Fibrochondrocyt aggregaten: effect van lage zuurstofspanning...

Fibrochondrocyt aggregaten: effect van

lage zuurstofspanning en TGF-β

Charlot PHILIPS

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Maria Cornelissen

Begeleider: Elke Berneel

Vakgroep: Medische Basiswetenschappen

Academiejaar 2013-2014

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk

ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder

met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het

aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum Charlot Philips Prof. Dr. Maria Cornelissen

Voorwoord

Doorheen het voorbije jaar zijn verschillende mensen betrokken geweest bij het tot stand

komen van deze masterproef. Zonder hen was het niet mogelijk geweest deze opdracht tot een

goed einde te brengen. Via deze weg wil ik hen dan ook bedanken voor hun bijdrage.

Als eerste zou ik graag Prof. Dr. Maria Cornelissen bedanken die mij de mogelijkheid gaf om

in haar labo vertrouwd te geraken met het wetenschappelijk onderzoek. Ook voor het nalezen

van mijn masterproef ben ik haar zeer dankbaar.

Als tweede gaat mijn dank uit naar Elke Berneel die mij het volledige jaar heeft begeleid.

Bedankt om mij mee te laten werken aan dit interessante onderzoek en kennis te laten maken

met heel wat verschillende technieken. Ook de vele verbeteringen die je aan mijn masterproef

hebt aangebracht, heb ik enorm geapprecieerd.

Daarnaast wil ik ook Leen Pieters bedanken om haar uitgebreide histologische kennis met mij

te delen. Bedankt om altijd beschikbaar te zijn voor vragen en te helpen met kleuringen indien

nodig.

Ook bedankt aan Johanna en Greet om mij op weg te helpen in de steriele kamer en in het

moleculair labo.

Dikke merci ook aan Annelies die altijd klaar stond met tips en tricks en in het bijzonder

ervoor gezorgd heeft dat de GAG bepaling succesvol kon uitgevoerd worden.

Verder wil ik ook Sebastian, Annelot, Julie, Elien, Pamela, Karolien, Toke, Heidi en Sylvia

bedanken voor de aangename sfeer in het labo en de leuke middagpauzes.

Mijn laatste woord van dank gaat uit naar mijn ouders, vrienden en familie die mij altijd zijn

blijven steunen. In het bijzonder wil ik ook mijn vriend Jonas bedanken, die er altijd stond op

de drukke momenten en onvoorwaardelijk in mij geloofde gedurende dit ganse jaar.

Charlot

Inhoudsopgave

Afkortingenlijst .......................................................................................................................

Samenvatting ..........................................................................................................................1

Summary ................................................................................................................................2

1 Inleiding ..........................................................................................................................3

1.1 De meniscus .............................................................................................................3

1.1.1 Anatomie...........................................................................................................3

1.1.2 Histologie ..........................................................................................................3

1.1.3 Biomechanische eigenschappen .........................................................................4

1.2 Huidige behandelingen voor meniscusletsels ............................................................5

1.2.1 Meniscus allogreffe ...........................................................................................6

1.2.2 Synthetische implantaten ...................................................................................7

1.3 Tissue engineering van fibrocartilago .......................................................................8

1.3.1 Cellen voor meniscus tissue engineering............................................................9

1.3.2 Biochemische en mechanische stimuli ............................................................. 10

1.3.3 Scaffolds ......................................................................................................... 11

1.3.4 Top-down versus bottom-up tissue engineering ............................................... 13

1.4 Doel van de masterproef ......................................................................................... 14

2 Materiaal en methoden .................................................................................................. 15

2.1 Isolatie meniscus en fibrochondrocyten .................................................................. 15

2.2 Monolayer expansie ............................................................................................... 15

2.3 Micro-aggregaten ................................................................................................... 16

2.3.1 Vorming .......................................................................................................... 16

2.3.2 Cultuuromstandigheden ................................................................................... 16

2.4 Evaluatie ................................................................................................................ 17

2.4.1 Viabiliteitstest ................................................................................................. 18

2.4.2 Biochemische analyse ..................................................................................... 18

2.4.3 Histologische analyse ...................................................................................... 19

2.4.4 Genexpressie ................................................................................................... 22

2.5 Inkapselen van micro-aggregaten............................................................................ 24

2.6 Statistische analyse ................................................................................................. 25

3 Resultaten...................................................................................................................... 26

3.1 Monolayer expansie ............................................................................................... 26

3.1.1 Cel morfologie ................................................................................................ 26

3.1.2 Gen expressie profiel van primaire en gesplitste fibrochondrocyten ................. 26

3.2 Fibrochondrocyten gecultiveerd in microchips........................................................ 27

3.2.1 Morfologische evolutie micro-aggregaten ........................................................ 27

3.2.2 Viabiliteit ........................................................................................................ 30

3.2.3 Gen expressie profiel ....................................................................................... 32

3.2.4 Immunohistochemie en histochemie ................................................................ 32

3.2.5 GAG/DNA bepaling ........................................................................................ 37

3.3 Micro-aggregaten ingekapseld in een collageen I hydrogel ..................................... 37

3.3.1 Morfologische evolutie .................................................................................... 37

3.3.2 Viabiliteit ........................................................................................................ 38

3.3.3 Gen expressie profiel ....................................................................................... 39

4 Discussie ....................................................................................................................... 40

4.1 Monolayer expansie van fibrochondrocyten ............................................................ 40

4.2 Fibrochondrocyten gecultiveerd in microchips........................................................ 40

4.3 Micro-aggregaten ingekapseld in een collageen I hydrogel ..................................... 44

5 Conclusie ...................................................................................................................... 45

6 Referenties .................................................................................................................... 46

7 Addendum ....................................................................................................................... I

Bijlage I: Samenstelling Ringer .......................................................................................... I

Bijlage II: Samenstelling FC medium ................................................................................. I

Bijlage III: Protocol Maken van microchips ........................................................................ I

Bijlage IV: Samenstelling PBS .......................................................................................... II

Bijlage V: Samenstelling neutraal gebufferde formol ......................................................... II

Afkortingenlijst

ADSCs Adipose-derived stem cells

bFGF basic Fibroblast Growth Factor

BMPs Bone Morphogenetic Proteins

BMSCs Bone marrow-derived stem cells

BSA Bovine Serum Albumine

CaPI kleuring Calceïne-AM Propidiumiodide kleuring

CMI Collagen Meniscus Implant

CTGF Connective Tissue Growth Factor

DAB 3,3'-diaminobenzidine

DMEM/F12 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12

ECM Extracellulaire matrix

FC medium Fibrochondrocyten medium

FGF2 Fibroblast Growth Factor 2

FKS Foetaal kalf serum

GAGs Glycosaminoglycanen

HIF-1α Hypoxia Inducible Factor 1α

IGF-I Insuline-like Growth Factor I

ITS Insuline-transferrine-selenium

NGF Neutraal gebufferde formol

NRS Normal Rabbit Serum

P1 Passage 1

P/S antibioticum Penicilline/streptomycine antibioticum

PBS Phosphate buffered saline

PCL Polycaprolacton

PDGF Platelet Derived Growth Factor

PG Proteoglycanen

PLGA Poly(lactide-co-glycolide)

RAM Rabbit anti-mouse

RPM Roads per minute

TGF-β1 Transforming Growth Factor β1

1

Samenvatting

De meniscus is een onmisbare structuur tussen de femur en de tibia die zorgt voor stabiliteit

van het kniegewricht en het opvangen en herverdelen van verschillende krachten. Aangezien

letsels aan de meniscus vrij frequent zijn, is het van belang om deze op een adequate manier

te kunnen behandelen. De huidige behandelingen, meniscectomie en transplantatie van een

allogreffe, zijn nog niet optimaal waardoor op termijn problemen zoals osteoartritis kunnen

ontstaan. De laatste decennia is er een groeiende interesse in de mogelijkheid van tissue

engineering waarbij op basis van cellen, scaffolds en groeifactoren nieuwe constructen

gevormd worden die de defecten kunnen opvullen.

In deze masterproef werden fibrochondrocyten eerst in monolayer geëxpandeerd en werden

vervolgens aan de hand van agarose microchips micro-aggregaten gevormd. Er werden vier

verschillende cultuurcondities uitgetest, namelijk een medium met of zonder TGF-β1 en lage

of hoge zuurstofspanning. Op dag 4, 14 en 21 werden de micro-aggregaten geëvalueerd via

een viabiliteitstest, RT-qPCR, histologische analyse en GAG/DNA bepaling. In een tweede

luik werden micro-aggregaten na vier dagen ingekapseld in een collageen I hydrogel en in een

chondrogeen medium bij 5% O2 in cultuur gehouden. Opnieuw werd op dag 7, 14 en 21 een

viabiliteitstest uitgevoerd, alsook evaluatie aan de hand van RT-qPCR.

Analyse met behulp van RT-qPCR toonde aan dat de expressie van collageen I, collageen II,

aggrecan en Sox-9 verhoogd was in de micro-aggregaten gecultiveerd in aanwezigheid van

TGF-β1. Dit werd bevestigd door een verhoogde GAG productie, alsook door een

toenemende intensiteit bij de immunohistochemische kleuringen. Deze effecten werden nog

versterkt door een lage zuurstofspanning. Ook de micro-aggregaten die ingekapseld werden in

een hydrogel vertoonden een verhoogde expressie van collageen II, aggrecan en Sox-9.

Uit dit onderzoek kunnen we besluiten dat de high throughput vorming van uniforme micro-

aggregaten mogelijkheden biedt voor redifferentiatie van fibrochondrocyten. Toevoegen van

TGF-β1 aan het medium en een lage zuurstofspanning blijken positief te zijn om stabiele

micro-aggregaten met een correct fenotype te bekomen. De micro-aggregaten konden hun

functionaliteit behouden wanneer ze ingekapseld werden in een hydrogel. Dit resultaat opent

perspectieven om in de toekomst grotere constructen te vormen door middel van bioplotting.

2

Summary

The meniscus is an important structure in the knee joint and is frequently injured in elderly as

well as in younger people. Due to the lack of regenerative capacity, lesions of the meniscus

can’t heal themselves, possibly leading to osteoarthritis in the long term. Recent studies are

focusing on the area of tissue engineering to meet the demand of new treatment strategies. In

this research, micro-aggregates of fibrochondrocytes were formed and cultured under four

different conditions for 21 days. RT-qPCR, histology and GAG/DNA assay were used to

determine the role of TGF-β1 and low oxygen tension on the redifferentiation capacity of

fibrochondrocytes. Micro-aggregates were also encapsulated in a hydrogel and evaluated

through RT-qPCR. In general, micro-aggregates cultured under hypoxia and in chondrogenic

medium showed the highest increase in gene expression of collagen I, collagen II, aggrecan

and Sox-9. They also produced more GAGs compared to micro-aggregates cultured under

normoxia. These results were supported by the immunohistochemical staining. Micro-

aggregates encapsulated in a hydrogel showed similar results, expressing higher levels of

collagen II, aggrecan and Sox-9 and producing more GAGs over time. Taken together, these

results show evidence for the use of high throughput micro-aggregates in redifferentiation

studies of fibrochondrocytes. They are also suitable for the use in 3D environments, offering

possibilities to create larger constructs in the future by bioplotting.

3

1 Inleiding

1.1 De meniscus

1.1.1 Anatomie

Het kniegewricht vormt met zijn complexe structuur de overgang tussen de femur en de tibia.

Een zeer belangrijk onderdeel van dit gewricht is de meniscus die zorgt voor een

contactoppervlak tussen beide botstructuren (Figuur 1). Zonder de meniscus zou er door de

incongruentie van de condylus van de femur en het tibiaplateau heel wat wrijving ontstaan.

De wrijvingen worden opgevangen door zowel de mediale als laterale component van de

meniscus. Beide componenten hebben een halvemaanvormige structuur en worden

ondersteund door verschillende ligamenten, met als voornaamste het mediale en laterale

collaterale ligament, de voorste en achterste kruisband en het transvers ligament (Figuur 1) [1].

Figuur 1: Anatomie van het kniegewricht [1]

1.1.2 Histologie

In de meniscus kunnen op basis van histologie 3 verschillende celtypes onderscheiden worden,

verspreid over verschillende zones (Figuur 2) [1-3]. Allereerst is er de perifere zone waar in

beperkte mate bloedvaten en zenuwen worden teruggevonden. De cellen in deze zone noemt

men fibroblastachtige cellen. Net zoals fibroblasten synthetiseren ze collageen type I, maar

door hun ovale vorm onderscheiden ze zich van de meer uitgestrekte fibroblasten [1]. Na een

4

overgangszone met daarin een mengeling van celtypes, kan men in het binnenste deel van de

meniscus fibrochondrocyten vinden. Deze cellen hebben een ronde vorm en worden omgeven

door een extracellulaire matrix (ECM) die zowel uit collageen type I als collageen type II

bestaat [1]. Over de exacte verhouding van beide types collageen bestaat er niet veel data,

maar volgens Cheung et al. zou er 60% collageen II aanwezig zijn tegenover 40% collageen I

[4]. Als laatste zijn er ook nog de spoelvormige cellen van de superficiële zone die zich

verspreid over het oppervlak bevinden. De rol van deze cellen is nog niet helemaal duidelijk,

maar mogelijks zijn dit progenitor cellen die van belang kunnen zijn bij regeneratie van de

meniscus [1].

