Evaluatie van meerdere Real-Time PCR voor de …...Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen...

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2015 – 2016

Evaluatie van meerdere Real-Time PCR voor de moleculaire

detectie van bacteriële gastro-enteritis aan de hand van

TaqMan Array Cards

Evelyne Duthoo

Promotor: Prof. Dr. Sc. Van Landschoot Anita

Tutor: Dr. Reynders Marijke en Dr. Sc. Descheemaeker Patrick

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van

Master of Science in de industriële wetenschappen: biochemie

AUTEURSRECHTELIJKE BESCHERMING

“De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te

stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt

onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de

verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze

scriptie.”

“The author and the promoter give the permission to use this thesis for consultation and to

copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more

specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis”.

3 juni 2016

Auteur Evelyne Duthoo

Promotor Prof. Dr. Sc. Van Landschoot Anita

Tutor Dr. Sc. Descheemaeker Patrick

Tutor Dr. Reynders Marijke

WOORD VOORAF

Bij het schrijven van dit eindwerk wil ik graag nog enkele mensen bedanken die een cruciale

rol hebben gespeeld in het tot stand brengen van deze masterproef. In het bijzonder mijn

promotoren Dr. Sc. Patrick Descheemaeker en Dr. Marijke Reynders, bij wie ik eindeloos

terecht kon voor zowel begeleiding als inzicht.

Daarnaast wil ik ook de mensen van het labo moleculaire diagnostiek bedanken, Sofie Maton,

Thomas Van Landschoot, Ellen Van Neder en Charlotte Vercamer, die steeds klaar stonden

voor een extra woordje uitleg tijdens het onderzoek.

Graag wil ik ook mijn interne promotor Dr. Sc. Anita Van Landschoot bedanken voor de

begeleiding doorheen het academiejaar.

Tot slot bedankt aan mijn familie voor de morele steun tijdens de voorbije studiejaren.

ABSTRACT

Gastro-enteritis is een vaak voorkomend probleem en kan bij kinderen, ouderen en personen

met een verzwakt immuunsysteem zelfs tot een fataal einde leiden. Vaak neemt de

conventionele bacteriologische diagnostiek te veel tijd in beslag en is deze niet gevoelig

genoeg. Daardoor is het belangrijk om tot een screeningsmethode te komen waarbij zowel de

parasitaire, virale en bacteriële veroorzakers van gastro-enteritis met slechts 1 enkele test

kunnen gedetecteerd worden met behulp van een TaqMan Array Card (TAC) op basis van

Real-Time PCR.

In deze masterproef stonden de bacteriële intestinale pathogenen centraal en werd er

onderzoek gedaan naar species specifieke targetgenen voor het opsporen van toxinogene

Clostridium difficile, Salmonella spp., Campylobacter coli en Campylobacter jejuni, Shigella

spp., Yersinia spp. en diaregene Escherichia coli. Voor deze genen werden primer- en

probesequenties gegenereerd, gevalideerd en geoptimaliseerd die in een Real-time PCR

reactie de betreffende pathogene species opsporen. Deze optimalisatie werd eerst enkel op

de primers uitgevoerd met de SYBR Select Mastermix samen met een smeltcurveanalyse.

Daarna werd overgegaan op evaluatie met een specifieke TaqMan Real-Time PCR met de

geselecteerde primers in combinatie met een probe van Minor Groove Binders (MGB) en de

TaqMan Fast Virus 1-step Mastermix. Beide evaluaties werden uitgevoerd op zowel

reinculturen als fecale stalen.

Na optimalisatie werden de initiele 63 primerparen en 23 probes gereduceerd tot 20 functionele

primer-probe-combinaties. Deze zullen gelyofiliseerd worden op de TAC, waarop verdere

validatie kan worden uitgevoerd. Het op punt stellen van de TAC voor bacteriële intestinale

pathogenen is dus tot op heden nog niet afgerond.

ENGLISH ABSTRACT

Gastro-enteritis is a frequently occurring problem which can be fatal when it develops within

children, the elderly or immunocompromised adults. Often the conventional bacteriological

diagnosis is too time consuming and has a low sensitivity. Therefore, it is important to develop

a new screening method that tests for parasitic, viral and bacterial initiators of the disease, all

in one test. This can be done, using a TaqMan Array Card (TAC) based on Real-Time PCR.

This master thesis only includes the bacterial pathogens. The first stage of the research

included the selection of species-specific target genes of toxinogenic Clostridium difficile,

Salmonella spp., Campylobacter coli and Campylobacter jejuni, Shigella spp., Yersinia spp.

and diarrheagenic Escherichia coli. Primers and probes were generated for each of these

genes, which were subsequently validated and optimized in a Real-Time PCR reaction. The

first optimisation was performed on the primers using the SYBR Select Mastermix and an

additional meltcurve analysis. Afterwards, the TaqMan Fast Virus 1-Step Mastermix was used

for further specific evaluation of the primers in combination with a probe of Minor Groove

Binders (MGB). All primers and probes were analysed on both axenic as faecal samples.

At the end of the optimisation the initially selected 63 primerpares and 23 probes were reduced

to 20 functional primer-probe combinations. These will be spotted on the TAC by lyophilisation.

Further validation of the primers and probes will be performed with the TAC. Consequently,

the development of the TAC for the examined bacterial pathogens has not yet been completed.

INHOUDSOPGAVE

Afkortingen ............................................................................................................................................................. 9

Figuren .................................................................................................................................................................. 10

Tabellen ................................................................................................................................................................. 11

Inleiding ................................................................................................................................................................. 13

1. Literatuurstudie................................................................................................................................................. 14

1.1 Bacteriële gastro-enteritis: transmissie ...................................................................................................... 14

1.2 Bacteriële gastro-enteritis: mechanismen .................................................................................................. 15

1.3 Bacteriële gastro-enteritis: oorzaken .......................................................................................................... 18

1.4 Geselecteerde pathogenen ......................................................................................................................... 19

1.4.1 Clostridium difficile ............................................................................................................................... 19

1.4.2 Salmonella ............................................................................................................................................ 20

1.4.3 Campylobacter ..................................................................................................................................... 22

1.4.4 Shigella ................................................................................................................................................. 23

1.4.5 Yersinia ................................................................................................................................................. 24

1.4.6 Escherichia coli ..................................................................................................................................... 25

1.5 PCR doelwitgenen ....................................................................................................................................... 32

1.5.1 C. difficile doelwitgenen ....................................................................................................................... 32

1.5.2 Salmonella doelwitgenen ..................................................................................................................... 33

1.5.3 Campylobacter doelwitgenen .............................................................................................................. 34

1.5.4 Shigella doelwitgenen .......................................................................................................................... 34

1.5.5 Yersinia doelwitgenen .......................................................................................................................... 34

1.5.6 E. coli doelwitgenen ............................................................................................................................. 35

1.6 Bespreking van de methoden voor het onderzoek ..................................................................................... 36

1.6.1 DNA-extractie ....................................................................................................................................... 36

1.6.2 Real-Time PCR ...................................................................................................................................... 37

1.6.3 Gelelektroforese .................................................................................................................................. 42

1.6.4 DNA sequentiebepaling ........................................................................................................................ 43

2. Materiaal en methoden .................................................................................................................................... 45

2.1 Selectie van primers en probes ................................................................................................................... 45


2.1.2 Salmonella ............................................................................................................................................ 45

2.1.3 Campylobacter ..................................................................................................................................... 46

2.1.4 Shigella ................................................................................................................................................. 46

2.1.5 Yersinia ................................................................................................................................................. 46


2.2 Reinculturen ................................................................................................................................................ 48

2.3 Vircell DNA controles .................................................................................................................................. 49

2.4 Fecesstalen .................................................................................................................................................. 49

2.5 Mastermixen ............................................................................................................................................... 50

2.5.1 SYBR® Select Master Mix...................................................................................................................... 50

2.5.2 TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix ............................................................................................... 51

2.6 DNA-extractie .............................................................................................................................................. 51

2.6.1 Benodigdheden .................................................................................................................................... 51

2.6.2 Werkwijze ............................................................................................................................................. 51

2.7 Real-Time PCR met SYBR Select Mastermix + smeltcurveanalyse .............................................................. 52

2.8 Efficiëntiebepaling ....................................................................................................................................... 53

2.9 Real-Time PCR met FAST Mastermix ........................................................................................................... 55

2.10 Gelelektroforese ....................................................................................................................................... 56

2.11 DNA sequentiebepaling ............................................................................................................................. 57

2.11.1 Benodigdheden .................................................................................................................................. 57

2.11.2 Werkwijze ........................................................................................................................................... 57

3. Resultaten en bespreking .................................................................................................................................. 59

3.1 Algemeen: Strategie .................................................................................................................................... 59

3.2 Selectie primers en probes .......................................................................................................................... 61


3.2.2 Salmonella ............................................................................................................................................ 67

3.2.3 Campylobacter ..................................................................................................................................... 69

3.2.4 Shigella. ................................................................................................................................................ 74

3.2.5 Yersinia ................................................................................................................................................. 75


3.4 Elektroforese ............................................................................................................................................... 82

3.5 DNA sequenering ........................................................................................................................................ 84

3.6 Kwaliteitscontrole ....................................................................................................................................... 85

4. Samenvattend Besluit ....................................................................................................................................... 86

5. Bronnenlijst ....................................................................................................................................................... 89

6. Bijlagen .............................................................................................................................................................. 95

AFKORTINGEN

A Adenine

A/E Attaching and Effacing

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

C Cytosine

CDI Clostridium difficile infectie

Ct Treshold cycle

DAEC Diffuus-adhererende E. coli

DEC Diarree veroorzakende E. coli

ddNTP Dideoxyribonucleotide trifosfaat

dNTP Deoxyribonucleotide trifosfaat

dsDNA Dubbelstrengig DNA

EAEC Enteroaggregatieve E. coli

EIA Enzyme immunoassays

EIEC Enteroinvasieve E. coli

EPEC Enteropathogene E. coli

ETEC Enterotoxigene E. coli

fw Forward

G Guanine

GDH Glutamaat dehydrogenase

GITC Guanidium isothiocyanaat

GTC Guanidium thiocyanaat

HC Hemorragisch colitis

HV Sterk virulent

HUS Hemolytisch-uremisch syndroom

LT Hitte labiele enterotoxines

LV Zwak virulent

MGB Minor Groove Binders

NTS Niet-typhoïdale Salmonella

PaLoc Pathogeniciteit locus

PCR Polymerase Chain Reaction

qPCR Real-Time PCR

PDV Phocine distemper virus

PMC Pseudomembraneuze colitis

rv Reverse

SCV Salmonella bevattende vacuolen

SDS Sodium dodecyl sulfaat

ssDNA Enkelstrengig DNA

ST Hitte stabiele enterotoxines

STEC Shiga-toxine producerend E. coli

SHV Seal herpes virus

T Thymine

TAC TaqMan Array Card

TAE Trix-Acetaat-EDTA

TBE Tris-boraat-EDTA

Tm Smelttemperatuur

VBNC Viable But Non-Culturable

VTEC Verotoxine producerend E. coli

ΔG Vrije Gibbs energie

FIGUREN

Figuur 1: Schatting van de sterftecijfers van kinderen jonger dan 5 jaar veroorzaakt door diarree (Croxen et al,

2013).

Figuur 2: Algemeen overzicht van potentiële transmissiebronnen, specifiek voor pathogene E. coli (Croxen et al,

2013).

Figuur 3: De verschillende pathogenesestadia van EAEC (Hebbelstrup Jensen et al, 2014).

Figuur 4: Pathogenese mechanisme van Salmonella enterica serovar Typhimurium (Fabrega et al, 2013).

Figuur 5: De totale frequentie van het voorkomen van gedetecteerde pathogenen (Spina et al, 2015).

Figuur 6: Clostridium difficile (Centers for Disease Control and Prevention, 2015).

Figuur 7: Salmonella (Centers for Disease Control and Prevention, 2014).

Figuur 8: Campylobacter (Centers for Disease Control and Prevention, 2013)

Figuur 9: Shigella (Centers for Disease Control and Prevention, 2015).

Figuur 10: Yersinia enterocolitica (Elika, 2013).

Figuur 11: Escherichia coli (Centers for Disease Control and Prevention, 2015).

Figuur 12: Voorstelling van het vasthechten van E. coli in het spijsverteringsstelsel (Croxen et al, 2013).

Figuur 13: Genetische map van PaLoc in C. difficile. (Carter et al, 2012).

Figuur 14: Theoretische voorstelling van een real-time PCR curve (Tawe,2014).

Figuur 15: Structuur SYBR Green I (Maervoet, 2014).

Figuur 16: SYBR Green I mechanisme (Tawe, 2014).

Figuur 17: Smeltcurve-analyse voor een homozygoot wild type, homozygote mutant en een heterozygoot

(Hoffman et al, 2007).

Figuur 18: TaqMan probe mechanisme (Tawe, 2014).

Figuur 19: Bekomen resultaat bij DNA sequenering volgens Sanger met fluorescent gelabelde ddNTPs (Fei, 2014).

Figuur 20: Fragment van een DNA sequentie file (GenSeq, 2015).

Figuur 21: PCR cycli voor real-time PCR met SYBR select mastermix + smeltcurveanalyse

Figuur 22: Grafische voorstelling efficiëntiebepaling.

Figuur 23: PCR cycli voor real-time PCR met FAST mastermix

Figuur 24: Voorbeeld van een mooie smeltcurve bij verschillende inputconcentratie van het targetgen.

Figuur 25: Voorbeeld van smeltcurve met aspecifieke amplificatie bij verschillende inputconcentraties van het

targetgen.

Figuur 26: Resultaat elektroforese van Campylobacter en Yersinia.

Figuur 27: Resultaat elektroforese ter voorbereiding van sequenering.

Figuur 28: Schematische voorstelling van de gewenste te bekomen indeling van de TaqMan array kaart.

TABELLEN

Tabel 1: Bacteriële veroorzakers van gastro-enteritis die verder zullen besproken worden in dit eindwerk.

Tabel 2: Overzicht van intestinale E. coli pathogenen (Croxen et al, 2013).

Tabel 3: Te testen primers Clostridium difficile

Tabel 4 : Te testen primers Salmonella spp.

Tabel 5: Te testen primers Campylobacter.

Tabel 6: Te testen primers Shigella.

Tabel 7: Te testen primers Yersinia spp.

Tabel 8: Te testen primers Escherichia coli.

Tabel 9: Overzicht reinculturen Clostridium difficile en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.

