Het effect van de substraatconcentratie en de temperatuur op de snelheid waarmee H2O2 wordt afgebroken tot O2 en H2O.

Inhoudsopgave

Introductie:Onderzoeksvraag:Inleiding:

Methode:

Variabelen:Materiaal:Methode:

Controlebehandeling:Resultaten:Kwantitatieve meetgegevens:

Berekeningen en statistische analyses:Discussie:

Conclusie:Evaluatie van de methode

Bijlage A.

Introductie:

Onderzoeksvraag:In dit practicum gaan we onderzoek doen naar de afhankelijkheid van de reactiesnelheid van

het katalase-enzym. De vraag wat het effect van de substraatconcentratie en de temperatuur op de snelheid waarmee H2O2 wordt afgebroken tot O2 en H2O is, zal hierbij beantwoord worden.

Inleiding:Katalase is een enzym dat zich bevindt in de peroxisomen1 van eukaryote cellen, plantencellen en komt in bijna alle aerobe2 cellen voor. Het beschermt de cel tegen de giftige effecten van waterstofperoxide (H2O2), een stof die ontstaat als bijproduct in de celstofwisseling. Katalase katalyseert de exotherme reactie waarbij H2O2 wordt afgebroken tot zuurstof en water. 2 H2O2 (aq) -> O2 (g) + 2 H2O (l)

Bij deze proef word een eenvoudige maar accurate methode gehanteerd voor het meten van de reactiesnelheid waarbij gebruikt wordt gemaakt van het floating disc assay. Hierbij gebruikt men filtreerpapier dat een hoeveelheid van het enzym extract heeft geabsorbeerd. Het filtreerpapier wordt in de waterstofperoxide-oplossing gelegd waarna deze naar de bodem zal zinken om vervolgens weer omhoog gebracht te worden door het zuurstofgas dat ontstaat bij de reactie. De tijd die tussen de aanraking van het filtreerpapier met het enzym extract met de waterstofperoxide-oplossing en het aanraken van het oppervlak na weer van de bodem omhoog te zijn gekomen wordt gemeten. Aan de hand van dit gegeven in combinatie met de concentratie stof kan de reactiesnelheid van de katalase worden berekend.

Hypothese:Wanneer de substraatconcentratie toeneemt, zal de snelheid waarmee H2O2 wordtomgezet tot O2 en H2O toenemen. Dit wordt verwacht omdat de toename van de substraatconcentratie resulteert in meer botsingen tussen het enzym katalase en het substraat. Doordat er dus meer effectieve botsingen zijn tussen het enzym en het substraat zal de katalase de reactie waarbij H2O2 wordt afgebroken tot zuurstof en water in grotere mate katalyseren. Hierdoor zal de reactiesnelheid toenemen en zal er dus in verhouding meer dizuurstof ontstaan. Als gevolg van deze gasvorming zal er bij de proef met behulp van de floating disc assay waargenomen worden dat er geldt; hoe hoger de substraatconcentratie, hoe meer effectieve botsingen tussen het substraat en hetenzym katalase. Hoe hoger de reactiesnelheid, hoe meer molair H2O en O2 er per seconde wordt omgezet en dus zal het filtreerpapier sneller omhoog worden gebracht door het gas.

Verder stellen wij dat de temperatuur tot een zeker niveau een positief effect zal hebben op de werking van het enzym. Dit zou juist moeten zijn omdat de temperatuur zowel een negatief als een positief effect op de katalase kan hebben. Zo resulteert een koude temperatuur in minder botsingen tussen het enzym en het substraat doordat de bewegings energie afneemt en hiermee dus ook de hoeveelheid omgezet substraat per tijdseenheid en de reactiesnelheid en de mate waarin H202 word omgezet. Een toename in temperatuur resulteert in de toename van bewegingsenergie waardoor er meer botsingen plaatsvinden

1 Een peroxisoom (ook: peroxysoom) is een celorganel in een eukaryote cel. Een enkel membraan sluit het af van het cytosol (interne vloeistof van een cel)2 Een organisme is aeroob wanneer het alleen in een zuurstofrijk milieu kan gedijen, omdat het zuurstof gebruikt ten behoeve van zijn metabolisme. Dit in tegenstelling tot anaerobe organismen, die voor hun stofwisseling geen zuurstof nodig hebben.

en meer effectieve botsingen tussen het enzym en het substraat ontstaan waardoor de hoeveelheid substraat die per tijdseenheid wordt omgezet toeneemt met een stijging in reactiesnelheid tot gevolg. Verder zou er bij een te hoge temperatuur denaturatie optreden waarbij de ruimtelijke structuur van het enzym onherstelbaar veranderd wordt met het gevolg dat het katalase enzym zijn functie niet meer normaal kan uitvoeren. Hierdoor verwachten wij dat de grafiek van de stijgtijd tegenover de temperatuur een top zal hebben.

