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( l!J } "PEDRO RUIZ GA~LO" (· ~ ~ <4/lfsAvr¿o~~ FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS u~"

-DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE MICROBIOLOGÍA

Y PARASITOLOGÍA

Pseudomonas spp. aisladas de la rizósfera de Lycopersicon esculentum Mili. "tomate" y su potencial como promotoras del crecimiento de plantas en Lambayeque, 2012

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE LICENCIADO EN

BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA • PARASITOLOGÍA

PRESENTADO POR:

Br. león Jara Carlos lván

LAMBAYEQUE - PERÚ 2014 111...-.-------------- . > ~..... ~ ••••• ..

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE MICROBIOLOGÍA

Y PARASITOLOGÍA

Pseudomonas spp. aisladas de la rizósfera de

Lycopersicon esculentum M ill. "tomate" y su potencial como

promotoras del crecimiento de plantas en Lambayeque, 2012

TESIS

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE LICENCIADO EN

BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA- PARASITOLOGÍA

PRESENTADO POR:

Br. León Jara Carlos lván

LAMBAYEQUE,PERÚ

2014

Pseudomonas spp. aisladas de la rizósfera de

Lycopersicon esculentum M ill. "tomate" y su potencial como

promotoras del crecimiento de plantas en Lambayeque, 2012

TESIS

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE LICENCIADO EN BIOLOGÍA

MICROBIOLOGÍA -PARASITOLOGÍA

PRESENTADO POR:

Br. León Jara Carlos lván

APROBADO POR:

Dr. César Vargas Rosado

PRESIDENTE

Dra. Gianina Llontop Barandiaran

SECRETARIA

Dr. Francisco Regalado Diaz

VOCAL

Dra. Carmen Carreña Farfán

PATROCINADORA

LAMBAYEQUE,PERÚ

2014

l. INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 1

11. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS ..................................................... 3

111. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................... 7

3.1 Materiales ....................................................................................................... 7

3.1.1 Material biológico ....................................................................................... 7

3.1.2 Población y muestra de estudio ............................................................. 7

3.2 Métodos .......................................................................................................... 7

3.2.2 Variables en estudio ................................................................................. 7

3.2.3 Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis ..................... 8

3.2.4 Lugar de muestreo .................................................................................... 8

/3.2.5 Obtención de muestras de rizósfera ...................................................... 8

3.2.6 Aislamiento de bacterias no fermentadoras de lactosa .................. 12

3.2.7 Identificación de Burkholderia y Pseudomonas spp ........................ 12

3.2.8 Mantenimiento de las bacterias .......................................................... 16

J 3.2.9 Producción de enzimas ........................................................................ 16

3.2.1 O Detección y cuantificación de ácido indol acético (AlA) producido in vitro .................................................................................. 16

3.2.11 Detección y cuantificación de nitrógeno fijado in vitro ..................... 17

3.2.12 Detección y cuantificación de fósforo solubilizado in vitro .............. 17

3.2.12 Prueba de antagonismo de hongos causantes de la chupadera fungosa por cepas nativas de Burkholderia y Pseudomonas spp ................................................................................. 18

3.2.14 Se lección de Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas ............... 23

3.2.15 Efecto en el poder germinativo de tomate ........................................ 23

/ 3.3 Análisis estadístico de los datos .............................................................. 29

rv. RESULTADOS ........................................................................................... 30

4.1 Burkholderia y Pseudomonas spp. aisladas e identificadas ............... 30

4.2 Potencial biológico de Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas .... 30

4.3 Porcentaje de germinación y poder germi nativo ................................... 50

4.4 Especies de Burkholderia y Pseudomonas promotoras del crecimiento de plantas .................................................................................................... 50

V. DISCUSIÓN · ................................................................................................ 51

VI. CONCLUSIONES ....................................................................................... 64

VIl. RECOMENDACIONES ..................... : ....................................................... 65

VIII. RESUMEN ................................................................................................... 66

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ........................................................ 67

X. ANEXOS ...................................................................................................... 75

Tabla 1.

Tabla2.

Tabla3.

Tabla4.

TablaS.

Tabla&.

Tabla7.

Índice de tablas

Análisis físico - qU1m1co de suelos agrícolas cultivados con Lycopersicon escu/entum Mll.''tomate" en Reque, 2012 ................ 13

Halo (cm) de hidrólisis formado por Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas en agar leche durante 48 horas .. . . . . . . . 34

Burkho/deria y Pseudomonas spp. nativas que desarrollaron biomasa en agar quitina durante 72 horas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

Ácido lndolacético (ppm) producido por Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas en caldo tripticasa soya durante 72 horas............................................................................ 40

Nitrógeno fijado como amonio (ppm) por Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas en caldo extracto de suelo durante 72 horas............................................................................ 43

Fósforo solubilizado (ppm) por Burkho/deria y Pseudomonas spp. nativas en caldo SRSM durante 96 horas . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

Radio (cm) de la colonia de Fusarium sp. y porcentaje de inhibición del crecimiento por efecto de Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas ............................................... ~.... 49

Tabla 8. Radio (cm) de la colonia de Rhizoctonia solani y porcentaje de inhibición del crecimiento por efecto de Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas................................................... 51

Tabla 9. Características de ocho cepas nativas de Burkholderia y Pseudomonas spp. seleccionadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

Tabla 10. Porcentaje(%) de germinación y poder germinativo de semillas de semillas de Lycopersicon escu/entum Mili. "tomate" cv. 'Río Grande por efecto de Burkholderia y Pseudomonas spp .

. nativas durante 7 días . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 53

Tabla 11. Características diferenciales de Pseudomonas aeruginosa y P. pulida ................................................................... 55

Tabla 12. Características de Pseudomonas aeruginosa y P. pulida nativas promotoras del crecimiento de plantas . . . . . . . . . . . . . . . 56

Índice de figuras

Figura 1. Ubicación geográfica de la zona de muestreo en el distrito de Reque, provincia de Chiclayo, región Lambayeque. Febrero, 2012 (https://maps.google.com.pe/).................................................. 9

Figura 2. Cultivo de Lycopersicon esculentum Mili. "tomate" en floración.............................................................................. 10

Figura 3. Extracción de suelo rizosférico de Lycopersicon esculentum Mil. "tomate" en Reque, 2012 ........ ...... .......... ... ...... ...... ...... ... ....... 10

Figura 4. M.iestra de suelo rizosférico de Lycopersicon escu/entum Mil. "tomate"... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

Figura 5. Diluciones de suelo rizosférico en solución salina esterilizada.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 14

Figura 6. Colonias de bacterias no fermentadoras de lactosa en agar l\llac Conkey.... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... 14

Figura 7. Cultivo de bacterias no fermentadoras de lactosa en agar tripticasa soya................................................................................... 15

Figura 8. Burkho/deria y Pseudomonas spp. nativas cultivadas en agar tripticasa soya para la caracterización macroscópica de las colonias............................................................................... 15

Figura 9. Crecimiento de Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas en caldo SRSM................................................................................ 19

Figura 10. Raiz de Lycopersicon esculentum Mil. ''tomate" con síntomas de pudrición.............................................................................. 19

Figura 11. Desinfección de tejido vegetal con hipoclorito de sodio.................. 21

Figura 12. Colonias de hongos filamentosos desarrollados en agar papa dextrosa más cloranfenicol....................................................... 21

Figura 13. Cultivo puro de hongo fitopatógeno aislado de raíces de Lycopersicon esculentum Mil. ''tomate"... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...... ........ 22

Figura 14. Crecimiento de Fusarium sp. y Pseudomonas sp. en la prueba de antagonismo......................................................................... 22

Figura 15. Burkho/deria y Pseudomonas nativas seleccionadas.................. 24

Figura 16. Semillas de Lycopersicon esculentum Mili. "tomate" cv. 'Río Grande' ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ...... ... ...... ... ... ...... ... ...... 24

Figura 17. Ensayo para determinar el efecto de ocho bacterias nativas de Burkholderia y Pseudomonas spp. en el poder germinativo de Lycopersicon escu/entum Mil. "tomate" cv. 'Río Grande'.............. 25

Figura 18. Cultivo de Burkho/deria y Pseudomonas spp. en caldo nutritivo....... 27

Figura 19. Semillas de tomate cv. 'Río Grande' inoculadas con Burkholderia y Pseudomonas spp.................. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 27

Figura 20. Ensayo de germinación de semillas de tomate cv. 'Río Grande' inoculadas con Burkholderia y Pseudomonas spp......... . . . . . . . . . . . . . . 28

Figura 21. Frecuencia de aislamiento de bacterias no fermentadoras de lactosa en muestras de suelo rizosférico de Lycopersicon escu/entum Mil. "tomate", en Lambayeque, 2013.... ... 31

Figura 22. Frecuencia de aislamiento de Burkholderia y Pseudomonas en bacterias no fermentadoras de lactosa, oxidasa positivas.............. 31

Figura 23. Porcentaje (%) de Burkholderia spp. productoras de proteasas en Lambayeque, 2013........ ...... ...... ... ... ...... ... ............ .................. 32

Figura 24. Porcentaje(%) de Pseudomonas spp. productoras de proteasas en Lambayeque, 2013... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

Figura 25. Halo de hidrólisis formado por Burkholderia spp. nativas en agar leche ................................................................................... 33

Figura 26. Porcentaje (%) de Burkho/deria spp. nativas que desarrolló abundante biomasa en agar quitina en Lambayeque, 2013... ... ... ... 35

Figura 27. Porcentaje (%) de Pseudomonas spp. nativas que desarrolló abundante biomasa en agar quitina en Lambayeque, 2013...... ....... 35

Figura 28. Biomasa formada por Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas en agar quitina... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

Figura 29. Coloración grosella observada en la cuantificación de ácido indol acético por la reacción calorimétrica de Salkowski........................... 39

Figura 30. Porcentaje (%) de Burkholderia spp. fijadoras de nitrógeno en Lambayeque, 2013... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ...... ... ...... ..... ...... ... 41

Figura 31. Porcentaje (%) de Pseudomonas spp. fijadoras de nitrógeno en Lambayeque, 2013....................... ...... ...... ... ........................... 41

Figura 32. Película blanquecina bajo la superficie del medio Nfb cultivado con Pseudomonas sp. fijadora de nitrógeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . 42

Figura 33. Viraje del indicador al azul en el medio Nfb cultivado con Pseudomonas sp. fijadora de nitrógeno . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

Figura 34. Porcentaje (%) de Burkholderia spp. solubilizadoras de fósforo, Lambayeque, 2013... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ........ ... ... .......... ... .. 44

Figura 35. Porcentaje (%) de Pseudomonas spp. solubilizadoras de fósforo, Lambayeque, 2013... ... ... ... ... .. . ... ... ... .. ..... ... .. .... ... ... ...... ... ....... 44

Figura 36. Viraje del indicador al amarillo y halos translúcidos alrededor de colonias de Pseudomonas spp. en agar SRSM ..... ...................... 45

Figura 37. Coloración observada en la cuantificación de fósforo soluble por el método calorimétrico del molibdato...... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 45

Figura 38. Observación microscópica (400x) de microconidias y macroconidias de Fusarium sp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Figura 39. Observación microscópica (400x) de hitas de Rhizoctonia solani..... 47

Figura 40. Antagonismo de Burkholderia sp. CT13 a Fusarium sp. (a); control (b)... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...... . . . .. . . . . . . .. 48

Figura 41. Antagonismo de Pseudomonas sp. CT7 a Rhizoctonia solani (a); control (b) . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

Figura 42. Semillas de Lycopersicon escu/entum Mil. ''tomate" germinadas por efecto de Pseudomonas sp. nativa (derecha) y agua destilada (izquierda) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 54

Figura 43. Plántulas normales de Lycopersicon escu/entum Mili. ''tomate", 7 días después de la inoculación de Burkholderia CT30 . . . . . . . . . . . . . . . . 54

Figura 44. Caparazón molido de Astacus serratus "camarón"...................... 80

Figura 45. Caparazón molido en 100 ml de H3P04 al85 %.... ... ... ..... ... ... ... ... 80

Figura 46. Filtración de suspensión obtenida con agua destilada... . . . . . . . . . .. . . . . . 81

Figura 47. Sedimento obtenido luego de la centrifugación...................... 81

Figura 48. Quitina deshidratada........................................................... 82

l. INTRODUCCIÓN

El cultivo de Lycopersicon esculentum Mili. "tomate" es una de las

hortalizas más importantes en el mundo, para consumo fresco e industrial. Es

una fuente importante de los minerales potasio y magnesio, vitaminas C, 81,

82, 85 y carotenoides como el licopeno, pigmento con propiedades

antioxidantes. En el Perú la producción es de 243 267 TM por año y en

Lambayeque se estima en 26 805 TM (MINAG, 2012).

El rendimiento del tomate es afectado negativamente por la baja fertilidad

del suelo, infestación por malezas, pudriciones radiculares fungosas, manchas

foliares fungosas y bacterianas, insectos plaga y nemátodos que causan atrofia

y pudrición de las raíces. Está problemática es solucionada en parte con la

aplicación de fertilizantes y plaguicidas químicos, insumos que son benéficos

para el sector agrícola; sin embargo, el exceso en su utilización genera

residuos que dañan el ambiente y la salud de los seres vivos en general.