Tabel 10: Overzicht reinculturen Salmonella en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.

Tabel 11: Overzicht reinculturen Campylobacter en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.

Tabel 12: Overzicht reinculturen Shigella en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.

Tabel 13: Overzicht reinculturen Yersinia en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.

Tabel 14: Weergave vircell DNA controles en de genen waarvoor ze positief/negatief zijn.

Tabel 15: Gebruikte fecesstalen.

Tabel 16: Bestanddelen SYBR® Select Master Mix (Life Technologies, 2015).

Tabel 17: Bestanddelen TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix (Thermofischer, 2012).

Tabel 18: Samenstelling PCR-mix voor 300 nm


Tabel 20: Fictieve waarden bepaling efficiëntie.

Tabel 21: Samenstelling PCR-mix met probe

Tabel 22: Temperatuursprofiel van het programma SEQ.

Tabel 23: Overzicht primers en probes C. difficile.

Tabel 24: Overzicht reinculturen Clostridium difficile en de genen waarvoor ze positief/negatief zijn.

Tabel 25: Ct-waarden C. difficile met bijbehorende efficiëntie.

Tabel 26: Bekomen efficiënties C. difficile uitgevoerd op reincultuur 901.

Tabel 27: Bekomen efficiënties C. difficile uitgevoerd op plasmides.

Tabel 28: Samenstelling reincultuur mengsels voor test op specificiteit.

Tabel 29: Gebruikte fecesstalen en de genen waarvoor ze verondersteld positief zijn.

Tabel 30: Overzicht primers en probes Salmonella spp.

Tabel 31: Resultaten functionaliteit Salmonella spp met primerconcentratie 1000 nM.

Tabel 32: Ct-waarden voor Salmonella met bijbehorende efficiëntie.

Tabel 33: Overzicht primers en probes Campylobacter spp.

Tabel 34: Resultaten functionaliteit Campylobacter spp met primerconcentratie 1000 nM.

Tabel 35: Resultaten voor functionaliteit in aanwezigheid van vreemd DNA voor Campylobacter.

Tabel 36: Bekomen efficiëntiewaarden voor Campylobacter, uitgevoerd op plasmides.

Tabel 37: Overzicht primers en probes Shigella spp.

Tabel 38: Overzicht primers en probes Yersinia spp.


Tabel 40: Bekomen efficiëntiewaarden voor E.coli.

Tabel 41: Overgebleven primerparen met hun probe

13

INLEIDING

Gastro-enteritis komt vaak voor en kan leiden tot verstoring van het metabolisme bij kinderen,

ouderen of bij mensen met een verzwakt immuunsysteem. Dit leidt nog steeds tot grote

medische problemen. Hierdoor is het nodig om een gevoelige detectiemethode op te stellen

die kan worden uitgevoerd op een snelle en nauwkeurige manier waardoor er vlug kan worden

overgegaan tot een juiste behandeling. Vaak is de conventionele diagnostiek te

arbeidsintensief, te langdurig en weinig gevoelig, waardoor het beter is gebruik te maken van

een moleculaire detectiemethode die een hogere gevoeligheid kent.

Het doel hierbij is dan ook om een gevoelige screeningsmethode te ontwikkelen waarbij alle

parasitaire, virale en bacteriële oorzaken van gastro-enteritis kunnen worden gedetecteerd

met behulp van een TaqMan Array Card (TAC). In dit onderzoek wordt er alleen gewerkt op

de bacteriële veroorzakers. Per pathogeen zal er gekozen worden om minstens twee genen

te detecteren. Voor deze targetgenen worden er op basis van de literatuur in totaal 63

primerparen ontwikkeld die tijdens dit onderzoek zullen worden geëvalueerd en

geoptimaliseerd naar functionaliteit, efficiëntie en specificiteit toe. Als eerste worden de

primers geoptimaliseerd met de SYBR Select Mastermix, waarbij er al een eerste selectie van

deze primerparen plaatsvindt. Daarna worden voor de geselecteerde primers TaqManprobes

van Minor Groove Binders (MGB) besteld en ook deze worden geoptimaliseerd, dit keer met

de TaqMan Fast Virus 1-step Mastermix. Hierbij kan een laatste selectie plaatsvinden, waarna

de geselecteerde primers en probes zullen worden gelyofyliseerd op de TAC. Daarna moet er

ook nog een validatie van deze TAC plaatsvinden.

Dit onderzoek begint met een literatuurstudie waarbij er informatie over de bacteriële

pathogenen verzameld wordt. Hierbij worden de algemene kenmerken van het pathogeen

besproken, net als het ziektebeeld die deze veroorzaken, de behandeling die kan worden

uitgevoerd en tot slot de doelwitgenen waarnaar gedetecteerd zal worden. Ook worden in deze

literatuurstudie de gebruikte technieken kort besproken. Dan worden de materialen die zullen

gebruikt worden beschreven in ‘Materiaal en methoden’, net als de methoden die gebruikt

worden tijdens het onderzoek. Hierna worden de resultaten van de optimalisatie van primers

en probes besproken met tot slot een algemeen besluit over deze nieuw ontwikkelde

screeningsmethode.

14

1. LITERATUURSTUDIE

Gastro-enteritis omvat de ontsteking van de mucosa van de maag, de dunne darm en/of de

dikke darm. Wanneer gastro-enteritis veroorzaakt wordt door virussen, bacteriën of parasieten

is ze besmettelijk, wat meestal het geval is. Daarnaast kan het ook veroorzaakt worden door

de inname van verdovende middelen en chemische giftige stoffen, die onder meer van metaal

afkomstig kunnen zijn of van plantaardige oorsprong. Gastro-enteritis kan leiden tot groot

ongemak, maar het elektrolyten- en vochtverlies dat hierdoor veroorzaakt wordt leidt bij

gezonde volwassen meestal niet tot verstoring van het metabolisme. Dit kan echter wel

ontstaan bij kinderen, ouderen of bij mensen met een verzwakt immuunsysteem. Wereldwijd

sterven zo’n 3 tot 6 miljoen kinderen jaarlijks aan infectieuze gastro-enteritis (Med-info, 2011).

In figuur 1 wordt kindersterfte door diarree voorgesteld op globaal vlak.

Figuur 1: Schatting van de sterftecijfers van kinderen jonger dan 5 jaar veroorzaakt door diarree, weergegeven

per land. Dit zijn de cijfers voor het jaar 2010. Deze kaart geeft weer dat de grootste mortaliteit in deze

leeftijdscategorie voorkomt in ontwikkelingslanden, voornamelijk in Centraal-Afrika en Zuid-Azië. (Croxen et al,

2013).

In deze masterproef worden enkel de bacteriële oorzaken van infectieuze gastro-enteritis

behandeld.

1.1 BACTERIËLE GASTRO-ENTERITIS: TRANSMISSIE

De bacteriële transmissie van gastro-enteritis wordt schematisch voorgesteld in figuur 2. Deze

is specifiek voor pathogene E. coli maar hetzelfde mechanisme is toepasbaar voor alle verder

besproken organismen. Pathogene stammen kunnen gevonden worden in dierenstallen, waar

het aan andere dieren kan worden doorgegeven. Feces afkomstig van deze dieren kunnen

voedsel, irrigatiewater en drinkwater besmetten, waardoor het bij de mens kan terechtkomen

15

door consumptie van dit besmet voedsel of water na onvoldoende behandeling. Daarnaast

kan er ook secundaire transmissie zijn tussen mensen onderling (Croxen et al, 2013).

Figuur 2: Algemeen overzicht van potentiële transmissiebronnen, specifiek voor pathogene E. coli. STEC staat voor

shiga toxine producerend E. coli , ETEC voor enterotoxigene E. coli, EAEC voor enteroaggregatieve E. coli, EIEC

voor enteroinvasieve E. coli, EPEC voor enteropathogene E. coli en aEPEC voor atypische EPEC (Croxen et al, 2013).

1.2 BACTERIËLE GASTRO-ENTERITIS: MECHANISMEN

Doordat entero-pathogenen in staat zijn om zich vast te hechten aan het intestinaal epithelium,

dit te koloniseren, in sommige gevallen de gastcel binnen te dringen, intracellulair te overleven

en zich te verspreiden van cel tot cel kunnen zij menselijke ingewanden succesvol infecteren.

Om dit mogelijk te maken hebben deze bacteriën een groot aantal moleculen ontwikkeld die

zullen interageren met de gastheer om zo de normale cellulaire functies te ondermijnen. De

meeste van deze moleculen worden gesecreteerd door type III secretiesystemen (Souza dos

Reis & Horn, 2010).

16

Pathogenen die diarree veroorzaken kunnen dit doen door het intestinale epithelium te

koloniseren op een aantal verschillende manieren. Deze pathogenen hebben de mogelijkheid

ontwikkeld om (1) niet-specifieke afweermechanismes van de gastheer te weerstaan zoals

maagzuur, peristaltiek, mucosale cel exfoliatie, intestinale mucines en bacteriocines en (2)

zich vast te hechten aan de intestinale epitheelcellen. Deze epithelia kunnen ze dan uiteindelijk

koloniseren. De kolonisatie kan cellulaire invasie inhouden maar dit is niet altijd zo. Wanneer

er cellulaire invasie optreedt verkrijgt men ofwel intracellulaire vermenigvuldiging en

verspreiding van de bacterie naar andere weefsels ofwel bacteriële persistentie. Verschillende

bacteriële pathogenen hebben verschillende werkwijzen om de gastheer te infecteren; toch

veroorzaken ze dezelfde cellulaire reacties. Virulentiefactoren werken ofwel vanuit

extracellulair milieu door cel-liganden te herkennen en hierop vast te hechten ofwel worden ze

ingebracht in het intracellulair milieu. Daar kunnen ze invloed hebben op de signalerende

pathways waardoor ze heel wat teweeg kunnen brengen op de cel zoals het verminderen van

de plasticiteit van het cytoskelet, de endocytose onderbreken en soms zelfs resistentie tegen

fagocytose opwekken. De gastheercel verdedigt zichzelf tegen de infectie door een

ontstekingsreactie op te wekken en de intestinale vochtbalans te veranderen om de

ongewenste bacteriën te kunnen wegspoelen met een diarreereactie als gevolg. Het al dan

niet voorkomen van een infectie hangt dus af van de interactie tussen de gastheer en de

bacterie voor elk organisme op zijn eigen manier. Voorbeelden hiervan zijn enteropathogene

E. coli (EPEC) die zich sterk gaan vasthechten aan epitheelcellen en zo extracellulair blijven

terwijl Salmonella, Shigella en Yersinia het darmepitheel binnendringen. De macrofagen

aanwezig in de cel gaan fagocytose induceren bij Salmonella en Shigella waardoor er een

ontstekingsreactie ontstaat die de epitheelbarrière verstoort. Yersinia kan deze fagocytose

echter vermijden en zal de ontstekingsreactie inhiberen. Bij al deze voorbeelden is het mogelijk

voor de bacterie om zich te vermenigvuldigen, de gastheer te verlaten en zo te worden

doorgegeven aan een nieuwe gastheer (Souza dos Reis & Horn, 2010). In figuur 3 wordt het

mechanisme van enteroaggregatieve E. coli (EAEC) verder toegelicht en geïllustreerd. In

figuur 4 wordt hetzelfde gedaan voor het mechanisme van Salmonella.

17

Figuur 3: De verschillende pathogenesestadia van EAEC. (1) stelt de agglutinatie van de EAEC bacterie voor. (2)

Het EAEC hecht zich vast aan het intestinale epitheel en koloniseert de darm. (3) De biofilm wordt geproduceert.

(4) Bacteriële toxines worden aangemaakt die ervoor zorgen dat het epitheel beschadigd wordt zodat de secretie

van deze toxines versterkt kan doorgaan. (5) Een additionele biofilm wordt aangemaakt (Hebbelstrup Jensen et

al, 2014).

Figuur 4: Pathogenese mechanisme van Salmonella enterica serovar Typhimurium. (1) Salmonella cellen hechten

zich vast aan het intestinale epitheel door middel van adhesines, gecodeerd in SPI-3 en SPI-4. (2) en (3) De bacterie

dringt de cel binnen. Dit wordt gemedieerd door de virulentiefactoren gecodeerd in SPI-1 en SPI-5. (4) Naast het

binnendringen van de cel kan het ook voorkomen dat de bacteriële cellen onmiddellijk worden opgenomen door

dendritische cellen aanwezig in het submucosa. (5) Wanneer de Salmonella zich in het cytoplasma bevindt, gaat

ze naar de Salmonella bevattende vacuolen (SCV) waar ze gaat repliceren. De factoren die gecodeerd worden in

SPI-2 en het pSLT plasmide zijn essentieel voor de overleving van Salmonella in deze SCVs. (6) Door middel van

transcytose gaan de SCVs naar het basolateraal membraan waar ze de interne cellen vrijlaten in het submucosa.

(7) De bacteriën worden opgevangen in fagocyten en opnieuw gelocaliseerd in een SCV, waar het SPI-3, SPI-2 en

het pSLT plasmide een belangrijke rol spelen. Uiteindelijk kunnen deze geïnfecteerde fagocyten zich verplaatsen

via het weefselvocht en het bloed (Fabrega et al, 2013).

18

1.3 BACTERIËLE GASTRO-ENTERITIS: OORZAKEN

Infectieuze gastro-enteritis kan worden veroorzaakt door zowel virussen, bacteriën als

parasieten. De meest voorkomende bacteriële oorzaken van gastro-enteritis kunnen afgeleid

worden uit onderstaande grafiek (Figuur 5) (Spina et al, 2015).

Figuur 5: Totale

frequentie van

voorkomen van

gedetecteerde

pathogenen en de

frequentie van het

voorkomen van

gedetecteerde

pathogenen in

fecesstalen waarin

meerdere pathogenen

werden

teruggevonden. In de

onderzochte stalen

werden er in totaal 555

pathogenen teruggevonden (Spina et al, 2015).

In deze masterproef worden enkel de meest voorkomende bacteriële oorzaken van gastro-

enteritis behandeld. Deze zijn samengevat in tabel 1.

Tabel 1: Bacteriële veroorzakers van gastro-enteritis die verder zullen besproken worden in dit eindwerk.

