Inhoudstafel - biblio.ugent.be sequencing 127 ... Allereerst wens ik mijn promotor Prof. Dr. J. Van...

Inhoudstafel

Inhoudstafel

Dankwoord Inleiding en situering 1 Hoofdstuk 1. Overzicht van bacteriële ijzer-zwaveleiwitten Inleiding 6 IJzer-zwaveleiwitten 7 ‘Eenvoudige’ ijzer-zwaveleiwitten 8 Rubredoxinen 8 2Fe-2S Ferredoxinen 11 4Fe-4S Ferredoxinen 15 3Fe-4S Ferredoxinen 17 ‘Complexe’ ijzer-zwaveleiwitten 18 Constructie van een ijzer-zwavelcluster 21 Referenties 24 Hoofdstuk 2. Hoge potentiaal ijzer-zwaveleiwitten Inleiding 31 HiPIP versus ferredoxine: de ‘Three state hypothesis’ 33 Verband tussen tyrosine en hoge redoxpotentiaal? 34 Ruimtelijk structuur en alignatie 36 HiPIP groep 1 38 HiPIP groep 2 38 HiPIP groep 3 38 HiPIP groep 4 41 HiPIP groepen 5 en 6 41 HiPIP in dimere vorm? 41 Biologische rol van HiPIP 42 Referenties 48 Hoofdstuk 3. Chemische en massaspectrometrische aminozuurvolgordebepalingen Inleiding 55 Chemische aminozuurvolgordebepaling Principe 56 Instrumentatie 59 ‘Biologische’ massaspectrometrische technieken Principe van ‘electrospray’ ionisatie massaspectrometrie Ionisatie 60 Massa-analyse 61 Electrosprayionisatie massaspectrometrische aminozuurvolgordebepalingen 65 Instrumentatie 72 Referenties 73

Inhoudstafel

Hoofdstuk 4. Primaire structuurbepaling van HiPIP sequenties Inleiding 81 Materiaal 82 Aminozuurvolgorde van Allochromatium warmingii HiPIP 83 Aminozuurvolgorde van Thiocystis violacea HiPIP 86 Aminozuurvolgorde van Isochromatium buderi HiPIP 88 Aminozuurvolgorde van Halochromatium salexigens HiPIP 90 Aminozuurvolgorde van Thiocapsa sp., stam CAU 94 Aminozuurvolgorde van Rhodopseudomonas cryptolactis HiPIP 97 Bijkomende tabellen 99 Allochromatium warmingii 100 Thiocystis violacea 102 Isochromatium buderi 103 Halochromatium salexigens 105 Thiocapsa sp., stam CAU 107 Rhodopseudomonas cryptolactis 107 Hoofdstuk 5. The primary structure of Rhodoferax fermentans high-potential iron-sulfur protein, an electron donor to the photosynthetic reaction center Summary 110 Introduction 110 Material and Methods Protein modification 111 Enzymatic digests 111 Protein and peptide purification 111 Sequence analysis 111 Mass analysis 111 Computer graphics 112 Results and discussion Sequence evidence 112 Comparison with other HiPIPs 114 References 119 Hoofdstuk 6. Mass spectrometric identification of in vivo carbamylation of the amino terminus of Ectothiorhodospira mobilis high-potential iron-sulfur protein, isozyme 1 Summary 125 Introduction 125 Material and Methods Isolation and purification of HiPIP 126 Removal of the iron-sulfur cluster and protein modification 126 Digestions of HiPIP and peptide purification 126 N-terminal sequencing 127 Mass spectrometry 127

Inhoudstafel

Peptide synthesis 127 Carbamylation of test peptides 127 Results and Discussion Detection of the modification 127 Location of the modification 129 Type of modification 131 Conclusion 134 References 135 Hoofdstuk 7. Amino acid sequences and distribution of high potential iron-sulfur proteins that donate electrons to the photosynthetic reaction center in purple phototrophic bacteria Summary 139 Introduction 139 Material and Methods Materials 141 Removal of iron and modification of the apoprotein 141 Enzymatic digestions 141 Peptide and protein purifications 141 N-terminal sequence and amino acid composition analysis 142 C-terminal analyses 142 Mass analyses 142 Overall sequence strategy 142 Results Distribution of redox proteins 143 Sequence determination 145 HiPIP sequences 146 Discussion Electron transfer protein distribution 153 HiPIP sequence comparisons 154 Conserved residues 156 References 159 Hoofdstuk 8. The primary structure of rubrerythrin, a protein with inorganic pyrophosphatase activity from Desulfovibrio vulgaris. Comparison with hemerythrin and rubredoxin Summary 167 Introduction 167 Methods Preparation of the rubrerythrin 168 Preparation and purification of peptides 168 Carboxypeptidase treatment 169 Chemical modification of peptides 169 Sequence analysis and amino acid analysis 169 Mass analysis 169 Results 171

Inhoudstafel

Discussion 174 References 178 Supplemental material Sequence analysis of the native protein 180 Peptides from cyanogen bromide cleavage 180 Peptides from the partial acid hydrolysis 180 Peptides from the digest with S. aureus protease 181 Peptides from the Lys-C endoproteinase digests 182 C-terminal sequence evidence 183 Samenvatting en Besluit Primaire structuurbepalingen 190 Klassificatie van de familie der HiPIP’s 191 Aanwijzingen voor het interactiegebied van HiPIP’s met het fotosynthetisch reactiecentrum tijdens de bacteriële fotosynthese 191 Appendix A: Aminozuren en hun residuële massa’s i Appendix B: Gekende post-translationele modificaties ii Appendix C: Bacteriële species en hun afkortingen iv Appendix D: Lijst der afkortingen vi Appendix E: Publicatielijst vii

DANKWOORD Hier is het dan, mijn proefschrift! Het opzetten en uitvoeren van het onderzoek en het schrijven van dit proefschrift was onmogelijk geweest zonder de hulp van de anderen. Zonder de illusie te hebben volledig te kunnen zijn wil ik een aantal mensen bedanken voor hun bijdrage. Allereerst wens ik mijn promotor Prof. Dr. J. Van Beeumen te danken voor de mogelijkheid die hij mij geboden heeft om dit onderzoek te doen in het Laboratorium voor Eiwitbiochemie en Eiwitengineering, maar ook voor zijn vertrouwen om dit onderzoek te mogen doen, niet alleen op Hoge-Potentiaal IJzer-Zwaveleiwitten, maar ook op andere eiwitten welke geleid hebben tot diverse publicaties. Mijn dank gaat ook uit naar Dr. B. Devreese voor de jarenlange samenwerking en suggesties op gebied van massaspectrometrie en voor de discussies gedurende en buiten deze onderzoeksperiode. Ik hoop dat wij deze samenwerking nog vele jaren kunnen voortzetten, nu hij stilaan naar de top reikt. Overzeese dank gaat naar Dr. T. Meyer voor het beschikbaar stellen van diverse eiwitten welke in dit onderzoek betrokken zijn, maar ook voor zijn kritische commentaren en suggesties bij het schrijven van publicaties. Yves, Hans en Nico wens ik ook te bedanken voor hun kritische commentaren tijdens het schrijven van dit proefschrift. Filip en Han wens ik te bedanken voor hun geduld, suggesties en hulp tijdens de moeizame kristallisering van Hoge-Potentiaal IJzer-Zwaveleiwitten. Jammer genoeg konden we nog geen 3D-structuur van deze eiwitten bepalen maar ik ben er van overtuigd dat deze structuren zich ooit zullen openbaren, zeker met hun verdere hulp. Ook andere collega’s verdienen hier zeker een vermelding (willekeurig volgorde): Isabel, Frank, Kjell, Bart (Samyn), ………………. en andere collega’s van zesde en zevende verdieping. And last but not least bedank ik natuurlijk mijn ouders voor hun grote steun !

Inleiding en situering

Dit proefschrift richt zich op een bepaalde familie van eiwitten die grotendeels uit

fotosynthetische bacteriën geïsoleerd werden. Lange tijd was voor deze eiwitten de biologische rol onbekend, maar daar is een keerpunt in gekomen. Deze eiwitten nemen voornamelijk een belangrijke plaats met betrekking tot het zgn. fotosynthetisch reactiecentrum van bacteriën waar licht wordt omgezet in metabolische energie nodig voor het fenomeen leven.

Het woord ‘eiwit’ is eigenlijk een synoniem voor ‘proteïne’. Proteïnen zijn biologische

moleculen die bestaan uit een lineaire keten van 20, in de natuur voorkomende, aminozuren die in een welbepaalde volgorde aaneengeregen zijn. Die volgorde, op basis van genetische informatie, is voor elk proteïne verschillend en wordt de ‘primaire structuur’ genoemd (Fig. 1). De aminozuurketens vormen op hun beurt voornamelijk twee verschillende types secundaire structuurelementen. Het eerste is een schroefvormige α-helix. Dergelijk secundair structuurelement wordt gevormd door vorming van een waterstofbrug tussen een carbonylgroep van een peptidebinding en een aminogroep van het aminozuur dat vijf plaatsen verder gelegen is (n+4). Er wordt een rechtsdraaiende helicale structuur gevormd waarbij de zijketens van de individuele aminozuren naar buiten steken. Een tweede manier waarop waterstofbruggen een regelmatige secundaire structuur kunnen vormen is door eventueel verder afgelegen delen van de polypeptideruggengraat bij elkaar te brengen, waarbij een β-vouwbladstructuur ontstaat. Hierbij worden waterstofbruggen gevormd tussen de amino- en carboxylgroep van de polypeptideruggengraat van de β-strengen. Dit kan gebeuren op twee manieren: parallel, met de aminotermini van de polypeptideketens aan dezelfde zijde van het vouwblad, of anti-parallel, met de aminotermini afwisselend aan elke zijde. De ruimtelijke structuren van de eiwitten zijn opgebouwd uit combinaties van alfa-helices, beta-vouwbladstructuren, en korte strengen van aminozuren (‘lussen’). Groepen van deze structuren vormen ‘domeinen’, substructuren van een grotere eiwitmolecule. Domeinen van hetzelfde type, hoewel in detail verschillend, zijn herkenbaar aan het uiteenlopend aantal en de rangschikking van hun componenten, de alfa-helices en beta-vouwbladen. Door die structuur worden welbepaalde aminozuren met een specifieke functionele zijketen op hun plaats gehouden waardoor ze een ‘actief centrum’ vormen. Soms wordt nog een actief chemische groep, ‘prosthetische groep’ genoemd, op bepaalde aminozuren aangebracht, zoals bijvoorbeeld een heem, een ijzer-zwavelcluster, een koperatoom, enz.

Proteïnen die een ijzer-zwavelcluster als actief centrum hebben, beschrijf ik in

Hoofdstuk 1, en ‘hoge-potentiaal ijzer-zwaveleiwitten’ specifiek in Hoofdstuk 2. Om actief te worden moet die keten een welbepaalde driedimensionale structuur aannemen (tertiaire structuur, Fig. 1). Verder moeten de op de juiste wijze opgevouwde proteïnen ook nog op de geschikte plaats in de cel terechtkomen, waar ze hun functie kunnen uitoefenen.

Sommige eiwitten, zoals hemoglobine, bestaan uit meerdere afzonderlijke

polypeptideketens die samen een complex vormen. De vier aparte eenheden die elk op zich al

2

een eiwitsubeenheid vormen, zijn met elkaar geassocieerd en werken in harmonie. Deze associatie noemt men de ‘quaternaire structuur’ (Fig. 1).

Driedimensionale eiwitstructuren kunnen in kaart gebracht worden met een techniek

die ‘X-stralenkristallografie’ genoemd wordt. Om een eiwitstructuur met behulp van deze techniek te karakteriseren moeten we vooreerst een goed geordend kristal van dat eiwit bekomen. Het groeien van een kwaliteitskristal gebeurt nog steeds proefondervindelijk en is relatief moeilijk omdat verschillende parameters het kristallisatieproces kunnen beïnvloeden (pH, type en concentratie aan zout, eiwitconcentratie, type en concentratie aan precipiterend agens). Microscopisch kleine kristallen zijn meestal niet bruikbaar en moeten minstens één à twee millimeter in doorsnede zijn, zodat een bundel röntgenstralen er doorheen kan worden geleid. De geordende atoomreeksen in het kristal verstrooien de röntgenstralen. Met behulp van ingewikkelde berekeningen kunnen we uit die reflectiepatronen de posities van de duizenden individuele atomen in het molecule bepalen wanneer de ‘primaire structuur’ van het eiwit bekend is. Het verband tussen een X-stralendiffractiepatroon en een ruimtelijke structuur van een eiwit kan men op twee manieren bepalen. Ofwel beschikt men over de 3D-structuur van een eiwit die verwant is (‘molecular replacement’ techniek), ofwel lost men het ’faseprobleem’ op via diffractie van de eiwitten na derivatisatie met zware metalen (‘anamolous scattering’). Deze techniek vereist grote hoeveelheden eiwitmateriaal en daarbij spreken we over milligrammen. Tot voor kort hield dit in dat we alleen van die eiwitten de driedimensionale structuur konden bekomen die in de organismen in grote concentratie voorkomen. Tegenwoordig is het ook mogelijk om een gen dat codeert voor het te onderzoeken eiwit in een geschikte bacterie binnen te brengen en eiwitten in overmaat te laten aanmaken met behulp van moleculair biologische recombinant-technieken. Maar ook deze gekloneerde eiwitten moeten we eerst opzuiveren, daarna controleren op hun fysiologische kenmerken, vooraleer tot kristallisatie kan worden overgegaan.

Figuur 1. Overzicht van de stapsgewijze structurele opbouw van één eiwitketen naar een quaternaire structuur.

3

Het aantal gepubliceerde eiwit- en genoomsequenties neemt de laatste twee jaren exponentieel toe, terwijl tegelijkertijd de structurele informatie die we bekomen met behulp van röntgendiffractieanalyse, of met de tweede beschikbare techniek van NMR (Nuclear Magnetic Resonance), nog relatief beperkt is. Als we de statistieken van de databanken mogen geloven kent men momenteel 16 miljoen, uit de baseparen afgeleide, DNA-sequenties (GenBank), 108.903 primaire aminozuursequenties (SwissProt) en 18.093 drie-dimensionale structuren (Brookhaven Protein Databank). Dit betekent dat voor veel gepubliceerde sequenties enkel de lineaire volgorde van de aminozuren beschikbaar is. Eiwitten die gekarakteriseerd zijn door hun eigen primaire structuur – maar met een onbekende driedimensionale opbouw – behoren vaak tot een bepaalde groep of familie waarvan één of meer ruimtelijke structuren gekend zijn. Eiwitdatabanken laten ons toe om gelijkaardige sequentiegedeelten terug te vinden waarvoor in een gegeven eiwitgroep de secundaire structuurelementen nagenoeg identiek zijn, ondanks de grote verschillen in de volledige aminozuursequentie van de eiwitten. Gebaseerd op de similariteit (>50%) tussen een nieuw eiwit en een eiwit uit een structurele gegevensbank kan men met behulp van 'protein modelling' een vrij betrouwbaar ruimtelijke structuur van een nieuw eiwit simuleren.

De biologische functie van een eiwit hangt af van zijn actief centrum in het geheel van

de driedimensionale structuur, en van de interactie van het eiwit met andere moleculen. Omdat eiwitten opgebouwd zijn uit lineaire aaneenschakelingen van aminozuren begint de structurele analyse van een eiwit met de bepaling van de primaire structuur van de polypeptideketen. Ondanks de voordelen van de nieuwe moleculaire kloneringtechnieken en snelle DNA-volgordebepalingen voor eiwitgenen vormen chemische technieken op de eiwitten zelf nog altijd een complementaire aanpak voor biochemici en moleculaire biologen die onderzoek op eiwitten verrichten. De introductie van ‘biologische massaspectrometrie’ voor de analyse van eiwitten en peptiden, ongeveer tien jaren geleden, zorgde niet alleen voor een zeer nauwkeurige bepaling van het moleculair gewicht van eiwitten, maar ook voor een belangrijke vooruitgang op het gebied van gevoeligheid, snelheid en efficiëntie voor de identificatie van gemodificeerde aminozuren die niet uit de gensequenties afgeleid kunnen worden. Deze technieken worden kort in Hoofdstuk 3 besproken. De toepassing van eiwitchemische en massaspectrometrische technieken voor primaire structuurbepaling van ‘hoge-potentiaal ijzer-zwaveleiwitten’ (HiPIP) beschrijf ik in Hoofdstuk 4.

In Hoofdstukken 5, 6 en 7 bespreek ik de primaire structuur van HiPIP’s geïsoleerd uit verschillende fotosynthetische bacteriën. De volledige primaire structuurbepaling van deze eiwitten wordt aangegeven, waarbij aan de massaspectrometrische analysen een belangrijke rol toebedeeld werd in de identificatie van gemodificeerde aminozuren, zoals o.m. de carbamylatie van het amino-terminus van Ectothiorhodospira mobilis HiPIP (Hoofdstuk 7), of van kleine variaties in de primaire structuur (Hoofdstukken 4 en 6). Al deze eiwitten vertonen onderling structurele verwantschappen die specifiek zijn voor deze groep eiwitten. Verder probeerde ik meer inzicht te krijgen in hun rol als elektronendonor aan de eerste heemgroep van het membraangebonden tetraheemcytochroom c van het fotosynthetisch reactiecentrum. Recent is men ook erin geslaagd om Allochromatium vinosum [1, 2], Halorhodospira halophila iso 1 [3] en Rhodocyclus tenuis HiPIP (wild-type en gemuteerd) [4] via genkloneringtechnieken in grote hoeveelheden aan te maken, dit om structureel onderzoek te verrichten naar de interactie met de redoxpartners en naar de factoren die bijdragen tot de hoge redoxpotentiaal van HiPIP’s.

4

Hoofdstuk 8 beschrijft de primaire structuurbepaling van rubrerythrine, een nieuw type eiwit geïsoleerd uit de zwavelreducerende bacterie Desulfovibrio vulgaris. Dit is een product van de genfusie van twee verschillende eiwitten: rubredoxine en hemerythrine. Een tijd na ons onderzoek terzake werd de gensequentie van rubrerythrine gepubliceerd, wat ons resultaat bevestigde [5]. Om het laatste aminozuur van deze eiwitketen te bepalen werd gebruik gemaakt van de toen geïntroduceerde plasmadesorptie massaspectrometer, welke in die periode een technische mijlpaal was op gebied van niet-destructieve biologische massaspectrometrie. Op basis van onze eiwitchemische primaire structuurbepaling en de nucleotidensequentie werd de ruimtelijke structuur van rubrerythrine bepaald [6]. Het C-terminale gedeelte van het eiwit vertoont een sterke structurele verwantschap met het ijzer-zwavelproteïne rubredoxine, waarbij het N-terminale gedeelte opgebouwd is uit vier lange alfa-helices die toelaten ijzeratomen zonder associatie met zwavel te binden, zoals hemerythrine dat doet.

We hopen dat deze studie bijdraagt tot het beter begrijpen van de biologische rol van hoge-potentiaal ijzer-zwaveleiwitten als elektronentransporter tijdens de bacteriële fotosynthese, en van hun verspreiding in de natuur. Referenties 1. Agarwal, A., Tan, J., Eren, M., Tevelev, A., Lui, S.M., Cowan, J.A. (1993). Synthesis, cloning and expression of a synthetic gene for high potential iron protein from Chromatium vinosum. Biochem. Biophys. Res. Commun. 197, 1357-1362 2. Brüser, T., Trüper, H.G., Dahl, C. (1997). Cloning and sequencing of the gene encoding the high potential iron-sulfur protein (HiPIP) from the purple sulfur bacterium Chromatium vinosum. Biochim. Biophys. Acta 1352, 18-22 3. Eltis, L.D., Iwagami, S.G., Smith, M. (1994). Hyperexpression of a synthetic gene encoding a high potential iron sulfur protein. Protein. Eng. 7, 1145-1150

4. Caspersen, M.B., Bennett, K., Christensen, H.E.M. (2000). Expression and characterization of recombinant Rhodocyclus tenuis high potential iron-sulfur protein. Protein Express. Purif. 19, 259-264 5. Prickril, B.C., Kurtz, D.M. Jr, LeGall, J., Voordouw, G. (1991). Cloning and sequencing of the gene for rubrerythrin from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). Biochemistry 30, 11118-11123 6. deMaré, F., Kurtz, D.M. Jr., Nordlund, P. (1996). The structure of Desulfovibrio vulgaris rubrerythrin reveals a unique combination of rubredoxin-like FeS4 and ferritin-like diiron domains. Nature Struct. Biol. 3, 539-546

1

Overzicht van bacteriële ijzer-zwaveleiwitten

1.1. INLEIDING 6

1.2. IJZER-ZWAVELEIWITTEN 7

1.3. ‘EENVOUDIGE’ IJZER-ZWAVELEIWITTEN 8

1.4. ‘COMPLEXE’ IJZER-ZWAVELEIWITTEN 18

1.5. CONSTRUCTIE VAN EEN IJZER-ZWAVELCLUSTER 21

1.6. REFERENTIES 24

Hoofdstuk 1. Overzicht van bacteriële ijzer-zwaveleiwitten. 6

Hoofdstuk 1

Overzicht van bacteriële ijzer-zwaveleiwitten

1.1. Inleiding

In het begin was het woord en het woord is God. “En God zeide: Laat Ons mensen maken, naar Ons beeld, naar Onze gelijkenis; en dat zij heerschappij hebben over de vissen der zee, en over het gevogelte des hemels, en over het vee, en over de gehele aarde, en over al het kruipend gedierte, dat op de aarde kruipt. En God schiep den mens naar Zijn beeld; naar het beeld van God schiep Hij hem; man en vrouw schiep Hij ze” (Genesis 1-26-27).

De stelling dat de schepping van God de bron van alle leven op aarde was hield stand

tot 1530 wanneer Nicolas Copernicus het tegendeel bewees. De Poolse astronoom (1473-1543) bewees in zijn verhandeling De Revolutionibus dat de aarde dagelijks rond haar eigen as en per jaar rondom de zon draait. Het was een fantastisch concept voor die tijd waarmee onze geliefde blauwe planeet aarde haar status als middelpunt van het heelal verloor. Met On the Origin of Species (1859) en The Descent of Man (1871), beide geschreven door Charles Darwin (1809-1882) na zijn observatiereizen met de Beagle, verloor het gedachtengoed van de Kerk over de Goddelijke Schepping meer en meer terrein. Door introductie van begrippen als ‘evolutie’ en ‘natuurlijke selectie’ werden immers zowel de Schepping als Ontwerp door God in de natuur op zijn zachtst gesproken in twijfel getrokken.

Vanaf die tijd zocht de wetenschap naar de oorsprong van het leven, waarbij

ondermeer met de experimenten van de onderzoeksgroep rond Miller [1] met elektrische ontladingen, reducerende atmosfeer van methaan en ammoniakgas, en water, aantoonden dat in zo’n primitieve ‘oeromgeving’ nieuwe moleculen zoals aminozuren konden worden gevormd. Tijdens recentere experimenten, waarbij vulkanische of hydrothermale omgevingen werden nagebootst met CO, methylmercaptaan (of methaanthiol, CH3SH) en een in water neergeslagen mengsel van pyriet (FeS) en NiS, kon azijnzuur geproduceerd worden [2]. Huber en medewerkers hebben verder ook aangetoond dat azijnzuur en methylmercaptaan konden worden gevormd uit reacties van CO en H2S alleen, in een NiS-FeS omgeving die in een lichte mate door selenium verontreinigd is [2]. Deze reacties mogen beschouwd worden als een mogelijk initiatiereactie voor het chemo-autotrofe begin van leven, en FeS en/of NiS als oudste biokatalysatoren. Deze soort biokatalysatoren vinden we tegenwoordig terug als de actieve centra in tal van eiwitten, bekend onder de naam metalloproteïnen of metaaleiwitten.

Metaalionen spelen door hun bijdrage in eiwitstabilisatie een sleutelrol in de

biochemie van het leven, vandaar hun aanwezigheid in het centrum van grote moleculen. Ze katalyseren ook een grote variëteit van biologische reacties door transport van elektronen


doorheen verschillende reactieprocessen, zoals de reductie van zuurstof, stikstof en sulfaat, de fotosynthese, en de DNA-transcriptie.. 1.2. Ijzer-zwaveleiwitten

Metaaleiwitten die een ijzer-zwavel (FeS)-actief centrum bevatten behoren tot een grote groep ‘ijzer-zwaveleiwitten’ [3-4] die sterk kunnen verschillen in hun biologische rol: transport van elektronen, functie als katalytisch of regulatorisch eiwit, of als sensorisch eiwit voor zuurstof of ijzer [5-8]. Deze eiwitten zijn dan ook wijd verspreid in alle bekende levende systemen, van eenvoudige bacteriën tot hogere organismen. Toch bezitten alle vertegenwoordigers van deze eiwitfamilie een gemeenschappelijk kenmerk, namelijk dat het FeS-centrum aan de eiwitketen gekoppeld is met behulp van thiolbindingen. Deze bindingen worden gevormd tussen het zwavelatoom van een cysteïne en een ijzeratoom, zoals

voorgesteld in Figuur 1.1. IJzeratomen die deel uitmaken van een groter ijzer-zwavelcluster zijn door zuur-labiele anorganische zwavelatomen aan elkaar verbonden.

Specifieke analysemethoden voor deze ijzer-zwaveleiwitten zijn tegenwoordig elektronspin-resonantie en Mössbauer spectro-scopie, chemische en kristallografische aminozuurvolgordebepaling, en redox-poten-tiaal studies. De meest voorkomende ijzer-zwavelclusters zijn van het type Fe-S, 2Fe-2S en 4Fe-4S (Fig. 1.1), aangevuld met recent ontdekte clustergroepen, al dan niet gecombineerd met een extra actief atoom of molecule zoals molybdeen, nikkel, heem of flavine [5-8].

IJzer-zwaveleiwitten zijn onderverdeeld in verschillende klassen op basis van hun sequentie en clustergegevens. Hieruit ontstaan twee belangrijke categorieën: ‘eenvoudige’ en ‘complexe’ ijzer-zwaveleiwitten (Fig. 1.2).

Figuur 1.1. Voorstelling van de meest voorkomende ijzerzwavel clusters: Fe-S (bovenaan), 2Fe-2S (midden) en 4Fe-4S (onderaan). (Figuur ontleend aan ref. 9)


1.3. ‘Eenvoudige’ ijzer-zwaveleiwitten

1.3.1. Rubredoxinen

Deze groep van kleine ijzer-zwaveleiwitten, rubredoxinen genoemd (Fig. 1.3), bevat geen enkele zuur-labiele zwavelverbinding. In dit geval is één enkele ijzeratoom tetraëdrisch door vier thiolaatbindingen aan de eiwitketen verbonden (zie Fig. 1.1). Deze eiwitten zijn in het algemeen 45 tot 55 aminozuren lang en hebben een gemiddelde redoxpotentiaal van –60 mV.

Op basis van elektronenopslag en de transfererende eigenschap van de Fe-S cluster werd lange tijd aangenomen dat rubredoxine als onderdeel van een biologische elektronentransportketen fungeert [3]. Het waren Gomes en medewerkers die de juiste rol van rubredoxine in de sulfaatreducerende bacterie Desulfovibrio gigas konden achterhalen [12]. Ofschoon sulfaatreducerende bacteriën als strikt anaëroob beschouwd worden zijn ze toch in staat om te overleven als ze aan zuurstof blootgesteld worden [13]. Ze doen dat met behulp van een drie-component elektronentransferketen, met regeneratie van NAD+ en reductie van zuurstof tot water. Deze keten is opgebouwd uit een NADH:rubredoxine oxidoreductase (NRO) complex, rubredoxine zelf (Rd) en een rubredoxine:zuurstof oxidoreductase (ROO) complex (Figuur 1.4).

Figuur 1.3. Structuur van rubredoxine [11].

Haemproteins Other iron-containing proteins

Other haemproteins Cytochromes

Rubredoxins Ferredoxins

(Iron-sulphur)flavoproteins

(Iron-sulphurmolybdenum)

proteins

(Iron-sulphurhaem) flavo-

proteins

Others: lipoxygenasemethane mono-

oxygenase...

2-iron Fd

etc.

3Fe/4S Fd

1-cluster Fd2Fe/cluster




4-iron Fd

1-center Rd 2-center Rd

FerritinTransferrinOxygenase

Figuur 1.2. Overzicht van ijzerzwaveleiwitten. Overgenomen uit ref. 10


Mutanten van Acinetobacter calcoaceticus kunnen niet overleven in een groeimedium

dat dodecaan bevat, maar behouden wel hun vermogen te leven op dodecaanzuur. Deze groeideficiëntie werd verholpen door een chromosomaal DNA-gedeelte uit de wildtype stam in te bouwen. De door de onderzoekers terug ingebrachte chromosomale gedeelten coderen voor eiwitten die verwant zijn met rubredoxine en NAD(P)-afhankelijke rubredoxine reductase [14]. Verbreking van deze genen resulteerde in het verlies van het vermogen van deze bacterie om te leven op groeimedia die dodecaan of hexadecaan bevatten. Dit toont dus een mogelijke rol van rubredoxine aan in de afbraak van dodecaan naar dodecaanzuur [14].

Pseudomonas oleovorans bezit een plasmide waarop geninformatie zit voor het

alkaanhydroxylase complex, bestaande uit twee verschillende rubredoxinen, cytoplasmatisch membraan alkaandehydroxylase en een NAD(P)-afhankelijk reductase [15].

• Rubredoxine 1 is 132 aminozuren lang, bevat 1 Fe-S cluster en een C-

terminale extensie van ongeveer 77 aminozuren. • Rubredoxine 2 is 172 aminozuren lang, bevat twee rubredoxinedomeinen

(regio’s 1-55 en 119-172), gescheiden door een tussenstuk van 65 aminozuren.

De N-terminus van beide rubredoxinen en regio 119-172 van rubredoxine 2 vertonen een sterke onderlinge gelijkenis, waardoor men mag besluiten dat rubredoxine 2 een product is van genduplicatie [15] (Figuur 1.6). Dit is het enige voorbeeld van het voorkomen van twee rubredoxinedomeinen in één eiwit. Kok en medewerkers [15] toonden aan dat het tweede domein van rubredoxine 2 een rol speelt in het elektronentransport van rubredoxinereductase naar alkaanhydroxylase in vitro, en dat rubredoxine 1 de rol van rubredoxine 2 als component van dit alkaan-hydroxylase complex niet kan vervangen. Dezelfde conclusie kan getrokken worden door de introductie van een mutatie in het gebied dat codeert voor de C-terminale regio van rubredoxine 2, waardoor alkaan-hydroxylase activiteit in vivo verloren ging [15].

Recent is de ruimtelijke structuur van een klein

aanverwant eiwit, desulforedoxine, bepaald (Figuur 1.5) [16]. Dit eiwit heeft een identieke prosthetische groep als rubredoxine, maar verschilt lichtjes in de ruimtelijke opvouwing rondom het centrum, door de verschillende posities van de clusterbindende cysteïnes. De clusterbindende

NAD+

NADH

NROox

NROred Rdred

Rdox

ROOred

ROOox O2

H2O

Figuur 1.4. Schematische voorstelling van Desulfovibrio gigas terminaal oxidase. .

Figuur 1.5. Ruimtelijk structuur van desulforedoxine (dimeer).


cysteïnes van rubredoxine maken deel uit van het kenmerkende sequentiemotief CX2CXnCX2C (n = 22 tot 31 naargelang het geïsoleerde rubredoxine). In desulforedoxine is dit motief CX2CX15CC (Fig. 1.6). Desulforedoxine is een klein homodimeer eiwit waarvan twee in tegengestelde richting georiënteerde aparte strengen van 36 aminozuren elk één ijzeratoom binden.

Heliobacillus RdClostridium RdChlorobium RdAcinetobacter RdPseudomonas Rd1Pseudomonas Rd2 (1-118)Pseudomonas Rd2 (119-172)Desulfovibrio RdDesulfovibrio DxDesulfovibrio Dfx

10 20 30

M K K Y G C L V C G Y V Y D P A K G D P D H G I A P GM T K Y V C T V C G Y V Y D P E V G D P D N N I N P GM Q K Y V C S V C G Y V Y D P A D G E P D D P I D P GM K K Y Q C I V C G W I Y D E A E G W P Q D G I A P GM S R Y Q C P D C Q Y I Y D E N K G E P H E G F H P N

A S Y K C P D C N Y V Y D E S A G N V H E G F S P GY L K W I C I T C G H I Y D E A L G D E A E G F T P GM Q K Y V C N V C G Y E Y D P A E H D N - - - - - - -

A N E G D V Y K C E L C G Q V V K V L E E G G - - - - - - -P K H L E V Y K C T H C G N I V E V L H G G G - - - - - - -

Heliobacillus RdClostridium RdChlorobium RdAcinetobacter RdPseudomonas Rd1Pseudomonas Rd2 (1-118)Pseudomonas Rd2 (119-172)Desulfovibrio RdDesulfovibrio DxDesulfovibrio Dfx

40 50 60

T A F E D L P A D W V C P L C G V S - K D E F E P LT S F Q D I P E D W V C P L C G V G - K D Q F E E E AT G F E D L P E D W V C P V C G V D - K D L F E P E ST K W E D I P D D W T C P D C G V S - K V D F E M I E VT S W N D I P K D W A C P D C A V R D K V D F I F L A D S PT P W H L I P E D W C C P D C A V R D K L D F M L I E S G VT R F E D I P D D W C C P D C G A T - K E D Y V L Y E E KV P F D Q L P D D W C C P V C G V S - K D Q F S P A- - - - - - - G T L V C - - C G E D M V K Q D- - - - - - - A E L V C - - C G E P M K H M V E G S T D G A

Pseudomonas Rd1Pseudomonas Rd2 (1-118)Desulfovibrio Dfx

70 80 90

S K E T Q L G V N S Q L A N S E S G I S D A T P T G M A V LG E K G V T S T H T S P N L S E V S G T S L T A E A V V A PM E K H - V P V I E K V D G G Y L I K V G S V P H P M E E K

Pseudomonas Rd1Pseudomonas Rd2 (1-118)Desulfovibrio Dfx

100 110 120

A A E L V I P L N Q E N K N E G C A A K T E V L D Q A S T PT S L E K L P S A D V K G Q D L Y K T Q P P R S D A Q G G KH W I E W I E L L A D G R S Y T K F L K P G D A P E A F F A

Pseudomonas Rd1Pseudomonas Rd2 (compleet)Desulfovibrio Dfx

130 140 150

Q V V R K S S T R K K M R N KAI D A S K V T A R E Y C N L H G H W K A E N

- - - - - - - - - - - - - -

Figuur 1.6. Alignatie van rubredoxinen (Rd) geïsoleerd uit Heliobacillus mobilis [17], Clostridium sticklandii [18], Chlorobium limicola [19], Acinetobacter calcoaceticus [14], Pseudomonas oleovorans (Rd 1 en Rd 2) [15], Desulfovibrio desulfuricans [20], desulforedoxine (Dx) uit Desulfovibrio gigas [21] en desulfoferrodoxine (Dfx) uit Desulfovibrio desulfuricans [22]. Clusterbindende cysteïnes zijn aangeduid in het rood.


Centra die verwantschap vertonen met deze in rubredoxinen zijn ook in grotere eiwitten aangetroffen en blijken geassocieerd te zijn met een extra prosthetische groep, wat resulteert in een unieke combinatie van actieve metaalcentra. Desulfoferrodoxine, rubrerythrine en nigerythrine zijn drie dergelijke eiwitten die geïsoleerd werden uit sulfaatreducerende bacteriën.

De naam rubrerythrine is een versmelting

van de namen voor twee verschillende eiwitten: rubredoxine (‘ruber’, rood) en hemerythrine. Spectroscopische studies toonden aan dat rubrerythrine twee verschillende ijzercentra bevat: één rubredoxine-achtig en één door zuurstof aan elkaar gekoppeld twee-ijzer centrum [23]. Dit laatste soort centrum vinden we ook terug in hemerythrine, dat een rol speelt als zuurstoftransporter in bloed van mariene invertebraten [24].

Alhoewel de fysiologische rol van rubrerythrine niet bekend is werd er bij dat eiwit in vitro pyrofosfatase-activiteit vastgesteld, een eigenschap die evenwel niet meer door andere onderzoeksgroepen kon aangetoond worden, en een ferro-oxidase activiteit [25, 26].

Bepaling van de ruimtelijke structuur van cytoplasmatisch rubrerythrine toonde aan dat het uit twee ruimtelijke domeinen bestaat (Figuur 1.7) [27]. Het C-terminaal domein vertoont sterke verwantschap met rubredoxinen, zoals aangetoond via aminozuursequentie-bepalingen [27, 28] en ook afgeleid uit de spectroscopische gegevens [28-31]. Het N-terminaal domein kan vergeleken worden met ferritine of bacterioferritine, beiden opgebouwd uit vier lange helixbundels waar één of meerdere ijzeratomen kunnen worden opgeslagen [27]. Voor nigerytrhine (‘niger’, zwart) is er momenteel nog geen ruimtelijke structuur beschikbaar, maar op basis van sterke sequentiesimilariteit met hemerythrine mogen we dus stellen dat het een rubrerythrine-verwante structuur zal opleveren [26-32].

Desulfoferrodoxine heeft een moleculair

gewicht van 14 kDa en bevat twee mononucleaire ijzercentra, zoals aangetoond door Mössbauer en EPR spectroscopische analysen [33, 34]. Het N-terminus vertoont dezelfde sequentiekarakteristieken als desulforedoxine [35] waar het eerste ijzercentrum gebonden wordt door vier cysteïnes. In het C-terminale gedeelte van het eiwit zit het tweede ijzercentrum via één thiolaatbinding en vier histidine zijketens aan het eiwitketen gebonden. Het vertoont de sequentiekarakteristieken van neelaredoxine [36].

1.3.2. 2Fe-2S Ferredoxinen

2Fe-2S ferredoxinen hebben over het algemeen één 2Fe-2S cluster (Figuur 1.8) en een

Figuur 1.7. Ruimtelijk structuur van Desulfovibrio vulgaris rubrerythrine.

Figuur 1.8. Ruimtelijk structuur van 2Fe-2S planttype ferredoxine.


hoger moleculair gewicht dan een ander mono- of bi-cluster ferredoxine. Historisch werd deze groep ferredoxinen voor het eerst uit planten en blauwgroenwieren geïsoleerd, waar ze een rol spelen in de fotosynthetische elektronentransportketen [3]. Deze wateroplosbare ferredoxinen vertonen een conservatief sequentiepatroon en vormen samen de groep van de 2Fe-2S planttype ferredoxinen (Figuur 1.9).

Later werden planttype ferredoxinen ook uit zoutminnende of fotosynthetische

bacteriën geïsoleerd zoals o.m. Halobacterium en Rhodobacter capsulatus [41, 42]. Op basis

SpinazieCyanophoraAnabaenaSynecococcusHalobacteriumRhodobacter

10 20 30

A A L P S N T G R S L F G L K T G S R G G R M T M A A Y K VA V Y K VA T F K VA S Y K V

P T V E Y L N Y E T L D D Q G W D M D D D D L F E K AM D K A


40 50 60

T L V T P T G - - N V E F Q C P D D V Y I L D A A E E E G IR L I C E E Q G L D T T I E C P D D E Y I L D A A E E Q G IT L I N E A E G T S N T I D V P D D E Y I L D A A E E Q G YT L I N E E M G L N E T I E V P D D E Y I L D V A E E E G IA D A G L D G E D Y G T M E V A E G E Y I L E A A E A Q G YT L T F T D V S-- I T V N V P T G T R I I E M S E K V G S


70 80 90

D L P Y S C R A G S C S S C A G K L K T G S L N Q D D Q S FD L P Y S C R A G A C S T C A G K V V E G T V D Q S D Q S FD L P F S C R A G A C S T C A G K L V S G T V D Q S D Q S FD L P Y S C R A G A C S T C A G K I K E G E I D Q S D Q S FD W P F S C R A G A C A N C A S I V K E G E I D M D M Q Q IG I T Y G C R E G E C G T C M T H I L E G S E N L S E P T A


100 110 120

L D D D - Q I D E G - - - - W V L T C A A Y P V S D V T I EL D D A - Q L A A G - - - - Y V L T C V A Y P S S D C T V KL D D D - Q I E A G - - - - Y V L T C V A Y P T S D V T I QL D D D - Q I E A G - - - - Y V L T C V A Y P A S D C T I IL S D E E V E E K D - - - - V R L T C I G S P A A D E V K IL E M R V L E E N L G G K D D R L A C Q C R V L G G A V K V


130 140 150

T H K E E E L T AT H Q E E S L YT H K E E D L YT H Q E E E L YV Y N A K H L D Y L Q N R V IR P A

Figuur 1.9. Alignatie van 2Fe-2S planttype ferredoxines geïsoleerd uit spinazie (Spinacia oleraccea) [37], Cyanophora [38], Anabaena [39], Synechococcus spp. [40], Halobacterium [41]. en Rhodobacter capsulatus (FdIV) [42]. Clusterbindende cysteïnes zijn in het rood weergegeven.

,


van zichtbaar lichtabsorptie- en circulair dichroïsmespectra gelijkt het Halobacterium 2Fe-2S ferredoxine sterk op planttype ferredoxinen, wat ook bevestigd is door de sequentiesimilariteit met andere gekende planttype ferredoxinen (Figuur 1.9). Hun redoxpotentiaal werd bepaald op –350 mV en fungeert als elektrondonor voor de reductie van nitriet [43].

Naast vier andere ferredoxinen bezit Rhodobacter capsulatus twee verschillende 2Fe-2S planttype ferredoxinen: FdIV (Figuur 1.9) en FdV. Hun respectievelijke genen liggen iets verderop van de nif genen, wat wijst op een mogelijke rol in de stikstoffixatie [44].

Bacteriën bevatten ook ferredoxinen die totaal verschillen van de planttype

ferredoxinen en worden daarom 2Fe-2S bacteriële ferredoxinen genoemd (Figuur 1.10).

Ps. aeruginosaE. coliHph. influenzaePs. sp.Rb. capsulatusPs. putidaRc. erythropolis

10 20 30

M P Q I V I L P H A D H C P E G A V F E A K P G E T I L D AP K I V I L P H Q D L C P D G A V L E A N S G E T I L D A

P K V I F L P N E D F C P E G M V V D A A - - - T G D N L LP R V V F I D E Q S G E Y A - - - V D A Q D G Q S L M E VA K I I F I E H N G T R H E - - - V E A K P G L T V M E AS K V V Y V S H D G T R R E - - - L D V A D G V S L M Q AP T V T Y V H P D G T K H E - - - V E V P T G K R V M Q A


40 50 60

A L R N G I E I E H A H A C E K S C A C T T C H V I V R E GA L R N G I E I E H - - A C E K S C A C T T C H C I V R E GE V A H N A G V E I H H A C D G S C A C T T C H V I V R E GA T Q N G V P G I V A - E C G G S C V C A T C R I E I E D AA R D N G V P G I D A - D C G G A C A C S T C H A Y V D P AA V S N G I Y D I V G - D C G G S A S C A T C H V Y V N E AA I G A G I D G I V A - E C G G Q A M C A T C H V Y V E S P


70 80 90

L - D S M E P S D E L E D D M L D K A W G L E - P D S R L SF - D S L P E S S E Q E D D M L D K A W G L E - P E S R L SF D - S L N E T S D Q E E D M L D K A W G L E - M D S R L SW V E I V G E A N P D E N D L L Q S T G E P M T A G T R L SW V D K L P K A L P T E T D M I D F A Y E P N P A T S R L TF T D K V P A A N E R E I G M L E C V T A E L K P N S R L CW A D K F P S I S E E E D E M L D D T V S P R T E A S R L S


100 110 120

C Q A V V A D E D - - L V V E I P K Y T I N Q V S E G HC Q A R V T D E D - - L V V E I P R Y T I N H A R E HC Q C V V G N E D L V V E I P K Y N L N H A N E A A H HC Q V F I D P S M D G L I V R V P L P AC Q I K V T S L L D G L V V H L P E K Q IC Q I I M T P E L D G I V V D V P D R Q WC Q L V V S D D V D G L I V R L P E E Q V

Figuur 1.10. Alignatie van bacteriële 2Fe-2S ferredoxinen uit Pseudomonas aeruginosa [45], Escherichia coli [46-47], Haemophilus influenzae [48], Pseudomonas sp. (terpredoxine) [49], Rhodobacter capsulatus (FdVI) [50], Pseudomonas putida (putidaredoxine) [51] en Rhodococcus erythropolis (rhodocoxine) [52]. Clusterbindende cysteïnes zijn aangeduid in het rood.


Voorbeelden hiervan zijn putidaredoxine (Pseudomonas putida), terpredoxine (Pseudomonas sp.) en rhodocoxine (Rhodococcus erythropolis).

Putidaredoxine, geïsoleerd uit Pseudomonas putida, fungeert als elektronentransfer-eiwit tussen NADH-afhankelijke putidaredoxine reductase en wateroplosbaar cytochroom P450 voor de oxidatie van camphor (bicyclische terpeen keton) [51]. In het cytochroom P450-afhankelijke mono-oxygenase systeem van Pseudomonas sp. heeft terpredoxine dezelfde functie als putidaredoxine voor de oxidatie van monoterpenen (NADH + H+ + RH + O2 → NAD+ + ROH + H2O) [49]. De volgorde van elektronentransfer waarin putidaredoxine en terpredoxine voorkomen lijkt sterk op deze van adrenodoxine dat in hogere organismen voorkomen.

De afbraak van het thiocarbamaat-bevattende herbicide door Rhodococcus

erythropolis gebeurt via een complex bestaande uit NAD+-afhankelijk dehydrogenase en cytochroom P450. Na de isolatie van het genproduct dat voor cytochroom P450 codeert, bleek dat het geflankeerd was door de genproducten voor een 2Fe-2S ferredoxine, rhodocoxine genaamd, en respectievelijk ferredoxine (rhodocoxine) reductase. Vermoedelijk levert rhodocoxine elektronen aan cytochroom P450, nodig voor thiocarbamaat afbraak [52].

In feite worden, algemeen gesproken, termen zoals ‘planttype ferredoxine’ of

‘bacterieel ferredoxine’ nog altijd vaak gebruikt, maar dan in hun generische betekenis. Door de verfijning van onderzoekstechnieken op het gebied van eiwit- en DNA-volgordebepalingen is er in de laatste jaren een sterke toename van de gegevens in databanken beschikbaar geworden. Hierdoor is het duidelijk dat één enkele organisme verschillende ferredoxinen kan biosynthetiseren, elk met zijn eigen specifieke biologische rol.

Uit Rhodobacter capsulatus werden er in totaal zes verschillende ferredoxinen geïsoleerd. FdI, FdII en FdIII zijn 4fe-4S ferredoxinen, waarbij FdI en FdIII twee dergelijke clusters bezitten. FdII bindt één 4Fe-4S en één 3Fe-4S cluster. FdIV en FdV zijn 2Fe-2S planttype ferredoxinen (zie 1.3.2). FdVI wordt gesynthetiseerd wanneer Rhodobacter capsulatus anaëroob in stikstofrijke omgeving gekweekt wordt. Dit ferredoxine vertoont op basis van zijn sequentie gelijkenis met putidaredoxin, maar tot nu toe werd in Rb. capsulatus nog geen wateroplosbare cytochroom P450 gevonden. Een mogelijke rol van FdVI blijft dus voorlopig onbekend [42, 50].

Tabel 1.1. Overzicht van biologische rollen van bacteriële 2Fe-2S ferredoxinen als elektronentransfereiwit in enzymatische reacties (Ontleend aan ref. [4]).

Reactie Organisme Reductie van nitriet Halobacterium species α-ketozuur oxidoreductase Halobacterium halobium Tolueen deoxygenase Pseudomonas putida Camphor methyleenhydroxylase Pseudomonas putida Steroid hydroxylase Escherichia coli Benzeen deoxygenase Pseudomonas putida Pyrazone deoxygenase

Pyrazon-degraderende bacteriën


Figuur 1.11. Ruimtelijk structuur van 2(4Fe-4S) ferredoxine [54].

2Fe-2S vertebraten-type ferredoxinen verschillen van de planten bacterietype ferredoxines door hun clusterbindend patroon. Ze worden geïsoleerd uit de mitochondria van hogere levensvormen. Ze fungeren vaak als elektronentransporter van NADPH-afhankelijk ferredoxine oxidoreductase naar een membraangebonden cytochroom P450 in mitochondriale mono-oxygenase systemen. Een voorbeeld hiervan is adrenodoxine [53], dat dezelfde functie heeft als beschreven voor putidaredoxine en terpredoxine (Tabel 1.1).


Deze groep eiwitten komt vaak voor in

anaërobe fermenters, in sulfaatreducerende en in fotosynthetische bacteriën. De groep speelt een belangrijke rol in het metabolisme van anaërobe bacteriën waarbij zich reacties afspelen tussen elektronacceptor/donor. Gedurende de oxidatie van pyruvaat kan een ferredoxine elektronen accepteren en naar hydrogenasen transfereren, waarbij de elektronen voor de productie van H2 gebruikt worden. Een andere biologische rol is de koppeling van de oxidatie van een substraat aan de reductie van NADP+, NAD+, FMN, FAD, riboflavine, sulfiet of stikstof (Tabel 1.2) [4]. Sommige van deze reacties worden gekatalyseerd door specifieke reductasen zoals nitrogenase, sulfietreductase of nitraatreductase. Hydrogenasen die de reversibele reactie H2 ↔ 2H+ + 2e- katalyseren

hebben ook één of meerdere ijzer-zwavelclusters, maar fungeren veeleer als een enzyme dan als elektronentransporteiwit. Daarom worden ze niet meer in deze klasse opgenomen [10].

Tabel 1.2. Overzicht van biologische rol van 4Fe-4S of 2(4Fe-4S) ferredoxinen in enzymatische reacties

Substraat Product Organisme (genus) Pyruvaat acetylfosfaat Clostridium Pyruvaat CO2 Clostridium Pyruvaat melkzuur M. lactilyticus NADP+ NADPH Micrococcus NAD+ NADH Chromatium Sulfiet sulfide Desulfovibrio N2 NH3 Azotobacter NO2 NH3 Clostridium FMN of FAD FMNH2 of FADH2 Micrococcus Riboflavine gereduceerd riboflavine Micrococcus


Az. vinelandiiPs. stutzeriTh. aquaticusC. vinosumRps. palustrisCh. limicolaRsp. rubrumCl. pasteurianumD. gigas IID. desulfuricansD. africanusB. subtilis

10 20 30

A F V V - T D N C I K C K Y T D C V E V C P V D C F YT F V V - T D N C I K C K Y T D C V E V C P V D C F YP H V I - C Q P C I G V K D Q S C V E V C P V E C I YA L M I - T D E C I N C D - - V C E P E C P N G A I SA Y K I I T S Q C T V C G - - A C E F E C P N A A I AA L Y I - T E E C T Y C G - - A C E P E C P V T A I SA Y K I - E E T C I S C G - - A C A A E C P V N A I EA Y K I - A D S C V S C G - - A C A S E C P V N A I SP I E V - N D D C M A C E - - A C V E I C P D V F E M

T I V I D - H E E C I G C E - - S C V E L C P E V F A MA R K F Y V D - Q D E C I A C E - - S C V E I A P G A F A M

A K Y T I V D K D T C I A C G - - A C G A A A P D I Y D Y


40 50 60

- - E G P N F L V I H P D E C I D C A L - - - - - - - - - C- - E G P N F L V I H P D E C I D C A L - - - - - - - - - C- - D G G D Q F Y I H P E E C I D C G A - - - - - - - - - C- - Q G D E T Y V I E P S L C T E C V G - - - H Y E T S Q C- - M K R G T Y V I D A V K C T E C E G - - - H F D K P Q C- - A G D D I Y V I D A N T C N E C A G - - - - L D E Q A C- - Q G D T I F V V N A D T C I D C G N - - - - - - - - - C- - Q G D S I F V I D A D T C I D C G N - - - - - - - - - CN E E G D K A V V I N P D S D L D C V E - - - - - - - - E AI D G E E K A M V T A P D S T A E C A Q - - - - - - - - D AD P E I E K A Y V K D V E G A S Q E E V - - - - - - - E E AD D E G I A F V T L D E N K G V V E V P E V L E E D M I D A


70 80 90

E P E C P A Q A I F S E D E V P E D M Q E F I Q L N A E L AE P E C P A Q A I F S E D E V P E D Q Q E F I E L N A D L AV P A C P V N A I Y P E E D V P E Q W K S Y I E L N A E L AV E V C P V D C I I K D P S H E E T E D E L R A K Y E R I TV A V C P V D N T C V P AV A V C P A E C I V Q GA N V C P V G A P V A EA N V C P V G A P V Q EI D S C P A E A I V R SI D A C P V E A I S K EM D T C P V Q C I H W E D EF E G C P T D S I K V A D E P F E G D P L K F E

Az. vinelandiiPs. stutzeriTh. aquaticusC. vinosum

100 110 120

E V W P N I T E K K D P L P D A E D W D G V K G K L Q H L EE V W P N I T E K K D A L A D A E E W D G V K D K L Q Y L EE I W P N I T E R K D V L P D A E H W D G K N R K L A G L EG E G

Figuur 1.12. Alignatie van 4Fe-4S, 2(4Fe-4S) en 3Fe-4S ferredoxinen uit Azotobacter vinelandii[54], Pseudomonas stutzeri [55], Thermus aquaticus [56-57], Allochromatium vinosum [58], Rhodopseudomonas palustris [59], Chlorobium limicola [60], Rhodospirillum rubrum [61], Clostridium pasteurianum [62], Desulfovibrio gigas FdII [63], Desulfovibrio desulfuricans [64], Desulfovibrio africanus [65] en Bacillus subtilis [66]. Clusterbindende cysteïnes voor het eerste en het tweede 4Fe-4S cluster zijn weergegeven in rood, respectievelijk groen. Cysteïnes betrokken in een zwavelbrug zijn voorgesteld door letters in het geel.


Op basis van het aantal 4Fe-4S clusters kan deze groep in twee subgroepen onderverdeeld worden: 4Fe-4S en 8Fe-8S.

De eerste subgroep wordt gekenmerkt door één 4Fe-4S cluster (Figuur 1.1, onderaan).

Deze eiwitten worden tot nu toe enkel gevonden in Bacillus subtilis, Paracoccus sp., sulfaatreducerende en fotosynthetische bacteriën. Ferredoxinen geïsoleerd uit de fotosynthetische bacteriën en Paracoccus sp. hebben een hoge redoxpotentiaal van gemiddeld +350 mV en worden daarom ‘High Potential Iron-sulfur Proteins’ (HiPIP) genoemd. Deze groep zal in het volgende hoofdstuk besproken worden. Andere ferredoxinen van deze subgroep hebben een negatieve redoxpotentiaal [3-4].

De tweede subgroep heeft twee 4Fe-4S ijzer-zwavelclusters (Figuur 1.11) en komt vaker voor in bacteriën dan de hiervoor besproken subgroep. De aminozuursequenties worden gekenmerkt door aanwezigheid van acht clusterbindende cysteïnes en een laag percentage van de volgende aminozuren lysine, histidine, arginine, methionine en tryptofaan (Figuur 1.12). Deze eiwitten hebben een zeer lage redoxpotentiaal (gemiddeld – 400 mV) en een zuur karakter wegens een laag percentage aan basische aminozuren [3-4]. Ferredoxinen geïsoleerd uit verschillende Clostridium species vertonen onderling sterke similariteit in twee clusterbindende gebieden, beide gekenmerkt door het conservatieve CysX2CysX2CysX3CysPro-bindingsmotief (niet opgenomen in Figuur 1.12) [67]. Die uit de fotosynthetische bacteriën vertonen dit conservatieve clusterbindende motief ook in regio 10-25, en het CysX2CysX7-8CysX3CysPro-bindingsmotief in regio 40-70 (Figuur 1.12). Azotobacter, Pseudomonas en Thermus ferredoxines hebben CysX2CysX4CysX3CysPro- en CysX2CysX7-8CysX3CysPro-motieven in hun respectievelijke clusterbindende locaties.


Dit ongewone Fe-S cluster werd voor het eerst ontdekt bij een ferredoxine uit Azotobacter vinelandii [54, 68-69]. De ruimtelijke structuur van het eiwit is ook bepaald, samen met zijn twee FeS clusters: één 4Fe-4S en één 3Fe-3S [68-69]. Laatst genoemd cluster werd eerst verondersteld opgebouwd te zijn uit drie ijzeratomen, aan het eiwit gebonden via vijf thiolaatbindingen en één zuurstofatoom. Verdere verfijning van de ruimtelijke structuur toonde aan dat het geen 3Fe-3S, maar wel een 3Fe-4S cluster bevat, m. a. w. een gewoon 4Fe-4S cluster waarin één ijzeratoom ontbreekt. Een verklaring voor deze ongewone vaststelling is een mogelijke oxidatieve beschadiging tijdens de isolatie of kristallisatie van het eiwit [70].

Een ander voorbeeld van zo’n ongewoon cluster is een tetrameer Desulfovibrio gigas

ferredoxine II [63]. Ferredoxine I uit dezelfde bacterie bevat een compleet andere aminozuurvolgorde en een volledig 4Fe-4S cluster. Het eiwit komt voor als een dimeer en zou een rol spelen in de reductie van sulfaat [71]. Het verband tussen de stabiliserende factoren in beide clusters van ferredoxine I en II werd onderzocht op gebied van interconversie van de clusters. Reconstitutie van D. gigas ferredoxine II, dat een 3Fe-4S cluster bevat, met Fe en S2- in een reducerende omgeving leidt tot vorming van een complete 4Fe-4S cluster (Figuur 1.13) [63, 72]. De ruimtelijk structuur van D. gigas FdII toont dat het eiwit een zwavelbrug heeft tussen twee cysteïnes op plaatsen waar normaal het tweede cluster voorkomt (posities 24 en 48 in Figuur 1.12) [73]. Verder is cysteïne op positie 15 zo georiënteerd dat zijn zijketen van de cluster weggedraaid is door modificatie met een kleine chemische groep, mogelijks een methaanthiol. Het is mogelijk dat deze modificatie een regulerende rol speelt voor de


clusteropbouw, ofwel is het een artefact ontstaan tijdens de opzuivering of kristallisatie van het eiwit.

Methaanthiol werd ook gevonden als eindproduct van het D. gigas metabolisme [73-

74], wat de vorige veronderstelling enigszins ondersteunt, maar toch is verder onderzoek hier noodzakelijk. Terwijl het methaanthiol een mogelijk artefact is, is dit zeker niet het geval voor het Desulfovibrio gigas 3Fe-4S cluster, omdat het ook in andere bacteriën teruggevonden wordt: Azotobacter vinelandii, Desulfovibrio africanus FdIII, Pyrococcus furiosus en aconitase [54, 69, 75-76]. In vitro conversie van 3Fe-4S naar een 4Fe-4S cluster met Fe en sulfide in reducerende omstandigheden zou lokale terugdraaiing van de cysteïne-zijketen noodzakelijk maken voor een goede interactie met het cluster. Een mogelijke verklaring voor het mechanisme van deze correctie is niet duidelijk, wat ook hier meer onderzoek vraagt. Hetzelfde geldt voor de vraag of de vorming van 3Fe-4S uit een 4Fe-4S cluster enzymatisch geregeld wordt (zie ook 1.3.6). Mogelijks heeft een 3Fe-4S cluster een regulatorische functie of fungeert het als opslagplaats voor een extra ijzeratoom.

1.4. ‘Complexe’ ijzer-zwaveleiwitten

Deze groep eiwitten zijn vaak complex in opbouw; één deel bevat meestal een ijzer-zwavelcluster, en een ander deel bevat een andere cofactor waarmee het ijzer-zwavelcluster in contact komt. Meestal bestaan complexe ijzer-zwaveleiwitten uit verschillende subunits, elk met een eigen actief centrum. Voorbeelden hiervan worden gegeven in Tabel 1.3. Vanwege een paar bijzonderheden wordt het Azotobacter vinelandii nitrogenase in het kort als voorbeeld besproken.

Figuur 1.13. Theoretische model van de vorming van 3Fe-4S uit een 4Fe-4S

cluster na de verwijdering van 1 ijzeratoom [70].


Nitrogenasen reduceren atmosferische stikstof tot ammoniak en spelen dus een

centrale rol in de globale stikstofcyclus. De reaktie is N2 + 8H+ + 8e- +18-24 Mg-ATP → 2NH3 +H2 + 18-24 Mg-ADP + 18-24 P. Ze zijn opgebouwd uit twee verschillende metalloproteïnen, een ijzereiwit (dinitrogenase-reductase) en een ijzermolybdeen eiwit (dinitrogenase) (Figuur 1.14).

Het ijzereiwit levert elektronen aan het Fe-Mo eiwit, waar de omzetting van stikstof naar ammoniak gebeurt [78-82]. In 1992 werd de ruimtelijke structuur van dit complex opgehelderd. Het ijzereiwit bestaat uit twee identieke subunits die één 4Fe-4S cluster binden, wat op zichzelf nogal ongewoon is. In alle tot nu toe gekende ferredoxinen wordt het 4Fe-4S

Tabel 1.3. Voorbeelden van ‘complexe’ ijzer-zwaveleiwitten (Overgenomen uit ref. 3). Reactie Organisme FeS Cofactor Succinaat dehydrogenase

Aërobe en fotosynthetische bacteriën

4Fe-4S FAD

NADH dehydrogenase Idem 2(4Fe-4S) FMN Nitrogenase Azotobacter vinelandii 4Fe-4S FeMo en P-cluster Xanthine dehydrogenase

Clostridium acidi-urici 4Fe-4S Flavine

Nitraatreductase Chloroplast 4Fe-4S Sirohaem Sulfietreductase Desulfovibrio species 2(4Fe-4S) 2 Sirohaems Sulfietreductase Escherichia coli 4(4Fe-4S) 4FAD + 4FMN +

4 Sirohaems

Dinitrogenase reductase complex

Dinitrogenase complex

Nucleotiden (ATP)

4Fe-4S cluster

P-cluster

FeMoco

Figuur 1.14. Ruimtelijk voorstelling van Azotobacter vinelandii nitrogenasecomplex (links) met de belangrijke elektronentransfer- of reactiecentra (rechts). Ontleend uit [77].


Figuur 1.15. Ruimtelijk structuur van het ijzereiwit dinitrogenase-reductase opge-bouwd uit twee identieke eiwitstrengen (groen en blauw) die één FeS cluster (centraal gelegen) binden. Onder het FeS cluster bevindt zich het Mg-ATP molecule [79].

S Cys154

Cys95

S Cys62

Cys88

Cys70 S

Cys153 S

Ser188 O

S

S

Figuur 1.16. Vereenvoudigde voorstelling van een ‘P-cluster’. De clusterbindende residuën van de α- en β-subeenheden zijn in het blauw, resp. groen, weergegeven [78].

cluster door één eiwitstreng gebonden. In dit geval wordt het ijzer-zwavelcluster op zijn plaats gehouden door twee eiwitstrengen waarvan de clusterbindende cysteïnes ver van mekaar liggen, met (CX34C)2 als bindingsmotief (Figuur 1.15). Het is ook in dit eiwitonderdeel dat twee Mg-ATP moleculen via het nucleotidebindings-motief GXXXXGKS/T gebonden worden. Het verbruik van 18 tot 24 ATP-moleculen voor deze reactie is intrigerend vermits het zo hoog is, namelijk 4 tot 6 ATP-moleculen per 2 getransfeerde electronen. De reden is dat stikstof buitengewoon inert is en een stabiele ‘triple-bond’ heeft (dissociatie-energie voor stikstof is hoger dan voor zuurstof). ATP wordt dus gebruikt om de reductiepotentiaal van het dinitrogenase-reductase complex van –300 mV naar –400 mV te verlagen zodat een reductie van stikstof mogelijk wordt.

Per molecule ijzereiwit wordt dus één 4Fe-4S en twee Mg-ATP gebonden. Het ijzer-

zwavelcluster speelt een belangrijke rol in het nitrogenaseproces omdat het de transfer van elektronen, gegenereerd als resultaat van de ATP-hydrolyse, naar het FeMoco eiwitcomplex (zie hierna) verzorgt. Het mechanisme achter de regulatie van deze elektronentransfer is momenteel nog onduidelijk.

Het ander metalloproteïne, het Fe-Mo eiwit, is een α2β2 complex, die een ijzer-

molybdeencofactor bevat, die soms ook FeMoco genoemd wordt. Het ijzer-zwavelcluster is van het 8Fe-8S type en wordt vanwege zijn ongewone opbouw ‘P-cluster’ genoemd (P van Proteïne). Het zijn in feite twee 4Fe-4S clusters, aan elkaar gebonden door twee cysteïne thiolliganden (Figuur 1.16). De twee FeMoco’s worden in de α-subunit aan de eiwitketen gebonden, terwijl het P-cluster door één α- en één β-subunit op zijn plaats wordt gehouden. Elke α- en β-subunit levert drie thiolaat-bindingen. De β-subunit levert ook nog een extra binding naar het P-cluster via de hydroxylzijketen van het aminozuur serine. De P-cluster transfereert elektronen vanuit de hierboven besproken 4Fe-4S cluster naar FeMoco, het actief centrum waar de feitelijke omzetting van stikstof naar ammoniak gebeurt (Figuur 1.17).