Methode:

Variabelen:Proef 1

Onafhankelijke variabele:

● samenstelling van de waterstofperoxide-oplossing

Afhankelijke variabele:

● enzymactiviteit

Constante variabelen:

● temperatuur● substraatconcentratie

Proef 2

Onafhankelijke variabele:

● temperatuur

Afhankelijke variabele:

● enzymactiviteit

Constante variabelen:

● substraatconcentratie● enzymconcentratie

Materiaal: ● pincet

● 12 reageerbuizen met reageerbuisrek

● 22 schijfjes filtreerpapier

● perforator

● pincet

● aquadest

● bekerglas 150 mL

● markeerstift

● 100% katalase-oplossing

● 3% H2O2 -oplossing

● keukenpapier

● stopwatch/smartphone

Methode: Proef 1Het effect van de substraatconcentratie op de snelheid waarmee H2O2 wordt afgebroken tot O2 en H2O:

1. Neem 6 reageerbuizen uit het reageerbuisrek en schrijf hier met de markeerstift op: 3%, 1,5%, 0,75%, 0,375%, 0,188% en 0%.

2. Bereid de H2O2-oplossingen in de bijbehorende reageerbuizen volgens het schema hieronder.

Totaal volume (mL) Concentratie (%) mL H2O2-oplossing mL aquadest

10 3,000 10 0

10 1,500 5 5

10 0,750 2,5 7,5

10 0,375 1,25 8,75

10 0,188 0,625 9,375

10 0 0 10

3. Pak een andere reageerbuis en vul deze met 20 mL 100% katalase-oplossing. Vul het bekerglas van 150 mL met water en ijs en zet hier deze reageerbuis in. Je vult deze met ijs omdat zoveel mogelijk enzymen dan intact blijven.

4. Gebruik je perforator om kleine schijfjes filtreerpapier uit je filtreerpapier te perforeren.

5. Pak met de pincet een schijfje filtreerpapier en dompel deze ongeveer 5 seconde in de 100% katalase-oplossing.

6. Haal het schijfje uit de oplossing en dep deze ongeveer 5 seconde droog met keukenpapier. Zorg ervoor dat de uiteinden van de pincet ook droog zijn. Als dit niet gebeurt, zal dit invloed hebben op de uiteindelijke resultaten.

7. Plaats nu het schijfje met behulp van de pincet in de reageerbuis met de 3% H2O2-oplossing. Pak je smartphone erbij en zodra het schijfje het oppervlak van de oplossing raakt, start je de timer. Het schijfje zakt nu naar de bodem.

8. Noteer de tijd die verstrijkt totdat het schijfje het oppervlak van de 3% H2O2-oplossing weer raakt. Doe de meting opnieuw indien het schijfje aan de randen van de reageerbuis blijft hangen. Het schijfje zal anders of niet omhoog

komen of pas na een lange tijd het oppervlak bereiken.9. Doe deze meting twee keer opnieuw. Gebruik telkens weer een nieuw schijfje

filtreerpapier.10. Herhaal stap 1 tot en met 9 voor de andere H2O2-concentraties (1,5%, 0,75%,

0.375%, 0,188% en 0%). Vergeet niet voor elke meting een nieuw schijfje filtreerpapier te nemen.

Proef 2Het effect van de temperatuur op de snelheid waarmee H2O2 wordt afgebroken tot O2 en H2O:

1. Neem vijf reageerbuizen uit het reageerbuisrek en label deze door middel van een markeerstift met 0 0C, 20 0C, 40 0C, 60 0C en 100 0C.

2. Vul nu elke buis met 15 mL 100% katalase-oplossing.3. Plaats elke reageerbuis in het bijbehorende waterbad en incubeer ze 5 minuten.4. Neem nu 2 andere reageerbuizen en vul beiden met 10 mL 3% H2O2-oplossing.5. Incubeer één bekerglas minimaal 5 minuten bij een temperatuur van 0 0C en

incubeer het andere bekerglas minimaal 5 minuten bij een temperatuur van ongeveer 20 0C (kamertemperatuur). Zet de overige 2 reageerbuizen in het bekerglas met de juiste temperatuur. De H2O2-oplossingen worden niet verwarmd. H2O2 is immers een instabiele stof die bij verwarming ook zonder katalase afgebroken wordt.