Durante el proceso de producción de los fertilizantes químicos se

consumen 1 ,3 toneladas de energía química no renovable para 1 tonelada de

urea y se utilizan compuestos tóxicos como el amoniaco y ácido sulfúrico,

cuyos efluentes afectan negativamente la biota de los ríos, donde son vertidos

y principalmente generan emisiones como los óxidos de nitrógeno y de azufre,

constituyentes de los "gases con efecto invernadero" y responsables en parte

de la destrucción de la capa de ozono. Asimismo, el uso inadecuado de los

1

fertilizantes químicos acumula nitratos que contaminan aguas superficiales

originando eutrofización y al lixiviarse a las aguas subterráneas pueden ser

ingeridos por los humanos causando metahemoglobinemia y nitrosaminas

cancerígenas. A su vez, debido a que los fertilizantes químicos son muy

solubles, producen salinización, problemas en el drenaje y compactación del

suelo. Por su parte, los plaguicidas en su mayoría generan contaminación

ambiental, resistencia de las plagas y patógenos y disminución de la

biodiversidad (Nicolalde & Quintana, 201 O; Pedraza et al., 201 0).

Como una alternativa a los insumes químicos están las bacterias

Burkholderia y Pseudomonas spp., que a través de diversos mecanismos

benefician el desarrollo de las plantas y aumentan el rendimiento,

denominándoles Rizobacterias Promotoras del Crecimiento de las Plantas

(Piant Growth Premoting Rhizobacteria, PGPR). Entre sus actividades

metabólicas están la fijación de nitrógeno, producción de reguladores,

solubilización de fosfatos y protección frente al ataque de patógenos, por lo que

se les utiliza como biofertilizantes; sin embargo, muchas veces no son

efectivas, debido a que proceden de condiciones edafoclimáticas muy

diferentes. Se prefieren microorganismos nativos adaptados a las condiciones

ecológicas 'Y que pueden competir exitosamente y complementarse con la biota

nativa; no obstante, en la región Lambayeque no se han realizado estudios que

permitan caracterizar las bacterias de los géneros Burkholderia y

Pseudomonas presentes en el cultivo del tomate como promotoras del

crecimiento, en una primera fase a nivel de laboratorio y en investigaciones

subsecuentes en invernadero y campo.

Por lo expuesto, se planteó la siguiente investigación, teniendo como

objetivos aislar e identificar Burkholderia y Pseudomonas spp. en la rizósfera

de Lycopersicon esculentum Mili. "tomate" de campos agrícolas del distrito de

Reque, en Lambayeque; determinar in vitro su potencial biológico como

productoras de enzimas y ácido indo! acético, fijadoras de nitrógeno,

solubilizadoras de fósforo, antagonista de hongos causantes de la chupadera

fungosa y determinar in vitro el poder germinativo de tomate por efecto de

Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas, caracterizadas como promotoras del

crecimiento de plantas.

2

11. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS

Las rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas conocidas como

PGPR (Prestan, 2004) son aquellas bacterias que colonizan la rizósfera y

pueden incrementar el desarrollo vegetativo y rendimiento de los cultivos

agrícolas. Entre las PGPR destacan especies de Pseudomonas cuyos

mecanismos de acción pueden ser directos como la solubilización de fosfatos,

síntesis de reguladores del crecimiento vegetal principalmente auxinas (AlA) y

citoquininas, compuestos volátiles como el etileno, 2,3 butanodiol y acetoina y

mecanismos indirectos o control biológico de patógenos, dado

fundamentalmente por la antibiosis, producción de sideróforos e inducción de

resistencia en la planta (Torres et al., 2000, Hemández et al., 2004, Prestan,

2004, Useche et al., 2004, Spadden, 2007).

En la rizósfera de cultivos de arroz se aislaron e identificaron 69 bacterias,

entre las que 51 % fue identificado como P. putida, P. aeruginosa,

P. f/uorescens y P. citchori; 26 % como Azotobacter vinelandii, A. chroococum y

A. nigrificans y 21 % fueron enterobacterias Klebsiella sp., Serratia sp. y

Enterobacter sp. Las cepas de A. vinelandii, A. chroococum, P. putida,

P. aeruginosa y Enterobacter sp. sintetizaron entre 3,5 a 32 mg L-1 de AlA. A su

vez, P. aeruginosa, P. pulida y P. fluorescens se comportaron como

antagonistas de Phytophtora infestans, principalmente por la producción de

3

sideróforos en un medio con una baja concentración de fierro, así como

también se observó la producción de antibióticos y colonización de hifas

(Torres et al., 2000).

En suelos ácidos amazónicos, donde el fósforo es un elemento limitante

para el desarrollo de las plantas, se aislaron bacterias solubilizadoras de

fósforo, identificando Pseudomonas sp., P. cepacia, P. gladioli,

Xanthomonas sp., X maltophilia, Enterobacter agglomerans y

Chromobacterium sp. La diversidad de bacterias estuvo representada por

bacilos y cocobacilos Gram negativos, siendo más abundantes que los

morfotipos Gram positivos. Pseudomonas sp., P. cepacia y

Chromobacterium sp. fueron las bacterias con mayor eficacia relativa de

solubilización, ERS (Useche et al., 2004).

Se investigó la producción de metabolitos de interés agrícola por

rizobacterias pertenecientes a los géneros Pseudomonas y Burkholderia

aisladas de maíz. Se cuantificó entre 5,30 a 21,53 ug mL-1 de ácido indol

acético, 3,1 O a 31 ,55 uM de sideróforos y 3,30 a 68,70 ug mL -1 de ácido

salicnico. El análisis multivariado de conglomerado jerárquico y ligamiento

completo para la selección de las mejores cepas destacó en forma integral

siete cepas de B. cepacia y una de P. fluorescens por las mejores

producciones de los metabolitos en estudio (Hernández et al., 2004).

En un estudio se caracterizaron 30 cepas de Pseudomonas fluorescentes

aisladas de suelo, siendo Gram negativas, positivas a las pruebas de citrato,

oxidasa, catalasa, indol, fluoresceína, hidrólisis del almidón y caseína,

utilización de glucosa, manitol, fructosa, arabinosa, trehalosa, glicerol, xilosa y

almidón como fuentes de carbono y producción de sideróforos. En presencia de

concentraciones crecientes de L-triptófano (50, 100, 200 y 500 ug mL-1), la

producción de AJA se incrementó hasta 0,5; 1 ,2; 4,3 y 9,3 ug mL-1 con

P. fluorescens AK1 y 0,2; 0,7; 3,8 y 8,3 ug mL-1 con P. aeruginosa AK2. La

inoculación de estas bacterias en semillas de arroz incrementó la producción

en 2,30 y 2,1 pmol mL-1 de AJA, respectivamente, frente a las semillas no

inoculadas con 1,6 pmol mL-1 (Karnwal, 2009).

Las Pseudomonas fluorescentes son habitantes de la rizósfera,

obteniendosé 103 aislados de la rizósfera de algodón y frijol a los que se

investigó su potencial para la inhibición de hongos, a través de la producción de

4

cianuro de hidrógeno, antibiótico diacetilfloroglucinol (2-4 DAPG), sideróforos,

proteasas y celulasas, así como la promoción del crecimiento de plantas y la

actividad de biocontrol en invernadero. Se encontraron 52 aislamientos con

actividad in vitro frente a Rhizoctonia solani, entre los que 41 fueron

seleccionados por su alta eficiencia de antagonismo in vitro. Algunos (6)

aislamientos produjeron HCN y otros (17) sintetizaron 0,6 a 11 ,4 ng DAPG.

Todas las bacterias, a excepción de una, sintetizaron proteasas y en ninguna

cepa se detectó la producción de celulasas. A su vez, 39 aislados

incrementaron significativamente, por lo menos en un parámetro, el crecimiento

de plantas de frijol en invernadero frente al control, observándose

predominancia del incremento de la longitud radicular (Ahmadzadeh y Tehrani,

2009).

Las bacterias Burkholderia y Pseudomonas están entre las más estudiadas,

porque producen reguladores del crecimiento vegetal y otros metabolitos

inhibitorios del crecimiento de patógenos en la rizósfera. Por lo expuesto,

nueve cepas de P. f/uorencens y tres de B. cepacia previamente aisladas de la

rizósfera del maíz y cultivadas en medio King B se enfrentaron a hongos

fitopatógenos de arroz (Curvularia sp. y Fusarium sp.) y maíz (F. oxysporum y

Altemaria altemata). Pseudomonas fluorecens se destacó por presentar las

mayores porcentajes de inhibición de Fusarium sp. y tanto P. f/uorecens como

B. cepacia mostraron efecto antagónico frente a Curvularia, F. oxysporum y

A. altemata. Por su parte, para determinar el efecto inhibitorio de los

metabolitos, las rizobacterias se sembraron en medio King B, luego se

sometieron a vapores de cloroformo durante 30 minutos y sobre ellas se

colocaron discos con los hongos fitopatógenos. Se determinó que los

metabolitos inhibieron el crecimiento de Fusarium sp, F. oxysporum,

Curvularia sp .y A altemata, concluyéndose que las rizobacterias investigadas

son potencialmente eficientes en el control de fitopatógenos (Trujillo et al.,

2007).

El efecto benéfico de Pseudomonas spp. resulta de la expresión de múltiples

actividades que directa o indirectamente inhiben a los patógenos. Los

mecanismos directos son mediados por la producción de antibióticos, que son

determinantes en la supresión de patógenos de suelos como hongos y

nemátodos. También se menciona la competencia por nutrientes, aunque no se

5

han publicado resultados consistentes. A su vez, el antagonismo indirecto es

mediado por la estimulación de las defensas del huésped. Por ejemplo el

antibiótico 2,4 diacetilfloroglucinol (DAPG) ha demostrado ser inhibitorio de

diversos patógenos, estimula las defensas de la planta huésped y la absorción

de aminoácidos por la raíz (Spadden, 2007).

En agar King 8 y King 8 modificado con 1 ,36 ppm de FeCI3 se investigó la

producción de sideróforos por cinco cepas de Pseudomonas antagonistas de

Phytopthora infestans. El hongo fue cultivado en el centro de placas de Petri a

28 oc durante 8 días y luego las bacterias fueron sembradas en líneas

circulares cerca al borde de las placas. Después de una incubación a 28 oc durante 8 días, se midieron las zonas de inhibición del fitopatógeno. En los

medios King 8 sin y con fierro, se observó la producción de sideróforos; sin

embargo; en este último el porcentaje de inhibición del hongo disminuyó

significativamente de 94 a 75 % con P. putida cepa 2, 1 00 a 57 % con P. putida

cepa 3, 95 a 68 % con P. putida cepa 1 , 98 a 78 % con P. aeruginosa y de 7 4 a

66 % con P. fluorescens. Estas variaciones parcialmente son atribuidas a la

inhibición del proceso de formación de pigmentos y en P .. f/uorescens puede

ser un factor determinante la producción de antibióticos (Torres et al., 2000).

En condiciones de laboratorio se determinó el efecto de 30 cepas

bacterianas en la germinación y crecimiento de Lactuca sativa L. "lechuga"

cv. Longifolia. En la germinación se encontraron diferencias altamente

significativas entre los tratamientos, alcanzando el mayor valor de 36,5 % con

Hafnia alvei. Por el contrario, dos cepas de P. aeruginosa inhibieron la

germinación. En cuanto al crecimiento de las plantas fue promovido por todas

las cepas de Hafnia alvei, Azospirillum brasilense, A. lipoferum,

Azospirillum sp., Beijerinckia indica, Enterobacter agglomerans, E. cloacae,

K. pneumoniae, P. aeruginosa, P. cepacia y P. fluorescens. A su vez

P. aeruginosa 5PS y A. brasilense T2P1 O mostraron efectos promotores del

crecimiento, tanto en la germinación como en el desarrollo vegetativo de

lechuga (Díaz et al., 2001 ).

6

111. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Materiales

3.1.1 Material biológico

El material biológico estuvo constituido por muestras de suelo rizosférico

de tomate, bacterias nativas de Burkholderia y Pseudomonas spp. y semillas

de Lycopersicon esculentum Mili. "tomate", cv. 'Río Grande'.

3.1.2 Población y muestra de estudio

Se consideró como población a las bacterias del género Burkholderia y

Pseudomonas presentes en la rizósfera de tomate cultivado en campos

comerciales del distrito de Reque, provincia de Chiclayo, en la región de

Lambayeque y se trabajó con las bacterias aisladas de 96 muestras de

rizósfera, cifra que fue calculada según la fórmula {Anexo 1) mencionada por

AMtres {2000), con una prevalencia de 80 % determinada por Cadena y

Martínez {2011).

3.2 Métodos

3.2.2 Variables en estudio

Las variables cuantitativas fueron las bacterias nativas Burkholderia y de

Pseudomonas spp. productoras de enzimas y de ácido indol acético, fijadoras

7

de nitrógeno, solubilizadoras de fósforo y antagonistas de hongos causantes de

chupadora fungosa.

3.2.3 Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis

El trabajo de investigación fue descriptivo y transeccional {Hernández

et al., 2003) y para contrastar la hipótesis se utilizó el diseño de una sola casilla

{Aivitres, 2000), según el cual se aislaron e identificaron Burkholderia y

Pseudomonas spp. y se investigó la actividad enzimática, producción de ácido

indolacético, fijación de nitrógeno, solubilización de fósforo, antagonismo frente

a hongos fitopatógenos, así como el efecto en el poder germinativo de tomate.

