In vitro vermeerdering van Ulva lactuca - lib.ugent.be · Abstract Voedsel en energie zullen...

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2013 – 2014

In vitro vermeerdering van Ulva lactuca.

Klaartje Bunkens

Promotor: Prof. dr. ir. Stefaan Werbrouck

Tutor: dr. Julia Wald

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van

Master of Science in de biowetenschappen: land- en tuinbouwkunde

De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te

stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de

beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdruk-

kelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.

Promotor:

Prof. dr. ir. Stefaan Werbrouck

De auteur:

Klaartje Bunkens

Voorwoord

Onze samenleving ziet zich geplaatst voor grote ecologische uitdagingen. Een groeiende we-

reldbevolking enerzijds en een zich doorzettende klimaatsverandering anderzijds dwingen ons

tot een dringende herziening van onze conventionele voedselproductie. Zeewierteelt kan een

bescheiden bijdrage leveren om ons huidige landbouwareaal uit te breiden. Bovendien kunnen

wieren ook ingezet worden als biobrandstof en als waterfilter. Wieren verbruiken immers uit-

gespoelde en/of overtollige nutriënten en kunnen zout water converteren naar zoet water. Al-

lemaal redenen om meer kennis te verzamelen over wieren en zeewier in het bijzonder. Dank-

zij deze inzichten kunnen we de fysiologie van de wieren beter begrijpen en kan het teeltsys-

teem verbeterd en duurzamer worden.

Omdat ik graag mijn steentje wil bijdragen aan het duurzamer maken van onze voedselpro-

ductie, heb ik voor dit onderwerp gekozen. Het is een klein begin, maar alle beetjes helpen.

Natuurlijk zou ik hier nooit alleen geraakt zijn. Daarom wil ik mijn promotor prof. Dr. Ir.

Werbrouck bedanken voor het ter beschikking stellen van zijn labo en zijn hulp bij de labora-

toriumproeven. Ook bedank ik graag Dr. Julia Wald en Dr. Willem Brandenburg van de Wa-

geningen Universiteit, om mij toe te laten tot dit unieke project. Ze hebben mij geïnspireerd

en ook steun geboden toen het onderzoek wat moeilijker ging. Ook dank aan alle medewer-

kers in het Laboratorium voor In Vitro Plantenbiotechnologie om een helpende hand te bieden

telkens het nodig was.

Het is in dit onderzoek gebleken dat wetenschappelijke resultaten niet altijd deze zijn die men

verwacht. Er waren heel wat tegenslagen en onverwachte resultaten. Hieruit valt te leren.

Als laatste wil ik ook heel graag mijn ouders en mijn vriend bedanken. Zij hebben mij gedu-

rende het proces gesteund en een luisterend oor geboden toen het nodig was. Dank jullie, voor

het nalezen en het advies.

Ondanks alle moeilijkheden is deze masterproef toch tot een goed einde gekomen en ik heb

veel bijgeleerd. Ik hoop dat dit eindwerk even leerzaam is voor anderen als voor mezelf en dat

het nuttig blijkt voor toekomstig onderzoek. Verder onderzoek is zeker nodig want er is geen

planeet B.

Abstract

Voedsel en energie zullen schaarser worden in de toekomst. Men zal de omvang van de voed-

selproductie moeten verdubbelen tegen 2050 en dit zal niet mogelijk zijn door conventionele

landbouw alleen. Er is voor conventionele landbouw te weinig plaats, zoet water en energie.

Een mogelijke bijdrage tot de oplossing is voedsel telen in de zee, waaronder het telen van

algen en wieren. Een duurzame optimalisering van deze teelt dringt zich op. Fundamenteel

onderzoek naar zeewier ondersteunt dit proces. Dit onderzoek beperkt zich tot één type wier,

namelijk Ulva lactuca. Het doel van dit eindwerk is de mogelijkheid te onderzoeken om Ulva

lactuca in vitro te vermeerderen.

Een in vitro cultuur van een weefsel vereist steriel weefsel. Er werden verschillende pogingen

ondernomen om een steriel stuk thallus te verkrijgen. De eerste methode was gebaseerd op de

‘landplantmethode’, namelijk via de rechtstreekse initiatie van uitwending gesteriliseerd thal-

lusweefsel op agarmedium. Verschillende klassieke sterilisatiemethoden werden uitgetest,

zoals spoelen met javel en ethanol, gassterilisatie of werken met bijzondere voedingsbodems

waarin proclin en antibiotica was verwerkt. Ulva lactuca thallus bleek zeer fragiel en niet be-

stand tegen de meeste sterilisatiebehandelingen. Ook de samenstelling van de voedingsbodem

moet verder onderzocht worden. Want hoewel zeesla een plant is, reageert het toch op een

aparte manier. De tweede methode om steriel weefsel te bekomen, bestond erin steriele sporen

of gameten te verkrijgen. Hiervoor moesten er eerst sporen of gameten gevormd worden. Dit

bleek een grotere uitdaging dan verwacht. De literatuur hieromtrent was immers niet eendui-

dig en de aangehaalde methodes niet reproduceerbaar. Een goed reproduceerbare methode om

sporen en gameten in het lab te induceren bleef uit. Het thallus reageert wel op stresscondities

door de vorming van reproductieorganen maar welke deze stresscondities precies zijn, bleef

nog onduidelijk. Het is wel zo dat het mogelijk is om deze sporen of gameten te isoleren en

steriel te krijgen. Maar voor de vorming van een effectief thallus zijn de resultaten uitgeble-

ven. De derde en laatste aanpak was om via een protoplastencultuur een steriel thallus te re-

genereren. Het was mogelijk om protoplasten te bekomen met 0,50mM MES, 1,5% cellulase,

1,5% abalone, 0,6M mannitol en 1%NaCl in miliQ water. De vorming van steriel thallus kon-

den we niet realiseren. Verder onderzoek rond de in vitro vermeerdering van Ulva lactuca is

dus nog nodig.

KERNWOORDEN: Ulva lactuca,, in vitro, protoplasten, sporen, gameten

Abstract

Food and energy will be scarce in the future. The food production must double by 2050 and

this will not be possible by conventional agriculture. There is little space, fresh water and en-

ergy for conventional agriculture. A possible contribution to the solution is to grow food in

the sea, like the cultivation of algae and seaweed. Sustainable optimization of this crop is im-

perative. Fundamental research of seaweed supports this process. This study is limited to one

type of seaweed, namely Ulva lactuca. The purpose of this thesis is to investigate how to mul-

tiply Ulva Lactuca in vitro.

An in vitro culture requires a sterile tissue. Several attempts were made to obtain a sterile

piece of thallus. The first method was based on the land plant method, namely through the

direct initiation of sterilized thallus tissue on agar medium. Several classic sterilization meth-

ods were tested , such ethanol rinse and bleach incubation, gas sterilization or administration

of ProClin 150 and antibiotics. Ulva lactuca thallus proved to be very fragile and not be re-

sistant to most sterilization treatments. The composition of the media needs to be further in-

vestigated. Even though sea lettuce looks like a land plant, it still responds differently. The

second method to obtain sterile tissue was by means of sterile spores or gametes. For this pur-

pose, the induction of spores or gametes was studied. This proved more challenging than ex-

pected. The literature was , after all, not so unambiguous and reproducible. A reproducible

method to induce spores and gametes in the lab was not developed. Normally, the thallus re-

sponds to stress conditions through the formation of reproductive organs, but the exact stress

conditions remained unclear. Although it was possible to induce and spores or gametes and to

isolate them under sterile conditions, they didn’t form a new thallus. The third and final ap-

proach was to regenerate a sterile thallus by means of a protoplast culture It was possible to

obtain protoplast with 0.50 mM MES, 1.5% cellulase, 1.5% abalone , 0.6 M mannitol, and 1%

NaCl in miliQ water solution. But we couldn’t realize the formation of sterile thallus. Further

research on the in vitro multiplication of Ulva lactuca is still needed .

KEYWORDS : Ulva lactuca, in vitro, protoplasts, spores, gametes

Inhoudstafel

Voorwoord ................................................................................................................................. 3

Abstract ...................................................................................................................................... 4

Abstract ...................................................................................................................................... 5

Inhoudstafel ................................................................................................................................ 6

Lijst met afkortingen .................................................................................................................. 9

Lijst met figuren ......................................................................................................................... 9

Lijst met tabellen ...................................................................................................................... 11

1 Inleiding .............................................................................................................................. 1

1.1 Probleemstelling .......................................................................................................... 1

1.2 Doelstelling .................................................................................................................. 2

1.3 Opbouw eindwerk ........................................................................................................ 2

2 Literatuur ............................................................................................................................. 3

2.1 Zeewier ........................................................................................................................ 3

2.1.1 Classificatie en naamgeving ................................................................................. 3

2.1.2 Morfologie van Ulva lactuca ............................................................................... 4

2.1.3 Verspreiding en nut van Ulva lactuca .................................................................. 5

2.1.4 Levenscyclus van Ulva lactuca ............................................................................ 5

2.1.5 De teelt van Ulva lactuca ..................................................................................... 6

2.2 In vitro teelttechniek .................................................................................................... 7

2.2.1 Ontstaan en werking in vitro teelt. ....................................................................... 7

2.2.2 In vitro teelt van landplanten ................................................................................ 7

2.2.3 Voor- en nadelen van in vitro teelt ....................................................................... 8

2.3 De in vitro teelt van zeewier ........................................................................................ 8

2.4 Vermeerdering door sporen en/of gameten ................................................................. 9

2.4.1 Vergelijkende literatuurstudie over sporen/gametenvorming .............................. 9

2.4.2 Sporen- en gametenvorming .............................................................................. 12

2.5 Protoplasten ............................................................................................................... 14

2.5.1 Definitie .............................................................................................................. 14

2.5.2 De celwand ......................................................................................................... 14

2.5.3 Enzymen ............................................................................................................. 15

2.5.4 Vergelijkende literatuurstudie ............................................................................ 17

3 Algemene materialen en methoden ................................................................................... 19

3.1 Herkomst Ulva lactuca .............................................................................................. 19

3.2 Teelt in aquaria .......................................................................................................... 19

3.3 Voedingsbodems ....................................................................................................... 20

3.3.1 Vast medium met zeewater (VMA) ................................................................... 20

3.3.2 Vast medium met zout water (VMB) ................................................................. 20

3.3.3 Vloeibaar medium (VlM) ................................................................................... 20

3.4 Microscopen .............................................................................................................. 21

3.5 Groei- of proefomstandigheden ................................................................................. 21

4 Experimenteel gedeelte ..................................................................................................... 22

4.1 Initiatie in vitro op agarmedium ................................................................................ 22

4.1.1 Doel .................................................................................................................... 22

4.1.2 Vaste voedingsbodems ....................................................................................... 22

4.1.3 Proeven in vloeibare voedingsbodems ............................................................... 30

4.2 Algemeen besluit in vitro initiatie met vast celweefsel ............................................. 36

4.3 Inductie sporulatie van Ulva lactuca ......................................................................... 36

4.3.1 Doel .................................................................................................................... 36

4.3.2 Inleiding ............................................................................................................. 36

4.3.3 Materiaal ............................................................................................................. 37

4.3.4 Methoden en resultaten ...................................................................................... 37

4.3.5 Bespreking sporulatie methoden ........................................................................ 47

4.3.6 Besluit sporulatie methoden ............................................................................... 47

4.4 Identificatie en isolatie sporen en gameten van U. lactuca ....................................... 48

4.4.1 Doel .................................................................................................................... 48

4.4.2 Identificatie van sporen en gameten ................................................................... 48

4.4.3 Isolatie van sporen .............................................................................................. 48

4.4.4 Bespreking identificatie en isolatie sporen en gameten ..................................... 51

4.4.5 Besluit identificatie en isolatie sporen en gameten ............................................ 51

4.5 Vorming van protoplasten ......................................................................................... 52

4.5.1 Doel .................................................................................................................... 52

4.5.2 Inleiding ............................................................................................................. 52

4.5.3 Vormen van protoplasten ................................................................................... 52

4.5.4 Bespreking vorming van protoplasten ................................................................ 57

4.5.5 Besluit: vorming van protoplasten ..................................................................... 57

5 Discussie ........................................................................................................................... 58

6 Algemeen besluit .............................................................................................................. 61

Referentie lijst .......................................................................................................................... 63

Bijlage ......................................................................................................................................... i

Lijst met afkortingen

AB Antibiotica.

AD Aqua destilata of gedestilleerd water.

BA 6-Benzyladenine.

FAO Food and Agricultural Organisation of the United Nations.

FDA Fluoresceïne diacetaat.

MES 2-(N-morpholino)ethane sulphonic acid.

MS Murashige en Skoog medium.

PAR Aantal μmol fotonen per vierkante meter per seconde = Photosynthetic Active

Radiation.

PM Protoplast medium.

VIB Vlaams instutuut voor biotechnologie.

VLM Vloeibaar medium.

VMA Vast medium gemaakt met zeewater.

VMB Vast medium met extra zout.

Lijst met figuren

Figuur 1: De verschillende structuren van gedifferentieerd weefsel van Ulva lactuca eigen

bewerking van (Tormo Molina, 2012) ....................................................................................... 4

Figuur 2: De reproductieve voortplantingscyclus van Ulva lactuca (Ponette & Bertin) ........... 5

Figuur 3: De vorming van gameten in Ulva mutabilis (Wichard & Oertel, 2010) .................. 12

Figuur 4: Bovenaan gesporuleerd weefsel (40X) Onderaan een duidelijke scheidingslijn

tussen vegetatief weefsel en gesporuleerd weefsel (20X) Microscopiefoto's genomen door

Norbert De Ruiter, het weefsel gevonden door Jetze Van Zwol .............................................. 13

Figuur 5: De celstructuur van Ulva sp. (Sperber, 2010) .......................................................... 14

Figuur 6: Turgor druk in plantencellen (wikipedia) ................................................................. 18

Figuur 7: Schematische weergave van de zeewier proefhoeve van Wageningen Universiteit 19

Figuur 8: Aquaria met Ulva lactuca ......................................................................................... 19

Figuur 9: Afgestorven, wit zeewier na één minuut in 10% javel oplossing ............................. 23

Figuur 10: Gespoelde Ulva lactuca met 1% NaClO (javel) ..................................................... 23

Figuur 11: Links onidentificeerbare doorzichtige vloeistof rond uitgesneden schijfjes, rechts

een duidelijke schimmel, bacterie en/of gist contaminatie....................................................... 24

Figuur 12: De grootte van het stukje thallus heeft geen invloed op de overleving op een

voedingsbodem ......................................................................................................................... 26

Figuur 13: Links bij de start van het experiment, midden en rechts dode en gecontamineerde

thallus schijfjes ......................................................................................................................... 27

Figuur 14: Resultaat antibioticaproef na 1 week: plaat 9 is gecontamineerd, het weefsel in

plaat 7 daarentegen leeft nog en is niet gecontamineerd .......................................................... 29

Figuur 15: Thallusschijfjes in vloeibaar zeewiermedium, links bij start rechts een week later

.................................................................................................................................................. 30

Figuur 16: Thallus gespoeld met steriel zeewater en Tween, links na dag 1 - rechts na 6 dagen

.................................................................................................................................................. 31

Figuur 17: Glazen stolp in trekkast waarin de gassterilisatie werd uitgevoerd ........................ 33

Figuur 18: 15 minuten natte gassterilisatie na tien dagen. ....................................................... 34

Figuur 19: Links de start van de antibiotica-proefopzet, rechts de proef negen dagen later,

gecontamineerd door micro organismen. ................................................................................. 35

Figuur 20: Links bij start van de proef en rechts een gesporuleerde versie, achtendertig dagen

later ........................................................................................................................................... 38

Figuur 21: Links het weefsel bij de start van het experiment en rechts zevenenveertig dagen

later. Het weefsel is dan zeer broos en het water rondom is licht groen gekleurd .................. 38

Figuur 22: Vermoedelijk gameten van Ulva lactuca. .............................................................. 39

Figuur 23: Herhaling van de tweede methode van Sluis (1.2). Links bij start van de

proefopzet rechts drieëndertig dagen later. Er is dan een groene wolk zichtbaar, dit zou

kunnen wijzen op het vrijkomen van sporen of gameten. ....................................................... 39

Figuur 24: Weefsel en omringend zeewater van de tweede keer methode 1.2 na 33 dagen, 40

maal vergroot. ........................................................................................................................... 40

Figuur 25: Derde uitvoering van de tweede methode van Sluis (1.2). Links met oud weefsel

dat al bijna een jaar in het opslagaquarium zat, rechts met nieuw, vers geoogst, weefsel ...... 41

Figuur 26: Beeld van de witte stukken weefsel bij 40X vergroting ......................................... 42

Figuur 27: Resultaat methode 4 ............................................................................................... 43

Figuur 28: Dood weefsel bij 40x vergroting ............................................................................ 44

Figuur 29: 11B na 17 dagen ..................................................................................................... 46

Figuur 30: 5A, het groene gedeelte is levend weefsel het zwarte gedeelte afgestorven weefsel

en het witte zou gesporuleerd weefsel kunnen zijn .................................................................. 46

Figuur 31: 11B: Links 20X vergroting van de rand. Midden een 40X vergroting van de

overgang van levend naar dood weefsel. Rechts lege cellen waarvan het niet duidelijk was of

ze gesporuleerd zijn .................................................................................................................. 46

Figuur 32: Links gecontamineerde voeding met weefselcellen. Midden vers overgeënte cellen

in VIM, Rechts groei van gameten na drie weken .................................................................. 49

Figuur 33: Sporen op VMA ..................................................................................................... 49

Figuur 34: Microscopisch beeld (40X vergroting) van de inhoud van de falcon met VLM. ... 49

Figuur 35: Gameten incubatieopstelling volgens (Lascaux, 2002) met links een aantal

opgepipetteerde losse gameten en rechts een stukje gevormd weefsel uit gameten. ............... 50

Figuur 36: Het vermenigvuldigen van de sporen in de duranfles met VLM ........................... 50

Figuur 37: Het VLM verdampte onder invloed van de droge perslucht die er in geblazen werd

.................................................................................................................................................. 50

Figuur 38: Zeewier weefsel gevormd na 70 dagen .................................................................. 50

Figuur 39: Na drie uur beginnen de cellen los te komen (20X vergroot) ................................ 55

Figuur 40: Links, één van de weinige protoplasten bij 0M mannitol na 16u incubatie. Rechts,

de herhaling, 24u incubatie ook 0M mannitol. (40X vergroting) ............................................ 55

Figuur 41: 0,8M mannitol na 24u incubatie (40X vergroting) ................................................. 55

Figuur 42: 0,6M mannitol na 24u incubatie (40X vergroting) ................................................. 55

Figuur 43: Celwand die aan het loskomen is, bekeken door de geïnverteerde microscoop..... 56

Lijst met tabellen

Tabel 1: Vergelijking van de verschillende in de literatuur beschreven methodes betreffende

de vorming van sporen en/of gameten bij gerelateerde zeewiersoorten Bronnen: (Azanza &

Aliza, 1999; Goudsmit, 2013; Han et al., 2008; Mantri et al., 2010; Niesenbaum, 1988; Ohno

& Dut Triet, 1997; Van Der Sluis, 2012; Wichard & Oertel, 2010). ....................................... 11

Tabel 2: Samenvatting van de verschillende manieren om protoplasten te vormen (Björk et al.

