend in het bloed, wordt
in zijn doelwitorganen door 5alfa-reductase omgezet tot 5alfa-dihydrotestosteron (DHT) dat bindt op
een specifieke nucleaire androgeen receptor (AR). Dit DHT-AR complex, in conjugatie met andere
chromosomale proteïnen, reguleert dan de synthese van specifiek RNA en moduleert zo de cellulaire
activiteit en orgaanfuncties. Mutaties in de genen voor 5alfa-reductase of voor het AR zijn
verantwoordelijk voor androgeen-ongevoelige syndromen bij mensen en dieren (79).
Epigallocatechine-3-gallaat (EGCG) is een natuurlijk groene thee extract dat bewezen heeft actief te
zijn als een 5alfa-reductase remmer (80).
Zowel de gallaat groep als de catechine structuur (vnl. dan het trihydroxy fenol deel hiervan) zijn
belangrijk voor de inhiberende activiteit tegen het 5alfa-reductase. Zo is bijvoorbeeld het niet-gallaat
catechine, epicathecin (EC) niet actief. Ook galzuur en het methylester van galzuur zijn niet actief, wat
de noodzaak van de catechine structuur doet vermoeden (81).
Kao et al (2000) onderzochten het effect van epigallocatechine-3-gallaat op het endocriene systeem
van ratten. Ze gaven de ratten dagelijks intraperitoneale injecties met EGCG (85 mg/kg
lichaamsgewicht) en bemerkten dat na ongeveer 7 dagen de circulerende niveaus van testosteron bij
de mannelijke ratten met ongeveer 70% daalde. Ook vertoonden deze mannelijke ratten een
significante daling in de serum LH concentratie (met 40 tot 50%).
Het gewicht van androgeen gevoelige organen, zoals de ventrale en dorsolaterale prostaat,
zaadblaasjes en de coagulerende en preputiale klieren verminderde na die 7 dagen ongeveer met 50
tot 70%. Het effect van EGCG op het gewicht van de prostaat is echter een gevolg van de
verminderde geslachtshormoonniveaus en niet een direct effect van het EGCG.
23
Terwijl deze effecten op de gonaden en de hormonale concentraties worden waargenomen bij
intraperitoneale injecties met EGCG, zijn deze effecten niet aanwezig wanneer dezelfde hoeveelheid
EGCG oraal wordt toegediend. Dit kan worden veroorzaakt door inefficiënte absorptie van het EGCG
of door de activiteit van het spijsverteringkanaal aangezien het EGCG dat intraperitoneaal wordt
geïnjecteerd niet onderhevig is aan wisselwerkingen met het voedsel of de werking van het
maagdarmkanaal. Hoewel orale toediening van het EGCG dus minder effectief blijkt te zijn, kan
langdurige orale consumptie van groene thee of EGCG bevattende extracten het effect van
intraperitoneale toediening van EGCG nabootsen (80).
Fig. 23 Effect van EGCG en 3 gerelateerde groene thee catechinen op lichaamsgewicht (A), serum testosteron concentraties (B), en gewicht van de ventrale prostaat (C), dorsolaterale prostaat (D), zaadblaasjes (E) en coagulatie klier (F) bij de mannelijke ratten na dagelijkse intraperitoneale injectie met de catechinene (85mg/kg lichaamsgewicht) gedurende 7 dagen (uit Kao et al., 2000)
Lange termijn effecten: Uit de studie van Kao et al. (2000) bleek dat het gewichtsverlies van de
androgeen gevoelige organen volledig werd omgekeerd na externe toediening van sekshormonen
(80). De effecten op de gonaden na stopzetting van de therapie werden niet bestudeerd, waardoor er
nog onzekerheid bestaat over de lange termijn effecten.
Toediening van EGCG bij de hengst en het effect ervan zijn tot op heden niet bestudeerd. Wel heeft
het gebruik van epigallocatechine-3-gallaat bij de mannelijke rat reeds zijn werkzaamheid bewezen tot
het onderdrukken van de spermatogenese. Dit biedt mogelijke perspectieven tot het gebruik van dit
groene thee extract voor onderdrukking van de spermatogenese bij de hengst als natuurlijk alternatief
voor de reeds bestaande synthetische onderdrukkingsmechanismen.