1.5. Constructie van een ijzer-zwavelcluster

De chemische reconstructie van een ijzer-zwaveleiwit werd al een paar keer aangetoond met apoFd in aanwezigheid van Fe en sulfide, in reducerende omstandigheden [72, 83]. Momenteel is er heel weinig gekend over de biologische of enzymatische opbouw van een ijzer-zwaveleiwit in vivo. Zheng en medewerkers [84-85] hebben nifU en nifS genproducten uit Azotobacter vinelandii gekarakteriseerd die een rol spelen in de opbouw of het herstel van FeS clusters van nitrogenasen (Fig. 1.18., nif = nitrogen fixatie). Het NifS genproduct is een pyridoxaalfosfaat afhankelijk L-cysteïne desulfurase en kan in vitro een verwijderd 4Fe-4S cluster van nitrogenase reconstrueren [85-86]. De fysiologische rol van nifU is niet bekend, maar er wordt verondersteld dat het de noodzakelijke ijzeratomen voor de clusteropbouw levert of fungeert als een tussenliggende cluster-assemblagewerkplaats. Verder vond Zheng ‘upstream’ van nifU een cysE gengedeelte dat codeert voor O-acetylserinesynthase, een enzyme dat een rol speelt in cysteïnebiosynthese. Een mogelijke functie van zo'n cysE-gen is de toelevering van voldoende cysteïnes voor een ijzer-zwavelclusterassemblering. Een aanwijzing hiervoor werd geleverd middels het effect van toenemende concentraties aan cysteïne wanneer Az. vinelandii in een stikstofrijke omgeving gekweekt wordt [87].

In 1998 werden door zelfde onderzoeksgroep identieke genproducten in Escherichia coli en Azotobacter vinelandii gevonden en werden hun genproducten ‘iron-sulfur cluster formation’-genen genoemd, of kortweg ‘isc’-genen: ORF1-ORF2-iscS-iscU-iscA-hscB-hscA-fdx-ORF3 [88] (Figuur 1.18). Vergelijkend gegevensonderzoek in genoomdatabanken toonde aan dat isc-genen ook in andere levende organismen voorkomen:

Dinitrogenase reductase

(geoxideerd)

Dinitrogenase reductase

(gereduceerd)

Dinitrogenase (geoxideerd)

Dinitrogenase (gereduceerd)

8 e- reductie

Meervoudige cycli van

electronentransfer met ATP hydrolyse

Figuur 1.17. Elektronen’flow’ van dinitrogenase reductase-complex naar dinitrogenase-complex.

Bijgewerkte figuur van referentie 74.


• Haemophilus influenzae (http://www.tigr.org/tdb/CMR/ghi/htmls/Background.html), • Yersinia pestis (http://www.sanger.ac.uk/Projects/Y_pestis/), • Pseudomonas aeruginosa (http://www.pseudomonas.com/), • Bordetella pertussis (http://www.sanger.ac.uk/Projects/B_pesrtussis/), • Actinobaccilus actinomyce-temconmitans (http://www.genome.ou.edu/act.html), • Saccharomyces cerevisiae (http://www.mips.biochem.mpg.de), • Archaeglobus fulgidus (http://www.tigr.org/tdb/CMR/gaf/htmls/SplashPage.html ) en • Homo sapiens (http://www.sanger.ac.uk/HPG/ ) .

In Tabel 1.4 worden de isc-genen voorgesteld, samen met hun relatie tot de nif-genen.

Tabel 1.4. Nif en isc genproducten en hun rol.

Azotobacter vinelandii nif

Azotobacter vinelandii isc Escherichia coli isc Functie

iscA iscA iscA Transfer van FeS

cluster? NifU iscU IscU Leveren van Fe? NifS iscS IscS Cysteïne

desulfurase NifV ? ? Homocitraat

synthase cysE1 cysE2 Rol in vorming van

2Fe-2S cluster hsca hsca Chaperone hscb hscb Co-chaperone fdx fdx Ferredoxine ORF1 ORF1 ? ORF2 ORF2 ? ORF3 ORF3 Leveren van Fe?

Figuur 1.18. Nif en isc systemen in Azotobacter vinelandii (AV) en Escherichia coli (Ec).


Uit experimenten waarin een fdx-gen tot co-expressie gebracht werd dat oorspronkelijk buiten gebruik gesteld was, samen met de studie van gemuteerde genproducten, bleek dat iscS, iscA, hscA en fdx noodzakelijk zijn voor een correcte assemblage van een ijzer-zwaveleiwit. Wanneer één van deze genen uitgeschakeld werd kon geen overproductie van gelijk welke ferredoxine bekomen worden, wat leidde tot niet leefbaarheid. Voor de productie van een 2Fe-2S ferredoxine bleken de volgende gengedeelten nodig te zijn: hscB, hscA en ORF3. De exacte functie van ORF3 is tot nu toe niet bekend. Men mag dus aannemen dat het fdx-genproduct een intermediair ijzer-zwaveleiwit vormt voor de ijzer-zwavelcluster assemblage van andere ijzer-zwaveleiwitten (Figuur 1.19). Inactivatie van ORF2 en hscB hebben slechts gedeeltelijk invloed op de productie van bepaalde ferredoxinen [89-90]. We merken hier op dat het fdx-gen codeert voor een bacterieël 2Fe-2S cluster waarbij vier van de zes aanwezige cysteïnes gebruikt worden voor de coördinatie met een 2Fe-2S cluster. De twee andere cysteïnes, die niet betrokken zijn bij de clusterbinding maar toch in de nabijheid van clusterbindende cysteïnes voorkomen, hebben ook het vermogen om tijdelijk een extra 2Fe-2S cluster te binden en zo de assemblage van een 4Fe-4S cluster te bevorderen. Deze veronderstelling wordt ondersteund door een waarneming waarin een 2Fe-2S cluster van E. coli biotinesynthase door dimerisatie tot een 4Fe-4S cluster kan omgezet worden [29]. Het is vooralsnog niet duidelijk hoe dat gebeurt of hoe een 3Fe-4S cluster uit een 4Fe-4S cluster gevormd kan worden. Is dit een enzymatisch proces of speelt modificatie van één van de cysteïnezijketens hier een rol (zie 1.3.4)?

Ofschoon de fysiologische rol van iscA niet gekend is wordt toch verondersteld dat het als een intermediaire clusterplaats fungeert voor de assemblage van een compleet ijzer-zwavelcluster en de transfer naar een feitelijk ferredoxine of een ander ijzer-zwaveleiwit (Figuur 1.19). De aminozuursequenties van hscB- en hscA-genproducten komen sterk overeen met de sequenties van moleculaire chaperone-eiwitten die fungeren als een katalysator voor de correcte opvouwing van de desbetreffende eiwitten.

IscU IscA

IscS

ORF2

ORF3

HscA HscB

Fe-S

Fe-S

Fe-S

?

S

Fe

ATP

ADP + PiCys Ala

Figuur 1.19. Model voor biogenese van ijzer-zwaveleiwitten in Escherichia coli. Eiwitten betrokken bij de assemblage van een FeS-cluster, met een fdx genprodukt (‘Scaffold”) als intermediare struktuur, zijn in het blauw weergegeven. Eiwitten betrokken bij de transfer van een FeS cluster uit de intermediaire structuur naar het uiteindelijke ijzer-zwaveleiwit zijn in het magenta weergegeven [90].


1.6. Referenties 1. Miller, S.L. (1953). A production of amino acids under possible primitive earth conditions. Science 117, 528 2. Huber, C., Wächtershäuser, G. (1997). Activated acetic acid by carbon fixation on (Fe,Ni)S under primordial conditions. Science 276, 245-247 3. Thomson, A.J. (1985). In Topics in Molecular and Structural Biology. Metalloproteins. Metal proteins with redox roles (ed. Harrison, P.M.). Iron-sulphur proteins, pp. 79-120. Verlag Chemie, Weinheim 4. Bruschi, M., Guerlesquin, F. (1988). Structure, function and evolution of bacterial ferredoxines. FEMS Microbiol. Lett. 54, 155-176 5. Volbeda, A., Fontecilla-Camps, J.C., Frey, M. (1996). Novel metal sites in protein structures. Curr. Opin. Struct. Biol. 6 , 804-812 6. Beinert, H., Holm, H.H., Münck, E. (1997). Iron-sulfur clusters: Nature’s modular, multipurpose structures. Science 277, 653-659 7. Johnson, M.K. (1998). Iron-sulfur proteins: new roles for old clusters. Curr. Opin. Chem. Biol. 2, 173-181 8. Beinert, H., Kiley, P.J. (1999). Fe-S proteins in sensing and regulatory functions. Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 152-157 9. Voet, D., Voet, J.G. (1990). Biochemistry. John Wiley & Sons, pp. 528 10. International Union of Biochemistry (1992) Nomenclature of elektron-transfer proteins. Recommendations 1989 of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB). J. Biol. Chem. 267, 665-677 11. Dauter, Z., Wilson, K.S., Sieker, L.C., Moulis, J.-M., Meyer, J. (1996). Zinc- and iron-rubredoxins from Clostridium pasteurianum at atomic resolution: A high-

precision model of a ZnS4 coordination unit in a protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8836-8840 12. Gomes, C.M., Silva, G., Oliveira, S., LeGall, J., Liu, M.-Y., Xavier, A.V., Pousada, C.R., Teixeira, M. (1997). Studies on the redox centers of the terminal oxidase from Desulfovibrio gigas and evidence for its interaction with rubredoxin. J. Biol. Chem. 272, 22502-22508 13. Dilling, W., Cypionka, H. (1990). Aerobic respiration in sulfate-reducing bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 71, 123-128 14. Geissdörfer, W., Frosch, S.C., Haspel, G., Ehrt, S., Hillen, W. (1995). Two genes encoding proteins with similarities to rubredoxin and rubredoxin reductase are required for conversion of dodecane to lauric acid in Acinetobacter calcoaceticus ADP1. J. Microbiol. 141, 1425-1432 15. Kok, M., Oldenhuis, R., van der Linden, M.P.G., Meulenberg, C.H.C., Kingma, J., Witholt, B. (1989). The Pseudomonas oleovorans alkBAC operon codes two structrually related rubredoxins and an aldehyde dehydrogenase. J. Biol. Chem. 264, 5442-5451 16. Archer, M., Carvalho, A.L., Teixeira, S., Moura, I., Moura, J.J.G., Rusnak, F., Romäo (1999). Structural studies by X-ray diffraction on metal substituted desulforedoxin, a rubredoxin-type protein. Prot. Science 8, 1536-1545 17. Lee W.Y., Brune D.C., Lobrutto R., Blankenship R.E (1995). Isolation, characterization, and primary structure of rubredoxin from the photosynthetic bacterium, Heliobacillus mobilis., Arch. Biochem. Biophys. 318, 80-88 18. Meyer J., Gagnon J., Moulis J.M. (1991). Submitted (APR-1991) to the PIR data bank 19. Woolley K.J., Meyer T.E. (1987). The complete amino acid sequence of rubredoxin from the green phototrophic bacterium Chlorobium thiosulphatophilum strain PM., Eur. J. Biochem. 163, 161-166


20. Hormel S., Walsh K.A., Prickril B.C., Titani K., Legall J., Sieker L.C. (1986). Amino acid sequence of rubredoxin from Desulfovibrio desulfuricans strain 27774. FEBS Lett. 201, 147-150 21. Bruschi M., Moura I., LeGall J., Xavier A.V., Sieker L.C. (1979). The amino acid sequence of desulforedoxin, a new type of non heme iron protein from Desulfovibrio gigas. Biochem. Biophys. Res. Commun. 90, 596-605 22. Devreese B., Tavares P., Lampreia J., van Damme N., le Gall J., Moura J.J.G., van Beeumen J., Moura I. (1996). Primary structure of desulfoferrodoxin from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774, a new class of non-heme iron proteins. FEBS Lett. 385, 138-142 23. LeGall., J., Prickril, B.C., Moura, I., Xavier, A.V.,Moura, J.J.G., Huynh, B.H. (1988) Isolation and chartacterization of rubrerythrin, a non-heme iron protein from Desulfovibrio vulgaris that contains rubredoxin centers and a hemerythrin binuclear iron cluster. Biochemistry 27, 1636-1642 24. Holmes, M.A., Letrong, I., Turley, S., Sieker, L.C., Stenkamp, R.E. (1991). Structures of deoxy and oxy hemerythrin at 2.0 Å resolution. J. Mol. Biol. 218, 583-593 25. Liu, M.-Y., LeGall, J. (1990). Purification en characterization of two proteins with inorganic pyrophosphatase activity from Desulfovibrio vulgaris: Rubrerythrin and a new, highly active, enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 171, 316-318 26. Pierik., A.J., Wolbert, R. B.G., Portier, G.L., Verhagen, M.F.J.M., Hagen, W.R. (1993). Nigerythrin and rubrerythrin from Desulfovibrio vulgaris, each contain two mononuclear iron centers and two dinuclear iron clusters. Eur. J. Biochem. 212, 237-245 27. deMaré, F., Kurtz, D.M. Jr., Nordlund, P. (1996). The structure of Desulfovibrio vulgaris rubrerythrin reveals a unique combination of rubredoxin-like FeS4 and ferritin-like diiron domains. Nature Struct. Biol. 3, 539-546

28. Van Beeumen, J.J. Van Driessche, G., Liu, M.Y., LeGall, J. (1991). The primary structure of rubrerythrin, a protein with inorganic pyrophosphatase activity from Desulfovibrio vulgaris. Comparison with hemerythrin and rubredoxin. J. Biol. Chem. 266, 20645-20653 29. Prickril, B.C., Kurtz, D.M. Jr, LeGall, J., Voordouw, G. (1991). Cloning and sequencing of the gene for rubrerythrin from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). Biochemistry 30, 11118-11123 30. Moura, I., Tavares, P., Ravi, N. (1994). Characterization of 3 proteins containing multiple iron sites - Rubrerythrin, desulforedoxin, and a protein containing a six-iron cluster. Meth. Enz. 243, 216-240 31. Dave. B.C., Cze rnuszewicz, R.S., Pickril, B.C., Kurtz, J.M. Jr. (1994). Resonance Raman spectroscopic evidence for the FeS4 and Fe-O-Fe sites in rubrerythrin from Desulfovibrio vulgaris. Biochemistry 33, 3572-3576 32. Lumppio H.L., Shenvi N.V., Garg R.P., Summers A.O., Kurtz D.M. Jr. (1997). A rubrerythrin operon and nigerythrin gene in Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). J. Bacteriol. 179, 4607-4615. 33. Moura I., Tavares P., Moura J.J.G., Ravi N., Huynh B.H., Liu M.-Y., Legall J. (1990). Purification and characterization of desulfoferrodoxin. A novel protein from Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774) and from Desulfovibrio vulgaris (strain Hildenborough) that contains a distorted rubredoxin center and a mononuclear ferrous center. J. Biol. Chem. 265, 21596-21602 34. Tavares, P., Ravzi, N., Moura, J.J.G., LeGall, J., Huang, Y.-H., Crouse, B.R., Johnson, M.K., Huynh, B.H., Moura, I. (1994). Spectroscopic properties of desulfoferrodoxin from Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774). J. Biol. Chem. 269, 10504-10510 35. Devreese B., Tavares P., Lampreia J., van Damme N., le Gall J., Moura J.J.G., Van Beeumen J., Moura I. (1996). Primary structure of desulfoferrodoxin from


Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774, a new class of non-heme iron proteins. FEBS Lett. 385, 138-142 36. Shenvi N.V., Kurtz D.M. Jr. (1997). Submitted (NOV-1997) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases. 37. Matsubara H., Sasaki R.M. (1968). Spinach ferredoxin. II. Tryptic, chymotryptic, and thermolytic peptides, and complete amino acid sequence. J. Biol. Chem. 243, 1732-1757 38. Hase T., Inoue K., Hagihara N., Matsubara H., Williams M.M., Rogers L.J. (1983). Ferredoxin from Aphanothece halophitica, a unicellular blue-green alga: close relationship to ferredoxins from filamentous blue-green algae and phylogenetic implications. J. Biochem. 94, 1457-1464 39. Alam J., Whitaker R.A., Krogmann D.W., Curtis S.E. (1986). Isolation and sequence of the gene for ferredoxin I from the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 168, 1265-1271 40. Neumann-Spallart C., Brandtner M., Kraus M., Jakowitch J., Bayer M.G., Maier T.L., Schenk H.E.A., Loeffelhardt W. (1990). The petFI gene encoding ferredoxin I is located close to the str operon on the cyanelle genome of Cyanophora paradoxa. FEBS Lett. 268, 55-58 41. Pfeifer F., Griffig J., Oesterhelt D. (1993). The fdx gene encoding the [2Fe-2S] ferredoxin of Halobacterium salinarium (H. halobium). Mol. Gen. Genet. 239, 66-71 42. Grabau C., Schatt E., Jouanneau Y., Vignais P.M. (1991). A new [2Fe-2S] ferredoxin from Rhodobacter capsulatus. Coexpression with a 2[4Fe-4S] ferredoxin in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 266, 3294-3299 43. Werber, M.M., Mevarech, M. (1978). Induction of a dissimilatory reduction pathway of nitrate in Halobacterium of the Dead Sea. Arch. Biochem. Biophys. 186, 60-65 44. Schmehl, M., Jahn, A., Meyer zu Vilsendorf, A., Hennecke, S., Masepohl, B., Schuppler, M., Marxer, M. Oelze, J., Klipp,

W. (1993). Idendification of a new class of nitrogen fixation genes in Rhodobacter capsulatus: a putative membrane complex involved in electron transport to nitrogenase. Mol. Gen. Genet. 241, 602-615 45. Sundin G.W., Shankar S., Chugani S.A., Chopade B., Kavanaugh-Black A., Chakrabarty A.M. (1996). Nucleoside diphosphate kinase from Pseudomonas aeruginosa: characterization of the gene and its role in cellular growth and exopolysaccharide alginate synthesis. Mol. Microbiol. 20, 965-979 46. Ta D.T., Vickery L.E. (1992). Cloning, sequencing, and overexpression of a [2Fe-2S] ferredoxin gene from Escherichia coli" J. Biol. Chem. 267, 11120-11125 47. Blattner F.R., Plunkett G. III, Bloch C.A., Perna N.T., Burland V., Riley M., Collado-Vides J., Glasner J.D., Rode C.K., Mayhew G.F., Gregor J., Davis N.W., Kirkpatrick H.A., Goeden M.A., Rose D.J., Mau B., Shao Y. (1997). The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277, 1453-1474 48. Fleischmann R.D., Adams M.D., White O., Clayton R.A., Kirkness E.F., Kerlavage A.R., Bult C.J., Tomb J.-F., Dougherty B.A., Merrick J.M., McKenne y K., Sutton G., Fitzhugh W., Fields C.A., Gocayne J.D., Scott J.D., Shirley R., Liu L.-I., Glodek A., Kelley J.M., Weidman J.F., Phillips C.A., Spriggs T., Hedblom E., Cotton M.D., Utterback T.R., Hanna M.C., Nguyen D.T., Saudek D.M., Brandon R.C., Fine L.D., Fritchman J.L., Fuhrmann J.L., Geoghagen N.S.M., Gnehm C.L., McDonald L.A., Small K.V., Fraser C.M., Smith H.O., Venter J.C. (1995). Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd., Science 269, 496-512 49. Peterson J.A., Lu J.-Y., Geisselsoder J., Graham-Lorence S., Carmona C., Witney F., Lorence M.C. (1992). Cytochrome P-450terp. Isolation and purification of the protein and cloning and sequencing of its operon. J. Biol. Chem. 267, 14193-14203 50. Naud, I., Vinçon, M., Garin, J., Gaillard, J., Forest, E., Jouanneau, Y. (1994).


Purification of a sixth ferredoxin from Rhodobacter capsulatus. Primary structure and biochemical properties. Eur. J. Biochem. 222, 933-939 51. Peterson J.A., Lorence M.C., Amarneh B. (1990). Putidaredoxin reductase and putidaredoxin. Cloning, sequence determination, and heterologous expression of the proteins. J. Biol. Chem. 265, 6066-6073. 52. Nagy I., Schoofs G., Compernolle F., Proost P., Vanderleyden J., de Mot R. (1995). Degradation of the thiocarbamate herbicide EPTC (S-ethyl dipropylcarbamothioate) and biosafening by Rhodococcus sp. strain NI86/21 involve an inducible cytochrome P-450 system and aldehyde dehydrogenase. J. Bacteriol. 177, 676-687 53. Hanukoglu, I. (1992). Steroidogenic enzymes: structure, function, and regulation of expression. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 43, 770-804 54. Morgan T.V., Lundell D.J., Burgess B.K. (1988). Azotobacter vinelandii ferredoxin I: cloning, sequencing, and mutant analysis. J. Biol. Chem. 263, 1370-1375 55. Saeki K., Wakabayashi S., Zumft W.G., Matsubara H. (1988). Pseudomonas stutzeri ferredoxin: close similarity to Azotobacter vinelandii and Pseudomonas ovalis ferredoxins. J. Biochem. 104, 242-246 56. Sato S., Nakazawa K., Hon-Nami K., Oshima T. (1981). Purification, some properties and amino acid sequence of Thermus thermophilus HB8 ferredoxin. Biochim. Biophys. Acta 668, 277-289 57. Hille R., Yoshida T., Tarr G.E., Williams C.H. Jr., Ludwig M.I., Fee J.A., Kent T.A., Huynh B.H., Munck E. (1983). Studies of the ferredoxin from Thermus thermophilus. J. Biol. Chem. 258, 13008-13013 58. Moulis J.M. (1996). Molecular cloning and expression of the gene encoding Chromatium vinosum 2[4Fe-4S] ferredoxin. Biochim. Biophys. Acta 1308, 12-14

59. Minami Y., Wakabayashi S., Yamada F., Wada K., Zumft W.G., Matsubara H. (1984). Ferredoxins from the photosynthetic purple non-sulfur bacterium Rhodopseudomonas palustris. Isolation and amino acid sequence of ferredoxin I. J. Biochem. 96, 585-592 60. Tanaka M., Haniu M., Yasunobu K.T., Evans M.C.W., Rao K.K. (1974). Amino acid sequence of ferredoxin from a photosynthetic green bacterium, Chlorobium limicola. Biochemistry 13, 2953-2959 61. Matsubara H., Inoue K., Hase T., Hiura H., Kakuno T., Yamashita J., Horio T. (1983). Structure of the extracellular ferredoxin from Rhodospirillum rubrum: close similarity to clostridial ferredoxins. J. Biochem. 93, 1385-1390 62. Graves M.C., Mullenbach G.T., Rabinowitz J.C. (1985). Cloning and nucleotide sequence determination of the Clostridium pasteurianum ferredoxin gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1653-1657 63. Bruschi M. (1979). Amino acid sequence of Desulfovibrio gigas ferredoxin: revisions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 91, 623-628 64. Bruschi M., Guerlesquin F.A., Bovier-Lapierre G.E., Bonicel J.J., Couchoud P.M. (1985). Amino acid sequence of the [4Fe-4S] ferredoxin isolated from Desulfovibrio desulfuricans Norway. J. Biol. Chem. 260, 8292-8296 65. Bruschi M., Hatchikian E.C. (1982). Non-heme iron proteins of Desulfovibrio: the primary structure of ferredoxin I from Desulfovibrio africanus. Biochimie 64, 503-507 66. Sorokin A.V., Azevedo V., Zumstein E., Galleron N., Ehrlich S.D., Serror P. (1996). Sequence analysis of the Bacillus subtilis chromosome region between the serA and kdg loci cloned in a yeast artificial chromosome. Microbiology 142, 2005-2016 67. Reyntjens, B., Jollie, D.R., Stephens, P.J., Gao-Sheridan, H.S., Burgess, B.K. (1997). Purification and characterization of a


fixABCX-linked 2[4Fe-4S] ferredoxin from Azotobacter vinelandii. JBIC 2, 595-602 68. Stout C.D., Stura E.A., McRee D.E. (1998). Structure of Azotobacter vinelandii 7Fe ferredoxin at 1.35 Å resolution and determination of the [Fe-S] bonds with 0.01 Å accuracy. J. Mol. Biol. 278, 629-639 69. Schipke C.G., Goodin D.B., McRee D.E., Stout C.D. (1999). Oxidized and reduced Azotobacter vinelandii ferredoxin I at 1.4 Å resolution: conformational change of surface residues without significant change in the [3Fe-4S]+/0 cluster. Biochemistry 38, 8228-8239 70. Beinert, H., Thomson, A.J. (1983). Three-iron clusters in iron-sulfur proteins. Arch. Biochem. Biophys. 222, 333-361 71. Camack, R., Rao, K.RK., Hall, D.O., Moura, J.J.G., Xavier, A.V., Bruschi, M., LeGall, J., Deville, A., Gayda, J.-P. (1977). Spectroscopic studies of the oxidation-reduction propertiess of three forms of ferredoxin from Desulfovibrio gigas. Biochim. Biophys. Acta 490, 311-321 72. Moura, J.J.G., Moura, I., Kent, T.A., Lipscomb, J.D., Huynh, B.H., LeGall, J., Xavier, A.V., Münck, E. (1982).Inter conversion of [3Fe-3S] and [4Fe-4S] clusters. Mössbauer and electron paragmagnetic studies of Desulfovibrio gigas ferredoxin II.J. Biol. Chem. 257, 6259-6267 73. Kissinger, C.R., Sieker, L.C., Adman, E.T. (1991). Refined crytal stucture of ferredoxin II from Desulfovibrio gigas at 1.7 Å. J. Mol. Biol. 219, 693-715 74. Hatchikian, E.C., Chaigneau, M., LeGall, J. (1976). In Microbial Production and Utilization of Gases. (Schegel, H.G., Gottschalk, G., Pfennig, N., eds.), pp. 109-118, Goltze, Gottingen 75. Bovier-Lapierre G.E., Bruschi M., Bonicel J.J., Hatchikian E.C. (1987). Amino-acid sequence of Desulfovibrio africanus ferredoxin III: a unique structural feature for accommodating iron-sulfur clusters. Biochim. Biophys. Acta 913, 20-26

76. Busse S.C., la Mar G.N., Yu L.P., Howard J.B., Smith E.T., Zhou Z.H., Adams M.W.W. (1992). Proton NMR investigation of the oxidized three-iron clusters in the ferredoxins from the hyperthermophilic archae Pyrococcus furiosus and Thermococcus litoralis. Biochemistry 31, 11952-11962 77. Howard, J.P., Rees, D.C. (2000). In Prokaryotic Nitrogen Fixation. A Model System for the Analysis of a Biological Procress (Triplett, E.W., ed.).Structure of the nitrogenase protein components. Pp. 31-55, Horizon Scientific Press, Norfolk 78. Howard, J.B., Rees, D.C. (2000). In Prokaryotic Nitrogen Fixation. A Model System for the Analysis of a Biological Procress (Triplett, E.W., ed.). Structure of the nitrogenase protein components. Pp. 43-53, Horizon Scientific Press, Norfolk 79. Prince, R.C., Grossman, M.J. (1993). Novel iron clusters. TIBS 18, 1543-154 80. Georgidias, M.M., Komiya, H., Chakrabarti, P., Woo, D., Komuc, J.J., Rees, D.C. (1992). Crystallographic structure of the nitrogenase iron protein from Azotobacter vinelandii. Science 257, 1653-1659 81. Kim, J., Rees, D.C. (1992). Crystallographic structure and functional implications of the nitrogenase molybdenum-iron protein from Azotobacter vinelandii. Nature 360, 553-560 82. Kim, J., Rees, D.C. (1992). Structural models for the metal centers in the nitrogenase molybdenum-iron protein. Science 257, 1677-1682 83. Flint, D.H., Tuminello, F.F., Miller, T.J. (1996). Studies on the synthesis of the Fe-S cluster of dihydroxy-acid dehydratase in Escherichia coli crude extract. Isolation of o-acetylserine sulfhydrylases A and B and β-cystathionase based on their ability to mobilize sulfur from cysteine and to participate in Fe-S cluster synthesis. J. Biol. Chem. 271, 16053-16068


84. Zheng, L., Dean, D.R. (1994). Catalytic formation of a nitrogenase iron-sulfur cluster. J. Biol. Chem. 269, 18723-18726 85. Zheng, L. White, R.H., Cash, V.L., Jack, R.F., Dean, D.R. (1992). Cysteine desulfurase activity indicates a role for NIFS in metallocluster biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2754-2758 86. Rangaraj, P., Rüttimann-Johnson, C., Skah, V.K., Ludden, P.W. (2000). In Prokaryotic Nitrogen Fixation. A Model System for the Analysis of a Biological Procress (Triplett, E.W., ed.). Biosynthesis of the iron-molybdenum and iron-vanadium cofactors of the nif- and vnf-encoded nitrogenases. Pp. 55-79, Horizon Scientific Press, Norfolk 87. Denk, D., Böck, A. (1987). L-Cysteine biosynthesis in Escherichia coli: Nucleotide sequence and expression of the serine acetyltransferase (CysE) gene from the wild-type and a cysteine-secreting mutant. J. Gen. Microbiol. 13,. 515-525 88. Zheng. L., Cash, V.L., Flint, D.H., Dean, D.R. (1998). Assembly of iron-sulfur clusters. Identification of an iscSUA-hscBA-fdx gene cluster from Azotobacter vinelandii. J. Biol. Chem. 273. 13264-13272 89. Nakamura, M., Saeki, K., Takahaschi, Y. (1999). Hyperproduction of recombinant ferredoxins in Escherichia coli by co-expression of the ORF1-ORF2-iscS-iscU-iscA-hscB-hscA-fdx-ORF3 gene cluster. J. Biochem. 126, 10-18 90. Takahaschi, Y., Nakamura, M. (1999). Functional assignment of the -ORF2-icsS-icsU-icsA-hscB-hscA-fdx-ORF3 gene cluster involved in the assembly of Fe-S clusters in Escherichia coli. J. Biochem. 126, 917-926

2

Hoge potentiaal ijzer-zwaveleiwitten

2.1. INLEIDING 31

2.2. HIPIP VERSUS FERREDOXINE: DE ‘THREE-STATE HYPOTHESIS’ 33

2.3. VERBAND TUSSEN TYROSINE EN HOGE REDOXPOTENTIAAL? 34

2.4. RUIMTELIJKE STRUCTUUR EN ALIGNATIE 36

2.5. HIPIP’S IN DIMERE VORM? 41

2.6. BIOLOGISCHE ROL VAN HIPIP 42

2.7. REFERENTIES 48

Hoofdstuk 2. Hoge potentiaal ijzer-zwaveleiwitten 31

Hoofdstuk 2

Hoge potentiaal ijzer-zwaveleiwitten

2.1. Inleiding Een Hoog Potentiaal IJzer-Zwaveleiwit (‘High Potential Iron-Sulfur Protein’, afgekort

HiPIP, is een klein proteïne dat, over het algemeen, in fotosynthetische bacteriën (α-, β- en γ-groep van de Proteobacteriën) in grote hoeveelheden voorkomt en dus relatief gemakkelijk te zuiveren is. HiPIP’s behoren tot de groep van de [4Fe-4S]-ferredoxines, besproken in het vorige hoofdstuk.

De redoxpotentiaal waarbij de elektronen overgedragen worden is in het geval van ferredoxines zeer negatief (-200 tot -400 mV). De HiPIP’s daarentegen transfereren elektronen bij een hoge oxidatiereductie-potentiaal (Tabel 2.1), zoals hun naam reeds aangeeft. Volgens de Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry. Nomenclature of electron-transfer proteins, Recommendations 1989 [1] is het niet meer wenselijk om [4Fe-4S]-ferredoxines te klasseren volgens hun oxidatiereductie-potentiaal, maar wel volgens de fysiologische oxidatietoestand waarin het cluster kan voorkomen.

Dezelfde instantie raadt ook aan om de uitdrukking 'high potential iron-sulfur protein'

(HiPIP) te gebruiken als verwijzing naar het ijzer-zwaveleiwit dat in fotosynthetische bacteriën oorspronkelijk geïsoleerd werd, met als notatie [4Fe-4S]2/3+ , 2/3+ verwijzend naar de twee mogelijke fysiologische oxidatietoestanden van het cluster. In feite zijn er drie mogelijke oxidatietoestanden van een ijzer-zwavelcluster:

[4Fe-4S]1+ √ [4Fe-4S]2+ √ [4Fe-4S]3+

In deze voorstelling zijn de cysteïneliganden niet opgenomen. Als er wel rekening gehouden wordt met de formele lading van het zwavelatoom van de cysteïnezijketen (-1), kunnen de oxidatietoestanden ook als volgt worden voorgesteld:

([4Fe-4S]SR4)3- √ ([4Fe-4S]SR4)2- √ ([4Fe-4S]SR4)1-

De bovenstaande formules stellen een ijzer-zwavelcluster als een geheel voor, waarbij SR voor een thiolaat-zijketen van cysteïne staat wanneer het een onderdeel is van een aan het eiwit gebonden cluster. De clusters zijn opgebouwd uit gemengde valentie ijzeratomen waarbij de structuur [4Fe-4S]2+ overeenstemt met twee Fe2+- en twee Fe3+-ionen.


Tabel 2.1. Overzicht van tot nu toe gekende HiPIP’s Bacterie

Foto- synthese

Em (mV)

Sequentie: referentie

HiPIP’s

Allochromatium vinosum ja + 365 [2] Thiococcus pfennigii ja + 345 [3] Rubrivivax gelatinosus ja + 330 [4] Paracoccus sp. neen + 360 [5] Rhodocyclus tenuis strain 3761 ja + 380 [6] Thiocapsa roseopersicina ja + 345 [7] Marichromatium gracile ja + 350 [7] Halorhodospira halophila iso 1 ja + 115 [8] Halorhorhodospira halophila iso 2 ja + 50 [8] Rhodocyclus tenuis strain 2761 ja + 330 [9] Thermochromatium tepidum ja + 323 [10] Rhodopila globiformis ja + 450 [11] Rhodothermus marinus neen + 260 [12, 13] Ectothiorhodospira vacuolata iso 1 ja + 244 [14] Ectothiorhodospira vacuolata iso 2 ja + 169 [14] Rhodoferax fermentans ja + 351 [15] Rhodovibrio salinarum iso 1 ja + 265 [16] Rhodovibrio salinarium iso 2 ja + 500 [16] Rhodopseudomonas palustris ja [17] Marichromatium purpuratum ja + 390 [18] Halochromatium salexigens ja dit werk Isochromatium buderi ja + 138* dit werk Allochromatium warmingii ja + 355 dit werk Thiocapsa sp., stam CAU ja ( + 130)*, a dit werk Thiocystis violace ja + 71* dit werk Ectothiorhodospira vacuolata iso 3 ja dit werk Ectothiorhodospira mobilis iso 1 ja ( + 87)* , a dit werk Ectothiorhodospira mobilis iso 2 ja (+ 202)* , a dit werk Ectothiorhodospira shaposnikovii iso 1 ja + 270 dit werk Ectothiorhodospira shaposnikovii iso 2 ja + 155 dit werk Rhodopseudomonas cryptolactis ja + 424* dit werk Rhodomicrobium vannielii ja + 429* dit werk Rhodobium marinum ja + 345 dit werk

Fe (II) oxidase

Acidithiobacillus ferrooxidans neen [19]

• * Redoxpotentiaalmetingen uitgevoerd in het laboratorium van Prof. Dr. W. Hagen • a Metingen dienen hernomen te worden wegens gebrek aan hoeveelheid materiaal


Figuur 2.2. EPR spectrum van

geoxideerd Rhodotermus marinus HiPIP [12-13].

2.2. HiPIP versus ferredoxine: de ‘Three state hypothesis’ Carter en medewerkers introduceerden een 'Three state hypothesis' om de

potentiaalverschillen tussen ferredoxinen en HiPIP's te begrijpen (Fig. 2.1) [20]. Ze gingen er van uit dat deze verschillen te wijten zijn aan de verschillende oxidatietoestanden die een ijzer-zwavelcluster kan innemen. Via EPR-studies van ferredoxinen en HiPIP’s stelden ze

vast dat een ijzer-zwavelcluster van een geoxideerd ferredoxine en een gereduceerd HiPIP in gelijkaardige toestand, toestand C, voorkomt dat diamagnetisch is en geen EPR-signaal geeft.

Het HiPIP-cluster zou in staat zijn om verder te oxideren naar een paramagnetische toestand (C+, g-waarden = 2.12 en 2.04, zie ook Figuur 2.2) waarbij zo'n oxidatieproces in ferredoxine niet mogelijk is door de afwezigheid van een hogere redoxpotentiaal. Het ferredoxine-cluster kan wel gereduceerd worden naar een andere paramagnetische toestand (C-, g-waarden= 2.07, 1.93 en 1.89) waarbij dit proces in HiPIP een lager redoxpotentiaal vereist.

De auteurs stelden ook vast dat een HiPIP-eiwit gedeeltelijk wordt ontvouwen na behandeling met 70% dimethylsulfoxide, waardoor de ijzer-zwavelcluster verder kan worden gereduceerd naar een andere, maar paramagnetisch gelijkaardige, toestand van gereduceerd ferredoxine [23]. Omkeerbare superreductie van Rhodopila globiformis HiPIP met Ti(III)-citraat in een niet-denaturende

- 500 mV

0 mV

+ 500 mV

3Fe2+ + 1Fe3+

2Fe2+ + 2Fe3+

1Fe2+ + 3Fe3+

Formele ladingen ferredoxineHiPIP“Toestand”

C-

C

C+ g = 2.12, 2.04

g = 2.04, 1.93, 1.89

EPR waarden

gereduceerd Fd

geoxideerd Fd

+ e-- e-

- e-

Super-gereduceerd HiPIP

gereduceerd HiPIP

geoxideerd HiPIP

+ e-

+ e-- e-

super- geoxideerd Fd

Figuur 2.1. ‘Three state’-theorie voor een HiPIP en een ferredoxine [20-22].


Figuur 2.3. Close-up van een tyrosine (rood) en

het cluster (S, gele bol en Fe, grijze) van Hlr. halophila HiPIP [35-36].

omgeving werd ook met succes onderzocht [24]. Op basis van de ruimtelijke structuur van het Allochromatium vinosum HiPIP-eiwit namen Carter en medewerkers waar dat het cluster op een grotere diepte in het eiwit begraven ligt dan het geval is voor een 8Fe-ferredoxine, en bovendien sterk op zijn plaats gehouden wordt [20, 25-26]. Het is ook het enige ijzer-zwaveleiwit waarvan een ruimtelijke structuur in beide oxidatietoestanden bepaald werd. Er zijn duidelijke verschillen in de Fe-Fe afstand tussen het geoxideerd (2.72Å) en het gereduceerd (2.81Å) cluster. Verder is er ook een kleine verandering in de algemene geometrie van het kubisch cluster (cubaan) te zien. In gereduceerde toestand vertoont het cluster een distortie ten opzichte van de geoxideerde toestand, waardoor de afstand tussen twee ijzeratomen iets langer wordt [27].

2.3. Verband tussen tyrosine en hoge redoxpotentiaal? Na de introductie van de ‘three state hypothesis’ om de verschillende

oxidatietoestanden tussen HiPIP en ferredoxine uit te leggen werden de eerste ruimtelijke structuren van HiPIP en ferredoxines vergeleken [20-22]. Daarbij werd het aantal NH—S waterstofbindingen tussen de amidezijketens en zwavelatomen van het ijzer-zwavelcluster vergeleken [26, 28-29]. In een ferredoxine zijn acht NH—S waterstofbindingen met en rondom het cluster aanwezig, terwijl er in een HiPIP slechts vijf gevonden worden. Deze waterstofbindingen stabiliseren de sterk negatief geladen zwavelatomen van het cluster. Door deze onderzoekers werd een mogelijk verband tussen het aantal waterstofbindingen rondom het ijzer-zwavelcluster en de oxidatietoestand van het cluster, met de daaruit voortvloeiende redoxpotentiaal, voorgesteld. Maar later is deze visie, na publicaties van nieuwe ruimtelijke structuren van ferredoxinen en HiPIP's en door resonantie-Ramanstudies op verschillende ijzer-zwaveleiwitten, in vraag gesteld [30-34].

Carter en andere onderzoekers stelden voorop dat het conservatief tyrosineresidu (zie

ook paragraaf 2.4), in de directe omgeving van het ijzer-zwavelcluster daarin een mogelijke rol zou spelen. In de ruimtelijke structuur van Halorhodospira halophila iso-1 HiPIP is de aromatische ring van tyrosine-12 (halophila nummering) op een afstand van 4.0 à 4.5 Å van het zwavelatoom van het cluster gelegen (Fig. 2.3). De licht positief geladen aromatische ring kan dus interageren met het negatief geladen zwavelatoom. Verder vormt de hydroxylzijketen van de aromatische ring van dit tyrosineresidu waterstofbruggen met het zuurstofatoom van asparagine-19, resp. het amine van de lysine-59 zijketen.

Dat dit conservatieve tyrosine-

residu wel degelijk een belangrijke rol speelt bleek nadien uit een experiment waarbij tyrosine-12 van Halorhodospira halophila HiPIP iso 1 door plaatsgerichte


mutagenese vervangen werd door fenylalanine (Yl2F), histidine (Yl2H), tryptofaan (Yl2W), isoleucine (Yl2I) en alanine (Yl2A). Alle mutanten, inclusief het recombinant wildtype HiPIP (RcWt), konden met vergelijkbare opbrengsten tot overexpressie gebracht en geïsoleerd worden gedurende celgroei bij lage temperatuur. In tegenstelling tot de eerste drie mutanten bleken Yl2I en Yl2A niet stabiel te zijn gedurende de opzuivering van het eiwit. Uit NMR-analyse van de Y12F mutant en het wildtype HiPIP bleek dat de Y12F-variant gedeeltelijk gedestabiliseerd wordt door het ontbreken van twee waterstofbruggen gevormd tussen de Tyr-12 hydroxylgroep en, respectievelijk, de aminozuren Asn-14 en Lys-59. Vergeleken met het wildtype bleken de varianten Y12H en Y12W ook gedeeltelijk instabiel te zijn, eveneens door het verlies van genoemde waterstofbruggen. De bekomen redoxpotentialen voor Y12F, Y12H en Y12W waren respectievelijk 17, 19 en 22 mV hoger dan de waarde voor het RcWt HiPIP [37]. Dezelfde experimenten met Allochromatium vinosum HiPIP (Tabel 2.2) resulteerden in gelijkaardige resultaten en besluiten [38].

Tabel 2.2. Gemeten reductiepotentialen voor natief en mutant HiPIP, geïsoleerd uit Halorhodospira halophila en Allochromatium vinosum [37-38].

HiPIP (halophila)

Potentiaal (mV)

HiPIP (vinosum)

Potentiaal (mV)

Wildtype 133 wildtype 367 Tyr12 à Trp 152 Tyr19 à Trp 380 Tyr12 à Phe 150 Tyr19 à Phe 375 Tyr12 à His 155 Tyr19 à His 354 Tyr19 à Ser 379 Tyr19 à Gln 334

Deze resultaten tonen dus aan dat het conservatief tyrosineresidu een belangrijke rol speelt in de stabilisatie van het ijzer-zwavelcluster door de elektrostatische interactie van zijn aromatische ring naar het cluster toe, en door vorming van de hierboven besproken waterstofbruggen, maar dat het geen grote rol speelt in de vorming van de hoge redoxpotentiaal. De stabiliteit van het ijzer-zwavelcluster wordt ook bevorderd door de aanwezigheid van verscheidene aromatische en hydrofobe aminozuren rondom het cluster, waardoor water buiten wordt gehouden. Een verlaging van de clusterstabiliteit, door vermindering van de hydrofobe barrière en een verhoogde solvent-toegankelijkheid, is in overeenstemming met de waarnemingen voor de Y12A- en Y12I-mutanten, en met de instabiliteit van Rhv. salinarum iso 2 HiPIP dat, in tegenstelling tot de andere HiPIP's, geen conservatief tyrosineresidu heeft wegens de deletie van een groot N-terminaal fragment [16].

Nu spelen het aantal NH—S waterstofbindingen rondom het ijzer-zwavelcluster en de

aanwezigheid van het conservatief tyrosineresidu geen rol in de modulatie van de gemeten redoxpotentiaal van +50 mV (Halorhodospira halophila iso 2) tot +500 mV (Rhodovibrio salinarum iso 2). Deze grote potentiaalverschillen zijn vermoedelijk het resultaat van verschillen in het aantal geladen aminozuren in de directe omgeving van het cluster of van de totale lading van het eiwit, welke varieert van -13 tot +5 [39-41]. Zet men de totale lading van het eiwit uit in het functie van de gemeten redoxpotentiaal (Fig. 2.4), dan onderscheidt men twee belangrijke groepen HiPIP’s [41].


Figuur 2.4. Invloed van eiwitlading op redoxpotentialen van HiPIP [41].

De eerste groep wordt gevormd door de op Chromatium-gelijkende HiPIP’s die de volgende bacteriën omvat: Rhodocyclus tenuis, Rubrivivax gelatinosus, Allochromatium vinosum, Marichromatium gracile, Thiocapsa roseopersicina en Thiococcus pfennigii. Ook het Paracoccus HiPIP kan allicht tot deze groep gerekend worden, ondanks het feit dat zijn potentiaal 50 mV lager is dan verwacht. Deze HiPIP’s hebben een potentiaal van rond de

+333 mV en zijn onafhankelijk van de totale eiwitlading.

De tweede groep omvat de op Ectothiorhodopira-gelijkende HiPIP’s, geïso-leerd uit Ectothiorhodospira vacuolata (iso 1 en 2), Halorhodospira halophila (iso 1 en 2), Rhodopila globiformis en Rhodovibrio salinarum (iso 2). De potentialen van deze HiPIP’s worden sterk beïnvloed door de totale eiwitlading. Het verband tussen de gemeten potentiaal en de nettolading van redoxeiwitten werd reeds gepostuleerd door Rees [42]. Voor één-elektrontransporterende eiwitten zoals HiPIP’s, ferredoxinen, flavodoxinen, azurinen en cytochromen werd een verschil van 23 mV per lading gevonden. Men weze echter indachtig dat een mogelijke interactie van het

redoxcentrum met de nettolading van het eiwit minder belangrijk is dan een interactie met de in een eiwit begraven ladingen of hydrofobe/aromatische residuen rondom het redoxcentrum of cluster [43].

De amidegroep tussen de aminozuren 78 en 79 van Allochromatium vinosum HiPIP komt, net zoals voor het al besproken conservatief tyrosineresidu, dicht in de buurt van het ijzerzwavel cluster voor en interageert via een waterstofbrug met de γ-zwavel van Cys77, één van het clusterliganden. De gemeten redoxpotentiaal van de S79P mutant was ongeveer 104 mV lager dan die bepaald voor het wildtype eiwit (+ 367 mV). Een NMR-studie toonde aan dat deze substitutie heel weinig effect veroorzaakt in de ruimtelijke structuur van het eiwit of van het cluster. Theoretische energieberekeningen leerden ons dat de verschillen in de gemeten reductiepotentialen te wijten zijn aan de verschillen in elektrostatische eigenschappen van residu 79 in de S79P variant en het wildtype ten overstaan van het ijzerzwavel cluster en/of de directe omgeving van residu 79. Deze resultaten vormden een aanwijzing voor het belang van in het eiwit begraven polaire en/of geladen aminozuren en de gemeten reductiepotentialen van HiPIP’s [44].

2.4. Ruimtelijke structuur en alignatie Na de publicatie in 1972 van de eerste ruimtelijke structuur van een HiPIP, deze van

Allochromatium vinosum, zijn er nog vijf andere X-stralenkristallografische [18, 26, 33, 36, 45-46] en/of NMR [47-54] HiPIP structuren bepaald, nml. van Ectotothiorhodospira vacuolata iso-2, Halorhodospira halophila iso-1, Rhodocyclus tenuis 2761, Marichromatium purpuratum, en Thermochromatium tepidum. Zoals geldt voor alle andere HiPIP-structuren vertoont de Marichromatium purpuratum molecule (Fig. 2.5) weinig secundaire structuurelementen en bevat het regio’s bestaande uit β-strengen (‘sheet’) en loops (‘turns’) die het centrale ijzer-zwavelcluster van de omgeving afschermen.


Figuur 2.5. Ruimtelijke structuur van Marichromatium purpuratum HiPIP [18].

Figuur 2.6. Superpositionering van de α-koolstofketen van de ruimtelijke structuren van de HiPIP’s uit Allochromatium vinosum (rood), Marichromatium purpuratum (geel), Ecthothiorhodospira vacuolata iso 1 (groen), Halorhodospira halophila iso 2 (blauw) en Rhodocyclus tenuis (oranje) .


Een opvallend en belangrijk secundair structuurelement, een α-helix, is gelokaliseerd in het N-terminaal gedeelte van het eiwit en is opgebouwd uit 4 tot 9 aminozuren. In Fig. 2.6. worden de α-koolstof ruggengraatketens van de vijf gekende HiPIP’s weergegeven; ze laten zien dat er drie belangrijke conservatieve regio’s zijn: regio I (16-30, Figuur 2.7 nummering), regio II (44-57) en regio III (67-100). De drie regio’s zijn met elkaar verbonden door lussen (loop) van verschillende lengte. De clusterbindende cysteïnes bevinden zich in regio’s II en III en het conservatieve tyrosineresidu in regio I. Figuur 2.6 werd ook als ‘blauwdruk’ gebruikt voor de correcte alignatie (Fig. 2.7) van alle in de literatuur gekende sequenties, met uitzondering van de Rhodopseudomonas palustris-sequentie. Laatstgenoemde sequentie werd opgespoord op een website met een vrijgegeven genoomdatabase, en de Marichromatium purpuratum-sequentie werd uit de kristallografische structuurgegevens afgeleid.

Op basis van de in Figuur 2.7 weergegeven alignatie kan men de gekende HiPIP-

sequenties in vijf belangrijke groepen onderverdelen.

2.4.1. HiPIP groep 1

De eerste groep wordt ingenomen door HiPIP’s geïsoleerd uit Allochromatium vinosum, Marichromatium gracile en purpuratum, Thermochromatium tepidum, Thiocapsa roseopersicina en Thiococcus pfennigii. Al deze bacteriën behoren tot de groep der purper fotosynthetische bacteriën, meer bepaald tot de γ-groep (Chromatiaceae) [55] en hebben HiPIP’s met de langst gekende aminozuurketen (81 tot 85 residu’s). Van deze groep zijn er drie ruimtelijke structuren bekend: Allochromatium vinosum, Marichromatium purpuratum and Thermochromatium tepidum [18, 26, 46].


HiPIP’s van Ectothiorhodospira vacuolata en Paracoccus halodenitrificans vormen een tweede groep, gekenmerkt door een deletie van vijf aminozuren in regio 37-41 en van drie aminozuren in regio 58-60, resulterend in een kleinere lus tussen de regio’s I-II en II-III. Die laatste deletie vinden we ook terug in de Rhodoferax fermentans en Rubrivax gelatinosus HiPIP’s. Deze twee species vertonen een deletie van slechts twee, in plaats van vijf, aminozuren in regio 58-60. Tenslotte heeft Paracoccus halodenitrificans, een denitrificerende bacterie behorend tot de α-groep van de purperbacteriën [56], een extra deletie van vier aminozuren in regio 61-64. Rhodoferax fermentans en Rubrivivax gelatinosus behoren tot de β-groep van de fototrofe bacteriën [57], en Ectothiorhodospira vacuolata tot de γ-groep (Ectothiorhodospiraceae). Deze laatste groep verzamelt fotosynthetische organismen waarvan de fysiologische karakteristieken en de specifieke groeiwijze aanduiden dat het om een verwante soort gaat, behorend tot de familie van de Chromatiaceae. Deze organismen gebruiken H2S als elektrondonor in het fotosynthetisch proces en maken er elementaire zwavel uit. In tegenstelling tot de tot nu toe gekende Chromatiaceae zetten ze zwavel af onder de vorm van globulen buiten de cel, in het groeimedium [58].

2.4.3. HiPIP groep 3 De derde groep bevat Halorhodospira halophila HiPIP’s die verschillen van de

tweede groep door een bijkomende deletie van vier aminozuren in regio 15-18 en door een insertie van een Pro-Asp sequentie in regio 79-80. De iso-2 HiPIP-sequentie bevat tevens vijf extra aminozuren aan de N-terminus van het eiwit die niet bij andere gekende sequenties


Allochromatium vinosumThiocapsa roseopersicinaMarichromatium gracileMarichromatium purpuratumThermochromatium tepidumThiococcus pfennigiiRhodoferax fermentansRubrivivax gelatinosusEctothiorhodospira vacuolata 1Ectothiorhodospira vacuolata 2Paracoccus sp.Halorhodospira halophila 1Halorhodospira halophila 2Rhodocyclus tenuis 2762Rhodocyclus tenuis 3761Rhodovibrio salinarum 1Rhodopila globiformisRhodopseudomonas palustrisAcidit hi obacillus ferrooxidansRhodovibrio salinarum 2

10 20 30

S A P A N A V A A D D A T A I A L K Y N Q D A T KE A P A N A V A A N D P T A V A L K Y N A D A T KE V P A N A V T E S D P T A V A L K Y H R N A E A

V P A N A V T E S D P A A V A L K Y H R D A A EA A P A N A V T A D D P T A I A L K Y N Q D A T KE D L P H V D A A T N P I A Q S L H Y I E D A N A

A A P L V A E T D A N A K S L G Y V A D T T KA P V D E K N P Q A V A L G Y V S D A A K

A E R L D E N S P E A L A L N Y K H D G A SM E R L S E D D P A A Q A L E Y R H D A S S

Q D L P P L D P S A E Q A Q A L N Y V K D T A EE P R A E D - - - - G H A H D Y V N E A A D

G L P D G V E D L P K A E D - - - - D H A H D Y V N D A A DG T N - - - A A M R K A F N Y Q Q D T A KG T N - - - A S M R K A F N Y Q E V S K T

Q - - - K A P K Q A V Q Y - Q E N P KQ D - - - K I D P K M V Q Y - Q D S P K

Q V T K - - - K A S H K D A G Y - Q E S P NG - - - S M P K A A V Q Y - Q D T P K

Allochromatium vinosumThiocapsa roseopersicinaMarichromatium gracileMarichromatium purpuratumThermochromatium tepidumThiococcus pfennigiiRhodoferax fermentansRubrivivax gelatinosusEctothiorhodospira vacuolata 1Ectothiorhodospira vacuolata 2Paracoccus sp.Halorhodospira halophila 1Halorhodospira halophila 2Rhodocyclus tenuis 2762Rhodocyclus tenuis 3761Rhodovibrio salinarum 1Rhodopila globiformisRhodopseudomonas palustrisAcidit hiobacillus ferrooxidansRhodovibrio salinarum 2

40 50 60

S E R V A A A R P G L P P E E Q H C A N C Q F M Q A D A A GS D R L A A A R P G L P P A E Q H C A N C Q F H L D D V A GS E R V A A A R P G L P P E E Q H C E N C Q F M L P D Q - -S S R V A A A R P G L P P E E Q H C E N C Q F M N P D Q - -S E R V A A A R P G L P P E E Q H C A N C Q F M Q A N V - -S E R N P V T K T E L P G S E Q F C H N C S F I Q A D - - -A D - K T K Y P K - - H T K D Q S C S T C A L Y Q G K - - -A D - K A K Y K Q - - F V A G S H C G N C A L F Q G K - - -V D - H P S - - - - - H A A G Q K C I N C L L Y T D P - - -V Q - H P A - - - - - Y E E G Q T C L N C L L Y T D A - - -A A D H P A - - - - - H Q E G E Q C D N C M F F Q A D - - -A S G H P R - - - - - Y Q E G Q L C E N C A F W G E A - - -T D - H A R - - - - - F Q E G Q L C E N C Q F W V D Y - - -- - - - - - - - - - - - - N G K K C S G C A Q F V P G A - -- - - - - - - - - - - - - A G K N C A N C A Q F I P G A - -- - - - - - - - - - - - - G D Q H C A N C Q F G I A P E - -- - - - - - - - - - - - - D G N K C S T C V N F E A P - - -- - - - - - - - - - - - - G A K R C G T C R Q F R P P - - -- - - - - - - - - - - - - G K D H C S V C A Q F I A P - - -

M Q C N N C R F F H A A - - -

Figuur 2.7. Alignatie van HiPIP's. Conservatieve residuen zijn aangeduid op een grijze achtergrond.


Allochromatium vinosumThiocapsa roseopersicinaMarichromatium gracileMarichromatium purpuratumThermochromatium tepidumThiococcus pfennigiiRhodoferax fermentansRubrivivax gelatinosusEctothiorhodospira vacuolata 1Ectothiorhodospira vacuolata 2Paracoccus sp.Halorhodospira halophila 1Halorhodospira halophila 2Rhodocyclus tenuis 2762Rhodocyclus tenuis 3761Rhodovibrio salinarum 1Rhodopila globiformisRhodopseudomonas palustrisAcidit hiobacillus ferrooxidansRhodovibrio salinarum 2

70 80 90

A T D E W K G C Q L - - - - - - - - - - F P G K - L I N V NA T E E W H G C S L - - - - - - - - - - F P G K - L I N V DG A D E W R G C S L - - - - - - - - - - F P G K - L I N L DA A A D W K G C Q L - - - - - - - - - - F P G K - L I N L SG E G D W K G C Q L - - - - - - - - - - F P G K - L I N V N- S G A W R P C T L - - - - - - - - - - Y P G Y - T V S E D- T A P Q G A C P L - - - - - - - - - - F A G K - E V V A KA T D A V G G C P L - - - - - - - - - - F A G K - Q V A N KS A T E W G G C A V - - - - - - - - - - F P N K - L V N A NS A Q D W G P C S V - - - - - - - - - - F P G K - L V S A N- - - - S Q G C Q L - - - - - - - - - - F P Q N - S V E P AV Q D G W G R C T H - - - - - - - - P D F D E V - L V K A E- V N G W G Y C Q H - - - - - - - - P D F T D V - L V R G ES P T A A G G C K V - - - - - - - - - - I P G D N Q I A P GS A S A A G A C K V - - - - - - - - - - I P G D S Q I Q P TG G S E M G Q C Q I - - - - - - - - - - V Q G E - - I S P D- - - - - S S C K I - - - - - - - - - - V A G K - - I S P N- - - - - S S C I T - - - - - - - - - - V E S P - - I S E N- - - - - H S C K V - - - - - - - - - - V A G N - - I S P N- - - - Q T Q C R R Y A P Q P T A D A K N A H W P I V S A N

Allochromatium vinosumThiocapsa roseopersicinaMarichromatium gracileMarichromatium purpuratumThermochromatium tepidumThiococcus pfennigiiRhodoferax fermentansRubrivivax gelatinosusEctothiorhodospira vacuolata 1Ectothiorhodospira vacuolata 2Paracoccus sp.Halorhodospira halophila 1Halorhodospira halophila 2Rhodocyclus tenuis 2762Rhodocyclus tenuis 3761Rhodovibrio salinarum 1Rhodopila globiformisRhodopseudomonas palustrisAcidith iobacillus ferrooxidansRhodovibrio salinarum 2

100 110 120

G W C A S W T L K A GG W C A S W T L K A GG W C A S W T L R A GG W C A S W T L R A GG W C A S W T L K A GG W C L S W A H K T AG W C S A W A K K AG W C S A W A K K AG W C T A Y V A R GG W C T A W V A RG W C Q S W T A Q NG W C S V Y A P A SG W C S V Y A P AG Y C D A F I V K KG Y C D A Y I V K KA W C N L W A K AG W C I A Y A P M E D K K GG W C R L Y A G K AG W C V A F V P K S AD W C G E Y Q P A D K A A A T A

Figuur 2.7. Vervolg.


voorkomen. Van deze groep is enkel de ruimtelijke structuur van iso-1 HiPIP bepaald [36]. Deze aparte onderverdeling is in overeenstemming met de DNA:DNA hybridisatiestudies van het genus der Ectothiorhodospiraceae welke aantoonden dat er twee subgroepen bestaan. Enerzijds is er de subgroep met de extreem halofiele species waartoe Halorhodospira halophila behoort, anderzijds is er de subgroep met de gematigde halofiele species die met een lager zoutgehalte kunnen leven [59-61]; hiertoe behoort ook Ectothiorhodospira vacuolata.


De kleinste HiPIP’s (57-63 aminozuren), gevonden in Rhodocyclus tenuis, Rhodovibrio salinarum iso-1, Rhodopila globiformis en Rhodopseudomonas palustris, behoren tot de vierde groep en zijn het resultaat van een deletie van twaalf aminozuren in regio 31-43, waardoor een lus tussen regio I en II wordt geëlimineerd. Rhodopila globiformis en Rhodopseudomonas palustris bezitten ook een extra deletie van acht aminozuren in regio 58-65, waardoor een lus tussen regio II en III verwijderd is. Rhodocyclus tenuis behoort tot de β-groep van de purperbacteriën, terwijl Rhodopila globiformis bij de α-groep kan worden ingedeeld. Een voorbeeld van een ruimtelijke structuur van deze vierde groep wordt gegeven voor het eiwit van Rhodocyclus tenuis 2761 HiPIP [33].

2.4.5. HiPIP groepen 5 en 6

Op basis van de verschillende insertie-deletiepatronen in de vierde groep mag men gerust stellen dat HiPIP’s van Rhodopila globiformis, Rhodopseudomonas palustris en chemolithotrofe Acidithiobacillus ferrooxidans een mogelijke vijfde groep vormen, los van de Rhodocyclus tenuis en Rhodovibrio salinarum iso-1 sequenties. Door het ontbreken van een groot stuk N-terminale sequentie waarin het conservatieve tyrosineresidu voorkomt, door een acht residuën insertie in regio 71-88, en door een langere C-terminale extensie heeft Rhodovibrio salinarum iso-2 een aparte plaats in deze alignatie en kan men wellicht het bestaan van een zesde groep postuleren.

2.5. HiPIP’s in dimere vorm? Over het algemeen werden wateroplosbare hoge-potentiaal ijzer-zwaveleiwitten

geïsoleerd uit het periplasma van fotosynthetische bacteriën. In Rhodothermus marinus komt HiPIP zelfs voor als een intermembranair eiwit dat tijdens de opzuivering ook goed oplosbaar is in een waterig milieu [12-13]. Met uitzondering voor Rhodovibrio salinarum HiPIP isozyme II (tetrameer) [16], Acidithiobacillus ferrooxidans Fe(II)-oxidase (hexameer) [19] en Marichromatium purpuratum HiPIP (dimeer) [62] werden HiPIP's gedurende gelfiltraties als monomeer eiwit opgezuiverd.

De eerste aanwijzingen voor een mogelijke dimerisatie van HiPIP werden bij de kristallografische studies bekomen. Behalve Allochromatium vinosum HiPIP kristalleerden Marichromatium purpuratum, Rhodocyclus tenuis en Halorhodospira halophila HiPIP als dimeren [18, 33, 36]. De dimere opbouw van eiwitten in een kristal moge dan als een artefact gedurende kristallisatie bij hoog zoutgehalte beschouwd worden, toch zijn er indirecte aanwijzingen gevonden dat een HiPIP ook in oplossing als een dimeer, of zelfs als een oligomeer, voorkomt. Marichromatium purpuratum HiPIP vormt een stabiel dimeer gedurende elektroforese, in aanwezigheid van β-mercaptoëthanol en zonder voorafgaande verhitting. Nadat het staal wordt gekookt migreert het eiwit in het gel als een monomeer.


Dezelfde waarneming werd ook gedaan voor Thiococcus pfennigii HiPIP. Dit eiwit migreert als dimeer en zelfs als trimeer. Dat laatste zou veroorzaakt worden door de uitwisseling van zwavelbruggen tussen gedenatureerde moleculen, ondanks het gebruik van β-mercaptoëthanol als reductans [63]. Acidithiobacillus ferrooxidans Fe(II)-oxidase migreert tijdens elektroforese als een 63 kDa actief eiwit of als een 24 kDa inactief eiwit. Beide vormen konden tot een monomere vorm van 6 kDa omgezet worden, dit na opkoken van de stalen [19]. Een tegenargument voor deze waarneming is dat de verschillende SDS-PAGE migratiepatronen voor HiPIP’s te wijten zijn aan onvolledige denaturatie van het eiwit, waardoor koken noodzakelijk is voor complete denaturatie. Een andere indirecte aanwijzing voor oligomerisatie van HiPIP is de aanwezigheid van een g-waarde van 2.07 bij de EPR-analyse van Rhodotermus marinus en Allochromatium vinosum, mogelijks te wijten aan coöperatieve metaal-clusterinteractie [64-65]. Dat laatste wordt evenwel momenteel nog onderzocht.

Wegens gebrek aan duidelijke biochemische gegevens over oligomerisatie en variatie van de interdimere organisatie van verschillende HiPIP’s is het nog altijd niet duidelijk of een dimere toestand van HiPIP voor zijn biologische functie noodzakelijk is.

2.6. Biologische rol van HiPIP Omdat HiPIP vaak in fotosynthetische bacteriën (behorend tot de α-, β- en γ-groep

van de Proteobacteriën (zie Tabel 2.1) gevonden wordt is er steeds aan een mogelijke rol in de fotosynthese gedacht, maar dit verband kon tot voor kort niet concreet aangetoond worden.

Fotosynthese is een proces waardoor fototrofe bacteriën en planten de energie van zonlicht omzetten in energierijke verbindingen. Het proces verloopt via een groot aantal stappen, waarvan de eerste stap de absorptie van licht is middels de aanwezigheid van bacteriochlorofylen (‘light harvesting’ complex, Figuur 2.8). De opgevangen lichtenergie wordt via het netwerk van bacteriochlorofylen naar het fotosynthetisch reactiecentrum overgebracht. Het reactiecentrum heeft een sleutelplaats in het fotosyntheseproces.

Een belangrijke stap in het onderzoek naar de bacteriële fotosynthese was het werk van J. Deisenhofer, H. Michel en R. Huber, die de ruimtelijk structuur van het reactiecentrum bij purperbacteriën hebben bepaald [65]. Het belang van dit werk blijkt uit de toekenning, in 1989, van de Nobelprijs Scheikunde aan deze drie onderzoekers.