,1992; Deryckere et al.,2012; Reddy & Fujita, 1991; Reddy et al. ,2007; Uchida et al. , 1992;

Uppalopati & Fujita, 2002; Van Ginneken et al. , 2013) ......................................................... 17

Tabel 3: Tweede proefopstelling met antibiotica, de nummers in de tabel zijn de nummers van

de platen ................................................................................................................................... 28

Tabel 4: Abiotische parameters van de verschillende fytotrons, gebruikt in het experiment .. 37

Tabel 5: Proefopzet methode 7 ................................................................................................. 45

Tabel 6: Dag drie methode 7 .................................................................................................... 45

Tabel 7: Dag vier methode 7 .................................................................................................... 45

Tabel 8: Dag zeven methode 7 ................................................................................................. 45

Tabel 9: Dag 17 methode 7 ...................................................................................................... 46

1

1 Inleiding

1.1 Probleemstelling

De groeiende wereldbevolking stelt ons voor grote uitdagingen. Voorspeld wordt dat we in

2050 met negen miljard mensen zullen zijn (Fischer, 2009). Voedsel en energie zullen schaar-

se goederen worden. De huidige omvang van voedselproductie zal moeten verdubbelen om

aan de groeiende vraag te voldoen. Deze stijging kan niet door de conventionele landbouw

alleen opgevangen worden (UN, 2013; NCDO, 2011). De conventionele landbouw beschikt

over een steeds krimpend landbouwareaal en verbruikt op een haast verkwistende wijze kost-

baar water en eindige bronnen zoals fosfaten (Berkhout et al., 2010).

Naast het matigen van onze huidige energie- en voedselconsumptie hier in het Westen, is het

telen van voedsel in de zee een mogelijke oplossingsstrategie. Zo zou gecontroleerde en sys-

tematische productie van eetbaar zeewier een bescheiden bijdrage kunnen leveren. Bij deze

evolutie is duurzaamheid het codewoord. Er moet op toegekeken worden dat niet het Aziati-

sche voorbeeld gevolgd wordt, waar de teelttechniek de zeefauna en –flora aantast en het

zeewater vervuild wordt door overvloedig nutriëntengebruik (Bandenburg, 2013).

Het duurzame telen van zeewier staat nog in de kinderschoenen. Er is voorlopig nog een ge-

brek aan wetenschappelijk kennis en bijhorende vaardigheden om dit voluit te laten slagen. Er

zijn reeds duurzame teeltexperimenten zoals op de proefhoeve “de wierderij” van Wagenin-

gen Universiteit in de Oosterschelde en de commerciële boerderij Zeewaar, van Rebecca Wie-

ring en Jennifer Breaton. Er is echter nood aan een hogere teeltefficiëntie.

In dit werk hebben de Wageningen Universiteit, met haar reeds bestaande kennis voor wat

betreft het telen van zeewier, en de Universiteit Gent met haar ervaring met in vitro cultuur

van planten elkaar ontmoet in een gezamenlijke zoektocht naar een gecontroleerde en effici-

ënte vermeerderingsstrategie voor zeewier. Tot nu toe hanteert men een arbeidsintensieve

methode van vegetatieve vermeerdering waarbij stukken thallus tussen touwen worden ge-

bonden en zo in zee gehangen om te groeien. Misschien kan Ulva lactuca in vitro vermeer-

derd worden, net zoals andere planten. Op die manier zouden selecties snel en arbeidsbespa-

rend vermeerderd kunnen worden. Het zou ook in vitro veredelingstechnieken toelaten zoals

ploïdiemanipulatie of celfusie.

2

1.2 Doelstelling

Studieobject was Ulva lactuca. Ulva lactuca werd gekozen omdat dit een modelwier is waar-

aan meerdere studies gewijd zijn. De doelstelling van dit project was het in vitro initiëren van

Ulva lactuca. Er werden verschillende strategieën gevolgd: klassieke uitwendige sterilisatie,

inductie van sporen- en gameten en isolatie van protoplasten. Dit alles om te kunnen starten

met in vitro-teelt en vermeerdering.

1.3 Opbouw eindwerk

De literatuurstudie biedt informatie over wieren in het algemeen en Ulva lactuca in het bij-

zonder. Vermeerdering via sporen en/of gameten wordt vanuit deze optiek begrijpelijk. Ook

in vitro cultuur wordt kort besproken. Dit betreft voornamelijk in vitro cultuur van hogere

planten aangezien er over de in vitro teelt van algen en zeewieren maar sporadisch gepubli-

ceerd werd. We wilden begrijpen en vergelijken. Zoals eerder vermeld, bleek het steriel krij-

gen van de zeesla een hele uitdaging. Steriliteit is een noodzakelijke voorwaarde voor het in

vitro bestaan. Tijdens het onderzoek drongen zich andere methodes op. Vandaar een stuk lite-

ratuurstudie over sporen en gameten en een deel over protoplasten. Om protoplasten te isole-

ren was het nodig om de celwand van Ulva lactuca te beschrijven, net zoals de enzymen die

nodig zijn om deze celwand af te breken.

Na de literatuurstudie komt er een hoofdstuk handelend over algemene materialen en metho-

den. Dit beschrijft de materiële context van het onderzoek: het in leven houden van het wier in

aquaria, de groeien proefomstandigheden, de gebruikte voedingsbodems e.d.

Hierna volgt het experimenteel gedeelte. Dit werd opgedeeld in drie grote delen: de in vitro

initiatie op agarmedium, de inductie en identificatie van sporen en gameten en de productie

van protoplasten. Van al deze onderwerpen werden materiaal en methode uitgewerkt en wer-

den de resultaten besproken. Dit eindwerk eindigt met een discussie, besluit en aanbevelingen

voor mogelijk toekomstig onderzoek.

3

2 Literatuur

2.1 Zeewier

2.1.1 Classificatie en naamgeving

Zeewier behoort tot het rijk van de algen of wieren. De afwezigheid van hoog gedifferentieer-

de cellen vormt het onderscheid tussen het rijk van de Plantae (gewone planten) en de Protis-

ta (algen). Wieren zijn autotrofe chlorofylhoudende organismen, zeer gevarieerd qua morfo-

logie en kleur. Ze behoren tot de Thallophyta, planten met een thallus, vroeger ook wel de

‘lagere planten’ genoemd (Coppejans, 1995).

Wieren omvatten alle chlorofylhoudende organismen die autotroof zijn t.o.v. koolstof maar

geen echte wortels, stengels noch bladeren bevatten. Er zijn landwieren, bijvoorbeeld lichenen

(korstmos, symbiose tussen wier en schimmel op rotsen of boomschors) en wieren die in zoet,

brak, en zout water leven (Coppejans, 1995).

Er zijn micro- en macro-algen. Microalgen zijn eencellig en al dan niet mobiel via flagellen of

zweepharen. Met macro-algen wordt een meercellige structuur bedoeld. Deze kan vasthangen

of vrij zwevend zijn (groenwieren, 2011). Zeewieren zijn zee-macroalgen. Daarom worden ze

beschouwd als planten ook al hebben ze geen vaatbundels (Coppejabs, 1995).

Er zijn verschillende soorten zeewieren: roodwieren (Rhodophyta), bruinwieren (Phaeophyta)

en groenwieren (Chlorophyta). Het onderzoek werd beperkt tot één type van Chlorophyta,

namelijk Ulva lactuca. Chlorophyta zijn groenwieren. Ze hebben deze naam verkregen door

hun groene kleur. Chlorophyta verkrijgen hun groene kleur door de chlorofyl a en b (groen

pigment), β-caroteen (geel pigment) en verschillende karakteristieke xanthophyllen (geel

bruin) in hun cellen (Guiry, 2000). Het zijn de evolutionaire voorlopers van de landplant

(Knee, 2008). Groenwieren kunnen in diverse biotopen voorkomen. Er zijn 5500 soorten en

meer van 90% van die soorten komt voor in zoet water. Er zijn ook groenwieren die voorko-

men in brak water, aan lucht blootgestelde substraten (bodem, rotsen bomen…) en uiteraard

ook in zeewater (Coppejans, 1995). Ze leven tussen 0 en 10 m diepte in zee om voldoende

licht te capteren voor fotosynthese (Brandenburg, 2013).

Rijk: Protoctista

Fylum: Chlorophyta

Genus: Ulva

Soort: Ulva lactuca L.

(BioInformatics, 2013)

4

Ulva lactuca, ook wel gekend onder de naam zeesla, is een opportunistische soort met een

variërende zouttolerantie en een extreem bereik van K+/Na

+ ratio. Dit wier is efficiënt in het

verwijderen van N en P (Van Ginneken et al., 2013). De soort Ulva lactuca is van het ge-

slacht Ulva. Dit is een meercellige stationaire “plant” met een eencellige mobiele generatieve

fase (BioInformatics, 2013; Knee, 2008).

2.1.2 Morfologie van Ulva lactuca

Ulva lactuca is een statisch multicellulair type wier met een mobiele eencellige reproductieve

fase. Dit wil zeggen dat de thallus bestaat uit meerdere cellen die een geordende structuur

vormen. Deze is statisch, dus niet bewegend. De seksuele en aseksuele voortplanting gebeurt

door middel van sporen of gameten. Deze hebben zweepharen en zijn mobiel. Zeesla bevat

een graad van cellulaire differentiatie en organisatie met verschillende structuren (Knee,

2008) (zie Figuur 1).

Figuur 1: De verschillende structuren van gedifferentieerd weefsel van Ulva lactuca

eigen bewerking van (Tormo Molina, 2012)

Ulva lactuca is groen tot donkergroen. De thallus kan tot één meter lang en 30 cm breed wor-

den en is zacht, gerimpeld en doorzichtig. Het is een membraan dat uit twee onregelmatig

geordende cellagen bestaat. Ulva kan zich vasthechten aan steen of een andere vaste substan-

tie met een klein schijfvormig voetje dat via een versterkt tussenstukje verbonden is met de

thallus. Deze hechtschijf is verstevigd door rizoïden (net zoals schimmeldraden) (Burrows

1991; Keizer, 2013; Coppejans, 1995). Ulva lactuca is een polymorfe soort die niet makkelijk

te differentiëren is (Van Ginneken et al., 2013). Dit wil zeggen dat er geen verschil waar te

nemen is tussen de diploïde en haploïde fase (zie 2.1.4).

5

2.1.3 Verspreiding en nut van Ulva lactuca

Ulva lactuca kan overal ter wereld voorkomen, van gematigde tot subtropische gebieden. Het

gedijt bij verschillende temperaturen en zoutgehaltes. Het komt zowel voor in het intergetij-

dengebied als ook dieper in zee. Omdat zeesla veel chlorofiel bevat (groenwier) heeft het wel

veel licht nodig om te kunnen groeien en komt niet dieper dan 10m diepte voor in zee (Keizer,

2013).

Zeewier kan gebruikt worden voor verschillende doeleinden. Als voedselcomponent voor

humane consumptie zoals bijvoorbeeld het gebruik als geleermiddel, farmaceutische toepas-

singen, maar ook voor dierenvoeding. Naast humane toepassingen kan ook de opvang en ver-

werking van de nutriëntenverliesstroom en de mogelijke bron als biobrandstof een extra

waarde geven aan de zeewierteelt (Goudsmit, 2013; Wolkers, 2011).

2.1.4 Levenscyclus van Ulva lactuca

De levenscyclus van Ulva lactuca start met vrouwelijke of mannelijke haploïde planten (ga-

metofyt) die gameten produceren. Uit de versmelting van mannelijke en vrouwelijke gameten

ontstaat de zygote waaruit een diploïde plant (sporofyt) ontspruit. Deze sporofyt levert na

reductiedeling haploïde sporen. De sporen vormen dan weer een volledig haploïde thallus

waardoor de cyclus gesloten is (figuur 2) (Guiry, 2000).

Figuur 2: De reproductieve voortplantingscyclus van Ulva lactuca (Ponette & Bertin)

6

Ulva lactuca is een haplodiplont, dit wil zeggen dat er zowel een haploïde als een diploïde

fase bestaat die beiden als zelfstandige plant kunnen voorkomen. Zeewieren kunnen zich op

drie manieren voortplanten: via de vegetatieve voortplanting, via de ongeslachtelijke voort-

planting en via de geslachtelijke voortplanting. De vegetatieve voortplanting is via scheuren

van stukjes thallus. De meest voorkomende manier van voortplanting is de ongeslachtelijke

voortplanting. Dit gebeurt door middel van zoösporen. Deze hebben vier flagellen en zijn iets

groter dan de gameten. Geslachtelijke voortplanting vindt plaats door middel van gametenco-

pulatie, zeesla heeft geflagelleerde gameten met twee flagellen. De mannelijke gameten zijn

iets kleiner dan de vrouwelijke gameten (Busink, et al., 2009; Eichhorn et al., 2005).

De haploïde en de diploïde fase wisselen af en zijn morfologisch nauwelijks te onderscheiden.

Er zijn maar enkele verschillen tussen de sporen en de twee types gameten, namelijk hun

grootte, de differentiatie van de cel voor de sporulatie en het aantal flagellen (Knee, 2008).

2.1.5 De teelt van Ulva lactuca

Volgens de Food and Agricultural Organization of the United Nations, de FAO, hebben enkel

China, Zuid-Korea en Japan een geregistreerde zeewierteelt voor voedselconsumptie

(www.fao.org). Naast de productie van Zeewaard, die in 2013 begonnen is, komt er in Neder-

land en België enkel experimentele teelt voor.

De teelt van zeesla kan op verschillende manieren gebeuren. Hieronder worden de twee voor-

naamste teeltvormen besproken, met name de intensieve en de extensieve teeltmethoden.

Bij intensieve teelt wordt op kleine schaal zeewier geteeld in tanks of in vijvers, dit meestal

als afvalbehandeling of als onderdeel van een geïntegreerde visboerderij. Deze teeltmethode

vraagt veel ruimte en aanzienlijke financiële middelen gezien de benodigde infrastructuur en

het onderhoud: het verversen van het water, de aangepaste belichting en verwarming indien

nodig (Van Ginneken et al., 2013; Busink et al., 2009).

Bij extensieve teelt wordt op grote schaal zeewier gecultiveerd met beperkte technologische

input. Men gebruikt gefixeerde bodems en drijvende touwen in de kustzones of verder in zee.

Dit kan gebeuren op drijvende vlotten of met netten tussen vast geankerde palen. De gefixeer-

de bodems zijn vaak lijnen van bamboe die op de zeebodem worden gefixeerd door betonnen

blokken (Van Ginneken et al., 2013; Busink et al., 2009; FAO, 2003).

De commerciële teelt gebeurt nu door vegetatieve vermeerdering. Kleine tukjes thallus wor-

den tussen de touwen geknoopt of in de tanks vrijgelaten. Deze groeien dan verder uit tot gro-

tere stukken thallus. Deze manier van werken is vergelijkbaar met het stekken bij gewone

landplanten (Brandenburg, 2013).

7

2.2 In vitro teelttechniek

De zeewierteelt op zee is nog niet voldoende efficiënt. Hier komen we bij het doel van dit

onderzoek. Door in vitro cultuur zouden we meer kennis, informatie en misschien wel een

efficiëntere manier van telen kunnen bekomen. Nu wordt zeewier vegetatief vermeerderd.

Stukjes zeewier worden manueel tussen touwen gestoken die aan pontons hangen. Dit is een

moeilijk en arbeidsintensief werk. Bovendien is de kwaliteit niet altijd even uniform en be-

staat er momenteel ook nog onduidelijkheid over bepaalde ziektesymptomen. Een cultuur in

vitro geeft mogelijkheid tot een snelle vermeerdering, kruising, selectie en verder onderzoek

naar zeewier.

2.2.1 Ontstaan en werking in vitro teelt.

In vitro betekent letterlijk “in glas”. In deze context wordt de term vooral gebruikt voor biolo-

gische technieken die buiten de normale omgeving, in gecontroleerde omstandigheden wor-

den toegepast. Dit hoeft uiteraard geen ‘glazen’ recipiënt te zijn. Onder in vitro cultuur ver-

staat men het kweken of telen van plantendelen op een kunstmatig samengestelde voedings-

bodem en dit onder gecontroleerde en steriele omstandigheden. Deze teeltvorm is mogelijk bij

verschillende plantendelen zoals geïsoleerde organen, weefsels, embryo’s, zaden, vruchtbe-

ginsels, meeldraden, cellen en zelfs protoplasten. In vitro teelt is mogelijk doordat plantencel-

len plastisch en totipotent zijn. De plasticiteit staat voor het grote aanpassingsvermogen van

plantencellen in zeer wisselende omstandigheden. Totipotentie stelt dat uit elke plantencel een

volledig nieuwe plant kan verkregen worden (Huys, 2002; INRA, 2013). De vraag is of dit

ook geldt voor zeewiercellen.

2.2.2 In vitro teelt van landplanten

De kennis over het in vitro telen van zeewier is bijna nihil, dus moesten we dit project baseren

op de kennis bij landplanten. Tot nu toe wordt de teelt van planten in vitro immers bijna uit-

sluitend op landplanten toegepast, en dan nog wel voornamelijk op zaadplanten.

De celwand van een landplant bevat veel lignine om de plant rechtop te houden en te be-

schermen tegen externe en interne factoren. Ook is er een waslaag omheen de celwand die

extra bescherming kan bieden (Verkerk et al., 2004). Dankzij deze beschermende lagen is het

makkelijker om deze planten steriel te krijgen. Deze steriliteit is noodzakelijk voor het over-

leven in vitro. De in vitro voedingsbodem met zijn vele nutriënten is als het ware een feest-

maal voor allerlei parasieten. Ze koloniseren het medium en tasten vaak ook de plant aan.

Dus, zonder een steriele plant, geen in vitro teelt. Het steriliseren van planten gebeurt met

ethanol en javel. Een groeipunt wordt steriel gemaakt, afgesneden en in de voedingsbodem

geplant. Door de rijke hoeveelheid aan nutriënten gaat deze extreem goed groeien en is een

snelle vermeerdering mogelijk (Werbrouck, 2011; INRA,2013).

8

2.2.3 Voor- en nadelen van in vitro teelt

In vitro teelt zorgt niet alleen voor een snelle vermenigvuldiging op basis van vegetatieve

vermeerdering, het maakt het ook mogelijk om op een makkelijke manier aan wetenschappe-

lijk onderzoek te doen en planten te veredelen. Onder deze gecontroleerde omstandigheden is

het niet moeilijk om de invloed van één specifieke parameter te controleren zonder dat er in-

terferentie is van bijvoorbeeld andere organismen of onbekende chemische stoffen

(Werbrouck, 2011; Huys, 2002). Ook fysiologisch onderzoek zou mogelijk kunnen zijn. Hoe

reageert deze primitieve plant op bepaalde plantenhormonen? Welke biochemische processen

zijn er al aanwezig? (Lascaux, 2002). Dit zou allemaal kunnen bijdragen tot een efficiëntere

manier van planten/zaaien in de commerciële zeewierteelt.

Een nadeel is wel dat in vitro telen een aanzienlijke financiële en infrastructurele inspanning

vraagt. Alle materiaal en installaties voor cultuurontwikkeling, zoals bijvoorbeeld een lami-

naire airflow of fytotrons, zijn duur. Het vereist bovendien een omkadering met een hoog tot-

voldoende wetenschappelijk geschoold personeel. (Werbrouck, 2011).