6. Zorg ervoor dat je weer genoeg schijfjes filtreerpapier hebt door met een perforator in het filtreerpapier te perforeren.

7. Pak met de pincet een schijfje filtreerpapier en dompel deze ongeveer 5 seconde in de 100% katalase-oplossing die bij 0 0C is geïncubeerd.

8. Haal het schijfje uit de oplossing en dep deze ongeveer 5 seconde droog met keukenpapier. Zorg ervoor dat de uiteinden van de pincet ook droog zijn.

9. Plaats nu het schijfje met behulp van de pincet in de reageerbuis met de 3% H2O2-oplossing die bij 0 0C is geïncubeerd. Pak je smartphone erbij en zodra het schijfje het oppervlak van de oplossing raakt, start je de timer. Het schijfje zakt nu naar de bodem.

10. Noteer de tijd die verstrijkt totdat het schijfje het oppervlak van de 3% H2O2-oplossing weer raakt. Doe de meting opnieuw indien het schijfje aan de randen van de reageerbuis blijft hangen.

11. Doe deze meting twee keer opnieuw. Gebruik telkens weer een nieuw schijfje filtreerpapier.

12. Herhaal stap 1 tot en met 11 voor de andere temperaturen (20 0C, 40 0C, 60 0C en 100 0C). Gebruik bij deze metingen de 3% H2O2-oplossing die bij 20 0C geïncubeerd is. Vergeet niet voor elke meting een nieuw schijfje filtreerpapier te nemen.

Controlebehandeling:

Proef 1We hebben een reageerbuis gevuld met 0 mL H2O2-oplossing en 10 mL aquadest. Als het schijfje filtreerpapier eenmaal in het water zit, dan zou hij niet meer terug aan het oppervlak moeten komen. De enzymoplossing heeft immers geen substraat om om te zetten. Het schijfje is uiteindelijk ook niet meer naar boven gekomen en is op de bodem blijven liggen. Dit is een negatieve controle.

Resultaten:

Kwantitatieve meetgegevens:*Zie de bijlage A. voor de tabel met meetgegevens, de gemiddelde stijgtijd, de spreiding en de standaarddeviatie.

Berekeningen en statistische analyses:A. Gemiddelde stijgtijd uitzet tegen de substraatconcentratie.

In bovenstaande grafiek is te zien hoe de stijgtijd en hiermee dus de reactiesnelheid afneemt naarmate de concentratie H2O2 toeneemt.

B. Gemiddelde stijgtijd uitzet tegen de temperatuur.

In bovenstaande grafiek is te zien hoe de temperatuur de stijgtijd en hiermee de reactiesnelhied beïnvloed. Er is te zien dat de stijgtijd toeneemt naarmate de temperatuur warmer wordt en na een zekere tijd overgaat in een dalende lijn.

Discussie:

Conclusie: Uit het practicum kunnen we dus concluderen dat de snelheid waarmee H2O2 wordt afgebroken tot O2 en H2O ook toeneemt, naarmate de substraatconcentratie toeneemt. Bovendien neemt de stijgtijd van het schijfje filtreerpapier toe, naarmate de temperatuur toeneemt tot ongeveer 83 0C. Bij ongeveer 83 0C heeft het enzym zijn maximumtemperatuur bereikt waardoor na de stijging van de temperatuur de stijgtijd afneemt.

Evaluatie van de methodeDoordat we meetgegevens van alle klassen hebben gebruikt zijn de resultaten betrouwbaarder. Zo worden fouten die gemaakt worden tijdens het practicum verkleint doordat het de invloed op het eindresultaaten verkleint. De spreiding is alleen erg groot omdat de andere klassen een andere enzymoplossing kreeg.

Het practicum was verder goed uitvoerbaar en duidelijk. Doordat we gebruik maakten van extra stopwatches verliep het practicum erg vlot.

Literatuurlijst:-bestand: Peroxisome__3__21593__1_blue_red_green.jpg - The Human Proteinatlas, ingezien 24 september 2017.http://www.proteinatlas.org/images_dictionary/

-bestand: 3e4w.png - Orientations of Proteins in Membranes (OPM) database, ingezien 11 oktober 2017.http://opm.phar.umich.edu/about.php

-informatie: Peroxisoom - Wikipedia, the Free Encyclopedia, ingezien 10 oktober 2017.

https://nl.wikipedia.org/wiki/Peroxisoom

-informatie: Aeroob - Wikipedia, the Free Encyclopedia, ingezien 10 oktober 2017.

https://nl.wikipedia.org/wiki/Aeroob

Bijlage A.