Het reactiecentrum is opgebouwd uit verschillende membraangebonden eiwitten die de reactiecentrum-pigmenten op hun plaats houden. De pigmenten zijn vier bacteriochlorofylen (BChl), twee bacteriofeofytinen (BPhe, verwant aan de BChl doch zonder een centraal magnesiumatoom), twee quinonen (Q) en een ijzerion. Quinonen zijn verbindingen die gemakkelijk elektronen kunnen opnemen. Twee van de BChl-moleculen, het ‘speciale paar’ (P), blijken heel dicht bij elkaar te liggen en een dimeer te vormen. Als het dimeer P in de aangeslagen toestand wordt gebracht (door de absorptie van een foton of door energieoverdracht via het antennecomplex) is het in staat een elektron af te staan aan het naburige bacteriochlorofyl en vandaar naar bacteriofeofytine, om uiteindelijk bij een quinon terecht te komen. Het gereduceerde quinon, dat twee elektronen en twee protonen opgenomen heeft, migreert naar het cytochroom bc1 complex waar het opnieuw geoxideerd wordt. Hier migreren de elektronen via het bc1 complex, met cytochroom c2 (bij purper fototrofe bacteriën) als intermediaire elektronendrager, naar het membraangebonden tetraheem cytochroom c, om uiteindelijk weer bij het speciale paar terecht te komen, waardoor de elektronencyclus gesloten wordt [66].


Cyt c

Cyt b

ISP

Tetra-heem cyt c

Fotosynthetisch reactiecentrum

com

plex

HiPIP

QH2

QQ

2H+

4H+

2e-

2e-2H+

Licht

2H+

Figuur 2.8. Vereenvoudigd schema van de elektronentransportketen van het cytochroom bc1

complex met het fotosynthetisch reactiecentrum. Hier heeft HiPIP de rol van een elektronendrager tussen het bc1 complex en het reactiecentrum. Sommige fotosynthetische bacteriën zoals Rhodobacter capsulatus en sphaeroides, Rhodospirillum rubrum en Rhodopseudomonas palustrisbezitten geen membraangebonden tetraheem cytochroom c maar wel een wateroplosbaar cytochroom c2 dat direct elektronen aan het foto-geoxideerde reactiecentrum kan leveren, en dus een gelijkaardige funktie heeft.

Bij de in vitro en in vivo reconstructie van de elektrontransferketen in de

fotosynthetische bacteriën Rhodoferax fermentans, Rubrivivax gelatinosus en Rhodocyclus tenuis fungeert HiPIP als een wateroplosbare elektronendrager tussen het cytochroom bc1-complex en het membraangebonden tetraheem cytochroom c van het fotosynthetisch reactiecentrum (Fig. 2.8) [67-71]. Later toonden Menin en medewerkers aan dat HiPIP een rol speelt in de reductie van foto-geoxideerd tetraheem cytochroom c in de volgende species: Ectothiorhodospira vacuolata, Allochromatium vinosum, Marichromatium purpuratum en Rhodophila globiformis, en niet in Rhodobium marinum en Halorhodospira halophila [72]. Vermelden we nog dat de inactivatie van het HiPIP-gen in Allohromatium vinosum letale gevolgen heeft en dus aanwijst dat HiPIP een cruciale rol speelt in de bacteriële elektronen-transferketen. Dit HiPIP wordt echter niet door het cytochroom bc1 complex gereduceerd en neemt dus geen deel aan de cyclische elektronen-transferketen van de fotosynthese [73-74].

Ander onderzoek heeft ook aangetoond dat, naast HiPIP, ook cytochroom c8 elektronen kan afgeven aan het foto-geoxideerde reactiecentrum. Cytochroom c8 kon worden geïsoleerd uit het periplasma van Rhodoferax fermentans, Rhodocyclus tenuis, Rhodomicrobium vannielii, Allochromatium vinosum en Marichromatium purpuratum [75]. Om uit te maken wat het verband is tussen HiPIP en cytochroom c8 als elektrondonor aan het fotosynthetische reactiecentrum werd Rhodocyclus tenuis anaëroob bij verschillende lichtintensiteiten gekweekt. Bij sterke lichtintensiteit (5 W/m2) fungeert het cytochroom als fysiologische elektrondonor naar het fotogeoxideerde membraangebonden tetraheem cytochroom c, terwijl


Figuur 2.9. Voorstelling van de bindingsplaats voor cytochroom c8 (a) en HiPIP (b) op de oppervlakte van de tetraheem cytochroom c subunit van Rubrivivax gelatinosus. De relatieve bijdrage van de geteste mutanten wordt voorgesteld door de kleurbalk waarbij blauw een totaal gebrek aan interactie voorstelt. Heemgroepen zijn in het groen aangegeven. Ontleend uit referenties [79-80].

deze rol bij zwakke lichtintensiteit (1.25 W/m2) overgenomen wordt door HiPIP. Eens vastgesteld werd dat cytochroom c8 en HiPIP allebei elektronen aan het fotosynthetisch reactiecentrum kunnen leveren bleef de vraag of ze al dan niet tegelijkertijd of gereguleerd tot expressie gebracht worden. In een donker en aëroob gegroeide cultuur van Rhodoferax fermentans werden weinig of geen water-oplosbare cytochromen c gevonden, dit in tegenstelling tot HiPIP dat in grote hoeveelheden voorkomt [76]. Anaëroob en licht gegroeide cellen van dezelfde bacterie lieten toe detecteerbare hoeveelheden van een c-type cytochroom, gekarakteriseerd als cytochroom c8, te isoleren [77]. Een andere situatie werd gevonden in een aërobe en donker gegroeide cultuur van Rubrivivax gelatinosus, een verwante soort van Rhodoferax fermentans, waar een 4 à 6-voudige concentratietoename van cytochroom c8 werd vastgesteld. De biologische rol van cytochroom c8, in donker gegroeide cellen, is nog steeds niet gekend [78].

Het feit dat twee verschillende periplasmatische eiwitten, HiPIP en cytochroom c8,

met hetzelfde membraangebonden tetraheem cytochroom c van het fotosynthetisch reactiecentrum interageren, wierp de vraag op of ze op dezelfde interactieplaats met het tetraheem cytochroom c interageren of op twee verschillende plaatsen. Oscyzaka en medewerkers onderzochten het mechanisme van hun interactie met behulp van plaatsgerichte mutagenese van geladen en hydrofobe aminozuren rondom het eerste heemgebied. Het betreft hier de residuën die buiten het membraan uitsteken. Ze stelden vast dat mutaties van negatief


Figuur 2.10. Computermodel van de mogelijke interactie tussen de tetraheem cytochroom c subunit (links) van het Rubrivivax gelatinosus fotosynthetisch reactiecentrum en Rhodocyclus tenuis HiPIP (rechts). Heemgroepen zijn in het groen weergegeven en het ijzer-zwavelcluster in het blauwgroen. Uit ref [80].

(D46, E79, E85 en E93 van Fig. 2.9) naar positief geladen aminozuren (lysine of arginine) een vertragend effect hebben op de elektronenoverdracht, wat wijst op een elektrostatische interactie van cytochroom c met het desbetreffende heemgebied.

De zure aminozuren die van belang zijn voor de interactie van cytochroom c8 met tetraheem cytochroom c bleken geen of weinig rol te spelen bij de interactie van HiPIP met tetraheem cytochroom. Verder bleek de bindingsite voor HiPIP een kleinere oppervlakte te bestrijken dan deze voor cytochroom c8, en opgebouwd te zijn uit ongeladen en hydrofobe aminozuren (Phe56, Val67 en Leu96). We mogen dus besluiten dat de bindingsplaats voor HiPIP gecontroleerd wordt door de hydrofobe contacten tussen beide eiwitoppervlakken, en dat deze sterk verschillen van de elektrostatische contacten voor cytochroom c8 (Fig. 2.10).

Ook andere gevallen van uitwisselbaarheid tussen verschillende elektrontransporteiwitten, in omstandigheden van tekort aan bepaalde metalen in de levensomgeving, zijn reeds bekend. Het oplosbare kopereiwit plastocyanin in cyanobacteriën kan vervangen worden door een cytochroom c6 bij een tekort aan koper in het milieu [75, 81]. Plastocyanine is een elektrontransporteiwit dat voorkomt tussen cytochroom f en PS I (soms ook P700 genoemd), en bezit twee verschillende interactiegebieden: een hydrofoob gebied rondom het kopercentrum en een zuur gebied bestaande uit vier of vijf zure aminozuren. De interactie van plastocyanine met het PS I complex gebeurt via hydrofobe contacten tussen beide moleculen, zoals beschreven voor het RC-HiPIP complex [79-80, 82],


het methylamine dehydrogenase-amicyanine complex [83], en het azurine-nitraatreductase en cytochroom c-551 complex [84].

Dat HiPIP als elektrontransporteiwit een andere rol buiten de fotosynthese kan hebben

blijkt uit twee publikaties [12, 13]. Rhodothermus marinus, een aërobe hyperthermofiele bacterie, werd voor het eerst geïsoleerd in warmwaterbronnen langs de kusten van IJsland. Het is een strikt chemo-organotrofe bacterie die 5-20 % NaCl nodig heeft voor optimale groei. Het groeioptimum ligt bij 65-70°C en de maximale groeitemperatuur rond 77°C [85]. Het organisme heeft een uniek cytochroom bc1 complex bestaande uit minimum drie subeenheden (43, 27 en 18 kDa), opgebouwd uit vijf heemcentra van het b- en c-type, respectievelijk in een verhouding van 1 op 4. Alle c-type heem komt voor in de subeenheid van 27 kDa, het b-type in de 43 kDa subeenheid. Het Rieske-type ijzer-zwaveleiwit, een vaak waargenomen subeenheid in andere gekende cytochroom bc1 complexen, is de grote afwezige in het Rhodothermus marinus bc1 complex. Het complex speelt een belangrijke rol in de elektronentransportketen en koppelt de elektronentransfer van de gereduceerde quinolen aan de finale elektrontransfer naar de terminale oxidasen [86]. Het HiPIP werd reeds uit de membranen van Rhodothermus marinus geïsoleerd en opgezuiverd voor verdere studies. Het is een wateroplosbaar eiwit van ongeveer 10 kDa en heeft een redoxpotentiaal van +260 mV. In vitro reconstitutie van de Rhodothermus marinus elektronentransferketen toonde aan dat HiPIP inderdaad een centrale rol in deze keten speelt, door het elektrontransport te verzorgen tussen het cytochroom bc1 complex en het terminaal oxidase complex (Fig. 2.11).

Cytochroom c oxidase is een groot enzymatische complex dat opgebouwd is uit een

zevental verschillende subeenheden. Als terminaal onderdeel van een grote elektronentransportketen in (facultatieve) aërobe organismen wordt zuurstof naar water omgezet. De vrijgekomen energie van deze reactie wordt gebruikt voor de transfer van protonen doorheen de membraan, en wordt ook gebruikt voor de productie van ATP door ATP-ase. In tegenstelling tot de mitochondriale complexen, en zoals bij bacteriële cytochroom bc1 complexen, zijn bacteriële cytochroom c oxidase complexen ook eenvoudiger opgebouwd. Ze bestaan namelijk uit drie à vier subeenheden waarvan er drie

Cyt c

Cyt b

HiPIPQH2

2e-

2e-

2H+

Cyt a

Cyt a3

1/2 O2 + 4H+ H2O

2H+

?

Figuur 2.11. Vereenvoudigd schema van cytochroom c oxidase complex, samen met cytochroom bc1 complex en HiPIP als electronendrager.


elektronentransport-eiwitten zijn: cytochroom c, cytochroom a en cytochroom a3, met twee koperatomen als intermediaire elektronacceptor/donor [87-91].

Wanneer facultatieve fototrofe bacteriën, zoals Rhodoferax fermentans en Rhodovibrio

salinarum, aëroob in het donker gekweekt worden, wordt HiPIP door het cytochroom bc1

complex gereduceerd en geoxideerd door cytochroom c oxidase complexen [92]. Het is dus duidelijk dat HiPIP een belangrijke rol speelt in de bacteriële elektronentransportketen. We mogen voorzichtig besluiten dat, in strikt fototrofe bacteriën, HiPIP als elektronentransporteiwit tussen cytochroom bc1 complex en het fotosynthetisch reactiecentrum fungeert. Verder zou het in facultatieve fototrofen een dubbele functie hebben, namelijk als elektrondonor aan het foto-geoxideerde reactiecentrum of aan het cytochroom c oxidase complex, dit naargelang van de groeiomstandigheden.

HiPIP kan blijkbaar ook als een enzym fungeren, wat onlangs aangetoond werd bij een

HiPIP-verwant eiwit uit Acidithiobacillus ferrooxidans. Dit organisme is een chemolithotroof die de noodzakelijke energie haalt uit de oxidatie van Fe2+ naar Fe3+, met zuurstof als terminale elektronacceptor [93]. De eerste stap wordt gekatalyseerd door het enzym Fe(II) oxidase dat een elektron doorgeeft aan cytochroom c-552. Dit enzym wordt ook wel ‘iron oxidase’ (iro) genoemd. Cytochroom c-552 geeft op zijn beurt zijn elektron door aan moleculaire zuurstof via het cytochroom c oxidase complex [94].

In 1992 werd het Fe(II) oxidase-gen door Kusano en medewerkers geïsoleerd en gekloneerd. Het resulterende genproduct vertoont 56% verwantschap met het Rhodocyclus tenuis 2761 HiPIP, een aanwijzing dat het hier om een verwant eiwit gaat. In tegenstelling tot veel HiPIP’s komt dit enzymatisch actief Fe(II) oxidase in een multimere vorm van identieke subeenheden voor, met een totale massa van 63 kDa. Dissociatie van deze multimere vorm naar kleinere vormen (24 en 12 kDa) heeft inactivatie van het enzym tot gevolg [19].


2.7. Referenties

1. International Union of Biochemistry (1992) Nomenclature of electron-transfer proteins. Recommendations 1989 of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB). J. Biol. Chem. 267, 665-677 2. Dus, K., Tedro, S., Bartsch, R.G. (1973). The complete amino acid sequence of Chromatium high potential iron sulfur protein. J. Biol. Chem. 248, 7318-7331 3. Tedro, S., Meyer, T.E., Kamen, M.D. (1974). Primary structure of a high potential iron-sulfur protein from the photosynthetic bacterium Thiocapsa pfennigii. J. Biol. Chem. 249, 1182-1188 4. Tedro, S., Meyer, T.E., Kamen, M.D. (1976). Primary structure of a high potential iron-sulfur protein from the purple non-sulfur photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas gelatinosa. J. Biol. Chem. 251, 129-136 5. Tedro, S., Meyer, T.E., Kamen, M.D. (1977). Primary structure of a high potential iron-sulfur protein from a moderately halophilic denitrifying coccus. J. Biol. Chem. 252, 7826-7833 6. Tedro, S., Meyer, T.E., Kamen, M.D. (1979). Primary structure of a high potential, four-iron-sulfur ferredoxin from the photosynthetic bacterium Rhodospirillum tenue. J. Biol. Chem. 254, 1495-1500 7. Tedro, S., Meyer, T.E., Bartsch, R.G., Kamen, M.D. (1981). Primary structure of high potential, four-iron-sulfur ferredoxins from the purple sulfur photosynthetic bacteria, Thiocapsa roseopersicina and Chromatium gracile. J. Biol. Chem. 256, 731-735 8. Tedro, S., Meyer, T.E., Kamen, M.D. (1985). Amino acid sequence of high-redox-potential ferredoxin (HiPIP) isozymes from the extremely halophilic purple phototrophic bacterium, Ectothiorhodospira halophila . Arch. Biochem. Biophys. 241, 656-664

9. Tedro, S., Meyer, T.E., Kamen, M. (1985). The amino acid sequence of a high-redox-potential ferredoxin from the purple phototrophic bacterium, Rhodospirillum tenue strain 2761. Arch. Biochem. Biophys. 239, 94-101 10. Moulis, J.-M., Scherrer, N., Gagnon, J., Forest, E., Petillot, Y., Garcia, D. (1993). Primary structure of Chromatium tepidum high-potential iron-sulfur protein in relation to thermal denaturation. Arch. Biochem. Biophys. 305, 186-192 11. Ambler, R.P., Meyer, T.E., Kamen, M.D. (1993). Amino acid sequence of a high redox potential ferredoxin (HiPIP) from the purple phototrophic bacterium Rhodopila globiformis, which has the highest known redox potential. Arch. Biochem. Biophys. 306, 215-222 12. Pereira, M.M., Antunes, A.M., Numes, O.C., da Costa, M.S., Teixeira, M. (1994). A membrane-bound HiPIP type center in the thermohalophile Rhodothermus marinus. FEBS Lett. 352, 327-330 13. Pereira, M., Carita, J.N., Teixeira, M. (1999). Membrane-bound electron transfer chain of the thermohalophilic bacterium Rhodothermus marinus : Characterization of the iron-sulfur centers from the dehydrogenases and investigation of the high-potential iron-sulfur protein function by in vitro reconstitution of the respiratory chain. Biochemistry 38, 1276-1283 14. Ambler, R.P., Meyer, T.E., Kamen, M.D. (1994). Amino acid sequences of two high-potential iron sulfur proteins (HiPIPs) from the moderately halophilic purple phototrophic bacterium Ectothiorhodospira vacuolata. Arch. Biochem. Biophys. 308, 78-81 15. Van Driessche, G., Ciurli, S., Hochkoeppler, A., Van Beeumen, J.J. (1997). The primary structure of Rhodoferax fermentans high-potential iron-sulfur protein, an electron donor to the photosynthetic reaction center. Eur. J. Biochem. 244, 371-377


16. Ambler, R.P., Daniel, M., Meyer, T.E., Cusanovich, M.A. (1999). Amino acid sequences of two high-potential iron sulfur proteins (HiPIPs) from the moderately halophilic purple phototrophic bacterium, Rhodospirillum salinarum. Arch. Biochem. Biophys. 369, 143-148 17. Rhodopseudomonas BLAST server at http://spider.jgi-psf.org/JGI_microbial/bin/rhodo_blast 18. Kerfeld, C.A., Salmeen, A.E., Yeates, T.O. (1988). Crystal structure and possible dimerization of the high-potential iron-sulfur protein from Chromatium purpuratum. Biochemistry 37, 13911-13917 19. Kusano, T., Takeshima, T., Sugawara, K., Inoue, C., Shiratori, T., Yano, T., Fukumori, Y., Yamanaka, T. (1992). Molecular cloning of the gene encoding Thiobacillus ferrooxidans Fe(II) oxidase. J. Biol. Chem. 267, 11242-11247 20. Carter, C.W., Jr., Kraut, J., Freer, S.T., Alden, R.A., Sieker, L.C., Adman, E., Jensen, L.H. (1972). A comparison of Fe4S4* clusters in high-potential iron protein and in ferredoxin. Proc. Natl. Acad. Sci USA 69, 3526-3529 21. Dickson, D.P.E., Johnson, C.E., Cammack, R., Evans, M.C.W., Hall, D.O., Rao, K.K. (1974). Mössbauer effect in the high-potential iron-sulphur protein from Chromatium. Evidence for the state of iron atoms. Biochem. J. 139, 105 22. Hall, D.O., Rao, K.K., Cammack (1975). The iron-sulphur proteins: structure, function and evolution of a ubiquitous group of proteins. Sci. Prog. Oxf. 62, 285-317 23. Cammack, R. (1973). Super reduction of Chromatium high potential iron-sulfur protein in the presence of dimethyl sulfoxide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 54, 548-554 24. Heering, H.A., Bulsink, Y.B.M., Hagen, W.R., Meyer, T.E. (1995). Reversible super-reduction of the cubane [4fe-4S](3+;2+;1+) in the high-potential iron-sulfur protein under non-denaturing conditons. EPR spectroscopic and

electrochemical studies. Eur. J. Biochem. 232, 811-817 25. Carter, C.W., Jr., Kraut, J., Freer, S.T., Xuong, N.-H., Alden, R.A., Bartsch, R.G. (1974). Two-angstrom crystal structure of oxidized Chromatium high potential iron protein. J. Biol. Chem. 249, 4212-4225 26. Freer, S.T., Alden, R.A., Carter, C.W. Jr., Kraut, J. (1975). Crystallographic structure refinement of Chromatium high potential iron protein refined at 2Å resolution. J. Biol. Chem. 250, 46-54 27. Carter, C.W., Jr., Kraut, J., Freer, S.T., Alden, R.A. (1974). Comparison of oxidation-reduction site geometries in oxidized and reduced Chromatium high potential iron protein and oxidized Peptococcus aerogenes ferredoxin. J. Biol. Chem. 249, 6339-6346 28. Carter, C.W., Jr. (1977). New stereochemical analogies between iron-sulfur electron transport proteins. J. Biol. Chem. 252, 7802-7811 29. Sheridan, R.P., Allen, L.C., Carter, C.W., Jr. (1981). Coupling between oxidation state and hydrogen bond conformation in high potential iron-sulfur protein. J. Biol. Chem. 256, 5052-5067 30. Krishnamoorthi, R., Cusanovich, M.A., Meyer, T.E., Przyiecki, C.T. (1989). 1H-NMR studies of high-potential iron-sulfur protein from the purple phototrophic bacterium, Rhodospirillum tenue. Eur. J. Biochem. 181, 81-85 31. Backes, G., Mino, Y., Loehr, T.M., Meye r, T.E., Cusanovich, M.A., Sweeney, W.V., Adman, E.T., Sanders -Loehr, J. (1991). The environment of Fe4S4 clusters in ferredoxins and high-potential iron proteins. New information from X-ray crystallography and resonance raman spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 113, 2055-2064 32. Langen, R., Jensen, G.M., Jacob, U., Stephens, P.J., Warshel, A. (1992). Protein control of iron-sulfur cluster redox potentials. J. Biol. Chem. 267, 25625-25627


33. Rayment, I., Wesenberg, G., Meyer, T.E., Cusanovich, M.A., Holden, H.M. (1992).The three-dimensional structure of the high-potential iron-sulfur protein isolated from the purple phototrophic bacterium Rhodocyclus tenuis determined and refined at 1.5Å resolution. J. Mol. Biol. 228, 672-686 34. Jensen, G.M., Warshel, A., Stephens, P.J. (1994). Calculation of the redox potentials of iron-sulfur proteins: The 2-/3- couple of [Fe4S*Cys4] clusters in Peptococcus aerogenes ferredoxin, Azotobacter vinelandii ferredoxin I, and Chromatium vinosum high-potential iron protein. Biochemistry 33, 10911-10924 35. Holden, H.M., Meyer, T.E., Cusanovich, M.A., Rayment, I. (1986). Crystalization of a high potential iron-sulfur protein from the halophilic phototrophic bacterium Ectothiorhodospira halophila . J. Biol. Chem. 261, 14746-14747 36. Breiter, D.R., Meyer, T.E., Rayment, I., Holden, H.M. (1991). The molecular structure of the high potential iron-sulfur protein isolated from Ectothiorhodospira halophila determined at 2.5Å resolution. J. Biol. Chem. 266, 18660-18667 37. Iwagami, S.G., Creagh, L., Haynes, C.A., Borsari, M., Felli, I.C., Piccioli, M, Eltis, L.D. (1995). The role of a conserved tyrosine residue in high-potential iron sulfur proteins. Prot. Science 4, 2562-2572 38. Agarwal, A., Li, D., Cowan, J.A. (1995). Role of aromatic residues in stabilization of the [Fe4S4] cluster in high-potential iron proteins (HiPIPs): Physical characterization and stability studies of Tyr-19 mutants of Chromatium vinosum HiPIP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9430-9444 39. Luchinat, C., Capozi, F., Borsari, M., Battistuzzi, G., Sola, M. (1994). Influence of surface charges on redox properties in high potential iron-sulfur proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 203, 436-442 40. Banci, L., Bertini, I., Ciurli, S., Luchinat, C., Pierattell, R. (1995). Rationalization of the reduction potentials within the series of the high potential iron-sulfur proteins. Inorg. Chimica Acta 240, 251-256

41. Heering, H.A., Bulsink, Y.B.M., Hagen, W.R., Meyer, T.E. (1995). Influence of charge and polarity on the redox potentials of high-potential iron-sulfur proteins: evidence for the existence of two groups. Biochemistry 34, 14675-14686 42. Rees, D.C. (1985). Electrostatic influence on energetics of electron transfer reactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3082-3085 43. Moore, G.R., Pettigrew, G.W., Rogers, N.K. (1986). Factors influencing redox potentials of electron transfer proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4998-4999 44. Babini, E., Borsari, M., Capozzi, F., Eltis, L.-D., Luchinat, C. (1999). Experimental evidence for the role of buried polar groups in determining the reduction potential of metalloproteins: the S79P variant of Chromatium vinosum HiPIP. J. Biol. Inorg. Chem. 4, 692-700 45. Benning, M.M., Meyer, T.E., Rayment, I., Holden, H.M. (1994). Molecular structure of the oxidized high-potential iron-sulfur protein isolated from Ectothiorhodospira vacuolata . Biochemistry 33, 2476-2483 46. Nogi, T., Fathir, I., Kobayashi, M., Nozawa, T., Miki, K. (2000). Crystal structure of photosynthetic reaction center and high-potential iron-sulfur protein from Thermochromatium tepidum: Thermostability and electron transfer. Biochemistry 97, 13561-13566 47. Bertini, I., Capozzi, F., Luchinat, C., Piccioli, M. (1993). 1H-NMR investigation of oxidized and reduced high-potential iron-sulfur protein from Rhodopseudomonas globiformis. Eur. J. Biochem. 212, 69-78 48. Banci, L., Bertini, I., Eltis, L.D., Felli, J.C., Kastrau, D.H.W., Luchinat, C., Piccioli, M., Pierattelli, R., Smith, M. (1994). The three-dimensional structure in solution of the paramagnetic high-potential iron-sulfur protein I from Ectothiorhodospira halophila through nuclear magnetic resonance. Eur. J. Biochem. 225, 715-725.


49. Banci, L., Bertini, I., Dikiv, A., Kastrau, D.H.W., Luchinat, C., Sompornpisut, P. (1995). The three-dimensional solution structure of the reduced high-potential iron-sulfur protein from Chromatium vinosum through NMR. Biochemistry 34, 206-219 50. Bertini, I., Dikiv, A., Kastrau, D.H.W., Luchinat, C., Sompornpisut, P. (1995). Three-dimensional solution structure of the oxidized high potential iron-sulfur protein from Chromatium vinosum through NMR. Comparative analysis with the solution structure of the reduced species. Biochemistry 34, 9851-9558 51. Bentrop, D., Bertini, I., Capozzi, F., Dikiv, A., Eltis, L., Luchinat, C. (1996). Three-dimensional structure of the reduced C77S mutant of the Chromatium vinosum high-potential iron-sulfur protein through nuclear magnetic resonance: Comparison with the solution structure of the wild-type protein. Biochemistry 35, 5928-5936 52. Bertini, I., Felli, I.C., Luchinat, C., Rosato, A. (1996). A complete relaxation matrix refinement of the solution structure of a paramagnetic metalloprotein: Reduced HiPIP I from Ectothiorhodospira halophila. Proteins 24, 158-164 53. Bertini, I., Couture, M.M.J., Donaire, A., Eltis, L.D., Felli, I.C., Luchinat, C., Piccioli, M., Rosato, A. (1996). The solution structure refinement of the paramagnetic reduced high-potential iron-sulfur protein I from Ectothiorhodospira halophila by using stable isotope labeling and nuclear relaxation. Eur. J. Biochem. 241, 440-452 54 Bertini, I., Cowan, J.A., Luchinat, C., Natarajan, K., Piccioli, M. (1997). Characterization of a partially unfolded high potential iron protein. Biochemistry 36, 9332-9339 55. Woese, C.R., Weisburg, W.G., Hahn, C.M., Paster, B.J., Zablen, L.B., Lewis, B.J., Macke, T.J., Ludwig, W., Stackebrandt, E. (1985). The phylogeny of purple bacteria: The gamma subdivision. System. Appl. Microbiol. 6, 25-33

56. Woese, C.R., Stackebrandt, E., Weisburg, W.G., Paster, B.J., Madigan, M.T., Fowler, V.J., Hahn, C.M., Blanz, P., Gupta, R., Nealson, K.H., Fox, G.E. (1984). The phylogeny of purple bacteria: The alpha subdivision. System. Appl. Microbiol. 5, 315-326 57. Woese, C.R., Weisburg, W.G., Paster, B.J., Hahn, C.M., Tanner, R.S., Krieg, N.R., Koops, H.-P., Harms, H., Stackebrandt, E. (1984). The phylogeny of purple bacteria: The beta subdivision. System. Appl. Microbiol. 5, 327-336 58. Stackebrandt, E., Fowler, V.J., Schubert, W., Imhoff, J.F. (1984). Towards the phylogeny of phototrophic purple sulfur bacteria - the genus Echtothiorhodospira. Arch. Microbiol. 137, 366-370 59. Ivanova, T.L., Turova, T.P., Antonov, A.S. (1985). DNA-DNA and rRNA-DNA hybridization studies in the genus Ectothiorhodospira and other purple sulfur bacteria. Arch. Microbiol. 143, 154-156 60. Imhoff, J.F., Süling, J. (1996). The phylogenetic relationship among Ectothiorhodospiraceae: a reevaluation of their taxonomy on the basis of 16S rDNA analyses. Arch. Microbiol. 165, 106-113 61. Ventura, S., Viti, C., Pastrorelli, Giovannetti, L. (2000). Revision of species delineation in the genus Ectothiorhodospira. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 583-591 62. Kerfeld, C.A., Chan, C., Hirasawa, M., Kleis-SanFrancisco, S., Yeates, T.O., Knaff, D.B. (1996). Isolation and characterization of soluble electron transfer proteins from Chromatium purpuratum. Biochemistry 35, 7812-7818 63. Meyer, T.E., Kennel, S.J., Tedro, S.M., Kamen, M.D. (1973). Iron protein content of Thiocapsa pfennigii, a purple sulfur bacterium of atypical chlorophyll composition. Biochim. Biophys. Acta 292, 634-643 64. Dunham, W.R., Hagen, W.R., Fee, J.A., Sands, R.H., Dunbar, J.B., Humblet, C. (1991). An investigation of Chromatium vinosum high-potential iron-sulfur protein by


EPR and Mössbauer spectroscopy: Evidence for a freezing-induced dimerization in NaCl solutions. Biochim. Biophys. Acta 1079, 253-262 65. Adman, E.T., Mather, M.W., Fee, J.A. (1993).Molecular modeling studies on the proposed NaCl-induced dimerization of Chromatium vinosum high-potential iron-sulfur protein. Biochim. Biophys. Acta 1142, 93-98 66. Deisenhofer, Epp, O., Miki, K., J., Huber, R., Michel, H. (1985). Structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction centre of Rhodopseudomonas viridis at 3Å resolution. Nature 318, 618-624 67. Hochkoeppler, A., Ciurli, S., Venturoli, G., Zannoni, D. (1995). The high potential iron-sulfur protein (HiPIP) from Rhodoferax fermentans is competent in photosynthetic electron transfer. FEBS Lett. 357, 70-74 68. Hochkoeppler, A., Zannoni, D., Venturoli, G. (1995). The electron transport system of the facultative phototroph Rhodoferax fermentans. II. Flash-induced oxidation of membrane-bound cytochromes c. Biochim. Biophys. Acta 1229, 81-88 69. Hochkoeppler, A., Zannoni, D., Ciurli, S., Meyer, T.E., Cusanovich, M.A., Tollin, G. (1996). Kinetics of photo-induced electron transfer from high potential iron-sulfur protein to the photosynthetic reaction center of the purple phototroph Rhodoferax fermentans. Proc. Natl. Acad. Sci: USA 93, 6998-7002 70. Schoepp, B., Parot, P., Menin, L., Gaillard, J., Richaud, P., Verméglio, A. (1995). In vivo participation of a high potential iron-sulfur protein as electron donor to the photochemical reaction center of Rubrivivax gelatinosus. Biochemistry 34, 11736-11742 71. Osyczka, A., Yoshida, M., Nagashima, K.V.P., Shimada, K., Matsuura, K. (1997). Electron transfer from high-potential iron-sulfur protein and low-potential cytochrome c-551 to the primary donor of Rubrivivax gelatinosus reaction center mutationally devoid of the bound cytochrome subunit. Biochim. Biophys. Acta 1321, 93-99

72. Menin, L., Gaillard, J., Parot, P., Schoepp, B., Nitschke, W., Verméglio, A. (1998). Role of HiPIP as electron donor to the RC-bound cytochrome in photosynthetic purple bacteria. Photos. Res. 55, 343-348 73. Tan, J., Corson, G.E., Chen, Y.L., Garcia, M.C., Güner S., Knaff, D.B. (1993). The ubiquinol:cytochrome c2/c oxidoreductase of Chromatium vinosum. Biochim. Biophys. Acta 1144, 69-76 74. Brüser, T., Trüper, H.G., Dahl, C. (1997). A new approach to the role of the high potential iron-sulfur protein (HiPIP) of Chromatium vinosum. Ixth International Symposium on Phototrophic Prokaryotes, Abstr. 52A 75. Menin, L. Schoepp, B., Parot, P., Verméglio, A. (1997). Photoinduced cyclic electron transfer in Rhodocyclus tenuis cells: Participation of HiPIP or cyt c8 depending on the ambient redox potential. Biochemistry 36, 12183-12188 76. Hochkoeppler, A., Moschettini, G., Zannoni, D. (1995). The electron transport system of the facultative phototroph Rhodoferax fermentans. I. A functional thermodynamic and spectroscopic study of the respiratory chain of dark- and light-grown cells. Biochim. Biophys. Acta 1229, 73-80 77. Hochkoeppler, A., Ciurli, S., Kofod, P., Venturoli, G., Zannoni, D. (1997). On the role of cytochrome c8 in photosynthetic electron transfer of the purple nonsulfur bacterium Rhodoferax fermentans. Photos. Res. 53, 13-21 78. Menin, L., Yoshida, M., Jacquinod, M., Nagashima, K.V., Matsuura, K., Parot, P., Verméglio, A. (1999). Dark aerobic growth conditions induce the synthesis of a high midpoint potential cytochrome c8 in the photosynthetic bacterium Rubrivivax gelatinosus. Biochemistry 38, 15238-15244 79. Osyczka, A., Nagashima, K.V.P., Sogabe, S., Miki, K., Shimada, K., Matsuura, K. (1999). Comparison of the binding sites for high-potential iron-sulfur protein and cytochrome c on the tetraheme cytochrome subunit bound to the bacterial


photosynthetic reaction center. Biochemistry 38, 15779-15790 80. Osyczka, A., Nagashima, K.V., Shimada, K., Matsuura, K.. (1999). Interaction site for high-potential iron-sulfur protein on the tetraheme cytochrome subunit bound to the photosynthetic reaction center of Rubrivivax gelatinosus. Biochemistry 38, 2861-2865 81. Ho, ,K.K., Krogmann, D.W. (1984). Electron donors to P700 in Cyanobacteria and algae. An instance of unusual genetic variability. Biochim. Biophys. Acta 766, 310-316 82. Hervás, M., Navarro, J.A., Díaz, A., Bottin, H., De la Rosa, M.A. (1995). Laser-flash kinetic analysis of the fast electron transfer from plastocyanin and cytochrome c6 to photosystem I. Experimental evidence on the evolution of the reaction mechanism. Biochemistry 34, 11312-11326 83. Chen, L., Durley, R.C., Mathews, F.S., Davidson, V.L. (1994). Structure of an electron transfer complex methylamine dehydrogenase, amicyanin and cytochrome c551i. Science 264, 86-90 84. van de Kamp, M., Silvestrini, M.C., Brunori, M., Van Beeumen, J., Hali, F.C., Canters, G.W. (1990). Involvement of the hydrophobic patch of azurin in the electron-transfer reactions with cytochrome c551 and nitrite reductase. Eur. J. Biochem. 194, 109-118 85. Alfredsson, G.A., Kristjansson, J.K., Hjörleifsdottir, S., Stetter, K.O. (1988). Rhodothermus marinus, gen. nov., sp. nov., a thermophilic, halophilic bacterium from submarine hot springs in Iceland. J. Gen. Microbiol. 134, 49-68 86. Pereira, M.M., Carita, J.N., Teixeira, M. (1999). Membrane-bound electron transfer chain of the thermohalophilic bacterium Rhodothermus marinus: a novel multihemic cytochrome bc, a new complex III. Biochemistry 38, 1268-1275 87 Crofts, A., Berry, E.A. (1998). Structure and function of the cytochrome bc1 complex of

mitochondria and photosynthetic bacteria. Curr. Opin Struct. Biol. 8, 501-509 88. Beinert, H. (1995). Crystals and structures of cytochrome c oxidases- the end of an arduous road. Curr. Biol. 2, 781-785 89. Yang, X., Trumpower, L. (1986). Purification of a three-subunit ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase complex from Paracoccus denitrificans. J. Biol. Chem. 261, 12282-12289 90. Ludwig, B., Schatz, G. (1980). A two-subunit cytochrome c oxidase (cytochrome aa3) from Paracoccus denitrificans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 196-200 91. Santana, M., Pereira, M.M, Elias, N.P., Soares, C.M., Teixeira, M. (2001). Gene cluster of Rhodothermus marinus high-potential iron-sulfur protein: oxygen oxidoreductase, a caa(3)-type oxidase belonging to the superfamily of heme-copper oxidases. J. Bacteriol. 183, 687-699 92. Bonora, P., Principi, I., Monti, B., Ciurli, S., Zannoni, D., Hochkoeppler, A. (1999). On the role of high-potential iron-sulfur proteins and cytochromes in the respiratory chain of two facultative phototrophs. Biochim. Biophys. Acta 1410, 51-60 93. Ingledew, W.J. (1982). Thiobacillus ferrooxidans. The bioenergetics of an acidophilic chemolithotroph. Biochim. Biophys. Acta 683, 89-117 94. Kai, M., Yano, T., Fukumori, Y., Yamanaka, T. (1989). Cytochrome oxidase of an acidophilic iron-oxidizing bacterium, Thiobacillus ferrooxidans. Biochem. Biophys. Res. Comm. 160, 839-843

3

Chemische en massaspectrometrische

aminozuurvolgorde bepalingen

3.1. INLEIDING 55

3.2. CHEMISCHE AMINOZUURVOLGORDE BEPALING 56

3.3. ‘BIOLOGISCHE’ MASSASPECTROMETRISCHE TECHNIEKEN 60

3.4. REFERENTIES 73

Hoofdstuk 3. Chemische en massaspectrometrische aminozuurvolgorde bepalingen 55

Hoofdstuk 3

Chemische en massaspectrometrische aminozuurvolgorde bepalingen

3.1. Inleiding Om de werking van verschillende biologische systemen te begrijpen is inzicht in de

chemische samenstelling van cellulaire systemen nodig. Omdat de gekende aminozuurvolgorde van eiwitten zich laat vertalen in een secundaire en een tertiaire structuur die finaal een biologische functie vastlegt, is de bepaling van de primaire structuur (synoniem van aminozuurvolgorde) een eerste noodzakelijke stap naar een betere kennis van hoe een eiwit zijn katalytische werking kan vervullen.

Na de isolatie en de zuivering van een eiwit wordt zijn primaire structuur bepaald met

behulp van automatische Edmandegradatie of van ‘biologische’ massaspectrometrie, afhankelijk van het beschikbare materiaal. Voorts kan uit de nucleotidensequentie van een gen, bekomen door automatische DNA-sequentietechnieken, de aminozuurvolgorde van een eiwit afgeleid worden, dit op basis van de regels van de genetische code. Alhoewel eiwitsequentiebepalingen als trager en omslachtiger beschouwd worden dan DNA-volgordebepalingen kunnen ze toch nuttige informatie opleveren die niet uit de geninformatie afgeleid kan worden, bijvoorbeeld het bestaan van post-translationele modificaties zoals acetylatie, methylatie, fosforylatie, en glycosylatie. Bepaling van slechts gedeeltelijke sequentie-informatie van het eiwit kan anderzijds gebruikt worden om een geschikte oligonucleotide ‘probe’ te ontwerpen met het doel het coderende gen te kloneren. Dergelijke partiële informatie kan ook gebruikt worden voor karakterisatie van recombinanteiwitten die overgeëxpresseerd zijn.

Tijdens de laatste tien jaren won ‘biologische’ massaspectrometrie meer en meer

terrein op gebied van eiwitchemisch onderzoek. Deze trend is het gevolg van de sterke ontwikkelingen en verbeteringen wat betreft niet-destructieve ionisatietechnieken. Daaraan gekoppeld zijn ook een verhoging van gevoeligheid, en van snelheid van analyse. Met deze technieken kan men, buiten post-translationele modificaties, ook meer specifieke structurele informatie bekomen worden, zoals de aanwezigheid van zwavelbruggen, het bestaan van niet-covalente interacties tussen twee verschillende eiwitten en, last but not least, geheel of gedeeltelijke informatie over de sequenties van gegenereerde peptiden.


3.2. Chemische aminozuurvolgordebepaling

3.2.1. Principe

De basis van de chemische, stapsgewijze, N-terminale aminozuurvolgordebepaling werd in de jaren vijftig gelegd door Pehr Edman en steunt op de specifieke reactiviteit van het N-terminaal aminozuur en op het selectief verwijderen van de aminozuurderivaten terwijl de rest van het eiwit intact blijft (Figuur 3.1) [1-2].

Bij de reactie in de reactiekamer wordt het vrije N-terminale aminozuur van het eiwit

geïsoleerd na een reactie met het specifiek reagens fenylisothiocyanaat, in basisch milieu, en

Figuur 3.1. Reactieschema van de Edmandegradatie. Links worden de reactiekamer en de conversiefles weergegeven, en onderaan de HPLC chromatogrammen van fenylthiohydantoïne-referentie -aminozuren, samen met de eerste twee N-terminale aminozuren van een peptide waaruit de sequentie methionine – lysine kan afgeleid worden.


gevolgd door een splitsing en cyclisatie tot het anilinothiozolinon (ATZ) aminozuur met behulp van een anhydrisch sterk zuur. De rest van het eiwit blijft daarbij in principe onaangeroerd. Het ATZ-aminozuur wordt vervolgens overgebracht naar de conversiefles en daar omgezet tot een stabieler fenylthiohydantoïne (PTH)-derivaat dat op basis van de retentietijd op een ‘reversed-phase’ (omgekeerde-fase) HPLC kolom geïdentificeerd wordt. Deze reactie wordt repetitief herhaald op het steeds korter wordende eiwit of peptide.

Afhankelijk van de hoeveelheid startmateriaal en de opbrengst tijdens de Edmandegradatie kunnen aminozuursequenties tot tientallen aminozuren lang worden ‘gelezen’. Cysteïne (een aminozuur dat een belangrijke rol speelt in de ruimtelijke opbouw van een eiwit, door o. m. de vorming van zwavelbruggen of door binding met een prosthetische groep) vormt bij de sequentieanalyse een belangrijk identificatieprobleem vermits het volledig chemisch afbreekt gedurende de Edmandegradatie. Om cysteïne toch te kunnen detecteren wordt het daarom tot een stabieler derivaat omgezet met, als mogelijke reagentia, 3-bromopropylamine, joodazijnzuur, joodacetamide of 4-vinylpyridine. Een andere mogelijkheid is de oxidatie van cysteïne tot cysteïnezuur met permierenzuur, waarbij echter ook methionine en tryptofaan geoxideerd worden, dit laatste tot een niet-detecteerbaar product [3-7].

Door elektroblotting van gelelektroforetisch gescheiden/opgezuiverd eiwitmateriaal naar een inerte PVDF-membraan is het mogelijk om het op gel gescheiden materiaal aan automatische sequentieanalyse te onderwerpen en langs deze weg informatie te verkrijgen [8-11]. Alhoewel N-terminale sequentieanalyse van gel en/of chromatografisch gescheiden eiwitten de meest directe manier is om deze eiwitten te identificeren is het succes van deze methode toch beperkt tot een beperkte groep eiwitten. De reden hiervoor is dat een groot deel van de in een cel geëxpresseerde eiwitten N-terminaal gemodificeerd zijn [12-13]. In deze gevallen zal men het eiwit identificeren via interne sequentieanalyse. Hierbij wordt het eiwit eerst enzymatisch of chemisch gehydrolyseerd [14-19], waarbij het bekomen peptidenmengsel gescheiden wordt met behulp van een ‘omgekeerde fase’- HPLC, en één of meerdere zuivere peptiden gesequeneerd [20-21]. Een overzicht van de meest gebruikte enzymen en chemische reagentia voor het ‘knippen’ van eiwitten in kleinere fragmenten (peptiden) vindt men in de onderstaande tabel.

Tabel 3.1. Meest gebruikte enzymen of chemische reagentia voor het knippen van eiwitten in kleinere fragmenten [3, 22].

Enzyme Plaats van splitsing in polypeptideketen

Chemische reagentia

Plaats van splitsing in polypeptideketen

Glu-C endoproteinase Glu-X, soms Asp-X

Verdund mierenzuur (kamertemperatuur)

Asp-Pro

Arg-C endoproteinase Arg-X * Verdund mierenzuur (105°C)

Asp-X

Lys-C endoproteinase Lys-X * Cyanogen bromide Met-X

Trypsine Arg-X *, Lys-X * Iodo-benzoëzuur Trp-X

Chymotrypsine Trp-X, Phe-X, Tyr-X

Asp-N endoproteinase X-Asp

* uitgezonderd X = Pro


Tijdens de laatste tien jaar hebben de technische verbeteringen en miniaturisatie van de reactiekamer en de conversiefles eigen aan de automatische Edmansequenatoren het mogelijk gemaakt om succesvolle analyses uit te voeren op picomol tot subpicomol hoeveelheden startmateriaal [23-27]. Alternatieve methoden voor een hogere detectiegevoeligheid van gevormde PTH-aminozuren tijdens sequentieanalyse werden ook ontwikkeld. Daarbij wordt gebruik gemaakt van massaspectrometrische detectie, i. p. v. de klassieke UV-absorbantiedetector. De door de Edmandegradatie afgesplitste aminozuurderivaten worden gekarakteriseerd door hun retentietijd op een ‘omgekeerde fase’ HPLC-kolom, of door hun gemeten massa [28-29]. Met deze laatste methode kunnen we ook sommige post-translationeel gemodificeerde aminozuren identificeren. Andere meer gevoelige detectiemogelijkheden zijn capillaire HPLC [30] en capillaire elektroforese [31]. Deze methoden vereisen zeer kleine hoeveelheden te onderzoeken injectievolume (lage microliter tot subnanoliter), wat een aantal praktische moeilijkheden met zich meebrengt wegens het feit dat de analyses on-line moeten gebeuren met de sequenator.

Naast de N-terminale is ook de C-terminale sequentieanalyse door een aantal

onderzoeksgroepen, inclusief onze groep, ontwikkeld [32-36]. Hierbij worden C-terminale

Figuur 3.2. Chemisch mechanisme voor C-terminale sequentieanalyse [32].


aminozuren op een chemische wijze stapsgewijs afgesplitst en geanalyseerd (Figuur 3.2). Deze techniek is momenteel enkel geschikt voor routine- en controlebepalingen van C-terminale aminozuren van een eiwit, omdat er ‘grote’ hoeveelheden startmateriaal (enkele honderden picomol) nodig zijn. Bovendien verschaft de procedure slechts sequentie-informatie over een beperkt gebied. Het C-terminale einde van het eiwit wordt eerst geactiveerd met bijvoorbeeld azijnzuuranhydride, zodat het met een isocyanaatreagens kan koppelen, tot vorming van een peptidylthiohydantoïne. Het gederivatiseerde aminozuur wordt dan afgesplitst en het resulterend thiohydantoïne-aminozuur met behulp van ‘reversed-phase’ HPLC geanalyseerd. We kunnen hier dus spreken van activatie, derivatisatie en splitsingstappen. In ons laboratorium wordt met alternatieve chemicaliën gewerkt, in een poging om het splitsingsprobleem, na de koppeling van het C-terminaal aminozuur proline, te verhelpen [37].

Alhoewel een aminozuuranalyse (# sequentie-analyse) uitgevoerd wordt om de

hoeveelheid en de samenstelling van eiwitten/peptiden te bepalen, kunnen aminozuursamenstellingen gebruikt worden om eiwitten in databanken te identificeren. Een aminozuuranalyse kan ook een belangrijk hulpgegeven zijn met betrekking tot de identificatie van gemodificeerde aminozuren of van een geblokkeerde N-terminus. Het proces bestaat uit twee stappen: eerst wordt het eiwit of peptide volledig gehydrolyseerd door zure hydrolyse in een inerte atmosfeer, nadien worden de vrijgekomen aminozuren tot fenylthiocarbamylderivaten omgezet. De aard en hoeveelheid van de vrijgekomen derivaten worden bepaald met behulp van hun retentietijden en de hoogte van de pieken bekomen bij een ‘reversed-phase’ HPLC scheiding [38-42].

3.2.2. Instrumentatie

Ons laboratorium beschikt over diverse N-terminaal automatische sequenatoren die in de loop van de jaren steeds verbeterd werden, wat de gevoeligheid van de te sequeneren stalen ten goede is gekomen: de 475A (uit dienst genomen in het jaar 1996), de 477A (sinds 1998 niet meer in gebruik) en de 476A sequenator (Figuur 3.3). Deze toestellen werden geleverd door Applied Biosystems.

De Edmandegradatie en -analyse van de

gevormde PTH-aminozuren gebeuren volledig automatisch en computergestuurd. Bij de 476A gebeurt de analyse van de PTH-aminozuren in het toestel waarbij het reversed-phase HPLC-systeem ingebouwd zit. Bij de modellen 475A en 477A wordt het PTH-derivaat getransfereerd naar een externe 120A PTH-analyzer die on-line gekoppeld is aan de sequenatoren.

De reactiekamer wordt gevormd door twee glazen cilinders die een concaaf oppervlak hebben waarin een glasvezelfilter past. Op die glasvezelfilter wordt de gewenste hoeveelheid van het te sequeneren materiaal (100-500 pmol) gepipetteerd, samen met 5-15 µl van een oplossing van polybreen (hoeveelheid naargelang de grootte van de reactiekamer). Polybreen is een positief geladen quaternair ammoniumzout waarmee het eiwit/peptide via geladen en hydrofobe interacties geïmmobiliseerd wordt op de glasvezelfilter. De reactie met eiwitten

Figuur 3.3. 476A N-terminale eiwitsequenator.


gebeurt in het bovenste gedeelte van de reactiekamer, waardoor de toegankelijkheid van de geleverde reagentia en solventia naar de membraan toe verbeterd werd.

C-terminale sequentieanalyses gebeurden op een ‘Procise’ toestel, een op het 476A

model gebaseerd apparaat dat volledig geautomatiseerd is met sensorische controle voor reagens- en solvens-leveringen. Het te sequeneren staal wordt vooraf geactiveerd en gemodificeerd, en nadien met behulp van Prosorb ultrafiltratie naar een geschikte membraan voor analyse getransfereerd [35].

De hydrolyse van een eiwit/peptide (25-200 pmol) werd uitgevoerd in een

voorgegloeid borosilicaatbuisje dat geplaatst werd in een hydrolysevaatje, in aanwezigheid van 6N zoutzuur, en overnacht gehydrolyseerd werd (20-24 uren) bij 106°C of gedurende 1 uur bij 165°C. Vrije aminozuren werden dan volledig automatisch gederivatiseerd en geanalyseerd in een aminozuuranalyser bestaande uit een 420A Derivatizer, een 130A Separation System en een 900A Data Module.

3.3. ‘Biologische’ massaspectrometrische technieken

3.3.1. Principe van ‘electrospray’ ionisatie massaspectrometrie

‘Biologische’ massaspectrometrie is geëvolueerd tot dè analytische techniek voor eiwitidentificatie en aminozuurvolgordebepalingen op grote schaal. Dit is het gevolg van de ontwikkeling van een aantal ‘zachte’ ionisatietechnieken waardoor intacte, grote biomoleculen massaspectrometrisch kunnen geanalyseerd worden, en gekoppeld aan het feit dat de analyses met grote gevoeligheid en zeer snel kunnen worden uitgevoerd. Door gebruik te maken van verschillende massaspectrometrische technieken gebaseerd op matrix-assisted laser desorption/ionisation (MALDI), electrospray ionisatie (ESI) en vloeistofchromatografie-electrospray ionisatie (LC-ESI), kan een grote verscheidenheid aan data bekomen worden [43-47]. Omdat ESI massaspectrometrie in dit doctoraatswerk uitvoerig gebruikt werd voor aminozuurvolgordebepalingen en massametingen van complete eiwitten (met of zonder FeS-cluster), wordt deze techniek hieronder nader besproken. 3.3.1.1. Ionisatie

De electrospray-ionen worden onder invloed van een hoog elektrisch veld bij een laag vloeistofdebiet (1-10 µl/min) direct uit de vloeistoffase gevormd, resulterend in een fijne spray van hooggeladen druppels. De verdamping van deze druppels produceert op zijn beurt hooggeladen ionen, volgens het zgn. principe van Rayleigh. Het solvens verdampt volledig waardoor we moleculaire species verkrijgen die meerdere ladingen dragen (Figuur 3.4). Het zijn deze ionen die gemeten worden met behulp van een ‘quadrupool’ of een ‘Time of Flight’ (TOF) analyser [48-50]. Principieel kunnen al de te onderzoeken stalen die op deze manier een lading dragen, worden onderzocht met behulp van ESI massaspectrometrie. Peptiden en eiwitten zijn belangrijke targetmoleculen voor deze techniek. Ze bevatten meestal basische aminozuren zoals lysine, arginine en histidine die in zuur milieu geprotoneerd worden, dus positief geladen, en nadien vluchtige ionen vormen. Oligonucleotiden kunnen geanalyseerd worden in de ‘negatieve mode’ waarbij fosfaatatomen negatieve ladingen dragen, te realiseren door omkering van de polariteit van de capillaire naald. Neutrale moleculen zoals oligosuikers kunnen ook


gedetecteerd worden als ze natrium of andere alkali-ionen als ‘charging agent’ opgenomen hebben. Deze groep geïoniseerde moleculen wordt in mindere mate waargenomen dan deze voor eiwitten of peptiden [45, 47-48].

Onlangs werd er van deze ionisatietechniek een belangrijke geminiaturiseerde versie

gecommercialiseerd. Deze aanpassing, ‘nano-spray’ genoemd, maakt gebruik van speciaal ontwikkelde glazen tips, waardoor het werken met stalen opgelost in een klein volume, en bij een zeer laag vloeistofdebiet (nanoliter/minuut), mogelijk is. Systematische studies hebben aangetoond dat het resulterende pieksignaal gedurende de analyse afhankelijk is van de concentratie van het te onderzoeken materiaal en niet van de gebruikte vloeistofdebieten [51-54]. Een interessante toepassing voor de nano-spray techniek is een mogelijkheid om ESI massaspectrometrie als HPLC-detector te gebruiken. In tegenstelling tot HPLC-systemen met narrow- of microbore kolommen is het vloeistofdebiet van capillaire HPLC zo laag dat het direct met de electrospray ionisatiebron kan aangesloten worden, wat de gevoeligheid ten goede komt [53-55].

3.3.1.2. Massa-analyse

Quadrupool ‘analysers’ zijn opgebouwd uit vier ronde of hyperbolische staven waarvan er twee positief en twee negatief geladen zijn. Een hooggeladen electrospray-ion treedt binnen in de open ruimte gevormd door de vier staven, richting negatieve staaf (Figuur 3.5). Door voortdurende omschakeling van de polariteit van de staven zullen de te detecteren deeltjes steeds van richting veranderen tot ze de detector bereiken. Ionen die door deze ruimte bewegen zijn dus onderworpen aan het elektrische veld opgebouwd door de superponering van een constante spanning en een variërende spanning (V = Vcte + Vvar). Door gebruik te maken van de opbouwende spanning (Vvar) worden de binnenkomende electrospray-ionen gefiltreerd volgens hun ‘massa tot lading’ (m/z) verhoudingen. Door de spanning (V) te laten variëren tussen twee bepaalde waarden kan men een bepaald m/z-gebied scannen [56].

Figuur 3.4. Principe van ionisatie gedurende electrosprayproces.


Figuur 3.6. Electrospray massaspectrum van myoglobine

Figuur 3.5. Werking van een quadrupoolanalyser. De A-staven staan onder dezelfde spanning; de B-staven hebben dezelfde spanning maar zijn tegengesteld aan die van de A-staven. Ze staan zo ingesteld dat enkel ionen met een m/z-waarde gelijk aan 100 de detector kunnen bereiken. Alle

overige ionen worden weggefilterd bij deze spanningswaarden (V = Vcte + Vvar).


ESI massaspectrometrie van grote eiwitten produceert een serie van meervoudig geladen ionen die door de quadropool-analyser gefilterd kunnen worden, naargelang hun verschillende m/z-waarden (zie massaspectrum van myoglobine, Figuur 3.6). We krijgen een quasi-Gaussiaanse verdeling van de pieken, waarbij elke piek van de volgende verschilt in één ladingswaarde. Nemen we een bepaalde piek met als m/z- waarde mn=M/n (vgl. 1) waarbij “M” het moleculair gewicht van het eiwit en “n” het aantal ladingen van het electrospray-ion is. De daaropvolgende piek heeft de m/z-waarde mn-1=M/n-1 (vgl. 2) en verschilt dus in zijn ladingsgehalte. Gezien mn en mn-1 beide experimenteel bepaald worden resulteert deze situatie in twee vergelijkingen met twee onbekenden. Door M in vgl. 2 door nMn uit vgl. 1 te vervangen krijgen we:

mn = M/n ⇒ M = n mn (vgl. 1) mn-1 = M/n-1 ⇒ M = (n-1) mn-1 (vgl. 2)

⇒ n mn = n mn-1 - mn-1

⇒ n mn - n mn-1 = - mn-1

⇒ n mn-1 - n mn = mn-1

⇒ n (mn-1 - mn) = mn-1 ⇒ n = mn-1 / (mn-1 - mn)

Eens de ladingen (n) van alle pieken gekend zijn kunnen we de waarde van de moleculaire massa of het gewicht (M) van het te onderzoeken materiaal berekenen. Dit massa/ladingpatroon is een unieke eigenschap van deze ionisatietechniek, en laat ons toe om de massa van het te onderzoeken materiaal met een nauwkeurigheid van 0.01% te bepalen. Commerciële software zoals MassLynx (Micromass, Altrincham, UK) maakt gebruik van principes uit de waarschijnlijkheidstheorie om een zgn. deconvolutie van de gegevens uit te voeren, wat uiteindelijk resulteert in een hogere resolutie (‘Maximum Entropie Berekeningen’ [57]).

Electrospray-ionisatie massaspectrometrie in combinatie met een quadrupoolanalyser

is een conventionele techniek waarbij deeltjes met m/z-waarden tot 3000 Da kunnen gedetecteerd worden. Dit is voldoende voor de analyse van grote biomoleculen in denaturerende omstandigheden. Bij natieve omstandigheden produceren de relatief compacte structuren van opgeplooide eiwitten een beperkter aantal ladingen tijdens het ionisatieproces. De m/z-waarden vallen dan meestal buiten het meetgebied van een gewone quadrupool analyser. Massaspectrometrische toepassingen van zulke hoogmoleculaire, niet-covalente complexen vereisen dus het gebruik van een massa-analyser met een groter m/z-bereik. ‘Time of Flight’ (TOF) analysers zijn met succes toegepast voor zulke moleculen, zelfs in combinatie met conventionele quadrupoolanalysers die ook wel eens ‘hybride’ quadrupool-TOF massaspectrometers genoemd worden (Figuur 3.7) [45, 48, 58-61].


TOF-analysers werden voor het eerst commercieel toegepast in de ’Plasma Desorption

Mass Spectrometer’ (ook wel eens ‘Particle-induced Desorption Mass Spectrometer’ genoemd) en later in ‘Matrix-assisted Laser Desorption Mass Spectrometry’ [45-48, 62-63]. De gegenereerde ionen worden door focusserende elektroden versneld, waarna ze de veldvrije vluchtbuis binnendringen en met een constante snelheid naar de detector gaan. De snelheid waarmee de ionen van startpunt naar eindpunt (detector) vliegen is omgekeerd evenredig met de vierkantswortel van hun massa. Hieruit blijkt dus dat de zwaardere ionen een kleinere snelheid hebben dan lichtere met dezelfde lading, en bijgevolg pas later de detector bereiken. Op die manier worden de éénwaardig geladen ionen meestal in de veldvrije vluchtbus gescheiden op basis van hun verschil in vluchttijd (=’time of flight’-analyse). Deze vluchttijden variëren van een paar tiental µs tot enkele ms, afhankelijk van de massa van de ionen en de lengte van de veldvrije vluchtbuis. Ionen afkomstig van een electrospray-ionisatiebron die de quadrupool doorgegaan zijn worden opgevangen in een soort ‘iontrap’-onderdeel bestaande uit lage-potentiaalelektroden die een afremmende werking hebben. Ze worden nadien versneld in een ruimte van 1 cm en dan met behulp van een ‘pusher’ in de veldvrije vluchtbuis geleid (Figuur 3.7). Deze staat loodrecht op de primaire ionbaan. De starttijd voor de TOF-analyse wordt gegeven door de

Ionisatie- kamer

Focusserend hexapool

Quadrupool Gascel

Reflectron

‘Pusher’ Detector

Quadrupool analyser TOF analyser

Figuur 3.7. Schema van een hybride massaspectrometer, voorzien van een quadrupool en een

reflectron TOF analyser.


activatie van een ‘pusher’, waardoor de gegeneerde ionen de veldvrije vluchtbuis binnengaan en aldus een startsein voor de time-of-flight-analyse gegeven wordt. Tegenwoordig worden de TOF-analysers ook uitgerust met een reflecterend elektrisch veld (reflectron) aan het einde van de vluchtbuis, waardoor de ionenbaan omgekeerd wordt [64-68]. Een serie concentrische ringen vervangt hier de detector, waardoor de vluchtbaan dus dubbel zo lang wordt. Voor twee ionen met verschillende snelheden (verschillende m/z-waarden) zullen hun ‘TOF’-vluchttijden in een lineaire vluchtbuis t1 en t2 zijn. Bij het gebruik van een reflectron zullen hun overeenkomstige vluchttijden 2t1 en 2t2 worden. Dit zal een verbetering van de massameting met zich brengen, wat de resolutie ten goede komt (zie Figuur 3.8).

3.3.2. Electrosprayionisatie massaspectrometrische aminozuurvolgorde bepalingen

Om structurele sequentieïnformatie over een biomolecule te bekomen met behulp van een massaspectrometer moet deze molecule gefragmenteerd worden en de fragmenten onderzocht. Er zijn tal van technieken ontwikkeld en getest.

Een eerste methode is de inwerking van carboxypeptidasen op een peptide/eiwit door er stapsgewijs de C-terminale aminozuren van af te knippen. Het onderzoeksmateriaal wordt daarbij geïncubeerd met carboxypeptidasen, en op steeds toenemende tijdstippen wordt er een fractie van afgenomen en massaspectrometrisch onderzocht. We kunnen in plaats van

m/z A m/zB m/z A

m/z A m/z A m/zB

m/zB

m/zB

vóór reflectron na reflectron

vóór reflectron na reflectron

Figuur 3.8. Voorbeelden hoe de scheidingsresolutie van twee verschillende nauwverwante m/z-

ionen verbeterd wordt bij gebruik van een ‘reflectron’.


carboxypeptidasen ook aminopeptidasen gebruiken, welke het eiwit sequentiëel aan de N-terminus sequentieel inkorten [69-72].

Chait en medewerkers [73] introduceerden een andere methode, zgn. ‘Ladder

sequencing’. Ze voerden een manuele Edmandegradatie uit waarbij, naast fenylisothiocyanaat, in de koppelingstap 5% blokkerend fenylisocyanaat als reagens gebruikt wordt. Na een aantal Edmancycli ontstaat er dus een mengsel van peptiden van verschillende lengte dat massaspectrometrisch kan geanalyseerd worden. Zowel bij enzymatische als chemische ladder-sequenering krijgen we een peptidenmengsel waarvan het massaverschil tussen de opeenvolgende massapieken gelijk is aan de residuële massa van een aminozuur. Hieruit kan de aminozuurvolgorde afgeleid worden (Figuur 3.9) [73-74].

Andere gebruikte methoden zijn intrinsiek verbonden aan electrospray ionisatie (ESI)

en matrix-assisted laser desorption ionisation (MALDI) massaspectrometers: respectievelijk ‘Cone Voltage’ (CV) fragmentatie en ‘Post-Source Decay’ (PSD) analyse.

Bij de gewone werking van een electrosprayionisatie massaspectrometer wordt een spanningsverschil van 35 V aangelegd tussen de ‘pepperpot’-elektrode en de ‘skimmer’. Door deze spanning op te drijven tot ongeveer 50V verhogen we de interne energie in de druppels en fragmenteren we het onderzoeksmateriaal. De ontstane fragmenten kunnen dan geanalyseerd worden. Het gebruik van kleine zuivere peptiden is noodzakelijk omdat de fragmentatie direct in de bron gebeurt. Hierdoor is een preselectie van de originele molecule (ouder of ‘parent’ ion genoemd) niet mogelijk [75].

Figuur 3.9. Voorbeeld van laddersequentieanalyse van een veertien aminozuren lang fibrinopeptide waarbij de eerste zes aminozuren duidelijk kunnen worden afgeleid [73]


De identificatie van de eiwitten kan ook gebeuren door de analyse van een ‘parent’ ion via MALDI-‘post-source decay’ (PSD) massaspectrometrie. Bij PSD zullen de intacte ionen tijdens de MALDI-analyse fragmenteren gedurende hun vlucht in de veldvrije vluchtbuis. De fragmentproducten hebben dezelfde snelheid als het intacte ion en kunnen dus niet van elkaar gescheiden worden wanneer de massaspectrometer in de lineaire mode werkt. Door stapsgewijs de spanning op de reflecterende lenzen te verlagen kunnen we deze fragmentionen wel waarnemen, omdat kleinere fragmentionen een lagere kinetische energie hebben dan grote fragmentionen of intacte ionen. Deze laatste, met grotere kinetische energie, zullen dieper in het reflectronveld dringen dan kleinere fragmentionen en zullen dus pas later in het ‘time-of-flight’-spectrum verschijnen (zie Figuur 3.10) [76-79].

