Radiogenomics voor predictie van complicaties bij

Radiogenomics voor predictie van

complicaties bij prostaatkankerpatiënten

na radiotherapie.

Julie Bolcaen

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. H. Thierens

Vakgroep medische basiswetenschappen

Academiejaar 2010-2011

Radiogenomics voor predictie van

complicaties bij prostaatkankerpatiënten

na radiotherapie.

Julie Bolcaen

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. H. Thierens

Vakgroep medische basiswetenschappen

Academiejaar 2010-201

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander

gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met

betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van

resultaten uit deze masterproef.”

Datum

(handtekening student) (handtekening promotor)

(Naam student) (Naam promotor)

I

Voorwoord

Bij aanvang van deze thesis zou ik iedereen willen bedanken die mij bijgestaan heeft tijdens

de realisatie van deze masterproef.

Vooreerst wil ik mijn promotor Prof. Dr. Hubert Thierens en mijn begeleidster Sofie De

Langhe bedanken omdat ze mij de mogelijkheid boden dit onderzoek te verrichten.

In het bijzonder wil ik Sofie De Langhe bedanken voor alle hulp en steun bij het aanleren van

de verschillende technieken en het schrijven van deze thesis. Daarnaast wil ik Dr. Ir. Kim De

Ruyck en Joke Werbrouck bedanken voor de inhoudelijke tips en hulp tijdens het labowerk.

Verder wil ik Virginie De Gelder en Nele Willaert bedanken voor het administratief werk en

hulp bij technische probleempjes.

Graag wil ik ook het volledige dienstpersoneel en mijn mede-studenten Lieselotte, Assunta,

Eva, Femke en Jolien bedanken voor de aangename werkomgeving en hulp tijdens deze

masterproef.

Ten slotte wil ik al mijn vrienden en familie bedanken voor hun morele steun. Een extra

dankwoord gaat uit naar mijn ouders en vriend waar ik altijd terecht kon tijdens deze

stressvolle periode.

Bedankt!

II

Inhoudstafel

Inleiding ..................................................................................................................................... 2

1. Prostaatkanker ............................................................................................................ 2

2. Behandeling ............................................................................................................... 2

3. Stralingsgeïnduceerde complicaties ........................................................................... 3

3.1. Genito-urinaire toxiciteit ...................................................................................... 4

3.2. Gastro-intestinale toxiciteit .................................................................................. 5

4. Pathogenese van normale weefseltoxiciteit ............................................................... 5

4.1. DNA herstelpathways .......................................................................................... 6

4.1.1 Homologe recombinatie ........................................................................................ 7

4.1.2. Non- homologe end joining .................................................................................. 7

4.2. Adhesiemolecules ................................................................................................. 7

4.3. TGFB1 .................................................................................................................. 8

5. Inter-individuele variabiliteit ..................................................................................... 8

5.1. XRCC3 c.722 C>T ................................................................................................ 9

5.2. Ku70 c.-1310 C>G ............................................................................................... 9

5.3. ITGB2 c.819 G>A ................................................................................................ 9

5.4. TGFB1 haplotype ............................................................................................... 10

6. Doelstelling .............................................................................................................. 11

Materiaal en Methoden .......................................................................................................... 12

1. Introductie ................................................................................................................ 12

2. Studiepopulatie ........................................................................................................ 12

3. Dosimetrische gegevens .......................................................................................... 13

4. DNA isolatie uit vol bloed ....................................................................................... 13

5. Concentratiebepaling en verdunning van het DNA ................................................. 14

6. Polymerase chain reaction (PCR) ............................................................................ 14

6.1. Principe ............................................................................................................... 14

6.2. PCR condities ..................................................................................................... 16

6.3. PCR primers ....................................................................................................... 16

6.4. PCR controle ...................................................................................................... 16

7. Genotypering ........................................................................................................... 17

7.1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ........................................ 17

7.2. High Resolution Melting (HRM) ....................................................................... 18

7.2.1 Algemene beschrijving ......................................................................................... 18

7.2.2. Spike-in techniek ................................................................................................. 19

7.2.3. Optimalisatie HRM ............................................................................................. 20

III

7.3. Snapshot ............................................................................................................. 21

7.3.1. Optimalisatie Snapschot ................................................................................. 22

8. Kwaliteitscontrole .................................................................................................... 22

9. Statistische analyse .................................................................................................. 22

Resultaten ................................................................................................................................ 23

1. Reeds geoptimaliseerde protocols ........................................................................... 23

1.1. RFLP geoptimaliseerde protocols ...................................................................... 23

1.2. HRM geoptimaliseerde protocols ....................................................................... 23

1.3. Snapschot geoptimaliseerde protocol ................................................................. 23

2. Optimalisaties .......................................................................................................... 24

2.1. Optimalisatie SYTO-9 dye voor HRM analyse ................................................. 24

2.2. Optimalisatie TGFB1 g.10780 T>G HRM protocol .......................................... 25

2.3. Optimalisatie snapschot protocol ITGB2 c.819 G>A ......................................... 27

3. SNP data .................................................................................................................. 28

4. Associatiestudie naar stralingsgeïnduceerde acute weefselcomplicaties ................ 29

4.1. Frequentie-analyse ............................................................................................. 29

4.2. Associatie tussen patiëntgerelateerde factoren en optreden van acute GU

complicaties. ..................................................................................................................... 30

4.3. Associatie tussen dosisgerelateerde factoren en optreden van acute GU

complicaties. ..................................................................................................................... 30

4.4. Associatie tussen genetische factoren en optreden van acute GU complicaties. 31

A. Eindpunt 1: Associatie tussen SNPs en optreden van acute geninocturie. .......... 31

B. Eindpunt 2: associatie tussen SNPs en optreden van acute genifrequentie. ........ 32

C. Eindpunt 3: Associatie tussen haplotypes van TGFB1 SNPs en optreden van

acute GU complicaties. ...................................................................................................... 33

5. Associatiestudie naar stralingsgeïnduceerde late weefselcomplicaties ................... 34


5.2. Associatie tussen patiëntgerelateerde factoren en optreden van late complicaties.

34

A. Late GI complicaties ................................................................................................... 35

B. Late GU complicaties .................................................................................................. 35

5.3. Associatie tussen dosisgerelateerde factoren en optreden van late complicaties.

35

A. Late GI complicaties ................................................................................................... 35

B. Late GU complicaties .................................................................................................. 35

5.4. Associatie tussen genetische factoren en optreden van late complicaties. ......... 36

A. Eindpunt 4. Associatie tussen SNPs en optreden van late GI complicaties. ....... 36

B. Eindpunt 5: Associatie tussen SNPs en optreden van late GU complicaties. ..... 37

IV

5.5. Associatie tussen optreden van acute en late stralingsgeïnduceerde complicaties.

37

Bespreking ............................................................................................................................... 38

1. Optimalisaties .......................................................................................................... 38

1.1. Optimalisatie SYTO-9 dye voor HRM analyse ................................................. 38

1.2. Optimalisatie TGFB1 g.10780 T>G HRM protocol .......................................... 38

1.3. Optimalisatie snapschot protocol ITGB2 c.819 G>A ......................................... 38

2. Associatie naar stralingsgeïnduceerde complicaties ............................................... 39


2.2. Associatie tussen patiëntgerelateerde factoren en optreden van acute GU en late

GI/GU complicaties. ......................................................................................................... 39

2.3. Associatie tussen dosisgerelateerde factoren en optreden van acute GU en late

GI/GU complicaties. ......................................................................................................... 40

2.4. Associatie tussen SNPs en optreden van acute weefselcomplicaties. ................ 41

2.4.1. XRCC3 c.722 C>T .......................................................................................... 41

2.4.2. Ku70 c.-1310 C>G .......................................................................................... 41

2.4.3. ITGB2 c.819 G>A .......................................................................................... 42

2.4.4. Haplotype TGFB1 ........................................................................................... 42

I. TGFB1 c.-800 G>A ..................................................................................................... 42

II. TGFB1 c.-509 C>T...................................................................................................... 42

III. TGFB1 c.29 T>C ......................................................................................................... 42

IV. TGFB1 c.74 G>C ........................................................................................................ 43

V. TGFB1 g.10780 T>G .................................................................................................. 43

VI. Haplotype TGFB1 ....................................................................................................... 43

2.5. Associatie tussen SNPs en het optreden van late normale weefselcomplicaties.

44

2.5.1. XRCC3 c.722 C>T .......................................................................................... 44

2.5.2. Ku70 c.-1310C>G ........................................................................................... 44

2.5.3. ITGB2 c.819 G>A ........................................................................................... 44

2.5.4. Haplotype TGFB1 ........................................................................................... 45

I. TGFB1 c.-800 G>A ..................................................................................................... 45

II. TGFB1 c.-509 C>T...................................................................................................... 45

III. TGFB1 c.29 T>C ......................................................................................................... 45

IV. TGFB1 c.74 G>C ........................................................................................................ 46

V. TGFB1 g.10780 T>G .................................................................................................. 46

2.6. Associatie tussen optreden van acute en late stralingsgeïnduceerde complicaties.

46

Besluit ...................................................................................................................................... 47

V

Referentielijst .......................................................................................................................... 48

Bijlagen ........................................................................................................................................

BIJLAGE A: Scoresysteem ............................................................................................. - 1 -

BIJLAGE B: RFLP protocols ........................................................................................... - 3 -

BIJLAGE C: HRM protocols ........................................................................................... - 5 -

BIJLAGE D: Snapschotprotocol ...................................................................................... - 8 -

BIJLAGE E: Geoptimaliseerde HRM protocol ................................................................ - 9 -

BIJLAGE F: Geoptimaliseerde snapschotprotocol ........................................................ - 10 -

BIJLAGE G: Resultaten van de genotypering ............................................................... - 11 -

BIJLAGE H: Associatie tussen patiënt- en dosisgerelateerde factoren voor acute

complicaties .................................................................................................................... - 18 -

BIJLAGE I: Associatie tussen de beschouwde SNPs en optreden van weefselcomplicaties. -

21 -

BIJLAGE J: Associatie tussen patiënt- en dosisgerelateerde factoren voor late complicaties

............................................................................................................................................. 30

VI

Afkortingen

AD Androgeendeprivatie

BER Base excision repair

BK Borstkanker

BSA Bovine Serum Albumine

CT Computed tomografie

CTC Common Terminology Criteria

CTV Clinical Target Volume

ddNTP Dideoxynucleotide trifosfaten

DNA DeoxyRiboNucleicAcid

DNA-PKCS DNA afhankelijke proteïn kinase katalytische subunit

dNTP Deoxynucleotide trifosfaten

DSB Dubbelstrengbreuken

dsDNA Dubbelstrengig DNA

EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur

EtBr Ethidiumbromide

GI Gastro-intestinaal

GTV Gross tumour volume

GU Genito-urinair

HE Heterozygoot

HR Homologe Recombinatie

HRM High Resolution Melting

HV Homozygoot variant

HWE Hardy Weinberg Equilibrium

IMRT Intensiteitsgemoduleerde radiotherapie

ITGB2 integrine beta 2

LENT-SOMA Late Effects on Normal Tisuue Subjectief Objectief Managent Analytisch

LD Linkage Disequilibrium

MRI Magnetic Resonance Imaging

MRN complex MRE11-RAD50-NBS1 complex

NCBI National Center of Biotechnology information

NER Nucleotide excision repair

NHEJ Non-homologous endjoining

PCR Polymerase chain reaction

PK Prostaatkanker

pN Lymfeklierresectie

PSA Prostaat specifiek antigen

PTV Plannend target Volume

Rbpa Rood bloedverlies per anum

RP Radicale Prostatectomie

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RT Radiotherapie

RTOG Radiation Therapy Oncology Group

SNP Single nucleotide polymorphism

SSB Enkelstrengbreuken

ssDNA Enkelstrengig DNA

Ta Hybridisatietemperatuur

TBE Tris-Boraat-EDTA

VII

TE Tris-EDTA

TGFB Transforming Growth Factor Beta

Tm Smelttemperatuur

TUR Transurethrale resectie

UZG Universitair ziekenhuis Gent

WT Wild type

XRCC X-Ray Cross Complementing

Inleiding

1

Samenvatting

Intensiteitsgemoduleerde radiotherapie is de standaardtherapie voor prostaatkanker in het

UZGent. Een hogere dosis resulteert in een betere tumorcontole maar anderzijds is de

incidentie van complicaties hoger. Gastro-intestinale (GI) en genito-urinaire (GU) toxiciteit

komt het meest voor. Het genetisch profiel van de patiënt zou hierbij een rol spelen. In dit

opzicht werd de associatie bestudeerd tussen SNPs in genen die een rol spelen in DNA herstel

en weefselrespons na bestraling en het optreden van acute GU (nocturie en frequentie), late GI

(frequentie, mucusverlies, urgentie, incontinentie) en late GU complicaties (hematurie,

nocturie, urgentie). De beschouwde SNPs zijn XRCC3 c.722C>T, Ku70 c.-1310C>G, ITGB2

c.819G>A, TGFB1 c.-800 G>A, TGFB1 c.-509 C>T, TGFB1 c.29 T>C, TGFB1 c.74 G>C en

TGFB1 g.10780 G>T.

Voor deze analyse werd DNA geïsoleerd uit vol bloed en vervolgens geamplificeerd via PCR.

Genotypering aan de hand van de Restriction Fragment Length Polymorphism werd toegepast

voor de SNPs TGFB1 c.-800 G>A, c.-509 C>T en c.74 G>C. High resolution melting (HRM)

werd gebruikt voor XRCC3 c.722 C>T en Ku70 c.-1310 C>G. Ten slotte werd de snapschot

techniek toegepast voor analyse van TGFB1 c.29 T>C. SNPs TGFB1 g.10780 T>G en ITGB2

c.819 G>A werden geoptimaliseerd voor HRM en snapschot analyse respectievelijk.

Statistische analyse via multivariate analyse werd uitgevoerd op een populatie van 329

prostaatkankerpatiënten. Uit het onderzoek van acute complicaties blijkt het XRCC3 c.722 TT

genotype geassocieerd te zijn met het optreden van GU nocturie en frequentie. De TGFB1

c.-509T, c.29C en g.10780G allelen blijken betrokken bij nocturie, terwijl een beschermend

effect wordt waargenomen van c.29 C en g.10780G voor urinaire frequentie. Bij haplotype-

analyse van de vijf TGFB1 SNPs blijkt het haplotype dat alle WT allelen bevat risicovol voor

de ontwikkeling van acute genifrequentie. Met betrekking tot late effecten blijkt het variante

allel XRCC3 c.722T, Ku70 c.-1310G, TGFB1 c.29C en TGFB1g.10780G een beschermend

effect te hebben op late complicaties. Ten slotte vertoont het ITGB2 c.819 en TGFB1 c.-800

A-allel een hoger risico op late GU en GI urgentie respectievelijk.

Het voorkomen van acute en late nevenwerkingen wordt ook beïnvloed door patiënt- en

dosisfactoren. Roken, pN en RP zouden beschermend zijn. Anderzijds verhoogt adjuvante

androgeendeprivatie, transurethrale resectie en abdominale chirurgie het risico op late urinaire

complicaties. Het volume van het rectum en sigmoïd dat een dosis ≥60 ontvangt is bepalend

voor het optreden van late GI complicaties. Het bestraald doelvolume van de prostaat heeft

eveneens een invloed op het voorkomen van acute en late GI en GU nevenwerkingen.

Inleiding

2

Inleiding

1. Prostaatkanker

Prostaatkanker (PK) is de meest voorkomende tumor bij mannen. In 2006 werden in België

9254 mannen geregistreerd met de grootste incidentie tussen 60 en 75 jaar [1]. De American

Cancer Society schat dat vorig jaar 217.730 nieuwe gevallen van prostaatkanker zijn

gediagnosticeerd in de VS en voor 32.050 mannen zou dit de doodsoorzaak zijn [2]. Verdere

ontwikkeling in preventie, diagnose, behandeling en follow up van prostaatkanker zijn dus

noodzakelijk.

De prostaat is een klier die gelegen is anterieur van het rectum en onder de urineblaas en het

produceert vocht dat dient ter bescherming van de zaadcellen in het semen. De urethra dat

urine en semen transporteert loopt dwars door het centrum van de prostaat (Fig1). Er zijn

verschillende types cellen aanwezig in de prostaat maar prostaatkanker ontwikkelt meestal uit

stromale cellen en kliercellen en wordt een adenocarcinoom genoemd [3].

Figuur1. De prostaatklier Bron. American cancer society [3]

2. Behandeling

Radiotherapie (RT), alleen of in combinatie met chirurgie en chemotherapie wordt gebruikt

om kankercellen te vernietigen. In ongeveer 50% van alle kankerpatiënten is RT een

onderdeel van de behandeling [4]. Standaardbehandelingen voor PK zijn radicale

prostatectomie en RT, zowel externe stralen als brachytherapie [5]. RT kan ook gecombineerd

worden met androgeendeprivatie (AD) [6]. In het UZ Gent is intensiteitgemoduleerde RT

(IMRT) de standaardtherapie. IMRT is een computergestuurd systeem waarbij straling

geleverd wordt tijdens het roteren rond de patiënt [7]. Deze techniek laat drie dimensionale

radiotherapie toe. Dit is mogelijk door middel van twee concepten, enerzijds door

Inleiding

3

optimalisatie van de behandelingsplanning en anderzijds kan de intensiteit gemoduleerd

worden [6]. Via computed tomografie (CT) en magnetic resonance imaging (MRI) wordt het

‘clinical target volume’ (CTV) bepaald dat de prostaat en de seminale vesikels omvat. De

omgevende risico-organen zijn het rectum, de blaas, het colon sigmoïdeum en de dunne darm

[8]. Voor een succesvolle behandeling met RT zijn relatief hoge dosissen nodig die

toegediend worden aan de volledige prostaatklier [5]. Een hogere dosis resulteert zowel in een

hogere tumorcontrole als een hogere kans op normale weefsel complicaties. Daardoor dient de

dosis binnen een bepaald bereik te blijven zodat de kans op tumorcontrole zonder

complicaties maximaal is (Fig2) [9]. IMRT laat toe de bestralingsdosis ter hoogte van de

volledige prostaat op te drijven en het slaagt er in de bestralingsdosis te beperken ter hoogte

van de omliggende organen [6].

Figuur2: Dosis-respons curve. Een hogere dosis verhoogt de probabiliteit op tumorgenezing (blauw), anderzijds

stijgt de kans op normale weefseltoxiciteit (rood). De stippellijn stelt de dosis voor geassocieerd met 60%

tumorcontrole en 5% ernstige late toxiciteit. Bron: Barnett et al.[9]

3. Stralingsgeïnduceerde complicaties

Tijdens RT wordt niet enkel de tumor bestraald maar ook normaal omliggende weefsels. Dit

kan ongewenste nevenwerkingen veroorzaken [9]. Stralingsgeïnduceerde complicaties kunnen

leiden tot een daling van de levenskwaliteit van de patiënt en zijn een belangrijke

dosislimiterende factor [10].

De weefselcomplicaties worden onderverdeeld in drie groepen. Enerzijds treden acute

effecten op tijdens of drie maand na het einde van de RT waarbij voornamelijk snel

proliferende weefsels worden getroffen. Deze zijn relatief ongevoelig voor veranderingen in

dosis per fractie maar zijn gevoelig voor de tijd waarin de straling geleverd wordt [9]. Acute

Inleiding

4

symptomen ontstaan wanneer celdood intreedt als gevolg van DNA schade door bestraling.

Ioniserende stralen activeren bovendien meerdere cellulaire pathways die leiden tot expressie

van pro-inflammatoire cytokines, vasculaire schade en activatie van de coagulatiecascade.

Deze veranderingen zouden betrokken zijn bij de ontwikkeling van oedeem, inflammatoire

respons en initiatie van wondhelende processen [11].

Acute effecten kunnen herstellen maar blijven soms persistent aanwezig. Deze chronische

lesies noemt men consequentiële effecten. Deze zijn een direct gevolg van een acute

stralingsrespons dat weefselschade veroorzaakt en die eventueel leiden tot late effecten na een

symptoomvrij interval. Urinaire en intestinale organen zijn hieraan het meest gevoelig

[12,13]. Als derde groep kunnen ook late effecten voorkomen. Deze komen voornamelijk

voor in traag proliferend weefsel tussen 3 maanden tot enkele jaren na RT en zijn meer

gevoelig voor veranderingen in dosis per fractie en minder gevoelig voor de totale

behandelingstijd [9]. De late complicaties zijn een gevolg van een combinatie van o.a.

stralingsgeïnduceerde fibrose, necrose, atrofie, inflammatie [14]. Deze kunnen irreversibel

zijn en beperken de stralingsdosis [9].

De verschillende weefselreacties krijgen een score, gaande van 1 tot 5, afhankelijk van de

ernst van de toxiciteit. Graad 1 symptomen zijn mild, graad 2 symptomen zijn middelmatig

ernstig en hebben nood aan een lokale interventie, graad 3 effecten zijn ernstig, graad 4

levensbedreigend en graad 5 leidt tot dood. In deze studie worden genito-urinaire en gastro-

intestinale bijwerkingen beschouwd. Deze zullen gescoord worden door middel van een

combinatie van gevalideerde schema’s: Common Terminology Criteria (CTC), Radiation

Therapy Oncology Group (RTOG), Late Effects on Normal Tisuue Subjectief Objectief

Managent Analytisch (LENT-SOMA) en via in-house observatie [8,15,16,17]. RTOG werd

gebruikt voor het scoren van late effecten. Later werd het SOMA scoresysteem gepubliceerd.

Dit laatste systeem is eveneens ontwikkeld voor het scoren van late effecten maar werd

opgenomen in het CTC scoresysteem, het eerste scoresysteem waar zowel acute en late

effecten zijn opgenomen [9].

3.1. Genito-urinaire toxiciteit

Acute genito-urinaire (GU) toxiciteit wordt verondersteld veroorzaakt te zijn door

inflammatie van de urethra en/of blaashals [8]. De acute fase van urinaire symptomen komt

voor vier tot zes weken na de start van RT waarbij patiënten pijn en een verhoogde urinaire

frequentie kunnen ervaren [18]. Het blaasvolume dat een dosis van >65 Gy ontvangt werd

Inleiding

5

beschouwd als een predictieve factor voor deze verhoogde frequentie [8]. De acute

symptomen verdwijnen meestal snel. De chronische fase ontwikkelt na zes maanden tot 2 jaar

na RT en wordt gekenmerkt door vasculaire ischemie en mucosale afbraak. De patiënten

ervaren geen inflammatoire symptomen zoals pijn en een brandend gevoel maar symptomen

die duiden op verzwakte spierfunctie van de blaas, zoals onvolledige lediging en verhoogde

urinaire frequentie. Daarnaast kunnen sporen van bloed voorkomen in de urine (hematurie).

Fibrose van de blaaswand met als gevolg een gedaalde urinaire capaciteit kan voorkomen tot

tien jaar na bestraling [18]. Nachtelijk urineren (nocturie), urgentie, pijnlijk urineren

(dysurie), hematurie en urinaire frequentie worden bestudeerd in deze studie.

3.2. Gastro-intestinale toxiciteit

Toxiciteit van de gastro-intestinale tractus (GI) wordt gemedieerd door afbraak van de

mucosale barrière en inflammatie, inductie van necrose, vasculaire sclerose en fibrose [18].

Het meest voorkomend acuut GI effect na bekkenbestraling is diarree [11]. Daarnaast kan ook

proctitis voorkomen [5]. De meest voorkomende late effecten aan GI tractus zijn verhoogde

stoelgangfrequentie, bloedverlies, partiële incontinentie en urgentie [14]. De rectale dosis zou

de meest determinerende factor zijn [19,20]. Mogelijke mechanismen voor late rectale

incontinentie zijn een beperkte absorptie door de rectale mucosa of neurovasculaire schade

die interfereert met de spieren rond het rectum [21]. Frequentie, urgentie en incontinentie

veroorzaken vooral ongemak bij vele patiënten en verlagen de levenskwaliteit meer in

vergelijking met occasionele rectale bloedingen [8]. In deze studie werden urgentie,

incontinentie, mucusverlies, rood bloedverlies per anum (rbpa) en een verhoogde fecale

frequentie opgenomen.