2.3 De in vitro teelt van zeewier

In de literatuur is er weinig te vinden over de in vitro teelt van zeewier en al helemaal niets

over het in vitro telen van Ulva lactuca. Azanza en Aliza (1999) vermelden het vrijkomen van

sporen in kunstmatig verrijkt zeewater. Zij voegen minieme hoeveelheden antibiotica toe aan

de oplossing om de groei van epifyten en ongewenste micro-organismen tegen te gaan. Ook

Lascaux (2002) vermeldt het in vitro telen van wieren. Hij benadrukt de hoge moeilijkheids-

graad en stelt dat deze specifieke teeltmethodes nog niet op punt staan. Zijn artikel is eerder

een uiteenzetting rond de bestaande werkpunten. De beste uitgewerkte methoden in dit artikel

zijn die voor kranswieren (Characeae). Dit zijn zoetwaterwieren en de rechtstreekse voorou-

ders van de landplanten. Bij Characeae is er al een duidelijke differentiatie tussen de stengel

en bladachtige structuren al wordt deze nog steeds “thalli” genoemd. Deze zijn iets steviger en

makkelijker steriel te krijgen (Lascaux, 2002).

9

2.4 Vermeerdering door sporen en/of gameten

Een alternatieve werkmethode om steriel wierweefsel te bekomen, is door sporen en/of game-

ten steriel te isoleren en deze te laten uitgroeien tot een steriel thallus. Deze werkwijze loopt

analoog met de in vitro cultuur van mossen, die taxonomisch dicht bij wieren staan

(Demeulenaere, Sterilizeren mossen, 2013).

2.4.1 Vergelijkende literatuurstudie over sporen/gametenvorming

Sporen en/of gameten zijn de voortplantingscellen van zeewieren. Deze kunnen gebruikt wor-

den voor een snelle manier van ‘zaaien’ van het zeewier (Azanza & Aliaza, 1999; Clifton &

Clifton, 1999). Gameten en/of sporen worden synchroon vrijgegeven op bepaalde tijdstippen.

De trigger tot dit gebeuren is nog niet helemaal achterhaald. Clifton (1999) maar ook Gouds-

mit (2013), Niesenbaum (1988), Ohno en Duy Triet (1997) en Han et al (2008) zeggen dat dit

bepaald wordt door omgevingsfactoren zoals temperatuur en licht. Deze veranderingen zijn

dus afhankelijk van het seizoen en de getijdenwerking in natuurlijke omstandigheden. Niese-

baun (1998) en Goudsmit (2013) beweren dat er een productie is van sporen na een koudebe-

handeling als een soort van overlevingsreactie. Voor Ohno & Duy Triet (1997) is het juist een

temperatuurverhoging die de productie van zoösporen vrijstelt. Bij Han et al. (2008) is het in

stukken snijden al genoeg om sporen te laten vrijkomen. Zij beweren dat indien er toxische

stoffen in het water zitten, deze de productie van sporen zullen minderen of helemaal tegen-

houden.

Wichard & Oertel (2010) kwamen met een andere theorie op de proppen. Zij beweren dat als

je de sporulatie inhibitoren -die door het zeewier zelf geproduceerd worden- weghaalt, er

spontaan gameetvorming ontstaat. Ze stellen ook dat er een donkere periode nodig is voor het

omzetten van de cellen in gameten. Martri et al. (2010) beweert dan weer dat de zoutconcen-

tratie de trigger is om zoösporen te induceren. Bij een lager dan normaal zoutgehalte, zouden

er spontaan sporen moeten ontstaan.

Veel van deze voorgaande artikels vonden het telkens weer de moeite waard om het artikel

van Smith (1947) en Lünig & Kadel (2008) over het maanafhankelijk zijn van sporulatie te

vermelden of tegen te spreken. Volgens hen zouden er vooral sporen en/of gameten gevormd

worden bij volle maan en nieuwe maan. Dit inzicht is plausibel omdat de getijdenwerking

nieuw, vers en koud water aanvoert.

10

Het is dus nodig al deze verschillende methoden naast elkaar te leggen (zie Tabel 1). Er werd

geen onderscheid gemaakt tussen de literatuur die specifiek bezig is met vorming van game-

ten of deze die over sporenvorming handelde. De standaard test-temperatuur lag tussen de 15

en de 25°C (meest voorkomend 20°C). Er was een grote variatie in de hoeveelheid licht die

nodig was voor het bekomen van sporen en/of gameten. Het zoutgehalte in het water lag tus-

sen de 15 en de 32 %. (meestal 30%). De pH was de standaard zeewater pH tussen 7 en 9. En

de meeste artikels creëerden sporen en/of gameten door het weefsel een shock te geven. Dit

door het zeewierweefsel bloot te stellen aan temperatuursverandering, het toebrengen van

schade door uitdroging of versnijding of het plaatsen in duisternis gedurende een bepaalde

periode.

11

Tabel 1: Vergelijking van de verschillende in de literatuur beschreven methodes betreffende de vorming van sporen en/of gameten bij gerelateerde zeewiersoorten Bronnen: (Azanza

& Aliza, 1999; Goudsmit, 2013; Han et al., 2008; Mantri et al., 2010; Niesenbaum, 1988; Ohno & Dut Triet, 1997; Van Der Sluis, 2012; Wichard & Oertel, 2010).

methode type wier temperatuur

(°C)

licht (µmol

fotonen m-2

s-

1)

licht

regime

zout

gehalte

(‰)

pH Hoeveelheid

wier

cultuurmedium

(ml)

extra

Azanza and

Aliaza

(1999)

Kappaphy-

cus alvarezii

27 200 12uL

12uD

30 twee takken? 50 één nacht drogen

Goudsmit

(2013)

Ulva lactuca 20 ? ? 30 - 35 8 -

8,5

40g (10 thal-

li)

150 000 bij start een koudebehande-

ling 24u bij 4°C in het don-

ker

Han et al.

(2008)

Ulva sp. 15 - 20 30 12uL

12uD

25 - 35 7,0-

9,0

één schijfje

met diameter

6mm

10

Mantri et al.

(2010)

Ulva fasciata 25 15 12uL

12uD

15 7,8 schijfje met

diameter

5mm

30

Niesen-

baum

(1988)

Ulva lactuca 21 44,87 9uL

15uD

? 8 -

8,5

12,5g 2 000 eerste 24u 2°C en maar 9u

licht per dag

Ohno and

Duy Triet

(1997)

Monostroma 21 verhoogd

in 0,5u tot 27

(+ vers warm

water)

100 ? 30 ? 5kg ? één nacht drogen

van der

Sluis (2012)

Ulva lactuca 15 ? 16uL

8uD

30- 35 ? een schijfje

met diameter

5mm

? start bij 11° C.

bij verkleuren van de schijf-

jes: 15°C

Wichard

and Oertel

(2010)

Ulva mutabi-

lis en Ulva

lactuca

20 60-120 16uL

8uD

? ? blade in stuk-

jes snijden

van ± 1 á 3

mm

10mg biomassa

per liter

bij start eerst 15 min. was-

sen met gedestilleerd water

vóór in cultuurmedia te

stoppen en derde dag medi-

um verversen.

12

2.4.2 Sporen- en gametenvorming

Aanvankelijk is er een gewone vegetatieve G1 cell-cyclus fase waarin gametogenesis kan

geïnduceerd worden, door het verwijderen van de populatie-inhibitor in het medium (Wichard

& Oertel, 2010). Dan gaat de cel over naar een vegetatieve S fase in dewelke het genoom ge-

repliceerd wordt. De daarop volgende fase is terug een G1 fase. Na deze tweede G1 fase komt

een S fase met inductie van gametogenese en een accumulatie van zetmeelgranulaten. Daarop

volgt een irreversibele gametangium differentiatie, een periode van progameet vorming, chlo-

roplastheroriëntatie en papilla-initiatie. Daarna worden de progameten gemultipliceerd (16

vrouwelijk, 8 mannelijk) en de papilla maturatie. Dit wordt gevolgd door de maturatie van de

gameten en de porie kap. Hierna opent de porie kap (Wichard & Oertel, 2010).

Figuur 3: De vorming van gameten in Ulva mutabilis (Wichard & Oertel, 2010)

De ongeslachtelijke voortplanting verloopt door de vorming van zoösporen. De sporophyte

produceert haploïde sporen door meiose (Eichorn et al., 2005). Eerst vormen de cellen die aan

de rand liggen zoösporen. Daarna worden steeds meer cellen door zoöspoorvorming geledigd.

Tenslotte blijft slechts een kleurloos vel met lege cellen van de plant over (Hardenberg,

2013).

13

Tijdens reproductie van het groen zeewier Ulva, is het afstaan van levende cellen geassoci-

eerd met een kleurverandering. Eerst wordt het weefsel geelachtig groen dan donker olijfkleu-

rig tot wit. De witte kleur reflecteert het feit dat de reproductieve delen vrijgelaten zijn (Han,

et al., 2008). Afhankelijk van het percentage kleurverandering kan er bepaald worden hoeveel

sporen en/of gameten er gevormd werden. Het is wel belangrijk om het verschil te zien tussen

dood weefsel (ook wit) en gesporuleerd weefsel. Weefsel dat sporuleerde, zou een scherpe

rand vertonen (Goudsmit, 2013). Op een stuk thallus zou het van groen weefsel plots over-

gaan naar kleurloos weefsel. Dood weefsel anderzijds is meer slijmerig en valt na aanraking

uit elkaar. Onder de microscoop is dit onderscheid duidelijk zichtbaar. Lege cellen met een

zwart puntje wijzen op gesporuleerd weefsel. Dit zwarte puntje is de opening waardoor de

sporen of gameten de cel verlaten hebben (Van Der Sluis, 2012; Ruiter, 2013; Wald, 2013).

Figuur 4: Bovenaan gesporuleerd weefsel (40X)

Onderaan een duidelijke scheidingslijn tussen vegetatief weefsel en gesporuleerd weefsel (20X)

Microscopiefoto's genomen door Norbert De Ruiter, het weefsel gevonden door Jetze Van Zwol

14

2.5 Protoplasten

Een tweede alternatieve weg om steriel weefsel te verkrijgen is te werken via een protoplas-

tencultuur. Isolatie en regeneratie van protoplasten zijn belangrijke stappen om genetische

variatie in te voeren. Deze genetische variatie kan bekomen worden via het gebruik van so-

maclonale variatie, door mutagenese, via somatische hybridisatie of door transformatie. Maar

bij de algen zijn er voor fusie en regeneratie nog veel problemen op te lossen (Lascaux, 2002).

2.5.1 Definitie

Protoplasten zijn “naakte cellen”. Het zijn levende cellen zonder celwand. Deze celwand kan

op mechanische, enzymatische, immunologische, chemische, spontane of elektrische wijze

verwijderd worden, zodat enkel de celinhoud en het celmembraan overblijven. Dit geeft een

uniek eencellig systeem (Lascaux, 2002; Reddy et al., 2007).

2.5.2 De celwand

Voor het starten van een protoplastencultuur is het nodig om te weten waaruit de celwand van

Ulva lactuca is opgebouwd (figuur 5). De celwand kan immers maar afgebroken worden in-

dien de juiste enzymen gebruikt worden voor de verschillende celwandcomponenten.

Figuur 5: De celstructuur van Ulva sp. (Sperber, 2010)

Bij A is er een schematisch doorzicht van de sectie te zien, bij

B is er een associatie voorgesteld tussen de verschillende celwand polysacchariden

15

Figuur 5 geeft de celstructuur weer van Ulva sp. Deze is verschillend van landplanten. De

celwand bestaat voornamelijk uit suikers. Vanwege de moeilijke omgevingsomstandigheden

waarin zeewieren in de natuur voorkomen bevat de zeewiercelwand veel beschermende com-

ponenten. Dit zijn fenolische componenten en grote hoeveelheden van polyanionische slijm-

laag. Ulva lactuca bevat ulvan, dit bevindt zich tussen de twee lagen waaruit het thallus be-

staat. De celwand bevat ook glucuronen. Deze bestanddelen zitten dicht bij het cytoplasma-

membraan, aan de buitenkant van de aanliggende zeewiercellen. De xylose en glucose bevat-

tende polysachariden vormen gestapelde lagen rondom de cellen (Van Ginneken et al., 2013).

2.5.2.1 Polysachariden

De polysachariden bestaan uit een water oplosbaar gedeelte (ulvan) en een in water onoplos-

baar gedeelte. Ulvan kan je karakteriseren als glucuronorhamnoxyloglycan. Het in water on-

oplosbaar gedeelte kan je indelen in een alkalisch oplosbaar gedeelte namelijk β-1,4-

glucoxylan en β-1,4-glucoranan, en een niet in basen oplosbaar gedeelte namelijk cellulose en

β-&,4 xyloglucans (Sperber, 2010).

2.5.2.2 Aminozuren en eiwitten

Ulva lactuca bevat veel hoogwaardige essentiële aminozuren en deze komen voor in dezelfde

concentraties als bijvoorbeeld in kikkererwten (Van Ginneken et al., 2013). Daarom kan zee-

wier ook gebruikt worden als vleesvervanger.

2.5.2.3 Lipiden

Zeesla bevat ook essentiële vetten waarvan de westerse mens denkt ze enkel in vis en noten te

vinden zijn. In veel literatuur wordt hiermee geen rekening gehouden als het aankomt op het

oplossen van de celwand. Waarschijnlijk omdat deze vetten zich vooral in de cellen bevinden

en niet zo zeer deel uitmaken van de celwand.

2.5.3 Enzymen

Om protoplasten te vormen is het nodig om de celwand af te breken. Zoals hierboven aange-

geven bestaat de celwand van Ulva lactuca voornamelijk uit polysachariden. Om polysacha-

riden af te breken heb je cellulase enzymen nodig (Reddy et al., 2007).

Uppalopati & Fujita (2002), Uchida, Yoshikawa, Ishida, & Saga (1992), Reddy C., Gupta,

Mantri, & Jha (2007) en Reddy & Fujita (1991) gebruiken Cellulase Onozuka R-10. Deze

enzymen zijn afkomstig van de schimmel Trichoderma viride. Deze cellulase is een multi-

16

enzymatisch systeem dat bestaat uit cellulase, α-amylase, hemicellulase, pectinase en protease

activiteit. Deze enzymen modificeren celluloses, lichines en graan β-D-glucans.

De modificatie gebeurt door de hydrolyze van 1,4-β-D glucosidische bindingen (amylase) en

het breken van 1,4-α-D-galastosiduronic bindingen (pectinase).

Cellulase onozuka R-10 bevat 1U/mg van cellulase activiteit, 1U/mg protease activiteit,

0,4U/mg pectinase activiteit en 0,01 U/mg protease activiteit. Die 1U/mg betekent dat één

eenheid cellulase 1µM van glucose van carboxymethyl cellulose zal vrijgeven (laboratories,

2011).

De meest algemene bron van niet-cellulitische zeewiercelwand-degraderende enzymen zijn

herbivore marine invertebraten (zeedieren die van algen leven) en marinebacteriën (Reddy et

al. ,2007). Deze hebben in de loop van evolutie efficiënte systemen gevonden om de celwand

van deze zeewieren af te breken. Abalone aceton poeder is gemaakt van abalone, een zeeslak.

De enzymen bevatten β-glucoronidase en sulfaten (Van Ginneken et al., 2013). Extracten van

digestieve enzymen van herbivore organismen bevatten echter potentieel schadelijke substan-

ties voor protoplasten. Het beste worden lage concentraties en korte incubatietijden gebruikt.

Ook het toevoegen van protease inhibitoren tijdens isolatie is mogelijk (Björk et al.,1992).

Tabel 2 op volgende pagina toont de vergelijking tussen de gegevens van een aantal artikels

over de vorming van protoplasten. De meeste artikels zijn gelijklopend qua enzymensamen-

stelling, temperatuur, pH en incubatieduur. Bij landplanten duurt het duidelijk langer om pro-

toplasten te vormen.

17

2.5.4 Vergelijkende literatuurstudie

Tabel 2: Samenvatting van de verschillende manieren om protoplasten te vormen (Björk et al. ,1992; Deryckere et al.,2012; Reddy & Fujita, 1991; Reddy et al. ,2007; Uchida et al. , 1992; Uppalopati &

Fujita, 2002; Van Ginneken et al. , 2013)

methode type

wier/plant

pH buf-

fer

osmotische

waarde

enzymen oplosmid-

del

incuba-

tie duur

zee-

wier

(mg)

oplosmid-

del (ml)

Tempera-

tuur (°C)

rotatie extra

Björk et

al (1992)

Ulva rigida 7 20m

M

He-

pes

0,4M manitol 1,5% abalone ace-

tone poeder, 1,5%

cellulysin

zeewater tot cel

digestie

100 10 20 60 rpm 30min met een

0,8M oplos-

sing behande-

len geeft extra

opbrengst.

Derycke-

re et al

(2012)

Cichorium 5,5 0,5M mannitol 1mg cellulase cay-

lase 345, 0,5mg

pectinase caylase

M2 (per ml)

miliQ wa-

ter

16u ? ? 23 25 rpm in het donker

Reddy

and Fuji-

ta (1991)

Entero-

morpha

6 50

mM

MES

0,6M Mannitol

0,5% kaliumdex-

transulfaat

3% cellulase RS,

2% top shell ace-

tone poeder

gefilterd

zeewater

3u 50 5 20 15-20

rpm

donker

Reddy et

al.

(2008)

all seaweeds 5 -

6

? 0,4M osmocicum 2% cellulase

onozuka R-10 2%

abalone acetone

poeder, 1% agarase

50U, 1% protease

1%NaCl in

H2O

? ? ? 20 - 25 schudden in

het donker

Uchida

et al.

(1991)

Ulva per-

tusa

5,5 50m

M

MES

1,2M D sorbitol 5% abalone ace-

tone poeder, 2%

cellulase onozuka

R10, 0,1%

macerozyme R-200

PES medi-

um

1u in-

ductie

5u en-

zymen

250 2,5 20 30 rpm

Uppala-

pati &

Fujita

(2002)

Ulva per-

tusa

6,5 50m

M

MES

kalium dextran

sulfaat 0,5%

0,6M mannitol

2% cellulase Ono-

zuka R-10, 2%

Macerozyme R-10

3% NaCl,

1mM CaCl

2- 2,5 ? 5 22 15-20

rpm

donker

Van

Ginne-

ken et al

(2013)

Ulva lactu-

ca

6 MES Mannitol, CaCl2 1,5% abalone,

1,5% cellysine

zeewater 30 min.-

1u

? ? 20 schud-

den

?

18

Vooral de osmotische waarde van de oplossing varieerde tussen de verschillende artikels

(zie Tabel 2: Samenvatting van de verschillende manieren om protoplasten te vormen). Het

aantal mol mannitol of sorbitol bepaalt de osmotische waarde. Door het verlies van de cel-

wand zijn de cellen niet meer bestand tegen hoge verschillen in omgevingsconcentratie aan

osmotisch actieve stoffen (molariteit)

Figuur 6: Turgor druk in plantencellen (wikipedia)

Indien de omgevingsconcentratie van deeltjes te laag is zal de protoplastcel veel water op-

nemen en uiteindelijk exploderen. Als er te veel deeltjes opgelost zijn zal de protoplast in-

wendig water verliezen en kan de cel imploderen.