Figuur 2: Overzicht verschillende celtypes in de meniscus [1]

1.1.3 Biomechanische eigenschappen

Dankzij zijn unieke opbouw zorgt de meniscus voor het opvangen en herverdelen van

verschillende krachten zoals wrijving, spanning en druk, alsook voor de stabiliteit van het

kniegewricht en de soepele werking ervan [1, 5]. De weerstand tegen spanningskrachten

wordt voornamelijk bepaald door de oriëntatie van de collageenvezels. De vezels zijn

hoofdzakelijk circumferentieel georiënteerd, waardoor ze spanningen tot 110 MPa aankunnen

[6]. Daarnaast zijn ook een aantal vezels radiaal georiënteerd die ervoor zorgen dat de

circumferentieel geordende collageenvezels samengehouden worden. Het opvangen van

schokken wordt dan weer bepaald door de aanwezigheid van proteoglycanen zoals aggrecan.

Deze moleculen zijn in staat om grote hoeveelheden water te absorberen waardoor een

hydrostatische druk ontstaat die bestand is tegen zware belasting [6].

5

1.2 Huidige behandelingen voor meniscusletsels

Doordat de meniscus onderhevig is aan heel wat druk en spanning zorgt dit ervoor dat

frequent letsels kunnen optreden. In de Verenigde Staten krijgen maar liefst 66 mensen per

100 000 inwoners te maken met enige vorm van schade aan de meniscus [1]. Ook in het

Verenigd Koninkrijk blijkt een gescheurde meniscus de meest frequente oorzaak van letsels

van zacht weefsel te zijn met een incidentie van 23.8 per 100 000 per jaar [7]. Bij oudere

patiënten gaat het vooral om slijtage die doorheen de jaren opgebouwd wordt. Jongeren

daarentegen zullen eerder letsels oplopen door een verkeerde beweging tijdens het sporten.

De behandeling van meniscusletsels hangt voornamelijk af van de locatie en omvang van de

scheur. Wanneer de scheur zich in de perifere, vasculaire zone bevindt, kan men opteren om

deze vanzelf te laten regenereren of door middel van hechtingen het herstel te bevorderen [1,

8]. In de avasculaire zone is herstel van een scheur echter heel wat complexer en veel minder

succesvol. Tot op heden blijft de meest courante behandeling partiële meniscectomie waarbij

het beschadigde deel van de meniscus wordt weggenomen [1].

Door het wegnemen van een deel van de meniscus kunnen op langere termijn diverse

problemen ontstaan. Het opvangen van schokken en de weerstand tegen druk en spanning zal

minder efficiënt verlopen, alsook kunnen er plaatsen ontstaan waar het onderliggend

kraakbeen niet meer beschermd is met osteoartritis tot gevolg [9-11]. Om deze problemen te

vermijden is men op zoek naar behandelingen die ervoor zorgen dat het defect opgevuld

wordt met nieuw weefsel, al dan niet van de patiënt, om zo de meniscus in zijn functie te

herstellen.

De laatste decennia werden een drietal strategieën uitvoerig bestudeerd, meer bepaald het

transplanteren van een meniscus allogreffe, het gebruik van synthetische implantaten en de

mogelijkheid van tissue engineering. Ondanks de vooruitgang die werd geboekt, is er nog

steeds geen ideale oplossing en blijft herstel van de meniscus een uitdaging voor de medische

wereld.

6

1.2.1 Meniscus allogreffe

Wanneer de mediale of laterale component van de meniscus op zijn geheel moet worden

weggenomen of onherstelbaar beschadigd is, kan men een allogreffe transplanteren. Deze

greffes zorgen voor verlichting van de pijn, voorkomen degeneratie van het kraakbeen en

verbeteren de mechanische eigenschappen van het kniegewricht [12, 13]. In eerste instantie

zijn de greffes acellulair, maar in de loop van de tijd treedt kolonisatie op door gastheercellen

wellicht afkomstig van het synovium en het gewrichtskapsel (Figuur 3) [12].

Figuur 3: Kolonisatie van meniscus greffes (*) door gastheercellen, wellicht afkomstig van het synovium

en het gewrichtskapsel (**) [12]

De eerste transplantaties werden uitgevoerd door Wirth et al. in een studie van 23 patiënten in

1984 [14]. Uit dit onderzoek bleek dat diepgevroren greffes betere resultaten opleverden dan

gevriesdroogde greffes. In de huidige praktijk bestaan er verschillende methoden voor de

verwerking, sterilisatie en bewaring van meniscus greffes. Zo kan men kiezen voor het

gebruik van viabele greffes, gecryopreserveerde greffes of versgevroren greffes [13]. Door de

positieve resultaten in de meerderheid van de patiënten, is de transplantatie van allogreffes de

standaard behandeling geworden na een totale meniscectomie, zeker bij jonge mensen [6].

Een groot nadeel van deze techniek is echter dat ze niet geschikt is voor het vervangen van

een gedeelte van de meniscus zoals nodig is na een partiële meniscectomie. Daarnaast is ook

het aantal donoren beperkt, is er een risico op overdracht van infectieuze ziekten, bestaat er

een zekere incongruentie tussen donor en acceptor en blijft de kans op afstoting reëel [15].

7

1.2.2 Synthetische implantaten

Een tweede mogelijkheid om de meniscus in zijn functie te herstellen is het gebruik van

synthetische implantaten. Deze hebben het grote voordeel dat men niet meer afhankelijk is

van donoren zoals bij de meniscus allograft. De implantaten kunnen op grote schaal en met

een hoge reproduceerbaarheid vervaardigd worden waardoor deze onmiddellijk beschikbaar

zijn. Tot op heden zijn er twee types commercieel beschikbaar, namelijk de collagen meniscus

implant (CMI®) en een poreuze polyurethaan scaffold (Actifit™) [16, 17].

1.2.2.1 Collagen meniscus implant (CMI®)

Stone et al. slaagden er in een implantaat te construeren op basis van collageen type I vezels

van runderen gecombineerd met hyaluronzuur en chondroïtine sulfaat (Figuur 4) [18]. Na heel

wat in vitro en in vivo studies bij dieren werd aangetoond dat het implantaat niet toxisch is en

de ingroei van fibrochondrocyten met de vorming van ECM gestimuleerd kan worden [19,

20].

Vervolgens werd een eerste klinische trial uitgevoerd om de resultaten te bevestigen in de

mens [18]. Uit deze kleinschalige studie bleek dat het implantaat ook veilig is voor humaan

gebruik en opnieuw leidt tot vorming van nieuw weefsel. Uiteindelijk volgde dan een

grootschalige studie waarbij de CMI® vergeleken werd met partiële meniscectomie [16]. De

auteurs concludeerden dat patiënten die leden aan een chronisch letsel van de meniscus een

duidelijk voordeel ondervonden van de CMI®, terwijl er in het geval van acute letsels geen

verbetering kon waargenomen worden. Deze conclusie wordt echter betwist aangezien ze

gebaseerd is op de positieve uitkomst van slechts één test waarvan de klinische relevantie in

vraag gesteld wordt [21]. Daarnaast worden ook nog andere negatieve aspecten van de CMI®

aangehaald door Verdonk et al. [22]. Zo is de CMI® afkomstig van dierlijk materiaal,

Figuur 4: Collagen meniscus implant [16]

Links: macroscopisch overzicht. Rechts: scanning elektronen microscopie van dwarsdoorsnede

8

waardoor er een kans op infectie bestaat. Verder blijkt ook dat de scaffold in grootte afneemt

wanneer deze aan natte omstandigheden blootgesteld wordt, wat nefast kan zijn voor de

implantatie.

1.2.2.2 Polyurethaan scaffold (Actifit™)

Meer recent werd een polyurethaan scaffold ontworpen die tracht de tekortkomingen van de

CMI® te verbeteren. De preklinische studies in honden leverden al meteen veelbelovende

resultaten op. Zo bleek er een snelle infiltratie op te treden van fibrovasculair weefsel met

vorming van een ECM rijk aan collageen I en werd ook amper een immunologische reactie

vastgesteld. De duur van de studie was echter te kort om het beschermende effect op

kraakbeen aan te tonen [23].

Verdere klinische studies bevestigden de ingroei van nieuw weefsel en toonden duidelijke

voordelen voor de behandelde patiënten aan, met name een vermindering van de pijn en een

verbetering van de functie van het kniegewricht [17, 22]. In de studie werd echter geen

controlegroep opgenomen, waardoor de meerwaarde ten opzichte van patiënten die enkel een

partiële meniscectomie ondergingen niet bepaald kan worden [21]. Daarnaast is het ook

afwachten of de resultaten bevestigd worden op lange termijn en moet men nagaan of de

degradatietijd van de scaffold voldoet aan de vereisten.

1.3 Tissue engineering van fibrocartilago

De mens heeft altijd al een interesse gehad in het verlies van weefsel en het zoeken naar

oplossingen hiervoor. Sinds eind jaren ’80 wordt het onderzoeksdomein dat zich met deze

vragen bezighoudt aangeduid als ‘tissue engineering’ en werd het als volgt gedefinieerd:

“ ‘Tissue Engineering’ is the application of principles and methods of engineering and life

sciences toward fundamental understanding of structure-function relationships in normal and

pathological mammalian tissues and the development of biological substitutes to restore,

maintain, or improve tissue function.” [24]

Tissue engineering is dus een interdisciplinair domein waarbij de kennis uit onder andere de

biologie en de ingenieurswetenschappen gecombineerd wordt om zo de structurele en

biomechanische eigenschappen van een bepaald weefsel in vitro te kunnen nabootsen.

9

In de orthopedie is men door de hoge incidentie aan meniscusletsels en het gebrek aan

donormateriaal ook tissue engineering als een optie gaan beschouwen naast de reeds

bestaande methoden van meniscectomie en allografts. Om tot een in vitro construct te komen

dat in staat is om het defect in de meniscus te vervangen, moet gezocht worden naar de juiste

combinatie van scaffolds, cellen en groeifactoren [1, 25, 26]. Daarnaast kunnen ook

biochemische en mechanische stimuli een belangrijke rol spelen [1, 25].

1.3.1 Cellen voor meniscus tissue engineering

Bij de keuze voor een bepaald celtype moeten een aantal afwegingen gemaakt worden. Zo

moet rekening gehouden worden met de beschikbaarheid van de cellen, hoe gemakkelijk de

cellen geïsoleerd kunnen worden, hun mogelijkheid om het gewenste fenotype te expresseren

en het gemak waarmee ze in cultuur geëxpandeerd kunnen worden.

1.3.1.1 Autologe fibrochondrocyten

Voor de zoektocht naar de perfecte replica van de natieve meniscus zijn fibrochondrocyten

afkomstig van de patiënt zelf de meest voor de hand liggende celbron. Deze cellen

synthetiseren reeds een ECM rijk aan collageen I en collageen II die ook voldoet aan de

biomechanische vereisten. Het gebruik van autoloog materiaal brengt echter ook een aantal

nadelen met zich mee. Zo is er voor de isolatie van fibrochondrocyten een voorafgaande

chirurgische ingreep vereist en kan deze procedure leiden tot morbiditeit op de plaats van

donatie [1, 25]. Daarnaast is de kwaliteit van de cellen soms niet meer optimaal door

eventuele traumata, ziekte of degeneratie van de meniscus [1, 25, 26].

Vaak zullen via een biopsie ook niet voldoende cellen voor tissue engineering geïsoleerd

kunnen worden, waardoor expansie van de fibrochondrocyten via monolayer cultuur

noodzakelijk is. In de praktijk leidt dit echter, zoals bij chondrocyten, tot dedifferentiatie

waarbij de expressie van collageen II sterk neergereguleerd wordt en er een toename is van

collageen I [27, 28]. Verschillende pogingen werden reeds ondernomen om

fibrochondrocyten in cultuur te redifferentiëren. Door modificaties aan te brengen aan het

oppervlak waarop de cellen expanderen, kan de genexpressie beïnvloed worden. Zo leidden

een collageen I en aggrecan coating tot neerregulatie van collageen I en opregulatie van

cartilage oligomeric matrix protein (COMP) [27]. Een andere onderzoeksgroep stelde vast dat

collageen II expressie verhoogd was na expansie op een oppervlak bestaande uit meerdere

lagen collageen I/II en chondroïtine-6-sulfaat [29].

10

1.3.1.2 Stamcellen

Om het probleem van onvoldoende cellen te omzeilen, kan men ook gebruik maken van

stamcellen. Zowel voor mesenchymale stamcellen uit het beenmerg (bone marrow-derived

stem cells – BMSCs) als stamcellen afkomstig van vetweefsel (adipose-derived stem cells –

ADSCs) werd reeds aangetoond dat deze een chondrogene capaciteit bezitten [30-32]. Door

hun overvloedige aanwezigheid in het lichaam, gemakkelijke isolatie en snelle proliferatie

zijn BMSCs en ADSCs een aantrekkelijk alternatief voor autologe fibrochondrocyten.

Ondanks deze voordelen zijn er ook een aantal beperkingen gekoppeld aan het gebruik van

stamcellen voor tissue engineering. Zo blijkt het niet evident om een homogene differentiatie

te bekomen in een populatie van stamcellen. Door transportgradiënten kunnen regionale

verschillen ontstaan in de ECM waardoor de mechanische eigenschappen inferieur zijn en de

cellen minder geschikt zijn voor verdere toepassingen [33]. Daarnaast moet ook gestreefd

worden naar de optimale combinatie van groeifactoren om de chondrogenese op een

reproduceerbare manier te induceren en hypertrofie van de cellen te voorkomen [34].

In een aantal studies werd ook de combinatie van mesenchymale stamcellen en

fibrochondrocyten onderzocht. Deze co-cultuur leverde enkele interessante resultaten op.

