Immunoprecipitatie

• Immuno geeft aan dat je antilichamen gebruikt

• Wat is een antilichaam? Eiwit dat in een dier wordt geproduceerd als reactie op antigeen (een lichaamsvreemde stof, bv. een eiwit)

Variabele deelbindt specifiek aan antigeen(Fab domein)

Constante gedeelte(Fc domein)

Hoe wordt een antilichaam gemaakt?

• Dier (konijn, muis, kip) produceert antilichamen als reactie op inbrengen antigeen

• Antilichaam materiaal verzamelen (bloed, eieren) - bevat antilichamen tegen veel verschillende antigenen!!!

• Zuiveren antilichamen uit dit materiaal (slechts een bepaald percentage van de antilichamen bindt aan specifiek antigeen)

Immunoprecipitatie

• Techniek om eiwitcomplexen te identificeren

- hierdoor wordt duidelijker welke functie deze eiwitten hebben

• Een antilichaam herkent een van de eiwitten- vaak wordt een fusie eiwit gemaakt, bijv. met GFP

Eiwit 2Eiwit 1

GFP

Eiwit 3

anti-GFP

Voorbeeld immunoprecipitatie(uit onderzoeksgroep van Dolf Weijers)

Lokalisatieeiwit1-GFP

in vaatweefselplantenwortel

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

wild-typewortel

wortelzondereiwit 1

(mutant)

wortelzondereiwit 2

(mutant)

abnormaalvaatweefsel

Eiwitcomplex geeft informatie over de functie van het eiwit

Hoe voer je een immunoprecipitatie uit?

• weefsel met eiwit-GFP malen

• anti-GFP toevoegen aan cel extract

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

Binden aan Protein A agarose

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

agarosebolletje

Eiwit 1GFP

Eiwit 2

Eiwit 1GFP

Eiwit 2Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

agarosebolletje

Protein A

Precipitatie eiwitcomplex door centrifugeren

vloeistof afpipetteren

bolletjes wassen

Eiwitcomplex denatureren en op gel laden

Eiwitbandjes scheiden door electroforese, kleuren en uitsnijden

Hoe voer je een immunoprecipitatie uit?

SDS-polyacrylamide gelelectroforese

Proteomics: identificatie van de eiwitten

Voorbehandeling met iodoacetaatom de vrije SH groepen (cysteines) van de eiwitten te blokkeren door carboxymethylering

Proteolyse

Eiwit in stukjes knippen met trypsine tot korte peptides

Voorbehandeling geëxtraheerde peptiden

De geëxtraheerde peptiden worden ontzout en gemengd met matrix oplossing.

Dit mengsel wordt op een plaatje gebracht en verdampt zodat er kristallen van het matrixmateriaal en peptiden overblijven.

Na bestraling door een laser en ionisatie (MALDI) worden de peptiden geanalyseerd met TOF mass spectrometrie.

MALDI-TOF spectrometer

De massa van een polypeptide keten kan bepaald worden met de MALDI-TOF techniek.

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight

Identificatie van eiwitcomplex

Massaspectrum tryptisch digest

Massa en lading van elk peptide worden geregistreerd

Identificatie van de eiwitten

Voorwaarden voor succesvolle IP

Meer dan 1% van de IgG moleculen moet reageren met GFP

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

Eiwit 1

GFP

Eiwit 2

• Testen van kwaliteit antilichaampreparaat Meer dan 1% van de IgG moleculen moet reageren met GFP

• Immunoprecipitatie en isolatie peptides

• Identificatie peptide(s) en

• Toekenning eiwitcomplex

Uitvoering experiment