Björk, Gómez-Pinchetti, Reina, & Pedersén (1992) en Reddy et al (2008) gebruikten 0,4M

mannitol als osmoticum. 0,5M mannitol was populair bij Deryckere et al (2012) en Uppala-

pati & Fujita (2002). Reddy and Fujita (1991) gebruikten 0,6M mannitol. Uchida et al.

(1991) was de enige die sorbitol gebruikte als osmoticum.

De pH was in alle artikels tussen de 5 en de 7 en bijna overal werd ook 50mM MES (2-(N-

morpholino) ethane sulphonic acid) gebruikt als buffer. De incubatieduur was in de meeste

publicaties over het algemeen vrij kort. Het is duidelijk dat het verwijderen van een land-

plantcelwand meer tijd vraagt (Dereyckere et al., 2012).

Ook de temperatuur (20°C) en het zachtjes schudden in het donker kwam algemeen voor.

Het zoutgehalte van het water kon variëren van 1% NaCl (Reddy et al., 2007) tot 3,2% (echt

zeewater) (Björk et al., 1992; Van Ginneken et al., 2011; Reddy & Fujita, 1991).

19

3 Algemene materialen en methoden

3.1 Herkomst Ulva lactuca

De Ulva lactuca was afkomstig uit de proefhoeve van Wageningen Universiteit in de

Schelphoek (Oosterschelde), coördinaten (40' 55'' N, 3° 49' 44'' E). Hier wordt de Ulva ge-

teeld aan touwen die aan pontons in het zeewater hangen. Er is ook materiaal gebruikt van

Nergena het zeewierlab van Wageningen Universiteit, waar Ulva gekweekt wordt in M3-

bakken.

Figuur 7: Schematische weergave van de zeewier proefhoeve van Wageningen Universiteit

3.2 Teelt in aquaria

De Ulva lactuca werd verdeeld in twee aquaria met afmetingen 20cm op 20cm op 35cm

(figuur 8). Elk plastic aquarium kan 14l bevatten. Elke maand werd het zeewater ververst en

de aquaria schoongemaakt. Het schoonmaken gebeurde met leidingwater en een sponsje. In

de tussentijdse periode werd ongeveer om de drie dagen het water aangevuld met gedestil-

leerd water om de verdampte hoeveelheid te compenseren. Om de twee weken werd er

vloeibare plantenvoeding toegevoegd (indien niet ververst). De vloeibare blad- en bodem-

bemesting waren van het merk Wulax met een NPK samenstelling van 8-8-6. Er werd 1ml

vloeibare voeding toegevoegd per 10l zeewater. Er werd continu lucht in de aquaria gebla-

zen met behulp van een klassiek aquariumpompje met bijhorend steentje (Crawfish airpump

3500 (2x144L/H)).

Figuur 8: Aquaria met Ulva lactuca

20

3.3 Voedingsbodems

Alle voedingsbodems in dit eindwerk zijn gemaakt op basis Murashige en Skoog medium

(MS). MS bestaat uit: NH4NO3 1,650 mg/l, CaCl2.2H2O 440 mg/l, MgSO4.7H2O 370 mg/l,

KH2PO4 170 mg/l, KNO3 1,900 mg/l, H3BO3 6.2 mg/l, CoCl2 6H2O 0.025 mg/l, Cu-

SO4.5H2O 0.025 mg/l, FeSO4.7H2O 27.8 mg/l, MnSO4.4H2O 22.3 mg/l, KI 0.83 mg/l,

Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/l, ZnSO4.7H2O 8.6 mg/l, Na2EDTA.2H2O 37.2 mg/l, Inositol 100

mg/l, Niacin 0.5 mg/l, Pyridoxine HCl 0.5 mg/l, Thiamine HCl 0.1 mg/l, IAA 1–30 mg/l,

Kinetin 0.04–10 mg/l, Glycine 2.0 mg/l, Edamine S 1.0 g/l en agar-agar 10 g/l.

Er zijn twee verschillende vaste voedingsbodems gemaakt en één type vloeibare bodem.

3.3.1 Vast medium met zeewater (VMA)

Medium (voor 1l):

1025ml gefiltreerd Noordzeewater;

4,405g Murashige en Skoog medium (Duchelfa);

7g agar;

30g Sucrose;

pH 8 door eventueel correctie met KOH.

Het water, MS en de suiker werd in een fles gedaan. De pH werd gecontroleerd (Hanna in-

struments HI 2550) en aangepast. Daarna kon het agar toegevoegd worden. De volledige fles

werd gesteriliseerd in de autoclaaf (130°C bij 1atm gedurende 15 tot 30 min).

3.3.2 Vast medium met zout water (VMB)

Medium (voor 1l):

32g NaCl;

1025ml miliQ water;

4,405g Murashige en Skoog medium (Duchefa);

7g agar;

30g Sucrose;

pH 8 door eventueel correctie met KOH.

Het water, MS en de suiker werd in een duranfles gedaan. De pH werd gecontroleerd (Han-

na instruments HI 2550) en aangepast. Daarna kon het agar toegevoegd worden. De volledi-

ge fles werd gesteriliseerd in de autoclaaf (130°C bij 1atm overdruk gedurende 15 minuten).

3.3.3 Vloeibaar medium (VlM)

De samenstelling van het VIM is hetzelfde als het vast medium met zeewater (VMA) maar

dan zonder het toevoegen van de agar.

21

3.4 Microscopen

In dit onderzoek werd een gewone lichtmicroscoop van het merk Olympus UTVX (Japan)

gebruikt. Deze microscoop was voorzien van een camera gekoppeld aan een computer. Er

werd ook een omkeermicroscoop gebruikt, een Nikon Eclipse2000S. Er werden objectieven

van 10x, 20x en 40x vergroting gebruikt.

3.5 Groei- of proefomstandigheden

De aquaria, petriplanten en falconbuizen met zeewierweefsel werden allen onder gecontro-

leerde klimatologische omstandigheden gehouden door ze in een in vitro groeikamer of een

fytotron te plaatsen. Hierdoor was het mogelijk ze altijd onder ‘lente’ condities te houden.

De verschillende fytotrons gebruikt in dit experiment hadden temperaturen van 15°C, 20°C,

23°C of 26°C. Er was altijd een dag-nacht ritme van 16u licht en 8u donker. De lichtintensi-

teit was afhankelijk van de afstand tot de lampen en het aantal lampen. In alle fytotrons wer-

den lampen gebruikt van het type TL-D Philips 38W/840. De lichtintensiteit werd gemeten

met Photosynthetic Active Radiation (PAR). Dit is het aantal μM fotonen per vierkante me-

ter en per seconde. De PAR werd gemeten met een PAR meter (Jaz lichtmeter van Ocean

Optics).

Voor wat betreft de zuurtegraad kan men stellen dat de pH in de zee (natuurlijke groeiom-

standigheid van zeewier) vrij hoog is, rond pH 8. De pH van een medium beïnvloedt de op-

name van heel wat componenten en reguleert heel wat biochemische reacties. Tijdens de

cultuur veranderde de pH door de selectieve opname en uitwisseling van ionen door de

plant.

Ook het zoutgehalte is belangrijk bij het telen van zeewier. Door verdamping van water

stijgt de zoutconcentratie tijdens de cultuur. Bij vaste bodems echter, is deze verdamping

minimaal.

22

4 Experimenteel gedeelte

4.1 Initiatie in vitro op agarmedium

4.1.1 Doel

Het doel is om Ulva lactuca in steriele omstandigheden op een kunstmatig medium te telen.

Om dit te realiseren moet het zeewier steriel gemaakt worden. De bestaande literatuur over

het in vitro telen van zeewier is beperkt, daarom is het nuttig terug te grijpen naar informatie

over het in vitro telen van zaadplanten. Heel wat landplanten zijn in vitro te telen op Muras-

hige and Skoog medium (MS) daarom werd dit medium ook voor Ulva lactuca gebruikt.

4.1.2 Vaste voedingsbodems

4.1.2.1 Inleiding

Omdat condities gemakkelijk te bestuderen zijn op een vast medium en Ulva lactuca een

zeewier is dat tegen een periodische droogte kan, leek het testen op vaste voedingsbodems

een goed begin. Eerst werd de standaard in vitro procedure voor landplanten gevolgd. Alle

proeven werden steriel uitgevoerd in een laminaire airflow.

4.1.2.2 0,7cm diameter, 10% javeloplossing

4.1.2.2.1 Inleiding

Door gebrek aan kennis over het in vitro initiëren van zeewieren werd de standaard land-

plant methode getest (Werbrouck, 2011).

4.1.2.2.2 Specifieke materialen en methoden

Het wier moest gesteriliseerd worden voor het in vitro geïnitieerd werd. Deze sterilisatie

gebeurde door de gewenste plantendelen eerst even heel kort met 70% ethanol te spoelen

dan een kwartier in 10% javel oplossing. Na het spoelen met javel werd er drie keer met

steriel water gespoeld. (Werbrouck, 2011)

4.1.2.2.3 Resultaat en bespreking

Na 1 minuut in de 10% javel oplossing veranderde het zeewier al van kleur (Figuur 9). De

concentratie van 10% javel bleek dodelijk voor het wier. Na opname in de cellen stierf het

af.

23

Figuur 9: Afgestorven, wit zeewier na één minuut in 10% javel oplossing

4.1.2.3 0,7cm diameter, 1% javeloplossing

4.1.2.3.1 Inleiding

Omdat sterilisatie met javel moeilijk bleek, werd de concentratie van de vorige proef (zie

4.1.2.2) verlaagd tot een minimale concentratie om nog in staat te zijn contaminanten de

doden.


Eerst werd het zeewier een minimaal aantal seconden in

ethanol gedompeld, dan 10 minuten in een 1% javelop-

lossing. Na 10 minuten spoelen van het zeewier in een

1% javeloplossing werd er met steriel zeewater gespoeld.

Er werd dan thallus in schijfjes gesneden met behulp van

een steriele kurkboor met diameter 0,7cm. De nog steeds

groen uitziende thallusschijfjes (Figuur 10) werden dan

op VMB gelegd en gecultiveerd in de klimaatkamer bij

15°C en 60µmol fotonen m-2s. Ook de platen, mesjes,

pipetten, pincetten, kurkboren e.d. waren steriel bij ge-

bruik. Deze waren steriel aangekocht of steriel gemaakt

via autoklaveren (130°C bij 1atm gedurende 15 tot 30

min.) of met behulp van een parelsterilisator.

Figuur 10: Gespoelde Ulva lac-

tuca met 1% NaClO (javel)


Alle thallus-schijfjes waren dood binnen de vier dagen. Er was wel geen contaminatie zicht-

baar. Vermoedelijk tast de NaClO de cellen van het ultradunne thallus aan door de oxide-

rende werking van chloor en zuurstof. Pas na enkele dagen worden de gevolgen hiervan dui-

delijk.

24

4.1.2.4 0,7cm diameter, gespoeld met steriel zeewater met verschil-lende hormoonconcentraties

4.1.2.4.1 Inleiding

De invloed van het groeihormoon 6-Benzyladenine (BA) werd getest. Dit cytokinine stimu-

leert de groei en celdeling van landplanten en het kan levensduur van de plant verlengen

(Werbrouck, 2011; Van Labeke, 2013). Het was daarom nuttig om de invloed van BA bij

zeewieren te bestuderen. Het steriliseren met javel had tot nu toe nog geen succes gehad,

daarom leek het interessant om het zeewier te laten groeien zonder het op voorhand te steri-

liseren, maar gewoon te spoelen met steriel zeewater. Het zou immers kunnen dat de zout-

concentratie in de voedingsbodem hoog genoeg was om de meeste bacteriën en schimmels

te onderdrukken.


Schijfjes van 0,7cm diameter zeewier werden uit het midden van het thallus gesneden met

een kurkboor. Deze werden grondig gespoeld met steriel zeewater en op VMB gelegd. De

concentraties 0µM BA, 0,1µm BA, 1µM BA en 10µM BA werden getest met elk nog een

controle plaat. Ook deze platen werden bij 15°C en 60µmol fotonen m-2

s gezet.


De eerste drie dagen bleven de thallusschijfjes groen, maar vanaf dag vier kregen de meeste

contaminanten de overhand. Alle zeewierschijfjes waren na een week al gecontamineerd. De

verschillende concentraties aan BA leken hier helemaal geen invloed uit te oefenen. Op fi-

guur 11 is te zien dat er vloeistof rond het thallus aanwezig was voordat het wier stierf. En-

kele dagen later was deze vloeistof gecontamineerd.

Figuur 11: Links onidentificeerbare doorzichtige vloeistof rond uitgesneden schijfjes,

rechts een duidelijke schimmel, bacterie en/of gist contaminatie

25

4.1.2.5 0,7cm diameter, 1% javel oplossing overgoten met 5ml steriel zoutwater

4.1.2.5.1 Inleiding

Het uitdrogen bleek toch een groter probleem te zijn dan aanvankelijk gedacht. Daarom

werd er geopteerd om steriel zoutwater op de voedingsbodem te gieten en zo het weefsel

vochtig te houden. Bij alle voorgaande proeven leek het zeewier veel water te verliezen na

verloop van tijd. Misschien was dit wel de oorzaak van sterfte. In de VMB zouden mogelijks

essentiële elementen kunnen ontbreken daarom werd in deze voedingsbodem steriel zeewa-

ter gebruikt in plaats van miliQ water met zout.


De opzet van de proef was gelijklopend als proef 4.1.2.3. Het zeewier werd met 1% javel

gespoeld en nadien in schijfjes van 0,7cm gesneden in een laminaire airflow. De schijfjes

werden op petriplaten met 20ml VMA gelegd. Er werd 5ml steriel zoutwater (16g NaCl in

500ml water) over de geënte plaat gegoten om uitdroging van het zeewierschijfje tegen te

gaan.


De opname van NaClO in de cellen bleek toch de doodsoorzaak te zijn, want de schijfjes

zeewier stierven al na twee dagen. Als zeewier steriel gemaakt wordt met NaClO sterft het

af. De controle, die niet gesteriliseerd werd, was binnen de week gecontamineerd en stierf

uiteindelijk.

4.1.2.6 2cm diameter, 1% javeloplossing

4.1.2.6.1 Inleiding

Misschien was het inoculum bij de vorige proeven te klein. Het kon zijn dat het zeewier niet

groeide omdat er te weinig of zelfs geen meristeemcellen aanwezig waren in het thallus-

schijfje. Bij landplanten wordt er meestal ook meristematisch weefsel geënt zoals bijvoor-

beeld een stengeltje met okselknop. Uit voorgaande literatuur bleek dat Ulva lactuca het

meest groeikrachtig was in het midden van het thallus (Sluis, 2012). Om dit te testen werden

grotere schijfjes zeewier uit het midden van het thallus gesneden met een kurkboor.

26


Het VMA werd steriel in platen gegoten in een laminaire airflow zoals bij alle vorige proe-

ven. Het Ulva lactuca thallus werd tien minuten voorgespoeld met 1% javel oplossing om

het steriel te maken. Maar nu had de kurkboor een diameter van 2cm. Er werden schijfjes uit

het midden van het thallus gesneden.

Figuur 12: De grootte van het stukje thallus heeft geen invloed op de overleving op

een voedingsbodem


Het gebruik van grotere thallusschijfjes gaf geen verschil. Ook deze gingen ook al na twee

dagen dood (zie Figuur 12). De grootte van het inoculum maakt dus niet uit. Een mogelijke

verklaring is dat het groeipunt van Ulva lactuca toch niet in het midden van het thallus ligt.

4.1.2.7 2cm diameter, 5 keer spoelen met steriel zeewater

4.1.2.7.1 Inleiding

Om zeker te zijn dat het sterven van het zeewier in vorige proeven niet aan de opname van

NaClO in de cellen lag, werd deze proef herhaald maar zonder gebruik van javel. De veron-

derstelling was dat als er vaak genoeg gespoeld werd met steriel zeewater de concentratie

aan bacteriën, schimmels en gisten zou verkleind worden.


Er werd dus een cirkel met 2cm diameter uit het midden van het thallusoppervlak gesneden.

Deze werden nadien vijf keer gespoeld met steriel zeewater in een laminaire airflow. Na de

spoeling werden de schijfjes op een mediumplaat gelegd met 20ml VMA.


Deze hypothese bleek ook fout. Al na een viertal dagen was er contaminatie waar te nemen.

Spoelen met steriel zeewater spoelt de contaminatie niet weg.

27

4.1.2.8 Toevoegen van Proclin 150

4.1.2.8.1 Inleiding

Als de zeesla zelf niet steriel te krijgen was, was het misschien mogelijk om de voedingsbo-

dem zelf ongevoelig te maken voor contaminatie. Hiervoor werd gebruik gemaakt van Pro-

clin 150, een commercieel product om voedingsbodems steriel te maken en te houden. De

samenstelling van het product is 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one, 2-methyl-4-

isothiazolin-3-one, magnesiumchloride, magnesiumnitraat en water (Supelco, 2013).


Aan de vaste voedingsbodem werd 0; 1,5; 1 en 10µM BA gecombineerd met 0; 5; 10 en

20µl Proclin 150. Beide werden in de plaat gepipetteerd met behulp van micropipet en ste-

riele filtertip. Daarna werd er 20ml medium in de petriplaat gegoten en moest er gewacht

worden tot de voedingsbodems gestold waren voor de thallus schijfjes, gemaakt met de ste-

riele kurkboor met diameter 0,7cm, op het medium gelegd werden.


Figuur 13 toont enkele foto’s drie dagen na het maken van de platen. De platen zonder pro-

clin waren dood en gecontamineerd. Die met proclin leven nog nauwelijks. Zes dagen na het

maken van de platen zijn ze allemaal dood. De platen vanaf 5µl proclin zijn niet gecontami-

neerd. Enige invloed van BA is niet waarneembaar.

Figuur 13: Links bij de start van het experiment,

midden en rechts dode en gecontamineerde thallus schijfjes

28

4.1.2.9 Toevoegen van antibiotica

4.1.2.9.1 Inleiding

Een alternatief om een voedingsbodem steriel te houden is het toevoegen van antibiotica

(AB).


Er werden platen gemaakt die verschillende soorten AB bevatten in verschillende concentra-

ties. De gebruikte concentraties zijn gebaseerd op toepassingen bij gewone zaadplanten

(Werbrouck, mondelinge mededeling, 2013). Om AB te besparen werden de tests in kleine

petriplaatjes uitgevoerd met maar 4ml medium. Er werd eerst steriel een druppel AB in de

plaat gebracht, respectievelijk 0, 2, 4, 6 en 8µl AB waarna het medium over de petriplaat

gegoten werd.

Er werden vijf soorten AB getest in de hierboven genoemde concentraties. De AB die getest

werden waren in volgende stockoplossingen beschikbaar: vancomycine 50mg/ml, stepromy-

cin 300mg/ml, cefotaxime125mg/ml, kananycin 50mg/ml, Ampiciline 100mg/ml. Op elk

plaatje werden twee cirkeltjes gelegd met diameter van 0,9cm. Het thallus werd op voorhand

gespoeld met steriel zeewater.

De platen met 2, 4 en 6µl cefotaxime 125mg/ml en de platen met vancomycine 50mg/ml

waren niet gecontamineerd en bleven zelfs nog een vijftal dagen groen.