Een techniek die al jaren succesvol toegepast wordt is ‘tandem’ massaspectrometrie

gecombineerd met een ‘Collison Induced Dissociation’ (CID) gascel [80-83]. Figuur 3.11 toont aan hoe de sequentiebepaling met behulp van deze techniek werkt en waarom ze ‘tandem massaspectrometrie’ of ‘MS/MS’ genoemd wordt. Een peptidenmengsel wordt geïnjecteerd en geïoniseerd in een tandem massaspectrometer. Het eerste deel van de analyser

Figuur 3.10. Schematische voorstelling van 'post-source decay' (PSD) fragmentatie. Een deel van de intacte ionen (P) is instabiel en fragmenteert in een veldvrije vluchtbuis (t1). Deze fragmentionen (f1 en f2) hebben dezelfde snelheid als het moederion, maar hebben een kleinere massa en dus lagere kinetische energie. Daarom dringen ze niet zo diep in het reflectronveld als hun moederion (t2), worden ze gescheiden van de intacte moederionen en bereiken ze sneller de detector (t3) (Bron: doctoraatsthesis K. Gevaert, 2000).


(meestal een quadrupool) wordt gebruikt om een te fragmenteren peptide uit een peptidenmengsel te filteren. Dit gebeurt door het elektrische veld van de quadrupool analyser zo in te stellen dat enkel ionen met een specifieke m/z-waarde doorheen de analyser bewegen en in de zogenoemde ‘gascel’ terechtkomen. Deze ruimte bevat een inert gas (meestal argon of xenon) waar de geselecteerde ionen tegenaan botsen, waardoor ze fragmenteren (‘Collison Induced Dissociation’). De fragmentionen worden in de tweede analyser (quadrupool of het in ons laboratorium opgestelde toestel een ‘Time of Flight’ buis) gedetecteerd in de daaraan gekoppelde detector. De fragmentatie gebeurt hoofdzakelijk tussen de amidebindingen van de peptideketen, wat resulteert in een één-aminozuur-gescheiden mengsel van massapieken (Figuur 3.12).

Figuur 3.11. Principe van massaspectrometrische fragmentatie met behulp van CID en twee

analysers (tandem massaspectrometrie).

Figuur 3.12. Na massa-screening van een peptidenmengsel (bovenste foto) wordt daaruit een te fragmenteren ion geselecteerd wat onderstaand fragmentatiepatroon oplevert(Bron: http://www.micromass.co.uk).


De nomenclatuur van de meest voorkomende fragmentionen is weergegeven in Figuur 3.13 [84-85]. De fragmentatie gebeurt hoofdzakelijk ter hoogte van de amide peptidenbinding waardoor er dus voornamelijk b- (N-terminaal) en y”- (C-terminaal) ionen gevormd worden. Verder kunnen deze fragmentionen satellietpieken genereren. Die zijn te wijten aan het verlies van aminegroepen (-NH2) van lysines en arginines, van een watermolecule (-H2O) en van de C-terminale CO-groep (x-fragmentionen). De plaats van de lading speelt hierbij trouwens een belangrijke rol. Wanneer de ladingen zich aan de beide uiteinden van het peptide bevinden zullen de fragmenten, zowel N- als C-terminale, deze ladingen meedragen en aldus gedetecteerd worden. De interpretatie van zulke complexe spectra kan vereenvoudigd worden door chemische modificatie van de N- of C-terminus van het te analyseren peptide. De modificatie waarbij een negatief geladen groep op het vrije N-terminus aangebracht wordt levert hoofdzakelijk C-terminale fragmentionen op, wat de interpretatie van fragmentatiespectra vergemakkelijkt. De plaatsing van een positief geladen groep op het N-terminus, bijvoorbeeld met een tertiair amine, levert hoofdzakelijk N-terminale fragmentatiespectra op, waardoor de sequentieanalyse ook eenvoudiger wordt [86-91].

Hieruit blijkt dat de massaspectrometrische sequentiebepaling belangrijke voordelen

heeft: snelheid, hoge gevoeligheid en de mogelijkheid om één peptide uit een mengsel te selecteren, te fragmenteren, en er aldus structurele informatie uit te halen. Nochtans kunnen massaspectrometrische sequentiebepalingen voorlopig niet volledig concurreren met de chemische microsequentietechnieken. Ze vormen er wel een nuttige aanvulling op. De reden hiervan is de beperkte lengte van de massaspectrometrische sequentie-informatie (meestal rond 15 aminozuren) die we bekomen na de fragmentatie, en het feit dat sommige isobare aminozuren niet van mekaar kunnen onderscheiden worden, bv. leucine/isoleucine (113.2 Da)

Figuur 3.13. Nomenclatuur en vooropgestelde structuren van peptidefragmentionen. y , a en b structuren zijn de meest waargenomen fragmentionen tijdens electrosprayionisatie CIDfragmentatie [84, 85].


en glutamine/lysine (128.1/128.2 Da). De fragmentatiespectra kunnen zeer complex zijn waardoor de interpretatie in het algemeen moeilijk kan zijn. Het inschakelen van bestaande software zoals MassLynx en het gebruik van eiwit- en genoomdatabanken kan daarbij wel een hulp bieden [92-96].

Veel onderzoekers doen inspanningen om massaspectrometrische bepalingen van

aminozuurvolgordes aantrekkelijker te maken door de introductie van de hierboven beschreven ‘nano-electrospray’-technologie. Er zijn ook verbeteringen in de automatische MALDI-PSD fragmentatietechnieken [97-98]. Een voorbeeld hiervan werd beschreven door Qin en medewerkers [99]. De auteurs fragmenteerden tryptische peptiden, bekomen door capillaire HPLC van een digest van myosin I ‘heavy chain’ kinase. Ze gebruikten 18O labelling en een quadrupool/TOF massaspectrometer met een ‘ion-trap’ techniek. Zeven van de zestien resulterende peptiden konden ondubbelzinnig gesequeneerd worden met deze techniek, aan een concentratie van 200 fmol/µl materiaal.

Een nieuw onderzoeksgebied in de massaspectrometrie is het terrein van de proteoom-

analyse (proteome = PROTeins expressed by the genOME) [100-103]. Het bacterieël DNA bevat de codes waarmee alle in de bacterie voorkomende eiwitten kunnen aangemaakt worden. De in de databank voorkomende bacteriële genoomsequenties kunnen als een ‘catalogus’ geraadpleegd worden. Veel onderzoekers, in allerlei onderzoeksthema’s, zijn geïnteresseerd in de eiwitten die tot expressie gebracht worden naargelang de groeicondities van de cel. Invloeden van de omgeving, bvb. ‘drug’ behandeling, groeiomstandigheden, ziekte, stress, genetische variatie, enz. kunnen hierdoor onderzocht worden [104-106]. Met dat doel werd de methodologie ontwikkeld die toelaat om honderden (200-700) geëxpresseerde eiwitten te scheiden via hoge-resolutie twee-dimensionele gelelektroforese en ondubbelzinnig te identificeren via massaspectrometrische fragmentatie en/of klassieke chemische sequentietechnieken. Deze gecombineerde techniek maakt van proteoomanalyse het instrument bij uitstek voor het testen van nieuwe inhibitoren/antibiotica, de opvolging van verschillende metabolische mechanismen, en de ontdekking van nieuwe enzymen die ingezet kunnen worden bij de bestrijding van milieuproblemen zoals, bijvoorbeeld, de dehalogenatie van gehalogeneerde calcitrante verbindingen [104-107].

Momenteel is 2D-gelelektroforese de enige techniek die met een hoge resolutie toelaat om verschillend geëxpresseerde eiwitten van mekaar te kunnen scheiden. Bij deze techniek gebeurt de scheiding in de eerste dimensie op basis van de verschillen in lading (isoëlectrische focussering) terwijl de scheiding in de tweede dimensie gebaseerd is op basis van de verschillen in het moleculair gewicht (SDS-PAGE). Na de elektroforetische scheiding kunnen de verschillende eiwitspots verder geïdentificeerd worden. Ofschoon in de meeste gevallen eiwitten op een twee-dimensioneel gel via hun verwacht moleculair gewicht en iso-elektrisch punt snel uit de genoomgegevens kunnen geïdentificeerd worden zullen de meeste eiwitten als één of meerdere spots op een 2D-gel voorkomen. Dit verschijnsel is te wijten aan post-translationele modificaties aangebracht tijdens of na de eiwitsynthese en het transport doorheen verschillende celcompartimenten, fenomenen die per definitie niet uit de genoomgegevens kunnen afgeleid worden. Post-translationele modificaties staan, algemeen gesproken, in voor de controle van intracellulaire eiwitfuncties, regulatie van enzymactiviteiten, stabilisatie van eiwitstructuren of toevoeging van een extra chemische functionaliteit aan een eiwit. De modificaties kunnen leiden tot veranderingen van iso-elektrisch punt en van moleculair gewicht. Voorbeelden hiervan zijn: N-terminale processing tijdens transport van een eiwit doorheen de periplasmatische membraan, acetylatie of formylatie aan het amino-terminus van het eiwit [109], fosforylatie [110], glycosylatie [111, 112], hydroxylatie [109], enz. Massaspectrometrische technieken vormen tegenwoordig een


interessante uitdaging voor onderzoek, identificatie en plaatsbepaling van post-translationeel gemodificeerde aminozuren in een eiwit (Figuur 3.14) [113, 114].

2D-gelectroforese

pI

MW

Analyse van een spot

Capillaire vloeistofchromatografie (links), gekoppeld aan een massaspectrometer (rechts)

Directe analyse van een peptidemengsel

Identificatie van een eiwit door vergelijking van gemeten massa’ met de verwachte massa van een eiwit dat in eiwit-databanken voorkomt

Vloeistofchromatografie van een peptidemengsel, gevolgd door massametingen

Tandem MS-fragmentatie van een geselecteerd eiwitfragment

Bevestiging van identificatie van een eiwit aan de hand van een sequentie bekomen na tandem MS-fragmentatie van een geselecteerd peptide.

Figuur 3.14. Proteoomanalyse van een onbekend eiwit op een twee-dimensionaal gel, gevolgd door identificatie met behulp van een eiwitdatabank aan de hand van massagegevens, na massaspectrometrische ‘screening’ van een peptidenmengsel. Bijkomende bevestiging werd geleverd door CID-fragmentatie van een geselecteerd eiwitfragment.


Puntmutaties vormen een andere reden van veranderingen in de primaire structuur van een eiwit [101, 110]. Dit soort van ‘modificatie’ kan enkel opgespoord worden door interpretatie van een MS/MS ionenspectrum van het mutatie-bevattend peptide bekomen na een digest van het eiwit met een geschikt protease. Daarvoor moet dus het betrokken peptide uit het digestmengsel geselecteerd worden na snelle ‘screening’ van alle peptiden met behulp van massaspectrometrie. Alleen het peptide dat de mutatie bevat zal immers een moleculeir gewicht hebben dat verschillend is van wat uit de gekende aminozuurvolgorde kan berekend worden. Om dat mogelijk te maken werd recent een nieuwe methodologie ontwikkeld, zgn. (multi-dimensionale) vloeistofchromatografie, gekoppeld aan tandem massaspectrometrie. Chromatografische technieken hebben diverse voordelen ten opzichte van klassieke gelelektroforese: een hoge automatiseerbaarheid, een grote gevoeligheid, goed kwantificeerbare detectiemogelijkheden en een hoge mate van integreerbaarheid met een massaspectrometer. Tegenwoordig wordt het te onderzoeken digestmateriaal eerst opgezuiverd met behulp van omgekeerde-fase capillaire chromatografie en dan direct geanalyseerd door een tandem massaspectrometer. Met multi-dimensionale chromatografie is het ook mogelijk om dit digestmateriaal eerst op te zuiveren door ionuitwisselingschroma-tografie of gelfiltratie waarbij de opgevangen fracties nadien met omgekeerde-fase chromatografie gescheiden worden [115]. Identificatie van eiwitten met of zonder post-translationele modificaties als onderdeel van biologische massaspectrometrische proteoomanalyse vormen tegenwoordig een interessante uitdaging waarbij men meer nadruk gaat leggen op automatisatie, snelheid, gevoeligheid en nauwkeurigheid. Tot slot kan multi-dimensionele chromatografie, gekoppeld aan een massaspectrometer, een interessante identificatietechniek vormen van kleine (< 10 kDa), zure (pH < 4) en basische eiwitten (pH > 11) die niet of moeilijk via 2D-gelelectroforese kunnen aangetoond worden. Deze ‘state of the art’ wordt momenteel door een paar laboratoria ter wereld verder ontwikkeld [116-117].

3.3.3. Instrumentatie

Bij ons doctoraatswerk werd gebruik gemaakt van de twee ESI-toestellen die het laboratorium ter beschikking heeft: een VG BIO-Q en een Q-TOF massaspectrometer (beide van Micromass, Altrincham, UK). Het eerste toestel heeft in de loop van de jaren veranderingen ondergaan die zowel de resolutie als de gevoeligheid ten goede kwamen. Het is een ‘triple’ quadrupool spectrometer waarvan het eerste en derde gedeelte quadrupoolanalysers zijn en het middelste gedeelte een gascel bevat bestaande uit een quadrupool focusseringssysteem.

Het tweede toestel, dat een 3-tal jaren geleden in dienst werd gesteld, is ook een ‘triple quadrupool’ massaspectrometer, maar de derde quadrupoolanalyser is vervangen door een veel gevoeliger TOF-analyser (Figuur 3.15). Dit toestel is ook voorzien van een zogenaamd ‘Z-spray’-ionisatiesysteem. Het te ioniseren staal

Figuur 3.15. Q-TOF hybride massaspectrometer met Z-spray ionisatiesysteem (zie Fig 3.16).


wordt niet meer rechtstreeks ‘in-line’ met een ionisatiekamer van de massaspectrometer ingebracht, maar in een ‘Z’-positie (Figuur 3.16) waarbij neutrale vloeistofdeeltjes rechtdoor gaan en hoog positief geladen ionen door het hoog elektrisch veld dat heerst tussen de nanospray-naald en de analysator afgebogen worden.

Het te onderzoeken staal wordt doorgaans opgelost in 5-10 µl 50% acetonitrile/0.1%

mierenzuur in water, of anders in water alleen, naargelang de soort analyse. Voor het eerste toestel wordt het staal geïnjecteerd via een Rheodyne injector (10 µl) en door middel van een Harvard Syringe pump doorheen het ‘fused’-silica capillair naar de zogenaamde ‘probe’ gepompt, waar het verbonden is met een metalen capillair. Bij het tweede toestel wordt het staal (3 µl) in een speciaal aangemaakte glazen naald geïnjecteerd en aldus op het nanospray-onderdeel opgebouwd waar de pneumatische druk van stikstof (ongeveer 5 psi) voor het lage nanoliterdebiet zorgt. De naaldpunt moet vooraf manueel afgebroken worden.

3.4. Referenties 1. Edman, P. (1950). Method for the determination of the amino acid sequence of peptides. Acta Chem. Scand. 4, 283-293 2. Shiveley, J.E. (2000). The chemistry of protein sequence analysis. In Proteomics in functional genomics. Protein structure analysis (Eds., Jollès, P., Jörnvall, H.). Pp. 99-118, Birkhäuser Verlag, Basel 3. Fontana, A., Gross, E. (1986). Fragmentation of polypeptides by chemical methods. In Practical Protein Chemistry. A Handbook (Ed., Darbre, A.). Pp. 68-120, John Wiley & Sons, New York 4. Kruft, V., Kapp, U., Wittmann-Liebold, B. (1991). On-sequencer pyridylethylation of cysteine residues after protection of amino groups by reaction with phenylisothiocyanate. Anal. Biochem. 193, 306-309

5. Iwamatsu, A. (1992). S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis 13, 142-147 6. Ploug, M., Stoffer, B., Jenssen, A.L. (1992). In situ alkylation of cysteine residues in a hydrophobic membrane protein immobilized on polyvinylidene difluoride membranes by electroblotting prior to microsequence and amino acid analysis. Electrophoresis 13, 148-153 7. Jue, R.A. and Hale, J.E. (1993) Identification of cysteine residues alkylated with 3-bromopropylamine by protein sequence analysis. Anal. Biochem. 210, 39-44. 8. Matsudeira, P. (1987). Sequence from picomole quantities of protein electroblotted

Capillaire leiding of nano-spray

naaldReinigbare plaat

Foccuserend hexapool

Binnenkomend kegel

Figuur3.16. Schematische voorstelling

van Z-spray opstelling


onto polyvinylidene difluoride membranes. J. Biol. Chem. 262, 10035-10038 9. Xu, Q.Y., Shively, J.E. (1988). Microsequence analysis of peptides and proteins. Improved electroblotting of proteins onto membranes and derivatized glass-fiber sheets. Anal. Biochem. 170, 19-30 10. Moos, M., Nguyen, N.Y., Liu, T.Y. (1988). Reproducible high-yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support. J. Biol. Chem. 263, 889-896 11. Bauw, G., Van Damme, J.,Puype, M. Vandekerckhove, J., Gesser, B., Ratz, G.P., Lauridsen, J.B., Celis, J.E. (1989). Protein-electroblotting and –microsequencing strategies in generating protein data bases from two-dimensional gels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7701-7705 12. Krishna, R.G., Chin, C.Q., Wold, F. (1991). N-terminal sequence analysis of Nα acetylated proteins after unblocking with N-acylaminoacyl-peptide hydrolase. Anal. Biochem. 199, 45-49 13. Hirano, H., Komatsu, S., Takakura, H., Sakiyama, F., Tsunasawa, S. (1992). Deblocking and subsequent microsequence analysis of Nα-blocked proteins electroblotted onto PVDF membrane. J. Biochem. 111, 754-757 14. Aebershold, R.H., Leavitt, J., Saavedra, R.A., Hood, L.E., Kent, S.B. (1987). Internal amino acid sequence analysis of proteins separated by one- or two-dimensional gel electrophoresis after in situ protease digestion on nitrocellulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6970-6974 15. Fernandez, J., Demont, M., Atherton, D., Mische, S.M. (1992). Internal protein sequence analysis. Enzymatic digestion for less than 10 mg of protein bound to polyvinylidene difluoride of nitrocellulose membranes. Anal. Biochem. 201, 255-264 16. Patterson, S.D., Hess, D., Yungwirth, T., Aebershold, R. (1992). High-yield recovery of electroblotted proteins and cleavage fragments

from a cationic polyvinylidene fluoride-based membrane. Anal. Biochem. 202, 193-203 17. Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J.C., Ferrara, P. (1992). In gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203, 173-179 18. Stone, K.L., McNulty, D.E., LoPresti, M.L., Crawford, J.M., DeAngelis, R., Williams, K.R. (1992). Elution and internal amino acid sequencing of PVDF-blotted proteins. In Techniques in Protein Chemistry III (Ed.: Angelitti, R.H.). Pp. 23-34. Academic Press, San Diego 19. Wadsworth, C.L., Knuth, M.W., Burrus, L.W., Olwin, B.B., Niece, R.L. (1992). Reusing PVDF electroblotted protein samples after N-terminal sequencing to obtain unique internal amino acid sequence. In Techniques in Protein Chemistry III (Ed.: Angelitti, R.H.). Pp. 61-68. Academic Press, San Diego 20. Simpson, R.J., Moritz, R.L., Begg, G.S., Rubira, M.R., Nice, E.C. (1989). Micropreparative procedures for high sensitivity sequencing of peptides and proteins. Anal. Biochem. 203, 173-179 21. Moritz, R.L., Ward, L.D., Simpson, R.J. (1992). High-sensitivity peptide mapping utilizing reversed-phase microbore and microcolumn liquid chromatography. In Techniques in Protein Chemistry III (Ed.: Angelitti, R.H.). Pp. 97-106. Academic Press, San Diego 22. Wilkinson, J.M. (1986). Fragmentation of polypeptides by enzymic methods. In Practical Protein Chemsitry. A Handbook (Ed., Darbre, A.). Pp. 121-148, John Wiley & Sons, New York 23. Farnsworth, V., Carson, W., Krutzsch, H. (1991). Reducing chemical background noise in automated protein sequencers. Peptide Res. 4, 1-6 24. Totty, N.F., Watersfield, M.D., Hsuan, J.J. (1992). Accelerated high-sensitivity microsequencing of proteins and peptides using a miniature reaction cartridge. Protein Sci. 1, 1215-1224


25. Sheer, D.G., Yuen, S., Wong, J., Wasson, J., Yuan, P.M. (1992). A modified reaction cartridge for direct protein sequencing on polymeric membranes. BioTechniques 11, 526-533 26. Reim, D.F., Hembach, P., Speicher, D.W. (1992) Evaluation of the blot cartridge for enchanced gas phase sequencing at maximum sensitivity. In Techniques in Protein Chemistry III (Ed.: Angelitti, R.H.). Pp. 53-60. Academic Press, San Diego 27. Muramoto, K., Nokihara, K., Ueda, A., Kamiya, H. (1992). Sensitization of gas-phase protein sequencer using fluorescein isothiocyanate PITC. J. Protein Chem. 11, 359 28. Aebershold, R., Bures, E.J., Namchuk, M., Goghari, M.H., Shushan, B., Covey, T.C. (1992). Design, synthesis and characterization of a protein sequencing reagent yielding amino acid derivatives with enchanced detectability by mass spectrometry. Protein Sci. 1, 494-503 29. Hess, D., Nika, H., Chow, D.T., Bures, E.J., Morrison, H.D., Aebersold, R. (1995). Liquid chromatography-electrospray ionisation mass spectrometry of 4-(3-pyridinylmethyl-aminocarboxypropyl) phenylthiohydantoins. Anal. Biochem. 224, 373-381 30. Moritz, R.L., Simpson, R.J. (1993). In Methods in Protein Sequence Analysis (Eds., Imahori, K., Sakiyama, F.). Pp. 3-10, Plenum Press 31. Waldron, K.C., Wu, S.L., Earle, C.W. Harke, H.R., Dovichi, N.J. (1990). Capillary zone electrophoresis separation and laser-based detection of both fluorescein thiohydantoin and dimethylaminoazobenzene thiohydantoin derivatives of amino acids. Electrophoresis 11, 777-780 32. Inglis, A.S. (1991). Chemical procedures for C-terminal sequencing of peptides and proteins. Anal. Biochem. 195, 183-196 33. Boyd, V.L., Bozzini, M., Zon, G., Noble, R.L., Mattaliano, R.J. (1992) Sequencing of peptides and proteins from the carboxy terminus. Anal. Biochem. 206, 344-352

34. Bailey, J.M., Shenoy, N.R., Ronk. M., Shively, J.E. (1992). Automatic carboxy-terminal sequence analysis of peptides. Protein Sci. 1, 68-80 35. Dupont, D.R., Bozzini, M., Boyd, V.L. (2000). The alkylated thiohydantoin method for C-terminal sequence analysis. In Proteomics in functional genomics. Protein structure analysis (Eds., Jollès, P., Jörnvall, H.). Pp. 119-132, Birkhäuser Verlag, Basel 36. Samyn, B., Hardeman, K., Van der Eycken, J., Van Beeumen, J. (2000). Applicability of the alkylation chemistry for chemical C-terminal protein sequence analysis. Anal. chem. 72, 1389-1399 37. Hardeman, K., Samyn, B., Van der Eycken, J., Van Beeumen, J. (1998). An improved chemical approach toward the C-terminal sequence analysis of proteins containing all natural amino acids. Protein Sci. 7, 1593-1602 38. Cohen, S.A., Strydom, D.J. (1988) Amino acid analysis utilizing phenylisothiocyanate derivatives. Anal. Biochem. 174, 1-16 39. West, K.A., Crabb, J.W. (1992). Applications of automatic PTC amino acid analysis. In Techniques in Protein Chemistry III (Ed.: Angelitti, R.H.). Pp. 233-242. Academic Press, San Diego 40. Gharandagh, F., Atherton, D., DeMott, M., Mische, S.M. (1992). Amino acid analysis of PVDF proteins. In Techniques in Protein Chemistry III (Ed.: Angelitti, R.H.). Pp. 249-260. Academic Press, San Diego 41. Hobohm,, U. Houthaeve, T., Sander, C. (1994). Amino acid analysis and protein database compositional search as a rapid and inexpensive method to identify proteins. Anal. Biochem. 222, 202-209 42. Wilkins, M.R., Pasquali, C., Appel, R.D., Ou, K., Golaz, O., Sanchez, J.C., Yan, J.X., Gooley, A.A., Hughes, G., Humphery-Smith, I., Williams, K.L., Hochstrasser, D.F. (1996). From proteins to proteomes: large scale protein identification by two-dimensional


electrophoresis and amino acid analysis. Biotechnology 14, 61-65 43. Chait, B.T., Kent, S.B.H. (1992). Weighting naked proteins – practical, high-accuracy mass measurement of peptides and proteins. Science 257, 1885-1894 44. Yates, J.R., Speicher, B., Griffin, P.R., Hunkapiller, T. (1993). Peptide mass maps: a highly informative approach to protein identification. Anal. Biochem. 214, 397-408 45. Fitzgerald, M.C., Siuzdak, G. (1996). Biochemical mass spectrometry: worth the weight. Chem. & Biol. 3, 707-715 46. Burlingame, A.L., Boyd, R.K., Gaskell, S.J. (1998). Mass spectrometry. Anal. Chem. 70, 647R-716R 47. Costello, C.E. (1999); Bioanalytic applications of mass spectrometry. Curr. Opin. Biotech. 10, 22-28 48. Mann, M., Wilm, M. (1995). Electrospray mass spectrometry for protein characterization. TIBS 20, 219-224 49. Kebarle, P. (2000). A brief overview of the present status of the mechanism involved in electrospray mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 804-817 50. De Hoffmann, E., Charette, J., Stroobant, V. (1996). Ion sources. In Mass spectrometry. Principles and applications. Pp. 9-38, Masson, Paris 51. Fong, K.W., Chan, T.W. (1999). A novel nonmetallized tip for electrospray mass spectrometry at nanoliter flow rate. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10, 72-75 52. Hsieh, F., Baronas, E., Muir, C., Martin, S.A. (1999). A novel nanospray capillary zone electrophoresis/mass spectrometry interface. Rapid. Comm. Mass. Spectrom. 13, 67-72 53. Juraschek, R., Dulcks, T., Karas, M. (1999). Nanoelectrospray – more than just a minimized-flow electrospray ionization source. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10, 300-308

54. Griffiths, W.J. (2000). Nanospray mass spectrometry in protein and peptide chemistry. In Proteomics in functional genomics. Protein structure analysis (Eds., Jollès, P., Jörnvall, H.). Pp. 69-80, Birkhäuser Verlag, Basel 55. McGinley, M.D., Davis, M.T., Robinson, J.H., Spahr, C.S., Bures, E.J., Beierle, J., Mort, J., Patterson, S.D. (2000). A simplified device for protein identification by microcapillary gradient liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Electrophoresis 21, 1678-1684 56. De Hoffmann, E., Charette, J., Stroobant, V. (1996). Mass analysers. In Mass spectrometry. Principles and applications. Pp. 39-98, Masson, Paris 57. Ferrige, A.G., Seddon, M.J., Jarvis, S. (1991). Maximum entropy deconvolution in electrospray mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 5, 374-379 58. Furestenau, S.D., Benner, W.H. (1995). Molecular weight determination of megaDalton DNA electrospray ions using charge detectiom time-of-flight mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass Spectrom. 9, 1528-1538 59. Gaskell, S.J. (1997). Electrospray: principles and practice. J. Mass Spectrom. 32, 677-688 60. Morris, H.R., Paxton, T. Panico, M., McDowell, R., Dell, A. (1997). A novel geometry mass spectrometer, the Q-TOF, for low-femtomole/attomole-range biopolymer sequencing. J. Protein Chem. 16, 469-479 61. Kristensen, D.B., Imamura, K., Miayamoto, Y., Yoshizato, K. (2000). Mass spectrometric approaches for the characterization of proteins on a hybrid quadrupole time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer. Electrophoresis 21, 430-439 62. Stults, J.T. (1995). Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 691-698 63. Takah, E.J., Hines, W.M., Patterson, D.H., Juhasz, P., Falick, A.M., Vestal, M.L.,


Martin, S.A. (1997). Accurate mass measurements using MALDI-TOF with delayed extraction. J. Protein Chem. 16, 363-369 64. Cornish, T.J., Cotter, R.J. (1993). A curved-field reflectron for improved energy focussing of product ions in time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 7, 1037-1040 65. Lee, H., Lubman, D.M. (1995). Sequence-specific fragmentation generated by matrix-assisted laser desorption/ionization in a quadrupole ion trap/reflectron time-of-flight device. Anal. Chem. 67, 1400-1408 66. Beussman, D.J., Vlasak, P.R., McLane, R.D., Seeterlin, M.A., Enke, C.G. (1995). Tandem reflectron time-of-flight mass spectrometer utilizing photodissociation. Anal. Chem. 67, 3952-3957 67. Doroschenko, V.M., Cotter, R.J. (1999). Ideal velocity focussing in a reflectron time-of-flight mass spectrometer. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10, 992-999 68. Fancher, C.A., Woods, A.S., Cotter, R.J. (2000). Improving the sensitivity of the end-cap reflectron time-of-flight mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 35, 157-162 69. Thiede, B., Wittmann-liebold, B., Bienert, M., Krause, E. (1995). MALDI-MS for C-terminal sequence determination of peptides and proteins degraded by carboxypeptidase Y and P. FEBS Lett. 357, 65-69 70. Bonetto, V., Bergmann, A.C., Jörnvall, H., Sillard, R. (1997). C-terminal sequence determination of modified peptides by MALDI-MS. J. Protein Chem. 16, 371-374 71. Bonetto, V., Bergman, A., Jörnvall, H., Sillard, R. (1997). C-terminal sequence analysis of peptides and proteins using carboxypeptidases and mass spectrometry after derivatization of Lys and Cys. Anal. Chem. 69, 1315-1319 72. Thiede, B., Salnikow, J., Wittmann-Liebold, B. (1997). C-terminal ladder sequencing by an approach combining

chemical degradation with analysis by matrix-assisted-laser-desorption ionization mass spectrometry. Eur. J. Biochem. 244, 750-754 73. Chait, B.T., Wang, R., Beavis, R.C., Kent, S.B. (1993). Protein ladder sequencing. Science 262, 89-92 74. Bergman, T. (2000). Ladder sequencing. In Proteomics in Functional Genomics (Eds., Jollès, P., Jörnvall, H.). Pp. 133-144, Birkhäuser Verlag, Basel 75. Harrison, A.G. (1999). Energy-resolved mass spectrometry: a comparison of quadrupole cell and cone-voltage collision-induced dissociation. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, 1663-1670 76. Kaufmann, R., Kirsch, D., Spengler, B. (1994). Sequencing of peptides in a time-of-flight mass spectrometer – evaluation of postsource decay following matrix-assisted laser-desorption ionization (MALDI). Int. J. Mass Spectrom. Ion Process 131, 355-385 77. Kaufmann, R., Chaurand, P., Kirsch, D., Spengler, B. (1996). Post-source decay and delayed extraction in matrix-assisted laser desorption/ionization-reflectron time-of-flight mass spectrometry. Are there trade offs? Rapid Commun. Mass Spectrom. 10, 1199-1208 78. Chaurand, P., Luetzenkirchen, F., Spengler, B. (1999). Peptide and protein identification by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) and MALDI-post-source decay time-of-flight mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10, 91-103 79. Gevaert, K., Vandekerckhove, J. (2000). Protein identification methods in proteomics. Electrophoresis 21, 1145-1154 80. Hamdan, M., Curcuruto, O. (1994). Collision-induced dissociation of some protonated peptides with and without mass selection. Rapid Commun. Mass Spectrom. 8, 274-279 81. Olling, A., Breimer, M.E., Peltomaa, E., Samuelsson, B.E., Ghardashkhani, S. (1998). Electrospray ionization and collision-induced dissociation time-of-flight mass


spectrometry of neutral glycosphingolipids. Rapid Commun. Mass Spectrom. 12, 637-645 82. Harvey, D.J. (2000). Electrospray mass spectrometry and fragmentation of N-linked carbohydrates derivatized at the reducing terminus. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11, 900-915 83. De Hoffmann, E., Charette, J., Stroobant, V. (1996). Analysis of biomolecules. In Mass spectrometry. Principles and applications. Pp. 203-262, Masson, Paris 84. Biemann, K. (1990). Sequencing of peptides by tandem mass spectrometry and high-energy collision induced dissociation. Meth. Enzymol. 193, 455-479 85. Roepstorff, P., Fohlmann, J. (1984). Proposal for common nomenclature for sequence ions in mass-spectra of peptides. Biomed. Mass Spectrom. 11, 601 86. Bartlet-Jones, M., Jeffrey, W.A., Hansen, H.F., Pappin, D.J. (1994). Peptide ladder sequencing by mass spectrometry using a novel, volatile degradation reagent. Rapid Commun. Mass Spectrom. 8, 737-742 87. Liao, P. Huang, Z.H., Allison, J. (1997). Charge remote fragmentation of peptides following attachment of a fixed positive charge: a matrix assisted laser desorption/ionization postsource decay study. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 8, 501-509 88. Roth, L.D.W., Hyang, Z.-H., Sadagopan, N., Watson, J.T. (1998). Charge derivatization of peptides for analysis by mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 17, 255-274 89. Keough, T., Youngquist, R.S., Lacey, M.P. (1999). A method for high-sensitivity peptide sequencing using postsource decay matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 7131-7136 90. Shen, T.L., Huang, Z.-H., Laivenieks, M., Zeikus, J.G., Gage, D.A., Allison, J. (1999). Evaluation of charge derivatization of a proteolytic protein digest for improved mass spectrometric analysis: de novo sequencing by

matrix-assisted laser desorption/ionization post-source decay mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 34, 1154-1165 91. Lindh, I., Hjelmqvist, L., Bergman, T., Sjovall, J., Griffiths, W.J. (2000). De novo sequencing of proteolytic peptides by a combination of C-terminal derivatization and nano-electrospray/collision-induced dissociation mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11, 673-686 92. Mann, N., Wilm, M. (1994). Error-tolerant identification of peptides in sequence databases by peptide sequence tags. Anal. Chem. 66, 4390-4399 93. Clauser, K.R., Hall, S.C., Smtith, D.M., Webb, J.W., Andrews, L.E., Tran, H.M., Epstein, L.B., Burlingame, A.L. (1995). Rapid mass spectrometric peptide sequencing and mass matching for characterization of human melanoma proteins isolated by two-dimensional PAGE. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5072-5076 94. Griffin, P.R., MacCoss, M.J., Eng, J.K., Blevins, R.A., Aaronson, J.S., Yates, J.R. 3rd (1995). Direct database searching with MALDI-PSD spectra of peptides. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 1546-1551 95. Shevchenko, A. Wilm, M., Vorm, O., Jensen, O.N., Podtelejnikov, A.V., Neubauer, G. Mortensen, P., Mann, M. (1996). Strategy for identifying gel-separated proteins in sequence database by MS alone. Biochem. Soc. Trans. 24, 893-896 96. Murray, K.K. (1999). Internet resources for mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 34, 1-9 97. Wilm, M., Shevchenko, A. Houthaeve, T., Breit, S., Schweigerer, L., Fotsis, T., Mann, M. (1996). Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectrometry. Nature 379, 466-469 98. Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K.G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. (1997). Rapid ‘de novo’ peptide sequencing by a combination of nano-electrospray, isotopic labeling and a


quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 99. Qin, J., Herring, C.J., Zhang, X. (1998). De novo peptide sequencing in an ion trap mass spectrometer with 18O labeling. Rapid Commun. Mass Spectrom. 12, 209-216 100. Haynes, P.A., Gygi, S.P., Figeys, D., Aebersold, R. (1998). Proteome analysis: Biological assay or data archive. Electrophoresis 19, 1762-1871 101. Haynes, P.A., Yates, J.R. III (2000). Proteome profiling –pitfalls and progress. Yeast 17, 81-87 102. Quadroni, M. James, P. (2001). Proteomics and automation. Proteomics 1, 664-677 103. Connor, C.D., Adams, P., Alefounder, P., Farris, M., Kinsella, N., Li, Y., Payot, S., Skipp, P. (2000). The analysis of microbial proteomes: strategies and data exploitation. Electrophoresis 21, 1178-1186 104. Klose, J. (1999). Genotypes and phenotypes. Electrophoresis 20, 643-652 105. Cordwell, S.J., Nouwens, A.S., Walsh, B.J. (2001). Comparative proteomics and bacterial pathogens. Proteomics 1, 461-472 106. Jungblutt, P.R., Zimmy-Arndt, U., Zeindl-Eberhart, E., Stulik, J., Koupilova, K., PleiBner, K.P., Otto, A., Müller, E.C., Sokolowska-Köhler, W., Grabner, G., Stöffler, G. (2100). Proteomics in human diseases: cancer, heart and infectious diseases. Electrophoresis 20, 2100-2110 107. Damborsky, J., Nyandoroh, M.G., Nemec, M., Holoubek, I., Bull, A.T., Hardman, D.J. (1997). Some biochemical properties and the classification of a range of bacterial haloalkane dehalogenases. Biotechnol. Appl. Biochem. 26, 19-25 108. Miklos, G.L.G., Maleszka R. (2001). Protein functions and biological contexts. Proteomics 1, 169-178

109. Aitken, A. (1990). Identification of protein consensus sequences. Active site and DNA-binding motifs, phosphorylation and other post-translational modifications. (Ed. Wiseman, A.), Ellis Horwood series in Biochemistry and Biotechnology, Ellis Horwood Lmited, Chichester, pp. 1-167. 110. Sickmann, A., Meyer, H.E. (2001). Phosphoamino acid analysis. Proteomics 1, 200-206 111. Harvey, D.J. (2001). Identification of protein-bound carbohydrates by mass spectrometry. Proteomics 1, 311-328 112. Schäffer, C., Graninger, M., Messner, P. (2001). Prokaryotic glycosylation. Proteomics 1, 248-261 113. Lennon, J.J., Walsh, K.A. (1999). Locating and identifying posttranslational modifications by in-source decay during MALDI-TOF mass spectrometry. Prot. Science 8, 2487-2493 114. Sickmann, A., Marcus, K., Schäfer, H., Butt-Dörje, E., Leher, S., Herkner, A., Suer, S., Bahr, I., Meyer, H.E. (2001). Identification of post-translationally modified proteins in proteome studies. Electrophoresis 22, 1669-1676 115. Figeys, D., Gygi, S.P., Zhang, Y., Watts, J., Gu, M., Aebershold, R. (1998). Electrophoresis combined with novel mass spectrometric techniques: powerful tools for the analysis of proteins and proteomes. Electrophoresis 19, 1811-1818 116. Unger, K.K., Racaityke, K., Wagner, K. (2000). Is multidimensional high performance liquid chromatography (HPLC) an alternative in protein analysis to 2D gel electrophoresis. J. High Res. Chrom.. 23, 259-265 117. Wagner, K., Racaityke, K., Unger, K.K., Milotis, T., Edholm, L.E., Boschoff, R., Marko-Varga, G. (2000). Protein mapping by two-dimensional high performance liquid chromatography. J. Chrom. 893, 293-305

4

Primaire structuurbepaling van HiPIP sequenties

4.1. INLEIDING 81

4.2. MATERIAAL 82

4.3. AMINOZUURVOLGORDE VAN ALLOCHROMATIUM WARMINGII HIPIP 83

4.4. AMINOZUURVOLGORDE VAN THIOCYSTIS VIOLACEA 86

4.5. AMINOZUURVOLGORDE VAN ISOCHROMATIUM BUDERI 88

4.6. AMINOZUURVOLGORDE VAN HALOCHROMATIUM SALEXIGENS 90

4.7. AMINOZUURVOLGORDE VAN THIOCAPSA SP., STAM CAU 94

4.8. AMINOZUURVOLGORDE VAN RPS. CRYPTOLACTIS 97

4.9. BIJKOMENDE TABELLEN 99

Hoofdstuk 4. Primaire structuurbepaling van HiPIP-sequenties

81

Hoofdstuk 4

Primaire structuurbepaling van HiPIP sequenties

4.1. Inleiding

In dit hoofdstuk wens ik voor een zestal HiPIP sequenties aan te tonen hoe we tot hun primaire aminozuurvolgorde gekomen zijn. Ondanks de sterke toename van de hoeveelheid genomische sequentiegegevens in de databanken blijft eiwitsequentie-analyse een hoeksteen van multidisciplinair onderzoek naar de structuur/functie verwantschap van diverse biologisch belangrijke eiwitten. Dank zij deze multidisciplinaire aanpak in het gebied van de biochemie, moleculaire biologie, microbiologie en genetica neemt de kennis over de rol van eiwitten die een belangrijke functie hebben in de regulatie van diverse biologische functies, explosief toe. Ofschoon een volledig sequentie-analyse op eiwitniveau tegenwoordig een minder belangrijke rol speelt dan volledige genoomsequentie-analyse blijft het toch een niet te onderschatten techniek voor veel onderzoekers. Partiële aminozuurvolgordes kunnen een belangrijke en ondubbelzinnige aanwijzing vormen voor de identificatie van het eiwit ter studie, wat ons in staat stelt om in zeer lage hoeveelheden geëxpresseerde eiwitten te kloneren en tot overexpressie te brengen. We herinneren er aan dat de hier gebruikte technieken momenteel de enige zijn om verschillende post-translationele modificaties van eiwitten op te sporen of te bevestigen. Jarenlang hebben veel wetenschappers hun krachten gebundeld om deze eiwitsequentietechnieken te perfectioneren door verbetering van de automatische sequenatoren, door vermindering van chemische achtergrond of van interferenties, en door het gebruik van betere chemicaliën. Dit leidde tot spectaculaire verbeteringen in gevoeligheid en verlaging van de analysetijden. Eén van de mijlpalen in de ontwikkeling naar gevoeliger eiwitsequentietechnieken is de introductie van tandem massaspectrometrie. Tot in de jaren tachtig bleef de massaspectrometrie het terrein van fysici en scheikundigen, maar toen het mogelijk werd om grotere moleculen zoals eiwitten en peptiden te onderzoeken raakten steeds meer ‘biologen’ geïnteresseerd in deze techniek. Deze is thans zo verfijnd dat men complexen van eiwitmoleculen kan analyseren met een nauwkeurigheid van 0.01% van de totale eiwitmassa (zie vorig hoofdstuk). In vergelijking met de ca 5% nauwkeurigheid voor de moleculaire gewichtsbepalingen bij SDS-PAGE is dit een enorme stap vooruit. Massaspectrometrische analyse van een onbekend eiwit, enzymatisch gesplitst in kleinere fragmenten, levert daarenboven als het ware een ‘vingerafdruk’ van elke brokstuk, maar daarmee ook van het hele eiwit.

De gebruikte technieken in dit hoofdstuk gaan van eenvoudige tot gecombineerde

processen waarbij men onder de eenvoudige de beschreven gewone N- en C-terminale microsequentieanalyses dient te verstaan. Met gecombineerde processen bedoelen we een combinatie van verschillende technieken die in ons laboratorium beschikbaar zijn, bvb. N-terminale microsequentieanalyse gecombineerd met fragmentarische massaspectrometrie.


82

Deze kunnen eventueel aangevuld worden met andere technieken, zoals elektroforese, gevolgd door transfer naar een dragermembraan en bepaling van de aminozuursamenstelling.

De experimenten besproken in deze scriptie worden het best toegelicht aan de hand van onderstaand schema (Figuur 4.1).

4.2. Materiaal

Alle hier besproken geïsoleerde en/of gezuiverde eiwitstalen zijn ons ter beschikking gesteld door Dr. T. E. Meyer van het Laboratory of Biochemistry, University of Arizona. Het betreft HiPIP’s geïsoleerd uit Rhodopseudomonas cryptolactis, Allochromatium warmingii, Thiocystis violacea, Isochromatium buderi, Halochromatium salexigens en Thiocapsa sp., stam CAU. In tegenstelling tot de eerste zes genoemde species is het laatstgenoemde tot nu

Controle zuiverheid van eiwitstaal via ESMS en/of SDS-PAGE

N-terminale microsequentieanalyse

Opzuivering van eiwitpreparaat

Ontclustering en modificatie van cysteïnes

Enzymatische digesten en HPLC scheiding van peptiden

Massametingen van opgevangen frakties

Voorlopig aminozuurvolgorde: N-terminale en partiële informatie

Finale aminozuurvolgorde

Isolatie van N-terminaal geblokkeerde peptide

Bepalen van aminozuursamenstelling

Geen informatie

Massaspectrometrische fragmentatieanalyse

informatie

Nog

nie

t gep

laat

ste

pept

idef

ragm

ente

n

massa

Vergelijking met gekende eiwitten in databanken

Figuur 4.1. Overzicht van experimenten en gegevensverwerking, respectievelijk voorgesteld door volle en gebroken lijnen.


83

toe niet in de literatuur beschreven en zijn identiteit wordt nog onderzocht in het laboratorium van T. Meyer.

4.3. Aminozuurvolgorde van Allochromatium warmingii HiPIP

Zoals aangegeven in het literatuuroverzicht over primaire structuurbepalingen van

eiwitten en/of peptiden werd het natief eiwit in eerste instantie aan automatische N-terminale Edmandegradatie onderworpen. Daarbij kon een duidelijke identificatie van alle aminozuren tot en met positie 41 bekomen worden (Figuur 4.2). Bij de analyses is de identificatie van de cysteïneresiduën altijd een hoofdprobleem geweest. Een vaak aanbevolen oplossing hiervoor is de verwijdering van de ijzer-zwavelclusters. De procedure staat in de literatuur beschreven als ’neerslagmethode met trichloorazijnzuur’, gevolgd door reductie van de zwavelbruggen en modificatie van de gereduceerde cysteïnes naar een stabiel derivaat. In de aminozuurvolgordebepaling van dit HiPIP hebben we tributylphosphine als reductans en vinylpyridine als modificerend reagens gebruikt. Na de ontzouting van overtollige reagentia

Ser Ala Pro Ala Asn Ala Val Ser Ala Asp Asp Ala Thr Ala Ile Ala Leu Lys Tyr Asn Gln Asp Ala Thr Lys Ser Glu Arg Val Ser

10 20 30

Gln His Cys Ala Asn Cys Gln Phe Met Gln Ala Asp Ala Ala Gly Ala Thr Asp Glu Trp

40 50 60

Ala Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Glu Glu

K4

70 80

K1

Cys Gln Leu Phe Pro Gly Lys Leu Ile Asn Val Asn Gly Trp Cys Ala Ser Trp Thr Leu Lys Ala GlyGlyLys

K5

D8

Figuur 4.2. Aminozuurvolgorde van het hoge potentiaal ijzer-zwavel eiwit uit Allochromatium warmingii. De bekomen sequentie-informatie van N- en/of C-terminale microsequentieanalyses op natief eiwit worden door zwarte pijltjes weergegeven. De richting waarin de pijltjes lopen stemt overeen met de richting van de geautomatiseerde sequentieanalyse: van links naar rechts voor de N-en van rechts naar links voor de C-terminale analyse. De resultaten van de N-terminale analyse op peptiden, bekomen na digestie op apo- en/of gemodificeerde apoproteïne, worden door pijltjes weergegeven met hun respectievelijke kleur verwijzend naar het gebruikte enzym:

• oranje voor Lys-C endoproteïnase (notatie is K) • geel voor Asp-N endoproteïnase (D) • lichtpaars voor Glu-C endoproteinase (S), ook gekend als het Staphylococcus

aureus V8 enzyme Tabellen die de toenames (uitgedrukt in picomoles) weergeven ten opzichte van de vorige stap voor elke cyclus tijdens de Edmandegradatie zijn weergegeven op het einde van dit hoofdstuk. Resultaten van fragmentaire massaspectrometrische analyses worden voorgesteld door pijltjes aan beide kanten. De betekenis van de symbolen is geldig voor alle hierna volgend sequentiefiguren.


84

werd het gepyridylethyleerd apoproteïne gedigesteerd met Lys-C endoproteïnase, wat resulteerde in een zestal pieken (Figuur 4.3). Fractie K4 verlengde de hierboven beschreven N-terminale sequentie met 17 extra residuen tot positie 58, waarbij fractie K2 de eerste 18 aminozuren omvatte. Fractie K1 was 8 aminozuren lang. Fracties K5 en K6 gaven dezelfde aminozuurvolgordes, met een blanco identificatie op plaatsen 7 en 11 (posities 76 en 80). Om de aminozuurvolgorde te vervolledigen was een tweede digest nodig. Een Asp-N endoproteïnase digest op gepyridylethyleerd apoproteïne gaf een achttal fracties (zoals weergegeven in Figuur 4.4) waarvan slechts één fractie, namelijk D8, aan de microsequentieanalyse werd onderworpen. De N-terminus van fractie D8 overlapte met het laatste aminozuur van fractie K4 en identificeerde ook de ontbrekende aminozuren in het gebied 59-61 en op de plaatsen 76, 50, en 84. Er bestond alleen nog wat twijfel over het laatste aminozuur op plaats 85. Het werd vooralsnog als glycine ingevuld wegens een sterke verwantschap van dit eiwit met de aminozuurvolgorde van Allochromatium vinosum HiPIP.

Na de introductie van ‘electrospray’-ionisatie massaspectrometrie werden alle

bekomen peptiden van beide digesten aan deze nieuwe techniek onderworpen. De experimenteel bepaalde massa’s voor fracties K1 – K3 en K5-K6 waren in overeenstemming met de uit de sequentie afgeleide moleculaire gewichten (Tabel 4.1). De gemeten massa voor peptide K3 stemt heel goed overeen met de theoretische massa van gebied 26 – 61 (3902.3 Da), vermeerderd met de massa voor twee gemodificeerde cysteïnes op plaatsen 43 en 46 (2 x 105.1 Da). De gemeten massa van één component van fractie K4 (K4A, 3900.4 Da), die hetzelfde sequentiegebied als voor K3 omvat, komt sterk overeen met dezelfde theoretische massa van gebied 26 – 61, verminderd met de waarde voor de vorming van een zwavelbrug tussen twee niet-gemodificeerde cysteïnes op plaatsen 43 en 46. Dit constrateert met de bevin-

Abs

orba

nce

at 2

20 n

m (

AU

)

Gra

dien

t (%

sol

vent

B)

0.08

0.16

0.00

100

50

010 200

Time (min)

1

23

45

6

Figuur 4.3. Hoge druk chromatografische scheiding van peptiden bekomen na een digestie van gepyridylethyleerd apoproteïne van Allochromatium warmingii met Lys-C endoproteïnase.


85

Tabel 4.1. Massametingen van Lys-C peptiden.

Peptide Gemeten Berekende Sequentie massa massa posities K1 953.8 954.2 62 – 69 K2 1685.4 1685.8 1 – 18 K3 4113.0 4112.5 26 – 61 K4 A 3900.4 3900.3 26 – 61* B 4085.5 -- C 4159.4 -- K5 1709.5 1710.0 70 – 83 K6 1709.3 1710.0 70 – 83 * Peptide bevat een zwavelbrug tussen twee cysteïnes op

plaatsen 43 en 46

Tabel 4.2. Massametingen van peptiden bekomen na digestie van apoproteïne met Glu-C endoproteïnase

Peptide Gemeten Berekende Sequentie massa massa posities S1 2009.2 2009.2 41 – 59* S2 2206.3 2206.3 1 – 22 S3 2723.2 2722.9 1 – 27 S4 1377.9 1378.6 28 – 40 S5 1378.0 1378.6 28 – 40 S6 2876.5 2876.4 60 – 85* * Beide peptiden bevatten een intramoleculaire

zwavelbrug tussen twee cysteïnes

dingen dat we op plaatsen 43 en 46 ondubbelzinnig pyridylethyl-cysteïnes hebben waargenomen tijdens microsequentieanalyse van peptide K4. Een mogelijke reden voor deze discrepantie kan gegeven worden op basis van de andere gemeten massa’s voor peptide K4 (4085.4 Da en 4159.4 Da) welke niet overeenstemmen met de theoretische massa (4012.5 Da). Het zijn waarschijnlijk gemodificeerde componenten die de pyridylethyl-cysteïnes bevatten die tijdens microsequentieanalyse gedetecteerd werden. Door een technisch falen van de ‘electrospray’ionisatie massaspectrometer konden de fracties bekomen na Asp-N endoproteïnase digestie niet geanalyseerd worden, en dus ook geen informatie over het C-terminale gebied leveren. Voor een bevestiging van de laatste twee

0

Abs

orba

nce

at 2

20 n

m (A

U)

Time (min)

Gra

dien

t (%

sol

vent

B)

0 10 20 30

1

50

0

1

2

34

5

67

8

Figuur 4.4. Chromatografische scheiding van Asp-N peptiden.

Time (min)

Gra

dien

t (%

sol

vent

B)

0.0

0 15 300

50

1000.3

0.6A

bsor

banc

e at

220

nm

(AU

)

1

4

2

3

5

6

Figuur 4.5. Scheidingspatroon van Glu-C peptiden.


86

aminozuren hebben we dus niet-gemodificeerd apoproteïne gedigesteerd met Glu-C protease en de bekomen fracties aan massaspectrometrische analyses onderworpen (zie Figuur 4.5 en Tabel 4.2).

Buiten peptide S6 waren alle bekomen moleculaire gewichten of massa’s in overeenstemming met de theoretisch berekende waarden, zelfs voor fractie S1 die een zwavelbrug bevat. De gemeten massa van peptide S6 (2875.5 Da) was 55 Da groter dan de berekende waarde voor gebied 60 – 80 (2821.5 Da). Het hier vermelde massaverschil kan verklaard worden wanneer we de theoretische massa van het kleinste aminozuur glycine (57 Da) als mogelijk laatste aminozuur in de berekening opnemen. Houden we ook rekening met een eventuele zwavelbrug tussen de twee cysteïnes op plaatsen 63 en 77 (-2 Da) dan komen we op exact 55 Da uit. Een finaal bewijs voor de juistheid van de complete sequentie werd gegeven door een massameting van gedenatureerd HiPIP waarvan de experimentele waarde van 8939.1 Da met een verschil van slechts 0.03% overeenstemt met de uit de complete sequentie afgeleide theoretische waarde van 8936.6 Da (Figuur 4.6).

4.4. Aminozuurvolgorde van Thiocystis violacea HiPIP

Een samenvatting van de sequentieresultaten is weergegeven in Figuur 4.7. Als vertrekpunt namen we de N-terminale Edmandegradatie van natief eiwit, succesvol tot positie 65. Op posities 43, 46, 47, 57 en 61 na konden immers alle residuen ondubbelzinnig bepaald worden. Rond dezelfde periode werd het natief eiwit ook aan een C-terminale sequentieanalyse onderworpen, wat de volgende sequentie opleverde: Gly-Ala-Lys-Leu (van C- naar N-terminale richting weergegeven). Om de hierboven beschreven ontbrekende aminozuren en de overlap met de gekende C-terminale residuen te vinden hebben we, op basis van de glutaminezuren op posities 40 en 55, gekozen voor een Glu-C digestie op aminogepropyleerd apoproteïne. We hebben ook gekozen voor 3-bromopropylamine als cysteïne-modificerend reagens wegens zijn goede oplosbaarheid in waterig milieu en de stabiliteit en identificeerbaarheid van PTH-aminopropylcysteïne. Het digest resulteerde in een vijftal belangrijke fracties (Figuur 4.8). Peptide S5 verlengde de N-terminale sequentie met 13 extra aminozuren en overlapte ook met de hierboven beschreven C-terminale sequentie.

894.9A10

994.1A9

1118.1A8

813.9A11

A: 8938.1 Da

B10

B9

B8

C8C9

Figuur 4.6. ‘Electrospray’ ionisatie massaspectrum van gedenatureerd Allochromatium warmingii HiPIP. Fragmenten, aangeduid als B- en C-componenten, zijn natrium- en kalium-adducten van hoofdcomponent “A”.


87

Samen met peptide S1 werden ook de aminozuren 47 en 57 geïdentificeerd als resp. asparagine en asparaginezuur.

Tenslotte werden de cysteïnes als aminopropylcysteïnes aangetoond op posities 43, 46,

61 en 75. Fractie 1 omvatte gebied Gln41 – Glu51, en fracties S2 en S3 bleken beide N-terminale peptiden te zijn. Een massa-analyse van S2 en S3 toonde een massaverschil van 16 Da aan, wat een aanwijzing is voor de oxidatie van een methionineresidu op positie 9 (Tabel 4.3). Op dit ogenblik is de complete sequentie,op één residu na (positie 78), bepaald. Op basis van sterke verwantschap van deze sequentie met andere HiPIP’s sequentie kan dit ontbrekende residu als tryptofaan gepostuleerd worden. Deze invulling wordt voldoende ondersteund door de massa-analyse van fractie S5 (Tabel 4.3) en van het gedenatureerd eiwit (Figuur 4.9). Het moleculair gewicht (8789.8 Da) op basis van de hierboven voorgestelde sequentie, met tryptofaan op positie 78, stemt zeer goed overeen met de bekomen massa van 8790.9 Da. De figuur toont ook de aanwezigheid aan van een tweede component, met massa van 8806.4 Da. Het massaverschil van 15.5 Da ten opzichte van de eerste component kan verklaard worden door de aanwezigheid van een zuurstofatoom op methionine (+16 Da), wat al eerder aangetoond was voor peptide S2 waar dit methionine in voorkomt.

Tabel 4.3. Massametingen van Glu-C peptiden

Peptide Gemeten Berekende Sequentie massa massa posities S1 1780.5 1780.8 41 - 55 S2 4148.5 4147.5 1 – 40* S3 4131.1 4131.5 1 - 40 S4 -- -- -- S5 3141.6 3141.5 56 – 83

*Peptide bevat methioninesulfoxide (+16 Da)

Glu Ala Pro Ala Asn Ala Val Thr Met Asp Asp Pro Thr Ala Gln Ala Leu Lys Tyr His Pro Ser Ala Ala Asp Ser Asp Arg Val Ala10 20 30

Gln His C y s Ala Asn C y s Asn Phe Met Gln Ala Asp Val Gly Glu Gly Asp Tyr Lys Gly

C y s Gln Leu Phe Pro Gly Lys Leu Ile Asn

40 50 60

Val Asn Gly Trp C y s Ala Ser Trp Thr Leu Lys Ala Gly70 80


S1

S5

Figuur 4.7. Aminozuurvolgorde van HiPIP geïsoleerd uit Thiocystis violacea. Voor de

figuurlegende, zie Fig. 4.2.

15 2520

Tijd (min)

0.0

0.8

1.5

Abs

orpt

ie b

ij 22

0 nm

(A

U)

100

50

0

Gra

dien

t (%

sol

vent

B)

5

3

1 2

4

30

Figuur 4.8. HPLC scheiding van Glu-C peptiden.


88

4.5. Aminozuurvolgorde van Isochromatium buderi HiPIP

Glu Val Pro Ala Asn Ala Val Thr Glu Ser Asp Pro Thr Ala Val Ala Leu Lys Tyr His Arg Asn Ala Ala Glu Ser Glu Arg Val Ala

10 20 30

Gln His Cys Glu Asn Cys Gln Phe Met Leu Pro Asp Gln Gly Ala Asp Glu Trp Arg Gly

Cys Ser Leu Phe Pro Gly Lys Leu Ile Asn

40 50 60

Leu Asn Gly Trp Cys Ala Ser Trp Thr Leu Arg Ala Gly

70 80


S4A

S6B

S2A

S4B

S’ 10

K4

K8

Fig. 4.10. Aminozuurvolgorde van Isochromatium buderi HiPIP.

880.00A10

A: 8790.85 Da B: 8806.36 Da

881.55B10

977.74A9

1099.87A8

1256.97A7

979.54B9

1001.80B8

Figuur 4.9. ‘Electrospray’-ionisatie massaspectrum van gedenatureerd HiPIP geïsoleerd uit Thiocystis violacea.


89

75

31

2

6

48

C

0.0

1.5

3.0A

bsor

ptie

bij

220

nm (

AU

)

75

31 2 6

4

Gra

dien

t (%

sol

vent

B)

A

7

5

3

1 2

6

4

8

9

10

B

0

100

50

0

100

50

0

100

50

10 30200

0.0

1.5

3.0

0.0

1.5

Figuur 4.11. HPLC-scheiding van peptiden bekomen na digesten van aminogepropyleerd apoproteïne met Glu-C (eerste digestie (A), tweede digestie (B)) en Lys-C (C) endoproteïnase enzymen.

Tabel 4.4. Massametingen van peptiden bekomen na eerste (S) en tweede Glu-C digest (S’), en een Lys-C digest (K) op aminogepropyleerd apoproteïne.

Peptide Gemeten Berekende Sequentie massa massa posities S1 859.6 859.9 19 – 25 S2 A 1590.3 1590.7 31 – 44 B 928.6 930.0 1 - 9 S3 A 1742.6 1742.9 10 - 25 B 1035.8 1036.2 31 - 40 S4 A 1524.0 1524.6 45 - 57 B 860.7 861.0 76 - 83 S5 -- -- S6 A -- -- 45 – (56) B -- -- 58 – (83) S7 -- -- S’1 800.0 800.9 2 - 9 S’2 -- -- S’3 859.0 859.9 19 - 25 S’4 1591.6 1590.7 31 - 44 S’5 928.3 930.0 1 - 9 S’6 A 2132.2 2133.1 26 – 44 B 1916.3 1917.1 28 - 44 S’7 A 2075.1 2076.1 26 – 44* B 2132.0 2134.3 26 - 44 S’8 A 1742.7 1742.9 10 – 2 B 1957.9 1959.1 10 – 27 S’9 -- -- S’10 4526.9 4528.0 45 – 83 S’11 4468.4 4471.0 45 – 83* K1 -- -- K2 -- -- K3 1811.6 1812.0 1 - 18 K4 5671.1 5671.4 19 - 67 K5 -- -- K6 1832.6 1832.2 68 - 83 K7 1832.1 1832.2 68 - 83 K8 1832.4 1832.2 68 – 83 * Peptide bevat een niet gemodificeerd cysteïne (-57 Da)

Zoals hierboven beschreven zijn we ook vertrokken van de N-terminale

sequentieanalyse van natief eiwit. Nadien volgde de sequentiebepalingen van alle peptiden bekomen na Glu-C endoproteïnase digestie op aminogepropyleerd apoproteïne (Figuren 4.10 en 4.11A). Uit Figuur 4.10 blijkt duidelijk dat peptiden S2A en S4B resultaten zijn van niet-specifieke splitsingen na Ala30 en Cys75. Het laatstgenoemde cysteïne kan evengoed aminopropylcysteïne zijn, aangezien de massa-analyses van fracties S5, S6 en S7, in


90

tegenstelling tot de andere fracties S1 tot en met S4, geen resultaat opleverden (Tabel 4.4). Om overlappingen en ontbrekende aminozuren aan te tonen was dus een tweede Glu-C digestie noodzakelijk. Om de kans op minder specifieke splitsingen te verlagen hebben we deze keer het digestmengsel minder lang bij 37°C geïncubeerd, wat resulteerde in een scheidingspatroon bij de bekomen peptiden, zoals weergegeven in Figuur 4.11B. Fracties S'10 en S'11 omvatten het gebied Asn45-Gly83 en ook de overlap van fractie S4A met S6B. Op drie plaatsen na (28, 74 en 75) werd de aminozuurvolgorde van Ich. buderi HiPIP daardoor grotendeels bepaald.

Met behulp van een derde digestie, met Lys-C endoproteïnase (Fig. 4.11C), werden de

ontbrekende aminozuren geïdentificeerd als arginine, tryptofaan en cysteïne (als aminopropylcysteïne). De aminozuurvolgorde van alle bekomen peptiden werd verder ondersteund door hun massa’s (Tabel 4.4). Het moleculair gewicht van het eiwit berekend op basis van deze sequentie is 9052.1 Da, wat op 0.01% na in overeenstemming is met de gemeten massa van 9053.0 Da (Figuur 4.12).

4.6. Aminozuurvolgorde van Halochromatium salexigens HiPIP

De complete aminozuurvolgorde van het hoge potentiaal ijzer-zwavel eiwit geïsoleerd uit Hch. salexigens, is weergegeven in Fig. 4.13. N-terminale sequentieanalyse op natief eiwit gaf geen resultaten zodat hieruit moest besloten worden dat het eiwit N-terminaal geblokkeerd is. Peptide K6, bekomen na een Lys-C digestie (Fig. 4.14) op aminogepropyleerd eiwit, bleek ook te weerstaan aan de Edmandegradatie. De overige peptiden werden tot hun C-terminaal residu gesequeneerd. Opvallend was dat een drietal van deze peptiden op aminopropylcysteïne eindigden in plaats van op het verwachte lysine (K1, K2 en K8) (Tabel 4.5). Dit kan worden verklaard door de sterk vergelijkbare zijketenstructuur van lysine en aminopropylcysteïne, dat voor de specificieke werking van Lys-C endoproteïnase blijkbaar geen probleem is. Een voorbeeld van ‘normaal’ niet-gesplitst aminopropylcysteïne kan

A: 9052.99 Da 1006.90

A91132.60

A8

906.30A10

1509.80A6

1294.20A7

Figuur 4.12. ‘Electrospray’massaspectrum van gedenatureerd HiPIP.


91

worden gevonden in peptide K7 (niet getoond in Fig. 4.13), wat toeliet een overlap van peptide K1 met peptide K4 te maken.

Een tweede digestie met Asp-N endoproteïnase (Fig. 4.15 en Tabel 4.6) gaf ons, via peptiden D1 en D3, nuttige additionele sequentiegegevens. Verder overlapten de laatste drie aminozuren van peptide D3 met de eerste drie aminozuren van K2. Andere overlaps werden aangetoond met behulp van peptiden D5, D7 en D9, waarbij het laatstgenoemde peptide de tot dan bepaalde aminozuurvolgorde verlengde met twee extra (C-terminale) aminozuren.

Tabel 4.5. ‘Electrospray’-ionisatie massametingen van peptiden bekomen na digestie van aminogepropyleerd apoproteïne met Lys-C endoproteïnase.