3.2.4 Lugar de muestreo

Para el aislamiento de Pseudomonas spp., durante marzo a junio de 2012,

se colectaron 9S muestras de rizósfera de cultivos de tomate, establecidos en

1S campos agrícolas del distrito de Reque, provincia de Chiclayo, región

Lambayeque. El distrito de Reque {Figura 1 ), está comprendido entre Jos

paralelos so 52' 00" y so 48' 5" de latitud sur y Jos meridianos 79° 49' 27" y 79°

44' 59" de latitud oeste. La zona presenta un clima subtropical, con una

temperatura mínima de 22 oc y una máxima absoluta de 33 °C {Municipalidad

de Reque, 2013).

3.2.5 Obtención de muestras de rizósfera

En campos agrícolas cultivados con tomate en fase de floración

{Figura 2), se seleccionaron aleatoriamente entre cinco a seis plantas y de

cada una se colectaron aproximadamente 100 g de suelo rizosférico {Figura 3).

Cada muestra se depositó en una bolsa de polietileno {Figura 4), debidamente

etiquetada e inmediatamente se transportaron para su procesamiento en la

sección Biotecnología Microbiana del laboratorio de Microbiología y

Parasitología en la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional

Pedro Ruiz Gallo en Lambayeque.

8

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Figura 1. Ubicación geográfica de la zona de muestreo en el distrito de Reque, provincia de Chiclayo, reg1on Lambayeque. Febrero, 2012 (https://maps.google.com.pe/).

9

Figura 2. Cultivo de Lycopersicon escu/entum Mili. "tomate" en floración.

Figura 3. Extracción de suelo rizosférico de Lycopersicon esculentum Mili. "tomate" en Reque, 2012.

10

Figura 4. Muestra de suelo rizosférico de Lycopersicon esculentum Mili.

"tomate".

11

En simultáneo al muestreo, en los 16 campos agrícolas del distrito de Reque,

se recolectaron submuestras de 1 Kg de suelo a una profundidad de 0,30 cm y

en diversos puntos (zig- zag), totalizando 11 Kg, que después se mezclaron

entre sí para obtener una muestra de 1 Kg y realizar la caracterización físico -

química en el laboratorio de Suelos de la Facultad de Agronomía, Universidad

Nacional Pedro Ruiz Gallo. Según los resultados (Tabla 1 ), el suelo es

fuertemente alcalino (pH 8,24), y medianamente salino (CE 5,14 mmhoscm-1),

con una textura franco areno-arcilloso, un contenido bajo de materia orgánica

(0,5 %), nitrógeno (0,09 %), fósforo (5,5 ppm) carbonato de calcio (0,42 %)

disponible, así como un contenido medio de potasio (7, 15 ppm).

3.2.6 Aislamiento de bacterias no fermentadoras de lactosa

Para el islamiento de Burkholderia y Pseudomonas spp. según Cadena y

Martínez (2011 ), cada muestra de suelo se tamizó y del material obtenido se

tomaron 1 O g para realizar diluciones en solución salina esterilizada,

NaCI 0,87 % p/v (Figura 5) hasta 1 o-2·. De la última dilución se obtuvo una

alícuota, se sembró por agotamiento y estría en agar Mac Conkey (Anexo 2) y

se incubó a 30 oc durante 48 horas. A continuación, se seleccionaron las

colonias no fermentadoras de lactosa (Figura 6) y se cultivaron en agar

tripticasa soya (TSA), a 30 oc, por 24 horas.

3.2.7 Identificación de Burkho/deria y Pseudomonas spp.

Para identificar los géneros Burkholderia y Pseudomonas según

Brenner et al. (2005), a los cultivos puros (Figura 7), se les realizó la prueba de

oxidasa y cuando se observó positividad, las bacterias se sembraron en agar

King B para investigar la producción del pigmento fluoresceína, en agar Citrato

de Simmons para la utilización de citrato como fuente de carbono y energía en

Citrato de Simmons, en agar Hierro Lisina (LIA) para la descarboxilación de la

lisina y en caldo peptonado para detectar la producción de indol. Asimismo, se

sembraron en agar Mueller Hinton para investigar la sensibilidad o resistencia a

la polimixina. Las colonias de Burkholderia y Pseudomonas spp. se cultivaron

en viales (Figura 9) con agar Tripticasa soya (Anexo 2) para su mantenimiento

en refrigeración a 8 oc.

12

Tabla 1. Análisis fiSico - qwm1co de suelos agrícolas cultivados con

Lycopersicon escu/entum Mill."tomate" en Reque, 2012

Clase textural

Fr.Ar.Ao

pH

8,24

Métodos empleados

Textura

pH

CE (mmhos

cm-1)

5,14

Conductividad eléctrica

Materia orgánica

Nitrógeno

Fósforo disponible

Potasio disponible

Carbonato disponible

MO (%)

0,5

N (%)

0,09

p (ppm)

5,5

: Método de Bouyoucos

K (ppm)

7,15

Calcáreo (%)

0,42

: Extracto de saturación: Potenciómetro

: Extracto de saturación: Conductímetro

: Método Walkey y Black

: Método de Kjeldah

: Método Olsen modificado

: Fotometría

:Gasometria

13

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Figura 5. Diluciones de suelo rizosférico en solución salina esterilizada.

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Figura 6.Colonias de bacterias no fermentadoras de lactosa en agar

Mac Conkey.

14

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Figura 7. Cultivo de bacterias no fermentadoras de lactosa en agar tripticasa

soya.

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Figura B.Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas cultivadas en agar tripticasa soya para la caracterización macroscópica de las colonias.

15

3.2.8 Mantenimiento de las bacterias

Para su mantenimiento, las bacterias nativas de Burkholderia y

Pseudomonas spp. fueron cultivadas en agar tripticasa soya durante 24 horas y

luego fueron llevadas a refrigeración (8 OC), realizándose subcultivos cada 30

días (Cadena y Martinez, 2011 ).

3.2.9 Producción de enzimas

Las bacterias nativas fueron sembradas mediante la técnica de

agotamiento y estría sobre agar leche 1 % y agar quitina coloidal al 1 %

(Anexo 3) y fueron incubadas a 30 oc, por 48 y 72 horas, respectivamente, en

aerobiosis, para investigar la producción de proteasas (Ríos & zuñiga, 2013) y

quitinasas (Franco, 2008), respectivamente. Con este propósito se observaron

las colonias bacterianas desarrolladas, para detectar y medir el halo de

hidrólisis o zona clara alrededor, que evidenció la producción de proteasas. A

su vez, para las quitinasas se tomó en cuenta la biomasa desarrollada,

asignándole valores de 1 y 2 para escasa y abundante biomasa,

respectivamente, considerándose como productoras de quitinasas aquellas

bacterias con abundante biomasa.

3.2.10 Detección y cuantificación de ácido indol acético (AlA) producido

in vitro

Para la detección y cuantificación de ácido indol acético producido in vitro,

según la reacción colorimétrica de Salkowski descrita por Mantilla (2007) y

García & Muñoz (2009), cada bacteria nativa fue cultivada en 5 mL de caldo

nutritivo por 24 horas, de donde se tomaron 0,6 mL para inocularlos en 5 mL de

caldo tripticasa soya suplementado con triptófano (Anexo 4).

Después de la incubación a 30 °C, por 72 horas, en agitación constante

(150 rpm), los cultivos fueron centrifugados a 2500 rpm durante 5 minutos. A

continuación, 0,4 mL de cada uno de los sobrenadantes se depositaron en

tubos, se agregaron 1,6 mL del reactivo de Salkowski modificado (Anexo 4) en

una relación 1 :4 se mezclaron y se dejaron en reposo durante 30 minutos, en

oscuridad. La positividad a la producción de ácido indol acético estuvo dada por

una coloración grosella y se leyó la absorbancia en espectrofotómetro de luz

16

visible, a 530 nm. Las concentraciones se calcularon en una recta patrón que

se obtuvo con diluciones sucesivas de una solución 100 ppm de ácido indol

acético (Anexo 4).

3.2.11 Detección y cuantificación de nitrógeno fijado in vitro

Para la detección y cuantificación de nitrógeno fijado in vitro según

Cadena & Martínez (2011 ), cada bacteria nativa fue sembrada por puntura en

6 mL de medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (Nfb) semisólido

(Anexo 5). La incubación se realizó en aerobiosis, a 30 °C, hasta por 1 semana

y se consideraron como bacterias fijadoras de nitrógeno, aquellos tubos donde

se observó una película gruesa blanquecina entre 3 a 5 mm bajo la superficie

del medio de cultivo y el viraje del indicador al azul.

Para la cuantificación del nitrógeno fijado como amonio, según el método

colorimétrico del fenolhipoclorito descrito por Lara et al. (2007), cada bacteria

cultivada en agar nutritivo por 24 horas, fue inoculada en tubos de 15x150 mm

conteniendo 5 mL de caldo extracto de suelo 1 O % (Anexo 5) y se incubaron a

30 °C, durante 72 horas; con agitación constante (150 rpm). A continuación, se

tomaron 3 mL de cada tubo y se agregaron 9 mL de KCI 2M, se agitaron a

1500 rpm durante 1 hora y se dejaron en reposo durante 1 hora adicional, para

después tomar 1 O mL del sobrenadante y centrifugarlos (2500 rpm) durante

5 minutos. Después, los sobrenadantes se vertieron en tubos de dilución y se

añadieron 0,4 mL de solución alcohólica de fenol 1 O %; 0,4 mL de nitroprusiato

de sodio 0,5 % y 1 mL de solución oxidante. Los tubos se agitaron para

mezclar y se dejaron en reposo durante 1 hora.

La positividad a la fijación de nitrógeno estuvo dada por una coloración

azul y se leyó la absorbancia en espectrófotómetro de luz visible a 632,9 nm.

Las concentraciones se calcularon en una recta patrón obtenida con diluciones

sucesivas de una solución de 1 00 ppm de cloruro de amonio (Anexo 5).

3.2.12 Detección y cuantificación de fósforo solubilizado in vitro

Para la detección y cuantificación de fósforo solubilizado in vitro según

Vasquez et al. (2000) y Cadena y Martínez (2011 ), cada bacteria nativa fue

sembrada mediante la técnica de estría en agar para aislamiento de

17

microorganismos solubilizadores de fósforo, Sundara Rao Sinha Medium,

SRSM (Anexo 6). Las placas de Petri se incubaron a 30 ac, hasta por 96

horas y las colonias de bacterias solubilizadoras de fósforo fueron reconocidas

por el cambio de color del indicador al amarillo y la formación de un halo

translúcido alrededor de la colonia. Después, las colonias se cultivaron

nuevamente en agar SRSM para verificar la actividad solubilizadora de fósforo

y se midió el halo de las colonias que conservaron su capacidad para

solubilizar fósforo.

Para la cuantificación del fósforo solubilizado, se obtuvo el inóculo con

cada bacteria nativa solubilizadora de fósforo cultivada en 1 mL de caldo

SRSM, a 30 oc, durante 20 horas, con agitación constante (150 rpm). A

continuación, 0,6 mL de cada uno de los cultivos bacterianos fueron inoculados

en frascos con 20 mL de caldo SRSM e incubados a 30 oc, con agitación

constante (150 rpm), hasta por 96 horas (Figura 9). Después, se tomaron

submuestras de 1 O mL, que fueron centrifugados a 3000 rpm por 5 minutos y

en el sobrenadante se cuantificó el fósforo soluble mediante el método

calorimétrico del molibdato (Anexo 6), según Rodier & Rodi (2005). Los

resultados se expresaron como fósforo solubilizado (ppm).

3.2.12 Prueba de antagonismo de hongos causantes de la chupadera

fungosa por cepas nativas de Burkholderia y Pseudomonas spp.

Para la prueba de antagonismo las bacterias nativas de Burkholderia y

Pseudomonas spp. se enfrentaron in vitro a los hongos causantes de

chupadera fungosa Rhizoctonia sola ni y Fusarium sp.

a. Aislamiento e identificación de los hongos Fusarium y

Rhizoctonia sp.

En campos comerciales de tomate se seleccionaron plántulas con

síntomas de chupadera fungosa (Figura 1 0), para aislar los hongos

fitopatógenos causantes de la enfermedad. Para el aislamiento de hongos

según Ríos & Zúñiga (2012), los raíces y tallos fueron lavados con agua de

caño para eliminar el suelo adherido. Después, en asepsia fueron cortados en

18

Figura 9. Crecimiento de Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas en caldo SRSM.

Figura 1 O. Raiz de Lycopersicon esculentum Mili. "tomate" con síntomas de

pudrición.

19

fragmentos de aproximadamente 1 cm, que fueron depositadas en un vaso de

precipitación, donde se adicionaron 40 mL de hipoclorito de sodio comercial

1 O % (v/v) y se homogenizó el contenido con movimientos rotatorios durante

2 minutos (Figura 11 ). A continuación, se eliminó el sobrenadante y se vertieron

50 mL de agua destilada esterilizada. El sobrenadante fue eliminado y el

material vegetal fue enjuagado una segunda vez con agua destilada

esterilizada.

Finalizada la desinfección, los fragmentos de tejido vegetal fueron

depositados sobre papel filtro esterilizado, para eliminar el exceso de humedad

y luego fueron llevados en número de cinco y dispuestos radialmente sobre

placas de Petri con agar papa dextrosa (PDA) más cloranfenicol. Después de la

incubación a 30 °C, hasta por 7 días se desarrollaron colonias de hongos

filamentosos (Figura 12), de donde se tomaron fragmentos para cultivarlos en

PDA, se incubaron a 30 OC, por 4 días y constituyeron los cultivos puros de

hongos (Figura 13), que fueron guardados en refrigeración. La identificación de

los hongos se realizó según las claves de Bamett y Hunter, (1999).

b. Prueba de antagonismo

Para la prueba de antagonismo se utilizó la técnica de enfrentamiento en

"cultivo dual" descrita por Femández & Vega (2001 ), según la cual cada

bacteria nativa se sembró masivamente en un extremo de una placa de Petri

con PDA, ocupando aproximadamente un cuarto del área total y se incubó a

30 oc, por 72 horas.