In een tweede proefopstelling werd dan enkel met deze twee antibiotica gewerkt. Er werd

telkens een combinatie gemaakt van het vancomycine en het cetotaxime zoals beschreven in

Tabel 3. In deze opstelling werden ook twee thallus schijfjes per plaat gebruikt. De platen

werden in de fytotron bij 15°C geïncubeerd bij 60µmol fotonen m-2

s-1

.

Tabel 3: Tweede proefopstelling met antibiotica, de nummers in de tabel zijn de nummers van de platen

0 µl cef** 2 µl cef 4 µl cef 8 µl cef

0 µl van* 1 2 3 4

2 µl van 5 6 7 8

4 µl van 9 10 11 12

8 µl van 13 13 15 16

* van = vancomycine; ** cef = cefotaxime

29


Bij de eerste antibiotica proef bleken cefotaxime en vancomycine een positieve invloed te

hebben op het overleven van de zeesla. Na een test met de combinatie van verschillende

concentratie cefotaxime 125mg/ml en cancomycine 50mg/ml bleek echter dat een te hoge

concentratie AB dodelijk was en zelfs niet in staat was om contaminatie tegen te gaan. Want

bij proef 2 waren na twee dagen de meeste petriplaten al beschimmeld. Met uitzondering

van plaatjes met nummers: 3, 4, 7, 8 en 15 die niet gecontamineerd waren (zie Tabel 3). Het

wier was zelfs nog een klein beetje groen. Na een week was het gecontamineerde weefsel

dood (wit). Pas na twee weken bleken ook de platen met nummers: 3, 4, 7 en 8 gecontami-

neerd (zie Figuur 14 ). Dus de antibiotica waren niet sterk genoeg om contaminatie tegen te

gaan. Een hoge concentratie van cefotaxime met een lage concentratie vancomycine bleek in

deze proef het beste resultaat te bekomen.

Figuur 14: Resultaat antibioticaproef na 1 week:

plaat 9 is gecontamineerd, het weefsel in plaat 7 daarentegen leeft nog en is niet gecontamineerd

4.1.2.10 Bespreking vaste voedingsbodem

Zeewier steriel krijgen is problematisch. Als het zeewier niet steriel is kan het ook niet in

vitro geteeld worden. Steriliseren met 10% javeloplossing betekende de dood voor het weef-

sel al na één minuut. Met 1% javel oplossing blijft het weefsel steriel maar is het ook binnen

de week na steriliseren dood. De grootte van het inoculum maakte geen verschil. Het toe-

voegen van het groeihormoon 6-Benzyladenine had eveneens geen invloed op de lengte van

de levensduur.

Vaste voedingsbodems bleken niet geschikt voor zeewier, vermoedelijk door een te lage

vochtigheidsheidsgraad van deze bodem. Maar zelfs na toevoegen van een laagje zout water

gaat het stukje weefsel toch dood. Door het toevoegen van proclin of antibiotica aan de voe-

dingsbodem blijven de thallusschijfjes wel iets langer leven, maar niet voldoende lang. Het

is niet mogelijk om via de standaardmethode voor landplanten zeewier in vitro te telen op

een vaste voedingsbodem. Sterfte kan te wijten zijn aan het gebrek aan symbiotische orga-

nismen, aan uitdroging of aan concurrentie met schadelijke organismen.

30

4.1.3 Proeven in vloeibare voedingsbodems

4.1.3.1 Inleiding

Ulva lactuca is een zeewier dat continu in de zee leeft. Uit voorgaande proeven leek vaste

bodemcultuur geen succes. Door de thallusschijfjes in een vloeibaar medium te steken zou

dit probleem eventueel opgelost kunnen worden. Vloeibare voedingsbodem is dezelfde MS

bodem als bij de vaste voedingsbodems maar dan zonder het toevoegen van de agar (zie

3.3.3). Om zuurstof toe te voegen, werden de buisjes met medium in een schudtoestel ge-

plaatst.

4.1.3.2 2cm diameter, 1% javeloplossing

4.1.3.2.1 Inleiding

De uitgevoerde procedure is dezelfde als bij de proef met vaste voedingsbodem en 1% javel

(zie 4.1.2.3) maar in dit geval met vloeibaar medium. Bij vaste voedingsbodems zou vocht-

verlies een mogelijke doodsoorzaak kunnen zijn. Dit zou bij vloeibare voedingsbodems geen

probleem mogen zijn.


Het vloeibare medium werd in duranflessen van 500ml gemaakt. Nadien werd 20ml van

deze voedingsbodem in steriele falconbuisjes gegoten met behulp van steriele pipetten in

een laminaire airflow. Het thallus werd 10 minuten gespoeld met een 1% javeloplossing,

daarna op steriel papier gelegd en met een gesteriliseerde kurkboor met twee cm diameter

werden er schijfjes uit het thallus gesneden. Deze schijfjes werden met behulp van een ste-

riel pincet in de falconbuis met medium gelegd. Het schudtoestel stond in de fytotron bij

15°C


De zeewierschijfjes stierven snel af door opname van NaClO in de cellen. De mediumoplos-

sing bleef wel steriel.

Figuur 15: Thallusschijfjes in vloeibaar zeewiermedium,

links bij start rechts een week later

31

4.1.3.3 2cm diameter, 5 keer spoelen met steriel zeewater

4.1.3.3.1 Inleiding

Bij voorgaande test bleek het gebruik van NaClO (javel) dodelijk. Er werd getest of de con-

centratie aan contaminanten door spoelen met steriel zeewater kon worden verminderd.


Hier gebeurde dezelfde procedure als de vorige. Het enige verschil was dat er vijf keer ge-

spoeld werd met steriel water in plaats van het gebruik van de 1% javeloplossing. De fal-

conbuis werd in een schudder gezet in de klimaatkamer bij 15°C.


Na een week trad er contaminatie op in de vloeibare voedingsbodem en al snel volgde de

dood van de cellen.

4.1.3.4 Afspoelen met Tween (detergent) in steriel zeewater

4.1.3.4.1 Inleiding

In het artikel van Azanza & Aliaza (1999) wordt er besproken dat het zeewier met detergent

werd gereinigd voor initiatie in het medium. Dus werd hier Tween als detergent uitgetest.


Voordat de thalluscirkel van twee centimeter diameter in de steriele falconbuis met vloei-

baar medium werd ondergedompeld, werd het zeewier grondig gereinigd in steriel zeewater

waarin detergent was opgelost. Het idee was om het zeewier “proper” te maken. Er werd

ook een controle gemaakt die niet gereinigd was.


Na zeven dagen is het weefsel dood. Of het gecontamineerd was, was moeilijk te zeggen

want het vloeibaar medium was al een beetje troebel van bij de start.

Figuur 16: Thallus gespoeld met steriel zeewater en Tween,

links na dag 1 - rechts na 6 dagen

32

4.1.3.5 Verschillende tijdspannes in 70% ethanoloplossing

4.1.3.5.1 Inleiding

Het artikels van Lascaux (2002) vermeldt het steriel krijgen van weefsel via ethanol. Daar-

om leek dit wel eens het proberen waard.


Hier werden de thallusschijfjes respectievelijk 0, 1, 5, 10 en 15 minuten in 70% ethanol ge-

houden om ze daarna af te spoelen in steriel zeewater en dan in een falcon buis te brengen

met 20ml vloeibaar medium. Alles werd uitgevoerd in een laminaire airflow.


Het weefsel dat één minuut in de ethanol gezeten had, heeft het drie dagen overleefd. De

andere thallusschijfjes waren allemaal na twee dagen dood. De ethanol werd door de cellen

opgenomen en dat kan mogelijkerwijze de cellen van binnenuit aangetast hebben. Opvallend

was dat de controle ook al na twee dagen dood was. Dus misschien was een tekort aan zuur-

stof de echte doodsoorzaak.

4.1.3.6 Pasteurisatie gewoon wier

4.1.3.6.1 Inleiding

Bij voedingswaren zoals zuivelproducten, wordt de techniek van de pasteurisatie gebruikt.

Pasteurisatie is een proces waarbij schadelijke organismen vernietigd worden door het weef-

sel gedurende een korte periode aan hoge temperatuur bloot te stellen. Dit zou ervoor zorgen

dat de bacteriën gedood worden maar het weefsel (eiwitten, suikers, …) gevrijwaard blijft.


De Ulva lactuca werd 15s in zeewater van 72°C gelegd. Nadien in VLM gestoken in een

laminaire airflow met een steriel pincet. Er was ook een controle met gewoon zeewater ge-

maakt.


Al na twee dagen lijkt het stukje thallus dat gepasteuriseerd was, bleek te worden. Na vier

dagen was het stukje thallus gestorven. De zeesla kan waarschijnlijk niet tegen hitte, vermits

de optimale groei temperaturen tussen de 10°C en de 25°C liggen. De controle was na een

week gecontamineerd en wit van kleur.

33

4.1.3.7 Gassterilisatie

4.1.3.7.1 Inleiding

Een andere methode om planten steriel te krijgen is met behulp van gassterilisatie. In het

Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB) steriliseren ze op deze wijze zaadjes voor in

vitro teelt en ook sporen van mossen.


De gassterilisatie vond plaats in een glazen stolp onder een trekkast. In een beker onder een

rekje werd 100ml bleekwater van 8% samengevoegd met 5ml van 38% HCl. Door de men-

ging van de vloeistoffen komt er een chloordamp vrij die alle schadelijke micro-organismen

zou doden. Er werd telkens een droog thallusschijfje en een thallusschijfje in zeewater op

het rekje in de glazen stolp gezet. Er werd ook een controle in gewone lucht gehouden. Ver-

schillende tijdspannes werden getest. 5 minuten, 15 minuten, en 1 uur.

Voor het weefsel in een steriele omgeving in het vloeibaar medium werd gebracht, werd het

eerst afgespoeld met steriel zeewater om alle schadelijke chloor af te wassen.

Figuur 17: Glazen stolp in trekkast waarin de gassterilisatie werd uitgevoerd


Na 15 minuten in de gassterilisator was de droge methode al dood. De natte methode leefde

nog, waarschijnlijk omdat het gas meer tijd nodig had om door te dringen door het water tot

aan het weefsel. Na drie dagen waren alle droge methoden dood.

De controles en de natte methodes waren nog groen. Maar wel lichtgroen of groen met witte

vlekken. Na vijf dagen waren de controles ook bruin-wit geworden. Van de vijf minuten

natte methode is na vijf dagen nog maar 10% groen. Bij de vijftien minuten nat zijn de ran-

den wel wit geworden maar het midden gedeelte ziet nog donkergroen. Tien dagen later is

de vijftien minuten methode nog steeds groen (Figuur 18).

34

Figuur 18: 15 minuten natte gassterilisatie na tien dagen.

Alle andere methoden en controles waren na tien dagen al dood. Na zestien dagen begon de

oplossing er troebel uit te zien en het weefsel begon uit elkaar te vallen. Dit kan mogelijk

door een tekort aan nutriënten zijn. Als het medium ververst zou geweest zijn, had het stukje

thallus misschien nog langer overleefd. Het is wel zo dat enkel de controles gecontamineerd

waren (witte en bruine substanties in het medium). Al de gasmethodes bleven steriel.

4.1.3.8 Antibiotica

4.1.3.8.1 Inleiding

De methode met het toevoegen van antibiotica aan de voedingsbodem (zie 4.1.2.9) werd hier

herhaald, maar dan in vloeibaar medium. Misschien was de oorzaak van de sterfte toen uit-

droging en kan dit bij deze methode vermeden worden.


Om uitdroging te voorkomen werd de gewenste concentratie antibiotica gemengd met de

juiste hoeveelheid VLM in een steriele proefbuis zoals weergegeven in Tabel 3. Voor de

thallusschijfjes (gesneden met een steriele kurkboor) in het medium gestoken werden, wer-

den ze eerst gespoeld met steriel zeewater. De steriele proefbuizen werden op een schudder

gezet om zuurstof in het medium te brengen. De incubatie vond plaats in de klimaatkamer

bij 15°C.

35


De thallusschijfjes bleven wel langer leven in vloeibaar medium dan op vast medium, maar

na negen dagen waren alle proefbuisjes besmet. De hoeveelheid antibiotica was dus niet

voldoende.

Figuur 19: Links de start van de antibiotica-proefopzet,

rechts de proef negen dagen later, gecontamineerd door micro organismen.

4.1.3.9 Bespreking vloeibare voedingsbodem

Het groeien van Ulva lactuca in vloeibare voedingsbodems was geen succes. Mogelijke oor-

zaken van sterfte kunnen zijn: contaminatie, opname javel, te lage concentratie zuurstof,

opname ethanol of andere onbekende factoren. Een andere verklaringsgrond kan zijn dat

zeewieren niet overleven zonder mogelijkheid tot symbiose met bepaalde zeeorganismen.

Volgens Wichard & Oertel (2010) leeft zeewier in symbiose met bepaalde zeebacteriën (Ro-

seobacter MS2 en Cyphaga MS6) Ook de website ecomare zegt dat de bacterie YM2-23

nodig is voor de uitgroei van zeesla (Ecomare, 2013). Het feit dat deze bacteriën in de bo-

dem ontbreken zou mogelijk een aanleiding kunnen zijn dat de groei van het zeewier stopt.

(Bij orchideeën die ook in symbiose leven met bepaalde grondbacteriën is de groei in vitro

wel gelukt.) Ook de problematiek van de zuurstoftoevoer is een mogelijke factor. Er moet

een meer geschikte manier van zuurstoftoevoeging zijn dan schudden. Na verloop van tijd

kan ook een tekort aan essentiële nutriënten een rol spelen.

36

4.2 Algemeen besluit in vitro initiatie met vast celweefsel

Het is zeer moeilijk en misschien onmogelijk om met delen van zeesla een in vitro cultuur

op te starten. Ulva lactuca is moeilijk steriel te krijgen. Ulva lactuca heeft bepaalde compo-

nenten nodig uit het zeewater, componenten waar we nu nog geen zicht op hebben. Of we de

testen nu uitvoerden met VMA of VMB, het resultaat bleef hetzelfde: sterfte van het weef-

sel. Als besluit kan gesteld worden dat de precaire specificiteit van het zeeslaweefsel ver-

hindert dat het behandelingen met javel, ethanol, antibiotica, proclin overleeft. Het dunne

weefsel bleek niet bestand te zijn tegen deze producten. Het kon ook niet concurreren tegen

andere micro-organismen. Vanaf een te hoge temperatuur, een te laag vochtgehalte of te

weinig zuurstof stierf het weefsel dan ook af.

4.3 Inductie sporulatie van Ulva lactuca

4.3.1 Doel

Het doel is het vormen van sporen en/of gameten bij Ulva lactuca op een gecontroleerde

manier. Deze sporen kunnen nadien voor tal van toepassingen gebruikt worden voor zowel

rechtstreeks zaaibed of als start bij in vitro groei na sterilisatie. Misschien zijn sporen wel

makkelijker te steriliseren dan gewoon weefsel. Deze sporen werden geïnduceerd met be-

hulp van verschillende methoden beschreven in de literatuur.

4.3.2 Inleiding

Een collega van Marlies Demeulenaere van het VIB maakt sporen van mossen steriel door

gassterilisatie. Dit in tegenstelling Tijana et al. (2007) en Jen-Tung & Weickun (2003) die

hun mossen steriel kregen op de conventionele manier door ze enkele ogenblikken in een

lage concentratie NaClO te houden. Maar voor dit getest kon worden, moesten er eerst spo-

ren en/of gameten gevormd worden. Hier is heel wat literatuur rond te vinden. Elke auteur

gebruikt een andere techniek om sporen of gameten te verkrijgen. Het is wel zo dat in dit

onderzoek er geen duidelijke scheiding gemaakt is tussen het vormen van sporen en het

vormen van gameten. Eigenlijk zouden elk nog eens apart moeten onderzocht worden.

37

4.3.3 Materiaal

Er werd gebruikgemaakt van gefilterd Noordzeewater. De filtratie gebeurde met een ederol

JC Bunzer No 15 (menge 100) filter. Het zeewater bevat 32‰ NaCl en heeft een pH 8. Er

werden twee soorten petriplaten gebruikt met verschillende diameter: 8,4cm en 4cm, en een

hoogte van 1cm. De abiotische parameters staan beschreven in Tabel 4

Tabel 4: Abiotische parameters van de verschillende fytotrons, gebruikt in het experiment

Temperatuur Aantal µmol fotonen m-2

s-1

* Hoeveelheid TL-D lampen

15°C 60 2

20°C 100 4

23°C 60 2

26°C 60 2

*Het aantal fotonen m-2

s-1

werd gewijzigd door de platen dichter bij de lampen te zetten

Er werden koelkasten gebruikt met de temperaturen 4°C of 0°C. De pH en het zoutgehalte

werd gemeten door een NaCl- en pH-meter (Hanna instruments HI 2550)

4.3.4 Methoden en resultaten

4.3.4.1 Inleiding

Al deze methoden tot het vormen van sporen of gameten zijn afkomstig uit de literatuur en

werden elk minstens twee keer getest. Hieronder volgt een samenvatting van de verschillen-

de testen.

4.3.4.2 Methode 1 (Sluis, 2012), (Niesenbaum, 1988)

Methode 1.1 Er werd koud zeewater (2°C) gegoten in een petriplaat en er werd met 5,00g

gecentrifugeerd thallus ( 3min. bij 5000 rpm) in het zeewater gelegd. Dit werd

24u bij 2°C gehouden. Daarna werd het water ververst (terug 2°C) en de plaat

werd dan in een klimaatkamer van 20°C en 100 µmol fotonen m-2

s-1

geïncu-

beerd. Volgens het artikels zou het 3500lux = 44,87 µmol fotonen m-2

s-1

9u

donker 15u licht moeten zijn. (Bij TL 33 (Philips): 1000 lux = 12.82

μmol/s.m2.

Methode 1.2 Voor de tweede opzet werd er ± 5,00g thallus in kleine stukjes gesneden, ge-

centrifugeerd (3min. bij 5000 rpm) om overtollig vocht te verwijderen en.

Deze thallusstukjes werden dan in zeewater van 2°C gelegd. Om de twee da-

gen werd het zeewater ververst (2°C) gedurende twee weken. De incubatie

was bij 15°C en 60 µmol fotonen m-2

s-1

.

38

Methode 1.3 Een derde manier bestond erin om ±5,00g stukjes thallus van 3 á 4 mm te

nemen en deze grondig te spoelen met koud (0°C) zeewater. Centrifugeer na

spoelen (3min. bij 5000 rpm). De gespoelde stukken thallus werden nadien in

een petriplaat met 40 ml zeewater van 20°C gelegd. Er werd in een klimaat-

kamer van 20°C met 100 µmol fotonen m-2

s-1

geïncubeerd.

4.3.4.3 Resultaat methode 1

Bij de eerste en derde methode van Sluis (1.1 en 1.3) bleef het weefsel gewoon groen, hier

en daar wat lichter en wit, maar bij microscopisch onderzoek bleek dit afgestorven weefsel

te zijn.

Bij de tweede methode van Sluis (1.2) had het thallus na achtendertig dagen gesporuleerd.

Het omringende water zag groen (zie Figuur 20). Onder de microscoop waren er ovale ga-

meten waar te nemen met twee flagellen. Bij het openen van de petriplaat kwam er stank

vrij. Dit kon duiden op een anaerobe omgeving. Het thallus zag bleekgroen en bij aanraken

voor microscopisch onderzoek viel alles uit elkaar.