Bacteriële veroorzakers van gastro-enteritis

Clostridium difficile Toxinogene C. diff Salmonella Species Shigella Species Escherichia coli ETEC enterotoxigene E.coli EPEC enteropathogene E.coli STEC shiga toxine-producerend E.coli EIEC enteroinvasieve E. coli EAEC enteroaggregatieve E.coli Campylobacter C. jejuni C. coli Yersinia Pathogene Y. enterocolitica

19

1.4 GESELECTEERDE PATHOGENEN

1.4.1 CLOSTRIDIUM DIFFICILE

1.4.1.1 ALGEMENE KENMERKEN

Clostridium difficile is de belangrijkste oorzaak van nosocomiaal infectieuze diarree (Persson

et al, 2015). Het is een strikt anaerobe, Gram-positieve sporenvormer (Jamal et al, 2014) die

alom vertegenwoordigd is in het milieu en in het

spijsverteringskanaal van mens en dier (Knight et al, 2015).

Toxine producerend C. difficile wordt teruggevonden in 10 tot

25% van met antibiotica-behandelde diarreegevallen (Persson

et al, 2015). Door het gebruik van antibiotica zoals

clindamycine, cefalosporine en ampicilline wordt de normale

intestinale microbiële flora verstoord, wat de overwoekering van

C. difficile tot gevolg kan hebben (Bélanger et al, 2003). C.

difficile wordt ook vaak teruggevonden in vlees dat bestemd is

voor consumptie (Persson et al, 2008).

Figuur 6: Clostridium difficile (Centers for Disease Control and Prevention,

2015).

Het voorkomen en de ernst van C. difficile infectie (CDI) is een grote last voor de globale

gezondheidszorg aangezien dit zorgt voor extra kosten bij behandeling en infectie-controle, dit

de kans op het terugkeren van de ziekte vergroot en de verblijftijd van de patiënt in het

ziekenhuis verlengt, voornamelijk bij ouderen (Knight et al, 2015).

Het testen op C. difficile kan gebeuren aan de hand van een cytotoxische assay op de

weefselcultuur, via enzym immunoassays (EIA) of via glutamaat dehydrogenase (GDH). De

cytotoxische assay wordt het meest gebruikt door zijn efficiëntie maar hij duurt lang, 24 tot 48

uur. Er zijn ook steeds verse culturen voor nodig, het is arbeidsintensief en het heeft nood aan

specifieke labofaciliteiten en technische expertise. Daarnaast worden EIA en GDH ook vaak

gebruikt maar deze zijn minder gevoelig en minder specifiek (Bélanger et al, 2003; de Jong et

al, 2012; Jamal et al, 2014). Daarom wordt er overgestapt naar real-time PCR. Echter heeft

deze het nadeel dat ook asymptomatische C. difficile infecties worden aangetoond, waardoor

het belangrijk zal zijn om ook toxinegenen te onderzoeken. Een nieuwere methode om C.

difficile te analyseren is om met real-time PCR het tcdB gen te beschouwen, rechtstreeks in

het fecesstaal. Deze methode heeft een hoge gevoeligheid en specificiteit ten opzichte van

EIA. Het heeft echter als nadeel dat er geen onderscheid kan gemaakt kan worden tussen CDI

en asymptomatische kolonisatie met C. difficile aangezien PCR geen biologisch actief toxine

kan detecteren (Jamal et al, 2014).

1.4.1.2 SYMPTOMEN EN ZIEKTEVERLOOP

Antibiotica-geassocieerde pseudomembraneuze colitis (PMC) CDI is een ziekte in de dikke

darm, geïnduceerd door C. difficile toxines, waarbij minstens 3 keer per dag waterige, maar

niet bloederige, stoelgang wordt geconstateerd. Andere symptomen zijn pijn in de onderbuik,

20

krampen en koorts. Manifestaties gelokaliseerd buiten de darmen komen amper voor. Het

ziektebeeld kan gaan van mild tot zeer ernstig en kan soms zelfs fataal zijn. Daarnaast komt

asymptomatische C. difficile infectie vaak voor, vooral in ziekenhuizen, wat waarschijnlijk een

rol speelt in de ziekteoverdracht (Knight et al, 2015).

1.4.1.3 BEHANDELING

De behandeling van een C. difficile infectie hangt af van de ernst van de infectie. Ook is het

belangrijk om weten of de ziekte voor de 1ste maal voorkomt of ze recidief is. Bij het voor het

eerst voorkomen van een milde C. difficile infectie wordt de patiënt behandeld met

metronidazol gedurende 10 tot 14 dagen. Wanneer een ernstige infectie voor het eerst

voorkomt wordt aan de patiënt vancomycine oraal toegediend gedurende 10 tot 14 dagen.

Bij een complexe infectie kan vancomycine zowel oraal als rectaal worden toegediend in

hogere dosis. Dit kan al dan niet worden gecombineerd met een intraveneuze dosis

metronidazol. Bij een zeer ernstig ziektebeeld kan een colectomie noodzakelijk zijn (Cohen

et al, 2010). Recent wordt echter meer gebruik gemaakt van stoelgangtransplantatie (Rohlke

& Stollman, 2012).

Bij een 1ste terugkeer van de infectie kan dezelfde behandeling gebruikt worden als bij het 1ste

voorkomen. Bij verdere terugkeer mag metronidazol niet meer worden toegediend omdat

deze cumulatieve neurotoxiciteit zou kunnen teweegbrengen (Cohen et al, 2010).

1.4.2 SALMONELLA


Salmonella is een Gram-negatieve, niet-

sporenvormer die behoort tot de familie

Enterobacteriaceae en nauw verwant is aan het

genus Escherichia. Deze micro-organismen hebben

een diameter van 0,7 tot 1,5 µm en een lengte van 2

tot 5 µm. Het zijn facultatieve anaeroben die

voornamelijk peritriche flagellen hebben (Fàbrega &

Vila, 2013).

Figuur 7: Salmonella (Centers for Disease Control and

Prevention, 2014).

Het is een belangrijk pathogeen dat voedselvergiftiging veroorzaakt en darmziekten kan

teweegbrengen in een grote variëteit aan gastheren (Tatavarthy & Cannons, 2010).

Pathogenen die voorkomen in voedsel komen vaak voort uit het gebruiken van met feces

vervuild water, gebruikt voor zowel irrigatie als in het productieproces. Het grootste risico

hierbij ligt bij voedingsmiddelen die niet of onvoldoende gekookt worden vooraleer ze worden

geconsumeerd (Vital et al, 2014). Van alle pathogenen die voedselvergiftiging veroorzaken

zorgt Salmonella voor 11% van de infecties, 35% van hospitalisaties en 28% van doden in de

21

VS (Zhang et al, 2011). Het genus Salmonella kan worden opgedeeld in twee species:

Salmonella enterica en Salmonella bongori (Tatavarthy & Cannons, 2010). Salmonella

enterica serotypes Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B en Paratyphi C worden samen gegroepeerd

als typhus veroorzakende Salmonella. Dit zijn organismen die enkel bij de mens voorkomen.

Ze kunnen buiktyfus en paratyfus veroorzaken. Andere S. enterica serotypes worden de niet-

typhoïdale Salmonella (NTS) genoemd. NTS stammen kunnen een grote variatie aan

gewervelden infecteren of koloniseren. Ook kunnen ze zich aanpassen aan of beperken tot

bepaalde niet-menselijke diersoorten (Crump et al, 2015). Deze NTS kunnen verder worden

opgedeeld in 6 subspecies (I, II, IIIa, IIIb, IV en VI). De meeste ziektes worden veroorzaakt

door S. enterica I, maar sporadisch komen er ook infecties voor die veroorzaakt werden door

S. enterica IIIa, IIIb, IV, VI en S. bongori (Tatavarthy & Cannons, 2010). Een voorbeeld van

een serotype binnen S. enteritica is Salmonella enteritidis, wat kan teruggevonden worden in

gevogelte en eieren. (Szmolka et al, 2015).

Conventionele identificatiemethoden van Salmonella in voedsel houden een aantal stappen

in: niet-selectieve aanrijking, selectieve aanrijking, selectief uitplaten en uiteindelijk

biochemische en serologische confirmatietechnieken. Dit is arbeidsintensief en er zijn

minstens 5 dagen nodig om al deze stappen te kunnen doorlopen. Daardoor wordt er

overgestapt naar methodes die een snelle screening en detectie mogelijk maken. Er wordt

gekozen voor qPCR omdat ze sneller en gevoeliger is dan een gewone PCR en er wordt real-

time data verkregen zonder dat de amplicons op gel moeten worden gezet (Zhang et al, 2011).


De 2 belangrijkste syndromen die veroorzaakt worden door Salmonella infectie zijn typhoïde

koorts en colitis. Typhoïde koorts wordt veroorzaakt door de pathogenen S. enterica serotype

Typhi en S. enterica serotype Paratyphi A en B. Deze zijn enkel pathogeen voor de mens. De

symptomen hierbij zijn koorts, hoofdpijn, buikpijn, voorbijgaande diarree of constipatie. De

infectie kan ook fatale schade berokkenen aan de luchtwegen, lever, milt en kan mogelijks

neurologische schade veroorzaken. De sterftecijfers voor deze ziekte liggen tussen de 10 en

20% wanneer de patiënt niet wordt behandeld. Met antibioticabehandeling daalt dit cijfer tot

<1%. NTS stammen die colitis veroorzaken kunnen naast mensen ook heel wat andere dieren

infecteren. NTS wordt voornamelijk veroorzaakt door S. enteritidis en S. typhimurium. Hierbij

liggen de sterftecijfers rond 24% in ontwikkelingslanden. De symptomen omvatten koorts,

krampen, buikpijn, diarree, stoelgang die bloederig kan zijn, vaak samen met misselijkheid en

braken. De ernst van deze symptomen kan sterk variëren. Ziekte komt meestal voor wanneer

meer dan 50 000 bacteriën worden geconsumeerd en de incubatieperiode bedraagt 6 tot 72

uur. Zo’n 5% van patiënten met NTS-infectie ontwikkelen ook bacteriemie, waarbij bacteriën

zich in de bloedbaan bevinden. Bij NTS infecties die zich beperken tot de darmen duren de

symptomen 5 tot 7 dagen, waarna ze spontaan uit zichzelf stoppen (Fàbrega & Vila, 2013).

1.4.2.3 BEHANDELING

Bij niet-thypoïdale salmonellose is behandeling met antibiotica niet nodig bij gezonde

personen. Deze is enkel noodzakelijk bij mensen met een verlaagd immuunsysteem, kinderen

22

en ouderen (Tatavarthy & Cannon, 2010). De behandeling gebeurt 3 tot 7 dagen, waarbij vaak

fluoroquinolones, trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP-SMZ), ampicilline of breedspectrum

cefalosporines (bv. Ceftriaxon of cefixim) worden toegediend. Antibioticaresistentie komt

echter steeds vaker voor bij S. typhimurium isolaten waardoor TMP-SMZ en ampicilline minder

vaak worden toegepast (Fàbrega & Vila, 2013).

1.4.3 CAMPYLOBACTER


Campylobacter species zijn Gram-negatieve, niet-sporenvormers die 0,2 tot 0,8 op 0,5 tot 5

µm groot zijn. Het zijn chemo-organotrofen die hun energie halen uit aminozuren of

tricarboxylzuurcyclus intermediairen. Ze behoren tot de familie Campylobacteraceae (de Boer

et al, 2010; Kaakoush et al, 2015).

Figuur 8: Campylobacter (Centers for Disease Control and Prevention,

2013).

Campylobacter species zijn een belangrijke oorzaak van

bacteriële enteritis bij mensen, waarbij vooral de species C.

jejuni en C. coli een rol spelen. Daarnaast worden ook C.

lari, C. upsaliensis en C. hyointestinalis gezien als

enteropathogenen. Ook C. concisus en C. ureolyticus

worden steeds vaker geconstateerd als de oorzaak voor

gastro-enteritis (de Boer et al, 2010). C. jejuni wordt

teruggevonden bij 90% van de gevallen waarbij een

Campylobacter species de oorzaak is van diarree

(Humphries & Linscott, 2015).

In klinische labo’s worden Campylobacter species meestal gedetecteerd door ze op te groeien

op selectieve media en daarna verder te identificeren met fenotypische methoden of met

MALDI-TOF. Deze cultuurmethoden zijn vooral gericht op het vinden van C. jejuni en C. coli.

De selectieve media die hierbij gebruikt worden (bv. Preston agar, Skirrow agar en Butzler

agar) kunnen de groei van andere Campylobacter species gaan inhiberen. Ook zijn er een

aantal niet-thermofiele Campylobacter species die niet kunnen overleven bij de

incubatietemperatuur van 42°C die tijdens deze identificatie gehanteerd wordt. Hierdoor wordt

het ware voorkomen van Campylobacter vaak onderschat. Ook is deze identificatiemethode

redelijk traag, waardoor slechts resultaten bekomen worden na 2 tot 4 dagen (Maher et al,

2003).


In onderzoeken werd er vastgesteld dat zelfs bij een lage dosis van 800 CFU aan C. jejuni

diarree kan optreden. Door infectie met C. jejuni of C. coli krijgen patiënten last van waterige

of bloederige diarree, koorts, gewichtsverlies en krampen die gemiddeld 6 dagen duren. Op

23

symptomen alleen kan men geen onderscheid maken tussen de infectie van beide species.

De incubatieperiode na inname is 24 tot 72 uur en hoe lager de dosis Campylobacter, hoe

langer deze incubatieperiode duurt. De piek van de ziekte kan 24 tot 48 uur duren, waarbij de

buikpijn gelijkaardig kan zijn aan deze bij appendicitis. Infectie met C. jejuni of C. coli komt

voor bij patiënten van alle leeftijden, maar vooral bij kleuters en jongvolwassenen. Ook werd

er geconstateerd dat bij iets oudere patiënten (vanaf leeftijd 34) en mensen die veel reizen de

kans op infectie met C. coli hoger lag dan met C. jejuni. Daarnaast kunnen andere species van

Campylobacter ook infectie veroorzaken, waarbij de symptomen iets milder zijn dan bij C. jejuni

en C. coli. C. jejuni kan ook leiden tot auto-immuunziektes zoals Guillain-Barré syndroom en

Miller Fisher syndroom. Campylobacter species kunnen ook leiden tot prikkelbare darm

syndroom, Barrett’s slokdarm en darmkanker. Daarnaast zouden ze een rol spelen bij

bacteriemie, longinfecties, abcessen in de hersenen, meningitis en artritis (Kaakoush et al,

2015).