Peptide Gemeten Berekende Sequentie massa massa posities K1 959.1 959.0 66 – 73 K2 3134.7 3134.2 19 – 46 K3 2721.9 2721.8 19 – 43 K4 704.5 704.8 74 – 79 K5 -- -- K6 1900.0 1900.1 1 – 18* K7 1645.9 1645.8 66 – 79 K8 1564.0 1564.7 47 – 59 * N-terminaal geblokkeerd peptide door vorming van pyroglutamaat (-17 Da), wat in de berekening opgenomen is.

pGlu Asp Leu Pro His Val Asp Pro Ala Thr Asp Pro Thr Ala Gln Ala Leu Lys Ty r Ser Glu Asp Ala Ala Asn Ala Asp Arg Ala Ala10 20 30

Gln Phe C y s His Asn C y s Gln Phe Val Leu Ala Asp Ser Gly Glu Trp Arg Pro C y s Ser

Leu Phe Pro Gly Lys Ala Val His Glu Thr

40 50 60

Gly Trp C y s Ala Ser Trp Thr Leu Lys Ala Gly70 80

Ala Ala Arg Pro Gly Lys Pro Pro Glu Glu

K8

K1

K2

K4

D1 D3

K6

D5 D7

D9

Figuur 4.13. Aminozuursequentie van Halochromatium salexigens HiPIP. Voor legende van deze figuur, zie Fig. 4.2.

20

Tijd (min)

0.0

0.6

1.2

Abs

orpt

ie b

ij 22

0 nm

(A

U)

100

50

0

Gra

dien

t (%

sol

vent

B)

5

3

1

2

4

400

6

7

8

Figuur 4.14. HPLC scheiding van Lys-C peptiden.

0 2010

Tijd (min)

0.0

0.9

1.8

Abs

orpt

ie b

ij 22

0 nm

(A

U)

100

50

0

Gra

dien

t (%

sol

vent

B)

5

3

12

4

25

6

7

8

9

Figuur 4.15. HPLC scheiding van peptiden bekomen na Asp-N digestie op geamino-propyleerd apoproteïne.


92

Tabel 4.6. ESMS massametingen van peptiden bekomen na digestie van aminogepropyleerd apoproteïne met N–Asp endoproteïnase

Peptide Gemeten Berekende Sequentie massa massa posities D1 401.8 402.4 7 – 10 D2 1335.8 1335.5 27 – 39

D3 1221.2 1222.3 11 – 21 D4 2870.1 2870.1 27 – 51 D5 1552.9 1552.6 40 – 51 D6 690.6 690.8 1 – 6* D7 1943.10 1943.1 52 – 68 D8 1466.9 1466.6 69 – 81 D9 3390.6 3391.7 52 – 81 * N-terminaal geblokkeerd fragment (zie Tabel 4.5)

Met betrekking tot het N-terminaal aminozuur van het eiwit vertrokken we van de veronderstelling dat het eiwit geblokkeerd was door de cyclisatie van N-terminaal glutamine tot pyroglutamaat, een fenomeenn dat vaak voorkomt tijdens de opzuivering van een eiwit in zuur milieu of tijdens een langdurige bewaring, al komt ook acetylatie en formylatie van de terminale amidegroep voor bij de blokkering van eiwitten [1, 2]. Op basis van deze veronderstelling hebben we het natief eiwit behandeld met pyroglutamaataminopeptidase en het digestmengsel opgezuiverd met behulp van SDS-PAGE/blotting, wat twee duidelijke banden opleverde (Fig. 4.16). Vertrekkende van de gekende massa’s van het ijzer-zwavel eiwit en van pyroglutamaataminopeptidase zelf werd enkel de onderste band geanalyseerd. Ondanks de lage opbrengsten van de PTH-aminozuren, vergeleken met de hoeveelheid op het gel geladen gedigesteerd materiaal, werd er toch een duidelijke aminozuurvolgorde bekomen (zie Fig. 4.13, grijze pijltjes). De voorgestelde aminozuurvolgorde van Hch. salexigens HiPIP werd verder ondersteund door de massa-analyses van de hier besproken peptiden (Tabellen 4.5 en 4.6) en de aminozuursamenstelling van het N-terminaal geblokkeerde peptide D6 (1.1 Asp, 1.5 Glu, 0.6 His, 1.0 Pro, 0.8 Val en 1.0 Leu). Verder is de theoretisch berekende massa op basis van de sequentie (8719.7 Da, met pyroglutamaat als N-terminus) in overeenstemming met de experimenteel bepaalde massa (8718.9 Da, Fig. 4.17), ook nu weer met een verschil van nauwelijks 0.01%.

94 Da67 Da43 Da

30 Da

20 Da14 Da

Figuur 4.16. Elektroforetische scheiding van aminopeptidase digestmengsel op 4-20% gradiëntgel.


93

Als additioneel bewijs hebben we het hierboven beschreven geblokkeerde peptide K6 ook aan MS/MS-fragmentatie onderworpen. De bekomen fragmentatiepatronen zijn weergegeven in Figuur 4.18. In dit spectrum zijn de b- en y"-ionen duidelijk zichtbaar. Deze fragmentatieanalyse bevestigt ook de juistheid van het voorgestelde N-terminale sequentiegebied Glp1-Lys18, vooral de aansluiting van peptide D1 op peptide D8. Hoewel er tijdens de fragmentatie geen N-terminaal pyroglutamaat als b1- of y"17-ion gevormd werd, vonden we toch een Asp-Glp (y"16-ion) en Glp-Asp-Leu-Pro-His (b4-ion), wat de aanwezigheid bevestigt van pyroglutamaat als N-terminus van het eiwit.

A: 8718.86 Da 969.79A9

1246.64A7

872.95A10 1090.85

A8

Figuur 4.17. ’Electrospray’ ionisatie massaspectrum van gedenatureerd Hch. salexigensHiPIP.

147.2

y” 1

260.3

y” 2 331.4

y” 3

459.5

y” 4

546.5

a 4

645.6

a 5

673.6

b 5

574.5

b 4

728.7

y” 7788.6

b 6

Lys Leu Ala Gln Ala Thr Pro

956.8

b 8

pGlu Asp Leu Pro His AspVal Pro Ala Thr

843.7

y” 8

Asp Thr Ala Pro


94

4.7. Aminozuurvolgorde van Thiocapsa sp., stam CAU HiPIP

Zoals beschreven voor HiPIPs van Thiocystis violaceae en Isochromatium buderi zijn we ook hier vertrokken vanuit:

• de N-terminale Edmandegradatie van een natief eiwit (Fig. 4.19) • peptiden bekomen na digestie van aminogepropyleerd apoproteïne met Glu-C

endoproteïnase (Fig 4.20) • de C-terminale sequentieanalyse op natief eiwit.

1113.0

y” 11

1228.0

y” 12

1327.1

y” 13 1464.3

y” 14

1172.9

b 10

1057.8

b 9

1561.3

y” 15

1270.0

b 11

His ProAsp Val Asp pGlu

1371.1

b 12

Asp AlaGln Leu Lys + (-17 Da)

1674.5

y” 16

Leu

1442.2

b 13 1641.3

b 15

1754.8

b 16

1570.3

b 14

Pro Thr Ala

Figuur 4.18. MS/MS fragmentatiespectra van peptide K6.

Glu Val Pro Ala Asn Ala Val Ala Ala Asn Asp Pro Thr Ala Ile Ala Leu Lys Tyr Asn Ala Asp Ala Thr Gln Ser Asp Arg Ala Ala10 20 30

Gln His Cys Ala Asn CysGln Phe His Leu Pro Asp Val Ala Gly Ala Thr Glu Glu Trp

His Gly Cys Ser Leu Phe Pro Gly Lys Leu

40 50 60

Ile Asn Val Asn Gly Trp Cys Ala Ser Trp Thr Leu Lys70 80


S7

Ala Gly

Figuur 4.19. Aminozuursequentie van Thiocapsa sp., stam CAU HiPIP. Legende, zie Fig. 4.2.


95

Op een drietal cysteïnes (posities 43, 46 en 63) en een paar andere aminozuren (posities 64 en 68) na kon de aminozuurvolgorde met grote zekerheid bepaald worden in de gebieden Glu1-Asn74 en Leu82-Gly85. Van de vier hier besproken aminozuurvolgordes is dit de langste N-terminale Edmandegradatie die kon gerealiseerd worden. Dit eiwit vertoont een sterke verwantschap met de reeds gekende aminozuurvolgorde van Allochromatium vinosum HiPIP, wat als 'blauwdruk' voor de vervollediging van deze volgorde gebruikt kon worden. Na de massa-analyses van de bekomen Glu-C peptiden konden alle fracties, met uitzondering van fractie S7, in de tot op dat moment bepaalde sequentie ingepast worden (Tabel 4.7). Fractie S7 werd als C-terminaal Glu-C peptide beschouwd en daarom aan MS/MS-fragmentatieanalyse onderworpen. Ook hier bekwamen we b- en y"-ionen (zie Fig. 4.21). Met de gekende C-terminale aminozuurvolgorde van Ach. vinosum HiPIP als blauwdruk en de bekomen fragmentatiespectra konden we het gebied Gly75-Thr81 en aminozuur Ser64 invullen. Als finale ondersteuning van de voorgestelde aminozuurvolgorde werd het gedenatureerd natief eiwit aan electrospray-ionisatie massa-analyse onderworpen, wat een waarde van 8928.6 Da opleverde (Fig. 4.22). Deze experimenteel bekomen massa stemt erg goed overeen met de theoretisch berekende massa van 8927.9 Da, op basis van de voorgestelde aminozuurvolgorde.

Tabel 4.7. Massa van Glu-C peptiden na digestie op aminogepropyleerd apoproteïne.

PeptideGemeten Berekende Sequentie massa massa posities S1 2184.2 2184.2 41 – 59 S2 3131.2 3131.3 32 – 59 S3 3099.3 3100.3 1 – 31 S4 4047.5 4047.4 1 – 40 S5 6214.0 6213.7 1 – 59 S6 6156.6 6156.7 1 – 59* S7 2960.5 2960.3 60 – 85

* Eén van de twee cysteïnes in dit peptide is niet aminogepropyleerd.

10 30200

Tijd (min)

0.0

1.5

3.0

Abs

orpt

ie b

ij 22

0 nm

(A

U)

100

50

0

Gra

dien

t (%

sol

vent

B)

7

5

3

1

26

4

Figuur 4.20. HPLC scheidingspatroon voor Glu-C peptiden.


96

100

0

%

0 100 200 300 400 500

Massa (Da)

129.2

275.3

324.2

381.3

489.4

y” 3

b 2

b 3

388.4

y” 4

y” 5

Gly Ala + (- 17)

Gly Ala Lys Leu Thr

Trp His Gly APC

100

0

%

1000 1100 1200 1300 1400 1500

Massa (Da)

1179.9

y” 10

1351.0

y” 12

1236.9

y” 11

Trp Asn Val

Leu Ile Asn

1170.9

b 10

1284.0

b 11

1451.1

y” 13

Gly

Gly Lys

1397.1

b 12

Asn

100

0

%

2000 2100 2200 2300 2400 2500

Massa (Da)

2073.6

y” 19

2332.8

y” 21

2219.7

y” 20

Phe Ser

Ala Trp

2127.6

b 182198.7

b 19

2419.9

y” 22

Leu

APC

2471.8

b 21

2285.7

b 20

Ser

Gly Pro

100

0

%

500 600 700 800 900 1000

Massa (Da)

675.5

y” 6

888.6

b 7

833.7

y” 8

762.6

y” 7

Trp Ala APC

Leu Phe Pro

541.0

b 4628.5

b 5

741.5

b 6

985.7

b 8

993.8

y” 9

Ser

Ser

100

0

%

1500 1600 1700 1800 1900 2000

Massa (Da)

1564.1

y” 14

1790.0

y” 161677.2

y” 15

Ile Lys

Asn Trp

1511.2

b 13

1724.3

b 15

1918.5

y” 17

Leu

Val

1610.3

b 14

1781.3

b 16

1967.5

b 17

Gly

100

0

%

2500 2600 2700 2800 2900 3000

Massa (Da)

2580.2

y” 23

2774.1

y” 25

2637.0

y” 24

Gly Trp

Leu Ala

2586.0

b 232814.1

b 24

2960.2

His

Thr

2572.9

b 222885.2

b 25

Lys Gly + (- 17)

APC

Figuur 4.21. MS/MS fragmentatiespectra van peptide S7.


97

4.8. Aminozuursequentie van Rhodopseudomonas cryptolactis HiPIP

Analoog met een HiPIP uit Thiocapsa sp, stam CAU, werd de sequentie van dit eiwit

bepaald na de N- en C-terminale analyse van natief eiwit en van peptiden bekomen na digesten van aminogepropyleerd apoproteïne met het Glu-C protease. Massametingen van natief eiwitmateriaal werden ook op dezelfde manier uitgevoerd: we vonden echter een verschil tussen componenten A en B van gemiddeld 14.45 Da voor de twee verschillende metingen (Fig. 4.23). De eerste meting vond plaats op natief eiwit dat voorbehandeld werd met mierenzuur, de tweede zonder voorbehandeling, gewoon in water. Het massaverschil is te klein om de aanwezigheid van een extra groep op het eiwit te verklaren, zelfs als we rekening houden met aanwezigheid van een zuurstofatoom (+16 Da) bij oxidatie van methionine Een tweede bedenking is dat we hier niet met een massaverhoging maar met een massaverlaging van ongeveer 14 Da te maken hebben, waarbij component A met de massa van 5997.9 Da overeenstemt met de theoretische waarde voor het holo-eiwit (5996.1 Da) en de massa van gedenatureerd eiwit (zonder het cluster, 5647.5 Da) met de berekende waarde van 5648.5 Da (zie sequentie in Figuur 4.23). Hieruit volgt dus dat de B-component 14 Da kleiner is dan de berekende waarde voor de A-component. Verder blijkt dat de gemeten massa van peptide 7, bekomen na digestie van aminogepropyleerd apoproteïne met Glu-C endoproteïnase, 14 Da kleiner is dan de massa van peptide 8 (Tabel 4.8 en Figuur 4.23) dat al gesequeneerd was als Ile–Ala–Pro-Lys–Gly-…… (gebied 38 – 51). Peptiden 7 en 8 werden aan een MS/MS- fragmentatieanalyse onderworpen wat aangaf dat de N-termini van het peptide bestonden uit respectievelijk isoleucine en valine, wat het massaverschil van 14 Da perfect kan verklaren (Ile = 113 Da en Val = 99 Da). Voor peptide 7 bekwamen we alleen een y”- fragmentatiepatroon, bij peptide 8 zagen we zowel y”- als z-fragmentionen, dit laatste

893.46A10

992.57A9

1116.5A8

1275.81A7

A: 8928.59 Da

Figuur 4.22. ‘Electrospray’ ionisatie massaspectrum van gedenatureerd Thiocapsa sp., stam CAU HiPIP.


98

door het verlies van ammoniak aan arginine- of lysinezijketens tijdens de fragmentatie (-17 Da) (Figuur 4.24).

Tabel 4.8. Massa van Glu-C peptiden na digestie op apoproteïne, gevolgd door reductie van gegenereerde peptiden met dithiothreitol.

Peptide Gemeten Berekende Sequentie Peptide Gemeten Berekende Sequentie massa massa posities massa massa posities S1 -- -- S6 3818.8 3818.3 1 – 35 S2 204.5 205.1 36 – 37 S7 1650.2 1650.1 38 – 51 S3 -- -- S8 1664.5 -- ∆ = 14.1 Da S4 2199.5 2199.5 1 – 20 S9 -- -- S5 1635.2 1634.8 21 – 35

A: 5647.5 Da B: 5632.7 Da 14.8 Da

600 800 1000 1200 1400

100

0

%

100

0

%

m/z

706.9

A8807.7

A7

942.1A6

1130.4

A51117.6

B5

B8

705.0B7

805.7B6

939.8

857.9A7B7

855.8

1000.7A6

B6

998.3

1200.4

A5

1197.5

B5

A: 5997.9 Da B: 5983.8 Da 14.1 Da

Lys Met Ser Gln Lys Ala Val Ala Tyr Gln Asp Thr Pro Leu Gly Asp Lys Thr Cys Asp10 20

Thr Cys Ser Asn Trp Arg Pro Pro Asn Gly30

Lys Gly Tyr Cys Arg Ile Phe Val Leu Lys Arg50

40Cys Ala Thr Val Glu Gly Glu Ile Ala Pro

Figuur 4. 23. Sequentie van Rhodopseudomonas cryptolactis HiPIP, en massametingen van natief eiwit behandeld met sterk zuur, en gewoon opgelost in water.


99

4.9. Bijkomende tabellen Deze tabellen geven de toenames aan van de hoeveelheid aminozuren (in picomoles) tijdens de Edmandegradatie, berekend ten opzichte van elke vorige stap. De belangrijkste peptiden die in de sequentiefiguren opgenomen zijn staan onderlijnd.

Figuur 4.24. Chromatografische scheiding van Glu-C peptiden en MS/MS-analyse van de fracties 7 en 8 van Rps. cryptolactis HiPIP.


100

4.9.1. Allochromatium warmingii

Natief eiwit 1 Ser 56,03 15 Ile 10,65 29 Val 1,72 2 Ala 85,65 16 Ala 13,15 30 Ser 1,34 3 Pro 39,83 17 Leu 9,73 31 Ala 2,07 4 Ala 50,78 18 Lys 3,69 32 Ala 2,35 5 Asn 67,09 19 Tyr 8,35 33 Arg 0,78 6 Ala 18,96 20 Asn 8,11 34 Pro 2,25 7 Val 51,50 21 Qln 10,72 35 Gly 1,62 8 Ser 11,90 22 Asp 7,57 36 Leu 1,19 9 Ala 16,99 23 Ala 7,29 37 Pro 1,79

10 Asp 15,53 24 Thr 3,71 38 Pro 0,60 11 Asp 15,57 25 Lys 1,56 39 Glu 0,41 12 Ala 15,87 26 Ser 2,33 40 Glu 1,13 13 Thr 11,28 27 Glu 2,44 41 Gln 0,64 14 Ala 4,62 28 Arg 1,94 42

Lys-C peptiden (K1-K4) K1 K2 K3 K4 1/4 1/2 1/4 1/4

1 Gly 551,22 Ser 278,12 Ser 44,70 Ser 80,88 2 PEC 205,05 Ala 670,47 Glu 40,05 Glu 109,91 3 Gln 142,11 Pro 462,18 Arg 19,58 Arg 94,17 4 Leu 68,67 Ala 544,47 Val 49,24 Val 125,59 5 Phe 29,92 Asn 144,79 Ser 42,58 6 Pro 20,04 Ala 329,41 Ala 89,93 7 Gly 27,06 Val 504,67 Ala 9,50 8 Lys 2,19 Ser 106,68 Arg 41,16 9 Ala 322,99 Pro 35,79 10 Asp 91,98 Gly 34,59 11 Leu 65,93 12 Pro 37,95 13 Pro 16,39 14 Glu 22,92 15 Glu 17,92 16 Gln 25,83 17 His 9,32 18 PEC 18,15 19 Ala 21,01 20 Asn 14,8 21 PEC 10,43 22 Gln 11,01 23 Phe 12,91 24 Met 10,47 25 Gln 5,48 26 Ala 6,26 27 Asp 2,96 28 Ala 3,66 29 Ala 1,06 30 Gly 3,47 31 Ala 0,75 32 Thr 0,85 33 Asp 0,27


101

Lys-C (K5-K6) en Asp-N peptiden

K5 K6 D8 1/4 1/4 1/2 1 Leu 55,37 Leu 93,89 Asp 189,58 2 Ile 87,37 Ile 47,89 Glu 107,95 3 Asn 51,33 Asn 8,34 Trp 21,03 4 Val 68,95 Val 53,63 Lys 49,87 5 Asn 34,05 Asn 7,00 Gly 40,17 6 Gly 39,16 Gly 17,56 PEC 20,08 7 Trp 20,13 -- Gln 119,31 8 PEC 13,05 -- Leu 96,72 9 Ala 17,80 Ala 8,47 Phe 168,38

10 Ser 3,29 Ser 1,32 Pro 112,16 11 -- -- Gly 52,07 12 Thr 2,48 Lys 14,19 13 Leu 1,57 Leu 58,09 14 Lys 1,28 Ile 164,01 15 Asn 73,54 16 Val 110,94 17 Asn 33,71 18 Gly 42,59 19 Trp 19,24 20 PEC 8,7 21 Ala 7,33 22 Ser 2,34 23 Trp 2,68 24 Thr 5,24 25 Leu 4,69 26 Lys 2,89 27 Ala 3,32 28 29 30 31 32 33


102

4.9.2. Thiocystis violacea

Natief eiwit 1 Glu 316,05 23 Ala 99,50 45 Asn 25,81 2 Ala 491,12 24 Ala 96,66 46 3 Pro 217,79 25 Asp 77,62 47 4 Ala 273,38 26 Ser 25,24 48 Phe 37,83 5 Asn 336,81 27 Asp 43,40 49 Met 27,26 6 Ala 270,97 28 Arg 69,01 50 Gln 21,41 7 Val 467,37 29 Val 69,55 51 Ala 27,42 8 Thr 220,33 30 Ala 36,07 52 Asp 19,70 9 Met 392,01 31 Ala 72,96 53 Val 10,20

10 Asp 312,82 32 Ala 28,13 54 Gly 21,40 11 Asp 99,06 33 Arg 58,73 55 Glu 12,18 12 Pro 196,73 34 Pro 65,50 56 Gly 9,78 13 Thr 87,01 35 Gly 52,11 57 14 Ala 202,31 36 Leu 20,92 58 Tyr 14,78 15 Gln 168,27 37 Pro 37,37 59 Lys 18,86 16 Ala 66,59 38 Pro 28,83 60 Gly 6,68 17 Leu 133,43 39 Glu 23,11 61 18 Lys 187,47 40 Glu 26,60 62 Gln 14,35 19 Tyr 166,37 41 Gln 39,22 63 Leu 9,14 20 His 107,52 42 His 16,14 64 Phe 10,60 21 Pro 128,13 43 65 Pro 6,60 22 Ser 31,23 44 Ala 24,77 66

Glu-C peptiden S1 S2 S3 S5 1/2 1/3 1/2 1/3 1 Gln 87,73 Glu 37,55 Glu 64,81 Gly 75,98 2 His 36,68 Ala 28,43 Ala 52,51 Asp 52,67 3 APC Pro 33,08 Pro 44,48 Tyr 89,34 4 Ala 125,34 Ala 32,77 Ala 36,69 Lys 72,35 5 Asn 79,25 Asn 20,31 Asn 28,84 Gly 49,45 6 APC Ala 18,60 APC 7 Asn 32,94 Val 32,91 Gln 32,70 8 Phe 63,07 Leu 60,52 9 Met 71,55 Phe 55,90

10 Gln 31,06 Pro 43,31 11 Ala 46,67 Gly 30,11 12 Asp 9,32 Lys 32,58 13 Val 25,70 Leu 51,98 14 Gly 21,36 Ile 21,78 15 Glu 1,76 Asn 25,15 16 Val 40,68 17 Asn 8,53 18 Gly 15,99 19 Trp 2,21 20 APC 21 Ala 8,83 22 Ser 2,34 23 24 Thr 1,84 25 Leu 2,77 26 Lys 0,98 27 Ala 0,66


103

4.9.3. Isochromatium buderi

Natief eiwit 1 Glu 34,02 18 Lys 11,37 35 Gly 3,59 2 Val 54,70 19 Tyr 13,39 36 Leu 5,49 3 Pro 15,13 20 His 0,71 37 Pro 2,26 4 Ala 35,35 21 Arg 1,38 38 Pro 2,16 5 Asn 16,22 22 Asn 4,75 39 Glu 0,62 6 Ala 25,28 23 Ala 7,79 40 Glu 1,2 7 Val 39,20 24 Ala 6,93 41 Gln 1,27 8 Thr 22,83 25 Glu 3,55 42 9 Glu 21,61 26 Ser 1,96 43

10 Ser 11,35 27 Glu 1,24 44 Glu 0,62 11 Asp 12,37 28 45 Asn 0,89 12 Pro 16,04 29 Val 4,61 46 13 Thr 9,62 30 Ala 4,71 47 14 Ala 14,43 31 Ala 5,65 48 Phe 0,58 15 Val 14,04 32 Ala 1,06 49 Met 0,67 16 Ala 7,75 33 50 17 Leu 13,96 34 Pro 3,71

Glu-C peptiden (eerste digestie) S1 S2 S3 1/2 1/2 1/2 A B 1 Tyr 70,40 Ala 235,61 Glu 146,81 Ser 179,20 2 His 35,87 (Ala) Val 175,16 Asp 258,26 3 Arg 52,81 Arg 133,98 Pro 165,77 Pro 235,35 4 Asn 41,75 (Pro) Ala 121,07 Thr 133,43 5 Ala 36,35 Gly 106,22 Asn 100,21 Ala 177,88 6 (Ala) Leu 66,17 Ala 58,05 Val 254,86 7 Pro 86,32 Val 71,10 Ala 128,65 8 Pro 31,86 Thr 21,26 Leu 191,07 9 Glu 37,39 (Glu) Lys 173,29 10 Glu 6,63 Tyr 125,48 11 Gln 28,71 His 1,59 12 His 14,03 Arg 5,60 13 APC Asn 31,93 14 Glu 4,32 Ala 33,06 15 Ala 29,86 16 Glu 4,18 17 18


104

Glu-C peptiden (vervolg) S4 S6 1/2 1/2 A B A B 1 Asn 69,85 Ala 143,18 Asn 14,23 2 APC Ser 23,69 APC Arg 4,99 3 Gln 66,24 Trp 5,50 Gln 11,62 Gly 4,42 4 Phe 83,85 Thr 42,31 Phe 13,04 APC 5 Met 90,58 Leu 61,47 Met 10,64 Ser 3,73 6 Leu 23,31 Arg 4,84 Leu 14,59 (Leu) 7 Pro 39,91 Ala 14,29 Pro 9,21 Phe 3,61 8 Asp 21,00 Gly 1,02 Asp 4,22 9 Gln 18,61 Gln 5,53 Gly 2,38

10 Gly 19,78 Gly 3,45 Lys 1,84 11 Ala 23,49 Ala 5,42 Leu 2,58 12 Asp 6,62 Asp 4,05 Ile 1,08 13 Glu 2,32 Asn 2,28 14 Leu 1,04 15 Asn 2,76 16 Gly 1,04 17 18

Glu-C peptide (tweede digestie) en Lys-C peptiden S' 10 K4 K8 3/4 3/4 3/4 1 Asn 47,96 Tyr 60,33 Leu 17,82 2 APC His 27,41 Ile 16,29 3 Gln 42,47 Arg 41,26 Asn 14,66 4 Phe 37,35 Asn 40,01 Leu 5,28 5 Met 32,84 Ala 31,54 Asn 1,13 6 Leu 31,10 Ala 8,32 Gly 2,9 7 Pro 22,99 Glu 16,86 Trp 0,78 8 Asp 13,45 Ser 8,76 APC 9 Gln 15,16 Glu 4,73 Ala 1,98

10 Gly 18,20 Arg 14,95 11 Ala 13,60 Val 17,41 12 Asp 9,72 Ala 14,58 13 Glu 6,84 Ala 5,25 14 Trp 0,81 Ala 3,27 15 Arg 3,94 Arg 8,54 16 Gly 3,33 17 APC 18 Ser 0,72 19 Leu 2,00 20 Phe 2,14 21 Pro 1,95 22 Gly 1,26 23 Lys 0,94 24 Leu 0,85 25 Ile 1,09


105

4.9.4. Halochromatium salexigens

Natief eiwit na behandeling met pyroglutamaat aminopeptidase

1 Asp 27,49 2 Leu 19,03 3 Pro 12,77 4 His 5,49 5 Val 15,53 6 Asp 10,02 7 Pro 10,42 8 Ala 17,99 9

10 Asp 5,31 11 Pro 4,20 12 13

Lys-C peptiden (K1-K4) K1 K2 K4 K7 1/2 1/2 1/2 1 Ala 415,76 Tyr 175,45 Ala 237,17 Ala 141,39 2 Val 362,02 Ser 71,55 Ser 121,87 Val 49,24 3 His 48,96 Glu 112,82 Trp 29,06 His 19,90 4 Glu 221,06 Asp 100,69 Thr 137,9 Glu 33,98 5 Thr 175,77 Ala 85,33 Leu 69,8 Thr 32,98 6 Gly 123,99 Ala 18,55 Lys 24,47 Gly 26,38 7 Trp 3,55 Asn 89,29 Trp 26,27 8 APC Ala 62,63 APC 9 Asp 81,78 Ala 21,60

10 Arg 67,41 Ser 12,84 11 Ala 62,15 -- 12 Ala 14,97 Thr 6,50 13 Ala 2,37 -- 14 (Ala) -- 15 Arg 39,52 16 Pro 77,88 17 Gly 37,41 18 Lys 30,41 19 Pro 58,95 20 (Pro) 21 Glu 18,51 22 Glu 17,65 23 Gln 23,57 24 Phe 9,53 25 APC 26 His 10,16 27 Asn 10,35 28 --


106

Lys-C peptide (vervolg) en Asp-N peptiden

K8 D1 D2 D3 1/2 3/4 3/4 1/2 1 Gln 193,8 2 Phe 173,97 Asp 161,21 Asp 95,88 Asp 195,31 3 Val 154,57 Pro 112,92 Arg 78,78 Pro 147,37 4 Leu 151,83 Ala 96,74 Ala 110,18 Thr 118,88 5 Ala 135,19 Thr 22,97 (Ala) Ala 261,53 6 Asp 99,93 (Ala) Gln 186,36 7 Ser 47,92 (Ala) Ala 153,51 8 Gly 58,99 Leu 210,04 9 Glu 57,61 Lys 93,16

10 Trp 14,3 Tyr 140,31 11 Arg 30,06 Ser 53,71 12 Pro 21,27 Glu 6,01 13 APC 14 15

Asp-N peptiden (vervolg)

D4 D5 D7 D8 1/2 3/4 1/2 1/2 Asp 136,32 Glu 124,78 Asp 173,19 Glu 105,77 Arg 60,97 Gln 128,45 Ser 82,84 Thr 77,14 Ala 172,29 Phe 84,7 Gly 83,58 Gly 79,83 (Ala) APC Glu 54,27 Trp 11,24 His 97,07 Trp 2,88 APC Asn 84,97 Arg 12,68 Ala 63,38 APC Pro 20,02 Ser 14,98 Gln 30,59 APC Trp 4,60 Phe 17,13 Ser 8,70 Thr 14,66 Val 9,36 Leu 13,05 Leu 8,68 Leu 4,43 Phe 10,01 Lys 1,93 -- Pro 9,90 Ala 9,52 Gly 2,76 Gly 4,74 Lys 0,32 Ala 3,32 Val 1,84 --


107

4.9.5. Thiocapsa sp., stam CAU

Natief eiwit 1 Glu 183,37 27 Asp 63,96 53 Val 12,77 2 Val 321,22 28 Arg 76,24 54 Ala 13,60 3 Pro 130,12 29 Ala 58,44 55 Gly 10,55 4 Ala 207,31 30 Ala 41,48 56 Ala 5,84 5 Asn 194,04 31 Ala 13,17 57 Thr 3,22 6 Ala 158,91 32 (Ala) 58 Glu 2,63 7 Val 249,96 33 Arg 65,98 59 Glu 3,58 8 Ala 168,82 34 Pro 55,76 60 Trp 1,09 9 Ala 54,40 35 Gly 42,92 61 His 5,14

10 Asn 212,04 36 Leu 56,85 62 Gly 1,19 11 Asp 192,85 37 Pro 36,05 63 12 Pro 151,24 38 Pro 15,9 64 13 Thr 70,14 39 Glu 18,13 65 Leu 1,30 14 Ala 133,19 40 Glu 24,58 66 Phe 2,80 15 Ile 131,61 41 Gln 25,00 67 Pro 3,81 16 Ala 47,73 42 His 16,69 68 17 Leu 146,64 43 69 Lys 2,77 18 Lys 127,39 44 Ala 21,15 70 Leu 1,65 19 Tyr 130,28 45 Asn 21,63 71 Ile 1,35 20 Asn 112,54 46 72 Asn 2,39 21 Ala 112,78 47 Gln 12,99 73 Val 1,18 22 Asp 101,19 48 Phe 18,44 74 Asn 1,3 23 Ala 57,08 49 His 13,40 75 24 Thr 43,33 50 Leu 14,89 76 25 Gln 85,28 51 Pro 14,39 26 Ser 16,09 52 Asp 11,36

4.9.6. Rhodopseudomonas cryptolactis

Natief eiwit 1 Lys 82.61 18 Thr 12.96 35 Glu 2.87 2 Met 117.42 19 36 Gly 2.39 3 Ser 29.19 20 Asp 13.87 37 Glu 1.31 4 Gln 74.13 21 Thr 2.53 38 Ile 1.44 5 Lys 88.65 22 39 Ala 1.78 6 Ala 67.35 23 Ser 5.66 40 Pro 0.70 7 Val 92.66 24 Asn 11.20 41 Lys 0.73 8 Ala 68.70 25 Trp 0.30 42 Gly 0.31 9 Tyr 70.95 26 Arg 9.51 43 Tyr 0.80

10 Gln 69.42 27 Pro 14.39 44 11 Asp 58.58 28 Pro 2.40 45 Arg 0.60 12 Thr 29.54 29 Asn 9.05 46 Ile 0.25 13 Pro 39.41 30 Gly 9.77 47 Phe 0.20 14 Leu 40.06 31 48 15 Gly 34.74 32 Ala 6.77 49 16 Asp 28.92 33 Thr 3.11 50 17 Lys 37.03 34 Val 6.39

5

The primary structure of Rhodoferax fermentans high-potential iron-sulfur protein, an electron donor

to the photosynthetic reaction center

5.1. SUMMARY 110

5.2. INTRODUCTION 110

5.3. MATERIALS AND METHODS 111

5.4. RESULTS AND DISCUSSION 112

Hoofdstuk 5. Primary structure of Rhodoferax fermentans HiPIP 109

5.5. REFERENCES 119

Hoofdstuk 5

The primary structure of Rhodoferax fermentans high-potential iron-sulfur protein, an electron donor

to the photosynthetic reaction center

Gonzalez Van Driessche1, Stefano Ciurli2, Alejandro Hochkoeppler3, Jozef J. Van Beeumen1

(European Journal of Biochemistry (1997) 244, 371-377) 1 Department of Biochemistry, Physiology and Microbiology, Laboratory of Protein Biochemistry and Protein Engineering, University of Gent, Ledeganckstraat 35, 9000 Gent, Belgium 2 Institute of Agricultural Chemistry, University of Bologna, Viale Berti Pichat 10, 40127 Bologna, Italy 3 Department of Biology, University of Bologna, Via Irnerio 42, 40126 Bologna, Italy Keywords: High-potential iron-sulfur protein; Rhodoferax Fermentans; amino acid sequence; mass spectrometry Abbreviations: HiPIP: high-potential iron-sulphur protein; RC: reaction center


Note. The novel amino acid sequence data published here have been deposited with the Swiss-Prot sequence data bank and are available under accession numbers P80882. 5.1. Summary The complete amino acid sequence of Rhodoferax fermentans high-potential iron-sulfur protein (HiPIP), which is known to be an efficient electron donor to the photosynthetic reaction center, has been determined using both N-terminal and C-terminal analyses. The sequence contains 75 residues, with 11 positive charges, 10 negative charges, and one histidine residue. The molecular mass of apo-HiPIP, determined by electrospray ionization mass spectrometry, is 7849.64 Da. Multiple sequence alignment, based both on primary and tertiary structure information, reveals conservation of Tyr 19 and Gly 75 (Allochromatium vinosum numbering) in addition to the four [Fe4S4]-bound cysteines. The HiPIP from Rfx. fermentans is most similar (57% similarity) to the HiPIP from Rubrivivax gelatinosus, a photosynthetic bacterium belonging to the β-1 subgroup of the proteobacteria. 5.2. Introduction

Rhodoferax fermentans is a non-sulfur purple phototrophic bacterium belonging to the β group of phototrophic bacteria [1-3]. Sequence analyses of the 16S rDNA gene has shown that this bacterium is closely related to members of the chemotrophic family of the Comamonadaceae and less closely related to Rubrivivax gelatinosus (formerly called Rhodocyclus gelatinosus) [4], a non-sulfur purple bacterium, and to species of the genus Rhodocyclus. Light-grown cells of Rfx. fermentans contain one soluble c-type, four membrane-bound c-type, and three b-type haem proteins. Dark-grown cells, however, contain three membrane-bound c-type and four b-type haem proteins [5]. It has been shown that the membrane-bound c-type haem proteins from light-grown cells are able to reduce the photo-oxidized photosynthetic reac-tion center (RC) [6]. A high reduction potential soluble protein, present in light grown cells of Rfx. fermentans in larger amounts than the soluble cytochrome c, was shown to be an iron-sulfur protein (HiPIP) by means of a variety of spectroscopic techniques [7-8]. HiPIPs are small-sized redox proteins that, in contrast to the low potential [4Fe-4S] ferredoxins, are characterized by reduction potentials in the range +50 to +450 mV [9-10] and by [Fe4S4]3+/2+ redox states [11]. Experiments of light-induced oxidation of RC and membrane-bound c-type haem proteins have shown that Rfx. fermentans HiPIP is able to rapidly reduce the photo-oxidized photosynthetic RC through the reduction of the membrane-bound c-556 haem [7,12]. This process follows multiphasic kinetics, with a fast phase occurring within a HiPIP/RC-complex [13]. The high value of this electron transfer rate (t1/2 = 2.2 µs) suggests a physiological role for HiPIP in photocyclic electron transfer [13]. Recent evidence pointing to a physiological role for HiPIPs has also been established in Rvi. gelatinosus whole cells [14]. Other functions, however, cannot be ruled out [15-20]. To deepen our understanding of the function of Rfx. fermentans HiPIP, to put the data obtained by NMR spectroscopy into focus [8], and to further investigate the relationship between the structure of the protein and its thermodynamic and kinetic properties, we have determined the primary structure of Rfx. fermentans HiPIP. We propose a multiple alignment scheme obtained by combining information from known primary and X-ray structures of HIPIPs, and we give some insights concerning the possible site of protein-protein interaction during the electron transfer process.


5.3 Material and Methods 5.3.1. Protein modification

The iron-sulfur cluster of the native protein was removed by precipitation in 20% trichloro-acetic acid in an ice-bath for 1h. After centrifugation and using a portion for the first digest, the remaining apoprotein was reduced with dithiothreitol and subsequently treated with 3-bromopropylamine as described by Jue et al. [21]. The reaction mixture was incubated at room temperature for 4 hours. 5.3.2. Enzymatic digests

Staphylococcus aureus V8 endoproteinase (Boehringer, Mannheim) digestion was performed on 30 nmoles apoprotein at an enzyme to substrate ratio of 1:40 for 14 hours at 37°C in 50 mM Tris/HCl, pH 8.0. The second half of the digestion mixture was treated with dithiothreitol for 2 hours at 37°C. 30 nmol aminopropylated apoprotein were digested with Lys-C endoproteinase (Wako) in 25 mM Tris/HCl, pH 8.0, for 4 hours at 37°C, at an enzyme to substrate ratio of 1:45. 5.3.3. Protein and peptide purification

A solution of the aminopropylated apoprotein was desalted in portions by reversed-phase HPLC on a Brownlee C4 column (10 mm x 100 mm, Applied Biosystems). The chromatographic equipment consisted of a Dupont 870 Chromatographic Pump, a 8800 Gradient Controller, an ultraviolet Spectrophotometer set at 220 nm and a Rheodyne injection valve equipped with a 100 µl loop. The same chromatographic equipment was also used for separation of peptides, obtained after Lys-C endoproteinase digestion, on a Pep-S C2/C18 column (4.0 mm x 250 mm, Pharmacia). Glu-C peptides were separated on a SMART chromatographic system (Pharmacia), equipped with a Pharmacia C18 column (2.1 mm x 10 mm). 5.3.4 Sequence analysis

N-terminal sequence analyses were performed on a 475A or a 477A pulsed liquid sequenator, both equipped with on-line 120A phenylthiohydantoin amino acid analyzers (Applied Biosytems, Foster City, CA). For C-terminal analysis, 3 nmol native protein were treated with 1 µg of carboxypeptidase A (Boehringer) and/or 1 µg of carboxypeptidase B (Boehringer) in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.8. Analyses of released amino acids at a set time interval were carried out on a 420A Derivatiser linked on-line to a 130A Separation System (Applied Biosystems). 5.3.5. Mass analysis

Electrospray mass spectrometry was performed on a Bio-Q quadrupole mass spectrometer equipped with an electrospray ionisation source (Fisons Instruments, Altrincham, UK). 10 µl sample in 50% acetonitrile/1% formic acid were injected manually in the 10 µl loop of the Rheodyne injector and pumped to the source at a flow rate of 6 µl/min. The solvent, 50% acetonitrile, was delivered by a Harvard 11 syringe pump. Scans of 1O seconds over the mass range of 400 to 1600 Da were collected over 2 minutes. Calibration of the scans was performed with 50 pmol of horse heart myoglobin (Sigma).


5.3.6. Computer graphics

The structures of HiPIPs from Halorhodospira halophila iso-I [22], Ectothiorhodospira vacuolata iso-II [23], and Rhodocyclus tenuis [24] were superimposed on the structure of Allochromatium vinosum HiPIP [25], using the MOTIVS option of the WHATIF 5.0 program package [26] running on an IBM Risc6000 workstation. 5.4. Results and Discussion

5.4.1. Sequence evidence The complete amino acid sequence of HiPIP from Rfx. fermentans is presented in Fig. 5.1. It was obtained after Edman degradation and mass analyses (Table 5.1) of the native protein and of peptides generated by digestions with Glu-C (Fig. 5.2) and Lys-C endoproteinases. Reversed-phase HPLC of the first portion of the Glu-C endoproteinase digestion mixture resulted in a bad separation pattern (Fig. 5.2A) which for the second portion could be improved by addition of dithiothreitol (Fig. 5.2B). The bad separation can be explained as a result of intra- and/or intermolecular formation of disulfide bridges between the cysteine-containing peptides formed during the alkaline pH conditions of the digest. A Lys-C digest of the aminopropylated apoprotein resulted in a clear-cut identification of cysteine residues at positions 38, 41, 54 and 68.

Ala Ala Pro Leu Val Ala Glu Thr Asp Ala Asn Ala Lys Ser Leu Gly Tyr Val Ala Asp Thr Thr Lys Ala Asp

K5A K5B

Lys Thr Lys Tyr Pro Lys His Thr Lys Asp Gln Ser Cys Ser Thr Cys Ala Leu Tyr Gln Gly Lys Thr Ala Pro

Gln Gly Ala Cys Pro Leu Phe Ala Gly Lys Glu Val Val Ala Lys Gly Trp Cys Ser Ala Trp Ala Lys Lys Ala

K7 K8K3

K4 K6

S4 S5

S2

S7 S6

10 20

30 40 50

60 70

K2

K1

Figure 5.1. Amino acid sequence of Rfx. fermentans HiPIP. Peptides obtained after digestion with Glu-C and Lys-C endoproteinases are presented by 'S' and 'K' respectively.


Table 5.1. Mass measurements of peptides obtained after digestion of the apoprotein and aminopropylated apoprotein with Glu-C (S) and Lys-C (K) endoproteinases respectively. The peptides are numbered following their elution during HPLC separations.

Peptide Measured Calculated Sequence Peptide Measured Calculated Sequence mass (Da) mass (Da) position mass (Da) mass (Da) position S1 1245.3 1245.5 K26-D35 K1 384.2 384.4 H32-K34 S2 1761.9 1762.0 T21-D35 K2 332.1 332.4 A24-K26 S4 669.4 669.8 A1-E7 K3 544.2 544.7 E61-K65 S5 1324.0 3124.4 T8-D20 K4 636.0 635.8 T27-K31 S6 1504.4 1504.8 V62-A75 K5A 1271.2 1270.4 A1-K13 S7 2659.4 2660.1 Q36-E61 K5B 1053.9 1054.2 S14-K23 K6 1516.6 1517.2 D35-K47 K7 1317.5 1317.6 T48-K60 K8 965.3 965.2 G66-K73

1

23

4

5

6

7

0 15 30

0.4

0.8

0.0

0.4

0.8

0.0

0

50

100

0

50

100

Time (min)

Abs

orba

nce

at 2

20 n

m

A

B

Figure 5.2. Reversed phase HPLC separation of peptides obtained after digestion with Glu-C endoproteinase before (A) and after (B) addition of dithiothreitol. Chromatographic conditions are given under 'Materials and Methods' section.

500 700 900 1100 1300 1500

Mass/charge

50

100

0

Rel

ativ

e in

tens

ity (

%)

714.7

785.9

873.2

982.2

1122.4

A11

A10

A9

B11

B10

B9

B8

B7

B6

C10

C9 C8

C7

100

%

07500 8000

mass

7707.5

7849.6

7889.3

A

B

C

Figure 5.3. Electrospray ionisation mass spectrum of native Rfx. fermentans HiPIP. The number at the top of each peak represents the number of positive charges for the particular m/z peak. The insert shows the transformed mass spectrum of the protein, performed with MassLynx software (Micromass, Altrincham, UK). The masses of components A and C respectively correspond to the cleavage of two residues at the N-terminus, and to a potassium adduct of


Evidence for the C-terminal sequence was obtained after treatment of the native protein with carboxypeptidase A which released alanine as the last residue. Treatment with carboxypeptidases A and B demonstrated that this alanine is preceeded by one or two lysine residues. This C-terminal sequence evidence is also supported by chemical C-terminal sequence analysis on the native protein (data not shown). Electrospray mass analysis of the native protein (Fig. 5.3) showed that the measured mass (7849.64 Da) completely fits the mass calculated from the sequence (7849.00 Da) without taking the iron-sulfur cluster into account. The latter appears to decompose in the 50% acetonitrile/1% formic acid solution used for the mass measurement [27-28]. 5.4.2. Comparison with other HiPIP's The amino acid sequences of 15 HiPIP’s are known at present [18,29-38] and a proposed multiple alignment scheme, which includes Rfx. fermentans HiPIP, is shown in Fig. 5.4. This alignment was obtained using both primary and tertiary structure information. A superposition of the models of the four HiPIPs for which the three-dimensional structures have been determined [22-25] was performed, using an algorithm that maximizes the overlap [26]. The superimposed α-carbon backbones for these four HiPIPs are shown in Fig. 5.5. It is evident from Fig. 5.4 that the tertiary structure of HiPIPs can be considered as consisting of highly conserved regions 5-26 (I), 38-49 (II), and 60-86 (III), alternated with loops of variable sequence and length. The cluster-bound cysteines are found in regions II and III, while the evolutionary invariant Tyr-19 is found in region I. The amino acid sequences can be subdivided into four subclasses. The first subclass, which includes HiPIPs from Ach. vinosum, Mch. gracile, Tch. tepidum, Tca. roseopersicina, and Tco. pfennigii, is the one with the largest polypeptide chains (between 81 and 85 amino acids). Within this class, the protein from C. vinosum has been crystallized and its X-ray structure determined [25]. All members of this subclass are from purple sulfur photosynthetic bacteria that belong to the γ-1 subgroup of the purple bacteria [39,40]. HiPIPs from Ect. vacuolata and Paracoccus sp., which belong to the second class, are characterized by deletion of a 5-residue peptide at positions 32-36 and of a 3-residue peptide at position 53-55. These deletions cause shortening of the corresponding loops between regions I-II and regions II-III, as confirmed by the X-ray structures of Ect. vacuolata iso-II HiPIP [23]. In addition, the Paracoccus HiPIP has an additional deletion of four residues at positions 56-59, which causes a further shortening of the second loop. This class of HiPIPs contains only 71 or 72 residues. Paracoccus sp., a denitrifying non-photosynthetic bacterium belongs to the α-subgroup of the purple bacteria [41] whereas Ect. vacuolata belongs to the γ-1 subgroup (Ectothiorhodospiraceae). A third class is represented by Hlr. halophila iso-I and iso-II HiPIPs, which differ from the second class of HiPIPs by a further deletion of a four-residue peptide at position 10-13, and by insertion of a Pro-Asp sequence at position 66-67. The iso-II isozyme is further characterized by the presence of a five-residue peptide at the beginning of the sequence, which is absent in all other HiPIPs. From this class, only the three dimensional structure of iso-I has been determined [22].


The fourth subclass, which includes HiPIPs from Rcy. tenuis and Rpi. globiformis, contains polypeptide chains of only 57-63 amino acids. This strikingly shorter length is mainly due to a 12-residue deletion at position 27-38, which essentially eliminates the loop between the structurally conserved regions I and II. Furthermore, the HiPIP from Rpi. globiformis, which is the shortest of all, is characterized by an additional deletion at positions 53-60, which erases the loop between regions II and III. From this class, the X-ray structure of Rcy. tenuis 2761 HiPIP has been determined [24]. Rpi. globiformis belongs to the α-1 subgroup of the purple bacteria, whereas Rcy. tenuis belongs to the β-2 subgroup [42]. Three-dimensional structure analysis of Rpi. globiformis HiPIP might lead to the conclusion for the existence of a separate fifth class.

5 10 15 20 (1) S A P A N A V A A D N A T A I A L K Y N Q D A (2) E V P A N A V T E S D P T A V A L K Y H R N (3) A A P A N A V T A D D P T A I A L Q Y N Q D A (4) E A P A N A V A A N D P T A V A L K Y N A D A (5) E D L P H V D A A T N P I A Q S L H Y I E D A (6) - - - - A P V D E K N P Q A V A L G Y V S D A (7) - - A A P L V A E T D A N A K S L G Y V A D T (8) - - - M E R L S E D D P A A Q A L E Y R H D A (9) - - - A E R L D E N S P E A L A L N Y K H D G

(10) - Q D L P P L D P S A E Q A Q A L N Y V K D T (11) - - - E P R A E D - - - - G H A H D Y V N E A (12) V E D L P K A E D - - - - D H A H D Y V N D A (13) - - - - G T N - - - A A M R K A F N Y - Q D T (14) - - - - G T N - - - A S M R K A F N Y - Q E V (15) - - - - - - - - Q D K I D P K M V Q Y - Q D S 25 30 35 40 45

(1) T K S E R V A A A R P G L P P E E Q H C A N C (2) E A S E R V A A A R P G L P P E E Q H C E N C (3) T K S E R V A A A R P G L P P E E Q H C A N C (4) T K S D R L A A A R P G L P A E E Q H C A N C (5) N A S E R N P V T K T E L P G S E Q F C H N C (6) A K A D - K A K Y K Q - - F V A G S H C G N C (7) T K A D - K T K Y P K - - H T K D Q S C S T C (8) S S V Q - H P A - - - - - Y E E G Q T C L N C (9) A S V D - H P S - - - - - H A A G Q K C I N C

(10) A E A A D H P A - - - - - H Q E G E Q C D N C (11) A D A S G H P R - - - - - Y Q E G Q L C E N C (12) A D T D - H A R - - - - - F Q E G Q L C E N C (13) A K - - - - - - - - - - - - - N G K K C S G C (14) S K T - - - - - - - - - - - - A G K N C A N C (15) P K - - - - - - - - - - - - - D G N K C S T C 50 55 60 65

(1) Q F M Q A D A A G A T D E W K G C Q L - - F P (2) Q F M L P D - Q G A - D E W R G C S L - - F P (3) Q F M Q A N - V G E - G D W K G C Q L - - F P (4) Q F H L D D V A G A T E E W H G C S L - - F P (5) S F I Q A D - S G A - - - W R P C T L - - Y P (6) A L F Q G K - - - A T D A V G G C P L - - F A (7) A L Y Q G K - - - - T A P Q G A C P L - - F A (8) L L Y T D A - - - S A Q D W G P C S V - - F P (9) L L Y T D P - - - S A T E W G G C A V - - F P

(10) M F F Q A D - - - - - - - S Q G C Q L - - F P (11) A F W G E A - - - V Q D G W G R C T H P D F D (12) Q F W V D Y - - - - V N G W G Y C Q H P D F T (13) A Q F V P G A - - S P T A A G G C K V - - I P (14) A Q F I P G A - - S A S A A G A C K V - - I P (15) V N F E A P - - - - - - - - S S C K I - - V A 70 75 80 85

(1) G K - L I N V D G W C A S W T L K A G - - - 85


(2) G K - L I N L D G W C A S W T L R A G - - - 83 (3) G K - L I N V N G W C A S W T L K - - - - - 83 (4) G K - L I N V D G W C A S W T L K A G - - - 85 (5) G Y - T V S E D G W C L S W A H K T A - - - 81 (6) G K - Q V A N K G W C S A W A K K A - - - - 74 (7) G K - E V V A K G W C S A W A K K A - - - - 75 (8) G K - L V S A N G W C T A W V A R - - - - - 71 (9) N K - L V N A N G W C T A Y V A R G - - - - 72

(10) Q N - S V E P A G W C Q S W T A Q N - - - - 71 (11) E V - L V K A E G W C S V Y A P A S - - - - 71 (12) D V - L V R G E G W C S V Y A P A - - - - - 76 (13) G D N Q I A P G G Y C D A F I V K K - - - - 62 (14) G D S Q I Q P T G Y C D A Y I V K K - - - 63 (15) G K - - I S P N G W C I A Y A P M E D K K G 57

Figure 5.4. Alignment of the amino acid sequence of Rfx. fermentans HiPIP (7) with the HiPIP sequences from Allochromatium vinosum (1), Marichromatium gracile (2), Thermochromatium tepidum (3), Thiocapsa roseopersicina (4), Thiococcus pfennigii (5), Rubrivivax gelatinosus (6), Ectothiorhodospira vacuolata iso-II (8), Ect. vacuolata iso-I (9), Paracoccus species (10), Halorhodospira. halophila iso-I (11), Hlr. halophila iso-II (12), Rhodocyclus tenuis 2761 (13), Rhodocyclus tenuis 3761 (14) and Rhodopila globiformis (15). The N-terminus of Hlr. halophila iso-II contains an extension of 5 amino acids (Gly-Leu-Pro-Asp-Gly, not shown) which is not found in any other HiPIPs. The sequences are numbered according to the HiPIP from Ach. vinosum. The number at the end of each line of this alignment is the total number of amino acids of that particular sequence. The region 27-36 of Hlr. halophila iso-I HiPIP has recently been corrected from the X-ray crystallographic data to be Ala-Ser-Gly-His-Pro-Arg [22]. Conserved aromatic and cysteine residues are boxed. Structurally conserved regions, determined by superposition of known three-dimensional structures of HiPIPs (maximal distance between corresponding α-carbons = 0.3 nm [26], see Fig. 5) are presented with a shadowed background. The sequence stretches for which the maximal distance between corresponding α−carbons is 0.3 nm were identified [26] and evidenced in Fig. 4 using a shadowed background. Finally, all other sequences were aligned using (i) invariance of cluster-bound cysteine residues, (ii) invariance of evolutionary invariant Tyr 19 (Ach. vinosum numbering) and Gly 75 (Ach. vinosum numbering), (iii) maximal sequence overlap of structurally and chemically similar residues, and (iv) minimal number od insertions and deletions. Rfx. fermentans HiPIP shows a very high sequence similarity (57%) with the HiPIP from Rvi. gelatinosus, whereas its similarity with the other HiPIPs is at most 37% (with the protein from C. vinosum). The chain lengths of 74 and 75 residues for Rvi. gelatinosus and Rfx. fermentans HiPIP, respectively, suggest that these proteins belong to either HiPIP subclasses 2 or 3. However, the four-residue deletion at position 10-13, which is typical for the third subclass, is not observed in Rvi. gelatinosus and Rfx. fermentans HiPIP, which suggests that they belong to the second subclass. The presence of three additional residues in the region 32-36 induces a less pronounced shortening of the loop between the structurally conserved regions I and II The features of the primary structure of Rfx. fermentans HiPIP clearly show the relatedness of this bacterium to Rvi. gelatinosus, and confirm the phylogenetic conclusions drawn from the sequence analysis of their 16S RNA's [3] as well as from features such as quinone content, bicarbonate-stimulated fermentative growth with fumarate, and DNA base composition [2]. Rfx. fermentans HiPIP does contain a tyrosine residue at postion 17 that is homologous to Tyr 19 of the consensus sequence. The function of this invariant residue has been recently investigated using site-directed mutagenesis [43,44]. The results indicate that Tyr 19 is important to maintain the structural rigidity of the protein and to decrease the solvent accessibility to the [4Fe-4S] cluster, which is thus stabilized against hydrolysis in the oxidized state. The polypeptide chain of Rfx. fermentans HiPIP contains 11 positive charges and 10 negative (including four thiolate ions), causing the oxidized HiPIP to have an excess of four positive charges (considering the +3 charge of the [4Fe-4S] cluster and a neutral His residue), consistently with its pI of


10.5 [7]. HiPIPs from Rvi. gelatinosus and Rcy. tenuis also have net positive charges, whereas all other HiPIPs are negatively charged. Banci et al. [45] proposed that the reduction potential of HiPIPs is correlated to their net charge of the proteins, with a value of about 20 mV per unit of charge, either positive or negative. However , Heering et al. [46] proposed the existence of two types of HiPIPs. One group (including Ach. vinosum, Mch. gracile, Tca. roseopersicina, Tco. pfennigii, Rcy. tenuis, Rvi. gelatinosus, and Paracoccus sp.) would have its redox potential modulated only by the cluster solvation. HiPIPs from the second group (Ectothiorhodospiraceae) would have their reduction potentials modulated by both cluster solvation and overall charge of the polypeptide (25 mV/unit) [46]. On the basis of the high sequence similarity of Rfx. fermentans HiPIP with the protein from Rvi. gelatinosus, we are prompted to classify the former in the group of HiPIPs for which the cluster solvation, and not the overall charge, is important for determining the reduction potential (Em,7 = +351 mV [7]). The presence of a single histidine residue in Rfx. fermentans HiPIP can be utilized to check the validity of this proposal by measuring the pH-dependence of the reduction potential. These assays are in progress. It has been shown that the reduced Rfx. fermentans HiPIP is an effective electron donor to the photosynthetic RC of the bacterium via the membrane-bound tetrahaem c-type cytochrome [7, 12-13]. Further-more, the oxidized HiPIP can be reduced by the bc1 complex of Rfx. fermentans in a reaction inhibited by myxothiazol and/or stigmatellin [20], which thus strongly suggests a role of this protein in the photosynthetic cycle. It should be added that the HiPIP from Ach. vinosum also appears to reduce the membrane-bound tetrahaem c-type cytochrome of the Ach. vinosum RC [47], but fails to mediate electron transfer between the cytochrome bc1 complex and the RC [48] The photo-induced electron transfer from Rfx. fermentans HiPIP to the photosynthetic RC involves the formation of a HiPIP/RC complex (Kd approximately 2.5 µM) characte-rized by mainly electrostatic interactions, involving 5-6 specific ionic pairs [13]. In an effort to establish the protein surface patch that is involved in protein-protein complex formation between the soluble HiPIPs and membrane-bound redox complexes such as bc1 and RC, we have followed the approach previously applied to cytochromes c [49] and the photo active yellow protein [50]. Amino acid substitutions in the 15 known HiPIP sequences were classified as either largely conservative or radical, they were color-coded and mapped onto the three-dimensional structure of C. vinosum HiPIP [25]. The front and back side view of the resulting prototype HiPIP are shown in Fig. 5.6 A and B respectively. It can be concluded that there is only one region of the protein (front view) for which the surface is fairly conserved, whereas the opposite region is characterized by the almost total absence of conservation. This suggests that the front side is a possible site for molecular recognition processes. Fig. 5.6 also shows that the [4Fe-4S] cluster (yellow), which is the core of the electron tranfer, is very close to the more conserved face of the protein, and that it is separated from this surface by highly conserved aromatic residues. Thus, the role of the latter may be either to stabilize the less charged oxidized [Fe4S4(SCys)4]1- state to protect the cluster from solvent-induced hydrolysis, or to take part in the redox process by providing pathways for electron transfer. Site-directed mutagenesis experiments on residues belonging to this protein will be necessary to test this hypothesis. On the basis of its high redox potential (Em,7 = +287 mV), the soluble cytochrome c-551 detected in Rfx. fermentans light-grown cells can likely be considered, in addition to the HiPIP, to act as an electron donor to the RC in vivo [5]. A soluble cytochrome of the c2 type has been found to effectively mediate electron transfer between the cytochrome bc1 complex and the tetrahaem-containing photosynthetic RC from the purple non-sulfur phototrophic bacterium Blastochloris viridis [51-53]. A similar role has been proposed for a soluble cytochrome c-551 in C. vinosum [54-55], recently determined to be of the short c8-type as found in non-photosynthetic bacteria such as Pseudomonas


aeruginosa [56]. Work is currently in progress to isolate, characterize, and sequence the Rfx. fermentans c-551, to investigate its possible role in photo-induced electron transfer to the RC, in comparison with the homologous HiPIP. This work was supported by grant 32001891 of the Belgian National Fund for Basic Research and by the Concerted Research Action 12052293 of the Flemish Government.

Figure 5.5. Stereoview of the α-carbon backbone of HiPIPs from Ach. vinosum (yellow), Ect. vacuolata iso-II (cyan), Hlr. halophila iso-I (green) and Rcy. tenuis (red). The [Fe4S4] cluster belonging to Ach. vinosum HiPIP is also shown.


Figure 5.6. Space-filling views of the front (A) and the back (B) sides of Ach. vinosum HiPIP. The figure is color coded according to the following percentage of conservancy among all HiPIPs: red (0- 50%), green (51 - 75%), cyan (76 - 99%), blue (100%). The percentage conservancy was calculated per each position in the sequence using the alignment in Fig. 5.4, after classification of amino acids as polar, apolar, aromatic, and negatively or positively charged. The [4Fe-4S] cluster is shown in yellow.


5.5. References [1] Hiraishi, A. and Kitamura, H. (1984) Distribution of phototrophic purple non sulfur bacteria in activated sludge systems and other aquatic environments, Bull. Jpn. Soc. Fish. 50, 1929-1937. [2] Hiraishi, A., Hoshino, Y. and Satoh, T. (1991) Rhodoferax fermentans gen. nov., sp. nov., a phototrophic purple non sulfur bacterium previously referred to as the Rhodocyclus gelatinosus-like group, Arch. Microbiol. 155, 330-336. [3] Hiraishi, A. (1994) Phylogenetic affiliations of Rhodoferax fermentans and related species of phototrophic bacteria as determined by automated 16S rRNA sequencing, Curr. Microbiol. 28, 25-29. [4] Willems, A., Gillis, M. and De Ley, J. (1991) Transfer of Rhodocyclus gelatinosus to Rubrivivax gelatinosus gen. nov., comb. nov., and phylogenetic relationship with Leptotrix, Sphaerotilus natans, Pseudomonas saccharophila, and Alcaligenes latus, Int. J. Syst. Bacteriol. 41, 65-73. [5] Hochkoeppler, A., Moschettini, G. and Zannoni, D. (1995) The electron transport system of the facultative phototroph Rhodoferax fermentans. I. A functional, thermodynamic and spectroscopic study of the respiratory chain of dark- and light-grown cells, Biochim. Biophys. Acta 1229, 73-80. [6] Hochkoeppler, A., Zannoni, D. and Venturoli, G. (1995) The electron transport system of the facultative phototroph Rhodoferax fermentans. II. Flash-induced oxidation of membrane-bound cytochromes c, Biochim. Biophys. Acta 1229, 81-88. [7] Hochkoeppler, A., Kofod, P., Ferro, G. and Ciurli, S. (1995) Isolation, characterization, and functional role of the high-potential iron-sulfur protein (HiPIP) from Rhodoferax fermentans, Arch. Biochem. Biophys. 322, 313-318.

[8] Ciurli, S., Cremonini, M.A., Kofod, P. and Luchinat, C. (1996) 1H NMR of high potential iron-sulfur protein (HiPIP) from the purple non-sulfur bacterium Rhodoferax fermentans, Eur. J. Biochem. 236, 405-411. [9] Luchinat, C., Capozzi, F., Borsari, M., Battistuzzi, G., Sola, M. (1994) Influence of surface charges on redox properties in high potential iron-sulfur proteins, Biochem. Biophys. Res. Commun. 203, 436-442. [10] Przysiecki, C.T., Meyer, T.E., Cusanovich, M.A. (1985) Circular dichroism and redox properties of high redox potential ferredoxins, Biochemistry 24, 2542-2549. [11] Carter, C.W. Jr., Kraut, J., Freer, S.T., Alden, R.A., Sieker, L.C., Adman, E. and Jensen, L.H. (1972) A comparison of Fe4S4 clusters in high potential iron protein and in ferredoxin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3526-3529. [12] Hochkoeppler, A., Ciurli, S., Venturoli, G. and Zannoni, D. (1995) The high potential iron-sulfur protein (HiPIP) from Rhodoferax fermentans is competent in photosynthetic electron transfer, FEBS Lett. 357, 70-74. [13] Hochkoeppler, A., Zannoni, D., Ciurli, S., Meyer, T.E., Cusanovich, M.A. and Tollin, G. (1996) Kinetics of photo-induced electron transfer from high potential iron-sulfur protein to the photosynthetic reaction center of the purple phototroph Rhodoferax fermentans, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 93, 6998-7002. [14] Schoepp, B., Parot, P., Menin, L., Gaillard, J., Richaud, P. and Verméglio, A. (1995) In vivo participation of a high potential iron-sulfur protein as electron donor to the photochemical reaction center of Rubrivivax gelatinosus, Biochemistry 34, 11736-11742.