Figuur 20: Links bij start van de proef en rechts een gesporuleerde versie, achtendertig dagen later

Bij het experiment in Figuur 20 werd een groot stuk thallus gebruikt. Bij Figuur 21 werd het

stuk thallus verdeeld in kleinere deeltjes door het thallus te scheuren.

Figuur 21: Links het weefsel bij de start van het experiment en rechts zevenenveertig dagen later.

Het weefsel is dan zeer broos en het water rondom is licht groen gekleurd

39

Onderstaande foto (Figuur 22) toont vermoedelijk gameten bij een microscopische vergro-

ting van 40 maal. Er zijn twee flagellen zichtbaar. Bij sporen zouden er vier flagellen zicht-

baar zijn. Deze gameten werden verder gebruikt in proef 4.4.3: Isolatie van sporen.

Figuur 22: Vermoedelijk gameten van Ulva lactuca

Herhaling tweede proef van Sluis (1.2)

Deze methode werd nogmaals herhaald als controle. Bij herhaling kleurde het omliggende

zeewater na drieëndertig dagen groen. Bij elke verversingsbeurt werd ook de pH en het

zoutgehalte gemeten. Bij de start van de proef was de pH 7,99 en het percentage NaCl

3,21%. Na twee dagen was de pH al 8,14 en was het zoutgehalte gestegen tot 3,28%. Na vijf

dagen zonder verversing was de pH al tot 9,38 gestegen en het zoutgehalte gedaald tot

2,79%. Dit zou er op kunnen wijzen dat door verbruik van de nutriënten door de zeesla de

pH van het zeewater stijgt en het zoutgehalte daalt. Of dit sporulatie stimuleerde was ondui-

delijk.

Figuur 23: Herhaling van de tweede methode van Sluis (1.2).

Links bij start van de proefopzet rechts drieëndertig dagen later.

Er is dan een groene wolk zichtbaar, dit zou kunnen wijzen

op het vrijkomen van sporen of gameten

40

Merkwaardig genoeg lijkt bij nader microscopisch onderzoek er een spontane vorming van

protoplasten te zijn. Op Figuur 24, de bovenste foto, lijken de cellen heel erg op protoplas-

ten. Er zijn geen flagellen waar te nemen. Een slechte microscopische belichting kan de oor-

zaak zijn van dit resultaat. Links onderaan zijn een aantal lege cellen te zien, die mogelijks

gesporuleerd zijn, omringd door een aantal dode cellen. Er vindt ook cellyse plaats wat duidt

op osmotische druk. Rechts onderaan lijkt het of alsof de cellen van elkaar los komen.

Figuur 24: Weefsel en omringend zeewater van de tweede keer methode 1.2 na 33 dagen, 40 maal vergroot

Bij gewoon gezond weefsel oefenen de onderliggende cellen druk op elkaar uit waardoor de

cel een hoekig uitzicht krijgt. Hier was dit niet het geval. De druk was volledig weg en de

cellen waren rond zoals bij protoplasten. De kans dat cellen zich spontaan tot protoplasten

zouden omvormen lijkt zeer onwaarschijnlijk. Toch hebben Reddy et al. (2007) een sponta-

ne protoplastvorming al eens beschreven. Mogelijk zou de celwand zichzelf kunnen afbre-

ken zonder dat er uitwendig toegevoegde enzymen op ingewerkt hebben.

41

Tweede herhaling tweede proef van Sluis (1.2)

Na nogmaals een herhaling van de tweede methode van Sluis (1.2) is er merkwaardig ge-

noeg na vijftig dagen nog steeds geen groene wolk waar te nemen. Dit werd zowel getest

met oud weefsel als met vers geoogst weefsel. Beiden bleven hardnekkig groen zonder enige

tekenen van sporulatie, zelfs geen afstervende deeltjes (zie Figuur 25).

Figuur 25: Derde uitvoering van de tweede methode van Sluis (1.2).

Links met oud weefsel dat al bijna een jaar in het opslagaquarium zat,

rechts met nieuw, vers geoogst, weefsel

42

4.3.4.4 Methode 2 (Goudsmit, 2013)

Bij de methode volgens Goudsmit werd ± 5g Ulva lactuca thallus genomen en gecentrifu-

geerd (6min. tegen 8000rpm). Dit thallus werd in een petriplaat gelegd gevuld met 40ml

zeewater. Deze platen werden gedurende 24u in het donker bewaard en dit bij 4°C in een

koelkast. Het stuk thallus werd nadien in een petriplaat met vers zeewater van 20°C geïncu-

beerd bij 100µmol fotonen m-2

s-1

.


Het materiaal leek gesporuleerd. Er waren witte stukken zichtbaar in het groene thallus. Na

de koelkastperiode en het verversen van het water werd geen verandering waargenomen. Pas

vanaf dag tien kwamen er hier en daar witte vlekken aan de rand van het thallus. Maar bij

nader microscopisch onderzoek bleken deze witte randen gewoon afgestorven weefsel te

zijn (zie Figuur 26). Dit weefsel stierf waarschijnlijk af doordat de randcellen beschadigd

werden bij het in stukken snijden. Ook bij de herhaling waren er geen sporen of gameten

waargenomen.

Figuur 26: Beeld van de witte stukken weefsel bij 40X vergroting

4.3.4.6 Methode 3 (Han, et al., 2008) (oorspronkelijk voor Ulva pertusa)

Met een kurkboor werden schijfjes van 0,6cm diameter uit de rand van de thallus gesneden.

Het cirkeltje werd in een petriplaat met 10ml zeewater met 32‰ NaCl gelegd. Er werd geïn-

cubeerd in en fytotron van 15°C bij een licht - donker regime van 16u licht en 8u donker. De

platen waren zo gepositioneerd dat ze 80-100µmol fotonen m-2

s-1

opvingen. De pH was

tussen 7 en 9. Volgens het artikel zouden er binnen de 72 tot 96 uur al sporen zichtbaar moe-

ten zijn.


Er waren witte randjes waar te nemen maar geen groene wolk. Bij nader microscopisch on-

derzoek bleken de witten raden gewoon afgestorven weefsel. Deze proef had dus twee keer

geen succes.

43

4.3.4.8 Methode 4 (Azanza & Aliaza, 1999)

± 1,5 g Ulva lactuca thallus werd 1u gedroogd door dit op filterpapier (Whatman No 15) te

leggen in een petrischaaltje. Deze petriplaat lag in een kamer van 15°C onder licht van

60µmol fotonen m-2

s-1

. Na deze droge periode werd het thallus in een petriplaat gelegd met

20ml vers gefilterd zeewater van 15°C en 32‰NaCl.


Het materiaal leek gesporuleerd. Vanaf dag twee waren er kleine witte vlekjes waar te ne-

men (zie links onderaan Figuur 27). Maar het grootste deel van het thallus bleef wel zeker

twintig dagen donker groen. Deze bevindingen waren niet in overeenstemming met het arti-

kel. Volgens Azanza & Aliaza (1999) zouden er binnen de vijf dagen al sporen gevormd

moeten zijn. Dit was niet het geval. De kleine witte vlekjes waren ook hier weer afgestorven

weefsel.

Figuur 27: Resultaat methode 4

44

4.3.4.10 Methode 5 (Wichard & Oertel, 2010)

Er werd ± 5g Ulva lactuca in stukjes van 1 tot 3mm gesneden. Dit thallus werd 15min. ge-

spoeld met gedestilleerd water en gecentrifugeerd (6 min. 8000rpm). Daarna werd het thal-

lus in vers zeewater in een kamer van 20°C bij 100µmol fotonen m-2

s-1

gelegd. Na drie da-

gen mocht het thallus voor een tweede keer gespoeld worden. Na deze tweede spoeling zou

er direct sporulatie moeten optreden, althans volgens het artikel.


Er zijn geen sporen en geen verkleuring waar te nemen. Zelfs 87 dagen later is het zeewier

nog steeds groen, zelfs zonder extra toevoeging van zuurstof en nutriënten (zie Figuur 28).

4.3.4.12 Methode 6 (De Ruiter, mondelinge overdracht 2013)

Een stuk thallus dat al kleurverandering vertoonde werd in een vierkante petriplaat gelegd.

Volgens De Ruiter zou dit stuk thallus al met sporulatie bezig zijn of zouden de cellen reeds

gedifferentieerd zijn. Deze plaat werd dan met zeewater gevuld tot het thallus volledig be-

dekt was. Één kant van de plaat werd verduisterd en de andere kant werd verlicht (in dit ex-

periment zonlicht). Na enkele uren zouden de eventuele gevormde gameten naar het licht

zwemmen en dus in de bovenhoek een groen laagje vormen. De sporen zouden naar de bo-

dem zinken om zich vast te hechten onder het thallus in het donkere gedeelte.


Er zijn geen sporen waar te nemen. Bij verder microscopisch onderzoek bleken de witte

stukken gewoon dood weefsel (Figuur 28). Door lange tijd in volle zon te staan begonnen de

andere organismen aanwezig in het gefilterd zeewater zich te vermeerderen. Hierdoor werd

de zeesla aangetast en opgegeten. Deze methode is niet echt reproduceerbaar. De sporulatie

moet in de bewaaraquaria al begonnen zijn. Hoe de sporulatie geïnduceerd werd bleef on-

duidelijk.

Figuur 28: Dood weefsel bij 40x vergroting

45

4.3.4.14 Methode 7 (Mantri, Singh, Bijo, Kumari, Reddy, & Jha, 2010)

Volgens Mantri et al. (2010) zou het zoutgehalte in combinatie met de temperatuur invloed

kunnen hebben op het sporulatiegedrag van Ulva faciata. Daarom werd deze methode getest

op Ulva lactuca. Per petriplaatje werd er een cirkel thallus gelegd met diameter van 0,6cm.

Er werd 10ml gefilterd zeewater, gedestilleerd water (AD) of een mengsel van elk 50% toe-

gevoegd. Dit werd dan verdeeld over verschillende temperaturen 15, 20, 23 en 26°C (zie

Tabel 5). De plaatjes kregen 60µmol fotonen m-2

s-1

. Van alle plaatjes werd ook een controle

exemplaar gemaakt.

Tabel 5: Proefopzet methode 7

AD 50% AD 50% zeewater zeewater

15°C 1 A,B 2 A,B 3 A,B

20°C 4 A,B 5 A,B 6 A,B

23°C 7 A,B 8 A,B 9 A,B

26°C 10 A,B 11 A,B 12 A,B


Al vanaf dag twee begonnen platen 10 A en 10 B het moeilijk te krijgen. 50% van het blad-

oppervlak was bleek geworden. De thallusschijfjes in AD hadden het duidelijk moeilijker

dan de platen met zeewater. In onderstaande tabellen staat de opvolging van de resultaten na

3 dagen, vier dagen en zeven dagen.

Tabel 6: Dag drie methode 7


15°C 1B 100% wit; 1A groen groen lichtgroen

20°C 4A 30% wit; 4B groen groen groen

23°C 7A 30% wit; 7B 10%wit groen groen

26°C 50% wit groen groen

Tabel 7: Dag vier methode 7


15°C 1B 100% wit; 1A groen groen Licht groen

20°C 4A 30% wit; 4B groen groen groen

23°C 7A 40% wit; 7B 20%wit groen 0,5% wit

26°C 50% wit groen Licht groen

Tabel 8: Dag zeven methode 7


15°C 1B 100% wit; 1A groen Licht groen 3B 10% wit

20°C 4A wit; 4B20% wit groen groen

23°C 7A 90% wit; 7B 30%wit groen 1% wit

26°C 100% wit groen Licht groen

46

Het is duidelijk dat water zonder zout niet zo goed was voor Ulva lactuca. Halvering van het

zoutgehalte maakte niet veel verschil in vergelijking met zuiver zeewater. De witte randen

waren scherp uitgelijnd en het leek of de stukken met lichtere kleur gingen sporuleren. Bij

microscopisch onderzoek bleek dit niet waar te zijn. Bij microscopisch onderzoek van 1A,

2A, 3B, 4A, 5A bleken de witte vlekken gewoon afgestorven weefsel. Hier en daar waren

ook wat lege cellen te zien, maar nergens sporen of gameten. Na zeventien dagen was het

resultaat als beschreven in tabel 9.

Tabel 9: Dag 17 methode 7


15°C 1B 100% wit; 1A 50% wit 2A 20% wit; 2B groen 3B wit

20°C 100% wit 5A 100% wit; 5B 40%wit groen

23°C 7A 100% wit; 7B 60%wit groen 1% wit

26°C 100% wit 10% wit Licht groen

Onderstaande foto’s tonen het resultaat van plaat 11B en 5B.

Figuur 29: 11B na 17 dagen Figuur 30: 5A, het groene gedeelte is levend weefsel het

zwarte gedeelte afgestorven weefsel en het witte zou

gesporuleerd weefsel kunnen zijn

Figuur 31: 11B: Links 20X vergroting van de rand. Midden een 40X vergroting van de overgang van levend naar

dood weefsel. Rechts lege cellen waarvan het niet duidelijk was of ze gesporuleerd zijn

47

4.3.5 Bespreking sporulatie methoden

De meeste methoden bleken niet succesvol. Of dit te wijten was aan de anaerobe omgeving

of aan het feit dat het meeste zeewier al een tijd in een aquarium had gelegen was niet hele-

maal duidelijk. Dit heeft verder onderzoek nodig. Het is nodig om al deze proeven nog eens

te herhalen en alle parameters zoals licht, temperatuur maar vooral saliniteit en pH beter vast

te leggen. Momenteel zijn de resultaten niet representatief en niet betrouwbaar. De enige

methode die werkte was deze waarbij om de twee dagen het zeewater werd ververst met

koud zeewater, gedurende twee weken ( zie 4.3.4.2).Hier werden bij de eerste poging game-

ten waargenomen. De proef leek niet consistent want herhalingen mislukten. Alle toepassin-

gen, overgenomen van de literatuur, bleken niet te lukken. Of dit lag aan het gebruik van

Noordzeewater of aan de kunstmatige belichting, was niet helemaal duidelijk. De literatuur

liet soms belangrijke details weg waardoor de proeven niet exact konden herhaald worden.

4.3.6 Besluit sporulatie methoden

Hoe sporen en gameten gevormd worden blijft onduidelijk. Een specifieke combinatie van

temperatuur, licht, pH en zoutgehalte moet de vorming van sporen of gameten induceren.

Welke combinatie dit mogelijk maakt blijft onduidelijk. Het besluit was dat verder onder-

zoek nodig zal zijn om de juiste omstandigheden te vinden. Door regelmatig een koude-

shock te geven en lang te wachten hadden we nog het meeste kans op sporulatie.

48

4.4 Identificatie en isolatie sporen en gameten van U. lactuca

4.4.1 Doel

Het doel was sporen of gameten op te wekken, te identificeren om ze vervolgens steriel te

maken en ze dan in een voedingsbodem te initiëren. Na deze initiatie kon de spore of gameet

uitgroeien tot een steriel thallus.

4.4.2 Identificatie van sporen en gameten

Sporen of gameten zijn waar te nemen doordat er een groene schijn in het water verschijnt

en het thallus wit kleurt en scherpe randen krijgt. Onder de microscoop met een vergroting

van 40 zien de sporen en gameten er ovaal uit. Sporen hebben vier flagellen. Gameten heb-

ben twee flagellen en zijn kleiner dan sporen. Mannelijke gameten zouden kleiner en talrij-

ker zijn dan vrouwelijke gameten (mondeling, Wald, Van Zwol en de Ruiter) (Goudsmit,

2013; Sluis, 2012).

4.4.3 Isolatie van sporen

4.4.3.1 Spoelen met steriel zeewater


Voor deze proef werden de gameten van de 4.3.4.2: methode 1 gebruikt. Het water rond het

gesporuleerde thallus zag wazig groen (zie Figuur 20). Er werd 90µl zeewater met groene

wolk gepipetteerd en in een eppendorfje gedaan. Het eppendorfje werd met een toerental

van 4000rpm gecentrifugeerd. Het supernatans werd verwijderd. 270µl steriel zeewater werd

toegevoegd in een steriele omgeving (laminaire airflow). De verschillende deeltjes werden

gehersuspendeerd en opnieuw gecentrifugeerd. Dit werd vijf keer herhaald. De pellet beko-

men na de vijfde spoeling werd opgelost in 90µl steriel zeewater en op/in VMA, VLM gego-

ten. De vloeibare oplossing zat in een falconbuis en werd in een schudtoestel geplaatst

(15°C) om de zuurstof toevoer te bevorderen. De vaste planten werden in de fytotron bij

15°C en 60µmol fotonen m-2

s-1

gezet.

Na groei werden een aantal cellen overgeënt in een andere falcon met 40ml medium. Na drie

weken groei werden de cellen microscopisch onderzocht en in en nieuwe opstelling met

perslucht ondergebracht. Alles werd bij 15°C bewaard.

49


De sporen op VMA schimmelden na twee weken (zie Figuur 33). De sporen in VLM waren

ook gecontamineerd. Maar na een plukje gedifferentieerd weefsel over te enten in nieuw

VLM bleef het steriel en had het de kans om verder te groeien (zie Figuur 32). De inhoud

van de falcons onder de microscoop zag er uit als Figuur 34. Deze groene bolletjes waren

bewegelijk en draaiden rond.

Figuur 32: Links gecontamineerde voeding met weefselcellen. Midden vers overgeënte cellen in VIM,

Rechts groei van gameten na drie weken

Figuur 33: Sporen op VMA

Figuur 34: Microscopisch beeld (40X vergroting) van de inhoud van de

falcon met VLM

50

4.4.3.2 Groei in duranflessen met perslucht


Wanneer het medium van Figuur 32 uitgeput begon te raken werden deze sporen na micro-

scopisch onderzoek overgezet in een opstelling met duranflessen waar perslucht door gebla-

zen werd. (Lascaux, 2002) (zie Figuur 35). Perslucht werd door luchtfilters in steriele rubbe-

ren buizen geblazen. Hierdoor kon er een zuurstofstroming in het steriele VLM gecreëerd

worden. Alle recipiënten werden samen geautoclaveerd (130°C bij 1atm gedurende 15 tot 30

min.).

Figuur 35: Gameten incubatieopstelling volgens (Lascaux, 2002) met links een aantal opgepipetteerde losse gameten

en rechts een stukje gevormd weefsel uit gameten


De gameten begonnen zich al snel te vermenigvuldigen en vormden groene vlakken aan de

randen waar ze zich konden vasthechten (zie Figuur 36). Helaas verdampte het VLM vrij

snel door de droge perslucht die er in geblazen werd (zie Figuur 37). Hierdoor moest er om

de twee weken minstens 150ml steriel medium bijgegoten worden in de eerste duranfles.

Het afdekken van de dop met folie hielp een klein beetje tegen de verdamping maar niet

voldoende. Figuur 38 toont de groei na 70 dagen.

Figuur 36: Het vermenigvuldigen

van de sporen in de duranfles met

VLM

Figuur 37: Het VLM verdampte onder invloed

van de droge perslucht die er in geblazen werd

Figuur 38: Zeewier weefsel

gevormd na 70 dagen

51

4.4.4 Bespreking identificatie en isolatie sporen en gameten

De vaste bodems droogden uit en beschimmelden. In de vloeibare bodems waren er bruine

contaminaties waar te nemen. Het was pas na overenten dat er een zuivere cultuur kon be-

komen worden. Maar zelfs dan was het niet zeker dat het een Ulva lactuca cultuur betrof.