Door beide celtypes samen in cultuur te brengen, werd er minder hypertrofie en een

verhoogde matrix vorming vastgesteld [35, 36]. Op deze manier zijn er minder

fibrochondrocyten nodig voor de vorming van constructen, verkrijgen de stamcellen meer een

meniscus fenotype en worden constructen bekomen met voldoende sterke mechanische

eigenschappen.

1.3.2 Biochemische en mechanische stimuli

Eén van de belangrijkste stimuli in tissue engineering zijn groeifactoren. Deze

signaalmoleculen hebben door hun binding op specifieke receptoren een invloed op

verschillende cellulaire processen. Door hun positief effect op proliferatie, differentiatie en

synthese van ECM zijn groeifactoren onmisbaar geworden in de cultivatie van

fibrochondrocyten [1, 26]. De voornaamste groeifactoren die in meniscus tissue engineering

gebruikt worden, zijn Transforming Growth Factor β (TGF-β), Insuline-like Growth Factor I

(IGF-I), Platelet Derived Growth Factor (PDGF), Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2), Bone

Morphogenetic Proteins (BMPs) en basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) [12, 37, 38].

11

De eigenschappen van de ECM kunnen nog verder beïnvloed worden door mechanische

stimulatie. Heel wat mogelijkheden werden reeds onderzocht met als belangrijkste

hydrostatische druk [39, 40] en directe compressie [41, 42]. Daarnaast werden ook nog hoge

en lage wrijving, vloeistofperfusie en ultrasound bestudeerd. Deze stimuli kunnen onder

andere leiden tot verhoogde synthese van collageen en GAGs, verhoogde proliferatie en

hogere compressieve eigenschappen. Het uiteindelijke effect van de mechanische stimulatie is

afhankelijk van verschillende parameters (methode, tijdstip van toepassing, magnitude, duur

en frequentie) wat het vinden van een optimale combinatie sterk bemoeilijkt [1, 25].

Als laatste wordt de kwaliteit van meniscus constructen mogelijks ook beïnvloed door de

toegepaste zuurstofspanning. Verschillende studies onderzochten reeds het effect van een lage

zuurstofspanning (2-5% O2) op de chondrogene capaciteit van cellen en constructen in

vergelijking met een normale zuurstofspanning (21% O2) [29, 33, 37, 43, 44]. Over het

algemeen werden positieve resultaten bekomen wanneer een lage zuurstofspanning toegepast

wordt. In de studie van Croutze et al. [44] werd dit echter niet vastgesteld, waardoor verder

onderzoek naar de rol van hoge en lage zuurstofspanning in tissue engineering van de

meniscus vereist is.

1.3.3 Scaffolds

Een belangrijke component in tissue engineering is de scaffold. Deze structuur zorgt voor

ondersteuning van het weefsel in de eerste fase na implantatie en stimuleert de cellen om

ECM te synthetiseren. Er zijn heel wat vereisten waaraan voldaan moet worden, waardoor er

nog steeds gezocht wordt naar de ideale scaffold. De voornaamste criteria zijn de porositeit,

ondersteuning van celviabiliteit, proliferatie, differentiatie en ECM productie, fixatie en

integratie met gastheerweefsel, mechanische ondersteuning en biodegradeerbaarheid.

Daarnaast mag de resorptie van een scaffold ook niet leiden tot vorming van toxische

bijproducten [25].

Het degradatieprofiel van een scaffold is van uitermate belang, omdat de snelheid van

degradatie afgestemd moet zijn op de vorming van nieuw weefsel om constructen met goede

biomechanische eigenschappen te bekomen (Figuur 5) [12, 26]. Wanneer de scaffold te snel

degradeert, zal het nieuwe weefsel dat zich aan het vormen is onvoldoende ondersteund

worden met falen van het construct als gevolg.

12

Figuur 5: Kinetiek van resorbeerbare scaffolds en herstellend weefsel [12]

(A) Ideale resorptie van de scaffold met vorming van nieuw, voldoende stevig weefsel (B) Falen van het construct door te snelle resorptie van de scaffold of te traag herstel van het weefsel

1.3.3.1 Synthetische polymeren

Een eerste soort scaffolds zijn de synthetische polymeren. De meest courant gebruikte zijn

polyurethaan, polycaprolacton (PCL), polylactide, polyglycolide en poly(lactide-co-glycolide)

(PLGA) [1]. Het voordeel van synthetische scaffolds is dat ze gemakkelijk te manipuleren

zijn waardoor porositeit, mechanische eigenschappen, geometrie, vezelgrootte en

degradatietijd naar wens aangepast kunnen worden [1, 26]. Synthetische polymeren hebben

echter ook een groot nadeel, ze hebben namelijk weinig biomimetische en bioactieve

eigenschappen [1]. Hierdoor is synthese van ECM en integratie van constructen in het

gastheerweefsel niet evident.

Om de biomimetische eigenschappen van synthetische scaffolds te verbeteren, kunnen

verschillende modificaties aan de scaffolds aangebracht worden. Men kan onder andere

moleculen uit de ECM laten integreren met de scaffold. Zo maakten Tan et al. gebruik van

een PLGA scaffold met een coating van collageen I/II en chondroïtine-6-sulfaat [29]. Het

aanbrengen van gelatine en fibronectine op een PCL scaffold blijkt ook een positief effect te

hebben op celadhesie, proliferatie en kolonisatie van de scaffold [45].

1.3.3.2 ECM componenten

Scaffolds kunnen ook opgebouwd zijn uit componenten van de natieve matrix zoals collageen,

hyaluronzuur en GAGs [1, 25]. Verschillende moleculen kunnen samengevoegd worden tot

op maat gemaakte scaffolds met een optimale driedimensionale architectuur [26]. Dankzij hun

natuurlijke oorsprong bezitten de scaffolds ook intrinsieke biomimetische eigenschappen wat

zorgt voor een goede micro-omgeving voor de cellen [46]. Anderzijds bestaat er bij het

13

gebruik van natuurlijke materialen steeds een risico op immuunreactie door de gastheer na

implantatie. Door processing van de scaffold kan deze reactie echter tot een minimum beperkt

worden [46].

Het meest onderzochte natuurlijke polymeer is wellicht collageen I. Door de overvloedige

aanwezigheid in het lichaam vinden scaffolds op basis van collageen I hun toepassing in

tissue engineering van heel wat weefsels [47]. Ook voor de vorming van meniscus

constructen lijken collageen I scaffolds geschikt. Zo toonden Gruber et al. aan dat

meniscuscellen goed op de scaffold adhereren en daarnaast gestimuleerd worden tot vorming

van ECM [48].

1.3.3.3 Hydrogels

Een speciale vorm van scaffolds zijn de hydrogels. Deze waterabsorberende structuren

kunnen synthetisch zijn zoals polyvinyl en poly(N-isopropylacrylamide) of natuurlijk zoals

collageen I, alginaat en fibrine [1]. Hydrogels hebben de unieke eigenschap om afhankelijk

van de omgevingstemperatuur in vloeibare toestand of als gel voor te komen. Hierdoor

kunnen ze geïnjecteerd worden in het kniegewricht waarna in situ een gel gevormd wordt.

Puetzer et al. onderzochten reeds het gebruik van collageen I hydrogels voor meniscus tissue

engineering [49]. Uit hun studie bleek dat deze hydrogels op vlak van biomechanische

eigenschappen beter scoorden dan alginaat, maar nog steeds niet dezelfde mechanische sterkte

vertonen als de natieve meniscus.

1.3.4 Top-down versus bottom-up tissue engineering

Om uiteindelijk in vitro constructen te vormen, kan men ofwel kiezen voor de klassieke top-

down approach ofwel voor de meer recente bottom-up approach. Deze beide benaderingen

worden schematisch weergegeven in Figuur 6. In de klassieke top-down approach gaat men

een weefsel trachten na te bootsen door welbepaalde celtypes uit te zaaien op scaffolds in

combinatie met de juiste groeifactoren. In de bottom-up approach daarentegen worden eerst

modulaire weefsels opgebouwd zonder het gebruik van biomaterialen of scaffolds en worden

deze vervolgens als bouwstenen gebruikt voor de vorming van grotere weefsels [50].

14

Figuur 6: Bottom-up en top-down tissue engineering [50] In de klassieke top-down approach worden cellen uitgezaaid op scaffolds waardoor na vorming van ECM,

proliferatie van de cellen en degradatie van de scaffold uiteindelijk nieuw weefsel gevormd wordt. In de bottom-

up approach zal men eerst microweefsels vormen die verder geassembleerd kunnen worden tot macroweefsel.

1.4 Doel van de masterproef

Voor tissue engineering van de meniscus is een voldoende aantal cellen met het juiste

fenotype van cruciaal belang om constructen met goede biochemische en mechanische

eigenschappen te bekomen. In deze masterproef zal daarom nagegaan worden of

fibrochondrocyten, eens ze gededifferentieerd zijn, nog in staat zijn om redifferentiatie te

ondergaan met vorming van stabiele micro-aggregaten die een correct fenotype bezitten. Deze

redifferentiatie zal geïnduceerd worden door toevoegen van een chondrogene stimulus in de

vorm van TGF-β1 en door het toepassen van een lage zuurstofspanning. In een tweede fase

zal ook bepaald worden of deze aggregaten na inkapseling in een collageen I hydrogel hun

viabiliteit en functionaliteit kunnen behouden.

15

2 Materiaal en methoden

2.1 Isolatie meniscus en fibrochondrocyten

Tijdens deze masterproef werd gebruik gemaakt van menisci van varkens verkregen via het

slachthuis. Aangezien varkensmenisci dezelfde complexe structuur vertonen als deze van de

mens, in grootte gelijkaardig zijn en gemakkelijk te verkrijgen zijn, vormen deze een

betrouwbaar alternatief voor humane menisci.

Protocol isolatie meniscus

Met behulp van scalpel meniscus uit kniegewricht snijden

Meniscus 10 seconden in 70% alcohol dompelen

10 seconden in Ringer (samenstelling zie Bijlage I) met penicilline/streptomycine (PS)

antibioticum (Life Technologies™; Cat No. 15140-122)

Bewaring overnacht bij 4°C in fibrochondrocyten medium (FC medium)

(samenstelling zie Bijlage II)

Protocol isolatie fibrochondrocyten

Verwijder buitenste 2/3 van de meniscus

Binnenste 1/3 mechanisch versnijden in stukjes van maximaal 1 mm³

Toevoegen 3 mg/ml pronase (Sigma-Aldrich; P5147) gedurende 3 uur

Toevoegen 2 mg/ml collagenase II (Sigma-Aldrich; C6885) gedurende 3,5 uur

Reactie stoppen door toevoegen 5 ml foetaal kalf serum (FKS) (Life Technologies™;

Cat No. 10270-106)

Suspensie filteren met behulp van cell strainer (BD Falcon™; REF 352350)

Centrifugeren: 10 minuten aan 1000 RPM

3x wassen met FC medium

Cellen tellen via trypaan blauw en een Bürker telkamer

2.2 Monolayer expansie

Voor monolayer expansie werden fibrochondrocyten in T175 cultuurflessen (BD FalconTM

)

uitgezaaid aan een densiteit van 2x104 cellen per cm

2. Wanneer 80% confluentie werd bereikt,

volgde een enzymatische behandeling met trypsine (Life Technologies™; Cat No. 25300-062)

en werden de cellen opnieuw aan de initiële densiteit uitgezaaid. Deze cellen vormden dan

passage 1 (P1) en werden verder geëxpandeerd tot P3 werd bereikt met verversen van het

medium om de 2 à 3 dagen.

16

2.3 Micro-aggregaten

2.3.1 Vorming

De fibrochondrocyten van P3 werden gebruikt voor de vorming van micro-aggregaten.

Hiervoor werden de cellen uitgezaaid op agarose microchips die in het labo aangemaakt

werden op basis van UltrapureTM

Agarose (Invitrogen™) (protocol zie Bijlage III). Een

overzicht van de verschillende stappen wordt weergegeven in Figuur 7. Door gebruik te

maken van een PDMS mould kunnen agarose gels met daarin 2865 microwells gevormd

worden. Met behulp van een puncher kan de grootte van de microchip aangepast worden

zodat deze past in de bodem van een 12-well plaat. Door 500 000 cellen per microchip uit te

zaaien, worden uiteindelijk aggregaten van ongeveer 175 cellen gevormd. Deze techniek laat

high throughput vorming van micro-aggregaten met uniforme afmetingen toe.

Figuur 7: Schematisch overzicht van de aanmaak van agarose microchips

Vloeibare agarose wordt aangebracht op een PDMS mould die 2865 microwells bevat. Na harder worden, bevat

de agarose gel eveneens 2865 microwells waar vervolgens cellen in uitgezaaid kunnen worden.

2.3.2 Cultuuromstandigheden

Om het effect van een lage zuurstofspanning en de invloed van een chondrogene stimulus te

bestuderen, werden de micro-aggregaten gedurende 21 dagen onder 4 verschillende

omstandigheden in cultuur gehouden (Tabel 1).

17

Tabel 1: Overzicht cultuuromstandigheden micro-aggregaten

Zuurstofgehalte Medium

Situatie 1 21% O2 Chondrogeen medium

Situatie 2 21% O2 FC medium

Situatie 3 5% O2 Chondrogeen medium

Situatie 4 5% O2 FC medium

In situatie 1 en 3 werd gebruik gemaakt van een chondrogeen medium dat de groeifactor

Transforming Growth Factor β1 (TGF-β1) bevat om de invloed ervan op de morfologie en

genexpressie van de micro-aggregaten na te gaan. Ter controle werd in situatie 2 en 4 een

expansiemedium (FC medium) gebruikt.