4. Pathogenese van normale weefseltoxiciteit

Ioniserende stralingen induceren op een directe manier clusters van ionisaties die een

spectrum van DNA lesies veroorzaken. Deze lesies kunnen zowel enkelstreng breuken (SSB)

als dubbelstreng breuken (DSB) zijn [22,23]. RT zorgt bovendien voor cytotoxische effecten

door indirecte ionisatie van DNA via vrije reactieve oxidatieve species gevormd door

radiolyse van water [4,22]. Oxidatieve stress bescherming beperkt deze schade en bestaat uit

verschillende enzymes en peptiden zoals superoxide dismutase, catalase en epoxide hydrolase

[4]. De respons op DNA schade resulteert in het herstel van DNA door het rekruteren van

enzymen voor DNA herstel of voor het stoppen van de celcyclus en/of apoptose [23]. Als

gevolg van RT wijzigt eveneens de micro-omgeving onder invloed van cytokines,

Inleiding

6

adhesiemolecules, influx van inflammatoire cellen en inductie van herstelmechanismen.

Genen betrokken bij deze processen zouden een invloed kunnen hebben op het ontwikkelen

van stralingsgeïnduceerde complicaties [9]. Om deze genetische basis te onderzoeken werden

genen geselecteerd die een rol spelen in deze processen. De functie ervan wordt hieronder

verder besproken.

4.1. DNA herstelpathways

SSB ontstaan door een breuk van een fosfodiësterverbinding in één streng van de DNA helix

en zijn voornamelijk het gevolg van indirecte ionisatie. Deze worden hersteld door

verschillende DNA herstelpathways zoals base-excision repair (BER), nucleotide excision

repair (NER) en mismatch repair. DNA DSB zijn het meest kritisch. Deze kunnen hersteld

worden door twee mechanismen, homologe recombinatie (HR) en non-homologous

endjoining (NHEJ), weergegeven in figuur 3 [22]. Indien deze niet hersteld worden kan dit

leiden tot celdood door de vorming van letale chromosoomaberraties [23]. Dit wordt

verondersteld een rol te spelen in het optreden van nevenwerkingen na radiotherapie [22]. In

deze studie zullen genen onderzocht worden die een rol spelen in DNA DSB herstel.

Figuur3: schematische voorstelling van homologe recombinatie (links) en non-homologe end joining (rechts)

Bron: bewerkt uit Downs JA et al [24].

Inleiding

7

4.1.1 Homologe recombinatie

HR treedt op in de S-G2 fase van de celcyclus en is enkel mogelijk in aanwezigheid van een

onbeschadigde homologe DNA streng [23,24]. Het MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) complex

wordt gerecruteerd na herkenning van de DSB. Het knipt nucleotiden weg ter hoogte van de

breuk waardoor een 3’ uiteinde wordt gevormd. Dit is een bindingsplaats voor zowel RAD52

als Ku70/80. Afhankelijk van welk ligand er bindt, zal er respectievelijk HR of NHEJ plaats

vinden.

RAD52 interageert na binden met RAD51. Dit zorgt voor een uitwisseling van een DNA

streng waardoor een ‘holiday junction’ wordt gevormd tussen het beschadigd en

onbeschadigd DNA. RAD54 stimuleert DNA synthese via DNA polymerase en finaal worden

de strengen opnieuw verbonden via een ligase [22,23,24]. Tijdens dit herstel interageert X-ray

cross complementing 3 (XRCC3) met RAD51 om initiatie van HR te promoten. Dit gen speelt

ook een rol in de stabilisatie van heteroduplex DNA [25].

4.1.2. Non- homologe end joining

NHEJ herstelt DSB zonder aanwezigheid van een homologe DNA streng en is vatbaar voor

fouten [22,23]. Deze komt voornamelijk voor in de G1 fase van de celcyclus [24]. Vooreerst

bindt het Ku70/Ku80 (XRCC6/XRCC5) heterodimeer op 3’ uiteinde gevormd door het MRN-

complex. Dit voorkomt verdere afbraak door exonucleasen. Vervolgens associeert dit

heterodimeer met een katalytische subunit van DNA-dependent protein kinase (DNA-PKcs).

Eens DNA-PKcs gebonden is, worden andere eiwitten aangetrokken. Finaal vormt XRCC4 een

stabiel complex met DNA ligase IV. Dit verbindt beide strengen opnieuw [23,24]. Deze

herstelpathway gebeurt heel snel [26]. Cellen deficiënt in één van de NHEJ hoofdeiwitten

vertonen hypersensitiviteit na ioniserende straling [27].

4.2. Adhesiemolecules

Adhesiemolecules mediëren cel-cel en cel-matrix interacties en zijn essentieel voor het

behoud van weefselintegriteit en tumorontwikkeling en progressie. Na blootstelling van

ioniserende straling zou de expressie van adhesiemolecules wijzigen en kan dit vervolgens

interfereren met inflammatie, fibrose, celsignalisatie en radioresistentie. Hierdoor spelen ze

mogelijks een rol in de ontwikkeling van late normale weefseleffecten na RT. Deze molecules

worden onderverdeeld in meerdere families, inclusief integrines, immunoglobulines,

selectines, cadherines en celoppervlak proteoglycanen. Integrines, zoals integrine beta 2

Inleiding

8

(ITGB2), bleek betrokken te zijn bij stralingsgemedieerde inflammatie en zijn mogelijks

betrokken bij normale weefselschade [28].

4.3. TGFB1

Transforming growth factor bèta 1 (TGFB1) behoort tot een familie van gesecreteerde

polypeptide groeifactoren [29]. TGFB1 zou betrokken zijn bij het ontwikkelen van late

complicaties, hoofdzakelijk stralingsgeïnduceerde fibrose. Daarnaast speelt TGFB1 ook een

rol in wondheling, activatie van inflammatoire cellen en productie van extracellulaire matrix

[14,30]. Blootstelling aan ioniserende stralen kan de expressie van TGFB1 doen stijgen op

een dosisafhankelijke manier en kan leiden tot overmatige fibrose. Daarnaast zorgt een

overexpressie van TGFB1 in de omgeving van een tumor voor bevordering van de lokale

groei en een hogere kans op metastasen [29]. TGFB1 kan dus de respons op RT beïnvloeden.

5. Inter-individuele variabiliteit

Er is een inter-individuele variabiliteit in het optreden en ernst van stralingsgeïnduceerde

normale weefsel effecten en deze volgt quasi een Gaussiaanse distributie. Het voorkomen van

complicaties is gerelateerd met dosimetrische factoren (totale dosis, dosis per fractie,

bestraald volume,…), klinische factoren (leeftijd, roken, diabetes, hypertensie,…) en het

genetisch profiel van de patiënt [9]. Bijkomende behandelingen zoals chemotherapie,

chirurgie en hormoontherapie kunnen ook een invloed hebben op het voorkomen van

neveneffecten.

De eerste indicaties voor een genetische basis voor ontwikkeling van klinische

radiogevoeligheid kwam van patiënten met zeldzame genetische syndromen, zoals ataxia

telangiectasia, Nijmegen breakage syndroom, Fanconi anemie en Bloom syndroom. Mutaties

in genen betrokken bij detectie van DNA schade en DNA herstel zijn verantwoordelijk voor

een verhoogde radiosensitiviteit in deze syndromen [31]. Ongeveer 80% van de variatie in

normale weefselreacties tussen patiënten zou genetisch bepaald zijn [9]. Single Nucleotide

Polymorfismen (SNPs) zouden hierbij een rol spelen. Dit zijn nucleotidesubstituties waarbij

het minor allel een voorkomen heeft van minimum 1% van de populatie en voor 90%

verantwoordelijk zijn voor de inter-individuele DNA sequentievariaties [31,32]. SNPs die de

genexpressie beïnvloeden kunnen voorkomen in alle regio’s van het genoom. SNPs gelegen in

coderende regio’s van genen kan functionele gevolgen hebben door foute opvouwing van

eiwitten, polaire shift en afwijkende fosforylatie. Dit komt voornamelijk voor als een

Inleiding

9

aminozuurwijziging optreedt. SNPs gelegen in niet-coderende kunnen regulatorische

sequenties beïnvloeden, zoals promotors, enhancers en silencers [33]. Anderzijds kunnen

deze splicing en RNA stabiliteit beïnvloeden [34]. In deze scriptie onderzoeken we of er een

associatie bestaat tussen onderstaande SNPs in genen die een rol spelen in DNA herstel,

adhesie en fibrose en klinische normale weefsel radiogevoeligheid.

5.1. XRCC3 c.722 C>T

Het XRCC3 gen speelt een rol in homologe recombinatie om het behoud van

chromosoomstabiliteit te onderhouden en herstel van DNA schade mogelijk te maken [25].

De XRCC3 c.722 C>T SNP (rs861539) is gelegen ter hoogte van codon 241 en veroorzaakt

een aminozuurwijziging van een threonine naar een methionine in exon 7. Dit zou zorgen

voor deficiëntie in DNA herstel met als gevolg meer chromosoomaberraties, deleties,

translocaties en micronucleï [35]. De associatie tussen deze SNP en RT geïnduceerde

nevenwerkingen werd reeds uitvoerig onderzocht in de literatuur. Dragers van het variant allel

zouden een hoger risico op nevenwerkingen vertonen [4], zoals late rectale bloedingen bij

bekkenbestraling en ernstige dysfagie bij hoofd- en halskankerpatiënten [25,36]. In

tegenstelling werd het homozygoot normaal genotype geassocieerd met een hoger risico op

subcutane fibrose na postmastectomie bij borstkanker (BK) [37].

5.2. Ku70 c.-1310 C>G

Naast zijn betrokkenheid in het DNA DSB herstel, speelt Ku70/Ku80 een rol in celadhesie,

migratie en invasie [38]. Ku70 c.-1310 C>G (rs2267437) is gelegen in de promotorregio. Het

variant allel is mogelijks geassocieerd met suboptimaal herstel van DSB [38] en werd

significant geassocieerd bevonden met een vier maal hoger risico op ontwikkeling van

ernstige dysfagie na RT bij hoofd en halskankerpatiënten [36].

5.3. ITGB2 c.819 G>A

Integrine beta 2 behoort tot de familie van integrine beta keten eiwitten. Ze combineren met

de familie van alpha keten eiwitten om zo β2 integrines te vormen. Dit zijn leukocyte

celadhesiemolecules met een belangrijke rol in celoppervlak signalisatie en

stralingsgemedieerde inflammatie [28,39]. De SNP rs2230528 is gelegen in exon 7 van het

ITGB2 gen op chromosoom 21. Het is een quad allelische variatie, dit wil zeggen dat het wild

type G allel kan vervangen worden door een A, een C en een T allel. De G>A substitutie is

het meest frequent. Recent onderzoek van onze onderzoeksgroep toonde aan dat dragers van

Inleiding

10

het variant allel voorspellend zou zijn voor de ontwikkeling van ernstige acute oesofagale

toxiciteit na RT bij longkankerpatiënten [39].

5.4. TGFB1 haplotype

De groeifactor TGFB1 zou een sleutelrol spelen in ontwikkeling van fibrose na

stralingsblootstelling [34]. Vijf SNPs in dit gen zullen geanalyseerd worden naar de associatie

met stralingsgeïnduceerde neveneffecten: TGFB1 c.-800 G>A, c.-509 C>T, c.29 T>C, c.74

G>C en 10780 T>G. De c.-800 en c.-509 SNPs, respectievelijk rs1800468 en rs1800469, zijn

gelegen in de promotorregio van het TGFB1 gen. C.-509 C>T is gelegen in de nabijheid van

een nucleaire hormoon receptor bindingsplaats en zou zo een effect kunnen hebben op de

transcriptie van het cytokine. C.29 T>C (rs1800470) is gelegen in exon 1 ter hoogt van codon

10. Dit leidt tot een substitutie van een Leucine in een Proline. Deze is gelegen in de

signaalsequentie en kan de secretie van TGFB1 beïnvloeden. De naburige SNP c.74 G>C

(rs1800471) is gelegen ter hoogte van codon 25 en leidt tot een substitutie van een polair

aminozuur arginine naar een apolair proline [14]. Beide SNPs die gelegen zijn in de coderend

gebied zijn gelegen in een regio van het TGFB1 gen dat een rol speelt in het transmembranair

transport van het cytokine doorheen het endoplasmatisch reticulum [30]. g.10780 T>G

bevindt zich in intron 2 van het TGFB1 gen (rs2241717). De nomenclatuur van de

beschouwde SNPs is weergegeven in tabel 1.

Deze vijf SNPs vormen samen mogelijks een haplotype dat veelbelovend is als kandidaat

voor een genetische basis voor stralingsgeïnduceerde nevenwerkingen. TGFB1 -509 C>T

werd reeds geassocieerd bevonden met complicaties na RT bij PK, cervix- en

endometriumkanker en BK [14,30,40]. Heterozygoten vertonen een significant hogere

plasmaconcentratie van TGFB1 [14]. De c.-800, c.29 en c.74 SNPs zouden bepalend zijn voor

het optreden van erectiele disfunctie na RT [30]. Een radioprotectief effect werd reeds

toegeschreven aan de aanwezigheid van het variant allel van c.29 T>C [41], terwijl Schirmer

et al. een beschermend effect observeerde bij aanwezigheid van het variant g.10780 G allel

[42]. Op basis van deze bevindingen kan men de hypothese opstellen dat dit TGFB1

haplotype de effecten van RT zou beïnvloeden.

Inleiding

11

Tabel 1. Nomenclatuur van de SNPs.

Gen SNP rs nummer

XRCC3

Ku70

ITGB2

TGFB1

c.722 C>T

c.1310 C>G

c.819 G>A

c.-800 G>A

c.-509 C>T

c.29 T>C

c.74 G>C

g.10780 T>G

rs861539

rs2267437

rs2230528

rs1800468

rs1800469

rs1800470

rs1800471

rs2241717

6. Doelstelling

Nevenwerkingen na RT hebben een invloed op de levenskwaliteit van

prostaatkankerpatiënten. Het optreden zou beïnvloed worden door het genetisch profiel van de

patiënt maar is heel complex. Radiogevoeligheid is het gevolg van interacties tussen genen

die betrokken zijn bij verschillende cellulaire pathways. Deze pathways bevatten genen

gerelateerd met DNA schade inductie en herstel, fibrose, adhesie en inflammatoire cytokines.

Het is dus een uitdaging om een combinatie van SNPs te vinden in deze genen die het

complexe fenotype beïnvloeden [4].

In deze masterproef zal nagegaan worden of er een associatie is tussen hierboven aangehaalde

SNPs en nevenwerkingen bij prostaatkankerpatiënten na IMRT. Hierbij worden dosimetrische

en patiënt gerelateerde factoren in rekening gebracht. Genito-urinaire bijwerkingen, nl.

nocturie, dysurie, frequentie, urgentie en hematurie samen met gastro-intestinale

bijwerkingen, nl. urgentie, incontinentie, mucusverlies, rood bloedverlies per anum en

verhoogde frequentie, zijn opgenomen als normale weefselcomplicaties. De SNPs die

onderzocht worden zijn: XRCC3 c.722C>T, Ku70 c.-1310C>G, ITGB2 c.819G>A, TGFB1 c.-

800 G>A, TGFB1 c.-509 C>T, TGFB1 c.29 T>C, TGFB1 c.74 G>C en TGFB1 g.10780 G>T.

De protocols voor PCR, snapschot en HRM voor het analyseren van ITGB2c.819G>A en

TGFB1 g.10780 G>T worden geoptimaliseerd.

Materiaal en Methoden

12

-Materiaal en Methoden

1. Introductie

In deze studie zullen SNPs gegenotypeerd worden om de genetische basis van

stralingsgeïnduceerde complicaties te onderzoeken. Hiervoor werden bloedstalen verzameld

van prostaatkankerpatiënten behandeld met IMRT in het Universitair Ziekenhuis Gent (UZG).

Uit deze stalen werd DNA geïsoleerd. Door middel van zelf gekozen primerparen werd het

gewenste fragment geamplificeerd via polymerase chain reaction (PCR). Vervolgens werden

de genetische variaties bepaald via Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), High

Resolution Melting (HRM) of Snapschot.

2. Studiepopulatie

De studiepopulatie bestaat uit 377 prostaatkankerpatiënten behandeld met IMRT in UZG. De

leeftijd op tijdstip van therapie varieert tussen 65 en 70 jaar. Na het invullen van een

‘informed consent’ werden bloedstalen afgenomen. Door de onderzoeksgroep werden reeds

311 stalen verzameld voor de start van deze scriptie. Aan elke patiënt die deelneemt aan de

studie werd gevraagd een lijst in te vullen om informatie te verkrijgen over hun leeftijd,

rookgedrag en voorkomen van hemorroïden, prikkelbaar darm syndroom, diabetes en gebruik

van statines. Tevens werden gegevens verzameld over abdominale chirurgie in het verleden,

transurethrale resectie (TUR), lymfeklierresectie (pN), radicale prostatectomie (RP) en

adjuvante hormoontherapie (AD).

De genito-urinaire nevenwerkingen werden gescoord door een combinatie van CTC, RTOG,

LENT-SOMA en in-house observatie [15,16,17]. De gastro-intestinale bijwerkingen werden

gescoord door gebruik te maken van RTOG, gecombineerd met de schaal voor GI urgentie en

incontinentie bepaald door Yeoh et al. [43] en via in house observatie (bijlage A) . Acute

toxiciteit werd gedefinieerd als een stijging van stralingsgeïnduceerde toxiciteit gedurende RT

of binnen drie maanden na het beëindigen van RT. Late toxiciteit werd gedefinieerd als een

stijgende stralingsgeïnduceerde toxiciteit startend zes maanden na RT of elke acute toxiciteit

die langer dan drie maanden aanhoudt. Voor elk symptoom werd de maximum

toxiciteitsscore geregistreerd. De studie werd goedgekeurd door het Ethisch Comité van UZG.


13

3. Dosimetrische gegevens

De prostaatkankerpatiënten kunnen behandeld worden volgens drie mogelijke

dosisvoorschriften: 74 Gy/Rectum 72 Gy (1), 76 Gy/Rectum 74 Gy (2) en 80 Gy/Rectum 76

Gy (3). Patiënten die een prostatectomie ondergaan worden enerzijds meteen behandeld

worden met een adjuvante radiotherapie of anderzijds pas na prostaat specifiek antigen

(PSA)1 falen. Deze patiënten ontvangen respectievelijk prescriptie (1) en (2). Bij primaire

radiotherapie varieert de dosis in functie van de tijd. Voor 2000 paste men prescriptie (1) toe,

tussen 2000 en 2003 prescriptie (2) en nu wordt prescriptie (3) verkozen. De voorgeschreven

dosis wordt gefixeerd ter hoogte van het planning target volume (prostaat en zaadblazen en

eromheen een expansie van 4-7mm) en wordt gegeven in 38 fracties. IMRT behandeling

wordt geleverd via 18MV-fotonen van een Elektra lineaire versneller, voorzien van een

multileaf collimator.

Dosimetrische gegevens van de patiënten werden verzameld, o.a. het volume van het orgaan

dat 40/60Gy of meer ontvangt (V40/60) en de maximale dosis in een bepaald punt van het

orgaan (Dmax). Specifieke volumes voor het plannen van radiotherapie zijn het ‘gross tumour

volume’ (GTV), ‘clinical tumor volume’ (CTV) en het ‘planned target volume’ (PTV) [44].

Het CTVtarget volume, CTVtarget max en CTV target50 werden beschouwd. Het CTVtarget

volume stelt het te bestralen doelvolume voor. De CTVtarget50 is de mediane dosis op de

prostaat en de seminale vesikels of het prostaatbed en is surrogaat voor de urethradosis.

4. DNA isolatie uit vol bloed

DNA isolatie kan rechtstreeks gebeuren uit vol bloed verzameld in ethyleendiaminetetra-

azijnzuur (EDTA) buizen. De eerste stap is cellyse waarbij het celmembraan van de cellen

wordt afgebroken. Hierbij wordt 3 ml bloed aan 9 ml rode bloedcellyse (Qiagen) toegevoegd.

Dit wordt gedurende 5 minuten geïncubeerd. Vervolgens wordt na centrifugatie gedurende 5

minuten aan 2000xg het supernatans verwijderd. Na hevig vortexen wordt 3 ml cellyse

oplossing (Qiagen) toegevoegd. Het protocol kan hier onderbroken worden daar de stalen 2

jaar stabiel blijven op kamertemperatuur. Vervolgens moeten de proteïnen neerslaan. Dit

gebeurt door 1 ml proteïne precipitatiebuffer (Qiagen) aan het cellysaat toe te voegen en

gedurende 20 seconden hevig te vortexen. Daarna wordt dit gedurende 5 minuten geincubeerd

op ijs en gecentrifugeerd gedurende 5 minuten aan 2000 x g. Deze stap wordt twee maal

1 Prostaat specifiek antigen wordt gesecreteerd door epitheelcellen van de prostaat en is in verhoogde

concentraties aanwezig bij prostaatkanker. Het meten van PSA wordt gebruikt voor het monitoren van de

respons op therapie [45].


14

uitgevoerd. De eiwitten zullen neerslaan met vorming van een donkerbruin pellet.

Aansluitend vindt DNA precipitatie plaats. Het supernatans dat het DNA bevat wordt

overgegoten in 3 ml 100% isopropanol (VWR). Dit wordt 50 maal omgedraaid om de DNA

draden zichtbaar te maken. Na 3 minuten centrifugeren aan 2000 x g is een pellet zichtbaar en

wordt het supernatans opnieuw afgegoten. Hieraan wordt 3 ml 70% ethanol (Sigma Aldrich)

toegevoegd om het DNA pellet te wassen. Vervolgens wordt het supernatans, na centrifugatie

van 1 minuut aan 2000xg, voorzichtig verwijderd om het pellet te isoleren. De buisjes worden

erna 10 minuten gedroogd aan de lucht. De laatste stap is DNA hydratie. Er wordt 500 µl

DNA hydratie oplossing (Qiagen) toegevoegd aan het pellet en gevortext gedurende 5

seconden. Dit wordt geïncubeerd gedurende 1 uur op 65°C. Finaal wordt de oplossing na

overnacht op kamertemperatuur bewaard op 4°C/-20°C in 1.5 ml buisjes.

5. Concentratiebepaling en verdunning van het DNA

Na DNA isolatie wordt de concentratie bepaald door middel van een Trinean Drop Sense-96

Multichannel spectrophotometer beschikbaar op de afdeling Medische Genetica in het UZG.

Deze meet de concentratie DNA in druppeltjes van 3 µl door bepaling van de hoeveelheid

ultraviolet licht of zichtbaar licht dat door de vloeistof wordt doorgelaten of geabsorbeerd. De

verhouding van de absorbantie bij 260 en 280 nm van 1.8 wordt beschouwd als een zuiver

staal. Eens de concentratie is bepaald wordt het DNA verdund tot een concentratie van 25

ng/µl. Dit gebeurt door toevoeging van Tris-EDTA (TE) buffer afhankelijk van de

hoeveelheid gewenste werkoplossing.

6. Polymerase chain reaction (PCR)

6.1. Principe

PCR is een snelle en accurate manier om DNA te amplificeren. Het algemene PCR proces

bestaat uit drie cycli die een specifieke tijdsduur en temperatuur vereisen. In de eerste fase

denatureert dubbelstrengig DNA (dsDNA) in enkelstrengig DNA (ssDNA) bij een

temperatuur van 95°C (Fig4B). Vervolgens daalt de temperatuur tot de

hybridisatietemperatuur (Ta) van de primers waarbij deze hybridiseren ter hoogte van

complementaire sequenties (Fig4C). Ta is afhankelijk van de base samenstelling van de

geselecteerde primers. Tijdens de derde fase vindt primerextensie plaats (Fig 4D). Bij een

temperatuur van 72°C zal het Taq polymerase deoxyribonucleotide trifosfaten (dNTPs)

inbouwen aan de DNA template om zo een complementaire streng te synthetiseren (Fig4).


15

Deze drie stappen worden 35 maal herhaald, wat resulteert in de amplificatie van het

gewenste DNA fragment (Fig4A) [46].

Figuur4 : PCR reactie: denaturatie (B), hybridisatie van primers (C), primerextensie (D) en amplificatie van het

fragment (A). Bron: Bijgewerkt uit Kim et al [46].