24
BESPREKING
De fysiologie van de seizoensgebonden voortplanting bij hengst en ram leert ons dat tijdelijke en
reversibele gonadale suppressie een natuurlijk fenomeen is. Onderzoek naar het mechanisme achter
deze seizoensgebonden voortplanting creëerde de mogelijkheid tot het toepassen van technieken die
dergelijke reversibele suppressie van de gonadale activiteit nabootsen. Het grote voordeel van
dergelijke technieken is de omkeerbaarheid waardoor er een onderdrukking in ongewenst seksueel of
agressief gedrag bij de hengst kan bekomen worden en toch de mogelijkheid behouden blijft om het
dier in de toekomst eventueel als dekhengst in te zetten (46).
Onderzoeken omtrent de artificiële onderdrukkingsmechanismen van de spermatogenese bij de
hengst zijn eerder beperkt en werden vaak op erg kleine onderzoeksgroepen uitgevoerd. Eveneens
de lange termijn effecten met bijhorende reversibiliteit werden niet altijd specifiek onderzocht, al
brengen de meeste onderzoeken toch enige vorm van reversibiliteit naar voor. Bij het gebruik van
progestagenen kan deze reversibiliteit echter nog niet met 100% zekerheid gegarandeerd worden met
als gevolg bij gebruik hiervan toch enige voorzichtigheid geboden is. Ondanks de goede resultaten op
het bekomen van gonadale suppresie bij de hengst worden progestagenen in de praktijk niet vaak
gebruikt. Dit kan verklaard worden door de noodzakelijkheid ervan om dagelijks in hoge dosissen
toegediend te worden en ook omdat het gebruik van progestagenen bij de hengst vaak nog als vorm
van doping wordt beschouwd op wedstrijden. Het toedienen van GnRH agonisten blijkt geen goed
alternatief te zijn voor het gebruik van progestagenen vanwege de primaire verhoogde secretie van
gonadotropinen die ze veroorzaken en doordat het beoogde effect van de gonadale suppresie (bijna
altijd) afwezig blijft (57, 58, 59, 60, 61). Hiertegenover vormen de GnRH antagonisten door hun
beperktere toedieningsnood en snelle werkzaamheid, zonder initiële hyperstimulatie van de
gonadotropinesecretie, wel een goed alternatief voor de progestagenen en GnRH agonisten. Enig
minpunt bij deze GnRH antagonisten is de hoge kostprijs. Vaccinatie tegen GnRH is een recenter
onderzocht alternatief voor het bekomen van tijdelijke gonadale suppressie bij de hengst. Bij de reeds
uitgevoerde experimenten werd er wel enige vorm van leeftijdsafhankelijke en/of individueel
verschillende respons gesuggereerd (44).
Een andere vorm van vaccinatie, namelijk het vaccineren tegen het KISS1 gen, zou eventueel dienst
kunnen doen als alternatief voor de reeds bestaande gonadale suppressietechnieken bij de hengst.
Dit KISS1 gen werd tot op de dag van vandaag nog niet ontdekt bij de hengst, maar onder andere wel
al bij de ram, ooi en de merrie, wat het bestaan ervan bij de hengst doet vermoeden. Bij ram
lammeren werd reeds een experiment uitgevoerd met een DNA-immunocastratie vaccin tegen het
KISS1 gen om zo een gonadale suppressie te bewerkstelligen (78). De resultaten die uit dit onderzoek
naar voor kwamen waren veelbelovend, al is bijkomend onderzoek nodig naar de reversibiliteit van de
gonadale suppressie en de effecten op lange termijn bij toepassing van deze techniek. Een ander
alternatief zou het gebruik van epigallocatechine-3-gallaat kunnen zijn. Het voordeel van dit gallaat is
dat het een natuurlijk groene thee extract is en geen synthetisch vervaardigd middel zoals alle
bovenvermelde producten. Een studie bij de rat toonde goede resultaten aan qua gonadale
suppressie (80). Bij dit onderzoek werden echter de effecten op lange termijn niet onderzocht.
25
REFERENTIELIJST
(1) Smith L.B., Walker W.H. (2014). The regulation of spermatogenesis by androgens. Seminars in
Cell & Developmental Biology 30, 2-13.
(2) Schlatt S., Ehmcke J. (2014). Regulation of spermatogenesis: An evolutionary biologist’s
perpective. Seminars in Cell & Developmental Biology 29, 2-16.
(3) Johnson L., Varner D.D., Roberts M.E., Smith T.L., Keillor G.E., Scrutchfield W.L. (2000).
Efficiency of spermatogenesis: a comperative approach. Animal Reproduction Science 60-61,
471-480.
(4) Roser J.F. (2001). Endocrine and paracrine control of sperm production in stallions. Animal
Reproduction Science 68, 139-151.