[15] Fukumori, Y. and Yamanaka, T. (1979) A high potential nonheme iron protein (HiPIP)-linked, thiosulfate-oxidizing enzyme derived from Chromatium vinosum, Curr. Microbiol. 3, 117-120. [16] Bartsch, R.G. (1991) The distribution of soluble metallo-redox proteins in purple phototrophic bacteria, Biochim. Biophys. Acta 1058, 28-30. [17] Kusano, T., Takeshima, T., Suguwara, K., Inoue, C., Shiratori, T., Yano, T., Fukumori, Y. and Yamanaka, T. (1992) Molecular cloning of the gene encoding Thiobacillus ferrooxidans Fe(II) oxidase. High homology of the gene product with HiPIP, J. Biol. Chem. 267, 11242-11247. [18] Tedro, S.M., Meyer, T.E. and Kamen, M.D. (1977) Primary structure of a high potential iron-sulfur protein from a moderately halophilic dentrifying coccus, J. Biol. Chem. 252, 7826-7833. [19] Pereira, M.A., Antunes, A.M., Nunes, O.C., da Costa, M.S. and Teixeira, M. (1994) A membrane-bound HiPIP type center in the thermohalophile Rhodothermus marinus, FEBS Lett. 352, 327-330. [20] Hochkoeppler, A., Kofod, P. and Zannoni, D. (1995) HiPIP oxido-reductase activity in membranes from aerobically grown cells of the facultative phototroph Rhodoferax fermentans, FEBS Lett. 375, 197-200. [21] Jue, R.A. and Hale, J.E. (1993) Identification of cysteine residues alkylated with 3-bromopropylamine by protein sequence analysis, Anal. Biochem. 210, 39-44. [22] Breiter, D.R., Meyer, T.E., Rayment, I. and Holden, H.M. (1991) The molecular structure of the high potential iron-sulfur protein isolated from Ectothiorhodospira halophila determined at 2.5 Å resolution, J. Biol. Chem. 266, 18660-18667. [23] Benning, M.M., Meyer, T.E, Rayment, I. and Holden, H.M. (1994) Molecular structure of the oxidized high potential iron-sulfur protein

isolated from Ectothiorhodopira vacuolata , Biochemistry 33, 2476-2483. [24] Rayment, I., Wesenberg, G., Meyer, T.E., Cusanovich, M.A. and Holden, H.M. (1992) Three-dimensional structure of the high potential iron-sulfur protein isolated from the purple phototrophic bacterium Rhodocyclus tenuis determined and refined at 1.5Å resolution, J. Mol. Biol. 228, 672-686 [25] Freer, S.T., Alden, R.A., Carter, C.W. Jr. and Kraut, J. (1975) Crystallographic structure refinement of Chromatium high potential iron protein with two Angstroms resolution, J. Biol. Chem. 250, 46-54. [26] Vriend, G. (1990) WHATIF: a molecular modelling and drug design program, J. Mol. Graph. 8, 52-56. [27] Nar, H., Huber, R., Messerschmidt, A., Filippou, A.C., Barth, M., Jaquinod, M., van de Kamp, M. and Canters, G.W. (1992) Characterization and crystal structure of zinc azurin, a by-product of heterologous expression in Escherichia coli of Pseudomonas aeruginosa copper azurin, Eur. J. Biochem. 205, 1123-1129. [28] Thorneley, R.N.F., Abell, C., Ashby, G.A., Drummond, M.H., Eady, R.R., Huff, S., MacDonald, C.J. and Schneier, A. (1992) Posttranslational modification of Klebsiella pneumoniae flavodoxin by covalent attachment of coenzyme A, shown by 31P NMR and electrospray mass spectrometry, prevents electron transfer from the nifJ protein to nitrogenase. A possible new regulatory mechanism for biological nitrogen fixation, Biochemistry 31, 1216-1224. [29] Dus, K., Tedro, S. and Bartsch, R.G. (1973) The complete amino acid sequence of Chromatium high potential iron sulfur protein, J. Biol. Chem. 248, 7318-7331. [30] Tedro, S.M., Meyer, T.E. and Kamen, M.D. (1974) Primary structure of a high potential iron-sulfur protein from the photosynthetic bacerium Thiocapsa pfennigii, J. Biol. Chem. 249, 1182-1188.


[31] Tedro, S.M., Meyer, T.E and Kamen, M.D. (1976) Primary structure of a high potential iron-sulfur protein from the purple non-sulfur photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas gelatinosa, J. Biol. Chem. 251, 129-136. [32] Tedro, S.M., Meyer, T.E. and Kamen, M.D. (1979) Primary structure of a high potential four-iron-sulfur ferredoxin from the photosynthetic bacterium Rhodospirillum tenue, J. Biol. Chem. 254, 1495-1500. [33] Tedro, S.M., Meyer, T.E., Bartsch, R.G. and Kamen, M.D. (1981) Primary structure of high potential, four-iron-sulfur ferredoxins from the purple photosynthetic bacteria, Thiocapsa roseopersicina and Chromatium gracile, J. Biol. Chem. 256, 731-735. [34] Tedro, S.M., Meyer, T.E., and Kamen, M.D. (1985) Amino acid sequence of high-redox-potential ferredoxin isozymes from the extremely halophilic purple phototrophic bacterium, Ectothiorhodospira halophila, Arch. Biochem. Biophys. 241, 656-664. [35] Tedro, S.M., Meyer, T.E. and Kamen, M.D. (1985) The amino acid sequence of a high-redox-potential ferredoxin from the purple phototrophic bacterium, Rhodospirillum tenue strain 2761, Arch. Biochem. Biophys. 239, 94-101. [36] Moulis, J.-M., Scherrer, N., Gagnon, J., Forest, E., Petillot, Y. and Garcia, D. (1993) Primary structure of Chromatium tepidum high-potential iron-sulfur protein in relation to thermal denaturation, Arch. Biochem. Biophys. 305, 186-192. [37] Ambler, R.P, Meyer, T.E. and Kamen, M.D. (1993) Amino acid sequence of a high redox potential ferredoxin (HiPIP) from the purple phototrophic bacterium Rhodopila globiformis, which has the highest known redox potential of its class, Arch. Biochem. Biophys. 306, 215-222. [38] Ambler, R.P., Meyer, T.E. and Kamen, M.D. (1994) Amino acid sequences of two high-potential iron sulfur proteins (HiPIPs) from the moderately halophilic purple phototrophic

bacterium Ectothiorhodospira vacuolata Arch. Biochem. Biophys. 308, 78-81. [39] Woese, C.R. (1987) Bacterial evolution, Microbiol. Rev. 51, 221-271. [40] Woese, C.R., Weisburg, W.G., Hahn, C.M., Paster, B.J., Zablen, L.B., Lewis, B.J., Macke, T.J., Ludwig, W. and Stackebrandt, E. (1985) The phylogeny of purple bacteria: the gamma subdivision, System. Appl. Microbiol. 6, 25-33. [41] Woese, C.R., Stackebrandt, E., Weisburg, W.G., Paster, B.J., Madigan, M.D., Fowler, V.J., Hahn, C.M., Blanz, P., Gupta, R., Nealson, K.H. and Fox, G.E. (1984) The phylogeny of purple bacteria: the alpha subdivision, System. Appl. Microbiol. 5, 315-326. [42] Woese, C.R., Weisburg, W.G., Paster, B.J., Hahn, C.M., Tanner, R.S., Krieg, N.R., Koops, H.-P., Harms, H. and Stackebrandt, E. (1985) The phylogeny of purple bacteria: the beta subdivision, System. Appl. Microbiol. 6, 327-336. [43] Agarwal, A., Li, D. and Cowan, J.A. (1995) Role of aromatic residues in stabilization of the [Fe4S4] cluster in high-potential iron proteins (HiPIPs): Physical characterization and stability studies of Tyr-19 mutants of Chromatium vinosum HiPIP, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 9440-9444. [44] Iwagami, S.G., Creagh, A.L., Haynes, C.A., Borsari, M., Felli, I.C., Piccioli, M. and Eltis, L.D. (1995) The role of a conserved tyrosine residue in high-potential iron sulfur proteins, Protein Science 4, 2562-2572. [45] Banci, L., Bertini, I., Ciurli, S., Luchinat, C. and Pierattelli, R. (1995) Rationalization of the reduction potentials within the series of the high potential iron-sulfur proteins, Inorg. Chim. Acta 240, 251-256. [46] Heering, H.A., Bulsink, Y.B.M., Hagen, W.A. and Meyer, T.E. (1995) Influence of charge and polarity on the redox potentials of high-potential iron-sulfur proteins: evidence for the


existence of two groups, Biochemistry 34, 14675-14686. [47] Dutton, P.L. and Leigh, J.S. (1975) Electron spin resonance characterization of Chromatium D hemes, non-heme irons and the components involved in primary photochemistry, Biochim. Biophys. Acta 314, 178-190. [48] Tan, J., Corson, G.E., Lane Chen, Y., Garcia, M.C., Güner, S. and Knaff, D.B. (1993) The ubiquinol:cytochrome c2/c oxidoreductase of Chromatium vinosum, Biochim. Biophys. Acta 1144, 69-76. [49] Meyer, T.E., Tollin, G. and Cusanovich, M.A. (1994) Protein interaction sites obtained via sequence homology. The site of complexation of electron transfer partners of cytochrome c revealed by mapping amino acid substitutions onto three-dimensional protein surfaces, Biochimie 76, 480-488. [50] Koh, M., Van Driessche, G., Samyn, B., Van den Broeck, G., Meyer, T.E., Cusanovich, M.A. and Van Beeumen, J.J. (1996) Sequence evidence for strong consrvation of the photoactive yellow proteins from the halophilic phototrophic bacteria Chromatium salexigens and Rhodospirillum salexigens, Biochemistry 35, 2526-2534. [51] Shill, D.A. and Wood, P.M. (1984) A role of cytochrome c2 in Rhodopseudomonas viridis, Biochim. Biophys. Acta 764, 1-7. [52] Knaff, D.B., Willie, A., Long, J.E., Kriauciunas, A., Durham, B. and Millett, F. (1991) Reaction of cytochrome c2 with photosynthetic reaction centers from Rhodopseudomonas viridis, Biochemistry 30, 1303-1310. [53] Meyer, T.E., Bartsch, R.G., Cusanovich, M.A. and Tollin, G. (1993) Kinetics of photooxidation of soluble cytochromes, HiPIP, and azurin by the photosynthetic reaction center of the purple phototrophic bacterium Rhodopseudomonas viridis, Biochemistry 32, 4719-4726.

[54] Van Grondelle, R., Duysens, L.N.M., Van der Wel, J. and Van der Wal, H.N. (1977) Function and properties of a soluble c-type cytochrome c-551 in secondary photosynthesis electron transport in whole cells of Chromatium vinosum as studied with flash spectroscopy, Biochim. Biophys. Acta 461, 188-201. [55] Knaff, D.B., Whetst one, R. and Carr, J.W. (1980) The role of soluble cytochrome c-551 in cyclic electron flow-driven active transport in Chromatium vinosum, Biochim. Biophys. Acta 590, 50-58. [56] Samyn, B., De Smet, L., Van Driessche, G., Meyer, T.E., Bartsch, R.G., Cusanovich, M.A. and Van Beeumen, J. (1996) A high-potential soluble cytochrome c-551 from the purple phototrophic bacterium Chromatium vinosum is homologous to cytochrome c8 from dentrifying pseudomonads, Eur. J. Biochem. 236, 689-696

6

Mass spectrometric identification of in vivo carbamylation of the amino terminus of Ectothiorhodospira mobilis High-

potential Iron-sulfur Protein, isozyme 1

6.1. SUMMARY 125


6.3. MATERIAL AND METHODS 126

6.4. RESULTS AND DISCUSSIONS 127

6.5. CONCLUSIONS 134

6.6. REFERENCES 135

Hoofdstuk 6. In vivo carbamylation of Ect. mobilis HiPIP, isozyme1

124

Hoofdstuk 6

Mass spectrometric identification of in vivo carbamylation of the amino terminus of Ectothiorhodospira mobilis High-

potential Iron-sulfur Protein, isozyme 1

G. Van Driessche1, I. Vandenberghe1, F. Jacquemotte2, B. Devreese1, and J.J. Van Beeumen1

(Journal of Mass Spectrometry 2002, 37: 858-866) 1 Department of Biochemistry, Physiology and Microbiology Laboratory for Protein Biochemistry and Protein Engineering University of Gent 9000 Gent, Belgium 2 Institut Meurice Avenue Emile Gryzon 1 1070 Bruxelles Running title: Mass spectrometric identification of a carbamyl fragment Keywords: Carbamylation; HiPIP; post-translational modification; mass spectrometry; CID Abbreviations: HiPIP: high-potential iron-sulphur protein Note. The novel amino acid sequence data published here have been deposited with the Swiss-Prot sequence data bank and are available under accession numbers P83341 and P83342.


125

6.1. Summary The complete amino acid sequence of a novel High-Potential Iron-sulfur Protein isozyme 1 from the moderately halophilic phototrophic bacterium Ectothiorhodospira mobilis was determined by a combined approach of chemical and mass spectrometric sequencing techniques. By mass analysis of the apo- and holo-protein in the positive electrospray ionization mode using different electrospray solvents, the protein was found to be post-translationally modified by a moiety of 43 Da. Further analysis showed the nature and location of this modification to be a carbamyl group at the amino-terminus of the HiPIP. This rare type of modification has previously been reported to occur in the water-soluble human lens αB-crystallin, class D β-lactamases and some prokaryotic ureases, albeit at an internal lysine residue. In this paper, we discuss the mass spectrometric features of a carbamylated residue at the N-terminus of a peptide or a lysine side-chain during sequence analysis by Collision-Induced Dissociation tandem mass spectrometry. Our data thus evidence the first case of a prokaryotic carbamylated electron transport protein occurring in vivo. 6.2. Introduction

In recent years, the introduction of new soft ionization methods such as electrospray

(ESI) and matrix assisted laser desorption (MALDI) for studying peptides and proteins has made mass spectrometry a valuable state-of-the-art tool in biological research. Unlike Edman amino acid sequencing, mass spectrometric sequence determination is independent of the presence and nature of modifying groups generated by post-translational modifications (i.e. glycosylation, phosphorylation, acetylation, methylation, sulfation, etc.), and is even an excellent and sensitive method to examine these modifying groups in detail. An overview of different known post-translational modifications of amino acids can be found at The Association of Biomolecular Resource Facility Resource website (http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home), with the references therein.

High-potential iron-sulfur protein (HiPIP) is a water soluble electron transport protein isolated from purple phototrophic bacteria such as Chromatiaceae and Ectothiorhodospiraceae, and also, but less often, from Rhodospirillaceae. Multiple isoforms are also reported for this family of proteins 1-2. HiPIPs are relatively small polypeptides (< 10 kDa), characterized by the presence of a single [4Fe-4S] cluster having 2+ and 3+ as the physiologically accessible oxidation states. Their redox potentials range from 50 to 500 mV, averaging 300 mV. HiPIP has recently been shown to function as a soluble mediator in photosynthetic electron transfer between the bc1 complex and reaction center bacteriochlorophyll in some species of purple bacteria 3-9 .

In this report, we describe the isolation and identification of the carbamylated N-terminus of High-potential Iron-sulfur Protein (HiPIP) isozyme 1 from Ectothiorhodospira mobilis by electrospray ionization mass spectrometry. Although many different bacterial electron transport proteins have been extensively studied in the past, this is the first report describing the presence of such a carbamyl moiety at the amino-terminus of an electron transport protein. We also discuss the identification of such a group present at a peptide with electrospray ionization tandem mass spectrometric sequencing techniques (MS/MS). In vivo carbamylation is generally an irreversible process of post-translational protein modification of a protein that was reported for the water-soluble lens αB-crystallin from humans. Analysis of the human lens tryptic peptides by reversed-phase HPLC and electrospray ionization mass spectrometry has led to the identification of this type of


126

modification existing along with a protein having an acetylation at the same lysine residue (position 92) 10. Both modifications alter the net charge of unmodified αB-crystallin, which may play a role in the origin of cataractogenesis 10-11. The presence of an internal carbamylated lysine was also reported for the class D β-lactamases, which are β-lactam antibiotics degrading enzymes, and for the α-subunits of ureases from Bacillus pasteurii and Klebsiella aerogenes 12-14. For the last group of proteins, the carbamoyl group provides the ligand for two nickel ions, as part of an active centre that catalyzes the decomposition of urea to ammonia.

6.2. Material and Methods 6.2.1. Isolation and purification of HiPIP Ectothiorhodospira mobilis HiPIPs were generally purified following the methods described by Bartsch15

and Meyer16. Briefly, the extract was adsorbed to a DEAE-cellulose column with 20 mM Tris-HCl, pH 7.3, eluted with 0.5M sodium chloride, and the fractions chromatographed on Sephadex G75 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). The resulting HiPIP containing fractions were rechromatographed on a DEAE-cellulose column using a linear gradient of 60-180 mM sodium chloride in 20 mM Tris-HCl, pH 8. Two incompletely resolved HiPIP peaks, marked as isozyme 1 and 2 respectively, were eluted at 130 and 140 mM sodium chloride respectively, desalted against water, and dried in vacuo. The present study only concerns HiPIP isozyme 1. 6.2.2. Removal of the iron-sulfur cluster and protein modification

Following the procedure of Hong and Rabinowitz17, the dried protein was dissolved in 50 mM Tris-HCl, pH 7.2, containing 20-25% trichloro acetic acid. After incubation in an ice-bath for one hour, the precipitated apoprotein was redissolved in water and desalted by ultrafiltration through a Centricon-3 membrane (Amicon, Beverly, MA) with three volumes water. After desalting, a first aliquot of the apoprotein was reduced with dithiothreitol and treated with 3-bromopropylamine as described by Jue and Hale18. The reaction mixture was incubated for 4h at room temperature and desalted on a C2/C18 column using the SMART chromatographic equipment (Pharmacia). A second aliquot of the apoprotein was directly used for digestion with Asp-N protease and subsequent mass spectrometric analysis, and for the isolation of the blocked N-terminal fragment. 6.2.3. Digestions of HiPIP and peptide purification Digestion with Asp-N and Lys-C endoproteinases (Boehringer, Mannheim, FRG) and, after separation of the peptides, subsequent subdigestion of the blocked N-terminal Asp-N peptide with Lys-C endoproteinase (Wako, Osaka, Japan) were carried out in 50-100 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5-8, for 2-4 hours at 37oC at an enzyme to substrate ratio (mass/mass) of 1/40 or 1/100 respectively. The generated peptides were separated on a Brownlee PTC-C18 column (2.1 x 100 mm, Applied Biosystems, Foster City, CA) using the SMART chromatographic equipment.


127

6.2.4. N-terminal sequencing Automated N-terminal sequence analyses of native protein and of peptides were performed on a pulsed liquid phase 476A sequenator (Applied Biosystems). 6.2.5. Mass spectrometry

Mass spectrometric analyses were carried out on a nano-electrospray ionization hybrid quadrupole- time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer (Micromass, Wythenshawe, UK), equipped with a Z-spray ionization system. Prior to mass analyses, 100 pmoles HiPIP were dissolved in 20 µL 50% acetonitrile/water, containing 0.1% formic acid. Alternatively, HiPIP was dissolved in 3 µL 100% formic acid and, after five minutes, diluted with 20 µL 50% acetonitrile/water. For analysis of holo-HiPIP, the protein was dissolved in 20 µL HPLC-grade water (Baker, Deventer, Holland) and analyzed directly. Peptides that were collected during chromatographic separations were also directly analyzed without any dilution. Tandem MS fragmentation of blocked and some selected peptides by Collision-Induced Dissociation (CID) was performed using argon as the collision gas, at a collision energy varying from 20 to 40 V. The MS/MS spectra were transformed using the MaxEnt Sequence Software supplied with the mass spectrometer.

6.2.6. Peptide synthesis

N-acetyl-Ala-Glu-Lys was synthesized as carboxylic acid by solid phase synthesis using the Wang-resin on an Advanced ChemTech 90 peptide synthesizer (Johannesburg, SA). An active ester coupling procedure, using pentafluorophenyl esters of 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids, was carried out. The N-terminus was acetylated with acetic anhydride. The peptide was then cleaved from the resin as the elimination of protecting groups (Boc for Lys, and OtBu for Glu) with trifluoroacetic acid:triisopropylsilane:water (95:2.5:2.5, by Vol). The generated peptide was desalted by reversed-phase HPLC on the SMART chromatographic system. 6.2.7. Carbamylation of test peptides Test peptides were dissolved in an old stock solution of 8M urea, containing 0.1N hydrochloric acid (final concentration of urea is 4M) and incubated at 40°for 60 hours. The carbamylated peptides were chromatographed on the same chromatographic equipment as described above. 6.4. Results and Discussion

6.4.1. Detection of the modification

We subjected native HiPIP isozyme 1 from Ectothiorhodospira mobilis to automated N-terminal sequence analysis for 24 cycles, with unambiguous identification of all residues. After this analysis, the iron-sulfur cluster of another aliquot of the protein was removed and the cysteines were modified to a stable derivative for identification during Edman degradation. The modified apoprotein was digested using two different enzymes, Asp-N and Lys-C endoproteinase, resulting in overlaps in sequence information between different peptides, and in the complete amino acid sequence, applying chemical and/or mass spectrometric techniques. The complete sequence of Ect. mobilis HiPIP isozyme 1 (72 residues in length) was determined to be


128

as follows: A E K L E E S S A E A K A L S Y V H D A T T S G H D S Y Q E G Q K C I N C L L Y T D P S Q E E W G G C A V F P G K L V N A N G W C T A Y V A R G. Electrospray ionization mass spectrometric analysis was used to determine the mass of the protein with and without the iron-sulfur cluster (Figure 6.1). The iron-sulfur clusters from HiPIPs and ferredoxins are known to be labile to acids and, therefore, are likely to be degraded under the weak acidic conditions used to favor the formation of positively charged molecular ions

17.

Pétillot and co-workers described electrospray ionization conditions that preserve the holoprotein during mass spectrometric analysis in the negative ionization mode 19-20. We here describe experimental conditions for the detection of iron-sulfur holoproteins and apoproteins during analysis in the positive mode. The left part of Figure 6.1A shows the spectra obtained when the protein sample was dissolved in a ‘classical’ electrospray solvent, namely 50% acetonitrile/0.1% formic acid in water. The reconstructed spectra (right part of Figure 6.1A) shows the heterogeneous distribution of molecular masses of Ect. mobilis HiPIP isozyme 1, starting with the mass of 7970.7 Da. The observed masses can not be assigned to the theoretical mass for apo-HiPIP (7757.5 Da) or holo-HiPIP (8105.1 Da). This is probably due to the presence of the partially degraded iron-sulfur cluster under the conditions used. The mass difference between the two main components, A (7970.7 Da) and B (8002.2 Da), and two minor components, C (8013.8 Da) and D (8045.4 Da), is 32 Da which corresponds to the value of a sulfur atom. The observed charges are +5 and +6, slightly less than the number of potential sites of positive charges of the protein (4 lysines, 1 arginine, 2 histidines and the amino terminus) and the physiological oxidation states for the holo-protein (1-/2-). To remove the iron-sulfur cluster, we dissolved the dried protein in a few microliters of neat formic acid for some minutes and then diluted it using the ‘classical’ electrospray solvent. Mass measurement of the resulting apoprotein resulted in the mass spectrum shown in the left part of Figure 6.1B. The molecular masses observed from the reconstructed spectra (right part of Figure 6.1B) are 7757.4 and 7800.5 Da. The former value agrees within 0.1Da with the isotope-averaged theoretical mass of the apo-HiPIP. The measured mass of 7800.5 Da can only be explained considering a post-translational modification of the protein for which acetylation (42 Da) or carbamylation (43 Da) are the best candidates. In retrospect, a similar difference is also observed in Figure 6.1A for the partially degraded holo-protein (component A versus C). The number of observed positive charges is six to eight, the highest charge being in agreement with the total number of potential positive sites of the protein. To examine whether the observed mass difference between component B (7800.5 Da) and component A (7757.4 Da) was not an artifact generated during removal of the iron-sulfur cluster under the strong acid conditions used for removal of the iron-sulfur cluster, we measured the mass of the holoprotein being dissolved in water. We observed here the same positively charged pattern as described above when using the classical electrospray ionization conditions (Figure 6.1C). The measured mass of 8104.7 Da is in agreement with the isotope-averaged theoretical mass of apo-HiPIP (7757.5 Da), supplemented with the mass of the whole 4Fe-4S iron-sulfur cluster (351.6 Da) and corrected for the loss of four hydrogens due to linkage of the cluster with the protein (4 Da). As observed for the apoprotein, we also detected the presence of component B with a measured mass of 8147.2 Da, which is 42.5 Da higher than that measured for component A. Based on the mass spectrometric observations of two different components with a mass difference of 43.1 Da and 42.5 Da for apo- and holo-protein respectively, we conclude that about 45% of the holoprotein is post-translationally modified at one of its amino acids.


129

6.4.2. Location of the modification Exactly where the modification is situated was first examined by digestion of the

unmodified apoprotein with Asp-N endoproteinase, resulting in five major peptides of which the measured and calculated masses are shown in Table 6.1. With the exception of fragment D4, all of the masses match peptides expected from the digestion of the Ect. mobilis HiPIP isozyme 1 with Asp-N endoproteinase (Figure 6.2). Fragment D4 was found to be 43.0 Da higher than another N-terminal fragment, D2. Tandem mass spectrometry of peptide D4 confirmed that it corresponds with the N-terminal sequence of the protein having an extra mass of 43 Da (Figure

Figure 6. 1. Electrospray ionization mass spectra (left column of the figure) and deconvoluted mass spectra for these particular raw mass spectra (right column) of Ectothiorhodospira mobilis HiPIP isozyme 1, performed with the ‘classical’ electrospray solvent (0.1% formic acid/50% acetonitrile in water) (A), formic acid subsequently diluted with ‘classical’ electrospray solvent (B), and water (C).


130

6.3A). As observed from the reconstructed CID MS/MS spectra of the double charged forms for the modified fragment D4, we detected nearly all the components of the y”-series (from y”18 to y”7), with loss of the 42.6 Da-moiety during fragmentation. Subsequent digestion of this modified fragment with Lys-C endoproteinase resulted in three smaller peptides (Table 6.2) which were used to determine the exact location of the modification. CID MS/MS spectra of peptide K1 also gave mainly y”-fragment ions, with an abundant fragment showing a loss of a 43.0 Da from the parent ion (Figure 6.3B). From these data, it is clear that it is the amino-terminus of the protein which is post-translationally modified.

Table 6.1. Asp-N peptide fragments measured and calculated masses for apo-HiPIP. Peptide numbers are following their chromatographic order. Peptide Measured Theoretical Sequence Remarks mass (Da) mass (Da) positions D1 688.5 687.7 19 – 25 D2 1962.0 1962.1 1 – 18 D3 1875.6 1876.1 26 – 41* D4 2005.1 1962.1 1 – 18 + 43 Da D5 3282.2 3281.6 42 – 72* D6** -- -- * Peptide containing intra-molecular disulfide bridge ** Peak containing a heterogenous peptide mixture formed by intra-molecular disulfide bridges

Table 6.2. Measured and calculated masses for subsequent Lys-C subdigestion of D4 fragment. Peptide Measured Theoretical Sequence Remarks mass (Da) mass (Da) positions K1 389.2 346.4 1 – 3 + 42.8 Da K2 962.4 962.5 4 – 12 K3 688.4 688.4 13 - 18

Ala Glu Lys Leu Glu Glu Ser Ser Ala Glu Ala Lys Ala Leu Ser Tyr Val His Asp10

Carb1

D2

Ala20

Thr Thr Ser Gly His Asp Ser Tyr Gln Glu

30Gly Gln Lys Cys Ile Asn Cys Leu Leu

D1 D3

Thr Asp Pro Ser Gln Glu Glu Trp Gly Gly Cys Ala Val Phe Pro Gly Lys Leu Val5040

Tyr

D5

Asn60

Ala Asn Gly Trp Cys Thr Ala Tyr Val Ala Arg Gly70

D4

K1 K2 K3

Figure 6.2. Amino acid sequence of Ectothiorhodospira mobilisHiPIP, isozyme1, showing the positions of Asp-N and Lys-C peptides.


131

6.4.3. Type of modification

From the data, and taking the accuracy of the mass spectrometric method into account, carbamylation is the best candidate for such modification because it fits very well with the measured mass for the above discussed fragments D4 and K1. Carbamylation, however, has so far been detected only in a few prokaryotic proteins. Amino-terminal acetylation, on the contrary, is a well-known post-translational modification in prokaryotes although it occurs more often in eukaryotic proteins 21-25. In order to disprove umabiguously the possibility of acetylation as a candidate for the modification in HiPIP isozyme 1, we subjected the synthetic peptide acetyl-Ala-Glu-Lys, of which the three constitutent amino acids are identical to those from the

Figure 6.3. Tandem mass spectrometry of modified peptide D4 obtained after digestion of the apoprotein with Asp-N endoproteinase (A), and of peptide K1resulting from subdigesting of the Asp-N peptide with Lys-C endoproteinase (B). In both spectra, we observe the loss of a 43 Da fragment during Collision-Induced Dissociation.


132

above discussed peptide K1, to CID MS/MS fragmentation techniques, and compared the fragmentation pattern (Figure 6.4) with that given in Fig. 6.3B for peptide K1. These spectra also show distinct differences in the fragmentation at the modified side chains. Both peptides yield the y”-series ions (from y”1 to y”3) as expected from the sequence. Starting from the 390.2 Da parent peak, we observe a dominant peak of 347.2 Da, due to the loss of a 43 Da-fragment which is absent for the acetylated peptide. As already reported for the acetylation at lysine 92 from αB-crystallin 10, this indicates that the acetyl group is resistent to collision induced dissociation. In an additional control experiment, we also observed the same phenomenon during

CID fragmentation of the acetylated amino-terminal tryptic peptide from horse cytochrome c (data not shown). In Figure 4, we notice the loss of a 18 Da fragment, but this is due to the loss of a water molecule from the COOH group of the glutamic acid or the C-terminal lysine.

To umambiguously prove the post-translational modification of carbamylation for HiPIP isozyme 1, we investigated the behaviour of known carbamylated peptides during collision-induced fragmentation. As already mentioned, this type modification is known to occur as a side reaction after chemical treatment of a protein/peptide

with urea. Free amino groups from internal lysines, the amino-terminus of proteins/peptides, and sulfhydryl groups from cysteines can be carbamylated when proteolytic digestions or the removal of prosthetic groups are performed using urea as a denaturant, the active compound being cyanate formed during decomposition of the urea 26. For this experiment, we incubated the test peptide Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys with urea and purified the resulting modified species by reversed-phase HPLC. Two modified peptides were isolated, one carbamylated at the N-terminus and another at the lysine side-chain (data not shown). Both carbamylated peptides were subjected to CID MS/MS fragmentation, resulting in the fragmentation patterns given in Figures 6.5A and B. The spectra show distinct differences in stability of the carbamylated residues towards collisional induced fragmentation. Both peptides have the peak of 922.5 Da due to the loss of the carbamyl moiety from the parent 965.5 Da mass ion. The N-terminal modified peptide shows the ions of abundant y”-series ( from y”2 to y”8) and ions of the minor b-series (bn), as expected. Also ions of a second b-series (bn-43) occur which lack the +43 Da carbamyl adduct (Table 6.3), indicating that the carbamyl group is not stable to collision induced dissociation. In the case of the carbamylated lysine at the C-terminal end of the peptide, we note ions of the abundant b-series (from b8 to b2) and ions from the second minor y”-series (Figure 6.5B). In comparison, Lapko et al. 10 described the CID MS/MS fragmentation pattern of a tryptic peptide having a carbamylated lysine at the second position. The spectrum has the nearly complete series of b- and y”-fragment ions, and a second b-series corresponding to the loss of the carbamyl molecule (-43 Da), as we also detect. These data indicate that CID, with its resulting fragmentation patterns, is a very useful method for the identification of a carbamylated side chain at lysine residues occuring within or at the C-terminal end of a polypeptide, as well as at its amino-terminus.

Figure 6. 4. Collision-Induced Dissociation spectrum of peptide Ac-Ala-Glu-Lys.


133

Figure 6.5 Tandem mass spectrometry of peptide Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys carbamylated at the N-terminus (A) or at the C-terminal lysine residue (B). The MS/MS spectrum of the former has a major y”-series (y”n), minor b-series (bn) and a second b-series (b*n) lacking the 43 Da molecule, corresponding to the loss of the carbamyl fragment. The spectrum of the carbamylated C-terminal lysine has a major b-series and minor y”-series. We also observe the loss of a water molecule during mass spectrometric fragmentation (y*n).


134

Table 6.3. Masses of fragment ions of the b- and y”-series for the carbamylated testpeptide.

Carbamylated Val1 calculated observed calculated observed bn series m/z m/z y”n series m/z m/z b1 143.1 -- y”1 147.1 147.1 b1-43 100.1 -- b2 280.1 280.1 y”2 276.2 276.2 b2-43 237.1 237.1 b3 393.2 393.2 y”3 375.2 -- b3-43 350.2 350.2 b4 494.3 494.3 y”4 472.3 472.3 b4-43 451.3 451.3 b5 591.3 -- y”5 573.3 573.3 b5-43 548.3 548.3 b6 690.4 -- y”6 686.4 686.4 b6-43 647.4 647.4 b7 819.4 -- y”7 823.5 823.4 b7-43 776.4 -- b8 -- -- y”8 -- -- y”8-43 922.5 922.5

Carbamylated Lys8 calculated observed calculated observed bn series m/z m/z y”n series m/z m/z b1 100.1 -- y”1 190.1 190.1 b2 237.1 237.1 y”2 319.2 319.2 b3 350.2 350.2 y”3 418.2 -- b4 451.3 451.3 y”4 515.3 515.3 b5 548.3 548.3 y”5 616.3 -- b6 647.4 647.4 y”6 729.4 -- b7 776.4 776.5 y”7 866.5 -- b8 904.5 904.5 y”8 -- -- y”8-43 922.5 922.5

6.5. Conclusion From this study, it is clear that the amino-terminus of Ectothiorhodospira mobilis HiPIP isozyme 1 is post-translationally modified through carbamylation in vivo since the protein was isolated without the use of urea, a strong inducing agent for in vitro carbamylation. Another fact which supports this conclusion is that we did not observe carbamylation at any of the amino acids of Ect. mobilis HiPIP isozyme 2, the protein isolated along with isozyme 1, having the characteristic sequence features of a HiPIP redox protein (Van Driessche et al., in preparation). This is therefore the first report of a prokaryotic electron transport protein post-translationally carbamylated at the amino-terminus of its polypeptide chain. Our study also confirm that this type of protein modification may arise as a chemical artifact of carbamylation using urea as a denaturing agent during the isolation procedure or manipulation of the protein prior to sequence or mass analysis. Therefore, it is preferable to use


135

fresh urea solutions, which is initially cyanate free, and desalt the protein mixture immediately thereafter, or to use another denaturant such as, for example, guanidine-hydrochloride. This work was supported by the Fund for Scientific Research-Flanders (projects G.0422.98 and G.0282.01). 6.6. References 1. Ambler, RP, Meyer, TE, Kamen, MD. Amino acid sequences of two high-potential iron sulfur proteins (HiPIPs) from the moderately halophilic purple phototrophic bacterium Ectothiorhodospira vacuolata . Archives of Biochemistry and Biophysics. 1994; 308: 78. 2. Ambler, RP, Daniel, M, Meyer, TE, Cusanovich, MA. Amino acid sequences of two high-potential iron sulfur proteins (HiPIPs) from the moderately halophilic purple phototrophic bacterium, Rhodospirillum salinarum. Archives of Biochemistry and Biophysics. 1999; 369: 143. 3. Hochkoeppler, A, Ciurli, S, Venturoli, G, Zannoni, D. The high-potential iron-sulfur protein (HiPIP) from Rhodoferax fermentans is competent in photosynthetic electron transfer. FEBS Letters. 1995; 357: 70. 4. Hochkoeppler, A, Zannoni, D, Ciurli, S, Meyer, TE, Cusanovich, MA, Tollin, G. Kinetics of photo-induced electron transfer from high-potential iron-sulfur protein to the photosynthetic reaction center of the purple phototroph Rhodoferax fermentans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996; 93: 6998. 5. Hochkoeppler, A, Ciurli, S, Kofod, P, Venturoli, G, Zannoni, D. On the role of cytochrome c8 in photosynthetic electron transfer of the purple nonsulfur bacterium Rhodoferax fermentans. Photosynthesis Research. 1997; 53: 13. 6. Menin, L, Schoepp, B, Parot, P, Verméglio, A. Photoinduced cyclic electron transfer in Rhodocyclus tenuis cells: Participation of HiPIP

or cyt c8 depending on the ambient redox potential. Biochemistry. 1997; 36: 12183. 7. Menin, L, Gaillard, J, Parot, P, Schoepp, B, Nitschke, W, Verméglio. A. Role of HiPIP as electron donor to the RC-bound cytochrome c in photosynthetic purple bacteria. Photosynthesis Research. 1998; 55: 343. 8. Osyczka, A, Nagashima, KVP, Sogabe, S, Miki, K, Shimada, K, Matsuura, K. Comparison of the binding sites for high-potential iorn-sulfur protein and cytochrome c on the tetraheme cytochrome subunit bound to the bacterial photosynthetic reaction center. Biochemistry. 1999; 38: 15779. 9. Schoepp, B, Parot, P, Menin, L, Gaillard, J, Richaud, P, Verméglio, A. In vivo participation of a high potential iron-sulfur protein as electron donor to the photochemical reaction center of Rubrivivax gelatinosus. Biochemistry. 1995; 34: 11736. 10. Lapko, VN, Smith, DL, Smith, J. In vivo carbamylation and acetylation of water-soluble human lens αB-crystallin lysine 92. Protein Science. 2001; 10: 1130. 11. Hardling, JJ, Rixon, KC. Carbamylation of lens proteins: A possible role factor in cataractogenesis in some tropical countries. Experimental Eye Research. 1980; 57: 29. 12. Golemi, D, Maveyraud, L, Vakulenko, S, Samama, J-P, Mobashery, S. Critical involvement of a carbamylated lysine in catalytic function of class D β-lactamases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2001; 98: 14280 13. Pearson, MA, Schaller, RA, Michel, LO, Karplus, PA, Hausinger, RP. Chemical rescue of Klebsiella aerogenes urease variants


136

lacking the carbamylated-lysine nickel ligand. Biochemistry. 1998; 37: 6214 14. Benini, S, Rypniewski, WR, Wilson, KS, Miletti, S, Ciurli, S, Mangani, S. A new proposal for urease mechanism based on the crystal structures of the native and inhibited enzyme from Bacillus pasteurii: why urea hydrolysis costs two nickels. Structure. 1999; 7: 205 15. Bartsch, RG. Purification of (4Fe-4S)1-2- ferredoxins (High-potential Iron-sulfur Proteins) from bacteria. Methods in Enzymology. 1978; 53: 329. 16. Meyer, TE. Purification and properties of high-potential iron-sulfur proteins. Methods in Enzymology. 1994; 243: 435. 17. Hong, JS, Rabinowitz, JC. Preparation and properties of clostridial apoferredoxins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 1967; 29: 246. 18. Jue, RE, Hale, JE. Identification of cysteine residues alkylated with 3-bromopropylamine by protein sequence analysis. Analytical Biochemistry. 1993; 210: 39. 19. Pétillot, Y, Golinelli, MP, Forest, E, Meyer, J. Electrospray-ionization mass spectrometry of molecular variants of a [2Fe-2S] ferredoxin. Biochemical and Biophysical Research Communications. 1995; 210: 686. 20. Pétillot, Y, Forest, E, Meyer, J, Moulis, JM. Observation of holoprotein molecular ions of several ferredoxins by electrospray-ionization-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 1995; 228: 56. 21. Itoh, H. Primary structure of an acidic ribosomal protein from Micrococcus lysodeikticus. FEBS Letters. 1981; 127: 67. 22. Driessen, HPC, deJong, WW, Tesser, GI, Bloemendal, H. The mechanism of N-terminal acetylation of proteins. CRC Critical Reviews inBiochemistry. 1985; 18: 281. 23. Persson, B, Flinta, C, von Heijne, G, Jörnvall, H. Structures of N-terminally acetylated proteins. European Journal of Biochemistry. 1985; 152: 523.

24. Flinta, C, Persson, B, Jörnvall, H, von Heijne, G. Sequence determinants of cytosolic N-terminal protein processing. European Journal of Biochemistry. 1986; 154: 193. 25. Moerschell, RP, Hosokawa, Y, Tsunasawa, S, Sherman, F. The specificities of yeast methionine aminopeptidase and acetylation of amino-terminal methionine in vivo. Journal of Biological Chemistry. 1990; 265: 19638. 26. Lippincott, J, Apostol, I. Carbamylation of cysteine: A potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Analytical Biochemistry. 1999; 267: 57.

7

Amino Acid Sequences And Distribution of High Potential Iron-Sulfur Proteins That Donate Electrons to The Photosynthetic Reaction Center in Purple Phototrophic Bacteria 7.1. SUMMARY 139 7.2. INTRODUCTION 139 7.3. MATERIAL AND METHODS 141 7.4. RESULTS 143 7.5. DISCUSSION 153 7.6. REFERENCES 159

Hoofdstuk 7. Amino acid sequences and distribution of HiPIPs

138

Hoofdstuk 7

Amino Acid Sequences And Distribution of High Potential Iron-Sulfur Proteins That Donate Electrons to The Photosynthetic Reaction Center in Purple Phototrophic Bacteria

G. Van Driessche1, I. Vandenberghe1, B. Devreese1, B. Samyn1, T.E. Meyer2, R. Leigh2, M.A. Cusanovich2, R.G. Bartsch2, U. Fischer3, and

J.J. Van Beeumen1

(Journal of Molecular Evolution (2002), submitted) 1 Department of Biochemistry, Physiology and Microbiology, Laboratory for Protein Biochemistry and Protein Engineering, University of Gent, 9000 Gent, Belgium 2 Department of Biochemistry, University of Arizona, Tucson, Arizona 85721, U.S.A. 3 Abteilung Marine Mikrobiologie, Fachbereich 2 und Zentrum für Umweltforschung und Umwelttechnologie, Universität Bremen, D-28359 Bremen, Germany Abbreviations*: Ach., Allochromatium; Atb., Acidithiobacillus; Blc., Blastochloris; Ect., Ectothiorhodospira; Hch., Halochromatium; Hlr., Halorhodospira; Ich., Isochromatium; Mch., Marichromatium; Psp., Phaeospirillum; Ral., Ralstonia; Rba., Rhodobacter; Rbi., Rhodobium; Rcs., Rhodocista; Rcy., Rhodocyclus; Rfx., Rhodoferax; Rmi., Rhodomicrobium; Rpi., Rhodopila; Rps., Rhodopseudomonas; Rsp., Rhodospirillum; Rhv., Rhodovibrio; Rdv., Rhodovulum; Rvi., Rubrivivax; Tch., Thermochromatium; Tca., Thiocapsa; Tco., Thiococcus; Tcs., Thiocystis * The new taxonomic classification for phototrophic bacteria is according to Imhoff (2001) and abbreviations according to the ‘International Committee on Systematic Bacteriology, Subcommittee on the taxonomy of phototrophic bacteria’. Int. J. Syst. Bact. (1999) 49, 925-926.


139

7.1. Summary HiPIP has recently been shown to function as a soluble mediator in photosynthetic electron transfer between the bc1 complex and reaction center bacteriochlorophyll in some species of purple bacteria, a role traditionally assigned to cytochrome c2. For those species that produce more than one high potential electron carrier, it is unclear which protein functions in cyclic electron transfer and what characteristics determine reactivity. To establish how widespread the phenomenon of multiple electron donors might be, we have studied the electron transfer protein composition of a number of purple bacterial species. Based upon the distribution of electron transfer proteins alone, we found that HiPIP is likely to be the electron carrier of choice in the purple sulfur bacteria in the families Chromatiaceae and Ectothiorhodospiraceae, but the majority of purple nonsulfur bacteria are likely to utilize cytochrome c2. We have identified several new species of purple bacteria that may use HiPIP as electron donor and a few that may use cytochromes c other than c2. We have determined the amino acid sequences of 14 new HiPIPs and have compared their structures. There is a minimum of three sequence categories of HiPIP based upon major insertions and deletions which approximate the three families of purple bacteria and each of them can be further subdivided prior to construction of a phylogenetic tree. The comparison of relationships based upon HiPIP and RNA revealed several discrepancies. 7.2. Introduction High Potential Iron-sulfur Protein (HiPIP) is generally believed to participate in electron transfer reactions similar to those of the c-type cytochromes. HiPIP is a small soluble protein, located in the bacterial periplasmic space, which has a relatively high redox potential comparable to those of the c-type cytochromes. In purple photosynthetic bacteria such as Rhodoferax fermentans, Rubrivivax gelatinosus, Rhodocyclus tenuis, Rhodopila globiformis, Allochromatium vinosum, Marichromatium purpuratum, Ectothiorhodospira vacuolata, and Halorhodospira halophila, HiPIP has been shown to function as mediator between the cytochrome bc1 complex and the membrane-bound tetraheme cytochrome c of the photosynthetic reaction center, although it may not be the only mediator (Hochkoeppler et al, 1995; 1996; Schoepp et al, 1995; Menin et al, 1997; 1998; Osyczka et al, 1999a,b). However, soluble cytochrome c2 was shown to donate electrons to the photoactivated special pair bacteriochlorophyll in the majority of purple nonsulfur bacterial species, either with or without participation of the membrane-bound tetraheme cytochrome c (Pettigrew and Moore, 1987). The interactions of cytochromes c2 with reaction centers appear to be dominated by electrostatic contacts, but the HiPIP - RC interaction is primarily hydrophobic and appears to require the participation of the tetraheme reaction center cytochrome c (Osyczka et al, 1999a,b). Another possible role of HiPIP was found during extensive studies of the thermophilic and chemoorganotrophic bacterium Rhodothermus marinus. HiPIP is associated with the membrane of this bacterium where it acts as an electron carrier between the novel cytochrome bc1 complex and the cytochrome oxidase complex (Pereira et al, 1994; 1999). Such a role of HiPIP in the respiratory chain was also proposed for the facultative photosynthetic bacteria Rhodoferax fermentans and Rhodovibrio salinarum (formerly known as Rhodospirillum salinarum) (Bonora et al, 1999). A role of HiPIP as a ferrous iron-oxidizing enzyme was proposed by Kusano et al (1992) who isolated the enzyme from the chemolithotrophic bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans (formerly known as Thiobacillus ferrooxidans) and identified it as a HiPIP homolog. HiPIPs are found primarily in purple phototrophic bacteria. With the exception of a halophilic


140

Paracoccus sp., the chemolithotrophic Acidithiobacillus ferrooxidans, Ralstonia metallidurans (formerly known as Alcaligenes eutrophus), Ralstonia solanacearum , and the thermophilic Rhodothermus marinus, all the other known HiPIP-containing bacteria are photosynthetic (Bartsch, 1991; Kusano et al, 1992; Perreira et al, 1994). HiPIP contains a single cubane [4Fe-4S] center with 3+ and 2+ as the physiologically accessible oxidation states (Carter et al, 1972). The redox potential ranges from 50 to 500 mV and averages 300 mV (Luchinat et al, 1994; Banci et al, 1995b; Heering et al, 1995). Bacterial ferredoxins have the same iron-sulfur cluster as HiPIPs but they differ in the redox potential (average about -400 mV) and they use the +1 and +2 oxidation states (Carter et al, 1972). In general, HiPIP cannot be reduced to the +1 level and bacterial ferredoxins cannot be oxidized to the +3 level without alteration of the iron-sulfur cluster. It is still uncertain what structural features determine which redox states will be accessible to the iron-sulfur cluster although the degree of hydrogen-bonding and relative exposure to solvent appear to be major contributors (Bentrop et al, 1996; Cowan et al, 1998; Babini et al, 1999). Usually, HiPIP is an abundant protein in soluble cell extracts of purple bacteria in the families Chromatiaceae and Ectothiorhodospiraceae, it is less abundant in the purple nonsulfur bacteria, and isozymes occur frequently. The amino acid sequences of a number of HiPIPs have been published (Dus et al, 1973; Fischer, 1980; Tedro et al, 1974; 1976; 1977; 1979; 1981; 1985a, b; Kusano et al, 1992; Moulis et al, 1993; Ambler et al, 1993b; 1994, 1999; Van Driessche et al, 1997). Besides these published data, there are HiPIP genes in the genomes of Rhodopseudomonas palustris, Ralstonia metallidurans and Ralstonia solanacearum (http://www.jgi.doe.gov/ and Salanoubat et al, 2002). The HiPIP sequences are not highly conserved and it is difficult to align them. Five three-dimensional structures of HiPIPs have been determined by X-ray crystallography and/or NMR, which aid in sequence alignment, but they do not cover the full range of variation (Carter et al, 1974; Freer et al, 1975; Holden et al, 1986; Rayment et al, 1992; Bertini et al, 1993; Banci et al, 1994; Benning et al, 1994; Banci et al, 1995a; Bertini et al, 1995; 1996; 1997; Kerfeld et al, 1998; Nogi et al, 2000). Because HiPIPs are small and the insertions and deletions can be relatively large, it is expected that these insertions and deletions will affect either the redox properties or functional interactions, or both, to a certain degree. Cytochromes c other than c2 have also been implicated in photosynthetic electron transfer. There is at least one instance, in Rhodocyclus tenuis, where a cytochrome c8 may assume the role of electron donor to the reaction center under some conditions (Menin et al, 1998). In Allochromatium vinosum, cytochrome c8 was found to be a good electron donor in vitro (Van Grondelle et al, 1977) although its cellular concentration is only a fraction of that of HiPIP, which would appear to preclude significant participation. Yet another high potential cytochrome was reported in Ach. vinosum (Cusanovich and Bartsch, 1969), but the amino acid sequence has not been reported and, so far, its role in photosynthetic electron transfer is unknown. In the Ectothiorhodospiraceae, HiPIP is generally dominant, but some species do not appear to have any at all, such as Hlr. halochloris and Hlr. abdelmalekii. In these cases, it is likely that a cytochrome c5 homolog rather than c2 or c8 may be the electron donor. In this paper, we report the high potential electron transfer protein compositions and the complete amino acid sequences of 14 HiPIPs from purple phototrophic bacteria and compare them with previously reported sequences. The present study pinpoints the species toward which further research should be directed to understand the structure/function relationship, especially as it relates to the roles of HiPIPs and cytochromes as electron donors to reaction centers.


141

7.3. Materials and Methods 7.3.1. Materials HiPIPs were generally purified by the methods described by Bartsch (1978a) and Meyer (1994). HiPIPs iso-1 and iso-2 from Ectothiorhodospira shaposhnikovii were isolated, purified, and described by Kusche and Trüper (1984) and Allochromatium warmingii by Wermter and Fischer (1983). Thiocystis violacea HiPIP was isolated and purified by Fischer and Meyer (unpublished). The isolation of Rhodobium marinum (formerly known as Rhodopseudomonas marina) HiPIP was described by Meyer et al (1990). Halochromatium salexigens, Ectothiorhodospira vacuolata iso-III, Ectothiorhodospira mobilis iso-I and iso-II, Rhodomicrobium vannielii and Rhodopseudomonas cryptolactis HiPIPs were purified in Tucson. Isochromatium buderi HiPIP was isolated by Bartsch (unpublished). 7.3.2. Removal of iron and modification of the apoprotein The procedure followed for the removal of the iron-sulfur clusters was described by Hong and Rabinowitz (1967). The dried protein was dissolved in 15 mM Tris-HCl, pH 7.2, containing 20-25% trichloroacetic acid. After incubation in an ice-bath for one hour, the precipitated apoprotein was redissolved in water and desalted by ultrafiltration through a Centricon-3 membrane (Amicon, Beverly, MA) with three volumes water. Cysteines were modified to carboxymethyl cysteine (Crestfield et al., 1963), pyridylethyl cysteine (Andrews et al., 1987), or aminopropyl cysteine (Jue et al, 1993). After incubation at 37oC for two to four hours, the excess salts and reagents were removed by ultrafiltration as described above, or by gel filtration through Sephadex SG25 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) equilibrated and eluted with 0.1 M ammonium bicarbonate, pH 7.4. 7.3.3. Enzymatic digestions Digestions or subdigestions with trypsin (Boehringer, Mannheim, FRG), Staphylococcus aureus V8 protease (Boehringer, Mannheim, FRG), Lys-C endoproteinase (Boehringer, Mannheim, FRG or Wako, Osaka, Japan) and/or Asp-N endoproteinase (Boehringer, Mannheim, FRG) were carried out in 50-100 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5-8, for 2-4 hours at 37oC at an enzyme to substrate ratio (mass/mass) of 1/40 to 1/100. 7.3.4. Peptide and protein purifications At an earlier stage of this work, peptides obtained after enzymatic digestions were separated by high performance liquid chromatography on a 214TP54 C4 column (Vydac, Hesperia, CA). The chromatographic equipment consisted of an 870 three-headed piston pump, an 8800 gradient controller, a UV spectrophotometer (DuPont, Wilmington, DE) set at 220 nm, and a Rheodyne injector equipped with a 100 µl loop. The eluted fractions were collected manually at a flow rate of 1 ml/min. At a later stage of the work, peptides were separated on a C18 column (2.1 x 100 mm) using the SMART chromatographic equipment (Pharmacia, Uppsala, Sweden). 7.3.5. N-terminal sequence and amino acid composition analysis Automated N-terminal sequence analysis of peptides were performed on a pulsed liquid phase 477A, 476A and/or 475A sequenator, equipped with an on-line 120A PTH-amino acid analyzer


142

(Applied Biosystems, Foster City, CA). Amino acid composition analyses were performed on a 420A Derivatizer with an on-line 130A PTC-amino acid Separation System (Applied Biosystems). Gas phase hydrolyses were carried out in borosilicate glass tubes of 5 x 55 mm placed in a Pierce hydrolysis vial, using 6N HCl for 20 hours at 106oC. 7.3.6. C-terminal analyses Several techniques were performed to confirm the C-terminal sequence of different HiPIPs. At an earlier stage of this work, different commercially available carboxypeptidases (Boehringer, Mannheim, FRG) were used to cleave the C-terminal residues of native or apoproteins and to analyze the released amino acids at different time intervals on a 420A Derivatizer, equipped with an on-line 130A Separation System. After introduction of biological mass spectrometry in our laboratories, we also analyzed the carboxypeptidase digested native or apoprotein with these techniques to measure the mass of the enzymatically shortened protein. At the later stage of work, the native proteins were subjected to automated C-terminal sequence analysis on the sequenator as described by Samyn et al. (2000). 7.3.7. Mass analyses In the earlier stages of our work, electrospray mass spectrometry was performed on a Bio-Q quadrupole mass spectrometer equipped with an electrospray ionisation source (Micromass, Altrincham, UK). Ten microliters of sample solution in 50% acetonitrile/1% formic acid were injected manually into the 10 µl loop of a Rheodyne injector and pumped to the source at a flow rate of 6 µl/min. The solvent of 50% acetonitrile/1% formic acid was delivered by the 140A Solvent Delivery System (Applied Biosystems, Foster City, CA). At a later stage, all samples were analysed on a hybrid nano-electrospray ionization quadrupole and time of flight (Q-TOF) mass spectrometer (Micromass, Wythenshawe, UK), equipped with an improved Z-nanospray ionization system. Tandem MS fragmentation of blocked and some selected peptides by Collision Induced Dissociation (CID) were performed using argon as the collision gas at a collision energy of 20-40 V. The MS/MS spectra were transformed using the MassLynx Sequence Software supplied with the mass spectrometer. 7.3.8. Overall Sequencing Strategy

As a starting point, we subjected the native HiPIPs to automated N-terminal sequence analysis, for which the sequencer was programmed to identify the maximum number of residues unambiguously in a single run. Mass spectrometric analysis was used to determine the mass of the proteins with and without the iron-sulfur cluster. After these analyses, the iron-sulfur cluster of the proteins was removed and the cysteines modified to a stable derivative for unambigious identification during Edman degradation. We digested the modified apoproteins with two different enzymes, selected according to the number of cleavable basic and acidic residues such as arginines, lysines, aspartic and glutamic acids, obtaining overlaps between different peptides and new sequence information to complete the final primary structure determination. In case of blocked native proteins, the Edman resistant peptide, obtained after chromatographic purification by reversed-phase HPLC, was selected and used for tandem MS fragmentation and amino acid composition analysis. Evidence for the C-terminal sequence of some HiPIPs, at an earlier stage of this work, was obtained after digestion of the native or modified apoproteins with carboxypeptidases, of which the released amino acids, following a time course of incubation, were analyzed by amino acid analysis. The combination of electrospray ionization mass spectrometric analysis and enzymatic digestion with carboxypeptidases on native or modified apoprotein proved to be a powerful tool for confirmation of the C-terminus. At a later stage, we used automated


143

C-terminal degradation to prove the correctness of the C-terminal sequence following the procedure described by Samyn et al. (2000). 7.4. Results 7.4.1. Distribution of redox proteins

Over the years, many species of purple bacteria have been studied with respect to their content of electron transfer proteins (Bartsch, 1978ab; 1991). It has been shown that cytochrome c2 is the principal electron donor to reaction centers in the purple nonsulfur bacteria (Donohue et al, 1988; Knaff et al, 1991). However, it has recently been found that, in some instances, HiPIP and cytochrome c8 can also function in photosynthetic electron transfer instead of cytochrome c2.

From continuating literature data, we have updated the survey reported by Bartsch (1991) concerning available information on high potential electron transfer proteins present in purple phototrophic bacteria that might conceivably function in cyclic electron transfer. In addition, we have surveyed a number of new species with an emphasis on HiPIP .

As can be seen from Table 7.1, there are twice as many purple bacterial species producing

HiPIP than those having cytochrome c2. It is difficult, if not impossible, to prove the absense of a particular redox protein short of having the complete genome sequences available. Thus, it is not certain that the purple sulfur bacteria generally do not have cytochrome c2 since there exist no published genome sequences for these species. It is only in the case of Thermochromatium tepidum, for which there is a preliminary genome sequence (Integrated Genomics), that we can postulate the absense of cytochrome c2. For the four purple nonsulfur bacteria for which partial genome sequences exist, it is likely that HiPIP is absent in three out of the four species (Joint Genome Institute and Integrated Genomics). Three of the four sequenced genomes (see Table 7.1) contain cytochrome c2 isozymes, as well as the well-characterized soluble c2 produced in abundance under phototrophic growth conditions. However, the tetraheme reaction center cytochrome (THRC) and cytochrome c8 are apparently absent in these four species. It is assumed that cytochrome c2 is present in most nonsulfur purple bacteria but we have no definitive evidence for its ubiquitous occurrence. Furthermore, it is not certain that all purple sulfur bacteria contain HiPIP and the tetraheme reaction center cytochrome but, at least, they have been found in nearly all species that have been examined. Therefore, it is likely that HiPIP funtions as principal electron donor to the reaction center in most, if not all, Chromatiaceae and in some purple nonsulfur bacteria.

Table 7.1 . Occurrence of high potential electron carriers in purple and green bacteria that could function in photosynthesis as primary or secondary electron donors to reaction centers. In addition, non-phototrophic species containing HiPIP are also listed. HiPIP THRC C2 C8 C5 C4 Copper Chromatiaceae Allochromatium vinosum + + + + Allochromatium warmingii + Thiocapsa roseopersicina + + + Thiocapsa sp. strain CAU + +


144

Marichromatium gracile + + + Marichromatium purpuratum + + + Thermochromatium tepidum * + + - - - + - Thiocystis violaceae + Isochromatium buderi + Halochromatium salexigens + + + Thiococcus pfennigii + + + Ectothiorhodospiraceae Ectothiorhodospira vacuolata +++ + + Ectothiorhodospira shaposhnikovii ++ + + Ectothiorhodospira mobilis ++ + + Halorhodospira halophila ++ + + Halorhodospira halochloris + + Halorhodospira abdelmalekii + + Rhodospirillaceae Rhodoferax fermentans + + ++ Rubrivivax gelatinosus + + ++ + Rhodocyclus tenuis + + + + Rhodocyclus purpureus + + Rhodovibrio salinarum ++ + Rhodovibrio sodomensis + Rhodopila globiformis + + + Blastochloris viridis + + Rhodomicrobium vannielii + + Rhodopseudomonas acidophila + Rhodobium marinum + + + Rhodocista centenaria + ++ Rhodopseudomonas cryptolactis ++ ++ Rhodopseudomonas palustris * ++ - ++ - - + - Rhodobacter capsulatus * - - +++ - - - + Rhodobacter sphaeroides * - - +++ - - ++ + Rhodovulum adriaticum + Rhodovulum sulfidophilum + + Rhodospirillum rubrum * - - + - - + + Rhodospirillum photometricum + Phaeospirillum molischianum + ++ Phaeospirillum fulvum ++ Chloroflexaceae Chloroflexus aurantiacus* - + - - - - +++ Non-phototrophs Paracoccus sp. + ++ Ralstonia metallidurans * + - - ++ - ++++ - Ralstonia solanacearum * ++ - - +++ ++ ++++ - Acidithiobacillus ferrooxidans * + - - +++ - ++++ + Rhodothermus marinus +

+ Indicates strong evidence for the presence of one, or more (++, +++, ++++) isozymes. A blank space indicates that the gene is not expressed, that there is too little protein to identify, that the protein is located in the membrane making it difficult to prove, or that no attempt has been made to identify it. - Not present, as indicated from nearly complete genome sequences. * Partial genome sequence; when completed, additional components may be discovered. THRC, tetra heme reaction center cytochrome c

Only a few species of nonsulfur purple bacteria such as Rpi. globiformis, Rmi. vannielii, Rbi. marinum , Rps. cryptolactis, and Rps. palustris have both c2 and HiPIP. Therefore, it will be of interest to determine which is the more efficient electron donor. Cytochrome c8 is not very common in purple bacteria, but most of those species containing this hemoprotein possess HiPIP as well. Rcy. purpureus is the only species that apparently has cytochrome c8 but not HiPIP. There are both high and low potential versions of cytochrome c8 in Rvi. gelatinosus that are differentially expressed under photosynthetic and aerobic growth conditions, indicative of different functional roles (Menin et al, 1999).


145

No HiPIP has been detected in Hlr. halochloris or Hlr. abdelmalekii according to Then & Trüper (1983) or by our own survey, but all other Ectothiorhodospiraceae species contain HiPIP isozymes. All three extremely halophilic Halorhodospira species contain a relative of cytochrome c5 which has been called Ectothiorhodospira cytochrome c-551. The cytochrome c5 family of proteins also includes green bacterial cytochrome c-555 and cyanobacterial cytochrome c6. It is conceivable that c5 too could function as electron donor to reaction center.

One of the most commonly encountered cytochromes in genome sequencing projects is

cytochrome c4, a protein that to date appears to be twice as common as cytochrome c2. It occurs in both purple sulfur and purple nonsulfur bacteria, in both monoheme and diheme versions, although its usual membrane location makes it difficult to assess its presence. Tiny amounts are often found in the soluble fraction but, in Ectothiorhodospira species, it appears to be a fully soluble protein. Thus, cytochrome c4 is a potential candidate for photosynthetic electron donor in some species. Chloroflexus aurantiacus is interesting in that the partial genome sequence (Joint Genome Institute) indicates the presence of the tetraheme reaction center cytochrome but the absence of HiPIP or any of the soluble c-type cytochromes (Pierson, 1985) typical of purple or green bacteria. Instead, Chloroflexus contains three small membrane-bound copper proteins, called auracyanin, that are likely candidates to participate in photosynthesis (Van Driessche et al., 1999; Bond et al., 2001). Genome sequences also indicate that Rba. capsulatus, Rba. sphaeroides, and Rsp. rubrum, but not Rps. palustris, contain genes for the blue copper protein pseudoazurin (Joint Genome Instute and Integrated Genomics). It has not been reported as a soluble protein in any of these species but should also be considered as a possible photosynthetic electron donor. 7.4.2. Sequence determination

Following sequencing and mass analysis of peptides obtained after digestion of modified apoprotein by one or two different enzymes, the theoretical calculated mass of the complete amino acid sequence was compared with the measured masses of native or denaturated HiPIPs. For some HiPIPs, electrospray ionization mass spectrometry showed that the protein sample was composed of two different species, of which the B-component differed from the A-component by +14 Da (Rps. cryptolactis), +43 Da (Ect. mobilis iso 1), +111 Da (Rmi. vannielii) and -184 Da (Rbi. marinum). The mass difference of -184 Da corresponds very well with the sum of the theoretical masses of the first two N-terminal residues of the major component (Ile-Ala, 184.Da). The cleaved, but minor, component was also observed during the N-terminal sequence analysis of otherwise native protein. Concerning the other three observed mass differences, they could be explained after tandem mass spectrometric fragmentation of selected peptides that also exhibit the above-mentioned mass differences between the theoretical and calculated masses of peptides after mass screening. Component B from Rmi. vannielii HiPIP corresponds with the mass of an extra pyroglutamic residue (111 Da) at the N-terminus of the protein. Carbamylation at the N-terminus of Ect. mobilis iso-1 and mutation of valine (99 Da) to isoleucine (113 Da) at position 38 of Rps. cryptolactis resulted in a mass increment of 43 Da and 14 Da respectively, as observed during the electrospray ionization mass spectrometric analyses of native protein samples. It is thus likely that Rps. cryptolactis has more than one HiPIP gene. Carbamylation is a rare post-translational modification that was already reported by Lapko and co-workers (2001), but this is the first report for such a post-translational modification at the N-terminus of a prokaryotic electron transport protein (Van Driessche et al, 2002).

7.4.3. HiPIP Sequences


146

In view of the fact that HiPIP may be as important as cytochrome c2 in purple bacterial photosynthesis, although relatively neglected until recently, we have isolated and characterized additional examples. The amino acid sequences of 14 new HiPIPs are shown in Figure 7.1, in comparison with species previously published. They generally fall into three size categories according to which family of purple bacteria they were isolated from. Thus, we have found that all species of Chromatiaceae that have been examined contain HiPIP, that they are of the largest type, and that the sequences are very similar to one another. We have characterized five new species in this family which are fairly typical (from Ach. warmingii, Ich. buderi, Hch. salexigens, Tcs. violaceae, and Thiocapsa sp.). About half the species of Chromatiaceae HiPIP contain a two-residue deletion at position 60-61 (Fig. 7.1 numbering) as determined by comparison of the three-dimensional structures of Ach. vinosum, Tch. tepidum, and Mch. purpuratum (Carter et al, 1974; Kerfeld et al, 1998; Nogi et al, 2000)(Figure 7.2A). This deletion must have occurred more than once, based upon the percentage identities shown in Table 7.2, yet it is located in exactly the same place. Two species, Halochromatium salexigens and Thiococcus pfennigii, contain a single four-residue deletion in the same region as the two-residue deletion of the other species, although it cannot be precisely located at the present time, nor be established whether it is the result of a single event or two sequential events. These two species of HiPIP are also the most divergent on a percentage basis.