Het algemene PCR programma dat in deze thesis werd gebruikt is weergegeven in Tabel 2.

Dit werd toegepast op SNPs XRCC3 c.722 C>T, Ku70 c.-1310 C>G, TGFB1 c.29 T>A en

TGFB1 c.74 G>C met een hybridisatietemperatuur van 58 °C. Voor TGFB1 c.-800 G>A en

TGFB1 c.-509 C>T SNPs is de hybridisatietemperatuur 60°C. Het Bio-rad c1000 Thermal

Cycler PCR toestel en het Gene Amp ® PCR systeem van Applied Biosystems was ter

beschikking.

Tabel 2. Algemeen PCR programma Tabel 3. Standaardmix PCR

95°C 5min

95°C 30sec

Ta 30sec 35 cycli

72°C 30sec

72°C 10min

15°C 10min

Standaard PCR 3µl DNA 5µl DNA

dNTP (1mM) 3µl 5µl

Buffer (Kapa Taq hot start 5x) 3µl 5µl

MgCl2 (50mM) 0.9µl 1.5µl

Forward primer (50µM, Biolegio®) 0.3µl 0.5µl

Reverse primer (50µM, Biolegio®) 0,3µl 0.5µl

Kappa Taq (Kapa biosystems)

Sigma water (dH2O, Sigma Aldrich)

0.07µl

4.43µl

0.12µl

7.38µl


16

6.2. PCR condities

De standaard PCR mix is weergegeven in tabel 3. Deze wordt aangevuld met Sigma water

(dH2O, Sigma Aldrich). Er kan gewerkt worden met 3µl of 5µl DNA voor een totaalvolume

van 15µl of 25µl respectievelijk. Dit is afhankelijk van de hoeveelheid PCR product nodig

voor verdere analyse. Als negatieve controle wordt DNA vervangen door Sigma water (Sigma

Aldrich).

6.3. PCR primers

De primers werden zelf ontworpen of er werd gebruik gemaakt van het programma

primer3plus [47]. Vervolgens worden deze geproduceerd en geleverd door het bedrijf IDT®.

De selectiecriteria zijn een lengte van ongeveer 20 nucleotiden, forward primer die eindigt op

C/G, reverse primer die start met C/G en geen herhaling van drie nucleotiden. Idealiter is Ta

voor beide primers ongeveer gelijk. Deze is afhankelijk van de base samenstelling van de

geselecteerde primers en wordt bepaald via volgende formule: Ta= (≠ [T/A]*2) + (≠ [G/C] *

4) -2. In tabel 4 wordt een overzicht gegeven van de gebruikte primers.

Tabel 4. PCR primers

Gen Naam Sequentie Lengte (nt) Ta (°C)

XRCC3

c.722 C>T

124

122

5’-GGCCAGGCATCTGCAGTC-3’

5’-CTCACCTGGTTGATGCACAG-3’

18

20

63

60.3

Ku70

c.1310 C>G

145

147

5’-GTCGTGGCCCAAGTCTCC-3’

5’-CCATCATGCTGGGTGAGG-3’

18

18

61.7

61.1

TFGB1

c.-509 C>T /c.-

800 G>A

39

40

5'-GCAGTTGGCGAGAACAGTTG-3'

5' -TGGGTCACCAGAGAAAGAGG-3’

20

20

60.0

60.0

TGFB1

c.74 G>C/

c.29T>C

41

42

5' -TGTTCGCGCTCTCGGCAG-3'

5' -GACCTCCTTGGCGTAGTAG-3'

18

19

58.0

58.0

6.4. PCR controle

Ter controle van de PCR wordt een gelelektroforese uitgevoerd. Hierbij wordt een 1.5%

agarosegel gemaakt door 1.5 g agarosepoeder (Invitrogen) toe te voegen aan 100ml TBE

buffer (0.5X). Na opwarming wordt een heldere vloeistof bekomen. Vervolgens wordt deze

overgebracht in een houder en met gebruik van kammetjes worden laantjes verkregen. Voor

de aanmaak van een stockoplossing Tris Boraat EDTA (TBE) buffer (10X, Sigma Aldrich)

wordt 54 g Tris, 27.5 g Boraat en 4.65 g EDTA2Na opgemengd in 500 ml dH2O. Deze

stockoplossing wordt 20 keer verdund met dH2O om de werkoplossing (0.5X) te krijgen. De

gel is na 30 min opgesteven en kan geladen worden. Aan elk laantje wordt 2µl PCR-fragment,


17

1µl ladingsbuffer (500µl glycerol en 250µl broomfenolblauw samen in 250µl dH20) en 8µl

H2O toegevoegd. Daarnaast wordt aan één laantje 1 µl DNA ladder (Invitrogen) gepipetteerd

dat resulteert in meerdere bandjes met een gekende grootte. Aan de hand van deze kan men

nagaan of het juiste amplicon werd verkregen. Na laden van de gel wordt het

elektroforesetoestel (Cosmo Bio, Westburg) ingesteld op 135 V gedurende 27 min. Finaal

wordt de gel geanalyseerd door kleuring met ethidiumbromide (EtBr Gibco, 0.5 µg/ml)

gedurende 30 minuten en visualisatie onder UV-licht (UV-Transilluminator, UPV). Van elke

gel wordt een foto (Olympus camera) genomen die bewaard blijft op de computer. De PCR is

succesvol als één bandje op de gewenste hoogte zichtbaar is en de controle negatief is.

7. Genotypering

Genotypering van de SNPs kan gebeuren op verschillende manieren, in deze thesis wordt

gebruik gemaakt van Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), welke enkel kan

uitgevoerd worden wanneer een geschikt resctrictie-enzym voorhanden is. Indien dit niet het

geval is, wordt via High Resolution Melting (HRM) of Snapschot toegepast.

7.1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

De SNPs TGFB1 c.-800 G>A, TGFB1 c.-509 C>T en TGFB1 c.74 G>C worden

gegenotypeerd via RFLP. Na PCR wordt het geamplificeerd fragment geïncubeerd met een

specifiek restrictie-enzym op een bepaalde temperatuur. Het restrictie-enzym wordt

geselecteerd via het programma ‘Restriction Mapper’ [48]. Een geschikt restrictie-enzyme zal

het fragment afhankelijk van het aanwezige allel al of niet knippen. Dit resulteert in een

specifiek knippatroon. De geselecteerde enzymen worden geleverd door Biolabs. De mix

bestaat uit PCR-product, buffer (10% van totaalvolume), restrictie-enzym en afhankelijk van

het enzym bovine serum albumine (BSA, Biolabs). Deze mix wordt aangelengd met dH2O tot

een eindvolume van 30µl. Dit wordt in een warmwaterbad (Polystat24, Fisher scientific)

geplaatst op de optimale temperatuur voor het enzym gedurende een optimale tijdsduur. De

gebruikte RFLP protocols zijn terug te vinden in bijlage B. Controle van het digest gebeurt

via 2% agarose gelelektroforese. De gel wordt achtereenvolgens geladen met ladder, een staal

ongeknipt PCR product ter bevestiging van de werking van het restrictie-enzym en

digestproduct waaraan 3 µl ladingsbuffer is toegevoegd. Daarna wordt de gel geplaatst in het

elektroforesetoestel (Cosmo Bio, Westburg) ingesteld op 135 Volt gedurende 40 min. Voor

visualisatie van de bandjes wordt de gel in een EtBr bad gelegd gedurende 30 min, waardoor


18

deze fluoresceren onder UV-licht. Bij een succesvolle restrictie wordt een knippatroon

zichtbaar waarbij de fragmenten gescheiden zijn op basis van lengte.

7.2. High Resolution Melting (HRM)

De SNPs XRCC3 c.722 C>T en Ku70 c.1310 C>G worden geanalyseerd via HRM. Dit is een

high-troughput techniek voor het identificeren van genetische variaties. Voor deze scriptie

werd gebruikt gemaakt van het Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR systeem en de

geassocieerde Applied Biosystems HRM software v2.0.

7.2.1 Algemene beschrijving

Deze techniek start met de amplificatie van het gewenste DNA fragment (±100bp) in

aanwezigheid van een fluorescente dsDNA bindende kleurstof. Deze kleurstof geeft een hoog

fluorescent signaal als deze gebonden is op dsDNA en een laag fluorescent signaal in

enkelstrenge toestand. De HRM mixen voor de geanalyseerde SNPs (XRCC3 c.722 C>T en

Ku70 c.1310 C>G) zijn weergegeven in Tabel.5. De mix wordt aangelengd met dH20 tot een

eindvolume van 20 µl. De HRM reagentia, 96 well platen en de adhesieve film worden

geleverd door Applied Biosystems.

Tabel 5. HRM mix

Product (concentratie) Hoeveelheid

XRCC3 c.722C>T Ku70 c.-1310C>G

AmpliTag Gold ® Buffer (10X)

MgCl2 (1.5mM)

dNTP (0.2mM)

Forward primer (300nM)

Reverse primer (300nM)

MeltDoctor TM

HRM dye (20X)

AmpliTaq Gold ® 360 DNA

polymerase (0.0125 U/ µl)

DNA (25ng/µl)

2 µl

1.2 µl

0.4 µ

1.2 µl

1.2 µl

1 µl

0.05 µl

1µl

2µl

1,6µl

0,4µl

1,2µl

1,2µl

1µl

0,2µl

1µl

Na amplificatie vindt een graduele uitsmelting plaats van de resulterende amplicons. Door de

temperatuursstijging denatureert het dsDNA in ssDNA waarbij de fluorescente kleurstof

vrijkomt. Het meten van een groot aantal fluorescente data per temperatuursverandering door

een optisch systeem resulteert in karakteristieke smeltpatronen (Fig5) die het mogelijk maken

de sequentievariatie af te leiden. Het algemeen HRM programma is weergegeven in tabel 6.


19

Tabel 6. Algemeen HRM programma

Stadium Reactiestap Temperatuur (°C) Tijd

Holding

Cycling (40 cycles)

Melt curve/dissociatie

Enzyme activatie

Denature

Anneal/Extend

Denature

Anneal

High Resolution melting

Anneal

95

95

60 (Ta)

95

60

95

60

10 min

15 sec

1 min

10 sec

1 min

15 sec

15 sec

De vorm van de smeltcurves varieert afhankelijk van de sequentie. Enerzijds zijn er

smeltcurves die gelijkaardig zijn in vorm maar van elkaar te onderscheiden zijn door een

verschillende smelttemperatuur (Tm). Deze worden gegenereerd door het wild type (WT)

(rode curve Fig5) en het homozygoot variante genotype (HV) (groene curve Fig5). De

homozygoten vertonen na amplificatie enkel homoduplexen. Het verschil in Tm is te wijten

aan de sequentievariatie. Anderzijds vertonen smeltcurves van heterozygoten een

verschillende vorm (blauwe curve Fig5) in vergelijking met de homozygoten [49,50].

Amplificatie van heterozygoten geeft vorming van heteroduplexen. Deze wijzigen de vorm

van de smeltcurve [50].

Figuur 5: Smeltcurve HRM, rood= homozygoot variant, groen= homozygoot wildtype, blauw=

heterozygoot. Bron: http://products.appliedbiosystems.com [49].

7.2.2. Spike-in techniek

SNPs kunnen onderverdeeld worden in verschillende klassen afhankelijk van hun

baseverandering: klasse 1 (C/T, G/A), klasse 2 (C/A, G/T), klasse 3 (C/G) en klasse 4 (A/T).

De eerste twee klassen zijn eenvoudig te detecteren via HRM daar ze een Tm shift

veroorzaken van ongeveer 1°C. Ze komen vaker voor in het humane genoom in vergelijking


20

met klasse drie en vier die moeilijker te onderscheiden zijn. Bij deze laatste verschilt Tm maar

0.2-0.5°C [49]. Daarom werd binnen de onderzoeksgroep de spike-in techniek

geoptimaliseerd die toelaat om SNPs behorend tot klasse drie en vier te genotyperen. Deze

techniek wordt toegepast op de klasse drie SNP Ku70 -61C>G. Hierbij worden twee

opeenvolgende reacties uitgevoerd. Eerst wordt een standaard reactie uitgevoerd om zo het

onderscheid te maken tussen heterozygote (HE) (blauwe curve Fig6) en homozygote stalen

(groene curve Fig6). Deze reactie maakt geen onderscheid tussen wild type en homozygoot

variante stalen. Bij een tweede reactie wordt aan elk staal 1 µl spike-in wild type DNA

toegevoegd. Dit veroorzaakt de vorming van twee heteroduplexen in de aanwezigheid van een

homozygoot variant genotype. Deze heteroduplexen geven een afwijkende curve. Op deze

manier kan het onderscheid gemaakt worden tussen het WT (rode curve Fig6) en het HV

genotype (paarse curve Fig6).

Figuur6: Smeltcurve van standaard reactie (links) en na toevoegen spike-in DNA (rechts).

7.2.3. Optimalisatie HRM

De optimalisatie van het HRM protocol van TGFB1 g.10780 T>G vormt één van de

doelstellingen van deze thesis. Voor deze analyse zijn steeds controlestalen noodzakelijk. Dit

vereist sequenering van een aantal stalen. Dit gaat gepaard met een PCR optimalisatie en het

selecteren van primers. Eens het genotype van deze controlestalen gekend is, kan de

optimalisatie van start gaan. Er worden verschillende HRM mixen met meerdere primerparen

(tabel5) en HRM programma’s (tabel 6) getest om tot optimale smeltcurves te komen die

duidelijk het verschil weergeven tussen de verschillende genotypes.


21

7.3. Snapshot

Genotypering van SNP TGFB1 c.29 T>C gebeurt via Snapshot fragment analyse. Deze

methode is gebaseerd op primerextensie. De snapshotprimers worden zelf ontworpen aan de

hand van de NCBI sequentie. De snapshotprimer voor deze SNP is weergegeven in tabel 7.

Eerst wordt het DNA geamplificeerd via PCR en vervolgens opgezuiverd door aan 5µl PCR

product 1 µl vSAP (USB) (verdunning 1:2 met Sigma water) en 1 µl vExoI (USB)

(verdunning 1:10 met Sigma water) toe te voegen terwijl de stalen op ijs worden geplaatst. De

stalen worden gevortext en afgedraaid. Daarna worden de stalen geplaatst in het PCR toestel

gedurende 60 min op 37°C en 15 min op 75°C, zo wordt respectievelijk de enzymreactie

geïnitieerd en stop gezet. Deze opzuivering is noodzakelijk om primers, ongebonden dNTPs

en fosfaatgroepen te verwijderen. Voor de tweede stap worden de stalen geplaatst op ijs en

volgt de snapshot PCR reactie. Per 2 µl opgezuiverd PCR product wordt 4 µl master mix

toegevoegd. Deze bevat per staal 0.5 µl snapshotprimer (100µM) (ITD), 1.25µl verdunde

RRmix en 2.25 µl H2O (Sigma Aldrich). De verdunde RR-mix wordt verkregen door de RR-

mix (ABI Prism SNaPschot multiplex kit) acht maal te verdunnen met Tris HCl MgCl2

(Sigma). De oplossingen met een eindvolume van 6 µl worden opnieuw geplaatst in het PCR

toestel gedurende 30 cycli, opeenvolgend 10 sec op 96°C, 5 sec op 50°C en 30 sec op 60°C.

Tijdens deze reactie zullen de geselecteerde primers die de SNP flankeren meteen

stroomopwaarts/stroomafwaarts van de SNP binden. Tijdens de primerextensie worden

fluorescente dideoxy nucleoside trifosfaten (ddNTPs) ingebouwd ter hoogte van het 3’

uiteinde. De ddNTPs (A/C/T/G) hebben een verschillende fluorescerende kleur en missen een

hydroxylgroep waardoor deze na inbouw verdere ketenverlenging vermijden. In de derde stap

moet het verkregen product opgezuiverd worden door per staal 1µl vSAP toe te voegen

(verdunning 1:4) en voor 60 min op 37°C en 15 min op 75°C te plaatsen in het PCR toestel.

Vervolgens worden de stalen getransporteerd naar de afdeling Medische Genetica van het

UZGent waar de stalen uitgelezen worden door middel van de ABI Prism 3730 Genetic

Analyser. Aan de hand van de ingebouwde fluorescente ddNTPs worden gekleurde curves

verkregen. Elk nucleotide heeft een specifieke kleur: A is groen, G is blauw, C is zwart en T

is rood. Op deze manier kan men analyseren welk allel aanwezig is op de SNP plaats.

Tabel 7. Snapshot primers

Gen Naam Sequentie Lengte (nt) Ta(°C)

TGFB1 c.29 T>C SS04 5'-TAGCCACAGCAGCGGTAGCAGCAGC-3' 25 80


22

7.3.1. Optimalisatie Snapschot

De optimalisatie van het snapshotprotocol van ITGB2 c.819 G>A vormt eveneens één van de

doelstellingen van deze thesis. In de eerste stap is selectie nodig van zowel een primerpaar

voor PCR als twee snapshotprimers. Vervolgens worden de PCR omstandigheden

geoptimaliseerd. Ten slotte worden twee snapshot master mixen uitgetest met verschillende

snapshotprimer om tot duidelijke pieken te komen die analyse van het genotype mogelijk

maken.

8. Kwaliteitscontrole

Om de verkregen resultaten te verifiëren worden per SNP ongeveer 15% van de stalen een

tweede maal gegenotypeerd. Als er afwijkingen worden gedetecteerd worden de stalen

opnieuw geanalyseerd om fouten te elimineren.

9. Statistische analyse

In de studie worden meerdere eindpunten onderzocht, eindpunt 1 en 2 zijn de associaties

tussen SNPs en optreden van acute geninocturie en genifrequentie. Eindpunt 3 is de associatie

tussen haplotypes van de TGFB1 SNPs en optreden van acute GU complicaties. Associatie

tussen SNPs en optreden van late GI complicaties is het vierde eindpunt. Ten slotte is het

vijfde eindpunt de associatie tussen SNPs en optreden van late GU complicaties.

De analyses zullen uitgevoerd worden met behulp van SPSS v.17 softwarepakket. Om na te

gaan of patiëntgerelateerde parameters (leeftijd, diabetes, roken, hemorroïden, abdominale

chirurgie, TUR, pN, AD, RP) of dosisgerelateerde parameters van de blaas, urethra en

rectum/sigmoïd een invloed hebben op het optreden van neveneffecten wordt een Mann-

Whitney U test of een chi-kwadraat test uitgevoerd. Voor het bepalen van de mogelijke

associatie tussen het voorkomen van een SNP met het optreden van GI en GU complicaties

wordt de odds ratio en de p-waarde berekend via logistieke regressie. Een p-waarde kleiner

dan 0.05 wordt gezien als statistisch significant. De invloed van mogelijke confounders zal in

rekening gebracht worden via multiple regressie.

Testen van Hardy Weinberg Equilibrium worden uitgevoerd aan de hand van de

genotypefrequenties en χ² test. Analyse van linkage disequilibrium tussen de vijf TGFB1

SNPs gebeurt aan de hand van het Haploview 4.2 programma.

Resultaten

23

Resultaten

1. Reeds geoptimaliseerde protocols

1.1. RFLP geoptimaliseerde protocols

De protocols voor het genotyperen van de SNPs TGFB1 c.-800 G>A, TGFB1 c.-509 C>T en

TGFB1 c.74 G>C werden reeds geoptimaliseerd door de onderzoeksgroep. De RFLP techniek

werd toegepast. Na inwerking van restrictie-enzymes, respectievelijk Bsu36I, HpyCh4IV en

BgII, werden specifieke knippatronen verkregen na gelelektroforese (zie Fig7). Aan de hand

van de lengte van de fragmenten kan een onderscheid gemaakt worden tussen de genotypes.

De protocols zijn terug te vinden in bijlage B.

Figuur7. Digest gels voor genotypering A: TGFB1 c.-509 C>T, B: TGFB1 c.-800 G>A en C: TGFB1 c.74

G>C. Van links naar rechts: ladder, ongeknipt product en 4 geknipte stalen.

1.2. HRM geoptimaliseerde protocols

De SNPs XRCC3 c.722 C>T en Ku70 c.-1310 C>G werden reeds door de onderzoeksgroep

geoptimaliseerd via HRM analyse. De standaard HRM mix (Tabel5) en het standaard HRM

protocol (Tabel6) met Ta 60°C voor de XRCC3 c.722 C>T SNP en 66°C voor de Ku70 c.-

1310 C>G SNP werden toegepast. Zoals reeds vermeld wordt voor het genotyperen van Ku70

c.-1310 C>G de spike-in techniek gebruikt. De protocols zijn weergegeven in bijlage C.

1.3. Snapschot geoptimaliseerde protocol

Snapshotanalyse werd toegepast voor het genotyperen van TGFB1 c.29 T>C. Dit is een

arbeidsintensieve maar high-troughput techniek die toelaat om 96 stalen in één analyse te

genotyperen. De snapshotanalyse aan de hand van de snapschot primer SS04 (Tabel7) werd

reeds geoptimaliseerd door de onderzoeksgroep (bijlage D).

Resultaten

24

2. Optimalisaties

2.1. Optimalisatie SYTO-9 dye voor HRM analyse

De fluorescente kleurstof die in het lab wordt gebruikt voor HRM analyse is Meltdoctor HRM

dye. Dit is een gestabiliseerde vorm van de dubbelstreng bindende kleurstof SYTO-9 dat

wordt aangeboden door Applied Biosystems voor de HRM applicatie op het Applied

Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR systeem. Om de kosten proberen te beperken werd

geopteerd om Meltdoctor HRM dye te vervangen door het goedkoper alternatief SYTO-9

Green fluorescent Nucleic Acid Stains (Invitrogen). Voor de optimalisatie werd een

concentratie van 50 µM aangeraden door de firma. De stockoplossing (5 mM) dient 100 maal

verdund te worden met een oplossing die geen fosfaatgroepen bevat. Er werd geopteerd om 1

µl SYTO-9 (5 mM) te verdunnen met 99 µl TE buffer. Voor de optimalisatie werden vier

standaardmixen uitgetest in één HRM analyse waarbij de XRCC3 c.722 C>T werd

gegenotypeerd. Drie mixen bevatten SYTO-9: 0.6 µl per staal (1.5 µM), 0.8 µl per staal (2

µM) en 1 µl per staal (2.5 µM). Deze resultaten werden vergeleken met de standaardmix die

Meltdoctor HRM dye bevat. Controlestalen waarvan het genotype van deze SNP reeds

gekend is werden gebruikt. De verkregen smeltcurves weken sterk af van de smeltcurve

verkregen met Meltdoctor.

De volgende optie was een verdunning van de SYTO-9 kleurstof met dH2O. Hierbij werd 1 µl

SYTO-9 (5 mM) verdund met 99 µl dH2O. Twee standaardmixen met 0.6 µl en 0.8 µl SYTO-

9 (50 µM) per staal werden geanalyseerd, met gebruik van dezelfde controlestalen gebruikt.

De verkregen smeltcurves zijn optimaal, met een beter resultaat voor 0.6 µl 50 µM SYTO-9

(zie Fig8). Het geoptimaliseerd HRM protocol van XRCC3 c.722 C>T met gebruik van

SYTO-9 is terug te vinden in bijlage C.

Figuur8. Smeltcurves optimalisatie XRCC3 c.722 C>T met SYTO-9 kleurstof met verdunning in dH2O met 0.6

µl (A) en 0.8 µl (B) SYTO-9 (50 µM) per staal.

Resultaten

25

Het HRM protocol van Ku70 c.1310 C>G werd eveneens geoptimaliseerd met SYTO-9

kleurstof. Er werd een optimale smeltcurve bekomen als de SYTO-9 5 mM stockoplossing

verdund werd met dH2O tot 50 µM en het volume 3% glycerol bevat. De 50 µM

werkoplossing bestaat uit 1 µl 5mM SYTO-9 en 3 µl glycerol in 96 µl dH2O. De verkregen

smeltcurves zijn weergegeven in figuur 9. Links is de curve bij de standaardreactie waar een

onderscheid mogelijk is tussen homozygoot vs heterozygoot en rechts is de curve verkregen

na het toevoegen van spike-in DNA zodat homozygoot varianten onderscheiden kunnen

worden van homozygoot WT. Het geoptimaliseerd HRM protocol van Ku70 c.1310 C>G met

gebruik van SYTO-9 is terug te vinden in bijlage C.