1.4.3.3 BEHANDELING

De meeste infecties met Campylobacter gaan na verloop van tijd vanzelf over, waardoor er

geen behandeling nodig is. Er moet alleen gezorgd worden dat de patiënt voldoende

gehydrateerd blijft. Antibiotica moet wel worden toegediend bij patiënten met auto-

immuunziektes, met extra-intestinale infecties of bij patiënten waarbij de symptomen zeer

ernstig zijn. Daarvoor wordt vaak ciprofloxacin toegevoegd, wat een fluoroquinolone is.

Daarnaast worden ook meer en meer macroliden zoals azitromycine toegediend omdat steeds

meer Campylobacter species resistent worden tegen ciprofloxacin door het veelvuldig gebruik

hiervan in de pluimvee industrie. Bij zeer zware Campylobacter infecties wordt vaak gewerkt

met aminoglycosiden zoals gentamicine of kanamycine (Kaakoush et al, 2015).

1.4.4 SHIGELLA


Shigellae zijn Gram-negatieve niet-sporenvormers, ze zijn

facultatief anaeroob en behoren tot de familie

Enterobacteriaceae (Sansonetti, 2001). Er zijn 4 verschillende

species bekend. Shigella flexneri, Shigella boydii en Shigella

sonnei zijn veroorzakers van gastro-enteritis. Shigella

dysenteriae veroorzaakt dysenterie (Jimenez et al, 2010). Het

voorkomen van Shigella infecties wordt waarschijnlijk

onderschat door het verkeerd uitvoeren van pre-analytische

stappen en door het feit dat Shigella vaak voorkomt Figuur 9:

Shigella (Centers for Disease Control and Prevention, 2015).

als “viable but non-culturable” (VBNC) (Prakash et al, 2015). De

labo detectie verloopt in dezelfde stappen als degene die hierboven zijn beschreven voor

Salmonella.

24


Shigella veroorzaakt shigellose, een acute gastro-enteritis. Shigellose is zeer besmettelijk en

kan worden doorgegeven bij fecaal contact. Hierdoor komt het vaak voor in dichtbevolkte

gebieden waar een gebrek aan hygiëne heerst. Ook kan het worden doorgegeven via besmet

voedsel of water (Hsu et al, 2007). De symptomen van shigellose zijn kortstondige waterige

diarree die vaak ook bloederig is, en koorts en krampen in de darmen (Sansonetti, 2001).

1.4.4.3 BEHANDELING

De behandeling van shigellose focust voornamelijk op rehydratie, al dan niet gecombineerd

met een antibioticakuur. De rehydratie gebeurt oraal. De antibioticakuur zorgt ervoor dat de

koorts en krampen verminderen, dat de symptomen van kortere duur zijn en dat het risico op

complicaties die de dood tot gevolg kunnen hebben verminderen. De antibioticakuur wordt 5

dagen toegediend. Het probleem bij Shigella species is dat ze snel resistentie ontwikkelen

waardoor ze onder andere resistent geworden zijn tegen tetracycline, chlooramfenicol,

ampicilline en co-trimoxazol. Vandaag de dag wordt voornamelijk fluoroquinolones toegediend

bij volwassenen en azitromycine bij kinderen (Niyogi, 2007).

1.4.5 YERSINIA


Yersinia enterocolitica bestaat uit een heterogene groep van meer dan 50 stammen die een

grote verscheidenheid aan pathogeniteit kan veroorzaken bij zowel mens als dier (Lamps et

al, 2006). Ze kunnen verscheidene syndromen veroorzaken zoals diarree, enteritis en

enterocolitis (Wang et al, 2014). Y.

enterocolitica zijn Gram-negatieve staven

die een diversiteit aan morfologie vertonen.

Zo komen ze voor als kleine coccobacilli

met afgeronde einden maar ook als

uitgestrekte staven, soms met uitsluitsels

aanwezig. Bij 37°C is Y. enterocolitica niet

beweeglijk, maar bij 25°C is ze dit wel door

de aanwezige peritriche

Figuur 10: Yersinia enterocolitica (Elika, 2013).

flagellen. Ze kan worden opgegroeid op een vast medium zoals MacConkey agar, Sheep

Blood agar en Hektoen-Enteric agar waarbij ze 24 uur wordt geïncubeerd. Een hierbij vaak

voorkomend probleem is dat de plaat wordt overwoekerd door andere Enterobacteriaceae

aanwezig in het fecale staal. Dan zal er opnieuw moeten worden geïncubeerd, dit keer

gedurende 48 uur bij 37°C om lactose-negatieve kolonies te selecteren. Y. enterocolitica is in

staat om het sucrose aanwezig in Hektoen-Enteric agar te fermenteren; dit is geen specifieke

karakteristiek voor Yersinia kolonies en kan ook voorkomen bij andere darmflora (Bottone,

2015).

25

Y. enterocolitica zijn pathogenen die vaak worden teruggevonden in water, zuivelproducten en

vlees (Wang et al, 2014), voornamelijk varkensvlees (Uyeda, 1997). In ander vlees dat door

mensen geconsumeerd worden komen meestal niet-pathogene stammen van Y. enterocolitica

voor (Thoerner et al, 2003). Pathogene Y. enterocolitica kunnen onderverdeeld worden in 2

groepen: de sterk-virulente (HV) biogroep 1B en de zwak-virulente (LV) groep die bestaat uit

biogroepen 2 tot 5. Pathogene stammen die vaak voorkomen bij de mens zijn de serotypes

O:8 en O:13, behorende tot de HV groep, en stammen O:1, O:3 en O:9 die behoren tot de LV

groep (Lamps et al, 2013).


Bij mensen kan Y. enterolitica zorgen voor zeer sterke buikpijn, koorts, diarree, hoofdpijn en

braken (Uyeda et al, 1997). Het kan leiden tot ernstige ziektes zoals de ziekte van Crohn en

mesenterische lymfadenitis, waarvan de symptomen sterk lijken op die van appendicitis. De

ernst van de ziekte is afhankelijk van verschillende parameters zoals gastheergevoeligheid,

het aantal ingenomen organismen en het serotype. De ziekte heeft een incubatieperiode van

24 tot 48 uur(Humphries & Linscott, 2015) en duurt ongeveer 10 dagen (Rosner et al, 2013).

In sommige gevallen kan ze echter 2 tot 12 maand aanhouden. Bij 20 tot 46% van de

gevallen komt bloederige stoelgang voor. Ziekte kan ook leiden tot opname in het ziekenhuis

door dehydratatie bij ernstige gevallen (Humphries & Linscott, 2015).

1.4.5.3 BEHANDELING

Net zoals bij vele andere gastro-intestinale infecties gaan de symptomen na verloop van tijd

vanzelf stoppen en is er geen antimicrobiële behandeling nodig. Toch kan in enkele gevallen

wel antibiotica worden toegediend wanneer de patiënt al verzwakt was of wanneer het gaat

over een zeer invasieve infectie die de dood tot gevolg kan hebben. Vroeger werd vooral

tetracycline, chlooramfenicol, gentamicine en cotrimoxazol toegediend, maar nu wordt meer

gebruik gemaakt van 3de generatie cefalosporines en fluoroquinolones (Fàbrega & Vila, 2012).

1.4.6 ESCHERICHIA COLI


Escherichia coli werd voor het eerst geïsoleerd en gekarakteriseerd door Theodor Escherich

in 1954 (Croxen et al, 2015). In ontwikkelingslanden is diarree een van de grootste oorzaken

van sterfte, voornamelijk bij kinderen. Hierbij is diarree veroorzakende Escherichia coli (DEC)

een belangrijke oorzaak onder de bacteriële pathogenen (Auvray et al, 2008). E. coli zijn

facultatief anaeroben (Barletta et al, 2013) die veelvuldig in de darmflora van warmbloedige

dieren aanwezig zijn waar ze normaal gezien geen schadelijke invloed hebben (Croxen et al,

2013).

26

Figuur 11: Escherichia coli (Centers for Disease Control and Prevention, 2015).

Wanneer de patiënt echter een verzwakt immuunsysteem heeft, door wederkerende infecties

(zoals urineleider infectie, meningitis,…), of een verminderde gastro-intestinale barrière heeft

kan er een infectie met E. coli ontstaan doordat sommige stammen virulentiegenen bevatten.

Deze virulentiegenen zijn niet geassocieerd met wederkerende infecties maar zorgen ervoor

dat pathogenen kunnen aanhechten aan de cel, deze kunnen binnendringen en uiteindelijk

hun functie kunnen doen veranderen (Barletta et al, 2013). Pathogene E. coli kan een grote

variatie aan ziektes induceren bij mensen, zowel gastro-intestinale ziektes als ziektes die zich

bevinden in de urineleider, de bloedstroom en het centrale zenuwstelsel (Croxen et al, 2015).

Het zijn de intestinale pathogenen die tot diarree zullen leiden. DEC stammen kunnen

onderverdeeld worden in 6 categorieën : enteropathogene E. coli (EPEC), enterotoxigene E.

coli (ETEC), enteroinvasieve E. coli (EIEC), shiga toxine-producerend E. coli (STEC),

enteroaggregatieve E. coli (EAEC) en diffuus-adhererende E. coli (DAEC) (Abbasi et al, 2014).

STEC wordt soms ook verotoxine-producerend E. coli (VTEC) genoemd (Auvray et al, 2008).

Naar DAEC wordt in dit eindwerk geen onderzoek gedaan. In figuur 12 wordt de aanhechting

van de verschillende DEC geïllustreerd en toegelicht.

27

Figuur 12: Voorstelling van het vasthechten van E. coli in het spijsverteringsstelsel. Pathogene E. coli hebben gastheerepithelen nodig om zich aan vast te hechten. EPEC (voorgesteld als geel) en STEC (voorgesteld als roze) zijn extracellulaire pathogenen die zich vasthechten aan het intestinale epitheel en daar microvilli verwijderen om zo laesies te veroorzaken. EPEC vertoont lokale aanhechtingspatronen door de aanwezigheid van pili waardoor ze microkolonies kunnen vormen. Daarnaast kan ETEC (voorgesteld als oranje) kolonisatiefactoren (CFs) gebruiken om zich aan te hechten in de intestinale cellen. EAEC (voorgesteld als groen) vormt een biofilm over de intestinale mucosa. De bacteriën hechten zich zowel aan elkaar vast als aan het celoppervlak waar ze aggregerende aanhechtingspatronen vormen (Stacked Brick). Tot slot gaat EIEC (voorgesteld als rood) het intestinale epitheel binnendringen door middel van M-cellen waardoor zij zich gaan nestelen in het submucosa. Ze worden niet afgebroken door de macrofagen daar aanwezig aangezien ze macrofage celdood induceren en darmcellen basolateraal binnendringen en zich van daaruit lateraal verspreiden (Croxen et al, 2013).

In tabel 2 wordt een samenvattend overzicht gegeven van de verschillende DEC, met hun

gastheer, plaats van kolonisatie, besmettingsbron, ziekteverschijnselen, behandeling,

aanhechting en genetische identificatie.

28

Tabel 2: Overzicht van intestinale E. coli pathogenen (Croxen et al, 2013).

Pathotype tEPEC aEPEC STEC EIEC ETEC

Gastheer

kinderen < 5 jaar, volwassenen bij hoge dosis

volwassenen & kinderen

kinderen < 5 jaar, volwassenen, frequente

reizigers, Immuungecompromitteerde

personen

Kinderen < 5 jaar, reizigers

plaats van kolonisatie

Dunne darm

Distaal ileum, dikke

darm Dikke darm Dunne darm

Ziekte(s) Sterke waterige diarree

Waterige diarree, HC,

HUS

Shigellose, bacteriële disentery, mogelijks HUS

Waterige diarree

Gekende bron van

besmetting Mensen Mensen, dieren

Mensen, dieren,

voedsel, water

Mensen, dieren, voedsel, water

Voedsel, water, mensen, dieren

Behandeling Orale rehydratatie, antibiotica

bij aanhoudende gevallen

Hydratie, extra zorg

bij HUS

Orale rehydratatie, antibiotica

Rehydratatie, antibiotica

Aanhechting Aanhecting en "effacing" Aanhecting

en "effacing"

Niet van toepassing (invasief)

Door ingrijpen CF

Genetische identificatie

Eae+, bfp+, stx- Eae+, stx-

Eae+/-, stx+ ipaH+, ial+, stx+ CFs, LT, ST

Pathotype DAEC AIEC EAEC

Gastheer

Kinderen (ernstiger tussen 18

maanden en 5 jaar),

volwassenen

volwassenen en kinderen

volwassenen kinderen Immuungecompromitteerde

personen

plaats van kolonisatie

Spijs-verterings-

stelsel Dunne darm

Dunne en/of dikke darm

Ziekte(s)

Aan-houdende waterige

diarree bij kinderen, kan bijdragen tot de ziekte van

Crohn

ziekte van Crohn Reiziger's

diarree, HUS (stx+)

Aan-houdende diarree Aan-houdende diarree

Gekende bron van

besmetting Onbekend Onbekend Voedsel, soms volwassen dragerschap

Behandeling Rehydratatie Antibiotica,

chirurgie

Antibiotica, orale

rehydratatie

Antibiotica, orale rehydratatie, mogelijks

probiotica Fluoroquinolones

Aanhechting Diffuus,

adherent en/of invasief

Niet van toepassing (invasief)

Stacked brick en/of invasief

Genetische identificatie

Geen uniforme merkers

Niet gekarakteriseerd

aat+A, aatC+, andere

29

1.4.6.1.1 EPEC

EPEC zijn de belangrijkste pathogenen bij het infecteren van kinderen onder de 2 jaar. Het

zijn ”attaching and effacing” pathogenen (A/E) en vormen vooral een probleem in

lageloonlanden (Abbasi et al, 2014). EPEC worden doorgegeven van gastheer naar gastheer

bij fecaal-oraal contact via gecontamineerde oppervlakten en humane dragers. Ook kan

besmetting worden veroorzaakt door consumptie van gecontamineerd water en voedsel, maar

dit komt minder vaak voor (Croxen et al, 2013). De EPEC bacterie gaat zich vastmaken aan

de darmwand van de gastheer en zorgt daar voor veranderingen in het cytoskelet van

epitheelcellen, wat zorgt voor een accumulatie aan gepolymeriseerd F-actine (Abbasi et al,

2014).

1.4.6.1.2 EAEC

EAEC is de 2de meest voorkomende oorzaak voor diarree tijdens het reizen (Morin et al, 2013).