(5) Roser J.F. (2008). Regulation of testicular function in the stallion: An intricate network of
endocrine, paracrine and autocriene systems. Animal Reproduction Science 107, 179-196.
(6) Sherwood L, Klandorf H., Yancey P. (2012). Animal physiology: from genes to organisms. 2nd
edition. Cengage Learning, Belmont, Callifornia, p. 777.
(7) Gerlach T., Aurich J.E. (2000). Regulation of seasonal reproductive activity in the stallion, ram and
hamster. Animal Reproduction Science 58, 197-213.
(8) O’Shaughnessy P.J. (2014). Hormonal control of germ cell development and spermatogenesis.
Seminars in Cell & Developmental Biology 29, 55-65.
(9) Sipahutar H., Sourdaine P., Moslemi S., Plainfosse B., Seralini G.E. (2003). Immunolocalization of
aromatase in stallion Leydig cells and seminiferous tubules. Journal of Histochemistry &
Cytochemistry 51, 311–318.
(10) Stewart B.L., Roser J.F. (1998). Effects of age, season, and fertility status on plasma and
intratesticular immunoreactive (IR) inhibin concentrations in stallions. Domestic Animal
Endocrinoly 15, 129–139.
(11) Carreau S., Bouraima-Lelong H., Delalande C. (2012). Estrogen, a female hormone involved in
spermatogenesis. Advances in Medical Sciences 57, 31–6.
(12) O’Donnell L., Robertson K.M., Jones M.E., Simpson E.R. (2001). Estrogen and spermatogenesis.
Endocrine Reviews 22, 289–318.
(13) Sinkevicius K.W., Laine M., Lotan T.L., Woloszyn K., Richburg J.H., Greene G.L. (2009).
Estrogen-dependent and independent estrogen receptor-alpha signaling separately regulate male
fertility. Endocrinology. 150, 2898–2905.
(14) Lubahn D.B., Moyer J.S., Golding T.S., Couse J.F., Korach K.S., Smithies O. (1993). Alterations
of reproductive function but not prenatal sexual development after insertional disruption of the
mouse oestrogen receptor gene. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 90,
1162–1166.
(15) Muyan M., Roser J.F., Dybdal N., Baldwin D.M. (1993). Modulation of gonadotropin-releasing
hormone-stimulated luteinizing hormone release in cultured male equine anterior pituitary cells by
gonadal steroids. Biology of Reproduction 49, 340–345.
26
(16) Adams T.E. (2005). Using gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and GnRH analogs to
modulate testis function and enhance the productivity of domestic animals. Animal Reproduction
Science 88, 127-139.
(17) Kainer R.A., (1993). Equine Reproduction. 2nd edition. Lea & Febiger, Philadelphia, p. 5–19.
(18) Thompson D.L. (2000). Immunization against GnRH in male species comparative aspects. Animal
Reproduction Science 60-61, 459-469.
(19) Moenter S.M., DeFazio A.R., Pitts G.R., Nunemaker C.S. (2003). Mechanisms underlying episodic
gonadotropin- releasing hormone secretion. Frontiers in Neuroendocrinology 24, 79-93.
(20) Clayton R.N. (1988). Mechanism of GnRH action in gonadotrophs. Human Reproduction 3, 479-
483.
(21) Guillaume D. (1996). Action de la photoperiode sur la reproduction des equides. INRA
Productions Animales 9, 61–69.
(22) Paul M.J., Zucker I., Schwartz J. (2008). Tracking the seasons: the internal calendars of
vertebrates. Philosophical Transactions of The Royal Society B 363, 341–361.
(23) Sarlos P., Egerszegia I., Balogha O., Molnar A., Cseh S., Ratky J. (2013). Seasonal changes of
scrotal circumference, blood plasma testosterone concentration and semen characteristics in
Racka rams. Small Ruminant Research 111, 90-95.
(24) Roser J.F. (2012). Reproductive characteristics of stallions during the breeding and non-breeding
season in a tropical region. Tropical Animal Health and Production 44, 1703-1707.
(25) Woodfill C.J.I., Wayne N.L., Moenter S.M., Karsch F.J. (1994). Photoperiodic synchronisation of a
circannual reproductive rhythm in sheep: identification of season-specific time cues. Biology of
Reproduction 50, 965 – 976.
(26) Robinson J.E., Karsch F.J. (1987). Photoperiodic history and a changing melatonin pattern can
determine the neuroendocrine response of the ewe to daylength. Journal of Reproduction &
Fertility 80, 159–165.