Figuur9. Smeltcurves na optimalisatie Ku70 c.1310 C>G met A de standaardreactie (groen: homozygoot en

blauw= heterozygoot) en B na toevoeging van spike-in DNA (groen: homozygoot WT en rood: homozygoot

variant).

2.2. Optimalisatie TGFB1 g.10780 T>G HRM protocol

Voor het optimaliseren van de TGFB1 g.10780 T>G werd geopteerd voor analyse via HRM

want er is geen restrictie-enzym voorhanden. In de eerste stap werden drie primerparen

geselecteerd aan de hand van de NCBI sequentie en het Primer3Plus programma [47]. Deze

zijn weergegeven in tabel 8. Bijkomende variaties aanwezig in de ampliconsequentie moeten

vermeden worden. In dit geval zijn er naast een SNP ook inserties (T) aanwezig. De

frequentie van voorkomen is echter verwaarloosbaar. Optimalisatie van HRM vereist een

aantal gekende stalen. Deze worden bekomen door sequenering van een 15-tal stalen.

Voorwaarden voor de sequenering zijn 10 µl PCR product en een amplicon van 100-800 bp.

Er werd geopteerd voor primerpaar 217-219 waar het amplicon 152 bp groot is. De standaard

PCR mix (Tabel 3) en het algemeen PCR programma (Tabel 1) met een Ta van 60°C gaven

optimale resultaten (zie Fig10). Er werden 15 stalen geamplificeerd en ingediend in de

Medische Genetica UZGent voor sequenering via de Sanger methode. De resultaten werden

geanalyseerd aan de hand van de Sequence Scanner™ Software (Applied Biosystems).

https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=600583&tab=Overview

Resultaten

26

Tabel 8. Primerparen TGFB1 g.10780 T>G

Gen HRM

Mix

Naam Sequentie Lengte

(nt)

Lengte PCR

fragment (bp)

Ta

(°C)

TGFB1

g.10780

T>G

mix1 216

219

5’-GGAGAGGGTGAGCTGTGACC-3’

5’-CAGCTTGGCAACAGAGTGAG-3’

20

20

155 62.2

59.8

Mix 2 217

219

5’-GAGGGTGAGCTGTGACCAAG-3’

5’-CAGCTTGGCAACAGAGTGAG-3’

20

20

152 60.9

59.8

Mix 3 218

220

5’-GTCGGCTGGTTACAAGGTC-3’

5’-GCTTGGCAACAGAGTGAGAC-3’

19

20

117 58.1

58.6

Figuur10. Optimalisatie PCR TGFB1 10780 T>G met primers 217/219

Voor het optimaliseren van het HRM protocol werden drie standaardmixen (Tabel 5) met

verschillende primerparen uitgetest (Tabel 8). Het standaard HRM programma met een Ta van

60°C werd toegepast. Voor elke mix werden 15 stalen geanalyseerd met gekend genotype.

Mix 2 en 3 gaven goede resultaten maar er werd gekozen voor mix 3, met primers 218 en 220,

omdat de smeltcurve duidelijker is (zie Fig11). Het HRM protocol werd eveneens

geoptimaliseerd voor de SYTO-9 kleurstof. Hiervoor werd 1 µl Meltdoctor vervangen door

0,6 µl 50 µM SYTO-9 per staal. Het standaard HRM programma met een Ta van 60°C werd

opnieuw toegepast. Zoals weergegeven in figuur 16D zijn de verschillende genotypes goed te

onderscheiden aan de hand van de smeltcurve. Het geoptimaliseerde HRM protocol van

TGFB1 g.10780 T>G staat beschreven in bijlage E.

Figuur11. HRM smeltcurves (TGFB1 g.10780 T>G) verkregen met mix1 (A), mix2 (B), mix3 (C) en SYTO-9

(D). Groen: homozygoot WT, blauw: heterozygoot en rood: homozygoot variant.

Resultaten

27

2.3. Optimalisatie snapschot protocol ITGB2 c.819 G>A

Omdat deze SNP quadallelisch is wordt deze SNP bepaald d.m.v. snapschot. In de eerste stap

van de optimalisatie werden primers geselecteerd aan de hand van de National Center for

Biotechnology Information (NCBI) sequentie. Een paar primers voor de amplificatie van een

fragment dat de polymorfe regio bevat (Tabel 9) en enkele snapshotprimers (Tabel10). De

snapshotprimers flankeren de SNP plaats zodanig dat bij primerextensie een fluorescente

ddNTP wordt ingebouwd ter hoogte van de SNP. Er werd een forward (SS21) en een reverse

primer (SS22) geselecteerd. Deze zijn terug te vinden in tabel 10 en werden geleverd door

IDT. De volgende stap is amplificatie van het fragment. Dit vereist optimalisatie van de PCR.

Aan de hand van de standaard PCR mix (Tabel 3) en het algemeen PCR programma (Tabel 1)

met een Ta van 62°C werden optimale resultaten verkregen (Fig12).

Tabel 9. Primerpaar ITGB2 c.819 G>A

Gen Naam Sequentie Lengte(nt) Lengte PCR

fragment(bp)

Ta (°C)

ITGB2

c.819 G>A

244

245

5’-CCACGCCTTCTTCTCAGGAG-3’

5’-GGTCAGAAGGAGGCTCTGTC-3’

20

20 272

62

62

Figuur12. Optimalisatie PCR ITGB2 c.819 G>A

Vervolgens werden de voorbereidende stappen voor snapshotanalyse uitgevoerd en ingediend

bij de dienst Medische Genetica UZGent voor fragmentanalyse. Analyse van de SS21 primer

gaf blauwe (G) en groene (A) pieken terwijl met SS22 zwarte (C) en rode (T) pieken werden

verkregen. Het was duidelijk dat SS21 minder ruis gaf dus werd deze snapshotprimer

geselecteerd. Het geoptimaliseerde protocol is weergegeven in bijlage F.

Tabel 10. snapshotprimers ITGB2 c.819 G>A

Gen Naam Sequentie Lengte(nt) Ta (°C)

ITGB2

c.819 G>A

SS21 5’-GACGGCTTCCATTTCGCGGGCGACGG-3’ 26 86

SS22 5’-CGTTGGGGGTCAGGATGGCGCCCAGCTT-3’ 28 92

Resultaten

28

3. SNP data

Voor elke SNP werden 377 stalen gegenotypeerd. Hiervan werden 48 patiënten geëxcludeerd

door aanwezigheid van kliermetastasen en/of hypofractionatie of onvoldoende follow up. De

minor allel frequenties (MAFs) berekend op deze populatie (n=329) voor XRCC3 c.722 C>T,

Ku70 c.-1310 C>G en ITGB2 c.819 G>A, zijn respectievelijk 35%, 38% en 23%. De

geobserveerde genotypefrequenties zijn consistent met het Hardy-Weinberg equilibrium

(HWE). Zowel MAFs als de p-waarden van HWE zijn weergegeven in tabel 11.

In totaal werden vijf SNPs in TGFB1 gegenotypeerd (lijst in bijlage G). De MAFs voor

TGFB1 c.-800G>A, c.-509C>T, c.29T>C, c.74G>C en g.10780 T>G zijn respectievelijk

9.6%, 28.9%, 37.2%, 8.9% en 41.0%. De positie van de TGFB1 polymorfismen en de linkage

analyse is weergegeven in figuur 18. De vijf SNPs liggen samen in een regio van 6kb. Om na

te gaan of de SNPs in linkage disequilibrium (LD) zijn wordt de r²-waarde berekend. Linkage

wordt beschouwd bij r²-waarden ≥ 0.80. De r²-waarden voor de vijf SNPs zijn weergegeven in

de LD-plot (Fig13). SNPs TGFB1 c.-509 C>T/c.29 T>C zijn bijna in linkage met een r²

waarde van 0.65. TGFB1 c.509C>T/g.10780T>G bereikt een r² waarde van 0.54. Overige

SNPs vertonen geen linkage.

Tabel 11. Kenmerken van de SNPs

XRCC3

c.722

C>T

Ku70

c.-1310

C>G

ITGB2

c.819

G>A

TGFB1

c.-800

G>A

TGFB1

c.-509

C>T

TGFB1

c.29

T>C

TGFB1

c.74

G>C

TGFB1

g.10780

T>G

MAF (%) 35.0 38.0 23.1 9.6 28.9 37.2 8.9 41.0

HWE (p) 0.757 0.788 0.366 0.806 0.959 0.770 0.213 0.839

Figuur13. LD plot haplotype TGFB1 met r2

waarden. Hoe hoger r², hoe donkerder het hokje wordt

weergegeven.

Resultaten

29

De vijf SNPs vormen samen vijf mogelijke haplotypes, weergegeven in tabel 12. Het H1

haplotype omvat alle wild-type allelen en komt voor bij 40.5% van de populatie. Dit komt in

deze studie overeen met 133 patiënten. H1 haplotype werd geselecteerd als referentie

haplotype. Het H3 haplotype dat voorkomt bij 92 patiënten wordt gekenmerkt door de

aanwezigheid van het variant allel van g.10780 T>G. Enkel H4 bevat het c.-800A allel, dit

komt voor bij 31 patiënten. H2 en H5 wijken het meest af, met respectievelijk drie en twee

variante allelen. Het H2 haplotype komt voor bij een aanzienlijk percentage van de populatie

(28%) in tegenstelling met H5 dat maar voorkomt bij 8.5%.

Tabel 12. TGFB1 haplotypes

c.-800

G>A

c.-509

C>T

c.29

T>C

c.74

G>C

g.10780

T>G

Frequentie

(%)

Aantal

patiënten

H1 G C T G T 40.5 133

H2 G T º C º G G º 28.0 92

H3 G C T G G º 12.5 41

H4 A º C T G T 9.4 31

H5 G C C º C º T 8.5 28

º Aanwezigheid van een variant allel verschillend van het referentiegenotype H1.

4. Associatiestudie naar stralingsgeïnduceerde acute weefselcomplicaties

Zowel genetisch onafhankelijke als genetische factoren werden statistisch geanalyseerd naar

het optreden van radiotoxiciteit op een groep van 329 prostaatkankerpatiënten. Voor de

analyses werden de patiënten voor elke onderzochte weefselcomplicatie opgedeeld in niet- tot

mild radiosensitieve groep (G0-1) en matig tot ernstige radiosensitieve groep (G2+) (zie

bijlage A). G0-1 werd telkens als referentie beschouwd.

4.1. Frequentie-analyse

In tabel 13 zijn de frequenties van optreden van GI en GU complicaties weergegeven. GI

complicaties komen zelden voor. Het optreden van stralingsgeïnduceerde genidysurie (8%) en

geni-urgentie (4%) is eveneens beperkt. Als gevolg van het beperkt aantal gevallen werd

statistische verwerking met betrekking tot deze complicaties niet uitgevoerd. Genifrequentie

(14%) en geninocturie (26%) treden frequent op en werden wel beschouwd bij analyse.

Tabel 13. Frequentieanalyse naar optreden van acute GI en GU complicaties

Gastro

mucusverlies

Gastro

frequentie

Gastro

rbpa

Gastro

Urgentie

Geni

dysurie

Geni

frequentie

Geni

nocturie

Geni

urgentie

G 0-1 321 (98,8%) 319(98.5%) 325(100%) 320 (98%) 298(92%) 278 (86%) 240 (74%) 311(96%)

G 2+ 4 (1.2%) 5 (1.5%) 0 (0%) 6 (2%) 26 (8%) 46 (14%) 84 (26%) 14 (4%)

Totaal 325 324 325 326 324 324 324 325

Resultaten

30

4.2. Associatie tussen patiëntgerelateerde factoren en optreden van acute

GU complicaties.

De p-waarden van de associaties tussen patiëntgerelateerde factoren en acute GU

nevenwerkingen zijn weergegeven in bijlage H. Hierbij werden de niet- tot mild

radiosensitieve groep (G0-1) en de matig tot ernstige radiosensitieve groep (G2+) vergeleken.

Leeftijd en roken vertonen een trend tot associatie met het optreden van geninocturie

(p=0.091 en p=0.051 respectievelijk). Zowel geninocturie als genifrequentie komen minder

voor bij patiënten die een RP ondergingen (p<0.001, p=0.035 resp.). Bovendien blijkt

abdominale chirurgie beschermend te zijn voor het optreden van nocturie (OR=0.6, p=0.046)

en het ondergaan van een lymfeklierdissectie (pN) leidt tot minder optreden van

genifrequentie (OR=0.38, p=0.011).

4.3. Associatie tussen dosisgerelateerde factoren en optreden van acute

GU complicaties.

De p-waarden van de associaties van dosisgerelateerde factoren en het optreden van GU

complicaties zijn weergegeven in bijlage H. Het gemiddelde voor de beschouwde dosisfactor

in de G0-1 en G2+ groep is eveneens weergegeven.

Het optreden van geninocturie is geassocieerd met de CTVtargetMax, CTVtarget50 (p<0.001)

en de maximumdosis ter hoogte van de blaas (p=0.003). Telkens ontving de groep die

nocturie ontwikkelt een hogere dosis in vergelijking met de patiënten die geen nocturie

ontwikkelen. Ook werd het bestraald volume geassocieerd bevonden met het optreden van

nocturie (p<0.001). Hierbij vertonen patiënten met een groter bestraald volume een groter

risico. De dosisprescriptie blijkt eveneens een invloed te hebben. Patiënten met

dosisprescritptie 3 (80 Gy/Rectum 76 Gy) ontwikkelen meer nocturie (p<0.001).

Het optreden van een hogere frequentie van urineren blijkt beïnvloed door het

CTVtargetvolume (p=0.036), CTVtarget50 (p=0.050) en de maximale blaasdosis (p=0.027).

Een groter bestraald volume en het krijgen van een hogere dosis gaat gepaard met het

optreden van een verhoogde urinaire frequentie. Het verschil in gemiddelde tussen de G0-1 en

G2+ groep is meestal klein, toch is de trend zichtbaar in de boxplotten (zie bijlage H).

Alle patiëntgerelateerde parameters die geassocieerd werden bevonden met acute GU

toxiciteit met een p-waarde ≤ 0.05, worden als confounder beschouwd in de analyse van

genetische factoren voor de ontwikkeling van stralingsgeïnduceerde complicaties.

Resultaten

31

4.4. Associatie tussen genetische factoren en optreden van acute GU

complicaties.

Hieronder volgt analyse van de associatie tussen de beschouwde SNPs XRCC3 c.722 C>T,

Ku70 c.-1310 C>G, ITGB2 c.819 G>A, TGFB1 c.-800 G>A, TGFB1 c.509 C>T, TGFB1 c.29

T>C, TGFB1 c.74 G>C en TGFB1 g.10780 G>A en het optreden van acute GU

nevenwerkingen. De genotype specifieke risico’s werden berekend aan de hand van OR. Een

OR>1 werd beschouwd als een verhoogd risico en een OR<1 werd beschouwd als een

verlaagd risico of beschermend effect t.o.v. het referentiegenotype. Er werd eveneens een p-

waarde berekend. Een p-waarde ≤ 0.05 werd als statistisch significant aangenomen. De

resultaten die beschreven zijn werden bekomen na multivariate analyse na correctie van

confounders (zie 4.2 en 4.3). Een overzicht van de OR’s en p-waarden voor zowel univariate

als multivariate analyse zijn weergegeven in bijlage I.

A. Eindpunt 1: Associatie tussen SNPs en optreden van acute geninocturie.

Figuur14. Voorkomen van nocturie volgens genotype van XRCC3 c.722 C>T, TGFB1 c.509C>T, TGFB1 c.29

T>C en TGFB1 g.10780 T>G.

De aanwezigheid van twee variante allelen van XRCC3 c.722 C>T is significant geassocieerd

bevonden met het optreden van acute geninocturie (p<0.001) met een 5.6 maal hoger risico in

vergelijking met het WT. Er wordt een recessieve werking van de SNP verondersteld omdat

dragers van het TT genotype een tot 4 maal hoger risico vertonen op nocturie in vergelijking

met WT en heterozygoten (p=0.001).

Resultaten

32

Het HE genotype van TGFB1 c.-509 (p=0.020) en c.29 T>C (p=0.002) werd significant

geassocieerd bevonden met het optreden van acute nocturie waarbij het risico respectievelijk

ongeveer 2 en 3 maal is verhoogd is t.o.v. het WT. In het dominante model wordt eveneens

een ≥ 2 verhoogd risico gevonden voor dragers van het variant allel in vergelijking met het

WT (p=0.020 en p=0.005).

Voor de SNP TGFB1 g.10780 T>G is het HE genotype (TG) significant geassocieerd met een

2.9 maal verhoogd risico op het optreden van acute geninocturie t.o.v. het WT (p=0.004). De

aanwezigheid van het HV genotype (GG) zou eveneens een 2.5 maal hoger risico vertonen

t.o.v. het WT (p=0.075). Er is dus een dominant effect aanwezig voor het variante allel

(p=0.003) waarbij aanwezigheid het risico op geninocturie bijna 3 maal verhoogd.

De genotypefrequenties van optreden van nocturie van de geassocieerde SNPs zijn

weergegeven in figuur 14.

B. Eindpunt 2: associatie tussen SNPs en optreden van acute genifrequentie.

Figuur15. Voorkomen van genifrequentie volgens genotype van SNP XRCC3 c.722 C>T, TGFB1 c.29 T>C en

TGFB1 g.10780 T>G.

Er werd een recessief effect voor XRCC3 c.722 C>T en optreden van acute genifrequentie

waargenomen. Bij vergelijking van het HV (TT) genotype met het WT (CC) en HE (CT)

genotype werd een statistisch significante associatie gevonden (p=0.010) met een 3 maal

verhoogd risico voor dragers van beide variante allelen.

Resultaten

33

Aanwezigheid van de twee variante allelen van de SNP TGFB1 c.29 T>C vertoont een trend

tot bescherming op de ontwikkeling van genifrequentie, doch niet statistisch significant

(OR=0.14, p=0.064). Vergelijking van het HV genotype (CC) met het WT (TT) en HE (TC)

genotype bevestigt deze trend (OR=0.15, p=0.065).

De TGFB1 g.10780 T>G SNP zou eveneens een beschermend effect hebben. Aanwezigheid

van het HV genotype (GG) vertoont een statistisch significant beschermend effect waarbij het

risico op genifrequentie 11 maal gereduceerd is (OR= 0.09, p= 0.024). Bij vergelijking van

het WT (TT) genotype met het HE (TG) en HV (GG) genotype werd een recessief

beschermend effect waargenomen (OR=0.11, p=0.030).

De genotypefrequenties van de geassocieerde SNPs zijn weergegeven in figuur 15.

C. Eindpunt 3: Associatie tussen haplotypes van TGFB1 SNPs en optreden

van acute GU complicaties.

Figuur16. Haplotypefrequenties, boven associatie met optreden van geninocturie en onderaan associatie met

optreden van genifrequentie.

De vijf mogelijke haplotypes (zie 3) zijn mogelijks geassocieerd met het optreden van acute

radiotoxiciteit. In figuur 16 zijn de haplotypefrequenties weergegeven voor acute nocturie en

acute genifrequentie. Met het H1 haplotype als referentie, vertoont H2 een beperkt verhoogd

risico op de ontwikkeling van acute geninocturie, doch niet significant (OR=1.10 en p=0.878).

H2 omvat de variante allelen van TGFB1 c.-509 C>T, c.29 T>C en g.10780 T>G.

Acute Geninocturie

Referentie

haplotype

Variant

haplotype

OR P

H1 H2 1.10 0.878

H3 0.58 0.379

H4 0.86 0.966

H5 0.68 0.681

Acute Genifrequentie

Referentie

haplotype

Variant

haplotype

OR P

H1 H2 0.45 0.070~

H3 0.11 0.017*

H4 0.23 0.101*

H5 0.23 0.120*

*: p≤0.05 is statistisch significant ~: trend tot signifcantie

Resultaten

34

Uit de analyse van de associaties tussen de haplotypes en optreden van genifrequentie kunnen

we besluiten dat het H1 referentiegenotype statistisch significant geassocieerd is met een

verhoogd risico op acute genifrequentie. Zowel haplotypes H2 (OR=0.45) en H3 (OR=0.11)

vertonen een statistisch significant beschermend effect t.o.v. H1. H2 bevat het variante

TGFB1 c.29 C en g.10780 G allel en H3 bevat het variante g.10780 G allel.

5. Associatiestudie naar stralingsgeïnduceerde late weefselcomplicaties


In tabel 14 zijn de frequenties van het optreden van late GI en GU complicaties weergegeven.

In tegenstelling tot late GI abdominale krampen, GI diarree en GU hematurie worden de

patiënten voor late GI frequentie, GI mucusverlies, GI urgentie, GI incontinentie, GU nocturie

en GU frequentie gescoord als een graad 1 beschouwd als een geval (zie bijlage A). Late GI

abdominale krampen (1.2%), diarree (3.3%) en rbpa (2.7%) komen zelden voor. Als gevolg

van het beperkt aantal cases werd statistische verwerking met betrekking tot deze

complicaties niet uitgevoerd.

Tabel 14. Frequentieanalyse naar optreden van late GI en GU complicaties

5.2. Associatie tussen patiëntgerelateerde factoren en optreden van late

complicaties.

De p-waarden van de associaties tussen patiëntgerelateerde factoren en late nevenwerkingen

zijn weergegeven in bijlage J. Hierbij werden de niet- radiosensitieve groep (G0) en de mild

tot ernstige radiosensitieve groep (G1+) vergeleken, behalve voor hematurie (G0-1 vs G2+).

Gastro

abdominale

krampen

Gastro

diarree

Gastro

Rbpa

Geni

hematurie

G 0-1 321

97.6%

314

95.4%

316

96%

300

91.2%

G 2+ 4

1.2%

11

3.3%

9

2.7%

25

7.6%

Totaal 325 325 325 325

Gastro

frequentie

Gastro

mucusverlies

Gastro-

urgentie

Gastro

incontinentie

Geni

hematurie

Geni

nocturie

Geni

urgentie

G 0 262

(79.6%)

265

(80.5%)

251

(76.3%)

269

(81.8%)

300

(91.2%)

236

(71.7%)

234

(71.1%)

G 1+ 59

(17.9%)

60

(18.2%)

75

(22.8%)

56

(17.0%)

25

(7.6%)

88

(26.7%)

91

(27.7%)

Totaal 321 325 326 325 325 324 325

Resultaten

35

A. Late GI complicaties

Roken is statistisch significant geassocieerd met het optreden van GI incontinentie (p=0.022)

en vertoont een trend tot associatie met het optreden van GI frequentie (p=0.056) en GI

mucusverlies (0.067). Het grootste aantal gevallen komt voor bij de niet-rokers. Abdominale

chirurgie (p=0.064) en pN (p=0.036) zouden het risico op GI mucusverlies halveren. RP

vertoont een trend tot associatie met gastro-incontinentie (p=0.075), met minder vaak

voorkomen van toxiciteit bij patiënten die een RP hebben ondergaan (OR=0.54).

B. Late GU complicaties

Abdominale chirurgie in het verleden zou het risico op late hematurie 2 maal verhogen, doch

niet significant (P=0.085). TUR in het verleden blijkt geassocieerd met een vijf maal

verhoogd risico op hematurie, met een sterk significante p-waarde (<0.001). Adjuvante

hormoontherapie (AD) is geassocieerd met het optreden van late urinaire urgentie met beperkt

verhoogd risico (OR=1.73,p=0.039) en met late nocturie met een 3 maal verhoogd risico

(p<0.001). Late geninocturie komt minder vaak voor bij patiënten die RP ondergingen

(p=0.001, OR=0.36).

5.3. Associatie tussen dosisgerelateerde factoren en optreden van late

complicaties.

De p-waarden en odds ratios van de associatie tussen dosisgerelateerde factoren en late

nevenwerkingen zijn weergegeven in bijlage J.

A. Late GI complicaties

Het optreden van GI mucusverlies, GI urgentie en GI incontinentie is significant geassocieerd

met R40 en R60. De patiënten die GI toxiciteit ontwikkelen, hebben een groter rectumvolume

dat 40 Gy of meer ontvangt. Patiënten met een groter te bestralen prostaatvolume en met een

groter volume van het sigmoïd dat 60 Gy of meer ontvangt zijn geassocieerd met het optreden

van GI urgentie (p=0.045 en 0.025) en GI incontinentie (p=0.014 en 0.003). Boxplotten zijn

weergegeven in bijlage J.