Ook zorgt het vaak voor ziektebeelden bij kinderen in ontwikkelingslanden en bij patiënten met

een humaan virus immunodeficiëntie (Shin et al, 2015). Bij EAEC gebeurt de infectie in 3

stages: eerst bindt het aan het slijmvlies, daarna wordt er een biofilm gevormd en uiteindelijk

wordt er een ontstekingsreactie geïnduceerd waarbij toxines worden vrijgesteld (Hebbelstrup

Jensen et al, 2014).

1.4.6.1.3 STEC

STEC komt vaak voor in geïndustrialiseerde landen door waterverontreiniging (Abbasi et al,

2014). Ook kan STEC teruggevonden worden in voedingsmiddelen (Auvray, 2008),

voornamelijk wanneer deze voedingsmiddelen niet genoeg gekookt worden (Feng et al, 2011).

STEC stammen die hemorragische colitis (HC) of hemolytisch-uremisch syndroom (HUS)

veroorzaken worden voornamelijk teruggevonden bij gezond vee. Humane infectie wordt dan

veroorzaakt door direct contact met vee, koeienvlees of ongepasteuriseerde melk (Nielsen &

Andersen, 2003).

1.4.6.1.4 ETEC

ETEC is in staat om hitte-labiele (LT) of hitte-stabiele (ST) enterotoxines aan te maken en het

draagt een groot aantal aan kolonisatiefactoren die adhesie aan intestinaal epitheel mogelijk

maakt (Croxen et al, 2013). De infectieuze dosis aan ETEC bij volwassenen is minstens 108

cellen (Feng et al, 2011).

1.4.6.1.5 EIEC

In tegenstelling tot andere E. coli zijn EIEC niet beweeglijk, gaan ze geen lysine

decarboxyleren en fermenteren ze geen lactose (Feng et al, 2011). EIEC stammen hebben

sterke biochemische, genetische en pathogene gelijkenissen met Shigella. Toch is infectie bij

EIEC milder dan bij Shigella en is er een hogere dosis aan EIEC nodig voor infectie (Croxen

et al, 2013). Er is een dosis van minstens 106 EIEC organismen nodig om ziekte te

veroorzaken in gezonde volwassenen. EIEC zijn pathogenen omdat ze in staat zijn om het

darmweefsel binnen te dringen en het af te breken. Het wordt niet teruggevonden bij dieren,

30

waardoor besmetting altijd gebeurt via geïnfecteerde personen (Feng et al, 2011). Meestal

wordt het doorgegeven via gecontamineerd water of voedingsmiddelen of via direct contact

met een besmet persoon (Croxen et al, 2013).


1.4.6.2.1 EPEC

EPEC kan resulteren in diarree, vaak gepaard met koorts, braken en

uitdrogingsverschijnselen. Deze symptomen treden vanaf 2,9 uur na inname van het wild-type

bacterie op. Meestal is er sprake van acute diarree, maar bij hardnekkige gevallen kunnen de

symptomen 2 weken duren (Croxen et al, 2013).

1.4.6.2.2 EAEC

EAEC infectie kan leiden tot waterige diarree, samengaand met lichte koorts, misselijkheid,

braken, buikpijn en af en toe bloederig feces. Bij kinderen en HIV-patiënten leidt EAEC tot

hardnekkige diarree die bij kinderen zelfs de groei en ontwikkeling kan afremmen (Croxen et

al, 2013).

1.4.6.2.3 STEC

De shiga toxine-producerende E. coli is een heterogene groep van organismen en het

ziektebeeld dat veroorzaakt wordt door een gastro-intestinale infectie hiervan is vrij

uiteenlopend (Auvray 2008). Zo kan dit leiden tot zowel milde tot bloederige diarree (Bugarel

et al, 2011) als HC, HUS en kan het uiteindelijk nierfalen veroorzaken (Auvray, 2008). De

incubatietijd bedraagt ongeveer 3 dagen. De eerste symptomen zijn meestal diarree samen

met koorts, buikkrampen en braken (Croxen et al, 2013).

1.4.6.2.4 ETEC

ETEC veroorzaakt milde tot ernstige waterige diarree die meestal niet bloederig is. Het heeft

symptomen die gelijkaardig zijn aan cholera en kan snel leiden tot dehydratatie. Naast diarree

kan er ook hoofdpijn, koorts, buikkrampen, misselijkheid en braken teweeggebracht worden.

De incubatietijd kan zeer kort zijn (zo’n 5 uur), maar meestal houdt ze 1 à 2 dagen in. De ziekte

zelf houdt 3 tot 5 dagen stand maar kan in ernstigere gevallen langer dan een week duren. Bij

kinderen onder de 2 jaar kan infectie leiden tot groeibeperkingen (Croxen et al, 2013).

1.4.6.2.5 EIEC

EIEC zal, net zoals Shigella, leiden tot shigellose, wat in een vroeg stadium kan leiden tot

waterige diarree, vermoeidheid, koorts en anorexia. Hiernaast kunnen ook buikkrampen,

bloederige feces, tenesmus en dehydratatie geconstateerd worden. In derdewereldlanden kan

shigellose aanleiding geven tot complicaties en uiteindelijk sterfte. Het kan ook voorkomen dat

na infectie patiënten te maken krijgen met prikkelbare darm syndroom (Croxen et al, 2013).

31

1.4.6.3 BEHANDELING

1.4.6.3.1 EPEC

Bij de meeste gevallen zijn de symptomen beperkt en kunnen ze behandeld worden met een

orale rehydratie therapie. In hardnekkige gevallen kan antibiotica gebruikt worden, maar hierbij

moet rekening gehouden worden met de antibioticaresistentie van EPEC. Zo zijn er EPEC

gevonden die resistent zijn tegen penicillines, cefalosporines en aminoglycosiden (Croxen et

al, 2013).

1.4.6.3.2 EAEC

EAEC is, afhankelijk van waar ter wereld de infectie zich voordoet, resistent aan bepaalde

antibiotica waar bij behandeling rekening mee moet gehouden worden. EAEC infecties worden

vaak behandeld met ciprofloxacin en andere fluoroquinolones. In de Verenigde Staten wordt

vaak rifaximine of azitromycine toegediend (Croxen et al, 2013).

1.4.6.3.3 STEC

Bij de meeste gevallen van STEC infectie stoppen de symptomen vanzelf na een week.

Behandeling van STEC houdt onder andere in om intraveneus vloeistoffen toe te dienen. Er

worden geen pijnstillers of antibiotica toegediend. Ook zijn er vaccinaties in ontwikkeling tegen

STEC (Croxen et al, 2013). Antibiotica kan echter de symptomen versterken en zo HUS

teweegbrengen doordat ze de productie en/of het vrijlaten van het Shiga toxine (Stx) verhogen

(Bielaszewska et al, 2012).

1.4.6.3.4 ETEC

Diarree geïnduceerd door ETEC is zelflimiterend en kan in de meeste gevallen behandeld

worden met orale rehydratie. Bij ernstige dehydratatie kan intraveneuze rehydratie nodig zijn.

Medicijnen die secretie gaan tegenhouden kunnen veilig gebruikt worden bij volwassenen,

samen met antimicrobiële stoffen. Antibiotica zoals fluoroquinolones, azitromycine en

rifaximine kunnen de duur van de infectie gaan inperken (Croxen et al, 2013).

1.4.6.3.5 EIEC

EIEC leidt tot shigellose, wat in de meeste gevallen zelflimiterend is zolang er genoeg

rehydratie is. Daarnaast kan een antibioticakuur ervoor zorgen dat de symptomen sneller

voorbij gaan en dat het risico op complicaties verminderd wordt. Antibiotica die hiervoor

gebruikt kunnen worden zijn azitromycine, 3de generatie cefalosporine, ceftriaxon en het

fluoroquinolon ciprofloxacine. Daarnaast kunnen ook zinksupplementen worden toegediend

(Croxen et al, 2013).

32

1.5 PCR DOELWITGENEN

Voor de PCR reacties zijn specifieke doelwitgenen nodig die zullen toelaten om via de TaqMan

Array Cards de verscheidene bacteriële gastro-enteritis pathogenen te identificeren. Deze

worden hieronder besproken per onderzocht species of genus.

1.5.1 C. DIFFICILE DOELWITGENEN

De pathogeniciteit van het organisme is geassocieerd met de productie van de 2 belangrijkste

toxines: het enterotoxine TcdA, gecodeerd door tcdA en het cytotoxine TcdB, gecodeerd door

tcdB (Persson et al, 2008). Beide genen maken deel uit van het pathogeniciteit locus (PaLoc)

operon (Jensen et al, 2015). Deze bevat ook tcdC, wat een mogelijks negatieve regulator is

van tcdA en tcdB (Persson et al, 2008). Er is vastgesteld dat wanneer dit tcdC gen enkele

deleties bevat, er sterkere expressie van het cytotoxine verkregen wordt (Wroblewski et al,

2009). De meeste pathogene stammen produceren zowel toxine A als B. Toch zijn er ook

pathogene stammen teruggevonden die enkel toxine B produceren (Bélanger et al, 2003).

Figuur 13: Genetische map van PaLoc in C. difficile. Toxinegenen worden weergegeven in het groen en

regulatorgenen in het rood (Carter et al, 2012).

Daarnaast zijn sommige C. difficile stammen in staat om het C. difficile binair toxine aan te

maken. Dit wordt gecodeerd door het cdtA (de enzymatische component) en cdtB (de

bindingscomponent) operon (Persson et al, 2008). De binair toxinegenen zorgen voor extra

kans op ziekteverschijnsel, sterfte en recidiviteit van de C. difficile infectie (Jensen et al, 2015).

cdtA en cdtB produceren samen het actine-specifiek ADP-ribosyltransferase dat schade

veroorzaakt aan het actine skelet, wat kan resulteren in structurele veranderingen in cellijnen

(Wroblewski et al, 2009). C. difficile stammen die de sterkste ziekteverschijnselen opwekken

zijn stammen die ofwel positief zijn voor het binair toxine, een 18-bp deletie bevatten in tcdC

of die resistent zijn tegen fluoroquinolones. Andere varianten die vaak ziekenhuisinfecties

veroorzaken zijn de C. difficile stammen die negatief zijn voor TcdA maar positief zijn voor

TcdB. Deze varianten hebben een deletie in het 3’-uiteinde van tcdA. Dit codeert voor het

ligand-bindend domein, wat ervoor zorgt dat ze moeilijk detecteerbaar zijn bij cultuur cytotoxine

assays. Ook is er aangetoond dat in Europa meer dan de helft van de labo’s ELISA testen

gebruiken die zich enkel richten op TcdA. Deze testen zijn gebaseerd op het herkennen van

het ligand-bindend domein, wat het onmogelijk maakt om C. difficile met een deletie in tcdA te

detecteren (Persson et al, 2008).

33

Naast de toxinegenen wordt er ook onderzoek gedaan naar het 16S rRNA specifiek voor C.

difficile. Dit zal de aanwezigheid van C. difficile bevestigen. Slechts 15% van de bacteriële

genomen bevatten 1 enkele 16S rRNA kopij en ongeveer de helft van de bacteriële genomen

bevatten 5 of meer 16S kopijen (Větrovský & Baldrian, 2013). Hierdoor zal de PCR reactie

gevoeliger zijn. Rainy et al (1996) hebben geconstateerd dat Clostridium paradoxum zelfs 15

kopijen van het 16S rRNA bevat.

C. difficile Ribotype 027 (RT027) is een belangrijk pathogeen bij mensen dat wordt

geassocieerd met het uitbreken van CDI in zowel Noord-Amerika als Europa. RT027 heeft een

aantal eigenschappen wat het een hypervirulent fenotype maakt, zoals een verhoogde

productie van grote Clostridium toxines (LCTs), de aanwezigheid van het binair toxine, een

verhoogde sporulatie, afwijkende vormen van tcdC, productie van toxine B varianten die een

verhoogd spectrum van cytotoxiciteit vertonen en mutaties in het DNA gyrase waardoor een

weerstand tegen fluoroquinolone verkregen wordt. Recente RT027 stammen bevatten extra

transcriptionele regulatoren, een uniek faageiland en een twee-componenten

regulatorsysteem. Naast deze nieuwe genen bevat RT027 ook een aantal puntmutaties en

nucleotide inversies in zijn coderende regio, wat waarschijnlijk veranderingen veroorzaakt in

gen functionaliteit en fenotype. Ook werd er vastgesteld dat RT027 weerstand tegen

fluoroquinolone kan verkrijgen op twee manieren, wat resulteert in 2 verschillende

afstammingen (FQR1 en FQR2) die een verschillende besmettingspatroon vertonen (Knight

et al, 2015).

1.5.2 SALMONELLA DOELWITGENEN

Voor specifieke detectie van Salmonella wordt vaak gezocht naar volgende genen: invA

(Salmonella invasion protein gene), fimA (major fimbrial subunit encoding gene), spv (virulence

gene), stn (enterotoxin gene), fliC (flagellin gene) en hilA (invasion gene transcriptional

activator). Sommige serotypes van Salmonella bevatten niet alle voorgaande genen. Ook

worden er soms vals positieve resultaten verkregen voor sommige van deze genen bij detectie

op niet-Salmonella stammen (Chen et al, 2010). Verscheidene studies hebben aangetoond

dat het invA gen en zijn mRNA goede targets zijn voor het detecteren van Salmonella in stalen

met qPCR (Zhang et al, 2011).Het invA gen bevindt zich op het Salmonella pathogeniciteit

eiland 1 (SPI 1) en doordat het verkregen wordt via horizontale gentransfer is het vaak instabiel

of afwezig in sommige serotypes zoals bv. Salmonella serotype Seftenberg (Tatavarthy &

Cannons, 2010). Het nadeel aan qPCR is dat er genoeg invA mRNA moet aanwezig zijn in

het staal om de Salmonella te kunnen detecteren. In bepaalde milieus kan het voorkomen dat

Salmonella wel overleeft, maar dat ze uitgehongerd voorkomt en onder hoge stress, waardoor

ze misschien niet het invA mRNA kan produceren (Zhang et al, 2011). Daardoor is het

belangrijk om bij real-time PCR detectie van Salmonella naast invA ook te testen op andere

targets zoals bv. het ompF (outer membrane porin F) gen (Tatavarthy & Cannons, 2010).

Uit de studie van Tatavarthy & Cannons (2010) bleek dat het ompF gen aanwezig is bij alle

Salmonella species en 100% afwezig bij niet-Salmonella stammen waarop getest werd.