The Ectothiorhodospiraceae are interesting in that all but Hlr. halochloris and Hlr.

abdelmalekii contain HiPIP. All species with HiPIP contain from 1 to 3 isozymes, and the sequences contain a three-residue deletion in the same area as the two- and four-residue deletions of the Chromatiaceae. In addition, they contain a six-residue deletion at positions 37 to 42 (Fig. 7.1 numbering) as determined from comparison of the three-dimensional structures of Ach. vinosum, Ect. vacuolata iso-2 and Hlr. halophila iso-1 HiPIPs (Breiter et al, 1991; Benning et al, 1994) (Figures 7.2A and 7.2B). Based upon its size (Pascarella & Argos, 1992), the 6-residue deletion is far more significant than the smaller ones described above, and is not likely to have occurred more than once. It clearly distinguishes the Ectothiorhodospiraceae HiPIPs from those of the Chromatiaceae. We have added five new HiPIPs to this family (Ect. shaposhnikovii iso-1 and iso-2, Ect. mobilis iso-1 and iso-2, and Ect. vacuolata iso-3) and now believe that all Ectothiorhodospira species may contain three or more isozymes. Hlr. halophila is unique in that both isozymes contain additional insertions and deletions beyond those of the family as a whole that define a distinctive subgroup of HiPIPs. Both isozymes have a two-residue insertion between positions 82 and 83, and they have a four-residue deletion at positions 15 to 18 (Fig. 7.1 numbering). Iso-1 HiPIP has a single-residue insertion between positions 27 and 28 (Ach. vinosum numbering, shared with the halophilic Paracoccus HiPIP). Iso-2 HiPIP has an extra-residue deletion in the region of the three-residue deletion shared by the other species. The halophilic Paracoccus HiPIP is most similar to the Ectothiorhodospira HiPIPs but has a seven-residue deletion, whereas the others have a three-residue deletion and may have the four-residue deletion near the N-terminus like those of Hlr. halophila based upon sequence evidence alone.

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1. S A P A N A V A A D D A T A I A L K Y N Q D A T K S E – R V A A A R P G L P P E E Q H C A N C Q F M 2. S A P A N A V S A D D A T A I A L K Y N Q D A T K S E – R V S A A R P G L P P E E Q H C A N C Q F M 3. E A P A N A V A A N D P T A V A L K Y N A D A T K S D – R L A A A R P G L P P A E Q H C A N C Q F H 4. E V P A N A V A A N D P T A I A L K Y N A D A T Q S D – R A A A A R P G L P P E E Q H C A N C Q F H 5. E V P A N A V T E S D P T A V A L K Y H R N A E A S E - R V A A A R P G L P P E E Q H C E N C Q F M 6. V P A N A V T E S D P A A V A L K Y H R D A A E S S - R V A A A R P G L P P E E Q H C E N C Q F M 7. A A P A N A V T A D D P T A I A L K Y N Q D A T K S E – R V A A A R P G L P P E E Q H C A N C Q F M 8. E A P A N A V T M D D P T A Q A L K Y H P S A A D S D - R V A A A R P G L P P E E Q H C A N C N F M 9. E V P A D A V T E S D P T A V A L K Y H R N A A E S E – R V A A A R P G L P P E E Q H C E N C Q F M 10. Q D L P H V D P A T D P T A Q A L K Y S E D A A N A D – R A A A A R P G K P P E E Q F C H N C Q F V 11. E D L P H V D A A T N P I A Q S L H Y I E D A N A S E – R N P V T K T E L P G S E Q F C H N C S F I 12. A A P L V A E T D A N A K S L G Y V A D T T K A D – K T K Y P K - - - H T K D Q S C S T C A L Y 13. R A A N P M V A R T D O Q A A A L G Y K A D T T K V D – Q A K Y P K - - - H A P D Q H C G N C A L Y 14. A P V D E K N P Q A V A L G Y V S D A A K A D – K A K Y K Q - - - F V A G S H C G N C A L F 15. D G K A E A Q T T A K L D E K D P Q A V A L G Y K H D T S K V D – K A K F A K - - - H D V S Q K C S N C Q L Y 16. A E R L D E N S P E A L A L N Y K H D G A S V D – H P S - - - - - - H A A G Q K C I N C L L Y 17. M E R L S E D D P A A Q A L E Y R H D A S S V Q – H P A - - - - - - Y E E G Q T C L N C L L Y 18. A E R L D P N S A Q A K A M S Y V E N A S D S T – T S A - - - - - - Y Y E G H N C A N C L M F 19. A E K L E E S S A E A K A L S Y V H D A T T S G – H D S - - - - - - Y Q E G Q K C I N C L L Y


147

20. A E L E R L S E D D A T A Q A L S Y T H D A S G V T – H D S - - - - - - Y Q E G S R C S N C L L Y 21. A E R L D E N A P E A Q A L N Y K H D N T S V D – H P S - - - - - - H A D G Q K C I N C L L Y 22. M E R L S E D D P A A Q A L E Y R H D A S S V Q – H P A - - - - - - Y E D G Q T C L N C L L Y 23. Q D L P P L D P S A E Q A Q A L N Y V K D T A E A A D H P A - - - - - - H Q E G E Q C D N C M F F 24. E P R A E D - - - - G H A H D Y V N E A A D A S G H P R - - - - - - Y Q E G Q L C E N C A F W 25. G L P D G V E D L P K A E D - - - - D H A H D Y V N D A A D T D – H A R - - - - - - F Q E G Q L C E N C Q F W 26. G T N - - - A S M R K A F N Y Q E V S K T - - - - - - - - - - - - - - A G K N C A N C A Q F 27. G T N - - - A A M R K A F N Y Q D T A K - - - - - - - - - - - - - - - N G K K C S G C A Q F 28. D - - - S G N R A M L H Y Q D S P K - - - - - - - - - - - - - - - D G K R C A D C T A F 29. Q - - - K A P K Q A V Q Y Q E N P K - - - - - - - - - - - - - - - G D Q H C A N C Q F G 30. Q D - - - K I D P K M V Q Y Q D S P K - - - - - - - - - - - - - - - D G N K C S T C V N F 31. N A Q V T K - - - K A S H K D A G Y Q E S P N - - - - - - - - - - - - - - - G A K R C G T C R Q F 32. S A V I P R - - - K S S Q Q D A R F A A T A T - - - - - - - - - - - - - - - S G R R C G S C R F Y 33. Q V A K - - - K A A Q S A V G Y Q G S P N - - - - - - - - - - - - - - - S G K H C A L C Q H F 34. I A N - - - K A K Q A I A G Y Q T T P K - - - - - - - - - - - - - - - G R Q E C D N C R H F 35. K M S Q K A V A Y Q D T P L - - - - - - - - - - - - - - - G D K T C D T C S N W 36. D A G - - - S M P K A A V Q Y Q D T P K - - - - - - - - - - - - - - - G K D H C S V C A Q F 37. G - - - T T P K A E V Q Y Q P H P K - - - - - - - - - - - - - - - G K A Q C S V C A N F 38. M Q C N N C R F F 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 1. Q A D A A G A T D E W K G C Q L - - - - - - - - - - - - F P G K – L I N V N G W C A S W T L K A G 2. Q A D A A G A T D E W K G C Q L - - - - - - - - - - - - F P G K – L I N V N G W C A S W T L K A G 3. L D D V A G A T E E W H G C S L - - - - - - - - - - - - F P G K – L I N V D G W C A S W T L K A G 4. L P D V A G A T E E W H G C S L - - - - - - - - - - - - F P G K – L I N V N G W C A S W T L K A G 5. L P D Q - - G A D E W R G C S L - - - - - - - - - - - - F P G K - L I N L D G W C A S W T L R A G 6. N P D S - - A A A D W K G C Q L - - - - - - - - - - - - F P G K – L I N L S G W C A S W T L R A G 7. Q A N V - - G E G D W K G C Q L - - - - - - - - - - - - F P G K – L I N V N G W C A S W T L K A G 8. Q A D V - - G E G D Y K G C Q L - - - - - - - - - - - - F P G K – L I N V N G W C A S W T L K A G 9. L P D Q - - G A D E W R G C S L - - - - - - - - - - - - F P G K – L I N L N G W C A S W T L R A G 10. L A D - - - - S G E W R P C S L - - - - - - - - - - - - F P G K – A V H E T G W C A S W T L K A G 11. Q A D - - - - S G A W R P C T L - - - - - - - - - - - - Y P G Y – T V S E D G W C L S W A H K T A 12. Q G K - - - - T A P Q G A C P L - - - - - - - - - - - - F A G K – E V V A K G W C S A W A K K A 13. Q G G - - - - T A A Q G G C P L - - - - - - - - - - - - F A G K – D V A N K G W C S A W A K K A 14. Q G K - - - A T D A V G G C P L - - - - - - - - - - - - F A G K – Q V A N K G W C S A W A K K A 15. Q G K - - - P G D A W G P C P I - - - - - - - - - - - - F A G K – Q V S A N G W C N S Y V K K A 16. T D P - - - S A T E W G G C A V - - - - - - - - - - - - F P N K – L V N A N G W C T A Y V A R G 17. T D A - - - S A Q D W G P C S V - - - - - - - - - - - - F P G K - L V S A N G W C T A W V A R 18. S D P - - - S Q A E W G P C A V - - - - - - - - - - - - F P G K – L V A A G G W C N A W V T R G 19. T D P - - - S Q E E W G G C A V - - - - - - - - - - - - F P G K – L V N A N G W C T A Y V A R G 20. S N P - - - D A K D W G P C S V - - - - - - - - - - - - F P K H – L V A E G G W C T A W V G R G 21. T D P - - - S A T E W G G C A V - - - - - - - - - - - - F P N K – L V N A N G W C T A Y V A R G 22. S D A - - - S A Q D W G P C S V - - - - - - - - - - - - F P G K – L V S A N G W C T A W V A R 23. Q A D - - - - - - - S Q G C Q L - - - - - - - - - - - - F P Q N – S V E P A G W C Q S W T A Q N 24. G E A - - - V Q D G W G R C T H - - - - - - - - - - P D F D E V – L V K A E G W C S V Y A P A S 25. V D Y - - - - V N G W G Y C Q H - - - - - - - - - - P D F T D V – L V R G E G W C S V Y A P A 26. I P G A - - S A S A A G A C K V - - - - - - - - - - - - I P G D S Q I Q P T G Y C D A Y I V K K 27. V P G A - - S P T A A G G C K V - - - - - - - - - - - - I P G D N Q I A P G G Y C D A F I V K K 28. K P G A – E S A P D T G T C K V - - - - - - - - - - - - I G G P - - V S P N G W C M A F S P R 29. I A P E - - G G S E M G Q C Q I - - - - - - - - - - - - V Q G E - - I S P D A W C N L W A K A 30. E A P - - - - - - - - S S C K I - - - - - - - - - - - - V A G K - - I S P N G W C I A Y A P M E D K K G 31. R P P - - - - - - - - S S C I T - - - - - - - - - - - - V E S P - - I S E N G W C R L Y A G K A 32. Q A P - - - - - - - - N Q C L V - - - - - - - - - - - - V E G P - - V S A D S V C N L W A Q R G G 33. Q A P - - - - - - - - S S C R V - - - - - - - - - - - - V E G T - - I S P N G Y C K I F S K K G 34. Q A P - - - - - - - - D A C K V - - - - - - - - - - - - V Q G T - - I S P K G W C R L Y A K K 35. R P P - - - - - - - - N G C A T - - - - - - - - - - - - V E G E - - I A P K G Y C R I F V L K R 36. I A P - - - - - - - - H S C K V - - - - - - - - - - - - V A G N - - I S P N G W C V A F V P K S A 37. I A P - - - - - - - - K C C K V - - - - - - - - - - - - V A G P - - V A P D G Y C I A F T P M P A 38. H A A - - - - - - - Q T Q C R R Y A P Q P T A D A K N A H W P I - - V S A N D W C G E Y Q P A D K A A A T A

Fig. 7.1 . HiPIP sequence comparisons. 1) Ach. vinosum, 2) Ach. warmingii, 3) Tca. roseopersicina , 4) Thiocapsa sp., strain CAU, 5) Mch. gracile, 6) Mch. purpuratum,7) Tch. tepidum, 8) Tcs. violaceae, 9) Ich. buderi,10) Hch. salexigens, 11) Tco pfennigii, 12) Rfx. fermentans, 13) Ral. solanacearum iso-1 14) Rvi. gelatinosus, 15) Ral. metallidurans, 16) Ect. vacuolata iso-1, 17) Ect.vacuolata iso-2, 18) Ect. vacuolata iso-3, 19) Ect. mobilis iso-1, 20) Ect. mobilis iso-2, 21) Ect. shaposhnikovii iso-1, 22) Ect. shaposhnikovii iso-2, 23) Paracoccus sp., 24) Hlr. halophila iso-1, 25) Hlr. halophila iso-2, 26) Rcy. tenuis 3761, 27) Rcy. tenuis 2761, 28) Ral. solanacearum iso-2 29) Rhv. salinarum iso-1, 30) Rpi. globiformis, 31) Rps. palustris iso-1, 32) Rps. palustris iso-2, 33) Rmi. vannielii , 34) Rbi marinum, 35) Rps. cryptolactis, 36) Atb. ferrooxidans strain Fe1 , 37) Atb. ferrooxidans strain 23270 (genome), 38) Rhv. salinarum iso-2. Minimal insertions and deletions are placed according to comparison of the available three-dimensional structures shown in Figure 7.2. Highly conserved residues are boldfaced.


148

Ach. vinosum - Mch. purpuratum - Ect. vacuolata iso 2

Mch. purpuratum - Ect. vacuolata iso 2 - Hlr. halophila iso 1

Mch. purpuratum - Ect. vacuolata iso 2 - Rcy. tenuis

deletion 60-61deletion 59-61

deletion 37-42

insertion 82-83

insertion 33

deletion 15-18

deletion 13-15

deletion 30-44

deletion 60-61

insertion 88

A

B

C

Figure 7.2. Panel A shows the structure of Ach. vinosum (black), superimposed upon the structures of Mch. purpuratum (red) and Ect. vacuolata iso-2 (blue). Panel B, the structures of Mch. purpuratum (red) and Ect. vacuolata iso-2 (blue) were superimposed upon the structure of Hlr. halophila iso-1 (black) In Panel C, the Rcy. tenuis structure (black) was superimposed upon the structures of Mch. purpuratum (red) and Ect. vacuolata iso-2 (blue). Significant insertions and deletions discussed in the text and shown in Figure 1 are indicated.


149

HiPIPs from the purple nonsulfur bacteria group into two major sequence categories based upon insertions and deletions. Those from Rubrivivax gelatinosus and Rhodoferax fermentans, plus the non-phototrophic Ralstonia metallidurans and Ralstonia solanacearum iso-1, contain a three- to four-residue deletion in the same region as the two- to four-residue deletions of the Chromatiaceae but, in addition, they contain a three-residue deletion in the vicinity of positions 34 to 36 of Ach. vinosum HiPIP (40 to 42 in Fig. 7.1). These gaps cannot be placed more precisely because of the lack of a three-dimensional structure, but the three-residue deletion appears to be in the same location as the six-residue deletion in the proteins from the Ectothiorhodospiraceae. Thus, these four HiPIPs define a subgroup that appears to be intermediate between those of the Chromatiaceae and the Ectothiorhodospiraceae, although slightly closer to those of the Chromatiaceae. The majority of HiPIPs from the purple nonsulfur bacteria, of which we have characterized four new examples (Rmi. vannielii, Rbi. marinum , and Rps. cryptolactis iso-1 and iso-2), generally share two rather large deletions, one of thirteen residues between positions 30 and 44 (Fig. 7.1 numbering) and another of eight based upon comparison of the three-dimensional structures of Mch. purpuratum and Rcy. tenuis HiPIPs (Rayment et al, 1992) (Figure 7.2C). The second deletion of eight residues between positions 59 and 66 cannot be precisely placed because of the lack of a three-dimensional structure for the smallest proteins. The Rcy. tenuis and Rhodovibrio salinarum iso-1 proteins have a two-residue deletion and the Ral. solanacearum iso-2 has a single-residue deletion rather than the eight-residue deletion present in most species, which defines an intermediate but distinct subgroup. The thirteen- and eight-residue deletions are quite unusual and clearly set the majority of purple nonsulfur bacterial HiPIPs apart from the other two families. Rcy. tenuis appears to have a three-residue deletion near the N-terminus (at positions 13 to 15) which may be shared by some of the other HiPIPs, but because of its position near the N-terminus, it is hard to be certain whether it is real. Rcy. tenuis also has a single-residue insertion between positions 69 and 70 of the Ach. vinosum sequence. The new HiPIPs from Rps. cryptolactis, Rbi. marinum, and Rmi. vannielii are typical of the group as a whole. The two Rps. palustris HiPIP genes, discovered as a result of genome sequencing (Joint Genome Institute), both conform to the pattern of small HiPIPs. However, the Ral. solanacearum HiPIPs (Salanoubat et al, 2002) fall into two different categories based upon insertions and deletions that suggest that one was acquired by gene transfer or that the smaller HiPIPs in our group VI were directly derived from those in group II through duplication and divergence.

The most unusual HiPIP is the Rhodovibrio salinarum iso-2 in which the N-terminal 40

residues have been deleted and 12 residues inserted in the region of positions 72-83 (Ambler et al, 1999). It has a seven-residue deletion in the same region as the eight-residue deletion of most of the other small HiPIPs. Rhodovibrio salinarum iso-2 HiPIP has a very high potential of 500 mV and the iron-sulfur cluster decomposes when oxidized, probably as a result of the large reduction in protein size that is likely to increase exposure of the cluster to solvent.

The percentage identities among the HiPIPs were calculated based upon the alignment of Figure

7.1 as shown in Table 7.2. The most significant numbers are highlighted and these data were in turn used to construct an evolutionary tree as shown in Figure 7.3. Both percentage identities as well as insertions and deletions were separately taken into account in tree construction. Halochromatium salexigens and Thiococcus pfennigii, both from group I, share a gap of four residues and are 55% identical to each other. However, Hch. salexigens is 60% identical to the other species from group I and Tco. pfennigii is only 40% identical to the others. Since these values are based on an average of 9 and 10 species respectively, they are more significant than the 55% identity. The same conclusion was arrived at for Rhodocyclus tenuis, Ralstonia solanacearum iso-2 and Rhodovibrio salinarum iso-1.


150

The observation that Rcy. tenuis HiPIPs have significantly less percentage identity to the group VI HiPIPs than do Rhv. salinarum iso-1 and Ral. solanacearum iso-2, but that the latter have similar insertions and deletions as Rcy. tenuis, suggest that the 8-residue deletion at 59-66 is less significant.

For group I, the nearest neighbors of Thiocystis violaceae are Thermochromatium tepidum, Allochromatium vinosum and Allochromatium warmingii at 80% (rms = ±3%) whereas Thiocapsa roseopersicinia and Thiocapsa sp., strain CAU, connect to the above group at 78% (rms.= ±4%). Because the errors of 3 and 4% are larger than the difference in the branch lengths, the values of 78% and 80% were averaged to 79%, and Tcs. violaceae and Tca. roseopersicinia-Thiocapsa sp. should be considered equidistant from the Ach. vinosum - Ach. warmingii - Tch. tepidum group. The same conclusion was also reached for the species of group V-VI: Rhodomicrobium vannielii, Rhodobium marinum and Rhodopseudomonas palustris iso-1 should be considered equidistant because the differences in branch lengths are smaller than the errors. Table 7.2. Percentage identities of HiPIP according to the alignment of Figure 7.1.

Ach. vinosum 97 Ach. warmingii 89 88 Tch. tepidum 78 77 85 Tcs. violacea 81 78 77 72 Tca. roseopersicina 82 80 78 73 91 Tca. sp., strain CAU 72 71 72 73 71 75 Ich. buderi 72 71 72 72 73 75 95 Mch. gracile 73 72 74 74 70 72 85 84 Mch. purpuratum 59 58 59 59 62 64 60 59 56 Hch. salexigens 40 38 40 38 40 38 36 38 33 55 Tco. pfennigii 36 35 32 29 36 35 27 27 29 31 29 Rfx. fermentans 35 38 38 35 42 40 31 31 34 34 31 74 Ral. solanacearum 1 38 38 35 35 41 38 35 34 36 35 30 57 67 Rvi. gelatinosus 36 36 36 32 36 36 36 35 35 38 32 51 55 57 Ral. metallidurans 32 33 32 32 38 36 38 35 36 31 22 32 39 37 48 Ect. vacuolata 1 33 35 33 32 38 38 36 35 35 31 24 33 41 34 48 93 Ect. shaposhnikovii 1 40 42 38 33 39 40 40 39 39 31 25 36 34 34 42 73 73 Ect. mobilis 1 37 37 39 38 37 38 41 39 42 39 31 32 37 35 48 65 66 62 Ect. vacuolata 2 35 35 38 37 37 37 39 38 41 38 31 33 37 34 48 64 66 59 97 Ect. shaposhnikovii 2 32 35 32 31 30 30 32 32 32 34 26 29 33 32 39 53 54 58 66 66 Ect. mobilis 2 35 33 32 32 35 35 35 35 33 32 25 29 28 35 35 51 50 61 52 52 54 Ect. Vaculata 3 37 35 35 38 31 33 35 32 38 38 30 29 31 39 34 35 38 35 36 33 32 33 Paracoccus sp. 24 24 28 26 21 23 28 26 28 26 22 27 25 33 25 30 31 38 35 33 31 34 32 27 27 27 30 27 28 27 25 31 30 22 25 28 24 31 33 30 38 31 30 21 30 35 22 22 21 21 22 22 21 21 21 22 20 22 25 29 20 29 30 30 25 25 23 33 25 24 24 21 21 21 23 21 21 21 19 19 24 27 32 22 28 30 32 24 24 28 33 25 21 21 21 23 17 25 23 21 23 20 24 24 25 25 23 32 32 32 36 37 30 32 23 19 19 19 21 17 15 15 17 17 19 21 23 28 25 21 19 19 21 19 20 23 25 23 26 26 26 26 25 26 23 21 21 21 23 25 25 28 28 26 25 28 27 26 25 28 23 22 22 22 24 19 20 20 19 19 20 22 28 23 26 31 26 28 30 25 27 21 26 21 33 33 31 31 25 27 24 22 24 20 24 22 24 27 27 22 22 26 24 24 22 27 22 30 30 28 28 25 25 23 23 23 23 28 32 32 30 27 23 23 26 23 23 21 25 25 35 35 33 33 32 30 32 33 28 31 31 25 29 25 32 21 23 25 25 25 23 32 25 22 22 20 22 18 22 20 18 18 20 24 25 23 24 21 18 19 22 16 16 22 22 15 24 24 24 24 24 25 24 24 24 20 18 24 26 24 17 22 22 25 20 20 20 25 20 20 20 20 20 20 18 16 18 16 20 29 24 25 24 22 22 25 27 27 27 27 27 22 24 24 24 24 19 22 22 19 19 24 27 22 24 22 32 28 28 28 36 31 19 25 31


151

Hlr. halophila 1 75 Hlr. halophila 2 20 19 Rcy. tenuis 3761 19 19 74 Rcy. tenuis 2761 21 21 44 44 Ral. solanacearum 2 18 17 32 36 39 Atb. ferrooxidans 23270 22 19 38 43 45 66 Atb. ferrooxidans Fe1 22 22 32 36 47 47 53 Rpi. globiformis 16 18 33 35 39 34 45 43 Rmi. vannielii 22 22 36 34 33 36 47 42 51 Rbi. marinum 25 29 30 23 25 39 47 42 43 51 Rhv. salinarum 1 16 18 31 29 33 25 36 43 50 47 35 Rps. palustris 1 17 16 32 41 28 35 43 37 45 41 35 45 Rps. cryptolactis 19 18 15 16 24 23 21 23 31 36 35 33 25 Rps. palustris 2 34 31 19 14 24 25 28 31 31 31 31 28 11 28 Rhv. salinarum 2


152

Rfx. fermentans

Rvi. gelatinosus

Ral. metallidurans

I

II

III

IV

V

three - residue deletion at positions 40-42

extend ed deletions at 30-36,42-43 and 59-66, and insertionat 88 for Rc. tenuis

Ect. vacuolata i so 1

Ect. vacuolata iso 2

Ect. vacuolata iso 3

Ect. shaposnikovii iso 1

Ect. shaposnikovii iso 2

Ect. mobilis iso 1

Ect. mobilis iso 2

Paracoccus sp.

Hlr . halophila iso 1

Hlr . halophila i so 2

Rcy. tenuis 2761

Rcy. tenuis 3761

Rhv. salinarum iso 1

deletion at positions 37-39, extra deletion for Paracoccus sp. at positions 62-65

insertion at positions 33 and 82-83

VI

VII

Rbi. marinum

Rmi. vannielii

Rps. cryptolactis

Rps. palustris iso 1

Rps. palustris iso 2

Rhv. salinarum iso 2

deletion of N-terminal region and insertion at positions 72-83

At b. ferrooxidans 23270

Rpi. globiformis

At b . ferrooxidans Fe1

Ral. solanacearum iso 1

Ral. solanacearum iso 2

Tco. pfennigii

Hch. salexigens

Mch. purpuratum

Mch. gracile

Ich. buderi

Tca. roseopersicina

Tca. sp., strain CAU

Tcs. violacea

Tch. tepidum

Ach. vinosum

Ach. warmingii

9788

91

9584

79

72

2-4 residue deletion at positions 59-62

59

40

7462

54

33

9373

9766

75

61

53

74

6650

44

49

42

32

24

38

Figure 7.3. Neighbor-joining evolutionary tree for HiPIP from the data in Table 7.2 and on insertions and deletions. The separation of species according to the occurrence of significant shared insertions and deletions is indicated by horizontal dashed lines. When the rms deviation (3%) was larger than the difference between groups, they were combined and averaged.


153

7.5. Discussion 7.5.1. Electron transfer protein distribution With the growing interest in alternative electron donors to photosynthetic reaction centers, it is appropriate to establish which high potential electron carriers in purple bacteria might conceivably interact with reaction centers. As shown in Table 7.1, all of the species of the Chromatiaceae that have been examined contain HiPIP. Our own experience indicates that it is one of the most abundant of the soluble electron carriers. Most, if not all species have the membrane-bound tetraheme reaction center cytochrome c as well. On the other hand, soluble high potential cytochromes have not been characterized in many species of Chromatiaceae, perhaps because they are much less abundant than is HiPIP. These findings are consistent with the observation that the HiPIP gene in Allochromatium vinosum is essential and cannot be inactivated (Brüser et al, 1997). HiPIP is probably the preferred electron donor to reaction centers under most conditions, as shown for Ach. vinosum and Mch. purpuratum (Menin et al, 1998). It has been demonstrated that a small soluble cytochrome c-551 can donate electrons to reaction centers in Ach. vinosum (Van Grondelle et al, 1977), and we have identified this protein as a cytochrome c8 through previous sequence determination (Samyn et al, 1996). It is relatively closely related to the prototypic cytochrome c8 from Pseudomonas aeruginosa. Marichromatium purpuratum is the only other species of purple sulfur bacteria that has been reported to have a cytochrome c8 (Kerfeld et al, 1996). A high potential cytochrome c extracted from Ach. vinosum membranes with acetone (Cusanovich and Bartsch, 1969) is a diheme cytochrome c4 (unpublished results) related to the prototypic cytochrome c4 from Azotobacter vinelandii (Ambler et al, 1984). We have observed small quantities in the soluble fraction of several other species of purple sulfur bacteria based upon spectral analysis as shown in Table 7.1. It is thus possible that both cytochromes c4 and c8 could function in photosynthesis under some conditions. Unlike the Chromatiaceae, we found HiPIP in only four out of six Ectothiorhodospiraceae species examined as shown in Table 7.1. However, HiPIP is abundant in these four species. There are two major components and one or more minor forms of HiPIP in each. We have determined the sequences of the major HiPIPs and of a minor component as well. The differences among the Ectothiorhodospira HiPIP sequences and redox potentials are large enough to suggest that they may have different functional roles, although it is unclear which of the HiPIP isozymes may function in photosynthesis. The work of Menin et al (1998) suggests that it is the higher potential iso-1 HiPIP in Ect. vacuolata that mediates electron transfer to the reaction center. There are soluble cytochromes in the Ectothiorhodospiraceae, but we have found that the protein from Ect. vacuolata is like the Ach. vinosum cytochrome c4 and that the Hlr. abdelmalekii protein is like the Hlr. halophila and Hlr. halochloris c-551 (unpublished results). The Halorhodospira c-551 proteins are part of the greater cytochrome c5 family (prototype from Azotobacter vinelandii) related to Chlorobium cytochromes c-555 and to cyanobacterial cytochromes c6 (Ambler et al, 1993a). Considering the apparent absence of HiPIP in Hlr. halochloris and Hlr. abdelmalekii, it is likely that the cytochrome c5 homolog may function as electron donor to reaction centers, although it is unclear what may be the role of this cytochrome in Hlr. halophila. A cytochrome does appear to be an electron donor in Hlr. halophila, although the c5 homolog has a potential to be an effective mediator


154

(Menin et al, 1998). Judging by the strong similarity between Ect. shaposhnikovii, Ect. vacuolata, and Ect. mobilis HiPIPs, it is likely that the high potential cytochromes from Ect. shaposhnikovii and Ect. mobilis will be like the cytochromes c4 from Ect. vacuolata and Ach. vinosum. A difference is that the Ectothiorhodospira cytochromes c4 are more abundant in the soluble fraction than is the Ach. vinosum protein.

The purple nonsulfur bacteria are quite different from the purple sulfur bacteria in that HiPIP was

found in only 10 out of 22 species examined and cytochrome c2 was present in 16 species. Five species have both HiPIP and c2 (Rmi. vannielli, Rbi. marinum, Rpi. globiformis, Rps. cryptolactis, and Rps. palustris). The Rps. palustris HiPIP isozymes are not normally expressed as soluble proteins during photosynthetic growth according to our analysis, and the Rmi. vannielii and Rps. cryptolactis HiPIPs are minor components. This leaves Rbi. marinum and Rpi. globiformis HiPIPs as major soluble constituents comparable in concentration to cytochrome c2 and, therefore, to be candidates for electron donor to the reaction center. HiPIP has in fact been found to function as photosynthetic mediator in Rpi. globiformis, but not in Rhodobium marinum (Menin et al, 1998). HiPIP has not yet been found in the Rba. capsulatus, Rba. sphaeroides, or Rsp. rubrum preliminary genome sequences and is likely to be absent. We have not yet found a cytochrome c2 in Rhodovibrio salinarum although there are small quantities of a high potential cytochrome that aggregates and has not yet been completely purified. It cannot be positively identified without sequence data. Unless the minor soluble cytochrome is a major membrane protein, it is most likely that Rhodovibrio salinarum HiPIP is the electron donor to the reaction center. Cytochrome c2 isozymes have been found in the nonsulfur purple bacteria, including membrane-bound forms which were found to function in photosynthesis under some conditions (Jenney et al, 1994).

Four species of purple nonsulfur bacteria that are particularly interesting, because a cytochrome

c8 is present instead of the more common cytochrome c2, are Rvi. gelatinosus, Rfx. fermentans, Rcy. tenuis, and Rcy. purpureus. It has been shown that Rvi. gelatinosus and Rfx. fermentans HiPIPs can function in photosynthesis (Hochkoeppler et al, 1995, 1996; Schoepp et al, 1995; Osyczka et al, 1999ab). A low-potential c8 was previously characterized in Rvi. gelatinosus (Ambler et al, 1979a, b) and a high-potential c8 in Rfx. fermentans (Hochkoeppler et al, 1997). More recently, it has been shown that Rvi. gelatinosus can make both high- and low-potential c8 isozymes, the former under aerobic and the latter under anaerobic photosynthetic conditions (Menin et al, 1999). It thus appears that HiPIP is likely to be the major electron donor to reaction centers in Rvi. gelatinosus and Rfx. fermentans. Rcy. tenuis c8 and HiPIP have both been shown to be electron donors to the photosynthetic reaction center (Menin et al, 1997). The Rcy. tenuis HiPIP is as abundant as the c8 and the ambient redox potential appears to determine which of the two is functional at any time. Rcy. purpureus does not appear to have either HiPIP or cytochrome c2, thus the c8 is most likely to function in photosynthesis.

7.5.2. HiPIP sequence comparisons We have shown that HiPIP sequences can be divided into three major groups on the basis of shared insertions and deletions which generally correspond to the three families of purple bacteria. Each of these three groups can be further subdivided by the same criteria, resulting in seven distinct subgroups of HiPIP that are consistent with other electron transfer characteristics (see Table 7.1). Ribosomal RNA has been u sed in the past to determine phylogenetic relationships among the purple

16S rRNA HiPIP +--- Ect. vacuolata ---+


155

+--¦ +--+ ¦ +--- Ect. shaposhnikovii ---+ ¦ +-----¦ +-----+ ¦ +------ Ect. mobilis ------+ ¦ +-----¦ +--------+ ¦ +------------ Hlr. halophila ------------+ ¦ ¦ ¦ ¦ +--- Ach. vinosum ---+ ¦ ¦ +--¦ +--+ ¦ ¦ ¦ +--- Ach. warmingii ---+ ¦ ¦ +--¦ +--¦ +--+ ¦ ¦ ¦ ¦ +------ Tch. tepidum ------+ ¦ ¦ ¦ ¦ +--¦ +--+ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------- Tcs. violacea ---------¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +------------ Tca. roseopersicina ---------+ ¦--+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--+ ¦ +--¦ +--- Mch. purpuratum ------+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------¦ +-----+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--- Mch. gracile ---+ ¦ ¦--+ ¦ ¦ ¦ +--¦ ¦--+ ¦ ¦ ¦ ¦ +--¦ ¦ +--------- Ich. buderi ---+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--¦ ¦ ¦--¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +------ Hch. salexigens ---------------+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +------ Tco. pfennigii ------------------+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--- Ral. metallidurans ---------------+ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--- Ral. solanacearum ---------+ ¦-----+ ¦ ¦ ++ ¦ +--+ ¦ ¦ +-+---------¦ +--------- Rfx. fermentans ---------+ +--+ ¦ ¦ ++ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--+--------- Rvi. gelatinosus ------------+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +--------- Rcy. Tenuis ------------+ ¦ ¦ ¦ ¦--+ ¦ ¦ +--------------------- Atb. ferrooxidans ---------+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦--+ ¦ ¦ ¦ +--------- Rpi. globiformis ---------+ +--------+ ¦ +-----¦ ¦ ¦ ¦ +--------- Rhv. salinarum ------------+ ¦ +--------¦ +--+ ¦ +--------- Rps. palustris ---------+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +-----+--------- Rmi. Vannielii ---------+--+ ¦ ¦ +--------- Rbi. marinum ---------+

Figure 7.4. A classification of species based upon our own analysis of rRNA data compiled in http://rrna.uia.ac.be, Imhoff et al, 1998 and Kelly et al, 2000) compared and contrasted with divisions based upon the HiPIP tree in Figure 7.3. Species which are connected differently based on analysis of the two molecules are boldfaced. These regions of disagreement are indicated by double lines. photosynthetic bacteria, including those in the current study (Imhoff et al, 1998). One should observe


156

the same results whether using HiPIP or RNA; thus the two are in agreement concerning the relationships among the Ectothiorhodospiraceae, as shown in Figure 7.4. There is also fairly good agreement among the Chromatiaceae, except for the position of Tco. pfennigii and Hch. salexigens with respect to the other species. Our HiPIP data clearly show that they are the most divergent of the Chromatiaceae both in terms of insertions and deletions and in percentage identity, but in the RNA tree they are connected to the Mch. gracile/Mch. purpuratum/Ich. buderi branch. The relationship of Ich. buderi to the other two species also differs in that the HiPIP is most similar to that of Mch. gracile, but the RNA is more like Tco. pfennigii and Hch. salexigens. This deserves further study.

Another difference between HiPIP and RNA is in the position of Rvi. gelatinosus and Rfx.

fermentans with respect to Rcy. tenuis. In RNA trees, all three species are on the same branch, but Rcy. tenuis HiPIP groups with the majority of the purple nonsulfur bacteria and the Rvi. gelatinosus/Rfx. fermentans pair branches nearer to the Chromatiaceae. In this case, it is plausible that a small HiPIP gene may have been transferred to Rcy. tenuis from a species containing a small HiPIP gene. A similar situation exists with Acidithiobacillus ferrooxidans whose RNA appears to be similar to those of Chromatiaceae according to Kelly et al (2000), but the HiPIPs are like those of the majority of purple nonsulfur bacteria. The HiPIPs from different strains of Atb. ferrooxidans are only about 66% identical (Kusano et al, 1992; The Institute for Genome Research) but the small copper protein rusticyanin is 92-98% identical in the same strains (Bengrine et al, 1998). The comparison of additional proteins or genes will be required to resolve these discrepancies. 7.5.3. Conserved residues The HiPIPs have no absolutely conserved residues besides the four cysteines required to bind the four-iron four-sulfur cluster. There are only a few positions that are highly conserved, such as tyrosine 24 (Fig. 7.1 numbering), glycine 94, and tryptophans 95 and 99. Rps. palustris iso-2 is the only HiPIP in which Tyr 24 has been substituted (by a Phe). Rhodovibrio salinarum iso-2 is missing the whole N-terminus, including Tyr 24. The function of Tyr 24 has been studied by mutagenesis, which shows that it has three important roles: in shielding the iron-sulfur cluster from solvent, in forming H-bonds to backbone and side chains, and through electrostatic interactions with the cluster (Iwagami et al., 1995, Agarwal et al. 1995). The Phe and Trp mutants were found to be relatively stable whereas other substitutions resulted in marked instability, particularly for the oxidized form. The function of the second most highly conserved residue, glycine at position 94, is not as well defined, although the lack of a side chain appears to be due to structural constraints imposed by its interaction with Tyr 24 (Benning et al, 1994). It is substituted in Rps. palustris iso-2 by Ser, in Rhodovibrio salinarum iso-1 by Ala, and in iso-2 of the same species by Asp. The highly conserved aromatic and hydrophobic residues in addition to Tyr 24, such as at positions 22, 54, 55, 66, 71, 84, 90, 95 and 99 (Fig. 7.1 numbering) generally appear to protect the iron-sulfur cluster from solvent. The necessity for such a protection may contribute to a hydrophobic site of interaction with reaction partner proteins, as determined by studies of the kinetics of oxidation by photosynthetic reaction centers (Osyczka et al, 1999a,b). The site of electron transfer is located where the iron-sulfur cluster is nearest to the protein surface and centered over positions 21, 22, 54, 71, 84, 99, and 101. Thus, the hydrophilic and charged residues in HiPIP are peripheral to the site of interaction and may contribute to binding and electron transfer in specific instances. On the contrary, the site of interaction of Class I cytochromes c with reaction centers is normally dominated by positively charged residues, surrounding the heme, that form salt bridges with negatively charged residues on the reaction centers (Osyczka et al, 2001). The two types of reaction centers, those that interact with HiPIP and those that use soluble cytochromes, differ in that the latter contain a negatively charged residue at the center of the interaction


157

site on the membrane-bound tetraheme reaction center cytochrome (Glu 67 in Blastochloris viridis vs. Val 65 in Rvi. gelatinosus) which promotes binding and electron transfer with the cytochromes, but which inhibits the reaction with HiPIP (Osyczka et al, 2001). The tetraheme reaction center cytochrome has a hydrophobic residue at the equivalent position in Ach. vinosum, Tch. tepidum, and Ect. shaposhnikovii, consistent with HiPIP being the electron donor. On the other hand, Rhodobium marinum has a Glu at that position which favors interaction with cytochrome c2, as found in functional analyses (Menin et al, 1998).

To determine which region on the protein surface may interact with reaction partner proteins, we

mapped identical, conservatively substituted, and radically changed amino acids of 11 sequences from the family Chromatiaceae onto the three-dimensional HiPIP structure of Ach. vinosum (Figure 7.5A) which also shows the distribution of charged amino acids (Figure 7.5B). From this map, it is clear that the surface composed of identical and conservatively substituted amino acids is located where the iron-sulfur cluster is nearest to the surface, at the front side of the protein. The center of this surface contains no charged residues which are rather located at the edges around this surface. Thus, the site of interaction with reaction partner proteins is most likely to be at this conserved surface. On the other hand, most of the radically changed amino acids are located at the opposite side of the protein where also the charged residues occur. As expected from the sequence alignment, the same observation was made when the seven Ecthothiorhodospira sequences were mapped onto the structure of Ect. vacuolata iso-2 HiPIP (Figure 7.5C). The area of identical and conservatively substituted amino acids around the cluster-binding cysteines is greater than those for the Chromatiaceae and covered nearly completely the front view of the protein (Figure 7.5D). We believe that the center of the distribution of conserved residues is more important than the size of the conserved region, which is dependent on the overall degree of sequence divergence of the species chosen for analysis. In contrast to the proteins from the Chromatiaceae and Ectothiorhodospiraceae, eleven small HiPIP sequences from the purple nonsulfur bacteria, with little similarity to each other, show a very low degree of conservation, resulting in a virtually red-colored map (Figure 7.5E). This is undoubtedly an artefact resulting from the fact that these sequences are too divergent for this method to work. Conserved amino acids are located around the conserved tyrosine and the cluster-binding cysteines, and most of them are buried in the protein. With the exception of a surface formed by amino acids at positions 27 to 39 (Rcy. tenuis numbering), most of the charged residues are evenly distributed at the surface of the protein (Figure 7.5F). Some of them, Asp14, Lys41 and Asp56, are located in the direct vicinity of the conserved tyrosine and cysteines. Neverthelesss, we feel that these proteins use the same site for electron transfer as in the other HiPIPs but that it will require more closely related sequences to demonstrate it. This does not exclude the possibility that some of these HiPIPs may have an interaction surface with substitutions suited to a particular functional role. JVB is indebted to the Fund for Scientific Research-Flanders for research grant 3G028201. This work was also supported in part by grant Fi 295/1 from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to UF and by the National Institutes of Health (GM21277) to MAC. We wish to thank Prof. Dr. H.G. Trüper for the gift of Ectothiorhodospira shaposnikov ii High-Potential Iron-sulfur Proteins.


158

Figure 7.5. Protein surface showing identical (green), conservatively substituted (yellow) and radically changed amino acids (red) mapped onto the three-dimensional structure of Ach. vinosum (A), Ect. vacuolata iso-2 (C) and Rcy. tenuis (E) HiPIP. Distribution of charged amino acids (basic; blue; acidic, red) are shown on the three-dimensional structures of Ach. vinosum (B), Ect. vacuolata iso-2 (D) and Rcy. tenuis (F) HiPIP. The conserved tyrosine and the cysteines are colored cyan and violet respectively


159

7.6. References Agarwal A, Li D, Cowan JA (1995) Role of aromatic residues in stabilization of the [Fe4S4] cluster in high-potential iron proteins (HiPIPs): Physical characterization and stability studies of Tyr-19 mutants of Chromatium vinosum HiPIP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9430-9444 Ambler RP, Daniel M, Hermoso J, Meyer TE, Bartsch RG, Kamen MD (1979a) Cytochrome c2 sequence variation among the recognized species of purple nonsulphur photosynthetic bacteria. Nature 278:659-660 Ambler RP, Meyer TE, Kamen, MD (1979b) Anomalies in amino acid sequences of small cytochromes c and cytochromes c’ from two species of purple photosynthetic bacteria. Nature 278:661-662 Ambler RP, Daniel M, Melis K, and Stout CD (1984) The amino acid sequence of the dihaem cytochrome c4 from the bacterium Azotobacter vinelandii . Biochem. J. 222: 217-227. Ambler RP, Meyer TE, Kamen MD (1993a) Amino acid sequences of cytochromes c-551 from the halophilic purple phototrophic bacteria, Ectothiorhodospira halophila and E. halochloris. Arch. Biochem. Biophys. 306:83-93 Ambler RP, Meyer TE, Kamen MD (1993b) Amino acid sequence of a high redox potential ferredoxin (HiPIP) from the purple phototrophic bacterium Rhodopila globiformis , which has the highest known redox potential. Arch. Biochem. Biophys. 306:215-222 Ambler RP, Meyer TE, Kamen MD (1994) Amino acid sequences of two high-potential iron sulfur proteins (HiPIPs) from the moderately halophilic purple phototrophic bacterium Ectothiorhodospira vacuolata . Arch. Biochem. Biophys. 308:78-81 Ambler RP, Daniel M, Meyer TE, Cusanovich MA (1999) Amino acid sequences

of two high-potential iron sulfur proteins (HiPIPs) from the moderately halophilic purple phototrophic bacterium, Rhodospirillum salinarum. Arch. Biochem. Biophys. 369:143-148 Andrews PC, Dixon JE (1987) A procedure for in situ alkylation of cystine residues on glass fiber prior to protein microsequence analysis. Anal. Biochem. 161:524-528 Babini E, Borsari M, Capozzi F, Eltis L-D, Luchinat C (1999) Experimental evidence for the role of buried polar groups in determining the reduction potential of metalloproteins: the S79P variant of Chromatium vinosum HiPIP. J. Biol. Inorg. Chem. 4:692-700 Banci L, Bertini I, Eltis LD, Felli JC, Kastrau DHW, Luchinat C, Piccioli M, Pierattelli R, Smith M (1994) The three-dimensional structure in solution of the paramagnetic high-potential iron-sulfur protein I from Ectothiorhodospira halophila through nuclear magnetic resonance. Eur. J. Biochem. 225:715-725 Banci L, Bertini I, Dikiv A, Kastrau DHW, Luchinat C, Sompornpisut P (1995a) The three-dimensional solution structure of the reduced high-potential iron-sulfur protein from Chromatium vinosum through NMR. Biochemistry 34:206-219 Banci L, Bertini I, Ciurli S, Luchinat C, Pierattell R (1995b) Rationalization of the reduction potentials within the series of the high potential iron-sulfur proteins. Inorg. Chimca acta 240:251-256 Bartsch RG (1978a) Purification of (4Fe-4S)1-2- ferredoxins (High-potential Iron-sulfur Proteins) from bacteria. Meth. Enzymol. 53:329-340 Bartsch RG (1978b) Cytochromes. In: Clayton RK, Sistrom WR (eds) The Photosynthetic Bacteria. Plenum Press, pp. 249-279. Bartsch RG (1991) The distribution of soluble


160

metallo-redox proteins in phototrophic bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1058:28-30 Bengrine A, Guiliani N, Appia-Ayme C, Jedlicki E, Holmes DS, Chippaux M, and Bonnefoy V (1998) Sequence and expression of the rusticyanin structural gene from Thiobacillus ferrooxidans ATCC33020 strain. Biochim. Biophys. Acta 1443: 99-112. Benning MM, Meyer TE, Rayment I, Holden HM (1994) Molecular structure of the oxidized high-potential iron-sulfur protein isolated from Ectothiorhodospira vacuolata . Biochemistry 33:2476-2483 Bentrop D, Bertini I, Capozzi F, Dikiv A, Eltis L, Luchinat C (1996) Three-dimensional structure of the reduced C77S mutant of the Chromatium vinosum high-potential iron-sulfur protein through nuclear magnetic resonance: Comparison with the solution structure of the wild-type protein. Biochemistry 35:5928-5936 Bergeys Manual of Systematic Bacteriology Second Edition (2001) (GM Garrity, ed) Springer-Verlag, New York. Bertini I, Capozzi F, Luchinat C, Piccioli M (1993) 1H-NMR investigation of oxidized and reduced high-potential iron-sulfur protein from Rhodopseudomonas globiformis. Eur. J. Biochem. 212:69-78 Bertini I, Dikiv A, Kastrau DHW, Luchinat C, Sompornpisut P (1995) Three-dimensional solution structure of the oxidized high potential iron-sulfur protein from Chromatium vinosum through NMR. Comparative analysis with the solution structure of the reduced species. Biochemistry 34:9851-9558 Bertini I, Couture MMJ, Donaire A, Eltis LD, Felli IC, Luchinat C, Piccioli M, Rosato A (1996) The solution structure refinement of the paramagnetic reduced high-potential iron-sulfur protein I from Ectothiorhodospira

halophila by using stable isotope labeling and nuclear relaxation. Eur. J. Biochem. 241:440-452 Bertini I, Cowan JA, Luchinat C, Natarajan K, Piccioli M (1997) Characterization of a partially unfolded high potential iron protein. Biochemistry 36:9332-9339 Bonora P, Principi I, Monti B, Ciurli S, Zannoni D, Hochkoeppler A (1999) On the role of high-potential iron-sulfur proteins and cytochromes in the respiratory chain of two facultative phototrophs. Biochim. Biophys. Acta 1410:51-60 Bond CS, Blankenship RE, Freeman HC, Guss JM, Maher MJ, Selvaraj FM, Wilce MCJ, Willingham KM (2001) Crystal structure of auracyanin, a "blue" copper protein from the green thermophilic photosynthetic bacterium Chloroflexus aurantiacus . J. Mol. Biol. 306:47-67 Breiter DR, Meyer TE, Rayment I, Holden HM (1991) The molecular structure of the high potential iron-sulfur protein isolated from Ectothiorhodospira halophila determined at 2.5Å resolution. J. Biol. Chem. 266:18660-18667 Brüser T, Trüper HG, Dahl C (1997) Cloning and sequencing of the gene encoding the high potential iron-sulfur protein (HiPIP) from the purple sulfur bacterium Chromatium vinosum. Biochim. Biophys. Acta 1352:18-22 Carter CWJr, Kraut J, Freer ST, Alden RA, Sieker LC, Adman E, Jensen LH (1972) A comparison of Fe4S4* clusters in high-potential iron protein and in ferredoxin. Proc. Natl. Acad. Sci USA 69:3526-3529 Carter CWJr, Kraut J, Freer ST, Xuong NH, Alden RA,Bartsch RG (1974) Two-angstrom crystal structure of oxidized Chromatium high potential iron protein. J. Biol. Chem. 249:4212-4225


161

Cowan JA, Lui SM (1998) Structure-function correlations in high-potential iron proteins. Adv. Inorg. Chem. 45:313-350 Crestfield AM, Moore S, Stein WH (1963) The preparation and enzymatic hydrolysis of reduced and S-carboxymethylated proteins. J. Biol. Chem. 231:622 Cusanovich MA, Bartsch RG (1969) A high potential cytochrome c from Chromatium chromatophores. Biochim. Biophys. Acta 189:245-255 Donohue TJ, McEwan AG, Van Doren S, Crofts AR, Kaplan S (1988) Phenotypic and genetic characterization of cytochrome c2 deficient mutants of Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry 27:1918-1925 Dus K, Tedro S, Bartsch RG (1973) The complete amino acid sequence of Chromatium high potential iron sulfur protein. J. Biol. .Chem. 248:7318-7331 Fischer U (1980) A high potential iron sulfur protein of the purple sulfur bacterium Thiocapsa roseopersicina. Z. Naturforsch. 35c: 150-153 Freer ST, Alden RA, Carter CWJr, Kraut J (1975) Crystallographic structure refinement of Chromatium high potential iron protein refined at 2Å resolution. J. Biol. Chem. 250:46-54 Heering HA, Bulsink YBM, Hagen WR, Meyer TE (1995) Influence of charge and polarity on the redox potentials of high-potential iron-sulfur proteins: evidence for the existence of two groups. Biochemistry 34:14675-14686 Hochkoeppler A, Ciurli S, Venturoli G, Zannoni D (1995) The high potential iron-sulfur protein (HiPIP) from Rhodoferax fermentans is competent in photosynthetic electron transfer. FEBS Letts. 357:70-74 Hochkoeppler A, Zannoni D, Ciurli S,

Meyer TE, Cusanovich MA, Tollin G (1996) Kinetics of photo-induced electron transfer from high potential iron-sulfur protein to the photosynthetic reaction center of the purple phototroph Rhodoferax fermentans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:6998-7002 Hochkoeppler A, Ciurli S, Kofod P, Venturoli G, Zannoni D (1997) On the role of cytochrome c8 in photosynthetic electron transfer of the purple nonsulfur bacterium Rhodoferax fermentans . Photosynth. Res. 53:13-21 Holden HM, Meyer TE, Cusanovich MA, Rayment I (1986) Crystalization of a high potential iron-sulfur protein from the halophilic phototrophic bacterium Ectothiorhodospira halophila. J. Biol. Chem. 261:14746-14747 Hong J, Rabinowitz JC (1967) Preparation and properties of clostridial apoferredoxins. Biochem. Biophys. Res. Comm. 29:246-252 Imhoff JF (2001) The anoxygenic phototrophic purple bacteria. In: Boone DR, Castenholz RW (eds.) Bergey’s Manual Syst. Bacteriol. 2nd ed., vol 1, Springer-Verlag; New York, pp 631-637 Imhoff JF, Suling J, Petri R (1998) Phylogenetic relationships among the Chromatiaceae, their taxonomic reclassification and description of the new genera Allochromatium, Halochromatium, Isochromatium, Marichromatium, Thiococcus, Thiohalocapsa and Thermochromatium. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:1129-1143 Iwagami SG, Creagh AL, Haynes CA, Borsari M, Felli IC, Piccioli M, Eltis LD (1995) The role of a conserved tyrosine residue in high-potential iron sulfur proteins. Prot. Science 4: 2562-2572 Jenney FEJr, Prince RC, Daldal F (1994) Roles of the soluble cytochrome c2 and membrane-associated cytochrome cy of Rhodobacter capsulatus in photosynthetic


162

electron transfer. Biochemistry 33: 2496-2502 Jue RA, Hale JE (1993) Identification of cysteine residues alkylated with 3-bromopropylamine by protein sequence analysis. Anal. Biochem. 210: 39-44 Kelly DP, Wood AP (2000) Reclassification of some species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothiobacillus gen. nov. and Thermitothiobacillus gen. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 511-516 Kerfeld CA, Chan C, Hirasawa M, Kleis-SanFrancisco S, Yeates TO, Knaff DB (1996) Isolation and characterization of soluble electron transfer proteins from Chromatium purpuratum. Biochemistry 35:7812-7818 Kerfeld CA, Salmeen AE, Yeates TO (1998) Crystal structure and possible dimerization of the high-potential iron-sulfur protein from Chromatium purpuratum. Biochemistry 37:13911-13917 Knaff DB, Willie A, Long JE, Kriauciunas A, Durham B, Millett, F (1991) Reaction of cytochrome c2 with photosynthetic reaction centers from Rhodopseudomonas viridis. Biochemistry 30:1303-1310 Kusano T, Takeshima T, Sugawara K, Inoue C, Shiratori T, Yano T, Fukumori Y, Yamanaka T (1992) Molecular cloning of the gene encoding Thiobacillus ferrooxidans Fe(II) oxidase. J. Biol. Chem. 267:11242-11247 Kusche WH, Trüper HG (1984) Iron sulfur proteins of the purple sulfur bacterium Ectothiorhodospira shaposnikovii. Arch. Microbiol. 137:266-271 Lapko VN, Smith DL, Smith J (2001) In vivo carbamylation and acetylation of water-soluble human lens αΒ-crystallin lysine 92. Prot. Science 10:1130-1136

Luchinat C, Capozi F, Borsari M, Battistuzzi G, Sola M (1994) Influence of surface charges on redox properties in high potential iron-sulfur proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 203:436-442 Menin L, Schoepp B, Parot P, Verméglio A (1997) Photoinduced cyclic electron transfer in Rhodocyclus tenuis cells: Participation of HiPIP or cyt c8 depending on the ambient redox potential. Biochemistry 36:12183-12188 Menin L, Gaillard J, Parot P, Schoepp B, Nitschke W, Verméglio A (1998) Role of HiPIP as electron donor to the RC-bound cytochrome in photosynthetic purple bacteria. Photosynth. Res. 55, 343-348 Menin L, Yoshida M, Jaquinod M, Nagashima KVP, Matsuura K, Parot P, Verméglio A (1999) Dark aerobic growth conditions induce the synthesis of a high midpoint potential cytochrome c8 in the photosynthetic bacterium Rubrivivax gelatinosus. Biochemistry 38:15238-15244 Meyer TE (1994) Purification and properties of high-potential iron-sulfur proteins. Meth. Enzymol. 243:435-447 Meyer TE, Cannac V, Fitch J, Bartsch RG, Tollin D, Tollin G, Cusanovich MA (1990) Soluble cytochromes and ferredoxins from the marine purple phototrophic bacterium, Rhodopseudomonas marina . Biochim. Biophys. Acta 1017:125-138 Moulis J-M, Scherrer N, Gagnon J, Forest E, Pétillot Y, Garcia D (1993) Primary structure of Chromatium tepidum high-potential iron-sulfur protein in relation to thermal denaturation. Arch. Biochem. Biophys. 305:186-192 Nogi T, Fathir I, Kobayashi M, Nozawa T, Miki K (2000) Crystal structures of


163

photosynthetic reaction center and high-potential iron-sulfur protein from Thermochromatium tepidum: thermostability and electron transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13561-13566 Osyczka A, Nagashima KVP, Shimada K, Matsuura K (1999a) Interaction site for high-potential iron-sulfur protein on the tetraheme cytochrome subunit bound to the photosynthetic reaction center of Rubrivivax gelatinosus. Biochemistry 38:2861-2865 Osyczka A, Nagashima KVP, Sogabe S, Miki K, Shimada K, Matsuura K (1999b) Comparison of the binding sites for high-potential iron-sulfur protein and cytochrome c on the tetraheme cytochrome subunit bound to the bacterial photosynthetic reaction center. Biochemistry 38:15779-15790 Osyczka A, Nagashima KVP, Sogabe S, Miki K, Shimada K, Matsuura K (2001) Different mechanisms of the binding of soluble electron donors to the photosynthetic reaction center of Rubrivivax gelatinosus and Blastochloris viridis. J. Biol. Chem. 276:24108-24112 Pascarella S, Argos P (1992) Analysis of insertions/deletions in protein structures. J. Mol. Biol. 224:461-471 Pereira MM, Antunes AM, Nunes OC, da Costa MS, Teixeira M (1994) A membrane-bound HiPIP type center in the thermohalophile Rhodothermus marinus. FEBS Lett. 352:327-330 Pereira MM, Carita JN, Teixeira M (1999) Membrane-bound electron transfer chain of the thermohalophilic bacterium Rhodothermus marinus: Characterization of the iron-sulfur centers from the dehydrogenases and investigation of the high-potential iron-sulfur protein function by in vitro reconstitution of the respiratory chain. Biochem. 38:1276-1283

Pettigrew GW, Moore GR (1987) The function of bacterial and photosynthetic cytochromes. In: Rich A (serial ed.) Cytochromes c. Biological Aspects. Springer-Verlag, New York. pp.113-230 Pierson BK (1985) Cytochromes in Chloroflexus aurantiacus grown with and without oxygen. Arch. Microbiol. 143:260-265 Rayment I, Wesenberg G, Meyer TE, Cusanovich MA, Holden HM (1992) The three-dimensional structure of the high-potential iron-sulfur protein isolated from the purple phototrophic bacterium Rhodocyclus tenuis determined and refined at 1.5Å resolution. J. Mol. Biol. 228:672-686 Salanoubat M, Genin S, Artiguenave F, Gouzy J, Mangenot S, Ariat M, Billault A, Brottler P, Camus JC, Cattolico L, Chandler M, Cholsne N, Claudel-Renard C, Cunnac S, Demange N, Gaspin C, Lavle M, Molsan A, Robert C, Saurin W, Schlex T, Siguler P, Thebault P, Whalen M, Wincker P, Levy M, Weissenbach J, and Boucher CA (2002) Genome sequence of the plant pathogen Ralstonia solanacearum. Nature 415: 497-502. Samyn B, De Smet L, Van Driessche G, Meyer TE, Bartsch RG, Cusanovich MA, Van Beeumen JJ (1996) A high-potential soluble cytochrome c-551 from the purple phototrophic bacterium Chromatium vinosum is homologous to cytochrome c8 from denitrifying pseudomonads. Eur. J. Biochem. 236:689-696 Samyn B, Hardeman K, Van der Eycken J, and Van Beeumen J (2000) Applicability of the alkylation chemistry for chemical C-terminal protein sequence analysis. Anal. Chem. 72:1389-1399 Schoepp B, Parot P, Menin L, Gaillard J, Richaud P, Verméglio A (1995) In vivo participation of a high potential iron-sulfur protein


164

as electron donor to the photochemical reaction center of Rubrivivax gelatinosus. Biochemistry 34:11736-11742 Tedro S, Meyer TE, Kamen MD (1974) Primary structure of a high potential iron-sulfur protein from the photosynthetic bacterium Thiocapsa pfennigii. J. Biol. Chem. 249:1182-1188 Tedro S, Meyer TE, Kamen MD (1976) Primary structure of a high potential iron-sulfur protein from the purple nonsulfur photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas gelatinosa. J. Biol. Chem. 251:129-136 Tedro S, Meyer TE, Kamen MD (1977) Primary structure of a high potential iron-sulfur protein from a moderately halophilic denitrifying coccus. J. Biol. Chem. 252:7826-7833 Tedro S, Meyer TE, Kamen MD (1979) Primary structure of a high potential, four-iron-sulfur ferredoxin from the photosynthetic bacterium Rhodospirillum tenue. J. Biol. Chem. 254:1495-1500 Tedro S, Meyer TE, Bartsch RG, Kamen MD (1981) Primary structure of high potential, four-iron-sulfur ferredoxins from the purple sulfur photosynthetic bacteria, Thiocapsa roseopersicina and Chromatium gracile. J. Biol. Chem. 256:731-735 Tedro S, Meyer TE, Kamen MD (1985a) Amino acid sequence of high-redox-potential ferredoxin (HiPIP) isozymes from the extremely halophilic purple phototrophic bacterium, Ectothiorhodospira halophila . Arch. Biochem. Biophys. 241:656-664 Tedro S, Meyer TE, Kamen M (1985b) The amino acid sequence of a high-redox-potential ferredoxin from the purple phototrophic bacterium, Rhodospirillum tenue strain 2761. Arch. Biochem. Biophys. 239:94-101

Then J, Trüper HG (1983) Sulfide oxidation in Ectothiorhodospira abdelmalekii. Evidence for the catalytic role of cytochrome c-551. Arch. Micobiol. 135:254-258 Van Driessche G, Ciurli S, Hochkoeppler A, Van Beeumen JJ (1997) The primary structure of Rhodoferax fermentans high-potential iron-sulfur protein, an electron donor to the photosynthetic reaction center. Eur. J. Biochem. 244:371-377 Van Driessche G, Hu W, Van de Werken G, Selvaraj F, McManus JD, Blankenship RE, Van Beeumen J (1999) Auracyanin A from the thermophilic green gliding photosynthetic bacterium Chloroflexus aurantiacus represents an unusual class of small blue copper proteins. Prot. Science 8:947-957 Van Driessche G, Vandenberghe I, jacquemotte F, Devreese B, Van Beeumen JJ (2002) Mass spectrometric identification of in vivo carbamylation of the amino terminus of Ectothiorhodospira mobilis High-potential Iron-sulfur Protein, isozyme 1. J. Mass Spectrom.: in press. Van Grondelle R, Duysens LNM, Van der Wel JA, Van der Wal HN (1977) Function and properties of a soluble c-type cytochrome c-551 in secondary photosynthesis electron transport in whole cells of Chromatium vinosum as studied with flash spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta 461:188-201 Wermter U, Fischer U (1983) Molecular properties of high potential iron sulfur protein of Chromatium warmingii. Z. Naturforsch. 38C:968-971

8

The primary Structure of Rubrerythrin, a Protein with Inorganic Pyrophosphatase

Activity from Desulfovibrio vulgaris. Comparison with Hemerythrin and Rubredoxin

7.1. SUMMARY 167


7.3. METHODS 168

7.4. RESULTS 171

7.5. DISCUSSIONS 174

7.6. REFERENCES 178

5.5. SUPPLEMENTAL MATERIAL 180

Hoofdstuk 8. Primary structure of Desulfovibrio vulgaris rubrerythrin 166

Hoofdstuk 8

The primary Structure of Rubrerythrin, a Protein with Inorganic Pyrophosphatase

Activity from Desulfovibrio vulgaris. Comparison with Hemerythrin and Rubredoxin

Jozef J. Van Beeumen +@, Gonzalez Van Driessche+, Ming-Yih Liuq, and Jean LeGallq

(Journal of Biological Chemistry. (1991) 266, 20645-20653) + Laboratory of Microbiology, University of Ghent, Ghent 9000, Belgium q Department of Biochemistry, School of Chemical Sciences, University of Georgia, Athens, Georgia 30602 United States of America Running title: Desulfovibrio vulgaris, rubrerythrin, primary structure The abbreviations used are: HPLC, high performance liquid chromatography; PTH, phenylthiohydantoin amino acid; PDMS, Cf 252 plasma desorption mass spectrometry; SDS, sodium dodecyl sulphate; TFA, trifluoroacetic acid.