B. Late GU complicaties

De dosisparameters CTVtargetMax (p=0.001), CTVtarget50 (p=0.006) en CTVtargetVol

(p=0.002) blijken significant geassocieerd met geninocturie. Hierbij is een hogere dosis en

een groter te bestralen volume geassocieerd met nocturie. Het verschil in gemiddelde tussen

Resultaten

36

beide groepen is klein, toch is de trend zichtbaar in de boxplotten (bijlage J). Late hematurie

treedt het meest frequent op bij een voorgeschreven dosis van 76 Gy/Rectum 74 Gy (2). Late

nocturie treedt voornamelijk op bij patiënten met dosisprescriptie 80 Gy/Rectum 76 Gy (3).

5.4. Associatie tussen genetische factoren en optreden van late

complicaties.

De statistische analyse van de associatie tussen de beschouwde SNPs na optreden van

weefselcomplicaties is weergegeven in bijlage I. De OR en p-waarden zijn weergegeven bij

univariate en multivariate analyse. Onderstaande resultaten werden verkregen via multivariate

analyse na correctie van confounders (zie 5.2 en 5.3).

A. Eindpunt 4. Associatie tussen SNPs en optreden van late GI complicaties.

Figuur17. Voorkomen van late GI complicaties volgens genotype van SNP Ku70 c.-1310 C>G, TGFB1 c.29

T>C en TGFB1 c.-800 G>A.

Aanwezigheid van het heterozygote genotype (CG) van Ku70 c.-1310 C>G zou een

beschermend effect hebben op het voorkomen van laat GI mucusverlies (OR= 0.41, p= 0.017)

t.o.v. het WT. Er werd geen associatie gevonden tussen de polymorfismen en het optreden

van late GI frequentie. Toch is er een trend tot associatie aanwezig van het heterozygote

genotype van TGFB1 c.29 T>C t.o.v. het WT met een beschermend effect (OR=0.58,

p=0.084). Het dominant model van TGFB1 c.-800 G>A blijkt sterk geassocieerd met het

optreden van late GI urgentie (OR=2.9, p=0.003) en GI incontinentie (OR=2.27, p=0.045)

Resultaten

37

t.o.v. het WT. Het recessief model vertoont eveneens een associatie met late GI urgentie met

een 10 maal hoger risico. Een verklaring voor deze hoge OR is het klein aantal patiënten dat

het HV (AA) genotype bezitten. Genotypefrequenties zijn weergegeven in figuur 17.

B. Eindpunt 5: Associatie tussen SNPs en optreden van late GU complicaties.

Figuur18. Voorkomen van late GU complicaties volgens genotype van SNP XRCC3 c.722 C>G, TGFB1

g.10780 T>G en ITGB2 c.819 G>A.

Aanwezigheid van het variant allel van de XRCC3 c.722 C>T SNP zou een dominant

beschermend effect hebben op het optreden van late hematurie (OR=0.391, p=0.048).

Daarnaast vertoont het TG genotype van TGFB1 g.10780 T>G een beschermend effect t.o.v.

WT, doch na correctie van confounders was dit niet meer significant (OR=0.43, p=0.095).

Dragers van het variant allel van ITGB2 c.819 G>A hebben een ± 2 maal hoger risico op het

ontwikkelen van late GU frequentie in vergelijking met dragers van het WT (p=0.031). In

figuur 18 zijn de genotypefrequenties weergegeven.

5.5. Associatie tussen optreden van acute en late stralingsgeïnduceerde

complicaties.

Ten slotte werd nagegaan of het optreden van acute complicaties predictief is voor het

optreden van late complicaties. Vijf nevenwerkingen werden zowel acuut en laat beschouwd.

Hierbij blijkt acute GU nocturie (OR=4.5, p<0.001) en GI frequentie (OR=9.4, p=0.019)

voorspellend te zijn voor het optreden van deze complicaties op lange termijn.

Bespreking

38

Bespreking

1. Optimalisaties

1.1. Optimalisatie SYTO-9 dye voor HRM analyse

De optimalisatie met de SYTO-9 kleurstof verliep niet vlot. De gebruiksaanwijzing gaf aan

dat de stockoplossing verdund moet worden in een oplossing zonder fosfaten. We kozen in

eerste instantie voor TE buffer omdat de primers eveneens verdund zijn in TE buffer, doch de

resultaten waren slecht. Vervolgens werd de stockoplossing verdund in dH2O. Hierbij werden

optimale resultaten verkregen voor de genotypering van XRCC3 c.722 C>T, maar voor Ku70

c.-1310 C>G waren de resultaten steeds niet goed. Pas na de ontdekking dat de Meltdoctor

HRM dye van Applied Biosystems glycerol bevatte was de volgende optie glycerol

toevoegen. Op deze manier werd de Meltdoctor oplossing nagebootst en dit zorgde voor

optimale resultaten. Een mogelijke verklaring is dat het Ku70 protocol sterk afwijkt van het

standaard HRM protocol voor de Meltdoctor HRM kit. Om die reden dient de Meltdoctor dye

bijna perfect worden nagebootst om de verschillende genotypes optimaal van elkaar te kunnen

onderscheiden.

1.2. Optimalisatie TGFB1 g.10780 T>G HRM protocol

De optimalisatie van het TGFB1 g.10780 T>G protocol verliep vlot. Het optimale primerpaar,

de sequenering van controlestalen en optimale reactiecondities werden bij de eerste

optimalisatiereactie gevonden. Op die manier was het mogelijk alle patiëntenstalen snel te

genotyperen. Optimalisatie met de SYTO-9 kleurstof was succesvol door gebruik te maken

van identieke condities zoals bij de XRCC3 c.722 C>T SNP. Een reden voor de snelle

optimalisatie ligt in het feit dat dit polymorfisme een klasse 2 SNP is. Het verschil in Tm

tussen het normaal en homozygoot variant allel is groter is dan 0.5°C en dus eenvoudig te

onderscheiden [49].

1.3. Optimalisatie snapschot protocol ITGB2 c.819 G>A

De optimalisatie van de ITGB2 c.819 G>A protocol verliep eveneens vlot. Na selectie van het

primerpaar werden aan de hand van het algemeen PCR programma (62°C) meteen optimale

resultaten bekomen. Optimalisatie van het snapshotprotocol lukte eveneens meteen.

Bespreking

39

2. Associatie naar stralingsgeïnduceerde complicaties


Als acute nevenwerkingen komen voornamelijk G2 genifrequentie (14%) en G2 geninocturie

(26%) voor. Overige GI en GU complicaties komen minder frequent voor. Late GI en GU

klachten komen vaker voor, dit kan verklaard worden door het feit dat in deze studie het

optreden van een graad 1 toxiciteit voor bepaalde eindpunten beschouwd wordt als een geval.

Late GU G1+ urgentie komt het meest frequent voor (28%), gevolgd door late GU G1+

nocturie (27%), GI G1+ urgentie (23%), GI G1+ mucusverlies (18%), GI G1+ frequentie

(18%) en GI G1+ incontinentie (17%). Late GI G2+ abdominale krampen, G2+ diarree en

G2+ rbpa komen zelden voor in deze studiepopulatie (≤3%). Toch werd rbpa reeds

beschreven als één van de meest frequente en hoofd dosislimiterende factoren [18]. Via IMRT

kan de frequentie van rbpa afnemen. Tevens kan de frequentie van stoelganginspectie door de

patiënt een beïnvloedende factor zijn [21]. Bij het analyseren van weefselcomplicaties is het

bovendien van belang om te corrigeren voor alle symptomen die gerapporteerd zijn voor de

start van RT [10].

2.2. Associatie tussen patiëntgerelateerde factoren en optreden van acute

GU en late GI/GU complicaties.

Roken zou een beschermende invloed hebben op late fecale incontinentie, GI mucusverlies en

GI frequentie. Dit werd eveneens waargenomen bij personen die lijden aan colitis ulcerosa,

waarbij nicotine een anti-inflammatoire functie heeft en de intestinale permeabiliteit doet

dalen [51]. Adjuvante AD werd in deze studie geassocieerd met een hoger risico op late GU

nocturie en urgentie. Door Fiorino et al. werd AD eveneens beschouwd als een risicovolle

factor, maar geassocieerd met de ontwikkeling van late rectale bloedingen [21]. Een

mogelijke verklaring voor dit verhoogd risico is een inflammatie en fibrose stimulerend effect

van AD [52]. In tegenstelling tot deze observatie zou AD een protectief effect hebben door

reductie van het prostaatvolume [21,53]. Als gevolg van een daling van androgenen wordt

apoptose van het prostaatepitheel geïnduceerd en verkleining van de klieren [54]. Dit laat toe

een kleiner veld te bestralen met een hogere dosis [21,53].

TUR van de prostaat werd geassocieerd bevonden met een vijf maal hoger risico op het

ontwikkelen van late hematurie. Dit kan verklaard worden door de sterke correlatie van TUR

met de aanwezigheid van een urinaire vernauwing [10]. Acute nocturie en laat GI

Bespreking

40

mucusverlies komen minder frequent voor bij personen die vroeger abdominale chirurgie

hebben ondergaan. Echter komt late hematurie vaker voor bij patiënten met abdominale

chirurgie in het verleden. In de literatuur werd abdominale chirurgie beschouwd als een

risicovolle factor voor de ontwikkeling van abdominale pijn, verhoogde stoelgangfrequentie

en rectale bloeding [10,21]. Het exacte mechanisme is niet duidelijk, mogelijks zou

voorgaande chirurgie leiden tot een beperkte bloedvoorziening of fixatie van de darm [21].

Zowel TUR als abdominale chirurgie blijken geassocieerd met late hematurie, mogelijks

speelt resterende schade aan de een rol.

Het optreden van acute GU nocturie/frequentie en late nocturie komt minder frequent voor bij

patiënten die een radicale prostatectomie hebben ondergaan. Dit komt overeen met de

literatuur dat RP urinaire incontinentie veroorzaakt, maar overige urinaire symptomen

verbetert, zoals urinaire irritatie en obstructie [55,56]. Deze zijn namelijk betrokken bij

nocturie en frequentie [57].

Het ondergaan van een lymfeklierdissectie vertoont een beschermend effect op acute

genifrequentie en late gastromucusverlies. Dit werd nog niet beschreven in de literatuur.

2.3. Associatie tussen dosisgerelateerde factoren en optreden van acute

GU en late GI/GU complicaties.

Men is ervan overtuigd dat dosimetrische factoren, zoals de totale dosis, bestraald volume en

bestralingsregio een invloed hebben op de ontwikkeling van stralingstoxiciteit [10]. Dit werd

bevestigd in deze scriptie waar sterke statistisch significante associaties gevonden zijn tussen

dosisparameters en optreden van acute GU en late GI en GU complicaties. Het bestraald

doelvolume, CTVtargetVol, heeft zowel een invloed op het optreden van acute GU (nocturie

en frequentie), late nocturie en late GI (mucusverlies, urgentie en incontinentie) complicaties.

Hoe groter het bestraald volume, hoe hoger het risico. Barnett et al. gaat hiermee akkoord.

Deze onderzoeksgroep concludeerde dat het bestralingsveld een voorspeller is voor late GU

toxiciteit [9].

Het volume van het rectum dat een dosis ≥ 40/60 Gy ontvangt is bepalend voor het optreden

van late GI complicaties, zowel mucusverlies, urgentie en incontinentie. R50 werd reeds

beschouwd als hoofdfactor voor late rectale toxiciteit [58] en deze associatie met late GI

incontinentie werd reeds teruggevonden door Fiorino et al. [21]. Het volume van het sigmoïd

dat 60 Gy of meer ontvangt blijkt eveneens een risicofactor voor de ontwikkeling van late GI

urgentie en incontinentie. Een mogelijks mechanisme voor ontwikkeling van incontinentie is

Bespreking

41

een gereduceerde absorptie door de rectale mucosa, wat een volume-effect kan hebben.

Namelijk, een bredere bestraling van de sfincterregio zou een hoger risico veroorzaken [21].

CTVtarget50, de dosis surrogaat voor de urethra, is geassocieerd met het voorkomen van

acute nocturie en verhoogde urinaire frequentie en late nocturie. Een hogere dosis van de

urethra blijkt dus bepalend voor het optreden van urinaire complicaties. Dit werd bevestigd

door Bucci et al. [59].

2.4. Associatie tussen SNPs en optreden van acute weefselcomplicaties.

2.4.1. XRCC3 c.722 C>T

In de huidige studie is de aanwezigheid van twee variante allelen (TT) geassocieerd met het

optreden van acute nocturie en acute genifrequentie met een ≥3 maal hoger risico. Het variant

allel blijkt een recessief effect te hebben (zie figuur 19 en 20). Het T allel werd reeds

geassocieerd bevonden met een verhoogde stralingsgevoeligheid [4,60]. De resultaten van

deze studie komen overeen met de bevindingen van Werbrouck et al. waarbij het HV

genotype geassocieerd werd met ernstige acute dysfagie bij hoofd- en halskankerpatiënten

[36]. Een mogelijke oorzaak is dat dit polymorfisme (Met241Thr) zorgt voor deficiëntie in

DNA herstel. Dit werd reeds gesuggereerd door Au et al. waar meer chromosoomaberraties,

deleties en/of micronucleï werden geobserveerd in aanwezigheid van dit variante allel na

bestraling [35]. Anderzijds zou aanwezigheid van het variant allel DNA herstel niet verstoren

[61] en dus niet verantwoordelijk zijn voor de geobserveerde radiotoxiciteit. Andere

ongekende polymorfismen die in linkage desequilibrium zijn met XRCC3 c.722 C>T zouden

een rol kunnen spelen.

2.4.2. Ku70 c.-1310 C>G

Dit polymorfisme in het Ku70 gen werd niet geassocieerd bevonden met de beschouwde acute

complicaties. Deze SNP is echter nog niet uitvoerig bestudeerd m.b.t. normale

weefselcomplicaties. De studie van Werbrouck et al. toonde een associatie aan tussen de

aanwezigheid van 1 of 2 variante allelen met ernstige RT geïnduceerde dysfagie bij hoofd en

halskankerpatiënten [36]. Er werd ook gesuggereerd dat de expressie van Ku70 een rol zou

spelen in de klinische uitkomst bij kanker [38]. Het effect van dit polymorfisme op DNA

herstel is niet duidelijk daar deze gelegen is in een niet-coderende regio [36]. Toch is het

mogelijk dat regulatorische sequenties, RNA splicing of RNA stabiliteit worden beïnvloed

[34].

Bespreking

42

2.4.3. ITGB2 c.819 G>A

Deze SNP werd niet geassocieerd bevonden met het optreden van acute nocturie en acute

verhoogde urinaire frequentie. Daarentegen werd in een recente publicatie van De Ruyck et

al. aangetoond dat het heterzygoot genotype voorspellend is voor de ontwikkeling van

ernstige acute oesofagale stralingsgeïnduceerde toxiciteit bij longkankerpatiënten [39].

2.4.4. Haplotype TGFB1

I. TGFB1 c.-800 G>A

In de huidige studie blijkt dit polymorfisme niet geassocieerd te zijn met het optreden van de

beschouwde acute complicaties, namelijk acute nocturie en urinaire frequentie. In de

literatuur werden eveneens nog geen associaties gevonden tussen dit polymorfisme en het

optreden van acute complicaties.

II. TGFB1 c.-509 C>T

Het variante T allel vertoont een dominant effect voor het optreden van acute geninocturie

met een 2 maal hoger risico t.o.v. het WT. Deze SNP ligt enkele basen verwijderd van

bindingsplaatsen voor nucleaire hormoonreceptoren die een rol spelen in de productie van

TGFB1. Op deze manier zou het polymorfisme de transcriptie beïnvloeden [14]. TGFB1

moduleert op zijn beurt de Ataxia Telangiectasia Mutated signaalpathway dat een rol speelt in

het regelen van cellulaire responsen op ioniserende stralen [62]. Op deze manier kan de acute

weefselrespons beïnvloed worden.

III. TGFB1 c.29 T>C

Het variant allel blijkt bepalend voor het optreden van acute geninocturie met een >2 maal

verhoogd risico. Hierbij werd een dominant effect waargenomen. Acute genifrequentie komt

daarentegen minder voor bij patiënten die twee variante allelen bezitten. De invloed van deze

SNP is mogelijks gemedieerd door een gewijzigde TGFB1 concentratie. Dit polymorfisme

veroorzaakt namelijk een aminozuurwijziging in het signaalpeptide dat het transport van

TGFB1 zou beïnvloeden [40]. Er wordt een tegengesteld effect van het variant allel

waargenomen bij het optreden van acute nocturie en frequentie. Dit kan verklaard worden

door een verschil in pathogenese en weefselmechanisme voor beide toxiciteiten. TGFB1 kan

door zijn multifunctionaliteit een rol spelen in de ontwikkeling van zowel nocturie en

frequentie. Dit toont wel aan dat het zinvol is verschillende toxiciteiten van éénzelfde

orgaanstelsel, in dit geval het geni-urinaire systeem, apart te beschouwen en niet samen zoals

in het RTOG scoresysteem.

Bespreking

43

IV. TGFB1 c.74 G>C

Deze SNP blijkt niet geassocieerd met acute nocturie en urinaire frequentie. In deze populatie

werd het HV genotype (CC) bij geen enkele patiënt waargenomen, dit kan een verklaring zijn

voor de niet significant associaties. In de literatuur werd de associatie van dit polymorfisme

en acute complicaties na RT nog niet besproken.

V. TGFB1 g.10780 T>G

Aanwezigheid van het variante G allel blijkt geassocieerd te zijn met het optreden van acute

nocturie met een bijna 3 maal verhoogd risico. In tegenstelling tot acute genifrequentie waar

de aanwezigheid van twee variante allelen geassocieerd werd met een sterk gedaald risico.

Opnieuw kan deze observatie verklaard worden door een verschil in

ontwikkelingsmechanisme (zie hoger).

VI. Haplotype TGFB1

Haplotypes worden belangrijker omdat ze meer informatie bevatten dan enkelvoudige

polymorfismen [14]. Het aantal risico-allelen zou namelijk een rol spelen in het optreden van

radiotoxiciteit [60]. In dit opzicht werden 5 haplotypes die de 5 TGFB1 SNPs omvatten

beschouwd (zie tabel 12). H2 omvat de variante allelen, c.-509T, c.29C en g.10780G en werd

geassocieerd bevonden met het voorkomen van acute nocturie, doch niet significant. Deze

trend komt overeen met de resultaten waarbij het variant allel van c.-509 C>T, c.29 T>C en

g.10780 T>G het risico verhogen. Toch is deze associatie nu sterk verzwakt. Aanwezigheid

van deze drie variante allelen samen blijken minder risicovol in vergelijking met individuele

variante allelen.

Het referentiehaplotype H1 blijkt een sterk verhoogd risico te hebben op het ontwikkelen van

acute genifrequentie (zie fig21). Hierbij vertoont H2 een gehalveerd risico en H3 een 11 maal

gereduceerd risico in vergelijking met H1. Dit is een bevestiging van de hierboven besproken

resultaten waarbij aanwezigheid van een variant allel, c.-509T en g.10780G, een beschermend

effect heeft. H2 bevat namelijk beide van deze variante allelen en H3 bevat het variante

g.10780G allel. In de studie van Schirmer et al. werd eveneens een haplotype-analyse

uitgevoerd voor deze 5 SNPs. Hierbij bleek H3 hypofunctioneel en zorgde eveneens voor een

gedaalde stralingsgevoeligheid. Toch is haplotype-analyse voor de HV associaties niet ideaal

voor het interpreteren van de resultaten.

De c.-509 en c.29 SNP vertonen een aanzienlijke graad van linkage (Fig18). In de studie van

De Ruyck et al. ligt de r² waarde hoger (0.65 vs 0.71) [14]. Indien niet enkel onze

studiepopulatie maar alle 377 gegenotypeerde stalen in rekening werden gebracht steeg deze

Bespreking

44

waarde tot 0.74. Een gemeenschappelijk effect van deze twee SNPs werd enkel waargenomen

voor acute nocturie.

2.5. Associatie tussen SNPs en het optreden van late normale

weefselcomplicaties.

2.5.1. XRCC3 c.722 C>T

In de huidige studie blijkt het variante T allel een dominant beschermend effect te hebben op

het optreden van late hematurie. Dit komt niet overeen met de bevinding dat het recessieve

model risicovol is voor acute complicaties. Ook in de literatuur zijn er tegenstrijdigheden.

Het HE genotype (CT) werd reeds geassocieerd bevonden met late rectale bloedingen bij PK

patiënten [25], terwijl het HV genotype (TT) geassocieerd werd met subcutane fibrose bij BK

patiënten [37]. Dit laatste effect werd niet bevestigd in een validatiestudie van dezelfde

onderzoeksgroep [63]. In de studie van De Ruyck et al. werd geen directe associatie gevonden

met normale weefselreacties na RT bij gynaecologische tumoren. Er werd een beschermend

effect waargenomen voor het T allel maar dit was niet statistisch significant [31]. Het effect

van het variant allel op lange termijn is dus niet duidelijk. De radiosensitiviteit is mogelijks

afhankelijk van een gecombineerd effect van meerdere risico-allelen.

2.5.2. Ku70 c.-1310C>G

Aanwezigheid van het heterozygote genotype (CG) zou een beschermend effect hebben op

voorkomen van laat GI mucusverlies. Onderzoek omtrent dit polymorfisme en ontwikkeling

van late normale weefselcomplicaties is nog niet uitgevoerd. Het beschermend effect moet

verder onderzocht worden.

2.5.3. ITGB2 c.819 G>A

Aanwezigheid van het variant allel van ITGB2 c.819 G>A werd geassocieerd met een twee

maal hoger risico op late urinaire urgentie. Dit polymorfisme is gelegen in een coderende

regio en het variant allel zou expressie van dit gen kunnen beïnvloeden. De expressie zou

eveneens moduleren onder invloed van ioniserende stralen [28]. β2 integrines spelen een rol

in stralingsgeïnduceerde inflammatie, wat één van de ontwikkelingsmechanismen is van

urinaire urgentie. Inflammatie zou de sensitiviteit van receptoren in de blaas en posterieure

urethra verhogen die verantwoordelijk zijn voor de drang tot urineren [28,64]. Dit is een

mogelijke verklaring voor de geobserveerde associatie.

Bespreking

45

2.5.4. Haplotype TGFB1

I. TGFB1 c.-800 G>A

Aanwezigheid van het variant allel blijkt een dominant effect te hebben met een >2 maal

verhoogd risico op late GI incontinentie en late GI urgentie. Dit komt niet overeen met de

studie van De Ruyck et al. waar geen associatie werd gevonden met late radiosensitiviteit bij

gynaecologische tumoren [14]. Deze SNP is gelegen in de promotorregio van het TGFB1 gen,

als gevolg van dit polymorfisme zou transcriptie kunnen beïnvloed worden. Toch neemt men

aan dat deze SNP de concentratie van TGFB1 in het plasma niet beïnvloed [42]. Mogelijks

kan fibrose en littekenweefsel de sfincterfunctie aantasten en zo betrokken zijn bij de

ontwikkeling van fecale incontinentie en urgentie op lange termijn.

II. TGFB1 c.-509 C>T

Dit polymorfisme werd in deze studie niet geassocieerd bevonden met de beschouwde late GI

en GU complicaties. Daarentegen werd het HV genotype (TT) reeds geassocieerd met late

rectale bloedingen bij PK patiënten [30], klinische radiosensitiviteit bij gynaecologische

tumoren [14] en fibrose bij BK [37,40,65,66]. Een mogelijke verklaring voor deze observaties

is dat het TT genotype geassocieerd is met hogere serumniveaus van TGFB1 [14], wat

fibroblastproliferatie en productie van collagenen versterkt en zo leidt tot fibrose. Anderzijds

werd deze associatie niet gevonden bij de onderzoeksgroepen van Yuan et al. en Andreassen

et al. [41,63]. Er is dus geen consensus omtrent deze SNP.