Samenstelling chondrogeen medium

Basismedium

o 8 ml DMEM/F12

o 80 µl Natrium pyruvaat (Life Technologies™; Cat No. 11360-039)

o 8 µl PS antibioticum

o 40 µl insuline-transferrine-selenium (ITS) (Sigma-Aldrich; I3146)

Chondrogeen medium

o 4 ml basismedium

o 80 µl ascorbinezuur (Sigma-Aldrich; A8960)

o 4 µl dexamethasone (Sigma-Aldrich; D2916)

o 2 µl TGF-β1 (R&D Systems; Cat No. 240-B-002)

2.4 Evaluatie

Evaluatie van de micro-aggregaten gebeurde op dag 4/7, 14 en 21. Voor elk tijdstip werden

een viabiliteitstest, biochemische analyse, verschillende (immuno)histochemische kleuringen

en een analyse van de genexpressie via RT-qPCR uitgevoerd. Vooraleer de micro-aggregaten

geëvalueerd konden worden, werden ze uit de microchips gehaald. Hiervoor werd het medium

op en neer gepipetteerd en vervolgens werd de celsuspensie overgebracht naar een 15 ml

conische tube (Greiner Bio-One). Na centrifugatie (5 minuten aan 1000 RPM) werd het

supernatans verwijderd en werd de celpellet gespoeld met phosphate buffered saline (PBS,

samenstelling zie Bijlage IV). Deze pellet kon vervolgens gebruikt worden voor verdere

analyse.

18

2.4.1 Viabiliteitstest

Om de viabiliteit van cellen na te gaan, kan een Calceïne-AM Propidiumiodide kleuring

(CaPI kleuring) uitgevoerd worden. Levende cellen bevatten actieve esterasen die in staat zijn

om de acetomethoxygroep van calceïne te verwijderen waardoor het calceïne de cel niet meer

kan verlaten. De aanwezigheid van deze molecule zorgt ervoor dat viabele cellen groen

kleuren. Dode cellen daarentegen bevatten geen actieve esterasen, maar zijn wel permeabel

voor propidiumiodide dat door binding aan DNA zorgt voor een rode fluorescentie.

Protocol CaPI kleuring

Voeg 1 ml Ringer (samenstelling zie Addendum), 2 µl calceïne-AM (AnaSpec; 89201)

en 2 µl propidiumiodide (Sigma-Aldrich; P4170) toe aan de celpellet

Breng de oplossing over naar een 12-well plaat

Laat 10 minuten incuberen in het donker op kamertemperatuur

Visualiseer met fluorescentiemicroscoop (Olympus IX 81)

2.4.2 Biochemische analyse

De aanmaak van een ECM kan in de tijd gevolgd worden door de hoeveelheid GAGs,

genormaliseerd ten opzichte van de hoeveelheid DNA, te bepalen. Om de GAGs vrij te stellen

werd gebruik gemaakt van het enzym papaïne dat peptidebindingen op een weinig specifieke

manier knipt. Vervolgens werden de Blyscan™ Glycosaminoglycan Assay (Biocolor) en

Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Reagent and Kits (Invitrogen™) gebruikt.

Protocol GAG bepaling

Voeg 0.5 ml van een 125 µg/ml papaïne oplossing toe aan celpellet

o 0.2 M Natriumfosfaatbuffer op pH 6.4 brengen

+ 400 mg Natriumacetaat

+ 200 mg EDTA (Sigma-Aldrich; E5134)

+ 40 mg Cysteïne HCl (Sigma-Aldrich; C1276)

o Papaïne (Sigma-Aldrich; P4762) oplossen in buffer

Laat overnacht incuberen op 60°C

Na digestie, centrifugeer gedurende 10 min aan 10 000 g

Breng 200 µl van het supernatans (= papaïne digest) over naar een eppendorf

Voeg 1 ml Blyscan reagens toe en laat 30 minuten incuberen met regelmatig schudden

Centrifugeren: 10 minuten aan 12 000 RPM

Verwijder supernatans

Voeg 0.5 ml dissociatie reagens toe

Gedurende 10 minuten vortexen

Centrifugeren: 5 minuten aan 12 000 RPM

Pipetteer 200 µl in een 96-well plaat

Meet absorbantie bij 656 nm (Paradigm™ Detection Platform; Beckman Coulter)

19

Protocol DNA bepaling

Breng 200 µl van het papaïne digest over naar een eppendorf

Voeg 800 µl TE buffer toe

Voeg 1 ml Quant-it toe

Laat 2 tot 5 minuten incuberen

Meet excitatie bij 480 nm en emissie bij 520 nm (Paradigm™ Detection Platform;

Beckman Coulter)

2.4.3 Histologische analyse

Via (immuno)histochemie kunnen verschillende onderdelen van de cel en de omgevende

matrix gevisualiseerd worden met de lichtmicroscoop. Weefsels of cellen, in deze masterproef

micro-aggregaten, worden hiervoor eerst gefixeerd en vervolgens ingebed in paraffine.

Daarna worden coupes gemaakt van 5 µm dikte waarop kleuringen uitgevoerd kunnen worden.

Protocol Fixatie en inbedding

Voeg 1,5 ml van 4% neutraal gebufferde formol (NGF) (samenstelling zie Bijlage V)

toe aan de celpellet

Bewaar overnacht bij 4°C

Breng celpellet over in 30% Disolol® (Chem-lab; CL00.1807.2500) gedurende 1 uur

Breng celpellet over in 50% Disolol® gedurende 1 uur



Breng celpellet over in isopropyl alcohol (Chem-lab; CL00.0901.5000) gedurende 1

uur

Breng celpellet over in isopropyl alcohol / toluol (1:1) (Chem-lab; CL00.0901.5000/

CL00.2001.5000) gedurende 1 uur

Breng celpellet over in toluol gedurende 30 minuten

Breng celpellet over in paraffine op 60°C

Bewaar overnacht op 60°C

Immunohistochemie maakt gebruik van specifieke antilichamen waardoor na binding van een

tweede antilichaam en streptavidine-peroxidase, een chromogeensubstraat geoxideerd kan

worden met vorming van een gekleurde neerslag. Hierdoor is visualisatie van de gewenste

molecule mogelijk. De samenstelling van de ECM kan op deze manier nagegaan worden door

targetting van collageen I, collageen II en aggrecan.

20

Protocol Collageen I kleuring

Coupes deparaffineren

Afgrenzen met toluolstift

Voorbehandeling met pepsine (Sigma-Aldrich; P6887 ) (1 mg/ml Trisbuffer pH=2)

gedurende 1 uur op 37°C (enzyme en preparaat voorverwarmen op 37°C)

5x wassen met PBS: telkens 2 min

Voorbehandeling met 3% H2O2 in AD gedurende 10 min

Blokkingsserum: 30 min

AL1 (Abcam; 6308) 1/400 verdund met verdunningsbuffer: 2 uur


AL2 (RAM, rabbit anti-mouse biotine) 1/200 verdund met verdunningsbuffer: 30 min


Streptavidine-peroxidase (1/200): 30 min


Wassen met trisbuffer: 5 min

Chromogeensubstraat: 10 min

Wassen met stromend leidingswater: 10 min

Tegenkleuring: haematoxyline: 1 sec

Dehydrateren

Monteren met mounting medium

Protocol Collageen II kleuring


Afgrenzen met toluolstift

Wassen met PBS gedurende 15 min op 37°C

Voorbehandeling met pepsine (1 mg/ml Trisbuffer pH=2) gedurende 10 min op 37°C

(enzyme voorverwarmen op 37°C)


Voorbehandeling met 3% H2O2 in AD: 10 min

Blokkingsserum: 30 min

AL1 (Acris; AMOO 618 PUN) 1/100 verdund met verdunningsbuffer: 2 uur


AL2 (RAM, rabbit anti-mouse biotine) 1/200 verdund met verdunningsbuffer: 30 min


Streptavidine-peroxidase (1/200): 30 min


Wassen met trisbuffer: 5 min

Chromogeensubstraat: 10 min

Wassen met stromend leidingswater: 10 min

Tegenkleuring met haematoxyline: 1 sec

Dehydrateren


21

Tabel 2: Samenstelling blokkingsserum, verdunningsbuffer en chromogeensubstraat (Col I en II kleuring)

Product Samenstelling

Blokkingsserum 0.25 ml NRS (normal rabbit serum voor monoclonaal AL)

50 mg BSA (bovine serum albumine)

5 ml PBS

100 µl Tween 20

Verdunningsbuffer 1 ml blokkingsserum

9 ml PBS

Chromogeensubstraat 5 ml trisbuffer

0.003 g DAB (3,3'-diaminobenzidine) (Sigma-Aldrich; D5637)

5 µl H2O2 (30 %)

Protocol Aggrecan kleuring


Coupes afgrenzen met toluolstift

2x wassen met PBS: 15 min op 37°C

Voorbehandeling met chondroitinase ABC 0.2U/ml (Sigma; C3667): 1 uur op 37°C

3x wassen met PBS: telkens 5 min op kamertemperatuur

Voorbehandeling met 3% H2O2


CAS BLOCK (Invitrogen): 15 min

AL1 (AbD Serotec; MCA4722) 1/250 verdunnen in PBS + 0,3% Tween20: 1 uur


AL2 (anti-muis IgG, Vector kit): 30 min


DAB Impact (Vector kit): 5 min

Wassen met stromend water: 10 min

Tegenkleuring met haematoxyline (onverdund): 1 seconde

Wassen met leidingwater: 1 min

Dehydrateren


Voor de samenstelling van de ECM kan ook gebruik gemaakt worden van histochemische

kleuringen. De aanwezigheid van glycosaminoglycanen (GAGs) kan aangetoond worden door

een alciaanblauw of toluïdineblauw kleuring. Alciaanblauw is een kationische kleurstof die

via elektrostatische krachten zal binden aan de negatief geladen GAGs. Door de binding is

een felblauwe kleur waarneembaar. Toluïdineblauw is eveneens een kationische kleurstof die

bij binding aan de sulfaatgroepen van GAGs een kleuromslag vertoont van blauw naar rood-

paars. Dit fenomeen wordt ook wel metachromasie genoemd en komt tot stand door vorming

van dimeren of polymeren ten gevolge van een hoge densiteit aan kleurstofmoleculen. De

22

aanwezigheid van proteoglycanen (PG) kan aangetoond worden met een Safranine-O kleuring.

De intensiteit van de kleuring is evenredig met de hoeveelheid PG aanwezig in de ECM.

Protocol Alciaanblauw kleuring


30 minuten alciaanblauw 1% in 3% ijsazijn

Spoelen met gedestilleerd water

Dehydrateren


Protocol Toluïdineblauw kleuring


5 minuten in toluïdineblauw 0,5% in 1% ijsazijn

20 seconden spoelen in gedestilleerd water

Dehydrateren


Protocol Safranin-O kleuring


15 seconden in haematoxyline (1/4 verdund)

5 minuten onder stromend leidingswater

5 minuten in fastgreen

10 seconden in 1% ijsazijn

5 minuten in Safranine-O (0,1 g in 100 ml gedestilleerd water)

Kort spoelen met gedestilleerd water

Dehydrateren


2.4.4 Genexpressie

2.4.4.1 RNA isolatie

Om het genexpressie profiel van cellen te kunnen bepalen, moet het RNA eerst vrijgesteld

worden. Door toevoegen van Tri reagent® (Sigma-Aldrich; T9424) zullen cellen lyseren

waarna de nucleïnezuren van de eiwitten gescheiden kunnen worden met behulp van

chloroform (Sigma-Aldrich; C2432). Vervolgens kan men het RNA laten precipiteren door

toevoegen van 2-propanol (Sigma-Aldrich; I9516). Om contaminatie met DNA te vermijden,

wordt als laatste ook nog een DNAse behandeling uitgevoerd. Hiervoor werd de DNase I,

Amplification Grade (Invitrogen™; REF 18068-015) gebruikt.

23

Protocol RNA isolatie

Resuspendeer celpellet in 1 ml Tri reagent® en pipetteer goed op en neer

Voeg 200 µl chloroform toe, goed vortexen en 3 minuten laten incuberen

Centrifugeer 15 minuten aan 12 000 g bij 4°C

Breng de bovenste kleurloze fase met RNA over naar een nieuw 1,5 ml eppendorf

Voeg 500 µl 2-propanol toe

Vortex op gematigde snelheid gedurende 10 seconden en laat 10 minuten incuberen

Centrifugeer 8 minuten aan 12 000 g bij 4°C

Verwijder het supernatans

Was de pellet met 75% koude ethanol

Vortex zachtjes, tot de pellet los komt van de bodem

Centrifugeer 5 minuten aan 7500 g bij 4°C

Zuig het supernatans grondig af

Laat 3-5 minuten drogen aan de lucht

Los de pellet op in 8 µl nuclease-vrij water

Voer DNAse behandeling uit

o 1 µl 10x buffer en 1µl DNAse toevoegen

o Short spin en laat 15 minuten incuberen

o Voeg 1 µl EDTA toe

o Plaats in de heating block voor inactivatie: 15 minuten op 65°C

Leng aan met nuclease-vrij water tot 20 µl

2.4.4.2 RNA bepaling via spectrofotometrie

Na isolatie wordt de concentratie en de zuiverheid van het RNA bepaald met behulp van de

NanoDrop ND-1000 spectrofotometer (Thermo Scientific). Door belichting met een UV-

straal van 260 nm golflengte, kan de absorptie door het RNA gemeten worden en finaal

omgezet worden in een RNA concentratie. Als blanco wordt de absorptie door 2 µl nuclease-

vrij water gemeten, vervolgens wordt 2 µl van het staal op het toestel aangebracht.