A continuación, un fragmento del hongo filamentoso se depositó en el

extremo de la placa opuesto al de la bacteria y se incubó a 30 OC (Figura 14).

Después de 5 días se midió el radio de la colonia del hongo y se comparó con

una placa testigo para determinar si el crecimiento fúngico fue afectado por las

bacterias seleccionadas. Los resultados se expresaron como porcentaje de

inhibición del crecimiento micelial respecto al testigo.

20

Figura 11. Desinfección de tejido vegetal con hipoclorito de sodio.

Figura 12. Colonias de hongos filamentosos desarrollados en agar papa

dextrosa más cloranfenicol.

21

Figura 13.Cultivo puro de hongo filamentoso aislado de raices de

Lycopersicon esculentum Mili. "tomate".

Figura 14. Crecimiento de Fusarium sp. y Pseudomonas sp. en la prueba de

antagonismo.

22

3.2.14 Selección de Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas

Debido a que presentaron los mayores valores en más de una

característica evaluada, se seleccionaron ocho bacterias nativas de

Burkholderia y Pseudomonas spp. (Figura 15) para determinar el efecto en el

poder germinativo de tomate.

3.2.15 Efecto en el poder germinativo de tomate

El cultivo de tomate cv. 'Río Grande' (Figura 16) y la inoculación de

ocho bacterias de Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas, productoras de

enzimas y ácido indolacético, fijadoras de nitrógeno, solubilizadoras de fósforo

y antagonistas de los hongos causantes de la chupadera fungosa se realizó en

el laboratorio de Microbiología y Parasitología, sección de Biotecnología

Microbiana, de la facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Pedro

Ruiz Gallo en Lambayeque. El ensayo (Figura 17) fue conducido entre el30 de

abril al 7 de mayo de 2013, con una temperatura mínima de 26 oc y una

máxima de 30 °C, determinándose el procentaje de germinación y poder

germinativo a los 7 días.

a. Características de la especie vegetal

El tomate cv. 'Río Grande', presenta un tamaño de fruto de

aproximadamente 4 cm, con un peso de 140 g como máximo. Las plantas son

de maduración media a tardía y tienen una adaptación climática alta, son de

crecimiento determinado y presentan un buen follaje. La época de carestía es

de junio a octubre y la de abundancia de noviembre a mayo (Ríos & Zuñiga,

2012).

b. Porcentaje de germinación de "tomate" cv. 'Río Grande'

Para determinar el porcentaje de germinación de semillas de tomate, en

cinco bandejas de tecnopor de 20 x 14 cm, en cuyo fondo se colocaron cuatro

capas de papel toalla esterilizado, humedecido con agua destilada esterilizada,

y con ayuda de pinzas esterilizadas, se depositaron 20 semillas de tomate por

bandeja, distribuidas en cuatro hileras. Las bandejas se mantuvieron a

temperatura ambiente (28 °C), humedeciéndolas intermediariamente, hasta

observar el máximo de germinación que fue 80% después de 7 días.

23

Figura 15. Burkholderia y Pseudomonas nativas seleccionadas.

Figura 16.Semillas de Lycopersicon esculentum Mili. "tomate"

cv. 'Río Grande'.

24

LJLJ[:JLJLJLJ[J[]LJOJ A= Pseudomonas sp. CT7 F= Burkholderia CT30

B= Burkholderia CT9 G= Pseudomonas sp. CT37

C= Burkholderia CT13 H= BurkholderiaCT54

D= Burkholderia CT16 1= Testigo caldo nutritivo

E= Burkho/deria CT25 J= Testigo agua destilada

Figura 17. Ensayo para determinar el efecto de ocho bacterias nativas de

Burkholderia y Pseudomonas spp. en el poder germinativo de

Lycopersicon esculentum Mili. "tomate" cv. 'Río Grande'.

25

c. Obtención del inóculo bacteriano en fase exponencial

Para la obtención del inóculo, cada bacteria nativa seleccionada fue

cultivada en 1 mL de caldo nutritivo a 30 OC, durante 12 horas en agitación

constante (150 rpm). Después 0,6 mL de cada cultivo bacteriano fue inoculado

en tubos con 5 mL de caldo nutritivo (Figura 18) e incubados a 30 °C, por

24 horas, en agitación constante (150 rpm), tiempo requerido para alcanzar

fase exponencial según Cadena y Martinez (2011 ).

d. Determinación del poder germinativo de tomate por efecto de la

inoculación de Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas

El inóculo bacteriano en fase exponencial fue mezclado con el adherente

constituido por una solución sacarosa al 1 O % previamente esterilizada

correspondiendo 8 mL de inóculo más 2 mL de solución. Ambos fueron

homogenizados por movimientos de rotación durante 2 minutos e

inmediatamente después fueron vertidos sobre las semillas de tomate en

bolsas de polietileno a razón de 100 mL por Kg de semillas, correspondientes a

1 mL para 1 00 semillas por bolsa (Figura 19). El material biológico fue

homogenizado durante 10 minutos y después fue secado en estufa a 30 °C,

durante 30 minutos para favorecer la adhesión del inóculo a las semillas

(Cadena & Martínez, 2011 ).

Para el ensayo de germinación, en bandejas de tecnopor de 20 x 14 cm, en

cuyo fondo se colocaron cuatro capas de papel toalla esterilizado y

humedecido con agua destilada esterilizada y con la ayuda de pinzas

esterilizadas, se depositaron 33 semillas de tomate inoculadas con las

bacterias seleccionadas (en tres hileras). El procedimiento se realizó por

triplicado, para cada una de las bacterias nativas seleccionadas, teniendo como

testigos semillas tratadas con caldo nutritivo no inoculado y agua destilada. Los

tapers se mantuvieron a temperatura ambiente (Figura 20), realizando riegos

i nterrriediariamente.

26

Figura 18. Cultivo de Burkho/deria y Pseudomonas spp. en caldo nutritivo.

Figura 19. Semillas de tomate cv. 'Río Grande' inoculadas con Burkholderia y

Pseudomonas spp.

27

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Figura 20. Ensayo de germinación de semillas de tomate cv. 'Río Grande'

inoculadas con Burkholderia y Pseudomonas spp.

28

Según Pérez et al. (2007), Méndez et al. (2008) y FAO (2011), se contaron

las semillas germinadas después de 7 días de instalado el ensayo, para

determinar la germinación (%); diferenciando plántulas normales (PN),

plántulas anormales (PPA) y semillas no germinadas (SNG). Después, con el ,.

número de plántulas normales, se calculó el poder germinativo (%).

3.3 Análisis estadístico de los datos

Los datos obtenidos fueron ordenados en tablas y figuras que permitieron

determinar el pot~ncial de Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas como ¡:

promotoras de crecimiento de plantas. En el presente trabajo se utilizó el

software estadístieo SPSS versión 15.0, así como los programas Microsoft

office Word, Excel versión 2007.

29

IV. RESULTADOS

4.1 Burkholderia y Pseudomonas spp. aisladas e identificadas

En el 38,54 % (37) de las muestras de suelo rizósférico de tomate se

aislaron bacterias no fermentadoras de lactosa (Figura 21), obteniéndose 129

cultivos puros. Entre éstos 45,7 4 % (59) fue positivo en la prueba de o:xidasa,

siendo 40,68 % (24) identificado como Pseudomonas, 44,07 % (26) como

Burkholderia y 15,25 % (9) correspondió a otros géneros (Figura 22). De esta

manera, el 35,42 % (34) de muestras rizosféricas de tomate fue positivo al

aislamiento de Burkholderia y Pseudomonas spp.

4.2 Potencial biológico de Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas

En el 38,46 % (1 O) de Burkholderia (Figura 23) y 50 % (11) de

Pseudomonas spp. (Figura 24) se detectó actividad proteolítica, evidenciada

por el halo formado alrededor de las colonias (Figura 25), cuyo tamaño osciló

entre O, 1 y 2,2 cm para Pseudomonas sp. CT46, CT54;

Pseudomonas sp. CT25, así como Burkho/deria CT11 respectivamente

(Tabla 2).

El 61,54 % (16) de Burkholderia (Figura 26) y 45,83 % (11) de

Pseudomonas spp. (Figura 27) desarrolló biomasa en agar quitina (Figura 28,

tabla 3), evidenciando la producción de quitinasas.

30

• Fermentadoras

• No fermentadoras

Figura 21. Frecuencia de aislamiento de bacterias no fermentadoras de

lactosa en muestras de suelo rizosférico de

Lycopersicon escu/entum Mili. "tomate", en Lambayeque, 2013.

• Burkholderia

1!11 Pseudomonas

D Otros géneros

Figura 22. Frecuencia de aislamiento de Burkholderia y Pseudomonas en

bacterias no fermentadoras de lactosa, o:xidasa positivas.

31

• Proteolíticas

13:1 No proteolíticas

Figura 23. Porcentaje (%) de Burkho/deria spp. productoras de proteasas en

Lambayeque, 2013.

"'-~~·-:'.:

11 Proteolíticas

f:J No proteolíticas

Figura 24. Porcentaje (%)de Pseudomonas spp. productoras de proteasas en

Lambayeque, 2013.

32

Figura 25. Halo de hidrólisis formado por Burkholderia spp. nativas en agar

leche.

33

Tabla 2. Halo (cm) de hidrólisis formado por Burkholderia y Pseudomonas spp.

nativas en agar leche durante 48 horas

Código

UNPRG

Pseudomonas sp. CT25

Burkholderia sp. CT24





Pseudomonas sp. CT1 O



Pseudomonassp.CT7


Halo

(cm)

2,2

1,9

1,3

1,3

1,3

1,1

1,0

1,0

0,9

0,8

0,8

Código

UNPRG


Pseudomonassp.CT40


Pseudomonas sp. CT2








Halo

(cm)

0,7

0,7

0,6

·o,4

0,3

0,2

0,2

0,2

0,1

0,1

0,1

34

• Quitinolíticas

D No quitinolíticas

Figura 26.Porcentaje (%) de Burkholderia spp. nativas que desarrolló

abundante biomasa en agar quitina en Lambayeque, 2013.

ll'J Quitinolíticos

O No quitinolíticos

Figura 27.Porcentaje (%) de Pseudomonas spp. nativas que desarrolló

abundante biomasa en agar quitina en Lambayeque, 2013.

35

Figura 28. Biomasa formada por Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas en

agar quitina.

36

Tabla 3.Burkho/deria y Pseudomonas spp. nativas que desarrollaron

abundante biomasa en agar quitina durante 72 horas

Pseudomonassp. CT2


Burkholderia sp. CTB




Pseudomonas sp. CT7

Pseudomonassp.CT22


Pseudomonassp.CT27





Código

UNPRG









Pseudomonassp.CT52





37

En cuanto a la producción de ácido indolacético, en el 26,92 % (7) de los

caldos cultivados con Burkholderia y 41,67 % (1 O) Pseudomonas spp. nativas,

se detectó este compuesto, observándose una coloración grosella (Figura 29) y

la concentración osciló entre 0,75 a 26,25 ppm para Pseudomonas spp. CT2 y

Burkholderia CT30, respectivamente (Tabla 4, anexo 3).

El 57,69 % (15) de Burkholderia y 54,17% (13) de Pseudomonas spp.

nativas fijaron nitrógeno (Figuras 30, 31), evidenciado por una película

blanquecina bajo la superficie (Figuras 32, 33) y el viraje del indicador en el

medio · Nfb. Asimismo, en caldo extracto de suelo se cuantificó entre 0,42 y

26,78 ppm de amonio para Burkholderia CT4 y Pseudomonas spp. CT54,

respectivamente (Tabla 5, anexo 3).

Respecto a la solubilización de fósforo, el 7,69 % (2) de Burkho/deria y

29,17 % (7) de Pseudomonas spp. nativas, solubilizó fosfato dicálcico

(Figuras 34, 35, anexo 4), observándose viraje del indicador al amarillo y halos

translúcidos en agar SMRS (Figura 36). En caldo SMRS se evidenció el viraje

del indicador al amarillo y se cuantificó el fósforo soluble, observándose una

coloración azul (Figura 37). A su vez, la concentración de fósforo solubilizado

osciló entre 1,53 y 7,31 ppm para Burkho/deria CT24 y

Pseudomonas spp. CT7, respectivamente (Tabla 6, anexo 5).

Para la prueba de antagonismo, se aisló Fusarium sp. y

Rhizoctonia so/ani del 80% de las muestras de raíces de tomate. Los hongos

fueron reconocidos macroscópicamente por las colonias características y

microscópicamente por la presencia de micro y macroconidias (Figuras 38 ,39).

Todas las bacterias seleccionadas afectaron el desarrollo de las colonias de

Fusariuin sp. (Figura 40) y Rhizoctonia solani aislados de raíces de tomate

(Figura 41 ). A los 8 días, el radio de la colonia de Fusarium sp, osciló entre 3,2

y 5,2 cm con Burkholderia CT13 y Pseudomonas spp. CT7; frente al control,

con 8,0 cm, correspondientes a 60,0 y 35,0 % de inhibición, respectivamente

(Tabla 7).