De groei in een vloeibaar medium gaat goed, zolang er voldoende nutriënten aanwezig blij-

ven (gedurende iets meer dan een maand). Er komen meer cellen en deze groeperen zich in

klontertjes. De groei in duranflessen met perslucht moet echter nog geoptimaliseerd worden.

Een groot probleem was de sterke verdamping van het medium. Bij het verversen was er

kans op contaminatie, zelfs al werd er in een laminaire airflow gewerkt. Na veertig dagen

was er een groene smurrie waar te nemen (zie Figuur 37 ) Maar er was nog geen sprake van

zeeslaweefsel klaar voor de teelt. De foto genomen na 70 dagen was een klompje cellen en

geen geordend thallusweefsel. De groei duurt langer dan aangegeven door Ohno & Duy Tret

(1997). Zij beweren dat er na 20 dagen al mooi weefsel kan verkregen worden.

4.4.5 Besluit identificatie en isolatie sporen en gameten

Spoelen met steriel zeewater om de gameten steriel te krijgen was niet geschikt. Er moet nog

een betere methode gezocht worden. Gameten groeien niet op VMA, ze overleven alleen in

VLM. Aan de opkweekmethode in duranflessen moet nog gewerkt worden. Deze methode

was arbeidsintensief en was gevoelig voor besmetting Ook de groei van weefsel duurde

lang.

52

4.5 Vorming van protoplasten

4.5.1 Doel

Ook via een protoplascultuur kan steriel weefsel verkregen worden dat dan verder in vitro

geteeld kan worden. Alle hinderlijke organismen kunnen samen met de celwand verwijderd

worden. Als de celwand nadien terug geregenereerd wordt, kan er thallusweefsel gevormd

worden. De eerste doelstelling was dus het creëren van protoplastische zeewieriecellen.

4.5.2 Inleiding

Protoplasten kunnen op verschillende manieren bekomen worden. Deze celwand kan op

mechanische, enzymatische, immunologische, chemische, spontane of elektrische wijze

verwijderd worden, zodat enkel de celinhoud en het celmembraan overblijven. In dit onder-

zoek werd geopteerd om protoplasten te bekomen via enzymatische weg omdat de enzymen

in het labo voorhanden waren vanwege een voorgaand onderzoek.

Op pagina 166 van ‘a simple method for mass isolation of protoplasts from species of Mo-

nostroma, Enteromorpha and Ulva (chlorophyta, Ulvales)’ van Uppalapati en Fujita (2002)

staat te lezen dat zij een steriele mutant uit India cadeau kregen van Dr C.R.K. Reddy. Het

was toen niet duidelijk of het steriel van ‘niet mogelijk om zich voort te planten’ of steriel

van ‘niet besmet’ bedoeld werd. Na het lezen van een aantal artikels van C.R.K. Reddy ont-

stond het idee om via plantregeneratie van protoplasten een steriel van ‘zonder ongewenste

micro-organismen’ algenweefsel te bekomen.

De in de literatuur gevonden methoden om protoplasten te vormen zijn niet altijd even uni-

form. Daarom worden eerst twee artikels uitgetest. Nadien worden de osmotische waarde

aangepast om tot het beste resultaat te komen.

4.5.3 Vormen van protoplasten

4.5.3.1 Poging 1 afgeleid van protoplastvorming bij zaadplanten + aba-lonepoeder

4.5.3.1.1 Inleiding

Eerst werd de methode voor landplanten uitgetest omdat de kennis hiervan het grootste is.

De geraadpleegde literatuur rond protoplastvorming bij zeewieren, gebruikt abalonepoeder

om de celwand af te breken, daar waar cellulase als enzym alleen niet voldoende was.

53


Er werd een 50mM 2-(N-morpholino)ethane sulphonic acid (MES) buffer gemaakt met pH 6

in gefilterd zeewater. 0,2M mannitol, 2% cellulaze onozuka R-10 en 2% abalonepoeder

werd hierin opgelost en gefiltreerd. 50mg zeewier samen met 4ml van bovenstaande oplos-

sing werd in een petriplaatje gedaan. Deze petriplaat werd gedurende 16u al schuddend ge-

ïncubeerd op kamertemperatuur en met 25 toeren per minuut.


Alle cellen waren kapot. Geen enkele protoplast te zien. Deze methode is maar één keer uit-

gevoerd.

4.5.3.2 Poging 2 afgeleid van (Reddy & Fujita, 1991; Reddy et al., 2007)

4.5.3.2.1 Inleiding

De methode voor standaard landplanten werkte niet. Daarom werden zeewiermethoden ge-

bruikt beschreven in de literatuur.


Jong vegetatief thallus werd gewassen met gefilterd zeewater. De enzymen werden in de

gewenste concentratie opgelost in water met 1% NaCl en 50mM MES buffer met pH6 +

0,6M Mannitol. De enzymconcentraties zijn 2% Fulka cellulase van Aspergillus niger en 2%

abalonepoeder (halias Iris aroma New-Zealand). Gefiltreerd omwille van de grove stukjes in

het abalonepoeder. Er werd 50mg weefsel in kleine stukjes gesneden van ongeveer 1mm2 en

hieraan toegevoegd. De plaatjes incubeerden bij 20°C in het donker op een roterende schud-

der (15-20rpm) gedurende drie uur. De protoplasten werden na drie uur door filtratie en cen-

trifugatie geïsoleerd. De scheiding van grote resten werd gedaan met een nylonfilter en er

werd gecentrifugeerd gedurende 10min. bij 1000rpm. Na de isolatie werden de protoplasten

in 1ml van 0,2M mannitol 50mM MES en 1% NaCl gehersuspendeerd.


Ook hier was geen enkele protoplast te zien, wel veel ongewenste contaminanten. Waar-

schijnlijk is drie uur incubatietijd niet genoeg. Hierdoor is besloten deze methode opnieuw

te testen met een langere incubatie duur (zie 0)

54

4.5.3.3 Poging 3 testen van verschillende concentraties mannitol

4.5.3.3.1 Inleiding

De literatuur betreffende deze methode was eensluidend, behalve op het vlak van osmoti-

sche waarden en incubatieduur. Daarom werden verschillende osmotische concentraties en

incubatietijden getest.


Het proces was gelijklopend met poging 2, maar met dit verschil dat er 0,2; 0,3; 0,4; 0,5;

0,6; 0,8 en 0;8 M mannitol uitgeprobeerd werd. Ook de invloed van incubatieduur werd na-

gegaan door regelmatig met de geïnverteerde microscoop naar het weefsel te kijken.

Samenstelling oplossing Y:

1% NaCl

0,75g abalone acetone poeder (halias Iris aroma New-Zealand) / 50ml (1,5%)

0,75g Fulka cellulase van Aspergillus niger / 50ml (1,5%)

0,83 MES / 50ml

50ml miliQ water

oplossing Y werd gefiltreerd en in 2 maal 25 ml verdeeld.

Met de 1e 25ml werd oplossing X gemaakt.

Samenstelling oplossing X:

4,55g mannitol/ 25ml (om 1M oplossing te maken)

50mM MES

25ml miliQ water

1% NaCl

Nadien werden in kleine petriplaatjes de volgende oplossingen verdeeld:

Voor 0,3M: 1,2ml X + 2,8ml Y

Voor 0,4M: 1,6 ml X + 2,4 ml Y

Voor 0,5M: 2 ml X + 2 ml Y

Voor 0,6M: 2,4 ml X + 1,6 ml Y

Voor 2,8M: 1,6 ml X + 1,2 ml Y

Voor 3,2M: 1,6 ml X + 0,8 ml Y

De plaatjes werden gevuld en het zeewier werd in stukjes gesneden. Daarna werd alles in

aluminiumfolie op de schudder geplaatst en regelmatig met de microscoop gecontroleerd op

het loskomen van cellen.

55

Na het loskomen van de cellen werd de oplossing gefilterd met een nylonfilter en in eppen-

dorfjes verdeeld. Deze werden dan gecentrifugeerd gedurende 10min. bij 1000rpm. Het su-

pernatans werd verwijderd en de pellets geresuspendeerd met de juiste concentratie van op-

lossing X. Deze proef werd twee keer uitgevoerd.


Bij 0,3M is niets te zien, hier en daar een geëxplodeerde cel. Bij 0,4M hangen de cellen nog

aan elkaar, maar geen protoplasten te zien. Een voorbeeld van cellen die loskomen is te zie

in Figuur 39. Bij 0,5M en 0,7 M mannitol was er niets te zien.

Op het eerste zicht waren er bij de tweede poging na 24u incuberen bij de 0,6M mannitol het

meeste protoplasten aanwezig (zie Figuur 42). Op één objectglaasje zijn er zeker 109 proto-

plasten zichtbaar. Bij de 0,4M mannitol slechts acht. Maar ook een osmotische concentratie

met 0M mannithol kan protoplasten vormen, of deze ook levensvatbaar zijn valt te betwijfe-

len (zie Figuur 40) Hier was duidelijk veel van het omgevingsvocht opgenomen. Voor een

exactere telling kan er best een Bürker chamber telkamer gebruikt worden.

Figuur 39: Na drie uur beginnen de

cellen los te komen (20X vergroot)

Figuur 40: Links, één van de weinige protoplasten bij 0M mannitol na 16u

incubatie. Rechts, de herhaling, 24u incubatie ook 0M mannitol. (40X ver-

groting)

Figuur 41: 0,8M mannitol na 24u

incubatie (40X vergroting)

Figuur 42: 0,6M mannitol na 24u incubatie (40X vergroting)

56

4.5.3.4 Poging 4: gelukte poging herhalen + testen zonder cellulase

4.5.3.4.1 Inleiding

Voorgaande tests waren niet eenduidig, daarom werden nog enkele herhalingen uitgevoerd.


De oplossingen X en Y werden bewaard bij -80°C. Hiermee werden de proeven van 0,6M,

de 0,4M en de 0M mannitol herhaald met 24u incuberen.

Voor de proef met enkel abalonepoeder als enzym werd er een volledig nieuwe oplossing

gemaakt. Deze test werd maar één keer uitgevoerd.

Figuur 43: Celwand die aan het loskomen is, bekeken door de geïnverteerde microscoop


Hier weer een identiek resultaat. Het meeste protoplasten bij 0,6M mannitol, het minste pro-

toplasten bij 0M mannitol. Als er enkel abalonepoeder als enzym gebruikt werd, werden er

geen protoplasten gevormd.

57

4.5.4 Bespreking vorming van protoplasten

De methode met 0,50mM MES, 1,5% cellulase, 1,5% abalone, 0,6M maninitol en 1%NaCl

in miliQ water was de beste methode. Er moet wel 24u in het donker geïncubeerd worden al

zacht schuddend. Deze incubatieduur was veel langer dan in de vergelijkende literatuur. Dit

kan te wijten zijn aan het gebruikte cellulasepoeder dat al vrij oud was. De temperatuur was

kamertemperatuur (±20°C), dit zou de reactiesnelheid vermoedelijk niet beïnvloeden.

Om het onderzoek af te ronden zouden er nog enkele proeven uitgevoerd kunnen worden:

levensvatbaarheid van de protoplasten via oplossing van fluoresceïne diacetaat

(FDA) (Thielemans, 2005).

degradatiegraad van de celwand testen met behulp van calcofluor-White

regeneratie van de protoplasten via lowmeltingpoint agar

telling van het aantal protoplasten via de Bürker chamber

4.5.5 Besluit: vorming van protoplasten

De methode met 0,50mM MES, 1,5% cellulase, 1,5% abalone, 0,6M maninitol 1%NaCl in

miliQ met 24u incuberen al zacht schuddend in het donker was de beste methode. Natuurlijk

is er nog onderzoek nodig naar onbekende factoren zoals het celaantal, de levensvatbaar-

heid, de aanwezigheid van de celwand, de verdere groei in een medium enz..

58

5 Discussie

Zeesla in vitro vermeerderen bleek heel moeilijk. Bij de eerste initiatieproeven van weefsel

op agarmedium bleek dat vaste voedingsbodems geen succes waren. Ook in de weinige lite-

ratuur over in vitro wierteelt, wordt er altijd gebruik gemaakt van vloeibare bodems (Las-

caux, 2002; Azanza & Aliaza, 1999). De stukjes zeesla die gebruikt werden, verloren ongeï-

dentificeerd doorzichtig vocht of beschimmelden. De standaardprocedure voor landplanten

met 10% javel zoals beschreven bij Werbrouck (2011) was dodelijk. Maar 1% javel werkte

wel gedeeltelijk. Waarom Ulva lactuca nadien afstierf, was niet duidelijk. Was de javel de

doodsoorzaak of was het de voedingsbodem? Alleszins bleken de leefomstandigheden niet

ideaal. De reactie van zeewier op het cytokinine BA is door de korte levensduur van het

stukje thallus ook niet duidelijk geworden. Beschikt het wier wel over een BA receptor?

Misschien lag de weefselsterfte wel aan de samenstelling van de bodem of aan het ontbreken

van essentiële componenten zoals symbiotische bacteriën (Ecomare, 2013; Wichard &

Oertel, 2010).

Ook andere componenten kunnen de oorzaak zijn. In de experimenten was er gevarieerd

gebruik gemaakt van medium met zout water en medium met zeewater. Alle weefsel ging

toch dood ongeacht het type voedingsbodem. Het is nodig om verder te experimenteren met

verschillende type voedingsbodems. Er zouden nog testen moeten gebeuren met andere me-

dia zoals IMR- of PES medium.

Waar meristematisch weefsel zit of hoe groot het innoculum moet zijn, is ook niet duidelijk.

Hier was de veronderstelling dat de schijfjes van eender welke grootte om het even waar in

het thallus genomen bruikbaar zouden zijn. Want het “midden” zo als vermeld bij Van Der

Sluis (2012) was een vage omschrijving. Dit is ook niet verder onderzocht vermits alle

weefsel stierf na enkele dagen. Met dit onderzoek is ook bewezen dat ProClin en antibiotica

toevoegen de zeesla vermoordt. Nochtans hadden Azanza & Aliaza (1999) een bruikbaar

vloeibaar medium met minieme hoeveelheden antibiotica. Maar zelf met hogere concentra-

ties AB dan in het onderzoek van Azana & Aliaza (1999), was in dit experiment na een tijd

toch alles gecontamineerd. De levensduur werd wel kortstondig verlengd dankzij het ge-

bruik van AB.

Ulva lactuca telen in vloeibare MS bodem met zeewater moet mogelijk zijn, kijk maar bij-

voorbeeld naar de sporenoplossing die maanden overleefde. Volgende problemen zijn nog te

overwinnen: het zeewier steriel maken, een goede zuurstoftoevoer vinden en op een makke-

lijke steriele manier de nodige nutriënten aan vullen. Dit zou eventueel kunnen opgelost

kunnen worden door de teelt in een bioreactor. Ook alternatieve sterilisatiemethoden werden

getest, maar zonder enig succes. Pasteurisatie, Tween, ethanol en gasserilisatie bleken ook

dodelijk. Hier was wel één uitzondering bij namelijk die met de vijf minuten natte gassterili-

satie. Hierbij heeft één van de twee controles het bijna twintig dagen overleefd. Wat hiervan

de oorzaak was, is nog onduidelijk.

59

Het uittesten van de gassterilisatie was eigenlijk bedoeld voor sporen want in het VIB wor-

den sporen van mossen gesteriliseerd met behulp van gassterilisatie. Maar door een tekort

aan sporen is dit niet verder uitgetest. Dit sprak andere literatuur tegen van Tijana et al

(2007) en Jen-Tung & Weickun (2003) die hun mossen steriel kregen op de conventionele

manier door ze enkele ogenblikken in een lage concentratie NaClO te houden. Tijdens het

onderzoek werd geen onderscheid gemaakt tussen de vorming van sporen en de vorming van

gameten. Er bestaat voorlopig geen eenduidige methode om sporen of gameten te vormen.

Na het uittesten van de verschillende methoden beschreven in de literatuur, bleek geen enke-

le methode te lukken. Bij toeval had er één keer gameetvorming plaatsgevonden bij de me-

thode met het regelmatig verversen met koud zeewater gedurende 2 weken. Wel veel later

dan vermeld in deze ongepubliceerde thesis. Het groen verkleurde zeewater bleek na micro-

scopisch onderzoek gameten te bevatten, er waren maar twee flagellen zichtbaar. Waarom

hier gameten gevormd werden is dus nog steeds een raadsel. Vermoedelijk heeft de tempera-

tuurverandering van 15°C naar 0°C en de anaerobe condities in de plaat hier iets mee te ma-

ken. Maar ook de verandering in pH en saliniteit zullen een rol gespeeld hebben.

In de toekomst kunnen er daarom best nog eens test gedaan worden met verschillende com-

binaties van pH en zoutgehalte omdat deze twee parameters haast niet beschreven staan in

de literatuur enkel Mantri et al., (2010) vermelden het zoutgehalte. In dit eindwerk bleek de

pH te stijgen en het zoutgehalte te dalen in de loop van de tijd. Maar er zijn te weinig metin-

gen gedaan om dit besluit te kunnen ondersteunen vermits in de meeste platen te weinig

vloeistof zat om te meten met de NaCl en pH meter Hanna instruments HI 2550.

Het is wel mogelijk, zodra er sporen gevormd zijn, deze steriel te krijgen. In dit onderzoek

werden sporen gesteriliseerd door ze vijf keer te spoelen met steriel zeewater en ze nadien

over te enten. Het is opletten geblazen om niet het foute weefsel op te zuiveren. Om de spo-

ren te laten opgroeien tot steriel gezond weefsel is veel voeding en plaats nodig. Perslucht in

duranflessen met medium blazen, bleek niet de ideale methode te zijn, waarschijnlijk kan dit

best eens in de toekomst uitgeprobeerd worden door een bioreactor op te starten. Volgens

(Ohno & Duy Triet, 1997) zou het maar twintig dagen duren om van vastgehechte zoöspore

om een bladachtige monostomatisch front te cultiveren. In deze proef was er na 50 dagen

nog geen tallus gevormd, vermoedelijk door het telkens terug loskomen van het opgroeiend

weefsel bij hervullen of door het af en toe gedeeltelijk uitdrogen. Na 70 dagen was een on-

geordende klonter weefsel gevormd van ongeveer vijf cm lang en drie cm breed.