III. TGFB1 c.29 T>C

In deze studie is er een trend tot associatie van het HE genotype (TC) met een beschermend

effect voor late GI frequentie. Dit komt overeen met de bevindingen van Alsbeih et al. waar

het variant allel ook een beschermend effect had op de ontwikkeling van late fibrose na

bestraling [67]. Daarentegen werd het HV genotype (CC) reeds geassocieerd bevonden met

late radiotoxiciteit bij BK en bij gynaecologische tumoren [14,37,40]. Echter, Andreassen et

al. kon geen associatie aantonen met late complicaties [63]. De oorzaak voor deze

tegenstrijdige resultaten zijn niet duidelijk. Mogelijks speelt linkage disequilibrium met

andere SNPs een rol. De invloed van deze SNP kan wel verklaard worden doordat deze

gelegen is in een regio van het TGFB1 gen dat een rol speelt in het transmembranair transport

van het cytokine doorheen het ER [30]. Dit zou een wijziging in TGFB1 concentratie kunnen

veroorzaken wat bepalend is voor late radiotoxiciteit [14].

Bespreking

46

IV. TGFB1 c.74 G>C

Dit polymorfisme werd niet geassocieerd bevonden met de beschouwde late GI en GU

complicaties. Dit komt overeen met een aantal studies die eveneens geen associatie vonden

met late radiotoxiciteit [14,40,63].

V. TGFB1 g.10780 T>G

Het HE genotype (TG) vertoont een beschermend effect voor late hematurie t.o.v. WT

(OR=0.4), doch na correctie van confounders was dit niet meer significant. Dit beschermend

effect van het variante G allel werd reeds geobserveerd door Schirmer et al. waarbij een

lagere TGFB1 secretie en minder stralingsgeïnduceerde chromosomale aberraties werden

geobserveerd bij aanwezigheid van dit allel [42].

2.6. Associatie tussen optreden van acute en late stralingsgeïnduceerde

complicaties.

Acute GI en GU toxiciteit werd reeds beschouwd als voorspellende factor voor late GI en GU

complicaties [6,8,10,13]. In de huidige studie bleek acute nocturie geassocieerd met het

optreden van late nocturie. Dörr et al. benadrukt dat chronische effecten van de blaas na

bestraling voornamelijk consequentiële effecten zijn. Ioniserende stralen zouden in een acute

fase het urothelium van de urinaire tractus aantasten waardoor de barrièrefunctie wordt

verstoord. Dit laat bijkomende secundaire letsels toe in cellen en structuren betrokken bij de

late respons [13]. Acuut voorkomen van GI frequentie heeft eveneens een invloed op het

voorkomen van late GI frequentie. Bestraling van het rectum zou epitheliale schade

veroorzaken dat late toxiciteit induceert na een latente periode. GI symptomen voor RT

zouden eveneens een invloed hebben [12]. Toch is de relatie tussen acute en late effecten

complex doordat het vaak moeilijk is om toegang te krijgen tot dosimetrische factoren.

Bovendien zou bijkomende ziekte patiënten vatbaar maken voor acute en late effecten en een

associatie tussen acute en late kan ontwikkelen door bias van de patiënten [10,13].

Bespreking

47

Besluit

Uit het onderzoek blijkt het XRCC3 c.722 HV genotype geassocieerd te zijn met het optreden

van acute GU nocturie en frequentie. Het variant allel van TGFB1 c.-509 C>T, c.29 T>C en

g.10780 T>G blijkt betrokken bij de ontwikkeling van acute nocturie, terwijl een recessief

beschermend effect wordt waargenomen voor deze laatste 2 allelen op acute GU frequentie.

Verder blijkt het variante allel van XRCC3 c.722 C>T (bij hematurie), Ku70 c.-1310 C>G

(bij mucusverlies), TGFB1 c.29 T>C (bij gastrofrequentie) en g.10780 T>G (bij hematurie)

een beschermend effect te hebben op late complicaties. Het variante ITGB2 c.819 en TGFB1

c.-800 A-allel vertoont een hoger risico op late GU en GI urgentie resp. Bij TGFB1

haplotype-analyse bleek het referentiehaplotype dat alle WT allelen bevat risicovol voor acute

genifrequentie. Anderzijds blijkt aanwezigheid van drie variante allelen van c.-509, c.29 en

g.10780 samen minder risicovol voor acute nocturie in vergelijking met de individuele

variante allelen. Analyse van patiëntenparameters toonde aan dat roken, pN en RP

beschermend zouden zijn. Androgeendeprivatie zou daarentegen het risico op late GU

toxiciteit verhogen. TUR van de prostaat en abdominale chirurgie blijken risicovol voor late

hematurie. Bij analyse van dosisparameters blijkt R40/60 en S60 bepalend voor het optreden

van late GI complicaties. Het bestraald volume (CTVtargetVol) is zowel bepalend voor acute

en late GU en GI complicaties. Ten slotte zorgt een hogere dosis t.h.v. de urethra voor meer

urinaire problemen.

Deze studie werd uitgevoerd op een omvangrijke populatie van 329 prostaatkankerpatiënten.

Toch is het noodzakelijk om deze resultaten te valideren. De beschouwde SNPs werden

geselecteerd op basis van kandidaatgenen. Een genome wide association studie is een

volgende stap in de zoektocht naar de genetische basis van stralingsgeïnduceerde complicaties

bij PK patiënten. Het karakteriseren van de bijdrage van het individuele genetisch profiel

kan leiden tot de klinische applicatie van predictieve testen om de behandelingen aan te

passen aan het individu.

48

Referentielijst [1] www.belgiancancerregistry.be

[2] Cancer facts and figures 2010 American Cancer Society

[3] Prostate Cancer, American Cancer Society

[4] Popanda O, Uwe Marquardt J, Chang-Claude J, Schmezer P (2009). Genetic variation in normal tissue

toxicity induced by ionizing radiation. Mutation Research 664:58-69.

[5] Budiharto T, Haustermanns K, Kovacs G (2010). External beam radiotherapy for prostate cancer. Journal of

endourology 24(5):781-789.

[6] BS Teh, WY Mai, BM Uhl, ME Augspurger, WH Grant, HH Lu, SY Woo, LS Carpenter, JK Chiu, EB

Butler (2001). Intensity-modulated radiation therapy (IMRT) for prostate cancer with use of a rectal balloon for

prostate immobilization: acute toxicity and dose-volume analysis. International Journal Radiation Oncology

Biology Physics 49(3):705-712.

[7] Fonteyne V, Villiers G, Lumen Nicolaas, De Meerleer G (2009). Urinary toxicity after high dose intensity

modulated radiotherapy as primary therapy for prostate cancer. Radiotherapy and Oncology 92:42-47.

[8] De Meerleer G, Vakaet L, Meersschout S, Villeirs G, Verbaeys A, Oosterlinck W, De Neve W (2004).

Intensity-modulated radiotherapy as primary treatment for prostate cancer: acute toxicity in 114 patients.

International Journal Radiation Oncology Biology Physics 60:777-787.

[9] Barnett GC, West CML, Dunning AM, Elliott RM, Coles CE, Pharoah PDP, Burnet NG (2009). Normal

tissue reactions to radiotherapy: towards tailoring treatment dose by genotype. Nature Reviews Cancer 9:134-

142.

[10] Barnett GC, De Meerleer G, Gulliford SL, Sydes MR, Elliott RM, Dearnaley DP (2011). The impact of

clinical factors on the development of late radiation toxicity: results from the medical research council RTO1

trial (ISRCTN47772397). Clinical Oncology doi:10.1016/j.clon.2011.03.001

[11] Stone HB, Coleman CN, Anscher MS, McBride WH (2003). Effects of radiation on normal tissue:

consequences and mechanisms. The Lancet Oncology 4:529-536.

[12] Heemsbergen WD, Peeters STH, Koper PC, Hoogeman MS, Lebesque JV (2006). Acute and late

gastrointestinal toxicity after radiotherapy in prostate cancer patients: consequential late damage. International

Journal Radiation Oncology Biology Physics 66(1):3-10.

[13] Dörr W, Hendry JH (2001). Consequential late effects in normal tissues. Radiotherapy and Oncology

61:223-231.

[14] De Ruyck K, Van Eijkeren M, Claes K, Bacher K, Vral A, De Neve W, Thieren H (2006). TGFβ1

polymorphisms and late clinical radiosensitivity in patients treated for gynecologic tumors. International Journal

Radiation Oncology Biology Physics 65(4):1240-1248.

[15] http://ctep.cancer.gov/reporting/ctc.html

[16] Cox JD, Stetz J, Pajak TF (1995). Toxicity criteria of the radiation therapy oncology Group (RTOG) and the

european organization for research and treatment of cancer (EORTC). International Journal Radiation Oncology

Biology Physics 31:1341-1346.

[17] Late Effects of Normal Tissues (LENT) Consensus Conference (1995). Lent soma scales for all anatomic

sites. International Journal Radiation Oncology Biology Physics 30:1049-1091.

[18] Pinkawa M, Fischedick K, Asadpour B, Gagel B, Piroth MD, Eble MJ (2006). Low-grade toxicity after

conformal radiation therapy for prostate cancer-impact of bladder volume. International Journal Radiation

Oncology Biology Physics 64(3):835-841.

[19] Pollack A, Zagars GK, Starkschall G, Antolak JA, Lee JJ, Huang E, Von Eschenbach AC, Kuban DA,

Rosen I (2002). Prostate cancer radiation dose response: results of the M.D. Anderson phase III randomised trial.

International Journal Radiation Oncology Biology Physics 53:1097-1105.

[20] Skwarchuk MW, Jackson A, Zelefsky MJ, Venkatraman ES, Cowen DM, Levegrün S, Burman CM, Fuks

Z, Leibel SA, Ling CC (2000). Late rectal toxicity after conformal radiotherapy of prostate cancer (I) :

Multivariate analysis and dose-response. International Journal Radiation Oncology Biology Physics 47:103-113.

[21] Fiorino C, Valdagni R, Rancati T, Sanguineti G (2009). Dose-volume effects for normal tissues in external

radiotherapy : pelvis. Radiotherapy and Oncology 93:153-167.

[22] Vral A (2009-2010). Hoofdstuk 2 cursus radiobiologie 1e master biomedische wetenschappen. Ugent

[23] Bourguignon MH, Gisone PA, Perez MR, Michelin S, Dubner D, Di Giorgio M, Carosella ED (2005).

Genetic and epigenetic features in radiation sensitivity Part I: Cell signaling in radiation response. European

Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 32(2):229-246.

[24] Downs JA, Nussenzweig MC, Nussenzweig A (2007). Chromatin dynamics and the preservation of genetic

information. Nature 447:951-958.

[25] Burri R, Stock R, Cesaretti J, Atencio D, Peters S, Peters C, Fan G, Stone N, Ostrer H, Rosenstein B (2008).

Association of single nucleotide polymorphisms in SOD2, XRCC1 and XRCC3 with susceptibility for the

development of adverse effects resulting from radiotherapy for prostate cancer. Radiation Research 170:49-59

http://www.belgiancancerregistry.be/

http://ctep.cancer.gov/reporting/ctc.html

49

[26] Iliakis G, Dahm-Daphi J, Dikomey E (2009). DNA repair and cell cycle regulation after ionizing

irradiation. Medical Radiology 251-271.

[27] Schulte-Uentrop L, El-Waldy RA, Schlieker L, Willers H, Dahm-Daphi J (2008). Distinct roles of XRCC4

and Ku70 in non-homologous end-joining of endonuclease- and ionizing radiation-induced DNA double strand

breaks. Nucleic Acids Research 36(8):2561-2569.

[28] Baluna RG, Eng TY, Thomas CR (2006). Adhesion molecules in radiotherapy. Radiation Research

166:819-831.

[29] Ancher MS (2010). Targeting the TGFβ1 pathway to prevent normal tissue injury after cancer therapy. The

Oncologist 15:350-359.

[30] Peters CA, Stock RG, Cesaretti JA, Atencio DP, Peters S, Burri RJ, Stone NN, Ostrer H, Rosenstein BR

(2008). TGFβ1 single nucleotide polymorphisms are associated with adverse quality of life in prostate cancer

patients treated with radiotherapy. International Journal Radiation Oncology Biology Physics 70:752-759.

[31] De Ruyck K, Van Eijkeren M, Claes K, Morthier R, De Paepe A, Vral A, De Ridder L, Thierens H (2005).

Radiation-induced damage to normal tissues after radiotherapy in patients treated for gynecologic tumors:

association with single nucleotide polymorphisms in XRCC1, XRCC3, and OGG1 genes and in vitro

chromosomal radiosensitivity in lymphocytes. International Journal Radiation Oncology Biology Physics

62:1140-1149.

[32] Ho AY, Atencio DP, Peters S, Stock RG, Formenti SC, Cesaretti JA, Green S, Haffty B, Drumea K, Leitzin

L, Kuten A, Azria D, Ozsahin M, Overgaard J, Andreassen CN, Trop CS, Park J, Rosenstein BS (2006). Genetic

predictors of adverse radiotherapy effects: the gene-pare project. International Journal Radiation Oncology

Biology Physics 65:646-655.

[33] Chorley BN, Wang X, Campbell MR, Pittman GS, Noureddine MA (2008). Discovery and verification of

functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: Current and developing

technologies. Mutation Research 659:147-157.

[34] Andreassen CN, Alsner J, 0vergaard J (2002). Does variability in normal tissue reactions after radiotherapy

have a genetic basis-where and how to look for it? Radiotherapy and Oncology 64:131-140.

[35] Au WW, Navasumrit P, Ruchirawat M (2004). Use of biomarkers to characterize functions of polymorphic

DNA repair genotypes. International Journal of Hygiene and Environmental Health 207:301-313.

[36] Werbrouck J, De Ruyck K, Duprez F, Veldeman L, Claes K, Van Eijkeren M, Boterberg T, Willems P, Vral

A, De Neve W, Thierens H (2009). Acute normal tissue reactions in head-and-neck cancer patients treated with

IMRT: influence of dose and association with genetic polymorphisms in DNA DSB repair genes. International

Journal Radiation Oncology Biology Physics 73:1187-1195.

[37] Andreassen CN, Alsner J, Overgaard M, Overgaard J (2003). Prediction of normal tissue radiosensitivity

from polymorphisms in candidate genes. Radiotehrapy and Oncology 69:127-135.

[38] Willems P, De Ruyck K, Van den broecke R, Makar A, Perletti G, Thierens H, Vral A (2009). A

polymorphism in the promoter region of Ku70/XRCC6, associated with breast cancer risk and oestrogen

exposure. Journal of Cancer Research & Clinical Oncology 135:1159-1168.

[39] De Ruyck K, Sabbe N, Oberije C, Vandecasteele K, Thas O, De Ruysscher D, Lambin P, Van Meerbeeck J,

De Neve W, Thierens H (2011). Development of a multi-component prediction model for acute esophagitis in

lung cancer patients receiving chemo-radiotherapy. Red Journal (accepted for publication).

[40] Quarmby S, Fakhoury H, Levine E, Barber J, Wylie J, Hajeer AH, West C, Stewart A, Magee B, Kumar S

(2003). Association of transforming growth factor beta-1 single nucleotide polymorphisms with radiation-

induced damage to normal tissues in breast cancer patients. International Journal Radiation Biology 79(2):137-

143.

[41] Yuan X, Liao Z, Liu Z, Wang L, Tucker SL, Mao L, Wang XS, Martel M, Komaki R, Cox JD, Milas J, Wei

Q (2009). Single nucleotide polymorphism at rs1982073:T869C of the TGFB1 Gene is associated with the risk

of radiation pneumonitis in patients with non-small-cell lung cancer treated with definitive radiotherapy. Journal

of Clinical Oncology 27(20):3370-3378.

[42] Schirmer MA, Brockmöller J, Rave-Fränk, Virsik P, Wilken B, Kühnle E, Campean R, Hoffmann AO,

Müller K, Goetze RG, Neumann M, Janke JH, Nasser F, Wolff HA, Ghadimi M, Schmidberger H, Hess CF,

Christiansen H, Hille A (2011). A putatively functional haplotype in the gene encoding transforming growth

factor beta-1 as a potential biomarker for radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology

Physics 79(3):866-874.

[43] Yeoh EK, Fraser RJ, Mc Gowan RE, Botten RJ, Di Matteo AC, Roos DE, Penniment MG, Borg MF (2003).

Evidence for efficacy without increased toxicity of hypofractionated radiotherapy for prostate carcinoma: early

results of a phase III randomized trial. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics 55(4):943-

955.

[44] Burnet NG, Thomas SJ, Burton KE, Jefferies SJ (2004). Defining the tumour and target volumes for

radiotherapy. Cancer Imaging 4:153-161.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/03603016



50

[45] Catalona WJ, Smith DS, Ratliff TL, Dodds KM, Coplen DE, Yuan JJ, Petros JA, Androile GL (1991).

Measurement of prostate-specific antigen in serum as screening test for prostate cancer. The New England

Journal Of Medicine 324(17):1156-1161.

[46] Kim Y, Flynn TR, Donoff RB, Wong DTW, Todd R (2002). The gene: the polymerase chain reaction and

its clinical application. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 60:808-815.

[47] Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi).

[48] Restriction mapper version 3 (http://www.restrictionmapper.org)

[49] A guide to high resolution melting (HRM) analysis. (http://products.appliedbiosystems.com).

[50] Reed GH, Wittwer CT (2004). Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by

high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry 50(10): 1748-1754.

[51] McGilligan VE, Wallace JMW, Heavey PM, Rdiley DL, Rowland IR (2007). Hypothesis about mechanisms

through which nicotine might exert its effect on the interdependence of inflammation and gut barrier function in

ulcerative colitis. Inflammatory Bowel Diseases 13:108-11.

[52] Wu C, Chen W, Lin P, Liao S, Chen M (2009). Androgen deprivation modulates the inflammatory response

induced by irradiation. BMC Cancer 9:92.

[53] Vavassori V, Fiorino C, Rancati T, Magli A, Fellin G, Baccolini M, Bianchi C, Cagna E, Mauro FA, Monti

AF, Munoz F, Stasi M, Franzone P, Valdagni R (2007). Predictors for rectal and intestinal acute toxicities during

prostate cancer high-dose 3D-CRT: results of a prospective multicenter study. International Journal of Radiation

Oncology Biology Physics 67(5):1401-1410.

[54] Omoto Y (2008). Estrogen receptor signaling in growth of the ventral prostate: comparison of neonatal

growth and postcastration regrowth. Endocrinology 149(9):4421–4427.

[55] Sanda MG, Dunn RL, Michalski J, Sandler HM, Northouse L, Hembroff L, Lin Xihong, Greenfield TK,

Litwin MS, Saigal CS, Mahadevan A, Klein E, Kibel A, Pisters L, Kuban D, Kaplan I, Wood D, Ciezki J, Shah

N, Wei JT (2008). Quality of life and satisfaction with outcome among prostate-cancer survivors. The New

England Journal of Medicine 358:1250-1261.

[56] Pardo Y, Guedea F, Aguilo F, Fernandez P, Macias V, Marino A, Hervas A, Herruzo I, Ortiz MJ, Ponce de

Léon J, Craven-Bratle J, Suarez JF, Boladeras A, Pont A, Ayala A, Sancho G, Martinez E, Alonso J, Ferrer M

(2010). Quality of life impact of primary treatments for localized prostate cancer in patients without hormonal

treatment. Journal of Clinical Oncology 28(31):4687-4695.

[57] Weiss JP, Blaivas JG (2000). Nocturia. The Journal of Urology 163:5-12.

[58] Ost P, Fonteyne V, Villiers G, Lumen Nicolaas, Oosterlinck W, De Meerleer G (2009). Adjuvant high-dose

intensity-modulated radiotherapy after radical prostatectomy for prostate cancer: clinical results in 104 patients.

European Urology 56:669-677.

[59] Bucci J, Morris J, Keyes M, Spadinger I, Sidhu S, Moravan V (2002). Predictive factors of urinary retention

following prostate brachytherapy. International Journal Radiation Oncology Biology Physics 53(1):91-98.

[60] Alsbeih G, El-Sebaie M, Al-Harbi N, Al-Buhairi M, Al-Hadyan K, Al-Rajhi N (2007). Radiosensitivity of

human fibroblasts is associated with amino acid substitution variants in susceptible genes and correlates with the

number of risk alleles. International Journal Radiation Oncology Biology Physics 68(1):229-235.

[61] Araujo FD, Pierce AJ, Stark JM, Jasin M (2002). Variant XRCC3 implicated in cancer is functional in

homology-directed repair of double-strand breaks. Oncogene 21(26):4176-4180.

[62] Wiegman EM, Blaese MA, Loeffler H, Coppes RP, Rodemann HP (2007). TGFB1 dependent fast

stimulation of ATM and p53 phosphorylation following exposure to ionizing radiation does not involve TGFB-

receptor I signaling. Radiotherapy and Oncology 83:289-295.

[63] Andreassen CN, Alsner J, Overgaard M, Sørensen FB, Overgaard J (2006). Risk of radiation-induced

subcutaneaous fibrosis in relation to single nucleotide polymorphisms in TGFB1, SOD2, XRCC1, XRCC3, APEX

and ATM – a study based on DNA from formalin fixed paraffin embedded tissue samples. International

Journal of Radiation Biology 82(8):577-586.

[64] Walker HK, Hall WD, Hurst JW (1990). Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory

Examinations. Boston: Butterworths 3rd edition.

[65] Giotopoulus G, Symonds RP, Foweraker K, Griffin M, Peat I, Osman A, Plumb M (2007). The late

radiotherapy normal tissue injury phenotypes of telangiectasia, fibrosis and atrophy in breast cancer patients

have distinct genotype-dependent causes. Britisch Journal of Cancer 96:1001-1007.

[66] Zschenker O, Raabe A, Boeckelmann IK, Borstelmann S, Szymczak S, Wellek S, Rades D, Hoeller U,

Ziegler A, Dikomey E, Borgmann K (2010). Association of single nucleotide polymorphisms in ATM, GSTP1,

SOD2, TGFB1, XPD and XRCC1 with clinical and cellular radiosensitivity. Radiotherapy and Oncology,

doi:10.1016/j.radonc.2010.01.016.

[67] Alsbeih G, Al-Harbi N, Al-Hadyan K, El-Sebaie M, Al-Rajhi N (2010). Association between normal tissue

complications after radiotherapy and polymorphic variations in TGFB1 and XRCC1 genes. Radiation Research

173:505-511.

http://www.restrictionmapper.org/

http://products.appliedbiosystems.com/



Bijlagen

- 1 -

BIJLAGE A: Scoresysteem

(*) RTOG toxiciteitsschaal

(**) Yeoh et al. [43]

(***) In house observatie ( + )SOMA

(# )RTOG + CTC

GRAAD 1 GRAAD 2 GRAAD 3 GRAAD 4

Nocturie (*) Twee maal

pretherapie, 2-3 maal

4-6 maal (<1 maal

per uur)

6 maal (>1 maal per

uur)

Urinaire

frequentie (*)

Één maal/2 uur, 2

maal pretherapie

Één maal/uur Één maal/half uur

(>1 maal per uur)

Hematurie (#) microscopisch Intermittent

microscopisch

Macroscopisch,

klonters

Transfusienood

Dysurie (*) Geen therapie

noodzakelijk

Perorale, niet

narcotische therapie

Narcotische

therapie

Urinaire

urgentie (*)

Geen therapie

noodzakelijk

Perorale therapie IV therapie

Urinaire

incontinentie (+)

Geen therapie Therapie of

hygiënische

verbanden (≤ 2

maal per dag)

Hygiënische

verbanden (> 2

maal per dag)

heelkunde

GRAAD 1 GRAAD 2 GRAAD 3 GRAAD 4

Abdominale

krampen (*)

Diarree (*)

Frequentie (*)

Mucusverlies (*)

Rbpa (***)

Geen medicatie

nodig, geen invloed

op dagelijkse

activiteiten, ≤ 3X per

week

Medicatie nodig,

dagelijkse

activiteiten

verstoord, ≥3

episodes per week

GI incontinentie

(**)

Flatus en verlies van

feces en rectumvocht

zonder nood aan

hygiënisch verband,

geen invloed op

dagelijkse activiteiten,

minder dan 3X per

week

Nood aan

hygiënisch verband,

dagelijkse

activiteiten

verstoord, ≥3

episodes per week

GI urgentie (**) Milde symptomen,

kunnen genegeerd

worden, geen invloed

op dagelijkse

activiteiten, ≤ 3X per

week

Nood aan

medicatie,

dagelijkse

activiteiten

verstoord, ≥3

episodes per week

- 2 -

Acute GI en GU complicaties:

G2+ opgenomen als geval.