38

:........,.-,·,..,¿~-A~ .. -. . . . . !1 !!!·. _,__.,_.., ____ .., ____ b~·-- !.-~- .::~-- ::~ ~~ -.:~~.,;,:_. ' ' ¡. ·1

.... ---"·---·~,--"·~ l.'"'l -- ' ' ~ 1

- ______ j Figura 29. Coloración grosella observada en la cuantificación de ácido indo!

acético por la reacción colorimétrica de Salkowski.

39

Tabla 4.Ácido lndolacético (ppm) producido por Burkholderia y

Pseudomonas spp. nativas en caldo tripticasa soya durante 72 horas

Código AlA Código AlA

UNPRG (ppm) UNPRG (ppm)

Burkholderia sp. CT30 26,25 Pseudomonassp.CT25 2,00

Pseudomonas sp. CT38 5,50 Burkholderia sp. CT11 1,75

Burkholderia sp. CT12 4,75 Burkholderia sp. CT8 1,50

Pseudomonas spp. CT37 4,75 Burkholderia sp. CT42 1,50

Pseudomonassp. CT41 3,00 Pseudomonassp.CT7 1,00

Pseudomonassp.CT34 2,75 Burkholderia sp. CT16 1,00

Pseudomonas sp. CT52 2,50 Pseudomonas sp. CT40 1,00

Pseudomonas sp. CT17 2,25 Pseudomonassp.CT2 0,75

Burkholderia sp. CT13 2,00

40

• Fijadoras

il!l No fijadoras

Figura 30.Porcentaje (%) de Burkholderia spp. fijadoras de nitrógeno en

Lambayeque, 2013.

1!1 Fijadoras

o No fijadoras

Figura 31.Porcentaje (%) de Pseudomonas spp. fijadoras de nitrógeno en

Lambayeque, 2013.

41

Figura 32. Película blanquecina bajo la superficie del medio Nfb cultivado con

Pseudomonas sp. fijadora de nitrógeno.

Figura 33. Viraje del indicador al azul en el medio Nfb cultivado con

Pseudomonas sp. fijadora de nitrógeno.

42

Tabla S.Nitrógeno fijado como amonio (ppm) por Burkholderia y

Pseudomonas spp. nativas en caldo extracto de suelo durante

72 horas

Código

UNPRG


Pseudomonassp.CT7


Pseudomonassp.CT27



Burkho/deria sp. CT56


Pseudomonas sp. CT2

Pseudomonassp. CT41




Pseudomonas sp. CT5

Amonio

(ppm)

Código

UNPRG

26,78 Burkholderia sp. CT24


18,09 Pseudomonassp. CT19

16,64 Burkholderiasp. CT21

11 ,89 Burkholderia sp. CT6





8,93 Pseudomonas sp. CT36





Amonio

(ppm)

6,31

6,18

5,92

5,72

5,42

3,35

2,54

2,22

1,88

1,54

1,49

1,29

0,62

0,42

43

• Solubilizadoras

o No solubilizadoras

Figura 34.Porcentaje (%) de Burkho/deria spp. solubilizadoras de fósforo,

Lambayeque, 2013.

!1il Solubilizadoras

Cl No solubilizadoras

Figura 35. Porcentaje (%) de Pseudomonas spp. solubilizadoras de fósforo,

Lambayeque, 2013.

44

Figura 36. Viraje del indicador al amarillo y halos translúcidos alrededor de

colonias de Pseudomonas spp. en agar SRSM.

Figura 37. Coloración observada en la cuantificación de fósforo soluble por el

método calorimétrico del molibdato.

45

Tabla 6. Fósforo solubilizado (ppm) por Burkholderia y Pseudomonas spp.

nativas en caldo SRSM durante 96 horas

Código Fósforo solubilizado

UNPRG (ppm)

Pseudomonas sp. Cl7 7,31


Pseudomonas sp. CT52 3,83

Pseudomonassp.CT25 3,58




Pseudomonassp.CT40 1,54


46

':

. Figura 38. Observación microscópica (400x) de microconidias y macroconidias

de Fusarium sp.

Figura 39. Observación microscópica (400x) de hifas de Rhizoctonia solani.

47

Figura 40.Antagonismo de Burkho/deria sp. CT13 a Fusarium sp. (a);

control (b).

Figura 41. Antagonismo de Pseudomonas sp. CT7 a Rhizoctonia solani (a);

control (b).

48

Tabla 7. Radio (cm) de la colonia de Fusarium sp. y porcentaje de inhibición

del crecimiento por efecto de Burkholderia y Pseudomonas spp.

nativas

Código Radio (cm) Inhibición

UNPRG 5 días 8 días (%) (%)

Burkho/deria sp. CT13 1,2 3,2 52,00 60,0

Pseudomonas sp. CT25 1,5 3,6 40,00 55,0


Burkholderia sp. CT16 1,7 4,2 32,00 47,5





Control Fusarium sp. 2,5 8,0

49

A su vez, el radio de Rhizoctonia solani aislado de la raíz de tomate,

osciló entre 1 ,4 y 4,8 cm con Pseudomonas spp. CT54 y Burkholderia CT9;

·frente al control con 6,0 cm, correspondientes a 76,7 y 20,0 % de inhibición,

respectivamente (Tabla 8).

Para determinar el efecto de las bacterias nativas en el poder germinativo

de tomate se seleccionaron Burkholderia sp. CT9, 13, 16, 30, y

Pseudomonas sp. CT7, 25, 37 y 54; porque alcanzaron los mayores valores en

más de una característica investigada (Tabla 9).

4.3 Porcentaje de germinación y poder germinativo

El porcentaje de germinación de las semillas de tomate cv. 'Río Grande',

osciló entre 86,88 y 93,94 % en los tratamientos con Burkholderia y

Pseudomonas spp. nativas; frente a 86,88 % en el testigo caldo nutritivo y

89,91 % en el testigo agua destilada. A su vez, el poder germinativo osciló

entre 71,73 y 89,91 % en los tratamientos con Burkholderia y

Pseudomonas spp. nativas, frente a 80,82 % en el testigo caldo nutritivo y agua

destilada (Tabla 10; figuras 42, 43). En este contexto, 37,5 % (3) de las

bacterias incrementó el poder germinativo, alcanzando 82,82 - 89,91 %, el

12,5 % (1) no lo afectó, registrando 80,82 %, igual que los testigos agua

destilada y caldo nutritivo. Por el contrario, 50,0 % (4) de las bacterias nativas

disminuyó el poder germinativo de tomate.

4.4 Especies de Burkholderia y Pseudomonas promotoras del

crecimiento de plantas

Pseudomonas sp. CT7, CT37 y Burkholderia sp. CT30 fueron

consideradas rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas, debido a

que demostraron actividad proteolítica y quitinolítica, sintetizaron ácido

indolacético, fijaron nitrógeno, solubilizaron fósforo e incrementaron el poder

germinativo de maíz, siendo identificadas como P. putida CT7,

P. fluorescens CT37 y B. cepacia CT30 (Tabla 11, 12). Asimismo, se consideró

Pseudomonas putida CT54 que también presentó potencial biológico y no

afectó el poder germinativo de tomate.

so

Tabla 8. Radio (cm) de la colonia de Rhizoctonia so/ani y porcentaje de

inhibición del crecimiento por efecto de Burkholderia y

Pseudomonas spp. nativas

Código Radio (cm) Inhibición

UNPRG 5 días 8 días (%) (%)








Burkho/deria sp. CT9 2,5 4,8 13,79 20,0

Control Rhizoctonia so/ani 2,9 6,0

51

Tabla 9. Características de ocho bacterias nativas de Burkholderia y Pseudomonas spp. seleccionadas

CÓDIGO Proteasas Quitinasas AJA Nitrógeno Fósforo Inhibición

UNPRG halo (ppm) fijado (ppm solubilizado (%)

(cm) de amonio) (ppm) Fusarium sp. Rhizoctonia sp.

Pseudomonas sp. CT7 0,80 Biomasa 1,00 21,86 7,31 35,0 30,0

Burkholderia sp. CT9 0,60 - - 11,89 4,91 43,8 20,0

Burkholderia sp. CT13 - - 2,00 - - 60,0 56,7

Burkho/deria sp. CT16 0,80 - 1,00 18,09 - 47,5 28,3

Pseudomonas sp. CT25 2.20 - 2,00 - 3,58 55,0 36,7

Burkho/deria sp. CT30 - Biomasa 26,25 - - 46,3 43,3

Pseudomonas sp. CT37 0,30 Biomasa 4,75 9,34 2,75 52,5 65,0

Pseudomonas sp. CT54 0,10 - - 26,78 - 43,8 76,7

52

Tabla 10. Porcentaje (%) de germinación y poder gerrninativo de semillas de

semillas de Lycopersicon esculentum Mili. "tomate" cv. 'Río Grande'

por efecto de Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas durante

7 días

Germinación Poder gerninativo Tratamientos

X % X %









Testigo caldo nutritivo 28,67 86,88 26,67 80,82

Testigo agua destilada 29,67 89,91 26,67 80,82

53

Figura 42. Semillas de Lycopersicon escu/entum Mili. "tomate" germinadas por

efecto de Pseudomonas sp. nativa (derecha) y agua destilada

(izquierda).

Figura 43. Plántulas normales de Lycopersicon esculentum Mili. "tomate",

7 días después de la inoculación de Burkholderia CT30.

54

Tabla 11.Características diferenciales de Burkholderia cepacia,

Pseudomonas aeruginosa y P. putida nativas

Caracteñsticas P. putida P. Fluorescens B. cepacia

diferenciales CT7 CT37 CT30

Cata lasa + + +

Oxidasa + + +

Fluoresceína en agar King B +

Crecimiento a 4 oc +

Crecimiento a 42 oc +

Utilización del citrato + + +

Descarboxilación de la lisina + + +

Sensibilidad a la polimixina + +

Producción de lndol + +

55

Tabla 12.Caracterfsticas de Pseudomonas putida, P. f/uorescens y Burkholderia cepacia nativas promotoras del

crecimiento de plantas

Características P. putida CT7 P. putida CT54 P. fluorescens CT37 B. cepacia CT30

Proteasas 0,80 0,10 0,30

Quitinasas Biomasa - Biomasa Biomasa

Ácido indolacético (ppm) 1,00 - 4,75 26,25

Nitrógeno fijado (ppm) 21,86 26,78 9,34

Fósforo solubilizado (ppm) 7,31 - 2,75

56

V. DISCUSIÓN

En el 38,54 % de las muestras de suelo rizosférico de tomate se aislaron

bacterias no fermentadoras de lactosa en agar Mac Conkey, valor inferior al

rango 52 - 57 % mencionado por Dávila & Linares (2013) y Barba & Bravo

(2013) para rizósfera de piñón blanco y malezas, respectivamente. En el agar

Mac Conkey utilizado mayoritariamente para aislar enterobacterias (Farro &

Graus, 2013) las sales biliares y el cristal violeta inhiben bacterias Gram

positivas y Gram negativas no entéricas (Cadena & Martínez, 2011 ). En este

medio de cultivo también forman colonias un grupo de bacterias no

fermentadoras, entre las que se han identificado Burkholderia y Pseudomonas

(Cadena & Martínez, 2011; Dávila & Linares, 2013; Barba & Bravo, 2013)

Cupriavidus necator (Lisboa & Segura, 201 0), así como también, Acinetobacter

y Stenotrophomonas (Farro & Graus, 2013).

En el grupo de bacterias no fermentadoras; 55,74 % fue positivo en la

prueba de oxidasa, en la que el sistema citocromo oxidasa activa la oxidación

del citocromo reducido por el oxígeno molecular o aceptar de electrones en la

57

fase terminal del sistema de transferencia. Según MacFaddin (2000), todas las

especies de Pseudomonas producen una enzima oxidasa que, en presencia de

oxígeno atmosférico y citocromo e, oxida el reactivo a un compuesto coloreado,

de indofenol.

Burkholderia y Pseudomonas, bacterias no fermentadoras de lactosa, con

actividad oxidasa, se identificaron en 35,42 % de las muestras de suelo

rizosférico de tomate, superando 34,37 % registrado en piñon blanco (Dávila &

Linares, 2013). A su vez, el valor fue inferior a 43,75 % alcanzado en malezas

(Barba & Bravo, 2013). Estas bacterias también han sido reportadas en

Anacardium excelsum "aspalvel" (Barreta et al., 2007); Pinus patula "pino"

(Orozco & Martínez, 2009), Avicennia germinans "manglares blancos" y

Laguncularia racemosa "manglares negros" (Vazquez et al., 2000),

Asparagus officinalis L. "espárrago" (Pérez et al., 2004), Gossypium herbaceum

"algodón" (Salaheddin et al., 201 O); Lycopersicon esculentum Mili. "tomate"

(Alfonso et al., 2005), Oryza sativa L. "arroi' (Torres et al., 2000; Rives et al.,

2008}, Zea mays L. "maíi' (Hernández et al ... 2003; Hernández et al., 2004;

Aguado & Moreno, 2008; Becerra & Gil, 2009; Carreña, 2009; Espinoza et al.,

2009; Adjanohorin et al., 2011; Cadena & Martínez, 2011) y Jatropha curcas L.

"piñón blanco" (Dávila & Linares, 2013).