2.4.4.3 Omzetten van RNA naar cDNA

Via reverse transcriptie kan RNA omgezet worden naar cDNA. Hiervoor werd 16 µl van het

RNA staal samengevoegd met 24 µl van een mix en vervolgens kon met behulp van de 2720

Thermal Cycler van Applied Biosystems de reactie doorgaan. Voor het maken van de mix

werd gebruik gemaakt van de Reverse Transcription Core Kit van Eurogentec.

Samenstelling mix (voor 1 staal)

10x buffer 4 µl

25 mM MgCl2 8 µl

dNTPs 8 µl

random nonameren 2 µl

RNAse inhibitor 0,8 µl

24

Euroscript RT 1 µl

RNAse vrij water 0,2 µl

2.4.4.4 RT-qPCR

Via RT-qPCR kan de expressie van verschillende genen bepaald worden. In deze masterproef

werd de expressie van de fibreuze merker collageen I en van de chondrogene merkers

collageen II, aggrecan en Sox-9 bepaald ten opzichte van de huishoudgenen HPRT1 en RPL4.

Via de 2-ΔCT

methode en de 2-ΔΔCT

methode konden dan respectievelijk de relatieve expressie

en de fold change berekend worden [29].

Protocol PCR

Aanmaken mix (voor 1 reactie) (qPCR Core Kit for SYBR®Green van Eurogentec)

o 2x mastermix 12,5 µl

o forward primer 0,75 µl

o reverse primer 0,75 µl

o SYBR®Green 0,75 µl

o nuclease-vrij water 8,25 µl

Voeg aan elke well van de Optical Reaction Plate 23 µl mix en 2 µl cDNA toe

Dek de plaat af met een Optical Adhesive Cover

Centrifugeer de plaat gedurende 30 seconden aan 1000 RPM

Plaats de plaat in het toestel (AB 7500 Fast Real-Time PCR)

2.5 Inkapselen van micro-aggregaten

Een deel van de micro-aggregaten werd op dag 4 ingekapseld in een collageen I hydrogel. De

gels werden vervolgens gedurende 21 dagen in een chondrogeen medium en bij 5% O2 in

cultuur gehouden. Op dag 7, 14 en 21 werd de gen expressie van de micro-aggregaten in de

gels bepaald zoals beschreven in hoofdstuk 2.4.4.

Protocol Inkapselen van micro-aggregaten

Haal de micro-aggregaten uit de microchips door het medium op en neer te pipetteren

Breng de celsuspensie over naar een 15 ml conische tube

Centrifugeer gedurende 5 minuten aan 1000 RPM

Verwijder het supernatans

Resuspendeer de micro-aggregaten in een klein volume medium

Voeg 1 ml PureCol EZ Gel (Sigma-Aldrich; Cat No. 5074) toe per 2 500 000 cellen

Verdeel de oplossing over een 48-well plaat (200 µl oplossing per well)

Laat de gel 90 minuten hard worden op 37°C

Voeg 0,5 ml chondrogeen medium toe

25

2.6 Statistische analyse

Alle data worden weergegeven als gemiddelde ± standaard deviatie. Via het programma

SigmaPlot werd de statistische significantie van de data berekend. Voor de vergelijking van

twee groepen (21% O2 ten opzichte van 5% O2) werd gebruik gemaakt van de Student’s t-test.

Wanneer meerdere groepen werden vergeleken, werd de one-way analysis of variance (one-

way ANOVA) gevolgd door de post-hoc Tukey test gebruikt. Een waarde van p < 0,05 werd

als significant beschouwd.

26

3 Resultaten

3.1 Monolayer expansie

3.1.1 Cel morfologie

Gedurende monolayer expansie van de fibrochondrocyten kon een duidelijke verandering in

morfologie waargenomen worden. Op Figuur 8 is te zien dat de primaire cellen (P0) een

ronde of polygonale vorm hebben. Na passage (P1 en P2) nemen de cellen een meer

uitgestrekte, fibroblastachtige vorm aan.

Figuur 8: Morfologie van fibrochondrocyten tijdens monolayer expansie. Schaal = 200 µm

3.1.2 Gen expressie profiel van primaire en gesplitste fibrochondrocyten

Via RT-qPCR werd de expressie van zowel de fibreuze merker collageen I als de

kraakbeenmerkers collageen II, aggrecan en Sox-9 in primaire en gesplitste fibrochondrocyten

bepaald. De relatieve expressie van de verschillende merkers werd genormaliseerd ten

opzichte van de huishoudgenen RPL4 en HPRT1. In Figuur 9 is te zien dat de primaire

fibrochondrocyten een hoge relatieve expressie van collageen I en collageen II hebben met

waarden van 5,45 en 3,65 respectievelijk. Ook aggrecan en Sox-9 zijn aanwezig, zij het in

mindere mate met waarden van 1,83 en 0,68 respectievelijk. Reeds na eerste passage neemt de

relatieve expressie van de kraakbeenmerkers sterk af, terwijl de expressie van collageen I

hoog blijft. Ook na tweede en derde passage is er zo goed als geen expressie van collageen II,

aggrecan en Sox-9 meer waar te nemen, terwijl de expressie van collageen I min of meer

gelijk blijft.

27

Figuur 9: Gen expressie profiel van primaire en gesplitste fibrochondrocyten via RT-qPCR

Relatieve expressie van collageen I, collageen II, aggrecan en Sox-9 genormaliseerd ten opzichte van de

huishoudgenen RPL4 en HPRT1 voor VG (vers geïsoleerd, primaire fibrochondrocyten), P1 (passage 1), P2 (passage 2) en P3 (passage 3) (n=3).

3.2 Fibrochondrocyten gecultiveerd in microchips

3.2.1 Morfologische evolutie micro-aggregaten

Gedurende 21 dagen werd de morfologische evolutie van de micro-aggregaten gevolgd. Op

Figuur 10 ziet men dat de fibrochondrocyten reeds na één dag een sterke compactie vertonen.

Deze trend zet zich verder waardoor op dag 4, ongeacht de conditie, aggregaten bekomen

worden die mooi afgelijnd zijn en waar geen individuele cellen meer te zien zijn (Figuur 11).

Op Figuur 12 is te zien dat de aggregaten die in een expansiemedium gecultiveerd werden

reeds op dag 7 uiteen beginnen te vallen, onafhankelijk van de zuurstofspanning. De

aggregaten die in een chondrogeen medium gecultiveerd werden, behouden daarentegen hun

afgeronde vorm en dit tot op dag 21 (Figuur 13).

Figuur 10: Morfologie van de micro-aggregaten op dag 0 (links) en dag 1 (rechts). Schaal = 200 µm.

0

2

4

6

8

10

12

Col 1 Col 2 ACAN SOX9

Re

lati

eve

exp

ress

ie (

1+E)

-DCT

Primaire en gesplitste fibrochondrocyten

VG

P1

P2

P3

28

Figuur 11: Morfologie van de micro-aggregaten op dag 4

(A) Micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium bij 21% O2 (B) Micro-aggregaten gecultiveerd in

chondrogeen medium bij 5% O2 (C) Micro-aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 21% O2 (D) Micro-

aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 5% O2. Schaal = 200 µm.

Figuur 12: Morfologie van de micro-aggregaten op dag 7 (A) Micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium bij 21% O2 (B) Micro-aggregaten gecultiveerd in



29

Figuur 13: Morfologie van de micro-aggregaten op dag 21 (A) Micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium bij 21% O2 (B) Micro-aggregaten gecultiveerd in



Om de 3 à 4 dagen werd ook de circulariteit van de micro-aggregaten bepaald. Dit werd enkel

gedaan voor de micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium, omdat de aggregaten

in expansiemedium vanaf dag 7 uiteen begonnen te vallen. Op Figuur 14 is te zien dat reeds

na 4 dagen stabiele aggregaten met een hoge circulariteit bekomen worden. Na dag 4 neemt

de circulariteit nog licht toe met waarden die schommelen tussen 0,90 en 0,95.

Figuur 14: Circulariteit van de micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium

0,7

0,75

0,8

0,85

0,9

0,95

1

Dag 1 Dag 4 Dag 7 Dag 11 Dag 14 Dag 18 Dag 21

Circulariteit

21% O2

5% O2

30

Naast de circulariteit werd ook de oppervlakte van de micro-aggregaten om de 3 à 4 dagen

berekend op basis van de perimeter en de diameter. Dit werd eveneens enkel voor de micro-

aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium gedaan. Op Figuur 15 is te zien dat er tussen

dag 1 en dag 4 een sterke afname in oppervlakte plaatsvindt, zowel bij hoge als lage

zuurstofspanning. Op de daaropvolgende tijdstippen ligt de gemiddelde oppervlakte van de

micro-aggregaten gecultiveerd bij 5% O2 significant (p < 0,01) hoger dan die van de micro-

aggregaten gecultiveerd bij 21% O2, met een gemiddelde waarde van 0,0100 mm2 en 0.0067

mm2 respectievelijk.

Figuur 15: Oppervlakte van de micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium

3.2.2 Viabiliteit

Op verschillende tijdstippen werd de viabiliteit van de micro-aggregaten bepaald aan de hand

van een CaPI kleuring. Op dag 7 is voor alle condities een hoge viabiliteit waarneembaar

(Figuur 16). Hier en daar zijn een aantal cellen losgekomen die rood aankleuren. Op Figuur

17 is te zien dat een aantal aggregaten op dag 21 reeds afgestorven zijn. De aggregaten

gecultiveerd in chondrogeen medium en bij 5% O2 behouden echter een vrij hoge viabiliteit.

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,014

0,016

0,018

0,02

Dag 1 Dag 4 Dag 7 Dag 11 Dag 14 Dag 18 Dag 21

Op

pe

rvla

kte

(mm

2 )

Oppervlakte micro-aggregaten

21% O2

5% O2

31

Figuur 16: CaPI kleuring van de micro-aggregaten op dag 7

(A) Micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium bij 21% O2 (B) Micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium bij 5% O2 (C) Micro-aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 21% O2 (D) Micro-

aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 5% O2.

Figuur 17: CaPI kleuring van de micro-aggregaten op dag 21

(A) Micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium bij 21% O2 (B) Micro-aggregaten gecultiveerd in


aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 5% O2. Schaal = 200 µm

32

3.2.3 Gen expressie profiel

Via RT-qPCR werd de expressie van de genen collageen I, collageen II, aggrecan en Sox-9 in

de micro-aggregaten bepaald en genormaliseerd ten opzichte van de huishoudgenen RPL4 en

HPRT1. Vervolgens werd de expressie via de ΔΔCT-methode uitgedrukt als een fold change

ten opzichte van de monolayer controle (P3). Waarden hoger dan 1 wijzen op een opregulatie

van het bestudeerde gen, terwijl waarden lager dan 1 wijzen op een neerregulatie. Op Figuur

18 is te zien dat er voor elk van de vier genen een significante (p < 0,05) toename is van de

expressie op dag 14 en dag 21, zowel bij hoge als lage zuurstofspanning. Voor de

kraakbeenmerkers collageen II, aggrecan en Sox-9 is deze toename het meest uitgesproken bij

een lage zuurstofspanning.

Figuur 18: Gen expressie profiel van de micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium

Verschil in expressie (fold change) ten opzichte van de monolayer controle (P3) voor collageen I, collageen II,

aggrecan en Sox-9 op dag 4, 14 en 21 bij hoge en lage zuurstofspanning (n=3).

3.2.4 Immunohistochemie en histochemie

Via een haematoxyline-eosine kleuring werd een gedetailleerd beeld van de micro-aggregaten

bekomen. Op Figuur 19 is te zien dat de structuur in alle condities en op elk van de drie

0

1

2

3

4

5

+TGFb 21% +TGFb 5%

Fo

ld c

ha

ng

e (

tov

P3

)

Collageen I

Dag 4

Dag 14

Dag 21

0

50

100

150

+TGFb 21% +TGFb 5%

Fo

ld c

ha

ng

e (

tov

P3

)Collageen II

Dag 4

Dag 14

Dag 21

0

2

4

6

8

10

12

+TGFb 21% +TGFb 5%

Fo

ld c

ha

ng

e (

tov

P3

)

Aggrecan

Dag 4

Dag 14

Dag 21

0

1

2

3

4

+TGFb 21% +TGFb 5%

Fo

ld c

ha

ng

e (

tov

P3

)

Sox-9

Dag 4

Dag 14

Dag 21

33

tijdstippen gelijkaardig is. Er zijn duidelijk verschillende, paars gekleurde kernen waar te

nemen met daar rond cytoplasma. De grootte van de micro-aggregaten varieert licht, maar

over het algemeen zijn er uniforme, duidelijk afgelijnde aggregaten te zien.