Late GI en GU complicaties:

- 3 -

BIJLAGE B: RFLP protocols

1. TGFβ1 c.-800 G>A en c.-509 C>T

Primers: 39 & 40

PCR programma

Step Temp Time

95°C 5 min

Denaturation 95°C 30 sec

Primer annealing 60°C 30 sec 35 cycli

Extension 72°C 30 sec

72°C 10 min

Hold 15°C 10 min

PCR Mix

5 µl dNTP (1 mM)

5 µl Buffer (5X)

1.5 µl MgCl2 (25mM)

0.5 µl forward primer (50 µM)

0.5 µl reverse primer (50 µM)

0.12 µl Kappa Taq (0.6U)

5 µl DNA (25 ng/µl), totaalvolume van 25 µl (7.38 µl)

Digest

-800 G>A

Enzyme: HpyCh4IV

Incubation: 37°C for minimal 3 hours

Digest volume 30 µl

dH2O 16,8 µl

PCR product 10 µl

NEBuffer 3 3 µl

HpyCh4IV 0,2 µl

Expected digest product -800:

GG: 195 / 486

GA: 195 / 486 / 681

AA: 681

-509 C>T

Enzyme: Bsu36I

Incubation: 37°C overnight (min 22h)


dH2O 18.4 µl

PCR product 8 µl

NEBuffer 3 3 µl

BSA 0.3 µl

Bsu36I 0,3 µl

Expected digest product -509:

CC: 193 / 488

CT: 193 / 488 / 681

TT: 681

- 4 -

2. TGFB1 c.74 G>C

Primers: 41 & 42

PCR programma

Step Temp Time

95°C 5 min




72°C 10 min

Hold 15°C 10 min

PCR Mix

3 µl dNTP (1 mM)

3 µl Buffer (5X)






Digest

Enzyme: BgI I

Incubation: 37°C for 3 hours


dH2O 16,6 µl

PCR product 10 µl

NEBuffer 3 3 µl

BgI I 0,4 µl

Expected digest product:

GG: 252

GC: 252 / 312

CC: 312

- 5 -

BIJLAGE C: HRM protocols

1. XRCC3 c.722 C>T

PCR Mix

Primers: Forward : 5’-GGCCAGGCATCTGCAGTC-3’ P124 Tm=63.0°C 18bp

Reverse : 5’-CTCACCTGGTTGATGCACAG-3’ P122 Tm =60.3°C 20bp

Fragment: 87 bp %GC=66

Mix: General 20 µl

1 reactie (µl) Finale conc Buffer (10x) 2 1x

MgCl2 (25mM) 1,2 1.5 mM

dNTP Mix (10mM) 0,4 0.2 mM

F primer (P124) 1,2 300 nM

R primer (P122) 1,2 300 nM

Meltdoctor HRM Dye (20x) 1 1x

AmpliTaq Gold DNA

Polymerase (5U/µl) 0,05 0.0125U/µl (0,25U)

dH2O 11,95

DNA 1

Meltdoctor dye vervangen door 0.6 µl SYTO-9 (50µM) (12.35 µl dH2O).

PCR/HRM program

Stage Step Temp Time

Holding Enzyme activation 95°C 10 min

Cycling (40 cycles) Denature 95°C 15 sec

Anneal/Extend 60°C 1 min

Melt curve/dissociation Denature 95°C 10 sec

Anneal 60°C 1 min

High Resolution

melting 95°C 15 sec

Anneal 60°C 15 sec

- 6 -

2. Ku70 c.-1310 C>G

PCR Mix

Primers: Forward : 5’-GTCGTGGCCCAAGTCTCC -3’ P145 Tm= 61.7°C 18-bp

Reversed : 5’-CCATCATGCTGGGTGAGG -3’ P147 Tm= 61.1°C 18-bp

Spike-in experiment

Mix: General 20 µl

1 reactie (µl) Finale conc

Buffer (10x) 2 1x

MgCl2 (25mM) 1,6 2.0 mM


F primer (P124) 1,2 300 nM

R primer (P122) 1,2 300 nM


AmpliTaq Gold DNA

Polymerase (5U/µl) 0,2 0.05U/µl (1U)

dH2O 11,4

DNA 1

Mix: Spike-in 20µl


Buffer (10x) 2 1x

MgCl2 (25mM) 1,6 2.0 mM


F primer (P124) 1,2 300 nM

R primer (P122) 1,2 300 nM


AmpliTaq Gold DNA


dH2O 10,4

DNA 1

Spike-in DNA 1

PCR/HRM program






Anneal 60°C 1 min

High Resolution


Anneal 60°C 15 sec

- 7 -

PCR Mix met SYTO-9 dye

SYTO-9:

Stockoplossing: 5mM

Werkoplossing: 50µM:

100 keer verdunnen

1 µl 5mM SYTO-9 in 99µl H2O

Werkoplossing voor KU70 SNP (benaderen van Meltdoctor dye):

1µl 5mM SYTO-9 + 3µl glycerol (3% van volume) in 96µl H2O

Mix: General 20 µl

1 reactie

(µl) Finale conc

Buffer (10x) 2 1x

MgCl2 (25mM) 1,6 2.0 mM


F primer (P124) 1,2 300 nM

R primer (P122) 1,2 300 nM

SYTO-9 (50µM + 3% glycerol) 0.6 1.5 µM

AmpliTaq Gold DNA


dH2O 11,8

DNA 1

Analoog voor spike-in mix

- 8 -

BIJLAGE D: Snapschotprotocol

TGFB1 c.29 T>C

Primers: 41 & 42

PCR programma

Step Temp Time

95°C 5 min




72°C 10 min

Hold 15°C 10 min

PCR Mix

3 µl dNTP (1 mM)

3 µl Buffer (5X)






SnapShot

Primer: SS04

- 9 -

BIJLAGE E: Geoptimaliseerde HRM protocol

TGFB1 g.10780 T>G

PCR Mix

Primers: Forward : 5’-GTCGGCTGGTTACAAGGTC-3’ P218 Tm=58.1°C 19bp

Reverse : 5’-GCTTGGCAACAGAGTGAGAC-3’ P220 Tm=58.6°C 20bp

Fragment: 117 bp %GC=44

Mix: General 20 µl


Buffer (10x) 2 1x

MgCl2 (25mM) 1,2 1.5 mM


F primer (P124) 1,2 300 nM

R primer (P122) 1,2 300 nM


AmpliTaq Gold DNA

Polymerase (5U/µl) 0,05 0.0125U/µl (0,25U)

dH2O 11,95

DNA 1

Meltdoctor dye vervangen door 0.6 µl SYTO-9 (50µM) (12.35 µl dH2O).

PCR/HRM program






Anneal 60°C 1 min

High Resolution


Anneal 60°C 15 sec

- 10 -

BIJLAGE F: Geoptimaliseerde snapschotprotocol

ITGB2 c.819 G>A

Primers: 244 en 245

PCR programma

Step Temp Time

95°C 5 min




72°C 10 min

Hold 15°C 10 min

PCR Mix

3 µl dNTP (1 mM)

3 µl Buffer (5X)






SnapShot

Primer: SS21

(G/A: blauw/groen)

- 11 -

BIJLAGE G: Resultaten van de genotypering

Code

XRCC3

c.722 C>T

Ku70 c.-

1310 C>G

ITGB2

c.819 G>A

TGFB1 c.-

800 G>A

TGFB1 c.-

509 C>T

TGFB1

c.29

T>C

TGFB1

c.74

G>C

TGFB1

g.10780

T>G

PK001 CT CC GG GG CT CC GC TG

PK002 CC CC GG GG CT TC GG TG

PK003 CC CG GA GG CT TC GG TG


PK005 CT CC AA GA CC TT GG TG

PK006 CT CG GG GG CC TC GC TT

PK007 CT CG GG GG CC TC GC TG

PK008 CC CC GG GG CC TT GG TT

PK009 CC GG GG GG CT TC GG TG

PK010 CC CG GG GA CT TC GG TG

PK011 CT CC GG GG CT TC GG TG

PK012 CC CG GA GG CT TC GG GG

PK013 CC CC GG GG CC TT GG GG

PK014 CC CG GG GA CC TT GG TT

PK015 CT GG GG GG CT CC GC TG

PK016 CC CG GG GG CC TC GC TT

PK017 CC CG GA GG CC TT GG TT

PK018 TT CG GG GG CT TC GG TG

PK019 CT CG GA GG CT CC GC TG

PK021 CT GG GG GG CT TC GG TG

PK022 CC CC GA GG CT CC GC TG

PK023 TT CG GA GG CT TC GG GG

PK024 CC CG GA AA CC TT GG TT

PK025 / CG GA GG CC TT GG TT

PK027 CT CG GG GG CT TC GG TG

PK028 CT CC GG GG CC TC GC TT

PK029 CC CG GG GG CC TT GG TT

PK030 CT CC GG GG CT TC GG GG

PK031 CC CC GG GG CT TC GG GG

PK032 CC CC GG GA CC TT GG TT

PK033 CC CG / GA CC TT GG TT

PK034 CC GG GA GG CC TC GC TT

PK035 / GG GA / / TC GC TT

PK036 CC GG GG GG TT CC GG GG

PK037 CT CG GA GG CT TC GG TG

PK038 CC GG GG GA CC TC GG TG

PK039 CC CG GG GG CT TC GC TT

PK040 TT CG GA GG CT CC GC TG

PK041 TT CG GG GG TT TC GG TG

PK042 CC CG GA GG CC TC GC TT

PK043 TT CC GG GG TT CC GG GG

PK044 CC GG GG GG CC TT GG TG

PK045 CT CG / GG TT CC GG GG

PK046 CC CG GG GA CC TT GG TG

PK047 CT CC GA GG CC TT GG GG

PK048 CC CG GG GG CT TC GG TG

PK049 CT CG / GG CC TT GG TG


PK051 CT GG GA GG CT TC GG TG

- 12 -

Code

XRCC3

c.722 C>T

Ku70 c.-

1310 C>G

ITGB2

c.819 G>A

TGFB1 c.-

800 G>A

TGFB1 c.-

509 C>T

TGFB1

c.29

T>C

TGFB1

c.74

G>C

TGFB1

g.10780

T>G

PK052 TT CC GA GA CT TC GG TG

PK053 CC CG GA GG TT CC GG GG


PK055 CC CC GG GG CC TC GC TT

PK056 CT CG GG GG CC TT GG TT

PK057 CT GG GA GG CT TC GG GG

PK059 CT CC GA GG CT TC GG GG

PK060 CT CG GA GG CC TT GG TT

PK061 CT CC GG GA CC TC GC TT


PK063 CT GG GA GG CC TC GC TT

PK064 TT GG GG GG CT TC GG TG



PK067 TT CC GG GG CC TT GG TT


PK069 TT CG GA GG TT CC GG GG

PK070 CT GG GA GA CT TC GG TG

PK071 TT CG GG GG CT TC GG GG

PK072 CC GG GG GG CC TT GG TG


PK074 TT CC GA GG TT CC GG GG

PK075 CC GG GG GG CT TC GG GG


PK077 TT CC GA GG CT TC GG TG


PK080 CT CC / GG CT TC GG TG

PK081 CT CG GA GG CT CC GC TG

PK082 TT CG / GA CC TT GG TG

PK083 TT CC GG GG CT TC GG TG

PK084 CT GG GG GG CC TT GG TG

PK085 CC GG GG GG CC TT GG TT


PK087 CT CG GA GG CT TC GC GG

PK088 CC CG GA GA CC TC GC TT

PK089 CT CG GA GG CC TC GC TG

PK090 CC CG / GG CC TC GC TT



PK093 CC CC GA GG CT TC GG TG

PK094 TT CG GA GG CT TC GG TG

PK095 / CC / / / / / /

PK097 CT GG GA GG CC TT GG TG

PK098 CC CG GG GG CT CC GC TG


PK102 CC CG / GA CT TC GG TG

PK103 CC CG / GG CC TT GG TG

PK104 CT GG GG GG CC TT GG TT


PK106 CC CG GG GG TT CC GG GG

PK107 CT CC GA GA CC TT GG TT

- 13 -

Code

XRCC3

c.722 C>T

Ku70 c.-

1310 C>G

ITGB2

c.819 G>A

TGFB1 c.-

800 G>A

TGFB1 c.-

509 C>T

TGFB1

c.29

T>C

TGFB1

c.74

G>C

TGFB1

g.10780

T>G

PK108 / CG / / / TC / TG

PK109 CT CC GA GA CC TT GG TT

PK110 CT CG GA GG CC TC GC TT

PK111 CC CC GG GG CT CC GC TG

PK112 CC GG GG GG CT TC GG GG

PK113 CT CG GA GA CC TC GC TT

PK114 CT CC GG GG CT CC GC TG


PK116 CC CG GA GG CC TC GC TT


PK118 CC CG GA GG CC TT GG TG

PK119 CT CC GG GG CC TT GG TG

PK120 CT GG GG GG CC TT GG TG

PK121 CC CC GG GG TT CC GG GG

PK122 CT CC GG GG CC TC GC TT

PK123 CT CC GG GA CT TC GG TG

PK124 CC GG GA GG TT CC GG GG


PK126 CT GG / GG CT TC GG TG

PK127 CC CG / GG CT TC GG TG

PK128 TT CC / GA CT TC GG TG

PK130 CT CG / GG CT CC GC TG

PK131 CC CG / GG CC TT GG TT

PK132 CT CG / GG CT TC GG GG

PK133 CC CG / GA CC TT GG TG

PK134 CC CG / GG CC TT GG TT

PK135 CC CC / GG CT TC GG GG

PK136 CT / / GG TT CC GG /

PK137 CT CC / GA CC TT GG TT

PK138 CT CG / GG CT TC GG TG


PK140 CT CC GG GA CT TC GG TG

PK141 CC CG GA GG TT CC GG GG

PK142 CT CG GG GA CC TT GG TT

PK143 CT GG GG GG TT CC GG GG

PK144 CC CC GA GA CC TC GC TT


PK148 CC CC / GG CC TC GC TG

PK149 CT CC GG GG CC TT GG TT

PK150 CC CG GA GG CC TT GG GG

PK151 CT CC GA GA CC TC GC TT

PK152 TT CC GA GG CT TC GG TG



PK155 CC CC GA GG CC TT GG TT

PK156 CT GG GG GA CT TC GG TG

PK157 CC CG GA GG CC TT GG TG



PK160 TT CC GG GA CC TT GG TG

PK161 CT CG GA GG CT TC GG GG

- 14 -

Code

XRCC3

c.722 C>T

Ku70 c.-

1310 C>G

ITGB2

c.819 G>A

TGFB1 c.-

800 G>A

TGFB1 c.-

509 C>T

TGFB1

c.29

T>C

TGFB1

c.74

G>C

TGFB1

g.10780

T>G

PK162 CT CG GA GA CC TT GG TT

PK163 CT CG GA GA CC TT GG TG




PK168 TT CG GA GG CC TT GG TT

PK169 CT GG GA GG CC TT GG TT

PK170 TT GG GG GG TT CC GG GG

PK171 CT CG GG GG CT TT GG TT

PK172 CC CG GG GG CT TT GG GG




PK176 CC CG GG GG CC TC GC TG

PK177 CT GG GA GG TT CC GG GG

PK178 CT CC GG GA CC TT GG TT





PK183 CT CG GG GG CT TC GG GG

PK184 CC CC GG GG CC TT GG TG




PK189 CC CC GG GA CC TT GG TT




PK193 CT GG GA GG CC TT GG TT

PK194 CC GG GA GA CT TC GG TG




PK199 CT CC GA GG CC TT GG TT






PK206 TT CC GG GG CC TT GG TT

PK208 CC CC GA GG CC TT GG GG


PK210 TT CG / GA CC TT GG TG

PK211 CT CG / GG CC TT GG TT

PK212 CC CG / GA CC TT GG TG


PK214 TT CC / GG CC TC GC TT



PK217 CC CG / GA CC TT GG TT

- 15 -

Code

XRCC3

c.722 C>T

Ku70 c.-

1310 C>G

ITGB2

c.819 G>A

TGFB1 c.-

800 G>A

TGFB1 c.-

509 C>T

TGFB1

c.29

T>C

TGFB1

c.74

G>C

TGFB1

g.10780

T>G

PK219 CT CC / AA CC TT GG TT

PK221 CC CC / GG CC TT GG TG


PK223 / CG / GG CT TC GG TG

PK225 CC CC / GG CT CC GC TG

PK226 CT CG / GA CC TT GG TG



PK229 CT CC / GG CC TT GG TG

PK230 CC CG / GG TT CC GG GG

PK231 CC CC / GG CT CC GC TG

PK232 TT CC / GG CC TT GG TT

PK233 CT CG / GA CC TT GG TG



PK236 CC CG / GA CT TC GG TG

PK237 CT CC / GA CT TC GG TG


PK239 CT CG AA GG CC TT GG TT

PK240 CT CC GA GG TT CC GG GG


PK242 CT CC GA GG CT TC GG TG


PK244 CT GG GG GG CC TT GG TT


PK246 TT CC AA GG CC TC GC TG

PK248 TT CC GG AA CC TT GG TT

PK249 CC CC GA GG CC TC GC TT

PK250 TT CG GA GG CC TC GC TT

PK251 CC CG GA GG CC TC GC TG

PK252 CC CG GG GG CT TC GC TG


PK254 CT CG AA GG TT CC GG GG



PK259 CC CC AA GG CC TT GG TG


PK261 CC CG GA GG CT TC GG GG



PK264 CC CG GG AA CC TT GG TT


PK266 CC CC GA GA CT TC GG TG



PK269 CT CG GG GG CC TT GG TG

PK270 TT CG GG GG CT CC GC TG


PK272 CC GG GA GA CC TT GG TT

PK273 CT CC GA GG TT CC GG GG

PK274 CC CG GG GG CT TC GG GG

- 16 -

Code

XRCC3

c.722 C>T

Ku70 c.-

1310 C>G

ITGB2

c.819 G>A

TGFB1 c.-

800 G>A

TGFB1 c.-

509 C>T

TGFB1

c.29

T>C

TGFB1

c.74

G>C

TGFB1

g.10780

T>G

PK275 CT CC / GG CC TC GC /

PK276 / CG GA GG CC TT GG TT


PK279 CT GG GA GG TT CC GG GG

PK281 TT CG GG GA CC TT GG TT

PK282 TT CG GG GG CC TT GG TG


PK284 CC CG GG GG CC TT GG GG


PK286 CT CG AA GG CC TC GC TT

PK287 TT CC GG GA CC TT GG TG

PK288 CT CC GG GG TT CC GG GG

PK289 CT CG / GG TT CC GG GG



PK292 CT CC GA GG CT TC GG TG



PK295 CC CG AA GG CC TC GC TG








PK305 / / / / / TC GG GG


PK307 TT CG GA GA CT TC GG TG

PK308 CC CG GG GG CT CC GC TG

PK309 CT CG GA GG TT CC GG /

PK310 CT CC GA GA CT TC GG TG

PK311 CC CC GA GG TT CC GG GG


PK313 CC CG GG GG CC TC GC TT

PK314 CT CG GG GA CT TC GG TG

PK316 CT CG AA GG CT TC GG TG

PK317 CC CC AA GG CC TT GG TT

PK318 / GG GG GG CC TT GG TT

PK319 CT GG GA GG CC / GG TT



PK323 CT CG GG GG CC TT GG TG

PK325 CT CC GG GG TT CC GG GG








- 17 -

Code

XRCC3

c.722 C>T

Ku70 c.-

1310 C>G

ITGB2

c.819 G>A

TGFB1 c.-

800 G>A

TGFB1 c.-

509 C>T

TGFB1

c.29

T>C

TGFB1

c.74

G>C

TGFB1

g.10780

T>G




PK341 TT CC GG GA CC TT GG TT


PK343 TT CG GG GA CT TC GG TG

PK344 CT CC AA GG CT CC GC TG




PK353 CT CC GG GG CT TC GG GG





PK361 CT CC GA GG CC TT GG TT

PK363 CT CC / GG CC TT GG TG

PK365 CC GG / GG CT TC GG TG

PK371 CC CG / GG CC TT GG /

PK372 CT CG / GA CC TC GC /

PK373 CT CG / GG TT CC GG /

PK374 CC GG / GG CC TC GC /

PK380 / / / / / / / /

PK383 / / / / / / / /

RT767 CC CC / GG CC TC GC /

- 18 -

BIJLAGE H: Associatie tussen patiënt- en dosisgerelateerde factoren voor

acute complicaties

Associatie tussen patiëntgerelateerde factoren en het optreden van acute GU complicaties.

Associatie tussen dosisgerelateerde factoren en optreden van acute GU complicaties.

Geni nocturie Geni frequentie

Graad G0-1 G2+ OR P G0-1 G2+ OR P

Leeftijd 65.6# 67.1

# 0.091

~ 66.0

# 65.8

# 0.843

Roken 0

1

2

71

126

43

15

56

12

0.051~ 71

161

46

15

21

9

0.363

Abdominale chirugie 0

1

98

141

45

39

0.6 0.046* 118

159

25

21

1.19

0.137

Hemorroïden 0

1

181

57

66

18

0.86

0.638 212

64

35

11

1.04

0.914

TUR 0

1

194

40

74

10

0.66

0.262 228

44

40

6

0.78

0.589

Adjuvante

hormoontherapie

0

1

93

141

31

52

1.11

0.701 108

164

16

29

1.19

0.597

pN 0

1

143

94

53

28

0.80

0.416 162

113

34

9

0.38 0.011*

Diabetes 0

1

208

30

74

10

0.94

0.867 243

33

39

7

1.30

0.535

Radicale

prostatectomie

0

1

149

90

73

11

0.25

0.000* 185

93

37

8

0.43

0.035*

Statines 0

1

129

47

46

17

1.01

0.966 147

58

28

6

0.54

0.194

*: <0.05 is statistisch significant ~: trend tot significantie #: gemiddelde controle vs case groep

Geni nocturie Geni frequentie

p G0-1 / G2+# p G0-1 / G2+

#

CTVtargetMax(Gy) <0.001* 80.5 - 81.6 0.203 80.7 - 81.3

CTVtargetVol(cc) 0.003* 44.4 - 54.4 0.036* 46.0 - 52.6

CTVtarget50(Gy) <0.001* 77.3 - 78-6 0.050* 77.6 - 78.2

BladderMax(Gy) 0.003* 78.2 - 78-2 0.027* 78.0 - 79.0

Radioprescriptie 0.000* 0.194

*: <0.05 is statistisch significant #: gemiddelde G0-1 vs G2+ groep

- 19 -

Boxplotten van de associaties tussen dosisparameters en optreden van acute GU complicaties.

- 20 -

- 21 -

BIJLAGE I: Associatie tussen de beschouwde SNPs en optreden van

weefselcomplicaties.