El género Burkholderia predominó frente a Pseudomonas spp. A

diferencia, Dávila & Linares (2013) y Barba & Bravo (2013) reportaron

51 - 87 % de Pseudomonas frente a 8 - 43 % de Burkholderia. Este último

género es relativamente nuevo, porque mediante el análisis de secuencia del

ARNr16S se determinó que algunas bacterias no correspondían a

Pseudomonas y fueron agrupadas como Burkholderia y Ralstonia (Martín,

2011 ). La especie B. cepacia es de considerable atención por su diversidad

genética, pudiendo ser patógena de plantas, saprofítica y biorremediadora

(Toledo et al., 2002), pero también estimula el crecimiento vegetal y es agente

de biocontrol (Pallai, 2005; Mantilla, 2007; Torriente, 2010).

Con las rizobacterias nativas se evidenció actividad enzimática,

producción de ácido indolacético y solubilización de fósforo, predominando

Pseudomonas frente a Burkholderia. Se coincide con Barba y Bravo (2013) y

58

Dávila y Linares {2013) en aislados de malezas y piñón blanco,

respectivamente. La actividad proteolítica se evidenció en agar leche, donde la

principal proteína, caseína, está en solución coloidal y es responsable del color

blanco y opacidad. Cuando las bacterias producen caseinasa, hidrolizan la

proteína, produciendo derivados solubles y cristaloides, que permiten el paso

de la luz, observándose halos transparentes {Ríos & Zuñiga, 2012). La

proteolisis facilita la utilización de fuentes proteícas que por su gran tamaño, no

son asimilables, favoreciendo la multiplicación bacteriana en la rizósfera

{Egamberdiyeva, 2007).

La actividad quitinolítica se detectó en agar quitina coloidal. Este

homopolímero formado por residuos de N-acetii-D-glucosamina con enlaces

¡3,1-4 es hidrolizado por el complejo quitinasa, cuando es utilizado como fuente

de carbono, observándose biomasa bacteriana y halos de hidrolisis {Martin,

2011; Priya, 2011). La quitinolisis es un mecanismo de biocontrol de hongos

fitopatógenos, porque su pared celular está constituida mayoritariamente de

polisacáridos como la quitina y glucanos {Da Silva et al., 2008).

Las bacterias investigadas sintetizaron AlA, característica que también ha

sido reportada por Mantilla {2007) y Criollo et al., {2012), identificándose

P. fluorescens, P. aeruginosa {Kamwal, 2009), B. cepacia, P. f/uorescens

{Hemández et al., 2004) y P. putida (Torres et al., 2000; Rives et al., 2009).

El AlA se cuantificó mediante la reacción calorimétrica de Salkowski, en la

que según Mantilla {2007), la concentración de indol es directamente

proporcional a la intensidad de una coloración grosella. A su vez, éste es el

resultado de una reacción oxidativa de los compuestos indólicos por las sales

férricas en acidez, donde por una transaminación un grupo amino del indol es

sustituido por el cloro del cloruro férrico. Con las bacterias nativas se cuantificó

hasta 26,25 ppm de ácido indolacético, valor que está en el rango 22 - 28 ppm,

alcanzado con aislados de maíz {Hemández, 2004; Cadena & Martínez, 2011)

y malezas {Barba & Bravo, 2013); sin embargo, también se ha reportado

35 ppm en aislados de piñón blanco {Dávila & Linares, 2013).

En el presente estudio se observó solubilización de fósforo por las

bacterias nativas, coincidiendo con Carreña (2009) y Criollo et al. (2012),

59

habiéndose identificado B. cepacia, P. gladioli (Useche et al., 2004}, P. stutzeri

(Vazquez et al., 2000}, B. gladioli, B. cepacia y P. fluorescens (Espinoza et al.,

2009}.

La solubilización de fósforo se evidenció por halos alrededor de las

colonias bacterianas, coincidiendo con Vazquez et al. (2000}, quienes

manifestaron que los medios de cultivo sólidos y líquidos con fosfato insoluble

en solución son adecuadas para la detección de microorganismos

solubilizadores. Al respecto, Vazquez et al. (2000}, Da Silva et al. (2008} y

Kaviyarasi et al. (2011} explicaron que la síntesis de ácidos orgánicos es el

principal mecanismo involucrado en la solubilización de fosfatos. Como

consecuencia, en medios sólidos se observa el viraje del indicador y zonas

claras de disolución (Vazquez et al., 2000; Cordero et al., 2008; Carreño,

2009}.

El fósforo solubilizado fue cuantificado por el método calorimétrico del

molibdato, donde en solución ácida los iones ortofosfato, producto de la

solubilización del fosfato di o tricálcico reaccionan con los iones molibdato,

formando ácido molibdofosfórico. Éste, reducido en presencia de ácido

ascórbico forma azul de fosfomolibdeno, cuya coloración es acelerada con el

catalizador emético y su intensidad es susceptible de una determinación

calorimétrica (Rodier & Rodi, 2005; Bobadilla & Rincón, 2008}. Se cuantificó

hasta 7,31 ppm de fósforo solubilizado, valor inferior al rango 10 - 14 ppm

alcanzado por aislados de maíz (Cadena & Martínez, 2011 }, malezas (Barba &

Bravo, 2013} y piñon blanco (Dávila & Linares, 2013}.

Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas evidenciaron ser diazótrofos

por una película blanquecina bajo la superficie del medio Nfb sin nitrógeno y

con ácido málico como fuente de carbono. Según Mantilla (2007}, Franco

(2008} y Reyes et al. (2008} la consistencia semisólida permite el crecimiento y

desplazamiento de bacterias hacia la zona donde la tasa de respiración está en

equilibrio con la tasa de difusión del oxígeno y se mantienen las condiciones de

microaerofilia, requeridas para la actividad de la nitrogenasa. También se

puede observar el viraje del indicador, debido a la alcalización por la actividad

60

metabólica de la película bacteriana, con utilización del ácido málico y

transformación a malato (Ruiz et al., 2000).

El amonio fue cuantificado por el método Berthelot, basado en la aparición

de un azul intenso de indofenol, producto de la reacción del ión amonio con los

compuestos fenólicos, en presencia del oxidante hipoclorito de sodio y un

catalizador como el nitroprusiato de sodio o el ferrocianato de potasio

(Lara et al., 2007). En el presente estudio se cuantificó hasta 26,78 ppm,

superando 11 - 25 ppm registrados con aislados de maíz (Cadena & Martínez,

2011 ), malezas (Barba & Bravo, 2013) y piñon blanco (Dávila y Linares, 2013).

Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas presentaron efecto antagónico

a Fusarium sp. y Rhizoctonia solani. De igual manera, se demostró

antagonismo frente a Fusarium oxysporum (Trujillo et al., 2007), F. vertici/loides

(Barba & Bravo, 2013), Fusarium sp. (Toledo et al., 2002), Rhizoctonia solani

(Ahmadzadeh & Tehrani, 2009) y otros fitopatógenos como

Phytophthora infestans (Torres et al., 2000) Pythium sp. (Pérez et al., 2000),

Alternarla altemata y Curvularia sp. (Trujillo et al., 2007), Pyricularia grisea

(Rives et al., 2009) y Botrytis cinerea (Sang et al., 2010).

El efecto antagónico de Burkholderia y Pseudomonas resulta de la

expresión de múltiples mecanismos, como la producción de antibióticos

(Spadden, 2007), sideróforos (Torres et al., 2000; Hemández et al., 2004;

Rives et al., 2008), cianuro de hidrógeno, antibióticos, proteasas (Ahmadzadeh

& Tehrani, 2009) e inducción de resistencia sistémica en las plantas

(Hemández et al., 2004 ).

Las bacterias investigadas afectaron diferencialmente el poder

germinativo de tomate, con incremento, disminución o ningún efecto, respecto

al testigo, coincidiendo con Barba & Bravo (2013), quienes observaron este

efecto en maíz. También se ha reportado en la emergencia de algodón

(Salaheddin et al., 2010), maíz (Cadena & Martínez, 2011) y piñon blanco

(Dávila & Linares, 2013).

El 37,5% de las bacterias nativas incrementaron el poder germinativo de

tomate, resultado explicado por la activación de los procesos metabólicos de

61

las semillas, como producto de la secreción bacteriana de sustancias

estimuladoras como las giberelinas, encargadas de activar la síntesis de

enzimas hidrolíticas en el endospermo {Torres et al., 2013). En este contexto,

las a amilasas promueven la germinación, porque incrementan la disponibilidad

del almidón {Bharathi et al., 2004 ).

En semillas de maíz, García et al. {2004) observaron efecto estimulatorio

de filtrados de cultivos libres de células de Azospirillum lipoferum, A. brasilense

y Azotobacter beijerinckii, tal que la germinación se inició a los 5 - 6 días con

los filtrados, así como también con 50 ppm de AlA, en comparación con

7 - 8 días en el testigo de agua destilada. Asimismo, ldris et al. {2004)

observaron elongación en los coleópteros de maíz con filtrados de cultivos de

B. amyloliquefaciens y B. subtilis, comparable con el efecto de

10-6 - 10-7 mol L-1 de AlA; sin embargo, las bacterias sintetizaron

1 o-8 - 1 o-9 mol L-1 de AlA; concluyéndose que el incremento fue resultado de

más de una sustancia promotora del crecimiento.

El 50 % de las rizobacterias disminuyó el poder germinativo. Al respecto,

Stefan et al. {2008) demostraron que en semillas de soya, la actividad de las

enzimas aspartato y alanina amino - transferasa, requeridas para la utilización

de las proteínas como fuentes de carbono y nitrógeno en la germinación, fue

mayor a las 120 horas en las semillas no inoculadas, sugiriéndose que debido

a la competencia por nutrientes entre semillas y bacterias, la germinación

disminuye.

El efecto negativo de las PGPR ha sido reportado también en las

características vegetativas. De esta manera, Rico (2009), demostró que los

metabolitos volátiles de Azotobacter spp. disminuyeron el peso fresco de

plántulas de lechuga; no obstante, éstos compuestos sintetizados por un

actinomiceto, incrementaron 35 % el peso fresco. Al respecto, Persello et al.

{2003) y Rico {2009) concluyeron . que demasiado AlA, puede afectar

negativamente el desarrollo de las raíces laterales, debido a que las plantas

carecen de un sistema regulador que mantenga los niveles de AlA

fisiológicamente apropiados en sus tejidos, tal que este compuesto bacteriano

62

exógeno, podría anular la síntesis de otros metabolitos de la ruta, inhibiendo el

desarrollo de la planta.

El 12,5 % de las bacterias nativas no afectó la emergencia de piñón

blanco. Al respecto, Díaz et al. (2001), concluyeron que el efecto de las PGPR

no es evidente, cuando no encuentran el hábitat adecuado y no se asocian con

la rizósfera para escapar de los mecanismos de defensa de la planta y

encontrar las condiciones nutritivas propicias para su establecimiento y

crecimiento. También es posible, que las bacterias pierdan viabilidad por el

efecto inhibitorio de las semillas, tal como se demostró con extractos solubles

de maíz que durante la germinación disminuyeron la multiplicación y

establecimiento de Burkholderia cepacia (Velasquez et al., 1999).

Cadena y Martínez (2011) demostraron que el efecto negativo de

Pseudomonas en la emergencia de maíz no estuvo relacionado directamente

con el desarrollo vegetativo, tal que las plantas inoculadas presentaron mayor

altura, longitud de raíces, peso de la biomasa radicular y aérea. Asimismo,

Carrillo et al. (2000) determinaron 54 - 64 % de germinación para semillas de

tomate inoculadas con P. f/uorescens frente al testigo con 67 %; no obstante,

se incrementó la altura de planta y el rendimiento, así como también se

disminuyó el número de días de floración. Por su parte, Díaz et al. (2001)

encontraron que 33 % de cultivos de P. aeruginosa, P. fluorescens y

P. cepacia incrementaron la emergencia de lechuga; sin embargo, 99 % de las

bacterias influenció positivamente el desarrollo vegetativo.

Las especies de Burkholderia y Pseudomonas que presentaron actividad

proteolítica, quitinolítica, sintetizaron ácido indolacético, fijaron nitrógeno,

solubilizaron fósforo e incrementaron la emergencia de tomate son

consideradas bacterias promotoras de crecimiento de las plantas, por lo que se

debe determinar su efecto en tomate, en condiciones de invernadero y

posteriormente en campo, con la perspectiva de obtener un inoculante

comercial.

63

VI. CONCLUSIONES

./ Se aislaron e identificaron Burkholderia y Pseudomonas spp. en el

35,42 % de muestras de rizósfera de tomate .

./ Con las bacterias nativas se cuantificó 0,75 - 26,25 ppm de AlA;

0,42-26,78 ppm de nitrógeno fijado como amonio y 1,53-7,31 ppm de

fósforo solubilizado, así como también se detectó actividad proteolítica,

quitinolítica y antagónica a Fusarium sp. y Rhizoctonia solani .

./ El 37,5 %de las bacterias nativas incrementó el poder germinativo de

tomate cv. 'Río Grande'; el 50% lo disminuyó y el12,5% no lo afectó.

64

VIl. RECOMENDACIONES

./ Caracterizar a nivel molecular P. putida CT7 y CT54,

P. fluorescens CT37 y B. cepacia CT30 .

./ Determinar el efecto de bacterias nativas en el desarrollo vegetativo y

rendimiento del tomate cv. 'Río Grande' en condiciones de campo .

./ Investigar sustratos económicos y disponibles en la región de

Lambayeque para el incremento masivo de Burkholderia y

Pseudomonas spp. caracterizadas como promotoras del crecimiento de

plantas.