(27) Provencio I., Rodriguez I.R., Jiang G., Hayes W.P., Moreira E.F., Rollag M.D. (2000). A novel
human opsin in the inner retina. The Journal of Neuroscience 20, 600-605.
(28) Lucas R.J., Freedman M.S., Lupi D., Munoz M., David-Gray Z.K., Foster R.G. (2001). Identifying
the photoreceptive inputs to the mammalian circadian system using transgenic and retinally
degenerate mice. Behavioural Brain Research 125, 97-102.
(29) Walton J.C., Weil Z.M., Nelson R.J. (2011). Review Influence of photoperiod on hormones,
behavior, and immune function. Frontiers in Neuroendocrinology 32, 303-319.
(30) Minneman K.P., Wurtmann R.J. (1975). Effects of pineal compounds on mammals. Life Sciences
17, 1189–1200.
(31) Reppert S.M., Weaver D.R. (2002). Coordination of circadian timing in mammals. Nature 418,
935-941.
(32) Lockley S.W., Brainard G.C., Czeisler C.A. (2003). High sensitivity of the human circadian
melatonin rhythm to resetting by short wavelength light. The Journal of Clinical Endocrinology &
Metabolism 88, 4502-4505.
27
(33) Brainard G.C., Sliney D., Hanifin J.P., Glickman G., Byrne B., Greeson J.M., Jasser S., Gerner E.,
Rollag M. (2008). Sensitivity of the human circadian system to short-wavelength (420-nm) light.
Journal of Biological Rhythms 23, 379-386.
(34) Guerin M.V., Deed J.R., Kennaway D.J., Matthews C.D. (1995). Plasma melatonin in the horse:
measurements in natural photoperiod and in acutely extended darkness throughout the year.
Journal of Pineal Research 19, 7–15.
(35) Bittman E.L., Dempsey R.J. and Karsch F.J. (1983). Pineal melatonin secretion drives the
reproductive response to day length in the ewe. Endocrinology 113, 2276-2283.
(36) Prendergast J., Gorman M.R., Zucker I. (2000). Establishment and persistence of photoperiodic
memory in hamsters. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97, 5586–5591.
(37) Gorman M. R. (2001). A plastic interval timer synchronizes pubertal development of summer- and
fall-born hamsters. American Journal of Physiology Regulatory, integrative and comparative
physiology 281, 1613–1623.
(38) Olster D.H., Foster D.L. (1988). Control of gonadotrophin secretion during the pubertal and
seasonal transitions in the male sheep. Journal of Reproduction & Fertility 82, 179–191.
(39) Cardinali D.P. (1981). Melatonin. A mammalian pineal hormone. Endocrine Reviews 2, 327-346
(40) Morgan P.J., Barrett P., Howell H.E., Helliwell R. (1994). Melatonin receptors: localization,
molecular pharmacology and physiological significance. Neurochemistry International 24, 101–
146.
(41) Lincoln G.A., Tortonese D.J. (1995). Does melatonin act on dopaminergic pathways in the
mediobasal hypothalamus to mediate effects of photoperiod on prolactin secretion in the ram?
Neuroendocrinology 62, 425 – 433.
(42) Nonno R., Capsoni S., Lucini V., Moller M., Fraschini F., Stankov B. (1995). Distribution and
characterization of the melatonin receptors in the hypothalamus and pituitary gland of three
domestic ungulates. Journal of Pineal Research 18, 207–216.
(43) Stankov B., Cozzi B., Lucini V., Fumagalli P., Scaglione S., Fraschni F. (1991). Characterization
and mapping of melatonin receptors in the brain of three mammalian species: rabbit, horse and
sheep. A comparative in vitro binding study. Neuroendocrinology 53, 214–221.
(44) Stout T.A.E., Colenbrander B. (2004). Suppressing reproductive activity in horses using GnRH
vaccines, antagonists or agonists. Animal Reproduction Science 82–83, 633–643.
(45) McDonnell S.M., Kenney R.M., Meckley P.E., Garcia M.C. (1985). Conditioned suppression of
sexual behavior in stallions and reversal with diazepam. Physiology & Behavior 34, 951–956.
(46) Line S.W., Hart B.L., Sanders L. (1985). Effect of prepubertal versus postpubertal castration on
sexual and aggressive behaviour in male horses. Journal of the American Veterinary Medical
Association 186, 249–251.
(47) Timoney P.J., McCollum W.H. (1993). Equine viral arteritis. Veterinary Clinics of North America
Equine Practice 9, 295–309.