Dag 4 Dag 14 Dag 21

A

B

Figuur 19: Haematoxyline-eosine kleuring van de micro-aggregaten op dag 4, 14 en 21

(A) Micro-aggregaten in chondrogeen medium bij 21% O2 (B) Micro-aggregaten in chondrogeen medium bij 5%

O2. Schaal = 20 µm

De samenstelling van de ECM werd op verschillende tijdstippen bepaald aan de hand van

immunohistochemische kleuringen voor collageen I, collageen II en aggrecan. Naarmate de

molecule meer aanwezig is in het micro-aggregaat zal de hoeveelheid neergeslagen

chromogeensubstraat toenemen met een sterkere bruine kleur tot gevolg. Een overzicht van de

drie kleuringen wordt weergegeven in Figuur 20. Op dag 4 was er zowel bij hoge als lage

zuurstofspanning slechts een heel lichte aankleuring van collageen I (Figuur 20A en 20D). De

intensiteit van deze kleuring was daarentegen een heel stuk sterker op dag 14 en dag 21

(Figuur 20B-C en 20E-F). De collageen II kleuring leverde enkel bij de micro-aggregaten bij

lage zuurstofspanning op dag 14 een matige aankleuring op (Figuur 20H). Op de andere

tijdstippen alsook bij hoge zuurstofspanning kon geen kleuring waargenomen worden (Figuur

20G en 20I-L). De aggrecan kleuring tenslotte evolueerde bij een lage zuurstofspanning van

een lichte aankleuring op dag 4 (Figuur 20M) naar een sterke aankleuring op dag 14 en 21

(Figuur 20N-O). Bij een hoge zuurstofspanning was er zo goed als geen aankleuring op dag 4

en dag 14 (Figuur 20P-Q) terwijl deze op dag 21 vrij sterk was (Figuur 20R).

34

Dag 4 Dag 14 Dag 21

A B C

D E F

G H I

J K L

M N O

P R Q

35

Figuur 20: Immunohistochemische kleuringen van micro-aggregaten in chondrogeen medium

(A-C) Collageen I kleuring; 5% O2 (D-F) Collageen I kleuring; 21% O2 (G-I) Collageen II kleuring; 5% O2 (J-L)

Collageen II kleuring; 21% O2 (M-O) Aggrecan kleuring; 5% O2 (P-R) Aggrecan kleuring; 21% O2.

Schaal = 20 µm

Aan de hand van de histochemische kleuringen alciaanblauw, Safranine-O en toluïdineblauw

werd de omvang van de ECM nog verder in beeld gebracht. Opnieuw is de intensiteit van de

kleuring gecorreleerd met de hoeveelheid ECM aanwezig in het micro-aggregaat. Figuur 21

geeft een overzicht van de drie kleuringen uitgevoerd op de micro-aggregaten gecultiveerd in

chondrogeen medium en bij 21% O2. De alciaanblauw kleuring evolueerde van een matige

intensiteit op dag 4 en dag 14 (Figuur 21A-B) naar een sterke kleuring op dag 21 (Figuur

21C). Na kleuring met Safranine-O kon op geen enkel tijdstip een aankleuring terug gevonden

worden (Figuur 21D-F). De toluïdineblauw kleuring tenslotte leidde tot een metachromasie op

dag 21 (Figuur 21I).

Dag 4 Dag 14 Dag 21

Figuur 21: Histochemische kleuringen van de micro-aggregaten in chondrogeen medium bij 21% O2. (A-C) Alciaanblauw kleuring (D-F) Safranine-O kleuring (G-I) Toluïdineblauw kleuring. Schaal = 20µm

A C

I

B

D

H G

E F

36

Op Figuur 22 worden de drie histochemische kleuringen weergegeven die uitgevoerd werden

op de micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium en bij 5% O2. De alciaanblauw

kleuring evolueerde van een zeer lichte kleuring op dag 4 (Figuur 22A) naar een sterke

kleuring op dag 14 en dag 21 (Figuur 22B-C). Na Safranine-O kleuring was er amper

aankleuring te zien op dag 4 (Figuur 22D). Op dag 14 daarentegen was de aankleuring vrij

sterk (Figuur 22E). Dit was niet meer het geval op dag 21 waar er nog slechts een lichte

aankleuring kon waargenomen worden (Figuur 22F). De toluïdineblauw kleuring tenslotte

leidde reeds op dag 14 tot metachromasie (Figuur 22H), wat ook nog het geval was op dag 21

(Figuur 22I).

Dag 4 Dag 14 Dag 21

Figuur 22: Histochemische kleuringen van de micro-aggregaten in chondrogeen medium bij 5% O2.

(A-C) Alciaanblauw kleuring (D-F) Safranine-O kleuring (G-I) Toluïdineblauw kleuring. Schaal = 20 µm

A

H G

F E D

C B

I

37

3.2.5 GAG/DNA bepaling

Om na te gaan of er een toename is in ECM, werd de GAG productie van de micro-

aggregaten bepaald. Deze werd genormaliseerd ten opzichte van de hoeveelheid DNA om

eventuele verschillen in celaantal op te vangen. Op Figuur 23 is te zien dat de GAG/DNA

verhouding bij de micro-aggregaten in chondrogeen medium en bij 21% O2 stabiel blijft

tussen dag 4 en dag 14, terwijl er op dag 21 een significante (p = 0,0337) toename waar te

nemen is. Bij de micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium en 5% O2

daarentegen is er reeds op dag 14 een significante (p = 0,00602) verhoging in GAG/DNA

verhouding. Op dag 21 is er een lichte terugval, maar is er nog steeds een hogere GAG/DNA

verhouding ten opzichte van dag 21 bij de micro-aggregaten gecultiveerd bij 21% O2.

Figuur 23: GAG/DNA verhouding van de micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium (n=3)

3.3 Micro-aggregaten ingekapseld in een collageen I hydrogel

3.3.1 Morfologische evolutie

De micro-aggregaten die op dag 4 gevormd waren, werden in een collageen I hydrogel

ingekapseld en vervolgens gedurende 21 dagen in een chondrogeen medium en bij 5% O2 in

cultuur gehouden. Op Figuur 24 is te zien dat er cytoplasmatische uitlopers gevormd worden

die in lengte toenemen naarmate de aggregaten langer in de hydrogel verblijven. Over het

algemeen behouden de micro-aggregaten hun sferische vorm en is er geen toename in de

omvang van de aggregaten.

0

10

20

30

40

50

60

+TGFb 21% O2 +TGFb 5% O2

GA

G(µ

g)/D

NA

(µg)

GAG/DNA verhouding

Dag 4

Dag 14

Dag 21

38

Figuur 24: Morfologie van micro-aggregaten in een collageen I hydrogel

(A) Dag 1 (B) Dag 4 (C) Dag 7 (D) Dag 21. Schaal = 200 µm

3.3.2 Viabiliteit

De viabiliteit van de micro-aggregaten in de collageen I hydrogel werd bepaald door een CaPI

kleuring en dit op dag 7, dag 14 en dag 21. Op Figuur 25 is te zien dat op elk tijdstip een

aantal aggregaten rood aankleuren en dus niet meer viabel zijn. In het grootste deel van de

aggregaten zijn slechts een aantal losse cellen rood gekleurd en is er een goede viabiliteit.

Figuur 25: CaPI kleuring van micro-aggregaten in een collageen I hydrogel op dag 7, dag 14 en dag 21.

Schaal = 200 µm

39

3.3.3 Gen expressie profiel

Via RT-qPCR werd opnieuw de expressie van de genen collageen I, collageen II, aggrecan en

Sox-9 bepaald. Deze werden eveneens genormaliseerd ten opzichte van de huishoudgenen

RPL4 en HPRT1 en vervolgens via de DDCT-methode uitgedrukt als een fold change ten

opzichte van de monolayer controle (P3). Op Figuur 26 is te zien dat de expressie van

collageen I min of meer constant blijft ten opzichte van P3 op dag 7 en dag 14 met een fold

change van 1,39 en 0,99 respectievelijk. Op dag 21 is er een significante (p < 0,001) toename

van de expressie met een fold change van 1,92. De expressie van collageen II is reeds op dag

7 sterk verhoogd ten opzichte van P3 (9,5 fold). Na een terugval op dag 14 is er op dag 21

opnieuw een sterke toename naar een waarde die significant (p = 0,002) hoger ligt dan op dag

7 (13,88 fold). Ook bij de expressie van aggrecan wordt deze trend waargenomen. De hoge

expressie op dag 7 kent een terugval op dag 14 om dan op dag 21 opnieuw te stijgen. Voor

Sox-9 is er een graduele toename in expressie beschouwd over de drie tijdstippen.

Figuur 26: Gen expressie profiel van de micro-aggregaten ingekapseld in een collageen I hydrogel Verschil in expressie (fold change) ten opzichte van de monolayer controle (P3) voor de genen collageen I,

collageen II, aggrecan en Sox-9 op dag 7, 14 en 21 (n=3).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Col 1 Col 2 ACAN SOX9

Fold

ch

ange

(to

v P

3)

Micro-aggregaten in hydrogel

Dag 7

Dag 14

Dag 21

40

4 Discussie

Meniscus tissue engineering steunt op het gebruik van gedifferentieerde fibrochondrocyten

voor de vorming van functionele constructen. In deze masterproef werd daarom onderzocht of

cultivatie van fibrochondrocyten in de vorm van micro-aggregaten kan leiden tot herstel van

het fenotype nadat dedifferentiatie is opgetreden door monolayer expansie. Daarbovenop

werd bestudeerd of de groeifactor TGF-β1 en een lage zuurstofspanning een bijkomend

positief effect kunnen bewerkstelligen.

4.1 Monolayer expansie van fibrochondrocyten

In een eerste fase van het onderzoek werden primaire fibrochondrocyten gedurende drie

passages in standaard cultuurflessen gecultiveerd om het aantal cellen te verhogen. Door deze

tweedimensionale expansie treedt echter dedifferentiatie van de fibrochondrocyten op.

Verschillende studies toonden reeds aan dat de expressie van collageen II snel afneemt,

terwijl de expressie van collageen I toeneemt tijdens monolayer expansie [27, 29]. Door

analyse met behulp van RT-qPCR kon deze trend ook in dit experiment waargenomen worden.

De expressie van de kraakbeenmerkers collageen II, aggrecan en Sox-9 was reeds na één

passage bijna onbestaande. De expressie van collageen I fluctueerde gedurende de

verschillende passages, maar bleef wel hoog gedurende het volledige experiment. Ook op

morfologisch vlak kon dedifferentiatie waargenomen worden aangezien de fibrochondrocyten

evolueerden van ronde en polygonale cellen naar meer uitgestrekte, fibroblastachtige cellen.

4.2 Fibrochondrocyten gecultiveerd in microchips

De gededifferentieerde fibrochondrocyten van P3 werden in een tweede fase van het

onderzoek uitgezaaid op agarose microchips. Het feit dat agarose niet-celinteractief is, maakt

dit materiaal geschikt voor gebruik in een 3D cultuur. Door stimulatie van cel-celinteractie

tussen de fibrochondrocyten kunnen op deze manier micro-aggregaten gevormd worden. De

eerste dag na uitzaaien van de fibrochondrocyten was er reeds een sterke compactie waar te

nemen. Dit zette zich verder tot dag 4 met uiteindelijk vorming van mooi afgelijnde

aggregaten in alle condities. Via een haematoxyline-eosine kleuring kon deze morfologie

bevestigd worden.

41

Vanaf dag 7 was er een duidelijk verschil in morfologie tussen de micro-aggregaten in

chondrogeen medium en deze in expansiemedium. In afwezigheid van TGF-β1 begonnen de

micro-aggregaten uiteen te vallen wat het belang van deze groeifactor in het behoud van een

gecondenseerde toestand suggereert. Een gelijkaardig fenomeen van condensatie vindt men

ook terug tijdens de endochondrale botvorming. Eén van de eerste stappen in dit proces is de

condensatie van mesenchymale cellen. Deze stap is essentieel voor verdere differentiatie tot

chondrocyten en staat onder controle van onder andere Connective Tissue Growth Factor

(CTGF). Deze groeifactor wordt op zijn beurt opgereguleerd door stimulatie met TGF-β1 [51,

52].

Gedurende de volledige periode in cultuur werd de grootte van de micro-aggregaten gevolgd.

Op basis van de perimeter en de diameter kon vervolgens de oppervlakte berekend worden.

Hieruit bleek dat de micro-aggregaten gecultiveerd onder een lage zuurstofspanning een

significant (p < 0,05) grotere oppervlakte hadden vergeleken met deze onder een normale

zuurstofspanning. Op basis van de GAG bepaling is dit verschil in grootte wellicht te wijten

aan een verhoogde aanmaak van ECM. Terwijl de GAG productie van de micro-aggregaten

bij 21% O2 min of meer constant bleef gedurende drie weken, nam de GAG productie van de

micro-aggregaten bij 5% O2 significant toe op dag 14 en dag 21. Deze resultaten zijn

consistent met de studie van Babur et al. [53]. De onderzoeksgroep vergeleek de

redifferentiatie van chondrocyten die ofwel in macropellets ofwel in micropellets gecultiveerd

werden en dit bij hoge en lage zuurstofspanning. Ook hier werden grotere aggregaten en een

hogere GAG productie vastgesteld voor de micropellets en de macropellets die bij 2% O2

gecultiveerd werden.

Via RT-qPCR kon de gen expressie in de micro-aggregaten bepaald worden om zo na te gaan

of redifferentiatie plaatsvond. De expressie van collageen I, collageen II, aggrecan en Sox-9

werd uitgedrukt als een fold change ten opzichte van de gededifferentieerde cellen uit P3

waardoor een opregulatie of neerregulatie snel duidelijk wordt. Volgens de verwachtingen

was er bij de micro-aggregaten in chondrogeen medium een toename van de

kraakbeenmerkers collageen II, aggrecan en Sox-9 op dag 14 en dag 21. De vorming van

micro-aggregaten en de aanwezigheid van TGF-β1 heeft dus een positief effect gehad op de

redifferentiatie capaciteit van de fibrochondrocyten. Deze resultaten komen overeen met de

studie van Moreira Teixeira et al. waar chondrocyten in aggregaten van verschillende

afmetingen gecultiveerd werden [54]. Wanneer micro-aggregaten van 50 of 100 cellen

gevormd werden en vervolgens gestimuleerd werden met TGF-β3, trad een significante

42

toename van collageen II en aggrecan op. Dit werd eveneens vastgesteld door de studie van

Babur et al. [53]. De expressie van aggrecan en collageen II was hier hoger bij de

chondrocyten gecultiveerd in micropellets in vergelijking met deze in de macropellets.