65

VIII. RESUMEN

El presente trabajo de investigación se desarrolló con el objetivo de aislar y

determinar el potencial biológico de bacterias nativas de Burkholderia y

Pseudomonas spp. y su efecto en el poder germinativo de

Lycopersicon escu/entum Mili. "tomate", como una alternativa a los fertilizantes

y plaguicidas químicos que causan contaminación ambiental. Las bacterias

fueron aisladas de muestras de suelo rizosférico de tomate procedentes del

distrito de Reque (6° 52' 00" y 6° 48' 5" de latitud sur y los meridianos

79° 49' 27" y 79° 44' 59" de latitud oeste), región Lambayeque. Se realizaron

diluciones (1 o-2) en solución salina esterilizada (0,87 % NaCI, p/v), se tomaron

alícuotas y se cultivaron en agar Mac Conkey a 30 oc, por 48 horas,

seleccionándose las colonias no fermentadoras de la lactosa, con actividad

oxidasa. El 44,07 %de bacterias fue identificado como Burkholderia y 40,68%

como Pseudomonas. Con las bacterias nativas se cuantificó 0,75-26,25 ppm

de AlA; 0,42- 26,78 ppm de nitrógeno fijado como amonio y 1,53-7,31 ppm

de fósforo solubilizado, así como también se detectó actividad proteolítica,

quitinolítica y antagónica a Fusarium sp. y Rhizoctonia so/ani. El37,5% de las

bacterias nativas incrementó el poder germinativo de tomate cv. 'Río Grande';

el 50 % disminuyó y el 12,5 % no lo afectó. Las bacterias caracterizadas como

promotoras del crecimiento de plantas fueron identificadas como P. putida CT7

y CT54, P. f/uorescens CT37 y B. cepacia CT30. Se demostró la posibilidad de

utilizar Burkholderia spp. y Pseudomonas spp. nativas como promotoras del

crecimiento en maíz.

66

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74

X. ANEXOS

75

ANEXO 1

Cálculo del número de muestras para el aislamiento de Burkholderia y Pseudomonas spp. (en Alvitres, 2000)

Donde:

n= (1,96) 2 (0,80)(0,20)

(0,08) 2

n = 96,04

n = 96 muestras de suelo rizosférico de tomate para el

aislamiento de Burkholderia y Pseudomonas spp.

n = tamaño de muestra

z = 1 ,96 (a = 0,005); valor estándar

p = tasa de prevalencia (0,80) presencia de Burkholderia y Pseudomonas spp. en rizósfera de tomate

q = 34tasa de ausencia 1 - p: (0,20)

t = error permitido (0,08)

76

ANEX02

Medios de cultivo para el aislamiento e identificación de

Pseudomonas spp. (en Cadena y Martínez, 2011)

a. Agar Mac Conkey

Componentes g/L

Peptona de caseína 17,0

Peptona de carne 3,0

Cloruro de sodio 5,0

Lactosa 10,0

Sales biliares 1,5

Rojo neutro 0,03

Cristal violeta 0,001

Agar-agar 13,5

Agua destilada en cantidad suficiente 1 L

b. Agar tripticasa soya

Componentes g/L

Triptona 15,0

Peptona 5,0

Extracto de levadura 3,0

Glucosa 5,0

Cloruro sódico 5,0

Agar 15,0


n

ANEXO 3

Medios de cultivo para la detección in vitro de proteasas y quitinasas

a. Agar leche 1 % (en Ríos y Zuñiga, 2013)

Componentes

Triptona

Extracto de levadura

Glucosa

Agar agar

Leche evaporada

Agua destilada

b. Agar quitina coloidal 1% (en Franco, 2008)

Componentes

Solución Stock K2HP04 3 % (p/v)

Solución Stock MgS04 7H20 1.5 % (p/v)

g/L

5,0

2,5

1,0

15,0

10mL

980mL

g/L o mUL

10,0 mL

10,0 mL

Solución Stock (CaCI2 0,5 %,FeCb 0,06 %, NaCI 0,5 % p/v) 10,0 mL

Quitina coloidal

Agaragar

1,0 g

10 (p/v)

15,0

Mezclar los componentes y llevar a volumen con agua destilada,

calentar al fuego durante 5 minutos para disolver las sales, ajustar el pH a

6,8. Autoclavar (15 lb y 121 °C). Servir en placas de Petri esterilizadas.

78

b.1 Obtención de la quitina de camarón por hidrólisis ácida (en Rosas, et

al, 2001, modificado por los autores)

Secar a temperatura ambiente {25 OC) 20 g de caparazones de

Astacus serratus "camarón" (Figura 44) previamente lavados con agua

corriente y agua destilada para eliminar los restos orgánicos. Después, moler

los caparazones y depositar 1 O g del material obtenido en 1 00 ml de H3P04 al

85 %, reposar 24 h a temperatura ambiente {Figura 45), agitando

eventualmente para disminuir la espuma. Agregar agua destilada hasta

obtener una suspensión en la que precipiten los gránulos de quitina. Filtrar con

cuatro capas de gasa {Figura 46). Eliminar el material retenido y centrifugar el

filtrado a 2500 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante y verter el

sedimento en una placa de Petri (Figuras 47, 48). Neutralizar la acidez con

NaOH al 20 %, hasta alcanzar un pH 7. Agregar alcohol etHico 96 % y

deshidratar en la estUfa a 30 OC y mantener en refrigeración {8 °C).

Fundamento

Los caparazones contienen gran cantidad de proteínas y carbonato de

calcio, que envuelven las microfibrillas de quitina. Estructuralmente la quitina

es un mucopolisacárido, insoluble en solución acuosa, que presenta una

estructura lineal compuesta de unidades repetitivas de

N-acetii-D-glucosamina {GicNAc), unidas por enlace glícosidicos del tipo

B-{1--A). El tratamiento de los caparazones de crustáceos, consiste

principalmente en la desmineralización, con la que se eliminan los minerales

como el carbonato de calcio. El peso se refleja con ácidos diluidos,

acompañado de la eliminación de proteínas o desproteinización, con una

solución alcalina caliente, por lo general, de hidróxido de sodio o potasio al

10%.

79

Figura 44. Caparazón molido de Astacus se"atus "camarón".

Figura 45. Caparazón molido en 100 ml de H3P04 al 85 %.

80

Figura 46. Filtración de suspensión obtenida con agua destilada.

Figura 47. Sedimento obtenido luego de la centrifugación.

81

Figura 48. Quitina deshidratada.

82

ANEX04

Detección y cuantificación de ácido indolacético producido in vitro

mediante la reacción calorimétrica de Salkowski (en Mantilla, 2007;

García y Muñóz, 2009)

a. Caldo tripticasa soya (g/L) suplementado con triptófano

Componentes g/L

Peptona de caseína 17,0

Peptona de harina de soya 3,0

D (+) Glucosa (o dextrosa) 2,5

Cloruro de sodio 5,0

Fosfato dipotásico 2,5

Triptófano 0,01


Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 7,3.

b. Reactivo de Salkowski

Componentes

Agua destilada

Ácido sulfúrico concentrado

Cloruro de fierro 0,5 M en agua destilada

g/L

250,0

150,0

7,5

La solución de cloruro de fierro 0,5M se obtiene al mezclar 1,61 g de cloruro de fierro (FeCb) con 20 ml de agua destilada. Realizar la mezcla bajo el chorro de agua

83

c. Procedimiento para elaborar la curva de calibración para cuantificar ácido indolacético (en Mantilla, 2007)

c.1 Fundamento de la reacción de Salkowski

Por la reacción de Salkowski se detectan grupos indol presentes en el medio

y la concentración de indol es directamente proporcional a la intensidad de

color rojo producido. A su vez, el cambio de color es el resultado de una

reacción oxidativa con el ácido sulfúrico, donde por medio de una

transaminación un grupo amino es sustituido por el cloro proveniente del

FeCb, originando un compuesto visible de color rosado a rojo en el caso del

indolacético. Otras coloraciones indican la presencia de productos

intermedios de la síntesis del ácido indolacético, que pueden ser generados a

partir del triptófano.

c.2 Preparación de diluciones a partir de una solución madre de AlA

Para obtener una curva patrón de ácido indolacético, preparar una solución

madre de 100 IJg. ml-1, para lo cual se pesan 1 O mg de ácido indolacético y

se disuelven con unas gotas de Na OH en un matraz aforado a 1 00 ml. A

continuación enrasar con agua bidestilada y agitar hasta homogenizar.

No de tubo Solución patrón H20 bidestilada Concentración

(1 00 IJgmL-1) [IJ L] AlA (mgl- 1)

01 o 1000 o 02 20 980 2 03 40 960 4 04 60 940 6 05 80 920 8 06 100 900 10 07 150 850 15 08 200 800 20 09 300 700 30 10 400 600 40 11 500 500 50 12 600 400 60

Posteriormente se realizan las s1gu1entes d1luc1ones:

*1000 IJL = 1 ml

84

c.3 Procedimiento para la cuantificación de AlA por colorimetría

Obtenidas las concentraciones parciales de AlA extraer de cada

tubo 1 ml de solución, verter en tubos de 13 x 75 mm y agregar 4 ml

de reactivo de Salkowski (1 :4). Dejar en reposo en oscuridad por 30

minutos. Observar la presencia de una coloración rojiza en los tubos. A

continuación, leer la absorbancia de cada dilución en espectrofotómetro

a 530 nm.

Una vez obtenida la absorbancia en todas las concentraciones de

ácido indolacético, corregir los valores y mediante regresión lineal en el

programa Microsoft Excel 2007, obtener la ecuación de la recta y el

coeficiente R2 que deberá ser mayor a 0,9 para demostrar una

dispersión homogénea de los valores sobre la recta.

N°tubo PJA (pg/ml) Absorbancia

1 o 0,000

2 2 0,013

3 4 0,023

4 6 0,034

5 8 0,043

6 10 0,060

7 15 0,087

8 20 0,110

9 30 0,141

10 40 0,202

11 50 0,229

12 60 0,273

85

Una vez obtenida la absorbancia de las doce concentraciones de ácido

indol acético, introducir los datos en el programa Microsoft Office Excel 2007

y construir la curva patrón de calibración:

0.250

~ 0.200 u e ca -e 0.150 ti .a e( 0.100

0.050

0.000 ~

o

En la ecuación obtenida:

Donde:

20 40 60 AlA ug/ml

y= 0.004Sx+ 0.0089 R2 = 0.9931

80

y= 0.0045 X+ 0.0089

y. representa la absorbancia captada (variable dependiente)

x: acido indolacético en ppm (variable independiente)

Despejar "x' para obtener la cantidad de acido indolacético (ppm) producido

por cada bacteria nativa.

X y- 0.0089

0.0045

86

ANEXOS

Detección y cuantificación de nitrógeno fijado in vitro mediante el

método indirecto de valoración del ión amonio empleando la técnica

calorimétrica de Berthelot (fenolhipoclorito)

a. Medios de cultivo (en García & Muñoz, 2009)

a.1 Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol, NFB

Componentes g/L

Ácido málico 5,0

KOH 4,0

K2HP04 0,5

FeS04.?H20 Trazas

MnS04.?H20 0,01

MgS04.?H20 0,01

NaCI 0,02

CaCI2 0,01

Na2Mo04 0,002

Azul de Bromotimol (0,5 % p/v en etanol) 2,0 ml

Biotinol 0,5 ml

Agua destilada en cantidad suficiente 1000 ml

Ajustar el" pH a 6,8-7,0 con NaOH. Para obtener medio semisólido

añadir 2 g de agar agar. Para medio sólido añadir 20 mg de extracto de

levadura y 15 g de agar.

87

a.2 Agar nutritivo (AN)

Componentes

Peptona

Extracto de carne

Agar- agar

Agua destilada en cantidad suficiente

a.3 Caldo extracto de suelo al 1 O %

Componentes

K2HP04

MgCI2

MgS04.1H20

FeCI3

CaCI2

Triptona

Extracto de levadura

Extracto de suelo al 1 O %

Agua destilada

g/L

5,0

3,0

15,0

1000 ml

g/L

0,4

0,1

0,05

0,01

0,1

1,0

1,0

250ml

750ml

Ajustar a pH 7 ,4. Para obtener extracto de suelo al 1 O %, depositar

en un matraz 250 g de suelo agrícola y 500 ml de agua destilada. Hervir

2 horas, completar a 500 ml con agua destilada y filtrar el sobrenadante.

Tomar 25 ml del filtrado y completar a 500 ml con agua destilada.