Porines aan de buitenkant van het membraan laten substraten door het membraan van Gram-

34

negatieve organismen. Het porine ompF is een niet-specifiek kation-verkiezend porine en het

gen wordt beter tot expressie gebracht wanneer het organisme zich bevindt in een milieu met

lage osmolariteit.

Het ssaN (putative type III secretion ATP synthase) gen codeert voor een eiwit van 47.8 kDA

dat waarschijnlijk dient als energiebron voor het type III secretie systeem (Hensel et al, 1997).

SsaN is essentieel voor secretie en Salmonella virulentie (Yoshida et al, 2014).

1.5.3 CAMPYLOBACTER DOELWITGENEN

Aangezien bijna alle Campylobacter species een rol spelen bij het veroorzaken van gastro-

enteritis, is een genusspecifieke 16S rRNA gen qPCR een belangrijke detectie-methode voor

het opsporen van deze species in stoelgangstalen (de Boer et al, 2010). Daarnaast kan

confirmatie worden uitgevoerd voor de twee belangrijkste Campylobacter species

verantwoordelijk voor gastro-enteritis: C. jejuni en C. coli. Voor C. jejuni gebeurt de confirmatie

aan de hand van het mapA gen. Dit gen codeert een 24 kDa membraan-geassocieerd eiwit

dat specifiek is voor dit species. Bij C. coli wordt er gezocht naar primers en probe voor het

ceuE gen, wat voor een periplasmatisch substraatbindend eiwit van 34.5 kDa codeert (Best et

al, 2003).

1.5.4 SHIGELLA DOELWITGENEN

Bij real-time PCR detectie wordt voor Shigella vaak gezocht naar primers voor het multicopy

ipaH gen (invasion plasmid antigen H). Deze target genen zijn betrokken bij het invasieproces

van de pathogenen in de cel. Ze bevinden zich zowel in het bacterieel chromosoom als in het

invasie plasmide (Jimenez et al, 2010) en zijn aanwezig bij alle 4 de Shigella species (Thiem

et al, 2004). Ook is ze aanwezig in entero-invasieve E. coli (Jimenez et al, 2010). Virulente

Shigella sp. hebben een type III secretiesysteem dat effectoren aanbrengt in het cytosol van

de gastheercel waar ze zullen inwerken op mechanismen die het actine cytoskelet controleren

om zo invasie en cel tot cel verspreiding tot stand te brengen. Eén van deze effectoren is het

45 kDA eiwit VirA, wat ervoor zorgt dat er een pad gevormd wordt waardoor de bacterie zich

kan verplaatsen in het dichte cytoplasma van de gastheercel. VirA werkt als een cysteïne

protease dat α-tubuline selectief zal afbreken. Shigella varianten die het functionele virA gen

missen kunnen zich niet doorheen het cytoplasma verplaatsen, waardoor het doordringbaar

vermogen van deze virA mutanten verminderd wordt. Hierdoor wordt aanvaard dat virA

essentieel is voor virulentie bij Shigella.(Davis et al, 2008).

1.5.5 YERSINIA DOELWITGENEN

Pathogene Y. enterocolitica organismen worden geclassificeerd onder biogroep 1B en

biogroepen 2 tot 5. Biogroep 1B is een serotype met hoge virulentie (HV). Biogroepen 2 tot 5

hebben lage virulentie (LV). Pathogene serotypes die vaak teruggevonden worden in de

mens zijn O:8 en O:13, die beide worden ingedeeld in de HV groep (Lamps et al, 2006). Bij

vroegere real-time PCR detectie naar Y. enterolitica werd alleen gezocht naar het

chromosomaal gelegen ail (attachment and invasion locus) gen. Dit gen komt niet voor bij

stammen van biogroep 1A, die vroeger werden gezien als niet-pathogeen. In recente studies

35

werd echter aangetoond dat sommige stammen van biotype 1A toch mogelijk pathogeen

zijn. Deze stammen bevatten het yst (Yersinia stable toxin) gen (Wang et al, 2014). Virulentie

bij Y. enterocolitica ontstaat door een complexe interactie tussen genen die gelokaliseerd zijn

op zowel het plasmide als chromosomaal. De genen gelokaliseerd op het virulentieplasmide

zijn echter niet geschikt als PCR targets aangezien ze zeer onstabiel zijn (Lambertz et al,

2008). De chromosomale virulentie genen zijn het ystA gen, ystB gen en ail gen. De

plasmide genen zijn het yadA gen en het virF gen. Het ail gen komt enkel voor in pathogene

stammen van Y. enterocolitica en zorgt ervoor dat de bacterie zich kan vasthechten op de

gastheercel. Het ystA gen codeert voor de productie van het hitte-stabiele enterotoxine in Y.

enterocolitica. ystB codeert een enterotoxine dat voornamelijk voorkomt in biotype 1A

varianten van Y. enterocolitica. yadA speelt een rol bij autoagglutinatie, serumresistentie en

adhesie. virF codeert voor transcriptionele activators van het yop regulon (Thoerner et al,

2003).

1.5.6 E. COLI DOELWITGENEN

1.5.6.1 EPEC

Vele EPEC en STEC bevatten het chromosomaal eae gen, wat codeert voor het 94 kDa eiwit

intimine. Wanneer dit eiwit bindt op de intimine receptor, zorgt hij voor een betere binding van

de bacterie aan de gastheercel. EPEC en VTEC onderscheiden zich van elkaar door de

afwezigheid van het Shiga toxine-coderende gen (stx) bij EPEC (Abbasi et al, 2014). Detectie

van EPEC is gebaseerd op het screenen naar de aanwezigheid van eae en bfpA (bundle

forming pili) (Croxen, 2013). Men spreekt over typische EPEC (tEPEC) wanneer ze BFP

bevatten, gelocaliseerd op het EAF (EPEC adherence factor) plasmide. Atypische EPEC

(aEPEC) daarentegen zijn de LEE(locus for enterocyte effacement)-positieve stx-negatieve

bfp-negatieve E. coli stammen (Hazen et al, 2014). Intimine wordt gevonden in alle stammen

die A/E histopathologie induceren. De vorming van A/E laesies gebeurt bij de omverwerping

van de actine dynamiek binnen de gastheercel en wordt in de hand gewerkt door de interactie

tussen intimine en de bacteriële translocatie van de intimine recepter Tir (Croxen, 2013).

1.5.6.2 EAEC

De transcriptionele regulator van EAEC is aggR (aggregative adherence regulator). Ze

reguleert de expressie van meerdere vermeende virulentiefactoren, zoals aggregatieve

bindingsfimbriae (AAF), dispersine, de dispersine translocator Aat en het Aai type VI

secretiesysteem (Morin et al, 2013). Deze factoren spelen een rol bij de adhesie en bij de

toxine productie (Croxen et al, 2013). Uit onderzoek is gebleken dat stammen waarbij aggR

tot expressie komt meer kans hebben om diarree te veroorzaken (Morin et al, 2013). aggR is

aanwezig bij meer dan 70% van EAEC isolaten uit patiënten (Croxen et al, 2013).

1.5.6.3 STEC

STEC wordt gekarakteriseerd door de productie van twee cytotoxines, Shiga toxine 1 en 2

(Stx1 en Stx2) en in sommige stammen de aanwezigheid van het LEE locus, wat ervoor zorgt

36

dat ze kan aanhechten aan de cel en wonden kan toebrengen aan de cel (Abbasi et al, 2014).

Hun mogelijkheid tot productie van deze 2 cytotoxines is de oorzaak van de ernstige ziektes

waartoe ze kunnen leiden bij mensen (Auvray, 2008). De binding van de bacterie aan de

gastheercel wordt beïnvloed door de binding van intimine op de intimine receptor. Dit intimine

wordt geproduceerd door het eae gen (Abbasi et al, 2014).

1.5.6.4 ETEC

ETECs zijn toxinogeen door hun productie van hitte instabiele (LT) of hitte stabiele (ST)

enterotoxines. De ST toxines die gelinkt worden aan menselijke ziektebeelden kunnen verder

onderverdeeld worden in STh en STp subtypes. Hun DNA sequenties hebben slechts kleine

verschillen. De ST en LT toxines worden tot expressie gebracht door genen op bacteriële

plasmiden. Voor onderzoek naar ETEC worden er 3 primers gezocht voor de 3 toxinegenen

van ETEC: estA voor STh, estB voor STp en eltB voor LT. Bij ST-positieve DNA stalen is STh

sterker vertegenwoordigd. Bij onderzoek naar kinderen uit Bangladesh met diarree waren

slechts 7% van alle ST-positieve stammen STp-positief (Lothigius et al, 2008).

1.5.6.5 EIEC

Detectie gebaseerd op PCR gaat vaak zoeken naar het invasie plasmide antigen H (ipaH) en

het invasie-geassocieerd locus ial gen, wat aanwezig is bij zowel EIEC als Shigella species

(Croxen et al, 2013).

1.6 BESPREKING VAN DE METHODEN VOOR HET ONDERZOEK

1.6.1 DNA-EXTRACTIE

De DNA extractie wordt uitgevoerd met het QIAsymphony SP-toestel van Qiagen. Deze

geautomatiseerde manier om DNA te extraheren maakt het mogelijk om accuraat te

pipetteren, de DNA extractie blijft vrij van contaminaties en het is een robuuste, ergonomische,

kosteneffectieve en snelle methode (Gehrig et al, 2009). De DNA-extractie gaat door in

verschillende stappen:

Cellen worden gelyseerd en eiwitten worden gedenatureerd met

guanidiumisothiocyanaat (GITC).

Eiwitten worden gedegradeerd met proteïnase K en sodium dodecyl sulfaat (SDS).

De vrijgekomen nucleïnezuren worden gebonden aan magnetische silica-

micropartikels bij hoge natriumchlorideconcentratie.

Onzuiverheden worden weggewassen.

Nucleïnezuren worden geëlueerd in een buffer met lage natriumchlorideconcentratie.

Om eiwitten te denatureren wordt een chaotroop agent gebruikt die de secundaire, tertiaire of

quaternaire structuur verstoort maar de primaire structuur intact laat. De vaakst gebruikte

reagentia zijn guanidinium thiocyanaat (GTC) en GITC. Beide zijn sterke chaotrope agentia

die in staat zijn om nucleïnezuren te beschermen tegen degradatie. Echter kunnen deze

agentia ook zorgen voor precipitaatvorming, dat mogelijks zal adhereren aan het recipiënt.

37

Om de vorming van precipitaten te voorkomen wordt een eiwit degraderend component

toegevoegd. Meestal wordt hiervoor gebruik gemaakt van een proteolytisch enzym dat de

splitsing in peptidebindingen katalyseert bij eiwitten, polypeptiden, oligopeptiden en peptiden.

Bij deze extractie wordt gekozen voor proteïnase K. Proteïnase K is ook resistent tegen

denaturatie door anionische detergenten zoals SDS (Voss T, 2014). SDS is een detergent dat

ervoor zal zorgen dat celmembranen worden opgelost en dat de overgebleven proteïnen een

negatieve lading krijgen (Maervoet & Van Hoorde, 2015).

De vrijgestelde nucleïnezuren kunnen geëxtraheerd worden door binding aan een vaste fase,

gevolgd door een wasstap waarbij onzuiverheden worden weggewassen en tot slot elutie van

de nucleïnezuren. Voor deze vaste fase wordt gebruik gemaakt van magnetische silica

partikels. Bij aanwezigheid van een hoge concentratie aan chaotrope zouten wordt een

hydrofoob milieu verkregen wat de binding tussen nucleïnezuren en silica-partikels mogelijk

maakt. Ook wordt de binding nog extra versterkt doordat de silica-partikels gesatureerd

worden met een positieve lading door de hoge concentratie aan chaotrope zouten. Door te

werken met magnetische silicapartikels kan de afscheiding van deze partikels, gebonden met

nucleïnezuren, van onzuiverheden uitgevoerd worden door het aanleggen van een

magnetische veld. Voor elutie wordt een buffer gebruikt met een lage zoutconcentratie zodat

de nucleïnezuren opnieuw worden gescheiden van de silicapartikels (SourceBioscience,

2016).

1.6.2 REAL-TIME PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) is een efficiënte DNA amplificatietechniek, ontwikkeld door

Kary Mullis in 1985. Opdat de PCR zou kunnen doorgaan, moeten er een aantal componenten

aanwezig zijn in de oplossing: een zo zuiver mogelijk DNA (of RNA) template, buffer bij pH 8

om depurinisatie en DNA nicking te vermijden, Mg2+-ionen als cofactor van de meeste DNA

polymerasen, thermostabiel DNA polymerase, deoxynucleotiden (dNTP; 200µM (µM of nM)

van dATP, dGTP, dCTP en dTTP) en een forward en reverse primer die complementair zijn

aan 1 van de 2 DNA-strengen. Het best gekende DNA polymerase is het Taq polymerase,

afkomstig van de thermofiele Thermus aquaticus. Deze heeft echter enkel 5’-3’ exonuclease

activiteit en geen 3’-5’ exonuclease activiteit waardoor er tijdens de PCR cycli meer fouten

kunnen ingebouwd worden in de sequentie.

De PCR gaat door in verschillende stappen:

Initiële denaturatie: het DNA wordt gedenatureerd gedurende 2-5 minuten bij 95-

98°C door verbreking van de waterstofbruggen aanwezig in de dubbele helix.

Daarna worden er 20 tot 40 cycli uitgevoerd, bestaande uit 3 stappen

Denaturatie waarbij dsDNA wordt gescheiden tot 2 ssDNA ketens.

Primer annealing waarbij de aanwezige primers zullen hechten aan de

gedenatureerde DNA ketens. De annealingtemperatuur is 5°C lager dan de

smelttemperatuur van de primers, deze ligt meestal tussen 50-70°C.

Elongatie of primer extension waarbij het thermostabiele DNA polymerase zal

hechten aan het 3’-uiteinde van de primer waardoor dsDNA verkregen wordt

(Maervoet, 2014).

38

Dit gaat maximaal 40 cycli door, daarna bereikt de PCR een plateau waarbij de activiteit van

het polymerase daalt door uitputting van dNTP’s, door inhibitie door, de overmaat aan

aanwezig amplicon en door een verminderde activiteit van het enzyme. (Van Houdt, 2012).

Deze methode maakt een exponentiële vermeerdering mogelijk van de doelwitsequentie. Het

is een snelle, gevoelige en specifieke analysemethode (Maervoet, 2014).