Het effect op redifferentiatie werd in de studie van Babur et al. nog versterkt door een lage

zuurstofspanning. Zowel collageen II als aggrecan expressie was significant verhoogd in de

micropellets gecultiveerd bij 2% O2 ten opzichte van de andere condities [53]. Ook de

onderzoeksgroep van Adesida et al. constateerde eenzelfde versterkend effect [37]. In hun

studie werden humane meniscuscellen eerst in monolayer geëxpandeerd, al dan niet in

aanwezigheid van FGF2. Vervolgens werden macropellets gevormd die in een chondrogeen

medium en bij 5% of 20% O2 gecultiveerd werden. Voor alle condities werd een opregulatie

van collageen II vastgesteld op zowel gen als eiwitniveau. Deze opregulatie was nog meer

uitgesproken voor de pellets gecultiveerd onder hypoxie en ging gepaard met een stijging in

de expressie van Sox-9. De exacte manier waarop hypoxie een invloed heeft op differentiatie

naar een meer chondrogeen fenotype is nog niet volledig duidelijk. Wel werd al meermaals

aangetoond dat een lage zuurstofspanning kan leiden tot accumulatie van hypoxia inducible

factor 1 alfa (HIF-1α) met daaropvolgend activatie van Sox-9 [55, 56]. Verschillende

downstream genen van Sox-9, zoals aggrecan en collageen II, kunnen hierdoor opgereguleerd

worden. Naast dit mechanisme zijn ongetwijfeld nog een hele reeks andere

transcriptiefactoren in de chondrogene pathway betrokken, zoals gesuggereerd door Lafont et

al. [57]. Overeenkomstig met bovengenoemde studies werd ook in onze experimenten een

positief effect op redifferentiatie door een lage zuurstofspanning teruggevonden. Zowel

collageen II, aggrecan als Sox-9 expressie liggen hoger bij de micro-aggregaten gecultiveerd

bij 5% O2 in vergelijking met deze bij 21% O2. Dit resultaat bevestigt de correlatie tussen de

expressie van Sox-9 en zijn target genen aggrecan en collageen II. De zeer uitgesproken

verhoogde expressie van collageen II (124-fold) doet echter vermoeden dat er nog

bijkomstige mechanismen zijn die hierop een invloed hebben. Verder onderzoek naar de

invloed van hypoxie op de expressie van collageen II kan bijgevolg waardevolle informatie

opleveren omtrent de vereiste cultuuromstandigheden die nodig zijn om fibrochondrocyten in

vitro te laten differentiëren.

In redifferentiatie studies met chondrocyten gaat een opregulatie van collageen II meestal

gepaard met een neerregulatie van collageen I [58, 59]. In tegenstelling hiermee nam de

expressie van collageen I in de micro-aggregaten echter toe, zowel bij hoge als lage

zuurstofspanning. Deze trend is mogelijks te verklaren doordat de ECM van articulair

43

kraakbeen bijna uitsluitend uit collageen II bestaat, terwijl er in de natieve meniscus zowel

collageen I als collageen II aanwezig is [29]. In dat opzicht is het logisch dat een verhoogde

aanmaak van ECM in deze studie gepaard gaat met een verhoging in de expressie van zowel

collageen I als collageen II. Voorgaande studies met fibrochondrocyten waar eveneens een

hogere expressie van collageen I werd vastgesteld tijdens de redifferentiatiefase ondersteunen

deze verklaring [29, 56].

Aan de hand van immunohistochemische kleuringen werd nagegaan of de expressie van

collageen I, collageen II en aggrecan ook weerspiegeld werd op eiwitniveau. Voor collageen I

en aggrecan kon een toenemende intensiteit bij de immuunkleuring waargenomen worden,

overeenkomstig met de resultaten bekomen via RT-qPCR en dit zowel voor de micro-

aggregaten gecultiveerd bij hoge als bij lage zuurstofspanning. In het geval van collageen II

was er echter weinig overeenkomst tussen het resultaat van de immuunkleuring en de

expressie op genniveau. Hoewel er op dag 14 en dag 21 een verhoogde gen expressie

vastgesteld werd bij de micro-aggregaten gecultiveerd bij 21% O2, uitte dit zich niet in een

toename van intensiteit bij de immuunkleuring. Ook bij de micro-aggregaten gecultiveerd bij

5% O2 kon de sterke toename in collageen II expressie op dag 21 niet aangetoond worden via

immunohistochemie. Er zijn een aantal verklaringen mogelijk voor deze discrepantie tussen

de expressie op genniveau en eiwitniveau. Zo kan dit veroorzaakt worden door

posttranscriptionele regulatie van het mRNA. Ook een verschil in de turnover rate tussen het

eiwit en het mRNA kan hier aan de basis liggen [60]. Daarnaast moet ook opgemerkt worden

dat, hoewel de expressie van collageen II een sterke toename vertoonde op dag 21 (124-fold),

deze verhoging slechts relatief is aangezien de uitgangswaarde van collageen II expressie in

de fibrochondrocyten van P3 zeer laag is. Het is mogelijk dat de hoeveelheid collageen II die

geëxpresseerd wordt onder de detectielimiet valt van het gevolgde immunohistochemisch

protocol.

De histochemische kleuringen waarmee de GAGs in de ECM gevisualiseerd kunnen worden,

geven een goed beeld van de evolutie van de ECM tijdens de 21 dagen cultuurperiode. Voor

de alciaanblauw kleuring is er een goede overeenkomst met de GAG bepaling. Zo is er een

toename in intensiteit van de kleuring op dag 14 en dag 21 voor de micro-aggregaten

gecultiveerd bij 5% O2 en op dag 21 voor deze bij 21% O2. De toluïdineblauw kleuring

resulteert eveneens op deze tijdstippen in metachromasie, wat wijst op een dense stapeling

van de GAGs. De toenemende aanwezigheid van GAGs in de micro-aggregaten en bijgevolg

ook de verhoging in ECM suggereert een positieve evolutie in de richting van redifferentiatie.

44

4.3 Micro-aggregaten ingekapseld in een collageen I hydrogel

In een derde fase van het onderzoek werden micro-aggregaten, die na vier dagen in de agarose

microchips gevormd waren, ingekapseld in een collageen I hydrogel om het effect hiervan op

viabiliteit en functionaliteit te bestuderen. Door het gebruik van een hydrogel wordt een

driedimensionale omgeving nagebootst, waardoor veronderstelt kan worden dat dit een

positief effect zal hebben op het fenotype van de micro-aggregaten. Opnieuw werden de

micro-aggregaten gedurende 21 dagen in cultuur gehouden. Aangezien in de tweede fase van

het onderzoek een cultuur in chondrogeen medium en bij 5% O2 het beste effect op

redifferentiatie had, werden deze condities geselecteerd voor cultuur van de micro-aggregaten

in de hydrogel.

Via RT-qPCR werd opnieuw de expressie van collageen I, collageen II, aggrecan en Sox-9

bepaald en uitgedrukt als een fold change ten opzichte van de monolayer controle (P3). De

expressie van de kraakbeenmerkers collageen II, aggrecan en Sox-9 nam significante toe in de

loop van de tijd met de hoogste expressie op dag 21. Dit resultaat is consistent met de studie

van Moreira Teixeira et al. waar micro-aggregaten van chondrocyten ingekapseld werden in

een hydrogel op basis van dextraan [54]. In tegenstelling tot de micro-aggregaten in de

microchips, is de expressie van collageen I in de micro-aggregaten in de hydrogel niet

verhoogd op dag 7 en dag 14. Dit is mogelijks te verklaren door een verzadigingseffect zoals

ook beschreven in de studie van Gunja et al.[27]. In hun onderzoek werd bestudeerd of een

oppervlak met daarop een collageen I coating een positief effect had op de redifferentiatie van

fibrochondrocyten. Er werd vastgesteld dat de expressie van collageen I tijdens cultuur op de

collageen I coating niet toenam. Dit werd toegeschreven aan de aanwezigheid van integrines

op het oppervlak van de fibrochondrocyten die collageen I in de omgeving kunnen aanvoelen.

De integrines kunnen vervolgens een signaal naar de nucleus sturen om de expressie van

collageen I neer te reguleren. Doordat de micro-aggregaten in onze experimenten ingekapseld

werden in een collageen I hydrogel, is het aannemelijk dat eenzelfde mechanisme geactiveerd

werd met een lage expressie van collageen I tot gevolg.

45

5 Conclusie

Uit dit onderzoek kan afgeleid worden dat fibrochondrocyten na monolayer expansie hun

capaciteit tot redifferentiatie niet verliezen. Wanneer gededifferentieerde fibrochondrocyten

gecultiveerd worden in de vorm van micro-aggregaten kunnen de eigenschappen positief

beïnvloed worden. Door gebruik te maken van agarose microchips kunnen bovendien op een

zeer reproduceerbare manier en in high throughput micro-aggregaten met een hoge

uniformiteit bekomen worden.

De condities waaronder redifferentiatie geïnduceerd wordt, hebben een belangrijke invloed op

de finale uitkomst. Wanneer alle resultaten naast elkaar gelegd worden, kan in eerste instantie

gesteld worden dat TGF-β1 noodzakelijk is voor de vorming van stabiele aggregaten. Verdere

analyse van deze micro-aggregaten wijst op een positief effect van een lage zuurstofspanning.

De micro-aggregaten gecultiveerd bij 5% O2 zijn niet alleen groter, ze vertonen ook een

hogere GAG productie en een verhoogde expressie van de kraakbeenmerkers collageen II,

aggrecan en Sox-9 die grotendeels bevestigd werd door de immunohistochemische kleuringen.

De inkapseling van de micro-aggregaten in een collageen I hydrogel leidde eveneens tot een

verhoogde expressie van collageen II, aggrecan en Sox-9 wat erop wijst dat redifferentiatie

onder deze condities mogelijk is. Verdere analyse aan de hand van immunohistochemie en

bepaling van de GAG productie is noodzakelijk om dit resultaat te kunnen bevestigen. Door

tijdsgebrek kon dit echter niet tijdens het verloop van deze masterproef uitgevoerd worden.

Voor tissue engineering van de meniscus is nu eenmaal een hoog celaantal vereist, waardoor

de eerste stap waarin fibrochondrocyten in monolayer geëxpandeerd worden onoverkomelijk

is. Uit de experimenten uitgevoerd tijdens deze masterproef kan echter afgeleid worden dat de

vorming van micro-aggregaten mogelijkheden biedt om als intermediaire stap tussen

monolayer expansie en hydrogel inkapseling te dienen. Indien redifferentiatie in een hydrogel

succesvol blijkt, kan het gebruik van een hydrogel in combinatie met een hoog aantal

uniforme micro-aggregaten perspectieven bieden voor de vorming van grotere constructen

door middel van bioplotting. Hierdoor zou een volgende stap in het onderzoek gezet kunnen

worden richting een modulaire opbouw van meniscus constructen.

46

6 Referenties

1. Makris EA, Hadidi P, Athanasiou KA (2011). The knee meniscus: Structure–function, pathophysiology,

current repair techniques, and prospects for regeneration. Biomaterials 32: 7411-7431.

2. Nakata K, Shino K, Hamada M, Mae T, Miyama T, Shinjo H, Horibe S, Tada K, Ochi T, Yoshikawa H

(2001). Human meniscus cell: characterization of the primary culture and use for tissue engineering.

Clinical orthopaedics and related research: S208-218.

3. Sanchez-Adams J, Athanasiou KA (2009). The Knee Meniscus: A Complex Tissue of Diverse Cells. Cell

Mol Bioeng 2: 332-340.

4. Cheung HS (1987). Distribution of type I, II, III and V in the pepsin solubilized collagens in bovine

menisci. Connective tissue research 16: 343-356.

5. Verdonk PCM, Forsyth RG, Wang J, Almqvist KF, Verdonk R, Veys EM, Verbruggen G (2005).

Characterisation of human knee meniscus cell phenotype. Osteoarthritis and Cartilage 13: 548-560.

6. Beaufils P (2010). The Meniscus: Springer; 407 p.

7. Clayton RA, Court-Brown CM (2008). The epidemiology of musculoskeletal tendinous and ligamentous

injuries. Injury 39: 1338-1344.

8. DeHaven KE (1999). Meniscus repair. The American journal of sports medicine 27: 242-250.

9. Berthiaume MJ, Raynauld JP, Martel-Pelletier J, Labonte F, Beaudoin G, Bloch DA, Choquette D, Haraoui

B, Altman RD, Hochberg M, Meyer JM, Cline GA, Pelletier JP (2005). Meniscal tear and extrusion are

strongly associated with progression of symptomatic knee osteoarthritis as assessed by quantitative

magnetic resonance imaging. Annals of the rheumatic diseases 64: 556-563.

10. Roos H, Lauren M, Adalberth T, Roos EM, Jonsson K, Lohmander LS (1998). Knee osteoarthritis after meniscectomy: prevalence of radiographic changes after twenty-one years, compared with matched

controls. Arthritis and rheumatism 41: 687-693.

11. Pengas IP, Assiotis A, Nash W, Hatcher J, Banks J, McNicholas MJ (2012). Total meniscectomy in

adolescents: a 40-year follow-up. The Journal of bone and joint surgery British volume 94: 1649-1654.