88

b. Reactivos (en García y Muñoz, 2009)

• Cloruro de potasio 2M

Cloruro de potasio 149,12 g

Agua destilada 1000 ml

• Solución alcohólica de fenol 1 O %

Fenol concentrado 10ml

Alcohol 97° 90ml

• Nitroprusiato de sodio 0,5%

Nitroprusiato de sodio 0,5 g

Agua destilada 100ml

• Solución oxidante

Citrato de sodio 20g

Hidróxido de sodio 1 g

Hipoclorito de sodio 5 % (lejía comercial) 2ml

Agua destilada 98ml

c. Procedimiento para elaborar la curva de calibración para cuantificar

el ión amonio (Lara eta/., 2007)

c.1 Fundamento del método calorimétrico de Berthelot (fenolhipoclorito)

Se basa en la formación de un color azul intenso de indofenol, que

resulta de la reacción del ión amonio (NH4) con los compuestos fenólicos en

presencia de un agente oxidante el cual puede ser hipoclorito de sodio u o

fenilfenol; y la presencia de un catalizador, principalmente nitroprusiato de

sodio o ferrocianato de potasio. El mecanismo de la reacción depende de la luz

presente, la temperatura ambiente, catalizadores y pH alcalino. Cuando se

89

utiliza fenol o hipoclorito de sodio la reacción puede ser representada de la

siguiente manera:

c.2 Preparación de diluciones a partir de una solución madre de NH4CI

Para obtener la curva patrón se prepara una solución madre de 1 00

ppm de NH4CI, para lo cual se pesa O, 1 g de NH4CI y se disuelve en 1 L de

agua bidestilada. Posteriormente, a partir de la solución madre se efectúan

las siguientes diluciones:

No de tubo Solución patrón H20 bidestilada Concentración

[ml] [ml] ~CI

01 0,0 10 o 02 0,2 9,8 2 03 0,4 9,6 4 04 0,6 9,4 6 05 0,8 9,2 8 06 1,0 9,0 10 07 1,5 8,5 15 08 2,0 8,0 20

c.3 Procedimiento para la cuantificación de amonio por colorimetría

Obtenidas las diluciones, agregar a cada tubo 0,4 ml de solución

alcohólica de fenol al 1 O %; 0,4 ml de nitroprusiato de sodio al 0,5 % y 1 ml

de solución oxidante, luego agitar para mezclar y dejar en reposo durante 1

hora. Observar una coloración que varia del verde azul al azul intenso en

función de la concentración de amonio. Leer la absorbancia de cada dilución

en el espectrofotómetro a 632,9 nm.

Una vez obtenida la absorbancia de todas las concentraciones de

amonio, corregir los valores y mediante regresión lineal con el programa

Microsoft Excel 2007, obtener la ecuación de la recta y el coeficiente R2 que

deberá ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersión homogénea de los

valores sobre la recta.

90

N°tubo NH4100 (ppm) Absorbancia Absorbancia corregida

01 o 0,058 0,000

02 2 0,199 0,141

03 4 0,311 0,253

04 6 0,480 0,422

05 8 0,576 0,518

06 10 0,619 0,561

07 15 0,884 0,826

Una vez obtenida la absorbancia de las siete concentraciones de

amonio, introducir los datos en el programa Microsoft Office Excel 2007 y

construir la curva patrón de calibración:

0.9

0.8

0.7

.!!! 0.6 CJ

:; 0.5 .e ~ 0.4 .e <C 0.3

~

0.2

0.1 o ..

o

.~.

5 10 15 NH4100 ppm

20

= 0.0544x + 0.0387 R2 = 0.9829

91


y = 0.0544 X + 0. 0387

Donde:

y: representa la absorbancia captada (variable dependiente)

x: cantidad de amonio en ppm (variable independiente)

Despejar "x' para obtener la cantidad de amonio (ppm) fijado por cada

bacteria nativa.

y-0.0387 x= 0.0544

92

ANEXOS

Detección y cuantificación de fósforo solubilizado in vitro

a. Agar Sundara Rao Sin ha SRSM (en Vásquez et al., 2000)

Componentes giL

Glucosa 10,0

Fosfato tricálcico Ca3(P04)2 5,0

Sulfato de amonio (NH4)2S04 0,5

Cloruro de potasio (KCI) 0,2

Sulfato de magnesio (MgS04. 7H20) 0,3

Sulfato de manganeso (MnS04. 7~0) 0,004

Sulfato de fierro (FeS04. 7~0) 0,002

Cloruro de sodio (NaCI) 5,0

Extracto de levadura 0,5

Púrpura de bromocresol 0,1

Agar agar 15

Agua destilada en cantidad suficiente 1000 ml

pH 6,8

Como fuente de fosfato se puede usar fosfato bicálcico (1 g/L de

fósforo), fosfato tricálcico (1 g/L de fósforo) y roca fosfórica (0,2 % de

fósforo).

b. Método calorimétrico del Molibdato para cuantificar fósforo soluble

(Rodier y Rodi, 2005)

b.1 Fundamento

En medio ácido y en presencia de molibdato amónico, los

ortofosfatos forman un complejo fosfomolíbdico que, reducido por el

ácido ascórbico, desarrolla una coloración azul susceptible de una

determinación calorimétrica y cuya aparición se acelera utilizando el

catalizador emético, tartrato doble de antimonio y potasio.

93

b.2 Limpieza de los recipientes de vidrio

Para la limpieza del material de vidrio no utilizar detergentes que

contengan fosfato. Lavarlos con ácido clorhídrico diluido y enjuagarlos

cuidadosamente con agua destilada.

b.3 Reactivos

• Solución de ácido sulfúrico 5 N

Ácido sulfúrico (d=1 ,8)

Agua destilada hasta enrase

• Solución de molibdato amónico 4 %

• Solución de ácido ascórbico

Ácido ascórbico

Agua destilada hasta enrase

• Solución de emético

14 ml

100 ml

20 ml

1,76 g

100 ml

Tartrato doble de antimonio y potasio 0.0274 g

Agua destilada hasta enrase 100 ml

• Reactivo para determinación de ortofosfatos

Ácido sulfúrico 5 N 40 ml

Solución de molibdato amónico 12 ml

Solución de ácido ascórbico 24 ml

Solución de emético 4 ml

• Solución madre de 0,2 mgl-1 de fósforo

Fosfato monopotásico previamente desecado

en estufa a 100 °C: 877 g

Agua destilada hasta enrase 100 ml

• Solución hija de 2 mgl-1 de fósforo

Diluir 1 ml de solución madre en 99 de agua destilada (1/100)

94

b.4 Preparación de la curva de calibración

Colocar en una serie de matraces aforados de 25 mL:

Número de matraces T 11 11

Solución salina de fósforo de 2 mgL-1 (mL) o 1 2 5 Agua bidestilada (mL) 20 19 18 15

Reactivo indicador (mL) 4 4 4 4

Agua destilada hasta enrase (mL) 25 25 25 25

Correspondencia de fósforo en mgL-1 o 0,1 0,2 0,5

Esperar 20 minutos y efectuar las lecturas en el espectrofotómetro a

la longitud de onda de 690 nm en cubetas de 1 O cm. Construir la curva

de calibración. Los datos de la absorbancia corregida se analizan

mediante regresión lineal con el programa Microsoft Excel 2007 para

obtener la ecuación de la recta y el coeficiente R2 que deberá ser mayor

a 0,9 para demostrar una dispersión homogénea de los valores sobre la

recta.

b.5 Procedimiento para cuantificar fosfatos en la muestra

Introducir 20 mL de la muestra a analizar en un matraz aforado de

25 ml. Añadir 4 mL de reactivo indicador, completar el volumen a 25 mL

con agua destilada. Esperar 20 minutos y efectuar la lectura en el

espectrofotómetro de luz visible con una longitud de onda de 690 nm.

Tener en cuenta el valor leído para el testigo. Obtener los resultados en

la curva de calibración. Para una muestra de 20 mL la curva indica el

contenido de fósforo expresado en miligramos por litro.

Leer la absorbancia de cada dilución a 690 nm

r de tubo Fosoforo soluble Absorban cía (ppm)

1 0,1 0,077 2 0,2 0,085 3 0,5 0,105

95

Una vez obtenida la absorbancia de las tres concentraciones de fosfato

dicálcico, introducir los datos en el programa Microsoft Office Excel 2007 y

construir la curva patrón de calibración:

0.12

E 0.1

e

~ 0.08 -CD ni

-~ 0.06 111 e ni .o ~ 0.04

.o <( 0.02

o o 0.1

--

0.2 0.3 0.4

Fósoforo (ppm)

0.5 0.6

+ Absorbancia

-Lineal (Absorbancia}

y = 0.0692x + 0.0705 R2 =0.9985


y = O, 069 X + 0,0705

Donde:

y: representa la absorbancia captada (variable dependiente)

x: cantidad de fósforo en ppm (variable independiente)

Despejar "x' para obtener la cantidad de fósforo (ppm) fijado por cada bacteria

nativa.

X = (y - 0,0705 ) / 0, 069

96

ANEX07

Agar papa dextrosa, PDA (g/L) para aislamiento de hongos

fitopatógenos (en Delgado y Ramos, 2009)

Componentes

Papa

Dextrosa

Agar- agar

Agua destilada en cantidad suficiente

g/L

250

20

20

1 L

Hervir 250 g de papas (peladas y picadas) en 500 ml de agua

destilada durante 20 minutos. Completar a 500 con agua destilada. Filtrar a

través de una gasa. Recepcionar el filtrado en un vaso de precipitación y

añadir 20 g de dextrosa y 20 g de agar disuelto en 500 ml de agua (baño

maria). Completar a 1 litro con agua destilada y distribuir en matraces.

Esterilizar a 151ibras de presión, 121°C durante 20 minutos.

97

ANEXOS

Absorbancia (530 nm) de caldo Tripticasa Soya suplementado con triptófano y cultivado con Burkholderia y Pseudomonas spp. durante

7 días

CÓDIGO Absorbancia CÓDIGO Absorbancia UNPRG (530 nm) UNPRG (530 nm)

CT50 0.420 CT8 0.067

CT30 0.166 CT42 0.067

CT13 0.102 CT7 0.065

CT38 0.083 CT16 0.065

CT12 0.080 CT40 0.065

CT37 0.080 CT2 0.064

CT39 0.074 CT5 0.061

CT41 0.073 CT9 0.061

CT34 0.072 CT31 0.058

CT52 0.071 CT55 0.058

CT17 0.070 CT59 0.058

CT14 0.069 CT20 0.055

CT25 0.069 CT26 0.055

CT11 0.068 CT54 0.054

CT51 0.068

98

ANEX09

Detección de fijación de nitrógeno por cepas nativas de Burkholderia y Pseudomonas spp. en agar Nfb semisólido

CÓDIGO Fijación

CÓDIGO Fijación

CÓDIGO Fijación

UNPRG de

UNPRG de

UNPRG de

Nitrógeno Nitrógeno Nitrógeno

CT1 Negativo CT21 Positivo CT41 Positivo

CT2 Positivo CT22 Negativo CT42 Positivo

CT3 Positivo CT23 Positivo CT43 Negativo

CT4 Positivo CT24 Positivo CT44 Positivo




CT8 Negativo CT28 Negativo CT48 Positivo



CT11 Negativo CT31 Negativo CT51 Negativo


CT13 Negativo CT33 Positivo CT53 Negativo


CT15 Positivo CT35 Negativo CT55 Negativo





CT20 Negativo CT40 Positivo

99

ANEX010

Absorbancia (639,2 nm) de medio libre de nitrógeno cultivado con

Burkholderia y Pseudomonas spp. durante 7 días.

CODIGO Absorbancia CODIGO Absorbancia

UNPRG (639,2 nm) UNPRG (639,2 nm)

CT54 1.860 CT24 0.746

CT7 1.592 CT49 0.739

CT16 1.387 CT19 0.725

CT27 1.308 CT21 0.714

CT9 1.05 CT6 0.698

CT42 1.001 CT45 0.585

CT56 0.938 CT12 0.541

CT57 0.911 CT15 0.524

CT2 0.897 CT29 0.505

CT41 0.889 CT36 0.487

CT59 0.868 CT44 0.484

CT58 0.841 CT40 0.473

CT10 0.833 CT52 0.437

CT5 0.807 CT4 0.426

100

ANEX011

Detección de solubilización de fósforo por cepas nativas de Burkholderia y Pseudomonas spp. en agar SRSM por el viraje del

indicador al amarillo y la presencia de halos translúcidos

CODIGO Solubilización CODIGO Solubilización CODIGO Solubilización UNPRG· de fósforo UNPRG de fósforo UNPRG de fósforo





CT5 Positivo CT25 Positivo CT45 Negativo



CTB Negativo CT28 Negativo CT48 Positivo



·CT11 Negativo CT31 Negativo CT51 Negativo









CT20 Negativo CT40 Positivo

101

ANEX012

Absorbancia (690 nm) en caldo SRSM cultivado con Burkholderia y Pseudomonas spp. durante 10 días

CÓDIGO Absorbancia UNPRG (690 nm)

CT7 0.970

CT9 0.802

CT13 0.763

CT52 0.726

CT25 0.709

CT37 0.651

CT5 0.609

CT38 0.589

CT40 0.566

CT24 0.565

CT26 0.565

102

ANEXO 13

Número de semillas de Lycopersicon esculentum Mill."tomate"

germinadas por efecto de Burkholderia y Pseudomonas spp. nativas

durante 7 días

Número de semillas germinadas T ratanie ntos

r1 r2 r3

Pseudomonas sp. CT7 30 31 32

Burkho/deria sp. CT9 29 30 28

Burkholderia sp. CT13 29 28 30






Testigo caldo nutritivo 30 28 28

Testigo agua destilada 28 30 31

103

ANEX014

Número de plántulas normales de Lycopersicon esculentum

Mill."tomate" germina.das por efecto de Burkholderia y

Pseudomonas spp. nativas durante 7 días

Número de plántulas normales T ratarrientos

r1 r2 r3

Pseudomonassp.CT7 29 28 32








Testigo caldo nutritivo 29 25 26

Testigo agua destilada 25 26 29

104

l!J u C¡4' PEDRO RUIZ GA~LO

Documents

Transcript of l!J u C¡4' PEDRO RUIZ GA~LO