1. Acute GU weefselcomplicaties

Associatie tussen de beschouwde SNPs en het risico op acute geninocturie

G0-1 G2+ OR P OR# P#

XRCC3

c.722

C>T

CC 109 (47%) 28 (35%) ref

CT 101 (43%) 35(43%) 1.349 0.300

TT 24 (10%) 18 (22%) 2.920 0.004* 5.617 <0.001*

Dominant (CT+TT vs CC) 1.651 0.061~

Recessief (TT vs CC+CT) 2.500 0.008* 4.088 0.001*

Ku70

c.-1310

C>G

CC 83 (35%) 36(43%) ref

CG 119(50%) 39(46%) 0.756 0.303

GG 35(15%) 9(11%) 0.593 0.217

Dominant(CG+GG vs CC) 0.719 0.202

Recessief (GG vs CC+CG) 0.693 0.355

Recessief(AA vs GG+GA) 0.963 0.974

ITGB2

g.10780

G>A

GG

GA

AA

Dominant(GA+AA vs GG)

Recessief(AA vs GG+GA)

108(57%)

77(40%)

6(3%)

42(61%)

23(33%)

4(6%)

Ref

0.768

1.714

0.836

1.897

0.378

0.422

0.533

0.333

TGFB1

c.-509

C>T

CC 131(55%) 30(37%) ref

CT 87(37%) 45(55%) 2.259 0.003* 1.760 0.020*

TT 19(8%) 7(9%) 1.609 0.328

Dominant (CT+TT vs CC) 2.142 0.004* 2.008 0.020*

Recessief ( TT vs CC+CT) 1.071 0.882

TGFB1

c.-800

G>A

GG 195(82%) 66(80%) ref

GA 39(16%) 15(18%) 1.136 0.703

AA 3(1%) 1(1%) 0.985 0.990

Dominant(GA+AA vs GG) 1.126 0.717


TGFB1

c.29

T>C

TT 105(44%) 19(23%) ref

TC 100(42%) 55(66%) 3.039 <0.001* 2.841 0.002*

CC 33(14%) 9(11%) 1.507 0.363

Dominant (TC+CC vs TT) 2.659 0.001* 2.470 0.005*

Recessief (CC vs TT+TC) 0.756 0.483

TGFB1

c.74

G>C

GG 195(82%) 68(83%) ref

GC 44(18%) 14(17%) 0.912 0.786

CC 0 (0%) 0 (0%)

Dominant(GC+CC vs GG) 0.912 0.786

Recessief (CC vs GG+GC)

TGFB1

g.10780

T>G

TT 91(39%) 17(21%) ref

TG 106 (45%) 50(62%) 2.525 0.003* 2.875 0.004*

GG 36(15%) 14(17%) 2.082 0.075~ 2.546 0.043~

Dominant (TG+GG vs TT) 2.413 0.004* 2.785 0.003*

Recessief (GG vs TT+TG) 1.143 0.698

*: <0.05 is statistisch significant

~ : trend tot significantie

#: multivariate analyse gecorrigeerd voor leeftijd, roken, abdominale chirurgie, RP, radioprescriptie, CTVtargetMax,

CTVtarget50, CTVtargetVol en BlaasMax.

- 22 -

Associatie tussen de beschouwde SNPs en het optreden van acute genifrequentie


XRCC3

c.722

C>T

CC 116(43%) 21(47%) ref

CT 123(46%) 13(29%) 0.584 0.152

TT 31(11%) 11(24%) 1.960 0.112

Dominant (CC vs CT+TT) 0.861 0.643

Recessief (CC+CT vs TT) 2.494 0.021* 3.158 0.010*

Ku70

c.-1310

C>G

CC 99(36%) 20(43%) ref

CG 136(49%) 22(48%) 0.801 0.508

GG 40(15%) 4(9%) 0.495 0.224

Dominant(CC vs CG+GG) 0.731 0.332

Recessief CC+CG vs GG) 0.560 0.292

ITGB2

c.819

G>A

GG 127(57%) 23(61%) ref

GA 85(38%) 15(3%) 0.974 0.943

AA 10(5%) 0 (0%) 0.000 0.999

Dominant(GG vs GA+AA) 0.872 0.702

Recessief(GG+GA vs AA) 0.000 0.999

TGFB1

c.-509

C>T

CC 137(50%) 24(52%) ref

CT 111(41%) 21(46%) 1.080 0.813

TT 25(9%) 1(2%) 0.228 0.157

Dominant (CT+TT vs CC) 0.923 0.803


TGFB1

c. -800

G>A

GG 223(82%) 38(83%) ref

GA 46(17%) 8(17%) 1.021 0.961

AA 4(1%) 0 (0%) 0.000 0.999



TGFB1

c.29

T>C

TT 105(38%) 19(41%) ref

TC 129(47%) 26(57%) 1.114 0.743

CC 41(15%) 1(2%) 0.135 0.055~ 0.141 0.064~

Dominant (TC+CC vs TT) 0.878 0.687

Recessief (CC vs TT+TC) 0.127 0.044* 0.148 0.065~

TGFB1

c.74

G>C

GG 224 (81%) 39 (85%) ref

GC 51(19%) 7 (15%) 0.788 0.588

CC 0 (0%) 0 (0%)


Recessief (CCvsGG+GC)

TGFB1

g.10780

T>G

TT 87(32%) 21(48%) ref

TG 135(50%) 21 (48%) 0.644 0.193

GG 48(18%) 2 (4%) 0.173 0.021* 0.093 0.024*

Dominant (TT vs TG+GG) 0.521 0.047* 0.571 0.117

Recessief (TT+TG vs GG) 0.220 0.041* 0.107 0.030*



#: multivariate analyse gecorrigeerd voor pN, RP, CTVtargetVol, CTVtarget50 en BlaasMax.

- 23 -

2. Late GI en GU weefselcomplicaties

Associatie tussen de beschouwde SNPs en het optreden van late GI frequentie



#: multivariate analyse gecorrigeerd voor roken

G0 G1+ OR P OR# P#

XRCC3

c.722

C>T

CC 114 (45%) 22(39%) ref

CT 108(43%) 28(49%) 1.343 0.349

TT 32(13%) 9(16%) 1.457 0.396


Recessief (CC+CT vs TT) 0.225 0.587

Ku70

c.-1310

C>G

CC 92(35%) 27(46%) ref

CG 131(50%) 25(42%) 0.650 0.164 0.695 0.243

GG 37(14%) 7(12%) 0.645 0.347



ITGB2

c.819

G>A

GG 119(56%) 31(66%) ref

GA 86(41%) 13(28%) 0.580 0.130 0.553 0.103

AA 7(3%) 3(6%) 1.645 0.489



TGFB1

c.-509

C>T

CC 125(45%) 34(58%) ref

CT 112(43%) 20(34%) 0.657 0.175 0.653 0.173

TT 21(8%) 5(8%) 0.875 0.803



TGFB1

c. -800

G>A

GG 210(81%) 49(83%) ref

GA 44(17%) 10(17%) 0.974 0.945

AA 4(2%) 0 (0%) 0.000 0.999



TGFB1

c.29

T>C

TT 94(36%) 28(47%) ref

TC 131(51%) 23(39%) 0.589 0.090~ 0.581 0.084~

CC 34(13%) 8(14%) 0.790 0.599

Dominant (TC+CC vs TT) 0.631 0.113 0.629 0.114


TGFB1

c.74

G>C

GG 212 (82%) 48 (81%) ref

GC 47(18%) 11 (19%) 1.034 0.929

CC 0 (0%) 0 (0%)



TGFB1

g.10780

T>G

TT 83(33%) 23(40%) ref

TG 128(51%) 28(48%) 0.789 0.452

GG 42(17%) 7(12%) 0.601 0.281

Dominant (TT vs TG+GG) 0.743 0.322

Recessief (TT+TG vs GG) 0.690 0.395

- 24 -

Associatie tussen de beschouwde SNPs en het optreden van laat GI mucusverlies



#: multivariate analyse gecorrigeerd voor roken, abdominale chirurgie, pN, R40, R60, RectumMax,

CTVtargetVol

G0 G1+ OR P OR# P#

XRCC3

c.722

C>T

CC 111(43%) 27(45%) ref

CT 113(44%) 23(38%) 0.837 0.570

TT 32(13%) 10(17%) 1.285 0.552



Ku70

c.-1310

C>G

CC 91(35%) 29(48%) ref

CG 137(52%) 21(35%) 0.481 0.021* 0.408 0.017*

GG 34(13%) 10(17%) 0.923 0.848

Dominant(CC vs CG+GG) 0.569 0.051~ 0.518 0.052~


ITGB2

c.819

G>A

GG 119(57%) 31(58%) Ref

GA 79(38%) 22(42%) 1.069 0.832

AA 10(5%) 0 (0%) 0.000 0.999



TGFB1

c.-509

C>T

CC 125(48%) 34(57%) ref

CT 112(43%) 20(33%) 1.154 0.635

TT 21(8%) 5(8%) 1.425 0.487



TGFB1

c. -800

G>A

GG 214(82%) 48(80%) ref

GA 42(16%) 12(20%) 1.274 0.506

AA 4(2%) 0 0.000 0.999



TGFB1

c.29

T>C

TT 99 (38%) 25(42%) ref

TC 129(49%) 27(45%) 0.829 0.542

CC 34(13%) 8(13%) 0.932 0.876



TGFB1

c.74

G>C

GG 213(81%) 51(85%) ref

GC 49(19%) 9(15%) 0.767 0.502

CC 0 (0%) 0 (0%)



TGFB1

g.10780

T>G

TT 86(34%) 22(37%) Ref

TG 132(52%) 25(42%) 0.740 0.353

GG 38(15%) 12(20%) 1.234 0.606



25

Associatie tussen de beschouwde SNPs en het optreden van late GI urgentie



#: multivariate analyse gecorrigeerd voor R40, R60, S60 en CTVtargetVol

G0 G1+ OR P OR# P#

XRCC3

c.722

C>T

CC 105(43%) 33(45%) Ref

CT 106(44%) 30(41%) 0.901 0.715

TT 31(13%) 11(15%) 1.129 0.764



Ku70

c.-1310

C>G

CC 95(38%) 25(34%) Ref

CG 119(48%) 39(53%) 1.245 0.451

GG 34(14%) 10(14%) 1.118 0.793



ITGB2

c.819

G>A

GG 114(57%) 36(59%) ref

GA 79(40%) 22(36%) 0.882 0.683

AA 7(4%) 3(5%) 1.357 0.670



TGFB1

c.-509

C>T

CC 124(50%) 37(50%) ref

CT 104(42%) 29(39%) 0.935 0.810

TT 18(7%) 8(11%) 1.489 0.391



TGFB1

c. -800

G>A

GG 207(84%) 55(74%) ref

GA 38(15%) 16(22%) 1.585 0.169 2.473 0.015*

AA 1(0.4%) 3(3%) 11.291 0.037* 14.931 0.022*

Dominant(GA+AA vs GG) 1.834 0.057~ 2.876 0.003*

Recessief(AA vs GG+GA) 10.352 0.044* 12.080 0.034*

TGFB1

c.29

T>C

TT 98(40%) 26(35%) ref

TC 118(48%) 38(51%) 1.214 0.502

CC 32(13%) 10(14%) 1.178 0.700



TGFB1

c.74

G>C

GG 207(83%) 57(77%) ref

GC 41(17%) 17(23%) 1.506 0.208

CC 0(0%) 0(0%)



TGFB1

g.10780

T>G

TT 80(33%) 28(39%) ref

TG 124(51%) 33(46%) 0.760 0.352

GG 40(16%) 10(14%) 0.714 0.419



26

Associatie tussen de beschouwde SNPs en het optreden van late GI incontinentie



#: multivariate analyse gecorrigeerd voor roken, RP, R40, R60, S60 en CTVtargetVol

G0 G1+ OR P OR# P#

XRCC3

c.722

C>T

CC 112(43%) 25(45%) Ref

CT 115(44%) 21(38%) 0.818 0.536

TT 32(12%) 10(18%) 1.400 0.428



Ku70

c.-1310

C>G

CC 95(36%) 24(43%) Ref

CG 133(50%) 25(45%) 0.744 0.349

GG 37(14%) 7(12%) 0.749 0.539



ITGB2

c.819

G>A

GG 121(57%) 26(57%) ref

GA 82(39%) 18(39%) 0.916 0.792

AA 8(4%) 2(4%) 1.043 0.959



TGFB1

c.-509

C>T

CC 130(49%) 31(55%) ref

CT 112(43%) 20(36%) 0.749 0.358

TT 21(8%) 5(9%) 0.998 0.998



TGFB1

c. -800

G>A

GG 220(84%) 41(73%) Ref

GA 41(16%) 13(23%) 1.701 0.141 0.878 0.767

AA 2(0.7%) 2(4%) 5.366 0.098~ 7.159 0.061~

Dominant(GA+AA vs GG) 1.872 0.069~ 2.268 0.045*

Recessief(AA vs GG+GA) 4.833 0.119 6.164 0.081~

TGFB1

c.29

T>C

TT 99(37%) 25(45%) ref

TC 129(49%) 26(46%) 0.798 0.468

CC 37(14%) 5(9%) 0.535 0.235



TGFB1

c.74

G>C

GG 216(82%) 47(84%) Ref

GC 49(18%) 9(16%) 0.844 0.669

CC 0(0%) 0(0%)



TGFB1

g.10780

T>G

TT 85(33%) 23(43%) ref

TG 136(52%) 20(37%) 0.543 0.069~ 0.999 0.998

GG 39(15%) 11(20%) 1.042 0.920

Dominant (TT vs TG+GG) 0.655 0.165 0.701 0.288


27

Associatie tussen de beschouwde SNPs en het optreden van late GU hematurie



#: multivariate analyse gecorrigeerd voor abdominale chirurgie, TUR en radioprscriptie


XRCC3

c.722

C>T

CC 122(42%) 15(63%) Ref

CT 129(44%) 7(29%) 0.441 0.085~ 0.376 0.062~

TT 40(14%) 2(8%) 0.407 0.245

Dominant (CC vs CT+TT) 0.433 0.056~ 0.391 0.048*


Ku70

c.-1310

C>G

CC 109(37%) 10(40%) Ref

CG 145(49%) 13(52%) 0.977 0.958

GG 42(14%) 2(8%) 0.519 0.410



ITGB2

c.819

G>A

GG 137(58%) 13(54%) ref

GA 89(38%) 11(46%) 1.303 0.540

AA 10(4%) 0(0%) 0.000 0.999



TGFB1

c.-509

C>T

CC 146(50%) 15(60%) Ref

CT 124(42%) 8(32%) 0.628 0.306

TT 24(8%) 2(8%) 0.811 0.790



TGFB1

c. -800

G>A

GG 243(83%) 18(72%) Ref

GA 48(16%) 6(24%) 1.687 0.293

AA 3(1%) 1(4%) 4.500 0.203 3.825 0.294

Dominant(GA+AA vs GG) 1.853 0.191 1.871 0.214

Recessief(AA vs GG+GA) 4.042 0.234 3.434 0.332

TGFB1

c.29

T>C

TT 112(38%) 12(48%) Ref

TC 144(49%) 11(44%) 0.713 0.438

CC 40(14%) 2(8%) 0.467 0.332



TGFB1

c.74

G>C

GG 244(82%) 19(76%) ref

GC 52(18%) 6(24%) 1.482 0.425

CC 0(0%) 0(0%)



TGFB1

g.10780

T>G

TT 95(33%) 13(50%) Ref

TG 148(51%) 8(33%) 0.395 0.047* 0.425 0.095~

GG 46(16%) 4(15%) 0.635 0.449

Dominant (TT vs TG+GG) 0.452 0.058~ 0.494 0.122


28

Associatie tussen de beschouwde SNPs en het optreden van late GU nocturie



#: multivariate analyse gecorrigeer voor adjuvante hormoontherapie, RP, radioprescriptie, CTVtargetMax,

CTVtargetVol en CTVtarget50.

G0 G1+ OR P OR# P#

XRCC3

c.722

C>T

CC 101(44%) 36(42%) Ref

CT 101(44%) 35(41%) 0.972 0.919

TT 27(12%) 15(17%) 1.559 0.238



Ku70

c.-1310

C>G

CC 87(37%) 32(36%) ref

CG 113(48%) 45(51%) 1.083 0.770

GG 33(14%) 11(13%) 0.906 0.808



ITGB2

c.819

G>A

GG 106(56%) 44(71%) ref

GA 76(40%) 24(34%) 0.761 0.354

AA 7(4%) 3(4%) 1.032 0.964



TGFB1

c.-509

C>T

CC 119(51%) 42(48%) ref

CT 95(41%) 37(43%) 1.104 0.709

TT 18(8%) 8(9%) 1.259 0.617



TGFB1

c. -800

G>A

GG 189(81%) 72(83%) ref

GA 41(18%) 13(15%) 0.832 0.597

AA 2(1%) 2(2%) 2.625 0.339 1.478 0.705



TGFB1

c.29

T>C

TT 96(41%) 28(32%) Ref

TC 108(46%) 47(54%) 1.492 0.148 1.397 0.305

CC 30(13%) 12(14%) 1.371 0.434

Dominant (TC+CC vs TT) 1.466 0.149 1.350 0.333


TGFB1

c.74

G>C

GG 195(83%) 68(78%) ref

GC 39(17%) 19(22%) 1.397 0.286

CC 0 (0%) 0 (0%)



TGFB1

g.10780

T>G

TT 77(34%) 31(36%) Ref

TG 115(50%) 41(48%) 0.886 0.664

GG 37(16%) 13(15%) 0.873 0.724



29

Associatie tussen de beschouwde SNPs en het optreden van late GU urgentie



#: multivariate analyse gecorrigeerd voor adjuvante hormoontherapie

G0 G1+ OR P OR# P#

XRCC3

c.722

C>T

CC 94(42%) 43(48%) ref

CT 97(43%) 39(43%) 0.879 0.625

TT 34(15%) 8(9%) 0.514 0.126



Ku70

c.-1310

C>G

CC 92(40%) 27(30%) ref

CG 105(46%) 53(58%) 1.720 0.050* 1.582 0.109

GG 33(14%) 11(12%) 1.136 0.757

Dominant(CC vs CG+GG) 1.580 0.085~ 1.465 0.167


ITGB2

c.819

G>A

GG 116(61%) 34(48%) ref

GA 66(35%) 34(48%) 1.758 0.050* 1.850 0.035*

AA 7(4%) 3(4%) 1.462 0.596 1.909 0.386

Dominant(GG vs GA+AA) 1.729 0.051~ 1.855 0.031*


TGFB1

c.-509

C>T

CC 112(49%) 49(54%) ref

CT 99(43%) 33(36%) 0.762 0.303

TT 17(7%) 9(10%) 1.210 0.669



TGFB1

c. -800

G>A

GG 185(81%) 76(84%) ref

GA 41(18%) 13(14%) 0.772 0.454

AA 2(1%) 2(2%) 2.434 0.378 3.886 0.272



TGFB1

c.29

T>C

TT 86(37%) 38(42%) ref

TC 116(50%) 39(43%) 0.761 0.309

CC 28(12%) 14(15%) 1.132 0.746



TGFB1

c.74

G>C

GG 191(83%) 72(79%) ref

GC 39(17%) 19(21%) 1.292 0.411

CC 0(0%) 0(0%)



TGFB1

g.10780

T>G

TT 75(33%) 33(38%) ref

TG 118(52%) 38(43%) 0.732 0.265

GG 33(15%) 17(19%) 1.171 0.665



30

BIJLAGE J: Associatie tussen patiënt- en dosisgerelateerde factoren voor late complicaties

Associatie tussen patiëntgerelateerde factoren en het optreden van late GI complicaties.

Gastro frequentie Gastro mucusverlies Gastro urgentie Gastro incontinentie

G0 G1 + OR P G0 G1+ OR P G0 G1+ OR P G0 G1+ OR P

Leeftijd 65.9# 66.2# 0.623 65.9

# 66.1

# 0.711 66.1

# 65.4

# 0.548 65.7

# 67.0

# 0.218

Roken 0

1

2

62

153

46

23

27

9

0.056~ 65

148

51

21

34

5

0.067~ 65

140

45

21

43

11

0.788 66

150

52

20

33

3

0.022*


1

118

143

25

34

1.12

0.692 110

153

33

27

0.59

0.064~ 109

140

35

40

0.89

0.659 117

151

27

29

0.83

0.532

Hemorroïden 0

1

199

61

45

14

1.01

0.965 202

61

46

14

1.01

0.982 196

53

53

22

1.54

0.147 208

59

40

16

1.41

0.297

Adjuvante

hormoontherapie

0

1

100

156

22

36

1.05

0.873 104

153

20

40

1.36

0.308 94

149

30

45

0.95

0.838 106

156

18

38

1.43

0.247

pN 0

1

160

97

34

24

1.16

0.607 152

107

44

16

0.52

0.036* 148

98

48

26

0.82

0.467 162

102

34

21

0.98

0.950

Diabetes 0

1

229

31

51

8

1.16

0.729 229

34

54

6

0.75

0.534 222

27

62

13

1.72

0.134 235

32

48

8

1.22

0.635

IBD 0

1

238

5

57

1

0.84

0.870 244

5

54

1

0.90

0.927 232

4

67

2

1.73

0.527 247

5

52

1

0.95

0.963

Radicale prostatectomie 0

1

182

79

37

22

1.37

0.295 178

86

45

15

0.69

0.253 166

84

57

18

0.63

0.116 178

90

44

12

0.54

0.075~

Statines 0

1

135

53

39

10

0.65

0.272 138

54

37

10

0.69

0.342 131

51

44

13

0.76

0.438 147

54

28

10

0.97

0.944

*: p <0.05 is statistisch significant ~ : trend tot significantie #: gemiddelde controle vs case groep

31

Associatie tussen patiëntgerelateerde factoren en het optreden van late GU complicaties.

Genihematurie Geninocturie Geni-urgentie

G0-1 G2+ OR P G0 G1+ OR P G0 G1+ OR P

Leeftijd 66.0# 65.2

# 0.587 65.7

# 66.6

# 0.297 65.9

# 66.1

# 0.744

Roken 0

1

2

78

168

53

8

15

2

0.438 67

129

39

19

53

16

0.456 61

135

38

25

48

17

0.756


1

137

162

7

18

2.17

0.085~ 99

136

44

44

0.73

0.205 107

126

37

54

1.24

0.392

Hemorroïden 0

1

231

67

17

8

1.62

0.279 175

59

72

16

0.66

0.183 181

52

67

23

1.19

0.537

TUR 0

1

256

39

13

11

5.55

<0.001* 196

36

72

14

1.06

0.868 197

33

72

17

1.41

0.295

Adjuvante

hormoontherapie

0

1

114

179

10

15

0.96

0.914 106

124

18

69

3.28

<0.001* 97

131

27

63

1.73

0.039*

pN 0

1

182

112

14

11

1.28

0.560 138

93

58

29

0.74

0.257 143

86

53

37

1.66

0.557

Diabetes 0

1

263

35

20

5

1.88

0.229 209

25

73

15

1.72

0.123 205

28

78

12

1.13

0.747

IBD 0

1

276

5

23

1

2.40

0.966 214

5

84

1

0.51

0.870 216

2

83

4

5.20

0.102

Radicale prostatectomie 0

1

206

93

16

9

1.25

149

86

73

15

0.36 0.001* 157

77

65

25

0.78

0.373

Statines 0

1

161

59

14

5

0.97

0.962 123

50

52

14

0.66

0.230 126

45

49

19

1.09

0.798

*: p <0.05 is statistisch significant ~ : trend tot significantie #: gemiddelde controle vs case groep

32

Associatie tussen dosisgerelateerde factoren en optreden van late GI en GU complicaties.

Gastro frequentie Gastromucusverlies Gastro-urgentie Gastro-

incontinentie

Geni hematurie Geninocturie Geni –

urgentie

P G0/G1+# P G0/G2+# P G0/G1+# P G0/G1+# P G0-1/G2+# P G0/G1+# P G0/G1+#

RectumVol40 (cc)

RectumVol60 (cc)

RectumMax (Gy)

SigmoïdVol40 (cc)

SigmoïdVol60 (cc)

SigmoïdMax (Gy)

CTVtargetMax (Gy)

0.680

0.999

0.419

0.605

0.846

0.802

0.440

0.039*

0.001*

0.059~

0.768

0.192

0.988

0.282

60.6-65.7

35.4-41.3

74.8-74.5

0.006 *

<0.001*

0.272

0.219

0.045*

0.227

0.462

60.1-66.2

35-41

2.3-3.4

0.011*

<0.001*

0.566

0.254

0.014*

0.202

0.341

60.5-67.0

35.2-42.6

2.4-3.5

0.391

0.001*

80.5-81.6

0.098

CTVtargetVol (cc) 0.699 0.088~ 45.3-53.6 0.025* 44.6-54.0 0.003* 44.8-56.7 0.802 0.006* 44.8-52.5 0.391

CTVtarget50 (Gy) 0.656 0.002* 77.4-78.2 0.274

BladderMax (Gy)

Radioprescriptie

0.841

0.877

0.754

0.979

0.287

0.011*

0.065~

0.025*

78.6-77.0 0.158

0.609

*:p <0.05 is statistisch significant ~: trend tot significantie #: gemiddelde controle vs case groep

33

Boxplotten van de associaties tussen dosisparameters en optreden van late GI en GU complicaties

Radiogenomics voor predictie van complicaties bij

Documents

Transcript of Radiogenomics voor predictie van complicaties bij