12. Van der Bracht H, Verdonk R, Verbruggen G, Elewaut D, Verdonk P (2007). Cell-based meniscus tissue

engineering. Topics in Tissue Engineering 3.

13. McDermott ID (2010). What tissue bankers should know about the use of allograft meniscus in

orthopaedics. Cell and tissue banking 11: 75-85.

14. Wirth CJ, Peters G, Milachowski KA, Weismeier KG, Kohn D (2002). Long-term results of meniscal

allograft transplantation. The American journal of sports medicine 30: 174-181.

15. Tucker B, Khan W, Al-Rashid M, Al-Khateeb H (2012). Tissue engineering for the meniscus: a review of

the literature. The open orthopaedics journal 6: 348-351.

16. Rodkey WG, DeHaven KE, Montgomery WH, 3rd, Baker CL, Jr., Beck CL, Jr., Hormel SE, Steadman JR,

Cole BJ, Briggs KK (2008). Comparison of the collagen meniscus implant with partial meniscectomy. A

prospective randomized trial. The Journal of bone and joint surgery American volume 90: 1413-1426.

17. Verdonk P, Beaufils P, Bellemans J, Djian P, Heinrichs EL, Huysse W, Laprell H, Siebold R, Verdonk R

(2012). Successful treatment of painful irreparable partial meniscal defects with a polyurethane scaffold:

two-year safety and clinical outcomes. The American journal of sports medicine 40: 844-853.

47

18. Stone KR, Steadman JR, Rodkey WG, Li ST (1997). Regeneration of meniscal cartilage with use of a

collagen scaffold. Analysis of preliminary data. The Journal of bone and joint surgery American volume 79:

1770-1777.

19. Stone KR, Rodkey WG, Webber RJ, McKinney L, Steadman JR (1990). Future directions. Collagen-based

prostheses for meniscal regeneration. Clinical orthopaedics and related research: 129-135.

20. Stone KR, Rodkey WG, Webber R, McKinney L, Steadman JR (1992). Meniscal regeneration with

copolymeric collagen scaffolds. In vitro and in vivo studies evaluated clinically, histologically, and biochemically. The American journal of sports medicine 20: 104-111.

21. Vrancken AC, Buma P, van Tienen TG (2013). Synthetic meniscus replacement: a review. International

orthopaedics 37: 291-299.

22. Verdonk R, Verdonk P, Huysse W, Forsyth R, Heinrichs EL (2011). Tissue ingrowth after implantation of

a novel, biodegradable polyurethane scaffold for treatment of partial meniscal lesions. The American

journal of sports medicine 39: 774-782.

23. Tienen TG, Heijkants RG, de Groot JH, Pennings AJ, Schouten AJ, Veth RP, Buma P (2006). Replacement

of the knee meniscus by a porous polymer implant: a study in dogs. The American journal of sports medicine 34: 64-71.

24. Viola J, Lal B, Grad O. The Emergence of Tissue Engineering as a Research Field. The National Science

Foundation, 2003.

25. Kock L, van Donkelaar CC, Ito K (2012). Tissue engineering of functional articular cartilage: the current

status. Cell Tissue Res 347: 613-627.

26. Buma P, Ramrattan NN, van Tienen TG, Veth RP (2004). Tissue engineering of the meniscus. Biomaterials

25: 1523-1532.

27. Gunja NJ, Athanasiou KA (2007). Passage and reversal effects on gene expression of bovine meniscal

fibrochondrocytes. Arthritis research & therapy 9: R93.

28. Darling EM, Athanasiou KA (2005). Rapid phenotypic changes in passaged articular chondrocyte

subpopulations. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society

23: 425-432.

29. Tan GK, Dinnes DL, Myers PT, Cooper-White JJ (2011). Effects of biomimetic surfaces and oxygen

tension on redifferentiation of passaged human fibrochondrocytes in 2D and 3D cultures. Biomaterials 32:

5600-5614.

30. Yoo JU, Barthel TS, Nishimura K, Solchaga L, Caplan AI, Goldberg VM, Johnstone B (1998). The chondrogenic potential of human bone-marrow-derived mesenchymal progenitor cells. The Journal of bone

and joint surgery American volume 80: 1745-1757.

31. Boeuf S, Richter W (2010). Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing

factors. Stem cell research & therapy 1: 31.

32. Estes BT, Guilak F (2011). Three-dimensional culture systems to induce chondrogenesis of adipose-derived

stem cells. Methods in molecular biology 702: 201-217.

33. Markway BD, Tan GK, Brooke G, Hudson JE, Cooper-White JJ, Doran MR (2010). Enhanced

Chondrogenic Differentiation of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Low Oxygen Environment Micropellet Cultures. Cell Transplant 19: 29-42.

34. Puetzer JL, Petitte JN, Loboa EG (2010). Comparative Review of Growth Factors for Induction of Three-

Dimensional In Vitro Chondrogenesis in Human Mesenchymal Stem Cells Isolated from Bone Marrow and

Adipose Tissue. Tissue Eng Part B-Rev 16: 435-444.

48

35. Cui X, Hasegawa A, Lotz M, D'Lima D (2012). Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal

stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnology and

bioengineering 109: 2369-2380.

36. Saliken DJ, Mulet-Sierra A, Jomha NM, Adesida AB (2012). Decreased hypertrophic differentiation

accompanies enhanced matrix formation in co-cultures of outer meniscus cells with bone marrow

mesenchymal stromal cells. Arthritis research & therapy 14: R153.

37. Adesida AB, Grady LM, Khan WS, Hardingham TE (2006). The matrix-forming phenotype of cultured human meniscus cells is enhanced after culture with fibroblast growth factor 2 and is further stimulated by

hypoxia. Arthritis research & therapy 8: R61.

38. Stewart K, Pabbruwe M, Dickinson S, Sims T, Hollander AP, Chaudhuri JB (2007). The effect of growth

factor treatment on meniscal chondrocyte proliferation and differentiation on polyglycolic acid scaffolds.

Tissue engineering 13: 271-280.

39. Natsu-Ume T, Majima T, Reno C, Shrive NG, Frank CB, Hart DA (2005). Menisci of the rabbit knee

require mechanical loading to maintain homeostasis: cyclic hydrostatic compression in vitro prevents

derepression of catabolic genes. Journal of orthopaedic science : official journal of the Japanese

Orthopaedic Association 10: 396-405.

40. Gunja NJ, Athanasiou KA (2010). Effects of hydrostatic pressure on leporine meniscus cell-seeded PLLA

scaffolds. Journal of biomedical materials research Part A 92: 896-905.

41. Puetzer JL, Ballyns JJ, Bonassar LJ (2012). The effect of the duration of mechanical stimulation and post-

stimulation culture on the structure and properties of dynamically compressed tissue-engineered menisci.

Tissue engineering Part A 18: 1365-1375.

42. Aufderheide AC, Athanasiou KA (2006). A direct compression stimulator for articular cartilage and

meniscal explants. Annals of biomedical engineering 34: 1463-1474.

43. Adesida AB, Mulet-Sierra A, Laouar L, Jomha NM (2012). Oxygen tension is a determinant of the matrix-forming phenotype of cultured human meniscal fibrochondrocytes. PloS one 7: e39339.

44. Croutze R, Jomha N, Uludag H, Adesida A (2013). Matrix forming characteristics of inner and outer

human meniscus cells on 3D collagen scaffolds under normal and low oxygen tensions. BMC

musculoskeletal disorders 14: 353.

45. Berneel E, Desmet T, Declercq H, Dubruel P, Cornelissen M (2012). Double protein-coated poly-epsilon-

caprolactone scaffolds: successful 2D to 3D transfer. Journal of biomedical materials research Part A 100:

1783-1791.

46. Rowland CR, Little D, Guilak F (2012). Factors influencing the long-term behavior of extracellular matrix-

derived scaffolds for musculoskeletal soft tissue repair. Journal of long-term effects of medical implants 22: 181-193.

47. Parenteau-Bareil R, Gauvin R, Berthod F (2010). Collagen-Based Biomaterials for Tissue Engineering

Applications. Materials 3: 1863-1887.

48. Gruber HE, Mauerhan D, Chow Y, Ingram JA, Norton HJ, Hanley EN, Jr., Sun Y (2008). Three-

dimensional culture of human meniscal cells: extracellular matrix and proteoglycan production. BMC

biotechnology 8: 54.

49. Puetzer JL, Bonassar LJ (2013). High density type I collagen gels for tissue engineering of whole menisci.

Acta Biomater 9: 7787-7795.

50. Nichol JW, Khademhosseini A (2009). Modular tissue engineering: engineering biological tissues from the

bottom up. Soft Matter 5: 1312-1319.

49

51. Song JJ, Aswad R, Kanaan RA, Rico MC, Owen TA, Barbe MF, Safadi FF, Popoff SN (2007). Connective

tissue growth factor (CTGF) acts as a downstream mediator of TGF-beta1 to induce mesenchymal cell

condensation. Journal of cellular physiology 210: 398-410.

52. Arnott JA, Lambi AG, Mundy C, Hendesi H, Pixley RA, Owen TA, Safadi FF, Popoff SN (2011). The role

of connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) in skeletogenesis. Critical reviews in eukaryotic gene

expression 21: 43-69.

53. Babur BK, Ghanavi P, Levett P, Lott WB, Klein T, Cooper-White JJ, Crawford R, Doran MR (2013). The interplay between chondrocyte redifferentiation pellet size and oxygen concentration. PloS one 8: e58865.

54. Moreira Teixeira LS, Leijten JC, Sobral J, Jin R, van Apeldoorn AA, Feijen J, van Blitterswijk C, Dijkstra

PJ, Karperien M (2012). High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage

formation in vitro and in vivo. European cells & materials 23: 387-399.

55. Robins JC, Akeno N, Mukherjee A, Dalal RR, Aronow BJ, Koopman P, Clemens TL (2005). Hypoxia

induces chondrocyte-specific gene expression in mesenchymal cells in association with transcriptional

activation of Sox9. Bone 37: 313-322.

56. Adesida AB, Grady LM, Khan WS, Millward-Sadler SJ, Salter DM, Hardingham TE (2007). Human meniscus cells express hypoxia inducible factor-1alpha and increased SOX9 in response to low oxygen

tension in cell aggregate culture. Arthritis research & therapy 9: R69.

57. Lafont JE, Talma S, Hopfgarten C, Murphy CL (2008). Hypoxia promotes the differentiated human

articular chondrocyte phenotype through SOX9-dependent and -independent pathways. The Journal of

biological chemistry 283: 4778-4786.

58. Kurz B, Domm C, Jin M, Sellckau R, Schunke M (2004). Tissue engineering of articular cartilage under the

influence of collagen I/III membranes and low oxygen tension. Tissue engineering 10: 1277-1286.

59. Grigolo B, Lisignoli G, Piacentini A, Fiorini M, Gobbi P, Mazzotti G, Duca M, Pavesio A, Facchini A (2002). Evidence for redifferentiation of human chondrocytes grown on a hyaluronan-based biomaterial

(HYAff 11): molecular, immunohistochemical and ultrastructural analysis. Biomaterials 23: 1187-1195.

60. Caron MM, Emans PJ, Coolsen MM, Voss L, Surtel DA, Cremers A, van Rhijn LW, Welting TJ (2012).

Redifferentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes: comparison of 2D and 3D cultures.

Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society 20: 1170-1178.

I

7 Addendum

Bijlage I: Samenstelling Ringer

1 liter gedestilleerd water

9 g NaCL

0,42 g CaCl2

0,24 g KCl

Bijlage II: Samenstelling FC medium

DMEM/F12 medium (Gibco® by Life Technologies; Cat No. 31330-038)

10 % FKS (Life Technologies; Cat No. 10270-106)

1% PS (Life Technologies; Cat No. 15140-122)

1% L-glutamine (Life Technologies; Cat No. 25030-024)

Bijlage III: Protocol Maken van microchips

Breng de moulds over van de 50 ml buis met ethanol naar de 2 middelste wells van

een 6-well plaat

Laat de moulds drogen aan de lucht zodat alle ethanol kan verdampen

Weeg 3 g agarose af

Voeg 97 ml PBS toe en laat opkoken tot een heldere vloeistof bekomen wordt

Voeg 7 à 8 ml agarose oplossing toe aan elke well waarin zich een mould bevindt

Centrifugeer de plaat gedurende 1 minuut aan 3000 RPM

Laat de plaat minstens 10 minuten afkoelen op 4°C

Verwijder de chips uit de wells met behulp van een steriel pincet

Doe steriele handschoenen aan

Verwijder de moulds uit de chips en breng ze over naar de 50 ml buis met ethanol

Punch de chip met behulp van de puncher

Breng de microchips over naar een 12-well plaat

Voeg aan elke microchip 1 ml PBS toe

Centrifugeer de plaat gedurende 1 minuut aan 2000 RPM

Bewaar de plaat bij 4°C tot verder gebruik

II

Bijlage IV: Samenstelling PBS

2 liter gedestilleerd water

3,56g Na2HPO4

0,84 g KH2P04

14,4 g NaCL

Oplossing op pH 7,2 brengen

Bijlage V: Samenstelling neutraal gebufferde formol

100 ml formaldehyde 35% (VWR®; UN.2209)

1,78 g Na2HPO4 (VWR®; 1.06580)

0,42 g KH2PO4 (VWR®; 1.04873)

KH2PO4 toevoegen tot pH 6,9

Fibrochondrocyt aggregaten: effect van lage zuurstofspanning...

Documents

Transcript of Fibrochondrocyt aggregaten: effect van lage zuurstofspanning...