(48) McCollum W.H., Little T.V., Timoney P.J., Swerczek T.W. (1994). Resistance of castrated male
horses to attempted establishment of the carrier state with equine arteritis virus. Journal of
Comparative Pathology 111, 383–388.
28
(49) Fortier G., Vidament M., DeCraene F., Ferry B., Daels P.F. (2002). The effect of GnRH antagonist
on testosterone secretion, spermatogenesis and viral excretion in EVA-virus excreting stallions.
Theriogenology 58, 425–427.
(50) Burger D., Janett F., Vidament M., Stump R., Fortier G., Imboden I., Thun R. (2006). Immunization
against GnRH in adult stallions: effects on semen characteristics, behaviour and shedding of
equine arteritis virus. Animal Reproduction Science 94, 1-4.
(51) Squires E.L., Badzinski S.L., Amann R.P., McCue P.M., Nett T.M. (1997). Effects of altrenogest on
total scrotal width, seminal characteristics, concentrations of LH and testosterone and sexual
behavior of stallions. Theriogenology 48, 313-328.
(52) Miller C.D., Varner D.D., Blanchard T.L., Thompson J.A., Johnson L. (1997). Effects of altrenogest
on behavior and reproductive function of stallions. Proceedings of the Annual Convention of the
AAEP 43, 197–198.
(53) Stout T.A.E. (2005). Modulating reproductive activity in stallions: A review. Animal Reproduction
Science 89, 93-103.
(54) Conn P.M., Crowley Jr. W.F. (1994). Gonadotropin-releasing hormone and its analogs. Annual
Review of Medicine 45, 391–405.
(55) McArdle C.A., Franklin J., Green L., Hislop J.N. (2002). Signalling, cycling and desensitisation of
gonadotrophin- releasing hormone receptors. Journal of Endocrinology 173, 1–11.
(56) Falomo M.E., Normando S., Zanibellato E., Romagnoli S. (2013). Sexual behavior and serum
testosterone concentration in stallions treated with slow-release implants of deslorelin acetate.
Journal of Veterinary Behavior 8, 278–284.
(57) Brinsko S.P., Squires E.L., Pickett B.W., Nett T.M. (1998). Gonadal and pituitary responsiveness
of stallions is not down-regulated by prolonged pulsatile administration of GnRH. Journal of
Andrology 19, 100–109.
(58) Montovan S.M., Daels P.F., Rivier J., Hughes J.P., Stabentfeldt G.H., Lasley B.L. (1990). The
effect of a potent GnRH agonist on gonadal and sexual activity in the horse. Theriogenology 33,
1305-1321.
(59) Boyle M.S., Skidmore J., Zhang J., Cox J.E. (1991). The effects of continuous treatment of
stallions with high levels of a potent GnRH analogue. Journal of Reproduction & Fertility 44, 169–
182.
(60) Roser J.F., Hughes J.P. (1991). Prolonged pulsatile administration of gonadotrophin-releasing
hormone (GnRH) to fertile stallions. Journal of Reproduction & Fertility 44, 155–168.
(61) Sieme H., Troedsson M.H.T., Weinrich S., Klug E. (2004). Influence of exogenous GnRH on
sexual behavior and frozen/thawed semen viability in stallions during the non-breeding season.
Theriogenology 61, 159–171.
(62) Akhtar F.B., Marshall G.R., Wickings E.J., Nieschlag E. (1983). Reversible induction of
azoospermia in rhesus monkeys by constant infusion of a gonadotropin-releasing hormone
agonist using osmotic minipumps. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 56, 534–
540.
29
(63) Dube D., Assaf A., Pelletier G., Labrie F. (1987). Morphological study of the effects of an GnRH
agonist on the canine testis after 4 months of treatment and recovery. Acta Endocrinologica
(Copenhagen) 116, 413–417.
(64) Huirne J.A.F., Lambalk C.B. (2001). Gonadotrophin-releasing-hormone-receptor antagonists.
Lancet 358, 1793–1803.
(65) Hinojosa A.M., Bloeser J.R., Thomson S.R.M., Watson E.D. (2001). The effect of a GnRH
antagonist on endocrine and seminal parameters in stallions. Theriogenology 56, 903-912.
(66) Turkstraa J.A., van der Meer F.J.U.M., Knaap J., Rottier P.J.M., Teerds K.J., Colenbrandere B.,
Meloen R.H. (2005). Effects of GnRH immunization in sexually mature pony stallions. Animal
Reproduction Science 86, 247–259.