Bij real-time PCR is het mogelijk om bij een PCR reactie het PCR product continu te volgen

na elke cyclus. De concentratie aan product kan worden gevolgd door het gebruik van een

fluorescent signaal in de reactiemix. Dit wordt voorgesteld aan de hand van een grafiek waarbij

de fluorescentie wordt uitgezet in functie van het aantal PCR cycli. Deze grafiek wordt in figuur

14 voorgesteld. De sterkte van het bekomen fluorescent signaal is gelinkt aan de hoeveelheid

gevormd product tijdens de PCR reactie. Aan het begin van de reactie kan het signaal niet

worden onderscheiden van de ruis. Het is maar na een aantal cycli dat er genoeg product is

aangemaakt zodat het signaal deze drempelwaarde, de baseline threshold, kan overschrijden

en gedetecteerd worden. De cyclus waar dit gebeurt wordt de kwantificatie cyclus of Cq

genoemd. Vanaf de Cq waarde zal het signaal exponentieel toenemen aangezien de

concentratie aan product theoretisch gezien verdubbelt na elke cyclus (Tawe,2014). Na een

bepaalde tijd zal de grafiek overgaan in een plateaufase waarbij geen product meer wordt

gevormd aangezien het TaqDNA polymerase geïnhibeerd wordt door de hoge concentratie

aan amplicon (Maervoet, 2014).

Figuur 14: theoretische voorstelling van een real-time PCR curve (Tawe,2014).

Zoals hierboven al werd aangegeven, wordt bij real-time PCR de fluorescentie-intensiteit

gemeten tijdens het amplificatieproces. Dit fluorescent signaal kan bekomen worden door

gebruik van specifieke of niet-specifieke labels (Tawe, 2014).

39

1.6.2.1 VOORWAARDEN WAARAAN PRIMERS MOETEN VOLDOEN

De primers die gebruikt worden bij qPCR moeten voldoen aan enkele voorwaarden. Zo moeten

ze een lengte hebben van 18 tot 25 nt en moet er 40 tot 60% GC’s aanwezig zijn. Ook moeten

complementaire sequenties aan het 3’ uiteinde van een primerpaar vermeden worden, dit om

de vorming van heterodimeren te voorkomen. Daarnaast moeten ze aan het 3’-uiteinde een

GC-klem hebben die uit niet meer dan 3 G’s of C’s mag bestaan. (Maervoet, 2014).

1.6.2.2 NIET SPECIFIEKE LABEL: SYBR

Als niet-specifiek label kan gewerkt worden met dsDNA bindende fluorochromen zoals SYBR

Green, picogreen en quentiflor dye, waarbij SYBR Green I het vaakst gebruikt wordt

(Maervoet, 2014). Zijn structuur wordt voorgesteld in figuur 15.

Figuur 15: Structuur SYBR Green I (Maervoet, 2014).

SYBR Green I is een assymmetrische cyanine kleurstof die niet-specifiek bindt met de kleine

groef van dubbelstrengig DNA en daarbij een fluorescent signaal kan uitzenden (Tawe, 2014).

Het absorbeert blauw licht (met λmax = 497 nm) en emitteert groen licht (met λmax = 520 nm) en

zijn fluorescentie-intensiteit ligt hoger wanneer ze gebonden is aan DNA waardoor een

verhoogde intensiteit kan gemeten worden tijdens de amplificatie (Maervoet, 2014). Het

werkingsprincipe wordt voorgesteld in figuur 16. Aangezien het niet specifiek is kan het ook

primer-dimers en contaminaties detecteren waardoor het beter is om de reactie te combineren

met een smeltcurve-analyse. Een primer dimer ontstaat wanneer 2 primers aan elkaar hechten

door aanwezigheid van complementaire basen in hun sequentie (Tawe, 2014).

40

Figuur 16: SYBR Green I mechanisme. SYBR Green I bindt niet aan enkelstrengig DNA waardoor geen signaal

wordt uitgezonden. Wanneer het DNA terug dubbelstrenging wordt door polymerisatie kan het SYBR Green I

wel binden en wordt er een fluorescent signaal gedetecteerd (Tawe, 2014).

Bij een smeltcurve-analyse wordt bepaald aan het eind van de PCR waarbij de negatieve

verandering van de fluorescentie-intensiteit wordt uitgezet ten opzichte van de temperatuur.

Tijdens de smeltcurve-analyse wordt de temperatuur steeds verhoogd en wanneer ze de

smelttemperatuur (Tm) van het amplicon bereikt zal ze worden gedenatureerd, komt SYBR

Green vrij en zal de intensiteit van het fluorescentie-signaal dalen. Deze Tm kan bepaald

worden met de formule van Walace en is voornamelijk afhankelijk van het GC-gehalte. De

smeltcurve geeft de specificiteit van de PCR weer, aangezien er bij een zuiver amplicon slechts

1 piek te zien zal zijn, ter hoogte van zijn Tm. Wanneer er echter primerdimers gevormd zijn

of als er contaminatie aanwezig is, zullen meerdere pieken verkregen worden. (Maervoet,

2014). In figuur 17 wordt een voorbeeld van een smeltcurve-analyse weergegeven.

Figuur 17: Smeltcurve-analyse voor een homozygoot wild type, homozygote mutant en een heterozygoot

(Hoffman et al, 2007).

41

1.6.2.3 SPECIFIEKE LABEL : PROBE (MGB)

Bij een specifiekere qPCR zal men werken met probes die gelabeld zijn met een fluorochroom.

Hiervoor kan gewerkt worden met een TaqMan probe, dit zijn sequentie-specifieke

oligonucleotiden met aan hun 5’ uiteinde een fluorofoor (reporter) en aan hun 3’ uiteinde een

niet-fluorescerende quencher (Tawe, 2014). De emissiegolflengte van de reporter stemt

overeen met de excitatiegolflengte van de quencher (Maervoet, 2014). De quencher zal de

fluorescentie van het fluorofoor uitdoven wanneer het fluorofoor en de quencher zich dicht bij

elkaar bevinden. De TaqMan probe kan aanhechten aan zijn complementaire sequentie op

het target DNA net voor de primerannealing stap van de PCR waarbij nog steeds geen signaal

wordt gedetecteerd. Daarna zorgt de 5’-3’ exonuclease activiteit van het Taq DNA polymerase

tijdens de elongatiefase ervoor dat de probe wordt afgebroken, waarbij quencher en fluorofoor

van elkaar worden losgemaakt. Hierdoor is de afstand tussen quencher en fluorofoor groot

genoeg waardoor het fluorescent signaal kan gedetecteerd worden bij de golflengte die

overeenkomt met de emissie-golflengte van de reporter. Het werkingsprincipe van de TaqMan

probe wordt voorgesteld in figuur 18 (Tawe, 2014).

Figuur 18: TaqMan probe mechanisme (Tawe, 2014).

Het werken met een TaqMan probe heeft een aantal voordelen, zoals het creëren van een

grotere specificiteit door de selectiviteit van de probe, de lage detectielimiet en de mogelijkheid

om probes met verschillende fluorochromen in één reactie toe te voegen. (Maervoet, 2014).

Minor groove binders (MGB) zijn een groep DNA probes die kunnen binden aan dsDNA. Ze

zijn lange, platte moleculen die bestaan uit een aantal subunits, bij elkaar gehouden door

peptiden die de vorm kunnen aannemen van een halve maan. Door hun halve-maan structuur

kunnen ze in de kleine groef van het dsDNA passen. Daar worden ze gestabiliseerd door

hydrofobe interacties. Wanneer het MGB wordt toegevoegd aan het 5’-uiteinde van een DNA

probe, kan ze tijdens de synthese binden in de kleine groef en zorgt ze voor een stabilisatie

van het probe-target complex (Corpus, 2010), waardoor kortere probes gebruikt kunnen

worden. Aangezien het gevormd complex stabieler is, zal een hogere temperatuur nodig zijn

om de strengen te doen dissociëren. Ook zal bij het gebruik van MGB de specificiteit

bevorderen (Kutyavin et al, 2000). Door het gebruik van MGB zal een lagere

42

achtergrondfluorescentie verkregen worden. Deze gaat iets stijgen met een langere

probelengte maar is nog steeds lager dan bij probes zonder MGB (Crocker & Murray, 2003).

1.6.3 GELELEKTROFORESE

Gelelektroforese is een techniek die gebruikt wordt om macromoleculen (voornamelijk eiwitten

en nucleïnezuren) van elkaar te scheiden of op te zuiveren. Dit wordt gedaan op basis van

grootte of lading. De stalen worden geplaatst op een matrix die ondergedompeld wordt in een

buffer om de pH constant te houden. Deze buffer zorgt ook voor ionen die de conductiviteit

bevorderen. Meestal wordt gebruik gemaakt van Tris-acetaat-EDTA (TAE) of Tris-boraat-

EDTA (TBE) als buffer. Hierover wordt een elektrisch veld aangelegd waardoor de moleculen

worden aangetrokken tot ofwel de negatieve of positieve pool. Aangezien nucleïnezuren een

negatieve lading hebben door hun aanwezige fosfaatgroepen, zullen ze worden aangetrokken

tot de positieve pool. Eiwitten kunnen zowel positief als negatief geladen zijn. Daarnaast is er

ook een verschil in migratie op basis van confirmatie. DNA komt voor in 3 confirmaties:

supercoiled, lineair en circulair. Wanneer DNA dezelfde massa heeft maar voorkomt in

verschillende confirmaties zal ze sneller migreren wanneer ze supercoiled is en circulair DNA

zal het traagst migreren. Dit komt doordat supercoiled DNA kleiner is waardoor ze minder

weerstand ondervindt van de gel. Hierop is ook de scheiding op grootte op gebaseerd: hoe

kleiner de molecule, hoe sneller ze zal migreren.

De matrix die gebruikt wordt is in het algemeen een agarose- of polyacrylamidegel. Agarose

is een polysacharide die aangemaakt wordt uit zeewier. Er wordt voornamelijk gebruik

gemaakt van 0.5 tot 2% gels. Hierdoor kunnen DNA-fragmenten van 200 tot 50 000 baseparen

gescheiden worden. Een hogere concentratie aan agarose wordt gebruikt voor een scheiding

van kleinere DNA-fragmenten en vice versa. Agarosegels zijn niet toxisch en hebben een grote

scheidingsrange. Echter hebben ze wel een relatief lage resolutie.

Polyacrylamide is een cross-linkpolymeer van acrylamide. De lengte van deze polymeerketens

hangt af van de gebruikte concentratie aan acrylamide. Deze ligt meestal tussen 3.5 en 20%.

Polyacrylamidegels zijn moeilijker om mee te werken aangezien zuurstof de polymerisatie

inhibeert. Ook is acrylamide een neurotoxine. Polyacrylamide is op zich niet toxisch maar moet

nog steeds voorzichtig worden behandeld aangezien het mogelijk is dat er vrij acrylamide in

aanwezig is. Polyacrylamidegels hebben een kleinere scheidingsrange dan agarosegels maar

hebben een zeer hoge resolutie. Ze worden voornamelijk gebruikt bij het scheiden en

karakteriseren van proteïnemengsels.

De stalen worden op de matrix aangebracht met een ladingsbuffer die glycerol en een kleurstof

(bv. Broomfenolblauw) bevat. De glycerol is een dichte stof die het staal in de well doet zakken

en de kleurstof zorgt ervoor dat de migratie van het staal makkelijker kan gevolgd worden.

Daarnaast is er ethidium bromide aanwezig in de gel die het mogelijk maakt om de DNA

fragmenten te visualiseren. Het is een fluorescente kleurstof die intercaleert met DNA en RNA.

Ethidium bromide is een gekend mutageen dus het is noodzakelijk om steeds met

handschoenen te werken. Om het DNA zichtbaar te maken moet de gel geplaatst worden

onder UV-licht (Bowen, 2000).

43

1.6.4 DNA SEQUENTIEBEPALING

Sanger en Gilbert ontwikkelde sequenering met ofwel ketenafbraak ofwel chemische

fragmentatietechnieken, gekoppeld aan scheiding naar grootte gebaseerd op elektroforese.

De Sanger methode gebruikt dideoxynucleotide trifosfaten (ddNTPs) als DNA keten

terminators. Deze wordt vaker gebruikt dan de Maxam-Gilbert chemische

fragmentatietechnieken aangezien de Sanger methode efficiënter is, er minder toxische

chemicaliën gebruikt worden en dat ze minder radioactief is (Karger & Guttman, 2009).

ddNTP’s zijn dideoxyribonucleotides en bevatten geen hydroxyl-groep aan hun 3’-uiteinde.

Wanneer een ddNTP wordt ingebouwd in een sequentie, kan de DNA-keten niet verder

verlengd worden en ligt de reactie stil. De concentratie aan dNTP’s ligt wel een stuk hoger dan

die van ddNTP’s (Seqcore, 2015).

De klassieke ketenafbraak methode is gelijkaardig aan een PCR, hierbij wordt een DNA primer

gebruikt die radioactief of fluorescent gelabeld is, een enkelstrengig (ss) template, een DNA

polymerase enzym en zowel deoxy- als dideoxynucleotiden. Het template wordt opgedeeld in

4 aliquots waarin zich dATP, dGTP, dCTP, dTTP en DNA polymerase bevindt. Aan elke reactie

wordt 1 van de 4 keten afbrekende dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP of ddTTP)

toegevoegd zodat deze aan het einde van een DNA fragment worden geplaatst tijdens de

elongatiereactie. Hierdoor worden DNA fragmenten verkregen van verschillende lengtes.

Deze worden gedenatureerd door een hittereactie en worden gescheiden aan de hand van

gelelektroforese met een polyacrylamidegel. De 4 reacties werden in 4 laantjes van een

elektroforesegel gebracht (lanen A, T, G en C) waarna de DNA bandjes werden gevisualiseerd

door middel van autoradiografie of UV-licht. De sequentie kon dan manueel bepaald worden

aan de hand van het patroon van de 4 parallelle runs. Deze methode kan geautomatiseerd

worden aan de hand van fluorescent gelabelde ddNTP’s of capillaire elektroforese (Karger &

Guttman, 2009).

Figuur 19: Bekomen resultaat bij DNA sequenering volgens Sanger met fluorescent gelabelde ddNTPs. De 4

ddNTPs zijn telkens gelabeld met een verschillend kleur. De keten elongatie gaat door totdat een ddNTP zich

vasthecht aan het fragment. Hierdoor wordt een mix aan fragmenten bekomen met een verschillende lengte en

deze worden gescheiden van elkaar door middel van gelelelektroforese op basis van grootte. De DNA sequentie

kan worden afgeleid van het bekomen kleurpatroon (Fei, 2014).