60

Een derde methode om steriel weefsel te bekomen was via een protoplastencultuur. De wijze

waarom men van Ulva lactuca weefsel protoplasten kon maken stond mooi beschreven in

verschillende artikels uit de literatuur (Björk et al., 1992; Reddy & Fujita, 1991; Reddy et

al., 2007; Uchida et al., 1992; Uppalopati & Fujita, 2002). De regeneratie in een steriel me-

dium lukte niet door tijdsgebrek. Het moet perfect mogelijk zijn om via protoplasten een

steriel thallus te bekomen in een in vitro conditie. De methode met 0,50mM MES, 1,5%

cellulase, 1,5% abalone, 0,6M maninitol en 1%NaCl in miliQ water was de beste. Er moet

evenwel 24u in het donker zacht schuddend geïncubeerd worden. Deze incubatieduur was

veel langer dan in de vergelijkende literatuur. Dit is vermoedelijk omdat het cellulasepoeder

gebruikt bij deze tests al oud was. Het poeder was nog aanwezig in het labo van vorige ex-

perimenten. Hier kunnen we in tegenstelling tot het artikel van Björk et al. (1992) besluiten

dat ongeacht de tijd dat het zeewier in aquaria had doorgebracht, het toch protoplasten

vormden. Maar ook hier is nog bijkomend onderzoek nodig. De levensvatbaarheid van de

protoplasten kan gecontroleerd worden door toevoeging van een oplossing van FDA aan de

protoplast oplossing (Thielemans, 2005). De aanwezigheid van de celwand kan getest wor-

den door een kleuring met Calcofluor White M2R (Uchida et al., 1992). Ook een telling van

het aantal protoplasten is mogelijk met behulp van een Bürker chamber telling. De regenera-

tie met agarose beats besproken in het artikel van Deryckere, Eeckhaut, Van Huylenbroeck,

& Van Bockstaele (2012) kan ook uitgetest worden. Deze methode staat uitgewerkt in de

bijlage. Het was de bedoeling deze uit te testen indien er meer tijd zou geweest zijn.

Tot slot van de discussie kan gesteld worden dat het in vitro telen van zeesla niet onmogelijk

is, maar dat verder onderzoek nodig is om dit in de praktijk te brengen.

Hier volgen nog de aanbevelingen voor toekomstig onderzoek kort samengevat.

Onderzoek van het vocht na afsterven van het thallusweefsel op vaste voedingsbo-

dem om de mogelijke de doodsoorzaak vaststellen;

Uittesten van de invloed van verschillende plantenhormonen op zeewier;

Uittesten van IMR, PES en andere media;

Onderzoek naar waar het groeipunt of het meristeem van zeesla zich bevindt;

Bij sporulatie onderzoek moet de pH en het zoutgehalte nauwlettender in de gaten

gehouden worden. Dit zou mogelijks wel de oorzaak kunnen zijn van sporulatie;

Opstarten van een bioreactor met een sporenoplossing om hieruit weefsel te kunnen

oogsten;

De regeneratie van protoplasten met het medium beschreven in bijlage A kan nog

bekeken worden.

61

6 Algemeen besluit

Om Ulva lactuca in een in vitro cultuur te krijgen moet er eerst een steriele “plant” verkre-

gen worden.

In dit onderzoek zijn er drie manieren uitgetest om steriel weefsel te krijgen. De eerste ma-

nier was een stuk weefsel rechtstreeks steriliseren, de tweede manier was om sporen of ga-

meten te bekomen en deze steriel te krijgen en een derde manier was om via een protoplast-

cultuur aan een steriel thallus te geraken.

Ulva lactuca weefsel is op zich wel steriel te krijgen, maar overleeft daarna niet lang meer.

Ook de vorming van sporen of gameten ging niet zo vlot. Sporen en/of gameten vorming

gebeurde nu door louter toeval. De geraadpleegde literatuur klopte niet, was onvolledig of

werd hier niet juist uitgevoerd. Het vormen van protoplasten daarentegen vlotte wel, maar

door tijdsgebrek zijn deze proeven niet afgewerkt.

We kunnen besluiten dat Ulva lactuca weefsel zeer fragiel is. Het verdraagt in het algemeen

geen gassterilisatie, noch contaminatie, noch pro clin, noch antibiotica, noch droogte, noch

tween, noch ethanol, noch hoge temperatuur en noch 10% javeloplossing. Tien minuten in

1% javel geeft wel steriel levend weefsel maar dit overleeft geen drie dagen.

We besluiten ook dat bij het vormen van sporen of gameten nog onderzoek nodig is. Waar-

om er maar één keer toevallig sporen gevormd zijn, is onduidelijk. De meeste literatuur is

het er wel over eens dat er eerst stresscondities moeten zijn om sporulatie te induceren. In dit

onderzoek was het gelukt gameten te vormen door koude shock en anaerobe omstandighe-

den na ongeveer een maand incuberen bij 15°C met 8u donker en 16u licht. De toen ge-

vormde gameten zijn dan geïsoleerd door vijf keer te spoelen met steriel zeewater. Deze

steriele zeewater-gameten oplossing werd dan in VLM gegoten. Na groei werd een kleine

hoeveelheid groen weefsel overgeënt naar nieuw VLM waar een volledig steriele cultuur

verkregen werd. Omdat de schudtoestellen te weinig zuurstof boden en de cultuur niet goed

kon groeien werd een deel overgeënt in duranflessen met perslucht. Maar deze opstelling

moet duidelijk nog verbeterd worden. Of er dan effectief een steriel thallus ontstaat, is on-

duidelijk. In dit project leek dit niet te lukken wellicht door tijdsgebrek, of door het vele

overenten. Volgens Ohno & Duy Triet (1997) zou het maar twintig dagen duren om van

vastgehechte zoöspore naar een bladachtige thallus uit te groeien. In deze proef was er na 50

dagen nog geen echt tallus gevormd, dit kwam waarschijnlijk door het telkens terug los ko-

men bij hervullen en door het af en toe gedeeltelijk uitdrogen. Er was een ongedifferentieer-

de en ongestructureerde massa van cellen gevormd na 70 dagen.

62

Het onderzoek naar de vorming van protoplasten ging vlotter. Dankzij de literatuur was er

snel een ideale protoplastvormingsmethode gevonden. Een enzymen oplossing van 1,5%

Fulka cellulase van Aspergillus niger en 1,5% abalonepoeder in een bufferoplossing van

0,50mM MES, 0,6M mannithol en 1% NaCl in miliQ water was de ideale oplossing om de

Ulva lactuca cellen te ontdoen van hun celwand. Het loskomen van de protoplasten gebeur-

de onder zacht schudden (20rpm) in het donker. De protoplasten kwamen pas na 24u los.

Een mogelijke verklaring hiervoor is dat de cellulase enzymen al iets ouder waren. Hier

kunnen we in tegenstelling tot het artikel van Björk et al. (1992) besluiten dat ongeacht de

tijd dat het zeewier in aquaria had doorgebracht, het toch protoplasten vormde. De verder

verwerking van de protoplasten en de regeneratie van steriel weefsel heeft niet kunnen

plaatsvinden door tijdsgebrek. In bijlage staat wel een potentiële methode tot opvolging van

de groei van de protoplasten die in de toekomst kan uitgevoerd worden.

Dit onderzoek is dus lang niet afgerond. Vele parameters zijn ongekend zodat geen alomvat-

tende besluiten getrokken kunnen worden. Zeesla in een in vitro cultuur krijgen moet moge-

lijk zijn, maar er dient nog tijd in het onderzoek gestoken worden. Ook de kennis over de

precieze trigger die leidt tot voortplanting bij Ulva lactuca is beperkt. Het is pas mogelijk

om uit sporen en gameten een volgroeid thallus te bekomen indien we deze mechanismen

beter begrijpen. De methode om steriel weefsel te verkrijgen via protoplasten lijkt het meest

plausibel. Het was relatief makkelijk om protoplasten te vormen. De eerstvolgende opdracht

is nu om deze protoplasten te isoleren in een steriel medium en ze zo te laten regenereren.

63

Referentie lijst

Azanza, R., & Aliaza, T. (1999). In Vitro carpospore release and germination in

Kappaphycus alvaverzii (Doty) Doty from Tawi-Tawi, Philippines. Botanica

Marina. 42, pp. 281-284.

Berkhout, P., Bakker, E., & Bruchem, C. (2010). Vlees, waarom niet?, eds pp. 22-27. Den

Haag: Lei Wagenignen UR.

BioInformatics, E. (2013). soortengroep classificatie. Geraadpleegd op 09 30, 2013, via:

<http://www.soortenbank.nl/soorten.php?soortengroep=duikgids&selected=beschrijv

ing&menuentry=soorten&record=Ulva%20lactuca>

Björk, M., Gómez-Pinchetti, J. L., Reina, G. G., & Pedersén, M. (1992). Protoplast isolation

from Ulva rigida (Chlorophyta). European Journal of Phycology, pp.401-407.

Brandenburg, W. Seaweed, commodities for the future. pouwerpoint presentatie.op 15

februari 2013, Gent, Oostvlaanderen, België: Universiteit Wageningen.

Busink, S., van Dalen, J., & van Dalen, P. (2009). Inventarisatie en beoordeling van

soorten. Zeewieren uit de Zeeuwse Delta [eindwerk]. Hogeschool Zeeland,

Aquatische EcoTechnologie

Clifton, K., & Clifton, L. (1999). The phenelogy of sexual reproduction by green algae

(Bryopsidales) on caribbean coral reefs. J. Phycol, pp.24-34.

Coppejans, E. (1995). Flora van de Noord-Franse en Belgische zeewieren. Leuven:

Nationale plantentuin van België.

Demeulenaere, M. (2013, 17 03).(Phd student VIB). (Gassterilizatie mossporen)

persoonlijke communicatie [interview]. VIB, Gent.

Deryckere, D., Eeckhaut, T., Van Huylenbroeck, J., & Van Bockstaele, E. (2012). Low

melting point agarose beads as a standard method for plantlet regeneration from

protoplasts within the Cichorium genus. Pant cell Rep., pp.2261-2269.

Ecomare. (2013). Zeesla. Geraadpleegd op 11 28, 2013, via ecomare:

<http://www.ecomare.nl/nl/ecomare-encyclopedie/organismen/planten/algen-en-

wieren/groenwieren/zeesla/>

Eichhorn, R., Evert, S., & Raven, P. (2005). Biology of plants. US: W. H. Freeman.

FAO. (2003). Seaweeds used als human food. Geraadpleegd op 11 30, 2013, via FAO:

<http://www.fao.org/docrep/006/y4765e/y4765e0b.htm>

Fischer, G. "World Food and Agriculture to 2030/50: How do climate change and bioenergy

alter the long-term outlook for food, agriculture and resource availability?"

Geprezenteerd op: How to feed the World in 2050. Proceedings of a technical

meeting of experts, Rome, Italy, 24-26 juni 2009

Goudsmit, E. (2013). Use of a cold water treatment to induce sporulation in Ulva lactuca

[Bachelorproef]. Wageningen Universiteit, faculteit plant science.

groenwieren. (2011). Geraadpleegd op 09 30, 2013, via zeewierwijzer:

<http://www.zeewierwijzer.nl>

Guiry, M. D. (2000). Ulva: Sea lettuce. Geraadpleegd op 11 16, 2013, via Seaweed:

<http://www.seaweed.ie/algae/ulva.php>

64

Han, T., Han, Y.-S., Park, C. Y., Jun, Y. S., Kwon, M. J., Kang, S.-H., et al. (2008). Spore

release by green alge Ulva: A quantitative assay to evaluate aquatic toxicants.

Elsevier, pp.699-705.

Hardenberg. (2013, 03). Beschr. 01 afdeling Bacteriophyta t.m. fam. Delesseriaceae.

Geraadpleegd op 11 16, 2013, via Beschrijving afbeeldingen flora op postzegels:

<http://www.floraoppostzegels.nl/index.php/beschrijvingen/20-beschr-01-afdeling-

bacteriophyta-t-m-fam-delesseriaceae>

Huys, H. (2002). In vitro-cultuur van Asimina triloba[Masterproef]. Hogeschool Gent,

Departement toegepaste bio-ingenieurswetenschappen.

INRA sience & impact (2013) in vitro culture methods, geraadpleegd op 12 20, 2013 via

Green biotechnologies: <http://www.inra.fr/en/Scientists- Students

/Biotechnologies/All-reports/green-biotechnologies/In-vitro-culture-methods>

Keizer, G. (2013). zeesla (Ulva lactuca). Geraadpleegd op 11 14, 2013, via Soortenbank:

<http://www.soortenbank.nl/soorten.php?soortengroep=duikgids&id=339>

Knee, M. (2008, 9 12). Algae. Geraadpleegd op 10 6, 2013 via Hort & crop science:

<http://hcs.osu.edu/hcs300/algae.htm>

laboratories, P. t. (2011). Cellulase onozuka R-10. Geraadpleegd op 11 17, 2013, via Phyto

technology laboratories: <http://www.phytotechlab.com/detail.aspx?ID=193>

Lascaux, B. (2002). Établissement et entretien de cultures in vitro awéniques de plantes

"inférieures" aquatiques. Biotechnologies végétales. Parijs, Frankrijk: Université

Paris-Sud.

Mantri, V. A., Singh, R. P., Bijo, A. J., Kumari, P., Reddy, C., & Jha, B. (2010). Differential

response of varying salinity and temperature on zoospore induction, regeneration and

daily growth rate in Ulva fasciata (Chlorophyta, Uvales). Springer science +

Business Media, pp.243-250.

NCDO (2011), Bevolkingsgroei en de gevolgen ervan. Factsheet 2011. NCDO, Amsterdam,

Nederland

Niesenbaum, R. A. (1988, maart 10). The ecology of sporulation by the macroalga Ulva

lactuca L. (chlorophyceae). Aquatic Botany, pp. 155-166.

Oertel, T. W. (2010). Gametogenesis and gamete release of ulva mutabilis and ulva lactuca

(chlorophyta): Regulatory effects and chemical characterization of the "swarming

inhibitor". Phycological Society of America, 46, pp.248-259.

Ohno, M., & Duy Triet, V. (1997). Artifecial seeding of the green seaweed Monostroma for

cultivation. Journal of applied Phycology, 417-423.

Ponette, Q., & Bertin, P. (sd). Les plantes (1 de 2). Geraadpleegd op 10 6, 2013, via

Formation en biologie végétale: <http://www.afd-

ld.org/~fdp_bio/content.php?page=cara_plantes&skin=modi>

Reddy, C., & Fujita, Y. (1991). Regeneration of plantlets from Enteromorpha (Ulvales,

Chlorophyta) protoplasts in axenic culture. Journal of applied phycology, pp.265-

275.

Reddy, C., Gupta, M. K., Mantri, V. A., & Jha, B. (2007). Seaweed protoplasts: status,

biotechnological perspectives and needs. Springer Science + Business Media, 619-

632.

65

Ruiter, D. (2013, 14 augustus) (Manager Wageningen Light Microscopy Center (WLMC)

WUR, Lab. of Cell Biology). Visuele kenmerken sporulatie[interview]. Wageningen

Universiteit, Wageningen.

Sperber, B. (2010). Ulva biochemical composition. Wageningen: AFSG Wageningen

Universiteit.

Supelco. (2013). ProClin® 150 Preservative for Diagnostic Reagents. Geraadpleegd op 11

04, 2013, via ProClin® 150 Preservative for Diagnostic Reagents:

<https://www.sigmaaldrich.com/Graphics/Supelco/objects/4800/4758.pdf>

Thielemans, F. (2005). Asymetrische protoplastenfusie bij Araceae [Masterproef].

Hogeschool Gent, departement industrieel ingenieur tuinbouw.

Tormo Molina, R. (2012, 12 3). Uvales. Opgeroepen op 10 6, 2013, van Plantas y Hongos:

<http://www.plantasyhongos.es/algas/Ulvales.htm>

Uchida, A., Yoshikawa, T., Ishida, Y., & Saga, N. (1992). Stable protoplast isolation and its

regeneration into thallus of the marine graan alga Ulva persuta. Nippon Suisan

Gakkaishi, pp.153-157.

UN (2013) World Population Prospects: The 2012 Revision, Key Findings and Advance

Tables. Working Paper No. ESA/P/WP.227. Department of Economic and Social

Affairs, Population Division, New York, USA.

Uppalopati, S. R., & Fujita, y. (2002). A simple method for mass isolation of protoplasts

from species of Monostroma, Enteromorpha and Ulva (Chlorophyta,Ulvales).

Journal of Applied Phycology, pp.165-168.

Van Der Sluis, J. (2012). Growth analysis of Ulva lactuca[Bachelorproef]. Wageningen

Universiteit, Departement Organismal an Developmental biology.

Van Ginneken, V., Verdegem, M., Waller, U., Blisseling, T., Wald, J., Helsper, J., et al.

(2013). [nog niet gepubliceerde publicatie]. Ulva lactuca, applications of an

opportunistic macro-algae species for modern mariculture. Wageningen, Nederland:

Wageningen universiteit.

Van Labeke, M.C. (2013). Groei- en ontwikkelingsbeheersing bij planten.[syllabus]. Gent:

Universiteit Gent.

Verkerk, G., Broens, JB., Bouwens, R.E.A., de Groot, P.A.M., Kranendonk, W., Vogelzang.

M.J., Westra, J., Wevers-Prijs, I.M,(2004) Binas, Informatieboek voor natuurweten

schappen en wiskunde., vijfde druk, Groningen: Wolters- Noordhoff.

Wald, J.(research assistent seaweed cultivation) [Thesis bespreking]. op 10 oktober 2013.

UGent, Gent.

Werbrouck. (2012). Grondloze teelten en hydroteelt[syllabus]. Gent: Hogeschool Gent.

Werbrouck, S. (2013, 17 oktober) (Hoofd plantentechnologie labo). Persoonlijke

communicatie [interview] op 17 oktober 2013. Universiteit Gent, Gent.

Werbrouck, S. (2011). Plantenweefselteelt[syllabus]. Hogeschool Gent, Departement

toegepaste bio-ingenieruswetenschappen.

Wichard, T., & Oertel, W. (2010). Gametogenesis and gamete release of ulva mutabilis and

ulva lactuca (chlorophyta): Regulatory effects and chemical characterization of the

"swarming inhibitor". Phycological Society of America, 46, pp.248-259.

Wolkers, H. (20011). Boeren op zee. Wagenignenworld, pp.16-17.

i

Bijlage

De regeneratie van protoplasten:

Materiaal:

Protoplast medium (PM)

Protoplast medium A (voor 1l):

2,2g MS

0,4molair (osmotische waarde):

o 0,3M mannose = 36g

o 0,1M sucrose = 34g

1% NaCl = 10g

Protoplast medium B (voor 1l)

Zie protoplast medium A maar dan met 10g low melting point (LMP) agarose.

Steriel zeewater

Steriele petriplaten

Steriele pipetten

Laminaera airflow

Steriele eppendors

Seriele nylon filters

centrifuge

Methode:

De protoplastoplossing die al in steriel zeewater gemaakt is, na het regelmatig steriel afspoe-

len van het thallus gebruikt voor protoplast vorming wordt door de nylonfilter gefiltreerd en

nadien gecentrifugeerd. Het supernatans wordt dan verwijderd en de pellet wordt geresus-

pendeerd in medium A. Hierna worden de eppedorfjes terug gecentrifugeerd. Deze hersus-

pendatiestap worden een aantal keer herhaald. (bijvoorbeeld 5 keer). Maak best een controle

dubbel zo dat er op contaminatie kan gecontroleerd worden onder de microscoop voor het

mengen met het low-meltingpoint medium. Voeg bij de protopasten 1ml medium A en 1ml

medium B (op 36°C) Verdeer deze in druppels over de plaat en voeg de gewenste hoeveel-

heid medium A aan de plaat toe nadat de agardruppels gestold zijn. Plaats het geheel op een

schudtoestel voor zuurstoftoevoer.

Opstelling:

A

A+B

In vitro vermeerdering van Ulva lactuca - lib.ugent.be · Abstract Voedsel en energie zullen...

Documents

Transcript of In vitro vermeerdering van Ulva lactuca - lib.ugent.be · Abstract Voedsel en energie zullen...