(67) Dowsett K.F., Knott L.M., Tshewang U., Jackson A.E., Bodero D.A.V., Trigg T.E. (1996).
Suppression of testicular function using two dose rates of a reversible water-soluble
gonadotrophin releasing hormone (GnRH) vaccine in colts. Australian Veterinary Journal 74, 228–
235.
(68) Malmgren L., Andresen, Dain A.M. (2001). Effect of GnRH immunisation on hormonal levels,
sexual behaviour, semen quality and testicular morphology in mature stallions. Equine Veterinary
Journal 33, 75-83.
(69) Janett F., Stump R., Burger D., Thun R. (2009). Suppression of testicular function and sexual
behavior by vaccination against GnRH (EquityTM) in the adult stallion. Animal Reproduction
Science 115, 88-102.
(70) Smith J.T. (2012). The role of kisspeptin and gonadotropin inhibitory hormone in the seasonal
regulation of reproduction in sheep. Domestic Animal Endocrinology 43, 75-84.
(71) Greives T.J., Mason A.O., Scotti M.A., Levine J., Ketterson E.D., Kriegsfeld L.J., Demas G.E.
(2007). Environmental control of kisspeptin: implications for seasonal reproduction. Endocrinology
148, 1158 – 1166.
(72) Shahab M., Mastronardi C., Seminara S.B., Crowley W.F., Ojeda S.R., Plant T.M. (2005).
Increased hypothalamic GPR54 signaling: a potential mechanism for initiation of puberty in
primates. Proceedings of the National Academy of Sciences 102, 2129–2134.
(73) Dhillo W.S., Chaudhri O.B., Patterson M., Thompson E.L., Murphy K.G., Badman M.K., McGowan
B.M. (2005). Kisspeptin-54 stimulates the hypothalamic-pituitary gonadal axis in human males.
The Journal of Clinical Endocrinoly & Metabolism 90, 6609 –6615.
(74) Magee C., Foradori C.D., Bruemmer J.E., Arreguin-Arevalo J.A., McCue P.M., Handa R.J.,
Squires E.L., Clay C.M (2009). Biological and Anatomical Evidence for Kisspeptin Regulation of
the Hypothalamic-Pituitary-Gonadal Axis of Estrous Horse Mares. Endocrinology 150, 2813–2821.
(75) Kotani M., Detheux M., Vandenbogaerde A., Communi D., Vanderwinden J.M., Le Poul E.,
Brézillon S., Tyldesley R., Suarez-Huerta N., Vandeput F., Blanpain C., Schiffmann S.N., Vassart
G., Parmentier M. (2001). The metastasis suppressor gene Kiss-1 encodes kisspeptins, the
natural ligands of the orphan G protein-coupled receptor GPR54. The Journal of Biological
Chemistry 276, 34631– 34636.
30
(76) Topaloglu A.K., Tello J.A., Kotan L.D., Ozbek M.N., Yilmaz M.B., Erdogan S., Gurbuz F., Temiz
F., Millar R.P., Yuksel B. (2012). Inactivating KISS1 mutation and hypogonadotropic
hypogonadism. The New England Journal of Medicine 366, 629–635.
(77) Skorupskaite K., George J.T., Anderson R.A. (2014). The kisspeptin-GnRH pathway in human
reproductive health and disease. Human Reproduction 20, 485–500.
(78) Han Y., Liu G., Jiang X., Ijaz N., Tesema B., Xie G. (2015). KISS1 can be used as a novel target
for developing a DNA immunocastration vaccine in ram lambs. Vaccine 33, 777-782.
(79) Hiipakka R.A., Liao S. (1998). Molecular mechanism of androgen action. Trends in Endocrinology
and Metabolism 9, 317-24.
(80) Kao Y.H., Hiipakka R.A., Liao S. (2000). Modulation of endocrine systems and food intake by
green tea epigallocatechin gallate. Endocrinology 141, 980-7.
(81) Liao S. (2001). The medicinal action of androgens and green tea epigallocatechin gallate. Hong
Kong Medical Journal 7, 369-374.
![Biodiversiteit als basis voor ecosysteemdiensten …...[ 239 ] Biodiversiteit als basis voor ecosysteemdiensten > Regulatie van het stedelijk microklimaat door vegetatie [ ] In de](https://static.fdocuments.nl/doc/165x107/5e4ca4e871f24a4845457062/biodiversiteit-als-basis-voor-ecosysteemdiensten-239-biodiversiteit-als.jpg)