8.1. Summary

The complete polypeptide chain of rubrerythrin from the sulfate reducing bacterium Desulfovibrio vulgaris, strain Hildenborough NCIB 8303, was found by protein chemical techniques to consist of 191 residues and to have the following amino acid sequence: M K S L K G S R T E K N I L T A F A G E S Q A R N R Y N Y F G G Q A K K D G F V Q I S D I F A E T A D Q E R E H A K R L F K F L E G G D L E I V A A F P A G I I A D T H A N L I A S A A G E H H E Y T E M Y P S F A R I A R E E G Y E E I A R V F A S I A V A E E F H E K R F L D F A R N I K E G R V F L R E Q A T K W R C R N C G Y V H E G T G A P E L C P A C A H P K A H F E L L G I N W. The C-terminal part of the protein (position 153 – 191) shows the typical sequence features of rubredoxin, a protein with a non-heme iron center also present in the same and other Desulfovibrio species. There are only 12 amino acids between th two cysteine clusters Cys-Xaa-Yaa-Cys and Cys-Pro-Xaa-Cys. This is 10 residues less than for rubredoxin of Desulfovibrio desulfuricans, the first example of a rubredoxin with 22 residues between the two cysteine clusters instead of the 29 residues in all other rubredoxins. Based on the known three-dimensional structure of D. desulfuricans rubredoxin, we propose that the C-terminal part of rubrerythrin is folded in a similar way and suggest that the deletion of the extra 10 residues is compatible with the same basic rubredoxin-fold. After characterization of the C-terminal region, and in contrast to what could be expected from previously published spectroscopic analyses, the N-terminal region 1-152 of rubrerythrin appears to have no sequence similarity with the eukaryotic protein hemerythrin which is known to contain a binuclear iron center bound by 5 histidine ligands. However, the N-terminal region of rubrerythrin does contain 5 histidine residues but they are differentlty spaced along the peptide chain. We suggest that at least one of the 3 histidine residues located in the rubredoxin-like center of rubrerythrin may be liganded to one iron atom of the hemerythrin-like center. This structural configuration would explain the 250mV higher redox potential of the rubredoxin-like center compared to classical rubredoxin, and would also be compatible with the iron stoichiometric and preliminary X-ray data which show that the hemerythrin-like center is probably liganded through two monomers and should be more symmetrical than in the authentic hemerythrin. This paper is the first sequence report of a protein with pyrophosphatase activity although the physiological substrate for the rubrerythrin may be not inorganic pyrophosphate. 8.2. Introduction

Inorganic pyrophosphatase is an essential enzyme for the activitation of sulfate by sulfate reducing bacteria [1]. Pyrophosphate itself is formed along with adenosyl-phosphosulfate (APS) from sulfate and one molecule of ATP through action of ATP-sulfurylase:

SO42- + ATP � APS + PPi


In order for the reaction to proceed, pyrophosphate must be hydrolyzed by pyrophosphatase to two molecules of inorganic phosphate. A recent survey of inorganic pyrophosphatase in Desulfovibrio vulgaris has shown that two enzymes are responsible for this activity [2]. One enzyme has a very high turnover and contains a dialyzable aton of zinc; the other, which is 35 times less active, is ‘rubrerythrin’.

The name of rubrerythrin was given to this protein because an extensive spectroscopic study has shown that it contains two rubredoxin-like centers and one hemerythrin-like binuclear-iron center in a dimer of 43800 molecular weight [3]. Rubredoxin is a very thoroughly characterized non-heme iron center containing protein in biology [4]. It is the simples member of the iron-sulfur class of metalloproteins and serves as the prototype of the proteins that bind high-spin iron in the tetrahedral coordination by sulfur atoms. Its small size (Mr # 6000) has made rubredoxin a particulary attractive candidate for a variety of physical and chemical studies [4-6]. As far as known, rubredoxin only occur in anaerobic bacteria [4]. Hemerythrin is another relatively small size iron center containing protein that has been thorougly studied [7]. Its polypeptide chain has a molecular mass of 13500 dalton and contains a binuclear iron center. Hemerythrin constitutes the prototype of a whole class of binuclear iron sites in proteins with different functions such as ribonucleotide reductase [8], purple acid phosphatase [9], protein A of methane-monooxygenase [10] and the formation of the ferritin core [11]. This type of protein has not yet been found in bacterial species. Mössbauer and EPR data of rubrerythrin have indicated that the rubredoxin centers are undistinguishable from those in rubredoxin [3]. Redoxtitrations monitored by EPR, however, have shown that they have a midpoint redox potential of 230 mV (+ 10 mV) which is 250 mV higher than that in normal rubredoxins.

In the present paper, we report the complete covalent structure of rubrerythrin which allows to make some interesting comparisons with both rubredoxins and hemerythrin. 8.3. Methods 8.3.1. Preparation of the rubrerythrin

Growth of the bacterial cells, preparation of extracts and protein purification were as described in [3]. The iron clusters of rubrerythrin were removed following the procedure described in [20]. After lyophilization, the apoportein was mixed with water giving a white suspension. 8.3.2. Preparation and purification of peptides

Partial acid hydrolysis of the aporubrerythrin at 106°C during 3 hours was carried out on 45 nanomoles of material using 2.5 % formic acid as hydrolysing agent. The final volume was 300 µl. An enzymatic digest of 30 nanomoles of the aporubrerythrin with Staphylococcus aureus V8 protease (Miles, UK) was performed at an enzyme/substrate ratio of 1/40 during 3 hours at 37° C. The buffer used was 0.1 M ammonium bicarbonate, pH 8,


supplemented with 0.3 % SDS, in a final volume of 200 µl. A first digest with Lys-C endoproteinase from Achromobacter lyticus (Wako, Japan) was performed on 15 nanomoles of aporubrerythrin at an enzyme/substrate ratio of 1/40 during 4 hours at 37°C in 0.1 M Tris-Cl buffer, pH 9, also in the presence of 0.3% SDS. A second digest with the same enzyme, on 15 nanomoles of the cluster-free rubrerythrin was carried out at an enzyme/substrate ratio of 1/20 under the same conditions but for a total period of 17 hours. Digest volumes were 100 µl each time.

Peptides resulting from the different cleavage procedures were separated by high performance liquid chromatography on a macroporous C4 column (Vydac, 4.6 x 250 mm, 214TP54). The chromatographic equipment consisted of a 8800 Gradient Controller, a 870 Chromatographic Pump and a UV spectrometric detector set al 220 nm (all parts from DuPont Instruments, USA). A Rheodyne injector was equipped with a 200 µl loop. The gradient was always made starting with 0.1% TFA in MilliQ-water (Millipore, USA) with increasing amount of 0.1% TFA in 70% acetonitrile. The course of the gradient is drawn on the Figures 2-5 and S.I. The generated peptides were collected manually, at a flow of 1 ml/min, in polypropylene tubes (Kartell, USA). The collected fractions were dried in the Speed Vac Concentrator (Savant, USA) and stored at –18°C. Before use, the peptides were redissolved in 40 to 100 µl 0.1% TFA in MilliQ-water. Some peptide mixtures were rechromatographed on a so-called ‘PTC C18-column’ of 2.5 x 250 mm using either a 130A Separation System or a 140A Solvent Delivery system equipped with a 1000S Diode Aray Detector (all instrumentation from Applied Biosystems, USA). Column eluents were as described for the Vydac-column but the elutuion rate was only 0.2 ml/min. 8.3.3. Carboxypeptidase treatment

Treatment of native rubrerythrin with carboxypeptidase P (Boehringer, BRD) was carried out on 825 picomoles of material. Samples were taken at several time intervals and analyzed on a 420A Derivatizer, coupled to a 130A Separation System (see Amino acid analysis), without prior precipitation of the protein and the protease. The digest was carried out in 0.2M sodium acetate buffer, pH 4.6, at an enzyme/substrate ratio of 1/75. 8.3.4. Chemical modification of peptides

Some peptides for which the presence of cysteine residues was anticipated (see further under ‘RESULTS’) ware pyridylethylated in the gas phase following the procedure described in [21] or in the liquid phase following the method described in [22]. 8.3.5. Sequence analysis and amino acid analysis

Automated Edman degradation were performed in a 477A pulsed liquid seqeunator followed by on-line analysis of the phenylthiohydantoin amino acids on a 120 A PTH-analyzer (Applied Biosystems, USA).

Amino acid analysis of protein and peptide samples was carried out on a 420A Derivatizer with on-line analysis of the phenylthiocarbamyl derivatives on a so called ‘PTC C18-column’ of 2.5 x 250 mm using a 130A Separation system (Applied Biosys-


Figure 8. 1. Amino acid sequence of rubrerythrin from Desulfovibrio vulgaris. Peptides obtained by chemical cleavage with cyanogen bromide and dilute formic acid and by enzymatic cleavage with Glu-C endoproteinase and Lys-C endoproteinase are indicated as CN, H, S and K respectively. The indication K’ refers to a second digest with the latter protease using more enzyme for a longer incubation time. The numbering of the peptides is that of the order of elution in the HPLC-chromatograms. Horizontal arrows indicate the assignment made from automated sequence analysis. The small vertical arrows mean that the sequence runs were deliberately stopped. The cysteines at the positions 158, 161, 174 and 177 were identified as the pyridylethyl derivatives.


Figure 7.2. Separation of the peptides obtained from partial acid hydrolysis of 45 nmol of apoprotein.

tems, USA). Hydrolysis of the samples was performed in glass tubes of 5 x 55 mm placed in a hydrolysis vial (Millipore, USA) and using 6N HCl as hydrolysing agent in the gaseous form. The duration of the hydrolysis was 24 hours at 106°C. In the case of apo-rubrerythrin, a hydrolysis was also carried out after addition of 30% dodecanethiol (Sigma, USA), final concentration [23].

8.3.6. Mass analysis

Time of flight mass spectrometry was carried out using a Bio-Ion 20 K plasma desorption spectrometer with Californium-252 source. The principle of the method is described in [24]. 8.4. Results

Fig. 8.1 shows the complete amino acid sequence of D. vulgaris rubrerythrin. The built-up of this proposal was as follows. Initially, N-terminal sequence analysis of the native protein allowed to determine 46 out of the first 51 residues. Chemical cleavage of the apoprotein with cyanogen bromide and dilute formic acid (Fig. 8.2) were then choosen as the first method to obtain peptides because compositional analysis of the protein (Table 8.1) revealed the presence of only two or three methionine and 12 or 13 aspartic acid residues, feeding the hope to obtain large peptides. The choice appeared to be justified since a major

hydrolysis peptide (H8) not only could be sequenced for 44 steps but also appeared to give an overlap with the last 12 identified residues of one major cyanogen bromide peptide (CN2) which itself could be sequence for 48 cycles. The first major cyanogen bromide peptide started off with the second residue of the protein so that it could be concluded that the second methionine is rubrerythrin occurred further down the polypeptide chain than residue 63, also because peptide H6 had prolonged the knowledge of the N-terminal region up to that position. Sequence analysis of peptide H10 indicated an overlap from Edman cycle 20 onwards with peptide CN2, and one of the two components in the fraction H12, peptide H12A, appeared to have the same sequence from residue 15 onwards as the N-terminal sequence of peptide H10. At that moment of analysis, and apart from the N-terminal region of the rubrerythrin (1-63), a continous polypeptide chain of 113 residues was established, covering the region Leu69 – Lys 181, albeit that the identity of the residues 75, 77, 78 and 79 remained to be confirmed as well as the residues 124, 125, 129, 130 and 179 to be identified from another digest.

Two cleavages on the apoprotein were then carried out more or less simultaneously, one with the Glu-C endoproteinase of Staphylococcus aureus V8 (Fig.


Figure 8.3. HPLC chromatographic analysis of the peptides obtained after treatment of 30 nmol of apo-rubrerythrin with Glu-C endoproteinase.

Figure 8.4. Rechromatography of fraction S4, after pyridylethylation, on a narrow-bore reversed phase PTC-column.

8.3), one with Lys-C endoproteinase from Achromo-bacter lyticus, both in the presence of sodium dodecyl sulfate. Under the conditions used several Glu-X and/or Lys-X peptide bonds appeared to have remained partially uncleaved. This unexpected phenomenon, however, was very benificial for the further sequence determination of the rubrerythrin. Peptide S8 showed that the partial hydrolysis peptides H6 and H12A succeeded each other in the sequence with only a distance of 7 residues between the last residue determined for H6 (Phe63) and the N-terminal residue for H12A (Leu69). Because of the purity of S8, the sequence of the first 11 residues of H12A could now unambiguously be established. Peptide S8 contained no less than 4 uncleaved Glu-X bonds with X= Arg, His, Gly and Ile. Anyway, the sequence result for peptide S8 now allowed to propose the sequence of rubrerythrin from its N-terminus up to lysine 181, with the residues, 28, 34, 67 and the above mentioned residues 124, 125, 129, 130 and 179 left to be identified.

At this point, a comparison with the literature data revealed that the region from residue 155 onwards showed similarity with bacterial rubredoxin sequences (see Discussion). For that reason, the sequence run of peptide H8 was repeated after pyridylethylation, and cysteine residues could be demonstrated at the positions 21, 24, 37 and 40 of H8. Another interesting S. aureus fraction of the rubrerythrin was S4. It appeared to contain 5 peptides (Table S.IV) of which four, by sequence analysis of the mixture, could be recognized to start off respectively at Met101, Gly167, Ile117 and Leu173. Because the latter peptide overlapped with 7 of the last 9 determined residues of H8, we separated

the pyridylethylated mixture S4 by reversed phase high performance liquid chromatography on a small bore column (Fig. 8.4) yielding the 5 peptides in a pure form. Peptide S4(PE)B proved to be 13 residues long and to contain cysteines at the presumed positions 2 and 5. It also proved the identity of His179. Another peptide, S4(PE)A, could be sequenced up to a C-terminal tryptophan residue although the amino acid composition obviously did not indicate the presence of the residue. However, the analysis showed that the peptide could not be very much longer than 6 residues, or a multiple therefore, and that it did not contain a gluytamic acid residue. Peptide S4A was therefore postulated to be a good condidate for being the C-terminal Glu-C peptide. The digest also allowed to


Figure 8.5. Separation of peptides obtained after incubation of 15 nmol apo-rubrerythrin with Lys-C endoproteinase.

Figure 8.6. PDMS-spectrum of the C-terminal peptides SA4 (A) and K3A (B). Values represent the species [MH]+.

identify the residues 28 and 34 (in peptide S11A and K1A) and 124, 125 and 130 (in S10).

Cleavage with Lys-C endoproteinaese (Fig. 8.5) was sufficienty to complete the sequence determination of rubrerythrin. Peptide K7 confirmed that residue 44 of the protein is indeed aspartic acid, and that residue 62 is lysine as alreaty found from analysis of peptide S8. The Lys-Phe, as well as a Lys-Arg bond (position 58, protein numbering) had apparently not been cleaved by the protease in peptide K7, although the sequence analysis of the fractions K5 and K6 proved that a partial cleavage had taken place. The most interesting peptide of the Lys-C digest was contained in fraction K3. Its major component showed to have a N-terminal sequence identical to the last 4 residues of S4(PE)B. Moreover, it could not be sequenced further than a tryptophan residue at Edmancycle 10, a feature which could be explained by the complete wash-out effect during sequence analysis. Alternatively, it could be explained by the fact that this tryptophan was the C-terminal residue of the peptide and, as already anticipated after sequencing S4A, of the protein as a whole. The identity of Gly67 could only clearly be established from peptide K’2, obtained after a second but longer cleavage of rubrerythrin with the Lys-C protease.

Definite evidence for the C-terminal sequence of the rubrerythrin was obtained by combining the results of carboxypeptidase P action on the native protein, and precise molecular mass measurements of the peptides S4A and K3A by Cf252 plasma desorption mass spectrometry. The spectra for the latter analyses are given in Fig. 8.6. The

molecular mass of 1202.7 confirmed the proposed sequence of K3A, including one tryptophan residue (calc. 1199.61), whereas the mass of 715.4 is in complete agreement with the sequence of the hexapeptide S4A (calc. 715.39). Carboxypeptidase P released only two residues from the native protein, asparagine and tryptophan (Fig. S.II) although so at a very slow rate. The polypeptide chain of rubrerythrin was therefore concluded to be 191 residues long and to have a tryptophan residue as C terminus. The protein has a slight excess of three acidic over the total number of 25 basic residues.


Finally, it may be noticed that many of the peptides obtained in this study were sufficiently pure to allow amino acid analysis. As can be found in the Miniprint Table S.III, S.V and S.VII, the data indeed corraborated the proposed sequence even though several analyses were carried out on not more that 10 picomoles of material.

Table. 8.I. Amino acid analysis of rubrerythrin. The results were obtained after hydrolysis during 24 h in the absence (A) and the presence (B) of dodecanethiol. (C) is the composition deduced from the amino acid sequence. The analyses were carried out on respectively 115 and 150 picomoles of material. (A) (B) (C) Asp Glu Ser Gly His Arg Thr Ala Pro Tyr Val Met Ile Leu Phe Lys Trp Cys

12.05 27.39 6.03

14.99 6.52

11.80 5.86

26.29 4.97 5.66 5.90 2.03

10.89 11.22 14.19 12.68 . n.d.

13.09 27.51 6.15

15.43 6.71

13.63 6.11

25.87 4.67 5.42 5.52 2.37

10.80 11.15 14.99 14.38 0.50 n.d.

13 27 7 15 8 14 7 27 5 6 6 2 12 11 14 11 2 4

n.d. : not determined 8.5. Discussion

Rubrerythrin is the first example of a protein in which, by means of extensive spectroscopic analyses, the presence of both a rubredoxin-type and a hemerythrin-type of polypeptide chain have been discovered [3]. The primary structure determined here shows that the combined name of rubrerythrin is justified, at least as far ast the rubredoxin part of the protein is concerned. Rubrerythrin is 191 residues long and contains 4 cysteine residues located in the C-terminal part of the protein at the positions 158, 161, 174 and 177 respectiverlty. The 4 residues are part of two typical rebredoxin clusters, namely -Cys-Xaa-Yaa-Cys-Gly-Tyr- and –Cys-Pro-Xaa-Cys-. There are 12 residues between the last cysteine of the first cluster and the first cysteine of the second. In Fig. 8.7A we compare the C-terminal region of rubrerythrin with the amino acid sequence of 2 rubredoxins for which the three dimensional structure is known in great detail: rubredoxin from D. desulfuricans (strain 27774) [4] and rubredoxin from the same strain from which the rubrerythrin has been isolated (D. vulgaris) [12]. The carbon-backbone of the spatial structures themselves are given in Fig. 8.7B. The main difference between the two rubredoxins is that the region between the two cysteine clusters is shorter by 7 residues in the D. desulfuricans protein. This deletion corresponds to a hairpin loop present in the protein of D. vulgaris which has 29 residues between the second and the third cysteine. If we now assume that the three-dimensional


structure of the rubredoxin part of rubrerythrin has the same general fold as that of the authentic rubredoxins and that therefore the 5 cysteines can effectively be aligned as given in Fig. 8.7A, it is apparent that in the rubrerythrin the extra 10 residues gap (very likely after a GAP sequence!) relative to D. Desulfuricans rebredoxin is due to an extra deletion as indicated with a heavy lining in Fig. 8.7B. It may be reminded that D. desulfuricans rubredoxin was unique amongst this class of proteins to have an important deletion in the sequence.

The rubredoxin part of rubrerythrin is also different from the rubredoxins in that

there is no tryptophan residue between the 2 cysteine clusters. This aromatic residue is thought to participate in the stabilizaiton of the rubredoxin center [13]. Interestingly, there is a tryptophan residue at position 156 of rubrerythrin corresponding to position 4 of the rubredoxins where an aromatic residue is always found. We suggest that Trp156 may take over this stabilizing role in rubrerythrin and that the gap and the different location of the tryptophan contribute to the higher site symmetry of the rubredoxin center that has been observed by resonance Raman spectrometric analysis [13].

In contrast to the C-terminal part which shows moderate but distinct sequence similarities with rubredoxins, it is quite difficult to demonstrate sequence similarities for the N-terminal part of rubrerythrin with any other know protein. Even hemrythrins, as could have been expected from the physicochemical data, do not seem to contain sequence patterns that can be recognized in the non-rubredoxin part of rubrerythrin [14-

Figure 8.7. A. Alignment of the C-terminal region of rubrerythrin (1) with rubredoxin from D. desulfuricans (2) and D. vulgaris (3). B. Schematic presentation of the α-carbon position of D. vulgaris rubredoxin (modified from [4]. The side chain carbon atoms of the cysteine residues at the positions 6, 9, 39 and 42 are shown as small filled circles, the sulfur atoms of the iron cluster as small open circles, and the iron atom as a large dotted circle. D. desulfuricans rubredoxin has the same overall structure with the hairpin loop 20-26 missing. We propose that also the C-terminal part of rubrerythrin has the same general folding of the carbon backbone but with an additional deletion of the region shown as heavy lines.


16] Hemeythrin is known to have a 4 anti-parallel up-down helix structure [17] with a binuclear iron center liganded by 5 histidine residues. It is generally understood that these residues are evolutionary conserved. In Fig. 8.8 we have indicated the precise positions of these 5 histidines in a linear presentation of the hemerythrin polypeptide chain. Rubrerythrin contains a total of 8 histidines and also five of them are located in the N-terminal non-rubredoxin part of the molecule. The spacing between these histidines, however, it not identical to that in hemerythrins. On itself, this does not, of course, exclude the possibility that part of the N-terminal region 1 - 152 of rubrerythrin has a similar three-dimensional folding as hemerythrin (108 residues for the protein of Phascolipsis gouldii [13]), since the different spacing may be due to insertions or deletions. When we align the first 2 histidines of hemerythrin (spaced by 27 residues) with the same residues in the rubrerythrin-part (spaced by 26 residues) there is no sequence similarity between the two proteins, even after introducing gaps. The only similarities of any significance can be found if one eligns the third histidine of hemertythrin (His 73) with the first histidine of rubrerythrin. This alignment is given in Fig. 8.8 as possibility (c). The amino acids flanking these histidines give a sequence similarity of 75 % but the comparable region comprises only 4 residues. Fig. 7.8 also presents the two other possibilities of alignment that give some sequence similarity in the polypeptide chain. Both possibilities include, however, that part of the N-terminal region of hemerythrin overlaps with the C-terminal rubredoxin part of rubrerythrin. Solution (b) is centered around histidine 84 of rubrerythrin and histidine 25 of hemerythrin with a stretch of 9 residues then giving 55 % sequence similarity. The identical residues are noted in the figure. Alignment solution (a) gives a similar figure of similarity (50 %) for the sequence region Arg 119-Glu128 of rubrerythrin, but does not include even one of the five histidines of hemerythrin or the hemerythrin-like center of rubrerythrin.

Figure 8.8. Schematic presentation of the polypeptide chain of rubrerythrin from D. vulgaris(Rr) and alignment with rubredoxin for the same species (Rb), and with hemerythrin from P. gouldii (Hr). For the latter alignment three possibilities are shown, (a), (b) and (c), which give the highest possible similarity with the N-terminal part of rubrerythrin (see Discussion). The position where identical residues occur are connected by vertical lines and the residues themselves are indicated individually. The additional 10 residues of the rubredoxin sequence are indicated as ‘+ 10 aa’.


The fact that 3 out of the 8 histidines in rubrerythrin are located in the C-terminal rubredoxin-like center of rubrerythrin raises the possibility that one or more of these residues could be involved as ligands of the hemerythrin-like center. Such a possibility would include that the two centers of rubrerythrin would be in close proximity of each other, and would well explain the high redox potential (+ 230 mV) of the rubredoxin-like center in rubrerythrin compared to that in authentic rubredoxin (-20 mV). Moreover, both the iron stoichiometry [3] and preliminary X-ray analysis date [18] suggest that the binuclear hemerythrin-center is liganded through two monomers. In such case, the center should be more symmetrical than in authentic hemerythrin. This extra factor of symmetry could be realised if the two iron atoms from the center would be liganded by six instead of five histidines with three ligands being donated per monomer. Anyone of the three distidines in the rubredoxin-like center can then be a ligand candidate for one of the iron atoms in the binuclear center. If such a hemerythrin-like structure would finally turn out to be real following high resolution X-ray analysis, it would explain the reason why there is no sequence homology between the N-terminal part of rubrerythrin and hemerythrin.

In the given status of data it is difficult to speculate on the evolutionary origin of rubrerythrin. The presence of a binuclear center indicates that the N-terminal part of the protein and hemerythrin could have a common evolutionary origin. However, hemerythrin is a eukaryotic protein that occurs in oxygen respiring worms whereas rubredoxin is found in sulfate reducing bacteria and rubrerythrin, so far, only in one sulfate reducing bacterium. We like to suggest that a rubrerythrin was an ancestral type of protein that existed in Desulfovibrio vulgaris long before the oxygen respiring eukaryotes developed on earth. The hemerythrin may be the result of transfer of a gene that was structurally homologous to the N-terminal part of rubrerythrin. The link with the rubredoxin gene may have been broken before transfer to the gene pool of the respiring worms has been place. Rubredoxin may from then on have evolved as an independent redox protein in the sulfate reducing bacterium as evidenced from the difference in structure between the rubredoxin-like center in rubrerythrin and in rubredoxin itself. Sipunculid worms are often found in the same ecological marine sediments of the sulfate reducing bacteria and such conditions are a prerequisite for the possibility of gene transfer.

Finally, we would like to stress the point that, although rubrerythrin has pyrophosphatase activity in vitro, the physiological substrate for the protein may not be inorganic pyrophosphate. Some phosphatases such as the binuclear iron-center containing acid phosphatase from bovine spleen also hydrolyse pyrophosphate and are thus rather substrate unspecific [19]. On the other hand, the presence of several inorganic pyrophosphatases in the same organism, as in D. vulgaris, has also been reported in the phototrophic bacterium Rhodospirillum rubrum which contains both a soluble and a membrane-bound enzyme [6]. The latter if thought to be able to translocate protons in a manner corresponding to that of ATP-ase.


Acknowledgement – The authors than Mr. M. Howard for his skillful technical help and Mr. B.C. Pickril for preliminary sequence determination. This work was supported by the Belgian National Incentive Program on Fundamental Research in the Life Sciences, initiated by the Belgian State-Prime Minister’s Office-Science Policy Programming Department (Contract Bio 22). The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be hereby marked “advertisement” in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact. 7.6. References

1. Lampreia, J., Moura, I., Teixeira, M., Peck, H.D.Jr., LeGall, J., Hyunh, B.H., and Moura, J.J.G. (1990) Eur. J. Biochem. 188, 653-664

2. Liu, M.-Y., and LeGall, J. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 171, 313-318

3. LeGall, J. Prickril, B.C., Moura, I., Xavier, A.V., Moura, J.J.G., and Huynh, B.H. (1988) Biochemistry 27, 1636-1642

4. Sieker, L.C., Stenkamp, R.E., Jensen, L.H., Prickril, B.C., and LeGall, J. (1986) FEBS Lett. 208, 73-76

5. Werth, M.T., Kurtz, D.M.Jr., Moura, I., LeGall, J. (1987) J. Am. Chem. Soc. 109, 273-275

6. Koral, A.T., Zambrano, I.C., Moura, I., Moura, J.J.G., LeGall, J., and Johnson, M.K. (1988) Inorg. Chem. 27, 1162-1166

7. Dawson, J.W., Gray, H.B., Hoenig, H.E., Rossman, G.R., Schredder, J.M., and Wang, R.H. (1972) Biochemistry 11, 461-465

8. Sjöberg, B.M. and Gräslund, A. (1983) Adv. Inorg. Biochem. 5, 87-110

9. Doi, K., Antanaitis, B.C. and Arsen, P. (1988) Structure and Bonding 70, 1-26

10. Woodland, M.P., Daulat, S.P., Cammack, R., and Dahon, H. (1987) Biochim. Biophys. Acta 873, 237-242

11. Chasteen, N.D., Antanaitis, B.C., and Aisen, P. (1985) J. Biol. Chem. 260, 2926-2929

12. Adman, I.T., Sieker, L.C., Jensen, L.H., Bruschi, M. and LeGall, J. (1977) J. Mol. Biol. 112, 113-120

13. Prickril, B.C., Kurtz, D.M., LeGall, J., Johson, M.K., Huang, H.Y., and Czernuszewics, R. (1989) J. Inorg. Biochem. 3-4, 228, G073

14. Klippenstein, G.L., Holleman, J.W., and Klotz, I.M. (1986) Biochemistry 7, 3868-3878

15. Loehr, J.S., and Loehr, T.M. (1979) in Advances of Inorganic Biochemistry, Vol. 1 (Eichhorn, G.L. and Marzilli, L.O., eds.), Elsevier North Holland, Amsterdam, pp. 235-251

16. Uchida, T., Yano, H., Satake, K., Kubota, I., and Tsugida, A. (1990) Protein Sec. Data Anal. 3, 141-147


17. Richardson, J.S. (1981) Adv. Protein

Chem. 34, 167-339

18. Sieker, L.C., Turley, S., Prickril, B.C., and LeGall, J. (1988) Proteins 3, 184-186

19. Saint-Martin, P., Lespinat, P.A., Fauque, G., Berlier, Y., LeGall, J., Moura, I., Teixeira, M., Xavier, A.V., and Moura, J.J.G. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9378-9380

20. Hong, J.-S., and Rabinowitz, J.C. (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 29, 246-252

21. Amons, R. (1987) FEBS-Lett. 212,

68-72

22. Thomsen, J., and Bayne, S. (1988) Abstract from Journal of Protein Chemistry, 7 (3), MPSA Short Communications 7, 295-296

23. Bozzini, M., Bello, R., Chui, A., and Dupont, D. (1989) in Biosystems Reporter 6, p. 9

24. Loo, J.A., Edmonds, C.G., Smith, R.D., Lacey, M.P., and Keough, T. (1990) Biomed. Environ. Mass Spectrom. 19, 286-294


8.7. Supplemental Material

8.7.1. Sequence analysis of the native protein (Table S.I) The N-terminal sequence of the native declustered protein was determined up to residue 51 with lack of assignment at the positions 28, 34, 42, 47 and 50. The fact that the level of the background of all the PTH-amino acids was not constant from one Edman cycle to the next one, combined with the very small individual increases of the PTH amounts at these 5 positions did not permit further unambiguous identification. 8.7.2. Peptides from cyanogen bromide cleavage The cleavage with cyanogen bromide of the native protein resulted in two peptides which were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. One electroeluted band (CN2) could be sequenced for 48 residues and had tyrosine as N terminus. Except for the positions 17, 23, 24, 28 and 29, the sequence was as given in Fig. 1 covering the region 101-149. The second band of only slightly different mobility from the first one contained the N-terminal sequence of the protein. The quantitative data for the sequence runs were found to be lost at the moment this paper has been written up. 8.7.3. Peptides from the partial acid hydrolysis (Fig. 8.2, Table S.II and S.III) The major peak, H8, in the separation pattern of the partial hydrolysate of the apoprotein contains 53 residues and is the C-terminal H-peptide. We sequenced it twice, one time before and a second time after pyridylethylation in the gas phase. In both cases 44 Edman steps were performed with, in the case of pyridylethylated peptide, identification of the residues 21, 24, 37 a,d 40 as the pyridylethyl-derivates of cysteine. The longest H-peptide, H12A, is composed of 69 residues and covers the region 69-137. It contains an uncleaved Asp-Thr bond. The peptide that did originate from the cleavage of this bond is H10. Its sequence determination revealed the unidentified residues 23, 27, 28 and 29 of H12A as Ala, His, His and Glu respectively and also extended the sequence of the latter peptide with 22 more residues. The flanking peaks of H10 both contained peptides with the same initial sequence as H10. The amino acid composition of the first eluted peptide H9 is in agreement with the total number of some 50 residues. H10 and H11, therefore, very likely have the same total length but should have some differently modified residues such as for example partially oxidized methionines. The N-terminal H-peptide could be identified as H4 and H5, but also as one of the two peptides of the mixture H3 (H3A). The two smaller peaks H1 and H2 seen earlier in the chromatogram are both 7 residues long, but differ in polarity. Peptide H2 covers the region Gly38-Asp44, whereas peptide H1 covers the region from Ile45 to Asp51 but contains one more acidic residue, H1 is also the N-terminal part of peptide H6 which gives a clear overlap with the last residues determined during the sequence run of the native protein, thereby extending the knowledge of the N-terminal sequence of the rubrerythrin up to residue 61.


8.7.4. Peptides from the digest with S. aureus protease (Fig. 8.3 and 8.4, Table S.IV and S.V) As could be expected from its width, peak S11 contained several peptides. Sequences analysis revealed a major peptide (A) which appeared to be the N-terminal S-peptide of the rubrerythrin. Two other peptides, (B) and (C), could be recognized as starting respectively at Met19 and Tyr16 of peptide H10, giving information up to position 139 (protein numbering). An unambiguous sequence identification in this part of the protein, however, was obtained by analysing the pure peptide S10, which on the basis of its amino acid composition contained some 50 residues including 9 glutamic acids. Only one of these appeared to be a glutamine (Gln 160) so that 7 Glu-X bonds have been uncleaved under the circumstances of the digest used. The earliest eluted main fraction of the S. aureus protease digest, S4, was a mixture of a major pentapeptide containing the last 5 residues of the protein, and three minor but longer peptides. The precise identity of all these peptides was revealed following sequence analysis of the peptides obtained after pyridylethylation of fraction S4 with subsequent separation of the mixture on a narrow-bore PTC-18 column (Fig. 4). The C-terminal peptides (S4A) of the protein eluted with the highest acetonitrile concentration, but also the 2 smaller peaks eluted somewhat earlier (A’ and A’’) have the same amino acid sequence. The amino acid composition of S4A fits the proposed sequence very well taken into account that the trypthophan residue was destroyed completely during acid hydrolysis (Table S.V). Peptide S4 (PE)B was of great importance since it definitely contained two cysteine residues, one at position 2 and one at position 5. These residues were confirmed by sequence analysis of peptide S4(PE)D which contained the sequence of of S4(PE)B from residue 7 onwards as the result of an uncleaved Glu-Leu bond; the pyridylethylated cysteines in S4(PE)D were consequently detected at the Edman cycles 8 and 11 in S4(PE)D. The third major peptide (S7) yielded no sequence information. As the amino acid analysis revealed the absence of peptide material, the peak must be due to a UV-absorbing impurity. The smaller peak S8 contained useful information as it covered the region starting with Thr49, and, on the basis of the amino acid composition, ending at Glu94. In this peptide, a Glu-Arg, a Glu-His, a Glu-Gly and a Glu-Ile bond have not been cleaved. Peptide S5 can be considered to be a subfragment of S8. It resulted from a cleavage of the Glu70-Ile71 bond and confirmed the sequence region Ile 80-Asp 82 already found in peptide H12A. Finally, the sharp peaks S1, S2 and S3 seen immediately after the infection peak (5 Fig. 7.3) are all tripeptides. Their amino acid compositions (Table S.V) suggest that they are the sequences Tyr98-Glu100, Gly167-Glu172 and Phe130-Glu 132 respectively.


8.7.5. Peptides from the Lys-C endoproteinase digests (Fig. 8.5 and Fig. S.I, Table S.VI and S.VII) A first digest of apoprotein with an enzyme/substrate ratio of 1/40 resulted in the separation pattern given in Fig. 5. Taken the differences of the sensivity setting during the elution into account, one can distinguish the presence of 4 major peptides (K1, K3, K4 and K5) and a few minor peptides (K2, K6 and K7). The sequence analysis of K7 was most useful, especially as it provided, at the Edman cycles, 7, 9, 12 and 27-31, the confirmation of the residues occuring in the peptides H2, H6 and S5. Peptide K7 has a lysine residue as N-terminus due to a Lys-Lys cleavage, and also contained 2 uncleaved Lys-X bonds (X= Arg and Lys). None of the other peptides was purer than 75 %. Peptide K5 apparently contained two peptides differing at the N-terminal side by an extension of 4 residues: the major peptide started off at Arg59 whereas the minor peptide started off at Phe63 as the consequence of an uncleaved Lys-Phe bond. The major component in K1 contained the sequence Asn11-Lys 35 of the rubrerythrin whereas the main peptide in peak K2 covered the region Asp37-Lys58 with the sequence preceding peptide being contaminant. K1 and K2 could be completely purified by rechromatography on a PTC-column (separation not shown). The amino acid compositions confirmed the proposed peptide lengths whereas the sequence run of K1A confirmed the identity of Asn28 and Ala34. The peptide mixture K3 not only contained the main component of K2 (K3D) as could be expected from the incomplete resolution (Fig. 5), but also the C-terminal peptide Ala181-Trp191 (K3A), a peptide starting off a Glu144, and one starting off a Arg134 (K3C) with an uncleaved Lys-Glu bond. Fraction K4, in spite of its split-peak appearance, was a pure peptide with the same initial sequence as K3C. Finally, fraction K6 was found to have same heterogenous composition of peptide K5.

Figure S.1. Separation of a second digest on 15 nanomoles of apo-rubrerythrin with Lys-C endoproteinase at prolonged period (17 hours instead of 4 hours as in Fig. 7.5).


The Lys-C protease digest was carried out for a second time with a higher ratio of E/S of 1/20 and a longer incubation time (17 instead of 4h). This resulted in a completely pure peptide K’2 (Fig. S.I) corresponding to the main component of K5. Apparently, the more extensive digest conditions resulted in more Lys-X bond cleavages, not only causing the disappearance of the peptides K6 and K7 but also peptide Arg59-Lys133 in the mixture K5. The bad separation of the early eluted peptides in Fig. 5 is not welll understood. The sequence analysis of peptide K’2 allowed the definite identifiation of the Gly-Gly sequence after the fifth Edman cycle and the confirmation of Asp69. The amino acid composition of K’2 (Table S.VII) completely corroborated the proposed sequence. 8.7.6. C-terminal sequence evidence (Fig. S.II) The fact that the peptides S4A and K3A have a common sequence from position 186 onwards but could not be sequenced up to a residue that can be expected from the specificity of the protease used to obtain them, was a first indication that they constitute the C-terminal sequence of the protein. The amino acid analysis of S4A also showed that this peptide is certainly not longer than 6 residues and the measurement of the precise mass by PDMS, both of S4A and K3A, definetely proved that there is a tryptophan residue following asparagine. The treatment of the native protein with carboxypeptidase P released the amino acids expected from the proposed sequence although the stoichiometry of release was only about 0.1 residue per mole of protein. We have no other explanation for this limited release than to assume that the C-terminal end in the three-dimensional structure of the native protein must have a rather hidden position such that the protease is strongly hindered in its action.

In the following tables with sequence results, the net increases of the given residues at each Edman cycle compared to the previous step are given in picomoles. Values smaller than 10 picomoles are reported with a decimal. Because of the coëlution

Figure S.II. Release of amino acids from native rubreruthrin after incubation for different lengths of time with carboxypeptidase P.


of PTH-Trp with diphenylurea, the values for tryptophan are not absolute and are mentioned between brackets. When two peptides in a mixture have the same residue at a given position this is indicated by mentioning that residue halfway the columns with the data for each peptide. When the mixture consists of more than two peptides, the same amino acid in two peptides is sometimes indicated with “+’ in one of the peptides (as e.g. in Table S.IV). When a sequence was deliberately stopped, this is indicated as ‘ ‘. The sign ‘----‘ at the bottom of the column means that no more amino acids could be identified at that cycle nor at two subsequent cycles. The position of the peptide in the total sequence of the protein is indicated at the bottom of each column. When there is no certainty about the identity of the C-terminal residue in the peptide, this fact is shown by leaving a blank. Peptides that are mentioned in Fig. 7.1. are underligned.

Samenvatting en Besluit 190

Samenvatting en Besluit

1. Primaire structuurbepalingen

In dit doctoraatsverhandeling werden de primaire structuurbepalingen van hoog-potentiaal ijzer-zwaveleiwitten beschreven en uitvoerig besproken. Een hoog-potentiaal ijzer-zwaveleiwit, afgekort HiPIP, is een klein proteïne dat in fotosynthetische bacteriën algemeen voorkomt en een rol speelt in de elektronentransfer van het cytochroom bc1 complex naar het fotosynthetisch reactiecentrum. Kenmerkend voor deze eiwitten zijn de cluster oxidatietoestand van 2+ of 3+ en een hoge redoxpotentiaal. HiPIP’s zijn leden van de [4Fe-4S] ijzer-zwaveleiwitgroep. Daartoe behoren ook de ferredoxinen die gekenmerkt zijn door een negatieve redoxpotentiaal en oxidatietoestanden van 1+ en 2+, en die wijdverspreid in alle organismen voorkomen. Juist door de beperkte verspreiding en hun hoge redoxpotentiaal vormen HiPIP’s een interessante groep van eiwitten om er structuur-functierelaties van te bestuderen (Hoofdstukken 1 en 2).

Voor dit structuur-functie onderzoek werden de aminozuurvolgordes van HiPIP’s uit twaalf verschillende fotosynthetische bacteriën via eiwitchemische en massaspectrometrische weg bepaald (Hoofdstuk 4). Hiervoor werden diverse methodologieën ontwikkeld met als doel nauwkeurige massametingen van holo-proteïne en apo-proteïne te kunnen uitvoeren. Aldus werden de post-translationele modificaties van deze HiPIP’s gedetecteerd en geïdentificeerd en de aminozuurvolgordes volledig bepaald, ook mede dank zij de introductie van tandem massaspectrometrische fragmentatietechnieken. Het amino-terminus van Ectothiorhodospira mobilis iso II HiPIP blijkt geblokkeerd te zijn door de aanwezigheid van een carbamylgroep. Dit feit is ongewoon, gelet op de natuur en het voorkomen van dit type modificatie (Hoofdstuk 6). De meest voorkomende amino-terminale blokkeringen van een eiwit zijn immers acetylatie, formylatie en cyclisatie van glutamine tot pyroglutamaat. De eerste twee types van modificaties komen vaak voor bij eukaryote eiwitten en slechts heel zelden bij een bacterieël eiwit. Door vergelijking van fragmentatiepatronen van een geacetyleerd en gecarbamyleerd synthetisch peptide met het amino-terminaal geblokkeerde peptide, bekomen na knippen van het eiwit in kleinere fragmenten met behulp van een geschikt protease, konden we de natuur van de N-terminale modificatie van het hier besproken eiwit bevestigen. Verder konden we ook aantonen dat het amino-terminaal gebied van Rhodomicrobium vannielii en Rhodobium marinum HiPIP op verschillende plaatsen geknipt werd na post-translationele verwijdering van het signaalpepide . Uit de hierboven beschreven voorbeelden blijkt dus duidelijk dat massaspectrometrische methoden een belangrijke rol toebedeeld krijgen in de primaire structuuropheldering van eiwitten. Deze techniek werd ook verder ontwikkeld ter identificatie van een variant in de aminozuurvolgorde van sommige eiwitten. Een voorbeeld hiervan is de mutatie van één aminozuur in de sequentie van Rhodopseudomonas cryptolactis HiPIP, namelijk valine naar isoleucine op positie 38. De technieken waarvan sprake maken gebruik van hoog-technologische apparatuur, namelijk een electrospray-ionization — Time of Flight —


massaspectrometer (Q-TOF) en een daaraan gekoppelde nano-spray ionisatiebron (Hoofdstuk 4). 2. Klassificatie van de familie der HiPIP’s Na vergelijking van de ruimtelijke structuren van HiPIP’s uit Allochromatium vinosum, Marichromatium purpuratum, Thermochromatium tepidum, Ectothiorhodospira vacuolata iso 2, Halorhodospira halophila iso 1 en Rhodocyclus tenuis werden de exacte posities van hun deleties en inserties in de onderlinge sequentie-alignering bepaald en als leidraad voor de verdere alignering met andere, van dit doctoraatswerk afkomstige, aminozuurvolgordes gebruikt. Na de eerste publicatie van de alignatie van Rhodoferax fermentans HiPIP met andere gepubliceerde HiPIP’s (Hoofdstuk 5) werd deze alignatie met elf nieuwe sequenties verder verfijnd en gecorrigeerd (Hoofdstuk 7). Op basis van de in deze vergelijkende studie besproken alignatie mogen we besluiten dat de HiPIP-sequenties volgens hun insertie/deletie-patronen in drie grote groepen kunnen onderverdeeld worden, in het algemeen overeenkomstig hun respectievelijke oorsprong in de familie der fotosynthetische bacteriën. Deze drie grote groepen kunnen verder onderverdeeld worden op basis van dezelfde criteria, resulterend in zeven verschillende subgroepen. Uit deze studie valt ook op dat HiPIP’s uit de families der Chromatiaceae en Ectothiorhodospiraceae, en dit in tegenstelling tot deze der Rhodospirillaceae, een hoge mate van onderling sequentiebehoud vertonen. Gaan we de verspreiding van identieke en conservatief gesubstitueerde aminozuren van een bepaalde subgroep in hun overeenkomstige ruimtelijk structuur na, dan blijkt dat het grootste gedeelte van de geconserveerde aminozuren rondom het ijzer-zwavelcluster liggen, vooral in het gebied waar het cluster dicht aan de buitenste omgeving van het eiwit blootgesteld wordt. Dit gebied is vooral opgebouwd uit hydrofobe aminozuren waar positief en negatief geladen residu’s ontbreken en grotendeels aan de andere kant van het hydrofobe gebied liggen. 3. Aanwijzigingen voor het interactiegebied van HiPIP’s met het fotoreactiecentrum tijdens de bacteriële fotosynthese

Het onderling sterke sequentiebehoud bij de Chromatiaceae en Ectothiorhodospiraceae HiPIP’s komt goed overeen met het feit dat deze redoxproteïnen een belangrijke rol spelen in de elektronentransfer van het cytochroom bc1 complex naar het fotosynthetisch reactiecentrum. Merken we ook op dat HiPIP’s, in tegenstelling tot cytochromen, in de hier besproken families in grote hoeveelheden aangemaakt worden, daar waar voor de Rhodospirillaceae een omgekeerde situatie geldt. We hebben ook een literatuurstudie doorgevoerd over de eiwitsamenstelling van redoxproteïnen van diverse species behorend tot de verschillende purper-fotosynthetische families (Hoofdstuk 7). Gelet op deze gegevens mogen we aannemen dat, alhoewel het precieze mechanisme nog niet gekend is, de elektronentransfer via het hydrofobe gebied aan het oppervlak van het eiwit rondom het ijzer-zwavelcluster gebeurt. Dit gebied is opgebouwd uit identieke en/of conservatief gesubstitueerde aminozuren. Dit is verder ondersteund door plaatsgerichte mutagenese van het tetraheemcytochroom c van het fotosynthetisch reactiecentrum (Oscyzka et al. 1999) waarbij werd aangetoond dat hydrofobe aminozuren een belangrijke rol spelen voor de interactie tussen HiPIP en het cytochroom. In de purper niet-zwavelfamilie der Rhodospirillaceae worden in het algemeen vooral cytochromen c2 en c8 in grote hoeveelheden aangemaakt die de elektronentransfer van het


cytochroom bc1 complex naar het fotosynthetisch reactiecentrum verzorgen. Omdat HiPIP’s in deze familie weinig aangemaakt worden en geen belangrijke rol als elektronentransporter hebben, of een totaal andere rol hebben, kan men hun zwak onderling sequentiebehoud verklaren. In tegenstelling tot de hoger besproken fotosynthetische families vertoont deze groep HiPIP’s ook een veel kleiner gebied van conservatief gesubstitueerde aminozuren rondom het ijzer-zwavelcluster en het conservatieve tyrosineresidue. Teneinde precies inzicht te krijgen in de wijze waarop kleine HiPIP’s (50-55 aminozuren) hun hoge potentiaal moduleren, en met hun redoxpartner interageren was het ook de bedoeling de 3D-structuur van enkele HiPIP’s te bepalen door X-stralen diffractiekristallografie. Voor deze experimenten hebben we HiPIP’s uit Rhodomicrobium vannielii (55 aminozuren) en Rhodospirillum salinarum iso II (52 aminozuren) als onderwerp gekozen. Opdat een structuur met behulp van deze techniek zou kunnen bepaald worden moeten er eerst kristallen van het eiwit gegenereerd worden. Na uitzoeken van geschikte omstandigheden werden er grote kristallen bekomen (3-4M ammoniumsulfaat, bij pH 6-8) (Figuren 1 en 2). Deze kristallen bleken echter niet stabiel te zijn voor X-stralenonderzoek, of diffracteerden heel slecht, zodat een verdere zoektocht naar betere kristallogenese noodzakelijk is.

Figuur 1. Kristallen van Rhodospirillum salinarum iso II HiPIP in 2.4M ammoniumsulfaat, pH 6.


Referenties Osyczka, A., Nagashima, K.V.P., Sogabe, S., Miki, K., Shimada, K., Matsuura, K. (1999). Comparison of the binding sites for high-potential iron-sulfur protein and cytochrome c on the tetraheme cytochrome subunit bound to the bacterial photosynthetic reaction center. Biochemistry 38, 15779-15790

Figuur 2. Kristallen van Rhodomicrobium vannielii in 3.2M ammoniumsulfaat, pH 7.

Appendix A: Aminozuren en hun residuële massa’s i

Symbolen en residuële massa’s van de twintig in natuur meest voorkomende aminozuren Symbolen Naam Monoisotopische Gemiddelde massa (Da) massa (Da) A Ala alanine 71.03 71.08 R Arg arginine 156.10 156.19 N Asn asparagine 114.04 114.10 D Asp asparaginezuur 115.03 115.09 C Cys cysteïne 103.01 103.14 Q Gln glutamine 128.06 128.13 E Glu glutaminezuur 129.04 129.12 G Gly glycine 57.02 57.05 H His histidine 137.06 137.14 I Ile isoleucine 113.08 113.16 L Leu leucine 113.08 113.16 K Lys lysine 128.09 127.17 M Met methionine 131.04 131.20 F Phe phenylalanine 147.07 147.18 P Pro proline 97.05 97.12 S Ser serine 87.03 87.08 T Thr threonine 101.05 101.10 W Trp tryptofaan 186.08 186.21 Y Tyr tyrosine 163.06 163.18 V Val valine 99.07 99.13 Residuële massa’s van gemodificeerde cysteïnes Naam Monoisotopische Gemiddelde massa (Da) massa (Da) cysteïne 103.01 103.14 aminoethylcysteïne 146.05 146.21 aminopropylcysteïne 160.05 160.21 carboxymethylcysteïne 161.01 161.18 cysteïnezuur 150.99 151.14 pyridylethylcysteïne 208.10 208.30

Appendix B: Gekende post-translationele modificaties ii

Overzicht van in natuur veel voorkomende post-translationele modificaties van eiwitten en peptiden, en hun gemeten massaverschillen ten opzichte van niet-gemodificeerde eiwitten of peptiden Type modificatie Monoisotopische Gemiddelde massa (Da) massa (Da) Vorming van pyroglutaminezuur -17.03 -17.03 Vorming van zwavelbrug -2.01 -2.01 C-terminaal amidatie -0.98 -0.98 Deamidatie van Asn of Gln 0.98 0.98 Methylatie 14.02 14.03 Hydroxylatie 15.99 15.99 Oxidatie van methionine 15.99 15.99 Proteolyse van een peptide binding 18.01 18.02 Formylatie 27.99 28.01 Acetylatie 42.01 42.03 Carboxylatie van Asp of Glu 43.99 44.01 Phosphorylatie 79.96 79.98 Sulfatie 79.96 80.06 Pentosen (Ara, Rib, Xyl) 132.04 132.12 Deoxyhexosen (Fuc, Rha) 146.06 146.14 Hexosaminen( GalN, GlcN) 161.07 161.16 Hexosen (Fru, Gal, Glc, Man) 162.05 162.14 N-acetylhexosaminen (GalNAc, GlcNAc) 203.08 203.20 Farnesylatie 204.18 204.36 Myristylatie 210.20 210.36 Palmitoylatie 238.23 238.41 Stearoylatie 266.26 266.47 Geranylatie 291.09 291.26 N-acetylneuraminezuren (Siaalzuur, NeuAc) 291.09 291.26 Gluthationylatie 307.09 307.26 Adenosylatie 329.05 329.21 Phosphopanteïne 339.08 339.33 ADP-ribosylatie 541.06 541.31

Appendix B: Gekende post-translationele modificaties iii

Gekende post-translationele modificaties1 met hun respectievelijke massatoenames in het gebied 30 - 60 Da Massatoename Type modificatie 30 6,7 Dione (van tryptofaan) 32 3,4,6-Trihydroxy-Phenylalanine (van tyrosine) (TOPA) 32 3,4-Dihydroxylatie (van proline) 32 Oxidatie van methionine (naar het sulfon) 34 3-Chlorinatie van tyrosine (met 35Cl) 36 3-Chlorinatie van tyrosine (met 37Cl) 38 Kalium 42 Acetylatie 43 Carbamylatie 43 N-Trimethylatie van lysine 44 γ -Carboxylatie van glutamaat of β-carboxylatie van aspartaat 44 Di-natrium 45 Nitro (NO2) 46 β-Methylthio-asparaginezuur 56 t-Butyl ester (OtBu) and t-butyl (tBu) 57 Glycyl (-G-,-Gly-) 58 Carboxymethyl (van cysteïne) 60 Natrium en kalium

1 Bron: http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home

Appendix C: Bacteriële species en hun afkortingen iv

Alfabetische lijst van besproken bacteriële species en hun afkortingen Acinetobacter calcoaceticus Ac. calcoaceticus Acidithiobacillus ferrooxidans Atb. ferrooxidans Allochromatium vinosum Ach. vinosum Allochromatium warmingii Ach. warmingii Azotobacter vinelandii Az. vinelandii Bacillus subtilis B. subtilis Blastochloris viridis Blc. viridis Chloroflexus aurantiacus Cfl. aurantiacus Chlorobium limicola Chl. limicola Clostridium acidi-urici Cl. acidi-urici Clostridium pasteurianum Cl. pasteurianum Clostridium sticklandii Cl. sticklandii Ectothiorhodospira mobilis Ect. mobilis Ectothiorhodospira shaposnikovii Ect. shaposnikovii Ectothiorhodospira vacuolata Ect. vacuolata Escherichia coli E. coli Desulfovibrio africanus D. africanus Desulfovibrio desulfuricans D. desulfuricans Desulfovibrio gigas D. gigas Desulfovibrio vulgaris D. vulgaris Halobacterium halobium Hb. halobium Haemophilus influenzae Hph. influenzae Halochromatium salexigens Hch. salexigens Halorhodospira abdelmalekii Hlr. abdelmalekii Halorhodospira halochloris Hlr. halochloris Halorhodospira halophila Hlr. halophila Heliobacillus mobilis Hba. mobilis Isochromatium buderi Ich. buderi Marichromatium gracile Mch. gracile Marichromatium purpuratum Mch. purpuratum Paracoccus sp. Phaeospirillum molischianum Psp. molischianum Phaeospirillum fulvum Psp. fulvum Pseudomonas aeruginosa Ps. aeruginosa Pseudomonas oleovorans Ps. oleovorans Pseudomonas putida Ps. putida Pseudomonas stutzeri Ps. stutzeri Ralstonia metallidurans Ral. metallidurans Ralstonia solaneacarum Ral. solaneacarum Rhodobacter capsulatus Rba. capsulatus Rhodobacter sphaeroides Rba. sphaeroides Rhodobium marinum Rbi. marinum Rhodocista centenaria Rcs. centenaria

Appendix C: Bacteriële species en hun afkortingen v

Rhodocyclus erythropolis Rcy. erythropolis Rhodocyclus tenuis Rcy. tenuis Rhodocyclus purpureus Rcy. purpureus Rhodoferax fermentas Rfx. fermentans Rhodomicrobium vannielii Rmi. vannielii Rhodopila globiformis Rpi. globiformis Rhodopseudomonas acidophila Rps. acidophila Rhodopseudomonas palustris Rps. palustris Rhodopseudomonas cryptolactis Rps. cryptolactis Rhodospirillum rubrum Rsp. rubrum Rhodospirillum photometricum Rsp. photometricum Rhodothermus marinus Rth. marinus Rhodovibrio salinarum Rhv. salinarum Rhodovibrio sodomensis Rhv. sodomensis Rhodovulum adriaticum Rdv. adriaticum Rhodovulum sulfidophilum Rdv. sulfidophilum Rubrivivax gelatinosus Rvi. gelatinosus Thiocapsa roseopersicina Tca. roseopersicina Thiocapsa sp., stam CAU Tca. sp, stam CAU Thiococcus pfennigii Tco. pfennigii Thiocystis violacea Tcs. violacea Thermochromatium tepidum Tch. tepidum Thermus aquaticus Th. aquaticus

Appendix D: Lijst der afkortingen vi

Lijst der afkortingen ADP Adenosine difosfaat Ara Arabinose ATP Adenosine trifosfaat ATZ Anilinothiozolinone CID ‘Collision induced dissociation’ CVF ‘Cone voltage fragmentation’ Da Dalton Dfx Desulfoferrodoxine DNA Deoxyribonucleïnezuur EPR Elektronen paramagnetisch resonantie ESI Electrospray ionisatie Fd Ferredoxine FAD Flavine adenine dinuleo- tide Fe-S Ijzer-zwavel FMN Flavine mononucleotide Fru Fructose Fuc Fucose Gal Galactose GalN Galactosamine GalNAc N-acetyl galactosamine Glc Glucose GlcN Glucosamine GlcNAc N-acetyl glucosamine HiPIP Hoge potentiaal ijzer- zwavel eiwit HPLC Hoge druk vloeistofchromatografie kDa kiloDaltons LC vloeistofchromatografie MALDI ‘Matrix assisted laser desorption ionization’ Man Mannose MS Massaspectrometrie mV millivolts MW Moleculair gewicht NAD(H) Nicotinamide adenosine dinucleotide (hydrogen) NAD(P) Nicotinamide adenosine dinucleotide (fosfaat)

NMR Nucleair magnetisch resonantie NeuAc N-acetyl neuraminezuur ORF Open reading frame PAGE Polyacrylamide gel electroforese PDMS ‘plasma desorption mass spectrometry’ pI Isoelectrische punt PS Fotosynthese PSD ‘Post source decay’ PTC Fenylthiocarbamyl PTH Fenylthiohydantoïne PVDF Polyvinylideen difluoride RC Reactiecentrum Rd Rubredoxine Rha Rhamnose Rib Ribose SDS ‘Sodium dodecylsulfate’ TOF ‘Time of flight’ UV Ultraviolet Xyl Xylose

Appendix E: Publicatielijst

vii

Publicatielijst

- Publicaties in verband met dit proefschrift

1. “The primary structure of rubrerythrin, a protein with inorganic pyrophosphatase activity from

Desulfovibio vulgaris. Comparison with hemerythrin and rubredoxin" J. Biol. Chem. (1991), 266, 20645-20653 Van Beeumen, J.J., Van Driessche, G., Liu, M.-Y., and LeGall, J. (Hoofdstuk 8)

2. "The primary structure of Rhodoferax fermentans high potential iron-sulfur protein, an electron donor to the photosynthetic reaction center" Eur. J. Biochem. (1997) 244, 371-377 Van Driessche, G., Ciurli, S., Hochkoeppler, A. and Van Beeumen, J. (Hoofdstuk 5)

3. "Mass spectrometric identification of in vivo carbamylation of the amino terminus of Ectothiorhodospira mobilis High-Potential Iron-Sulfur Protein, isozyme 1" J. Mass Spectrom. (2002), in press Van Driessche, G., Vandenberghe, I., Jacquemotte, F., Devreese, B. and Van Beeumen, J.J. (Hoofdstuk 6)

4. "Amino acid sequences and distribution of High-Potential Iron-Sulfur Protein proteins that donate electrons to the photosynthetic reaction center in purple phototrophic bacteria" J. Mol. Evol. (2002), submitted Van Driessche, G., Vandenberghe, Devreese, B., Samyn, B., Meyer, T.E., Leigh, R., Cusanovich, M.A., Bartsch, R.G., Fischer, U. and Van Beeumen, J.J. (Hoofdstuk 7)

- Andere publicaties

1. “Electron transfer proteins of the purple phototrophic bacterium, Rhodopseudomonas rutila” Arch. Biochem. Biophys. (1991) 286, 389-393 Meyer, T.E., Fitch, J. Van Driessche, G., Van Beeumen, J., Fischer, U., Bartsch, R.G. and Cusanovich, M.A.

2. “The primary structure of cytochrome c-554 from the green photosynthetic bacterium

Chloroflexus aurantiacus” Biochemistry (1991), 30, 11451-11458 Dracheva, S., Williams, J.C., Van Driessche, G., Van Beeumen, J. and Blankenship, R.E.

3. “Cloning and sequencing of the gene coding for the large subunit of methylamine dehydrogenase

from Thiobacillus versutus” J. Bacteriol. (1993), 175, 6254-6259


viii

Huitema, F., Van Beeumen, J., Van Driessche, G., Duine, J.A. and Canters, G.W. 4. “N-terminal heterogeneity of methylamine dehydrogenase from Thiobacillus versutus”

FEBS Lett. (1993), 133, 188-192 Van Beeumen, J., Van Driessche, G., Huitema, F., Duine, J.A. and Canters, G.A.

5. "Heterogeneity of the covalent structure of the blue copper protein umecyanin from horseradish

roots" Protein Sci. (1995) 4, 209-227 Van Driessche, G., Dennison, C., Sykes, A.G., and Van Beeumen, J.

6. “A high potential soluble cytochrome c-551 from the purple phototrophic bacterium

Chromatium vinosum is homologous to cytochrome c8 from denitrifying pseudomonads” Eur. J. Biochem. (1996), 236, 689-696 Samyn, B., De Smet, L., Van Driessche, G., Meyer, T.E., Bartsch, R.G., Cusanovich, M.A.

7. “Sequence evidence for strong conservation of the photoactive yellow proteins from the halophilic

phototrophic bacteria Chromatium salexigens and Rhodospirillum salexigens” Biochemistry (1996), 35, 2526-2534 Koh, M., Van Driessche, G., Samyn, B., Hoff, W.D., Meyer, T.E., Cusanovich, M.A. and Van Beeumen, J.

8. “Electron transfer properties and active site structure of the type I (blue) copper protein

umecyanin” Chem. Eur. J. (1996), 2, 104-109 Dennison, C., Van Driessche, G., Van Beeumen, J., McFarlane, W. and Sykes, A.G.

9. "Covalent structure of the flavoprotein subunit of the flavocytochrome c: sulfide dehydrogenase from the purple phototrophic bacterium Chromatium vinosum" Protein Sci. (1996) 5, 1753-1764 Van Driessche, G., Koh, M., Chen, Z.-W., Mathews, F.S., Meyer, T.E., Bartsch, R.G., Cusanovich, M.A. and Van Beeumen, J.

10. "The origin of hyaluronectin in human tumors"

Int. J. Cancer (1997) 72, 942-948 Delpech, B., Girard, N., Olivier, A., Maingonnat, G., Van Driessche, G., Van Beeumen, J., Bertrand, P., Duval, C., Delpech, A. and Bourgignon, J.

11. .”Structural characterization or Paracoccus denitrificans cytochrome c peroxidase and assignment

of the low and high potential heme sites” Biochemistry (1997), 36, 7958-7966 Hu, W., Van Driessche, G., Devreese, B., Goodhew, C.F., McGinnity, D.F., Saunders, N., Fulop, V. Pettigrew, G.W. and Van Beeumen, J.J.

12. “Ligand binding and covalent structure of an oxygen-binding heme protein from Rhodobacter sphaeroïdes, a representative of a new structural family of c-type cytochromes” Biochemistry (1998) 37, 5995-6002.


ix

Klarskov, K., Van Driessche, G., Backers, K., Meyer, T.E., Tollin, G., Cusanovich, M.A. and Van Beeumen, J.J

13. “The primary structures of the low-redox potential diheme cytochromes c from the phototrophic

bacteria Rodobacter sphaeroides and Rhodobacter adriaticus reveal a new structural family of c-type cytochromes” Biochemistry (1998) 37, 13075-13081 Vandenberghe, I., Leys, D., Demol, H., Van Driessche, G., Meyer, T.E., Cusanovich, M.A. and Van Beeumen, J.J.

14. “The primary structure of soluble cytochrome c-551 from the phototrophic green sulfur bacterium

Chlorobium limicola, strain Tassajara, reveals a novel c-type cytochrome” Biochemistry (1998) 37, 10555-10602 Klarskov, K., Verté, F., Van Driessche, G., Meyer, T.E., Cusanovich, M. and Van Beeumen, J.

15. “Characterization of cytochrome c-556 from the purple phototrophic bacterium Rhodobacter

capsulatus as a cytochrome-c peroxidase” Eur. J. Biochem. (1998) 258, 29-36 Hu, W., De Smet, L., Van Driessche, G., Bartsch, R.G., Meyer, T.E., Cusanovich, M.A. and Van Beeumen, J.

16 “The Dmp A aminopeptidase from Ochrobactrium anthropi LMG 7991 is the prototype of a

new terminal nucleophile hydrolase family” Biochem. J. (1999) 341, 147-155. Fanuel, L., Goffin, L., Cheggour, A., Devreese, B., Van Driessche, G., Joris, B., Van Beeumen, J. and Frère, J.M.

17 “Auracyanin A from the thermophilic green gliding photosynthetic bacterium Chloroflexus

aurantiacus represents an unusual class of small blue copper proteins” Protein Sci. (1999) 8, 947-957. Van Driessche, G., Hu, W., Van de Werken, G., Selvaraj, F., McManus, J., Blankenship, R.E. and Van Beeumen, J.J.

18. “Structure and characterization of Ectothiorhodispira vacuolate cytochrome b558, a Prokaryotic

Homologue of eukaryotic Cytochrome b5" J. Biol.Chem. (1999) 274, 35614-35620. Kostanjevecki, B., Leys, D., Van Driessche, G., Meyer, T.E., Cusanovich, M., Fischer, U., Guisez, Y. and Van Beeumen, J.

19. “Primary structure characterization of a Rhodocyclus tenuis diheme cytochrome c reveals the

existence of two different classes of low-potential diheme cytochromes c in purple phototropic bacteria” Arch. Biochem. Biophys. (2000) 381, 53-60.


x

Devreese, B., Brigé, A., Van Driessche, G., Meyer, T.E.,Cusanovich, M. and Van Beeumen, J. 20. “The dppA gene of Bacillus subtilis encodes a new D-aminopeptidase”

Mol. Microbiol. (2000) 37, 504-513. Cheggour, A., Fanuel, L., Duez, C., Joris, B., Bouilenne, F., Devreese, B., Van Driessche, G., Van Beeumen, J., Frère, J.M. and Goffin, C.

Inhoudstafel - biblio.ugent.be sequencing 127 ... Allereerst wens ik mijn promotor Prof. Dr. J. Van...

Documents

Transcript of Inhoudstafel - biblio.ugent.be sequencing 127 ... Allereerst wens ik mijn promotor Prof. Dr. J. Van...