44

Bij geautomatiseerde DNA sequencers kan de klassieke elektroforesegel vervangen worden

door capillaire elektroforese. Hierbij wordt het DNA sequeneringsproduct tijdens de

elektroforese in het glasvezel capillair gebracht door middel van elektrokinetische injectie. Er

wordt een hoge spanning aangelegd gedurende korte tijd over de sequeneringsreactiebuffer

die de negatief geladen fragmenten in het capillair zal duwen. De sequenties worden

gescheiden op basis van hun totale lading en verlaten het capillair gerangschikt volgens

grootte. Een ultraviolet laser ingebouwd in de sequencer bestraalt het product nadat het de

elektroforese is doorgelopen om fluorescentiesignalen te kunnen opvangen. De computer kan

dan een plot van het staal genereren, waarbij de fragmenten gerangschikt worden van kortste

naar langste. Door interpretatie van het fluorescentiesignaal kan de nucleotide sequentie

bepaald worden (Fei, 2014) (GenSeq, 2015). Een fragment van zo’n plot wordt voorgesteld in

figuur 20.

Figuur 20: Fragment van een DNA sequentie file (GenSeq, 2015).

45

2. MATERIAAL EN METHODEN

2.1 SELECTIE VAN PRIMERS EN PROBES

De selectie van de gebruikte primers en probes in deze masterproef werd gedaan op basis

van een aantal gepubliceerde artikels, waarop hieronder verder zal worden ingegaan. De

sequenties van deze primers en probes en de eventuele wijzigingen van de sequenties die

deze hebben ondergaan zullen hier niet worden weergegeven in verband met confidentialiteit.


De gebruikte primers voor Clostridium difficile worden gegeven in tabel 3.

Tabel 3: Te testen primers voor Clostridium difficile

Forwarda Reverseda Referentieb

16S p503 p506 Mutters et al, 2009

Clostridium difficile Toxine A enterotoxin

einde tcdA gen p510 p511 eigen ontwerp

begin tcdA gen p512 p513 Jensen et al, 2015

begin tcdA gen p514 p515 Wroblewski et al, 2009

Clostridium difficile Toxine B cytotoxin

p516 p517 Jensen et al, 2015

p518 p519 Wroblewski et al, 2009

p526 p527 van den Berg et al, 2006

Clostridium difficile Binair Toxine

C. difficile Binair Toxine A enzymatic component p520 p521 Wroblewski et al, 2009

C.difficile Binair Toxine A enzymatic component p522 p523 Jensen et al, 2015

C. difficile Binair Toxine B binding component p524 p525 Wroblewski et al, 2009

a: enkel primercode wordt weergegeven (geen sequentie) wegens confidentialiteit. b: referentie waarop gebaseerd werd om de primers verder te ontwikkelen

2.1.2 SALMONELLA

De uit te testen primers voor Salmonella spp zijn samengevat in tabel 4.

Tabel 4 : Te testen primers Salmonella spp.


ompF (outer membrane porin F gene) p568 p569 Josefsen et al, 2004; Soli et al, 2010

ttr (The genes ttrA, ttrB, and ttrC encode the tetrathionate reductase structural proteins)

p570 p571 Bruijnesteijn & van Coppenraet, 2015; de Boer et al, 2010; Lin et

al, 2011 ttr p572 p573 Omiccioli et al, 2009 invA (Salmonella invasion protein gene) p574 p575 Zhang et al, 2011 invA p576 p577 Liu et al, 2013 ssaN (putative type III secretion ATP synthase gene (ssaN).)

p578 p579 Chen et al, 2010


46

2.1.3 CAMPYLOBACTER

De uit te testen primers voor Campylobacter spp zijn samengevat in tabel 5.

Tabel 5: Te testen primers Campylobacter.


16S (5 species: jejuni, coli, lari, upsaliensis, hyointestinalis) p556 p558 Boer et al, 2013




16S (All) p560 p561 Boer et al, 2013

Campylobacter jejuni

cadF (Campylobacter adhesin to fibronectin) p562 p563 Elfving et al, 2014

mapA (a species-specific 24-kDa membrane-associated protein)

p564 p565 Elfving et al, 2014

Campylobacter coli

ceuE(encoding a periplasmic substrate binding protein) p566 p567 Boer et al, 2013


2.1.4 SHIGELLA

De uit te testen primers voor Shigella spp zijn samengevat in tabel 6.

Tabel 6: Te testen primers Shigella.


ipaH p627 p628 Eigen ontwerp

virA p629 p630 Al-Talib et al, 2014


2.1.5 YERSINIA

De uit te testen primers voor Yersinia spp zijn samengevat in tabel 7.

Tabel 7: Te testen primers Yersinia spp.


Enterotoxin Yst precursor p646 p647 Elfving et al, 2014 Heat-stable toxin yst p648 p650 Bruijnesteijn &

van Coppenraet, 2015

Heat-stable toxin yst p649 p651 Eigen ontwerp yst p652 p653 Cremonesi et al,

2014 ail (Y. enterocolitica attachment invasion locus gene) p654 p655 Lambertz, 2008


47


De uit te testen primers voor Escherichia coli zijn gegeven in tabel 8.

Tabel 8: Te testen primers Escherichia coli.


EPEC eae (outer surface protein intimin) p580 p581 Bruijnesteijn & van

Coppenraet, 2015 eae p582 p583 Nielsen & Andersen, 2003 bfpA (bundle-forming pilus encoded by the EPEC adherence factor (EAF) plasmid)

p584 p585 Hardegen et al, 2010

bfpA p586 p587 Liu et al,2013 bfpA p588 p589 Bruijnesteijn & van

Coppenraet, 2015 EAEC aggR p590 p591 Bruijnesteijn & van

Coppenraet, 2015 STEC stx1 (Shiga-like toxin ) p593 p596 de Boer et al, 2010 stx1 p594 p596 de Boer et al, 2010 stx1 p595 p596 Bruijnesteijn & van

Coppenraet, 2015 stx1 p597 p599 Liu et al, 2013 stx1-O157:H7 p598 p600 Sharma & Dean-Nystrom,

2003 stx2 p601 p603 Bruijnesteijn & van

Coppenraet, 2015 stx2 p602 p603 de Boer et al, 2010 stx2 p604 p605 Jinneman, 2003 ETEC estA p606 p608 Elfving et al, 2014 estA (Heat-stable enterotoxin I) p606 p609 Bruijnesteijn & van

Coppenraet, 2015 estA p606 p610 Lothigius et al,2008 estA p606,1 P610 Lothigius et al,2008 estA p606,2 p610 Lothigius et al,2008 estA p607 p608 Lothigius et al,2008 estA p607 p609 Lothigius et al,2008 estA p607 p610 Lothigius et al,2008 estB (STp) p611 p612 Bruijnesteijn & van

Coppenraet, 2015 estB (STp) p611 p613 Lothigius et al,2008 eltB (LT) p614 p615 Elfving et al, 2014 eltB (LT) p616 p617 Liu et al, 2013 ETEC LT p618 p619 Bruijnesteijn & van

Coppenraet, 2015 Escherichia coli LT gen. Heat-stable toxin eltB p618 p620 Lothigius et al, 2008 lt p621 p622 Soli et al, 2014 LT gene LT-1 for p621 p623 Hardegen et al, 2010 EIEC ipaHc p624 p626 Liu et al, 2013 Shigella spp./EIEC Invasive plasmid ipaH 10 p625 p626 Bruijnesteijn & van

Coppenraet, 2015; Thiem et al,2004


48

De primers en probes worden aangekocht in concentraties van 100 pmol/µl en bewaard bij -

30°C.

2.2 REINCULTUREN

De verschillende bacteriële stammen gebruikt tijdens de validatie van de verschillende PCRs

zijn afkomstig van het UZ Brussel (C. difficile), werden aangekocht bij het ATCC of maken deel

uit van een eigen collectie van stammen geïsoleerd uit klinische stalen. Deze reinculturen zijn

verzameld in tabellen 9 tot 13.

Tabel 9: Overzicht reinculturen Clostridium difficile en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.

Clostridium difficile 16S tcdA tcdB binA binB

898 + - + - -

901 + + + + +

902 + + + - -

5475 + + + - -

5476 + - + - -

5477 + + + + +

Tabel 10: Overzicht reinculturen Salmonella en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.

Salmonella spp ompF ttr ssaN

ATCC 14028 (S. enterica) + + + 3A9 53 (S. enteritidis) + + + 3A9 87 (S. groep B) + + + 3A9 86 (S. groep C) + + + 3A9 02 (S.D.) + + + 3A9 82 (S. groep D) + + +

Tabel 11: Overzicht reinculturen Campylobacter en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.

Campylobacter spp 16S cadF (C. jejuni) ceuE (C. coli)

3A9 15 (C. jejuni) + + -

3A9 23 (C. jejuni) + + -

ATCC 33291 (C. jejuni) + + -

3A9 42 (C. coli) + - +

3A9 89 (C. coli) + - +

3A9 75 (C. coli) + - +

Tabel 12: Overzicht reinculturen Shigella en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.

Shigella spp ipaH virA

3A8 74 (S. boydii) + +

3A9 09 (S. flexneri) + + ATCC 12022 (S. flexneri) + + ATCC 25931 (S. sonnei) + +

49

Tabel 13: Overzicht reinculturen Yersinia en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.

Yersinia enterocolytica yst ail

ATCC 23715 (Y. enterocolitica) + + 3A9 86 (Y. enterocolitica) + + 3A8 89 (Y. pseudotuberculosis) + + 1C6 87 (Y. enterocolitica) + + 1C6 88 (Y. enterocolitica) + + 1C6 93 (Y. enterocolitica) + + 1C6 97 (Y. enterocolitica) + + 1C6 99 (Y. enterocolitica) + + 1C8 02 (Y. enterocolitica) + + 1C6 92 (Y. pseudotuberculosis) + +

2.3 VIRCELL DNA CONTROLES

Voor Escherichia coli werd gebruik gemaakt van Vircell DNA controles. Deze worden

gegeven in tabel 14.

Tabel 14: Weergave vircell DNA controles en de genen waarvoor ze positief/negatief zijn.

Escherichia coli eae bfpA aggR stx1 stx2 estA eltB ipaH

MBC121 (EAEC) - - + - - - - -

MBC122 (EIEC) - - - - - - - +

MBC123 (EPEC) + - - - - - - -

MBC124 (ETEC) - - - - - + - -

MBC022 (STEC) - - - + + - + -

2.4 FECESSTALEN

Tabel 15 geeft alle klinische stalen weer die gebruikt werden tijdens de specificiteitsstudie. De

resultaten weergegeven in tabel 15 is gebasseerd op basis van klassieke bacteriologische

kweekprocedures en Gen Expert resultaten (voor C. difficile) binnen het labo bacteriologie van

het AZ Sint Jan Brugge.

50

Tabel 15: Gebruikte fecesstalen.

Feces Species gedetecteerd Feces Species gedetecteerd

163596001 Shigella flexneri 215900401 Campylobacter jejuni

164942201 Shigella sonnei 215985201 Campylobacter coli

177573801 Shigella sonnei 217853301 negatief

185922001 Shigella flexneri 219264001 Yersinia enterocolitica

199236701 Shigella boydii 221398528 Shigella boydii

208897001 Yersinia enterocolitica 223679901 C. difficile 16S, negatief voor toxine A en B en binair toxine

209571701 Campylobacter jejuni 224940501 Alle C. difficile genen

209873401 Salmonella typhimurium 225059901 Alle C. difficile genen

210635301 negatief a 225561501 C. difficile positief 16S, toxine A en B, negatief voor binair toxine

210945301 negatief 231048601 C. difficile positief 16S, toxine A en B, negatief voor binair toxine

212258801 negatief 231459301 C. difficile positief 16S, toxine A en B, negatief voor binair toxine

212380801 Alle C. difficile genen 233842501 C. difficile positief 16S, toxine A en B, negatief voor binair toxine

212404201 negatief 234337701 Alle C. difficile genen

212407201 C. difficile 16S, negatief voor toxine A en B en binair toxine

234557701 C. difficile 16S, negatief voor toxine A en B en binair toxine

212410501 negatief 234698701 C. difficile 16S, negatief voor toxine A en B en binair toxine

212449101 Alle C. difficile genen 235433201 C. difficile 16S, negatief voor toxine A en B en binair toxine

212478401 Alle C. difficile genen 235540101 Alle C. difficile genen



213467001 C. difficile 16S, toxine A en B 236690501 negatief

214521901 Alle C. difficile genen 236704101 negatief

215252501 Campylobacter jejuni 236704601 negatief

215548201 C. difficile positief 16S, toxine A en B, negatief voor binair toxine

236716901 negatief

a negatief: geen pathogene species werden gedetecteerd a. d. h. v. de klassieke kweekprocedures binnen het

labo bacteriologie

2.5 MASTERMIXEN

2.5.1 SYBR® SELECT MASTER MIX

De primers worden aangekocht in concentraties van 100 pmol/µl en bewaard bij -30°C. Als

mastermix wordt hier gebruik gemaakt van de SYBR Select Mastermix (Thermofischer,

cataloog nr 4472908), deze wordt aangekocht in een dubbele concentratie. De samenstelling

van deze mastermix is terug te vinden in tabel 16. De mastermix wordt bewaard bij 4°C.

51

Tabel 16: Bestanddelen SYBR® Select Master Mix (Life Technologies, 2015).

Bestanddelen

SYBR® GreenER™ dye

AmpliTaq® DNA Polymerase UP

dNTPs met een dUTP/dTTP mix

hitte-labiel UDG

ROX dye (passieve referentie)

geoptimaliseerde buffer componenten

Als DNA-staal kan er gebruik gemaakt worden van opgekweekte culturen of fecesstalen.

Beiden worden eerst geëxtraheerd volgens onderstaande werkwijze.

2.5.2 TAQMAN® FAST VIRUS 1-STEP MASTER MIX

Als mastermix wordt hier gebruik gemaakt van de FAST Mastermix (Thermofischer, cataloog

nr. 4444432). De samenstelling van deze mastermix is terug te vinden in tabel 17.

Tabel 17: Bestanddelen TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix (Thermofischer, 2012).

Bestanddelen

AmpliTaq® Fast DNA Polymerase

Thermostabiel MMLV enzym

dNTPs (dATP, dGTP, dCTP en dTTP)

RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor

ROX™ dye (passieve referentie)

Buffer componenten, geoptimaliseerd voor maximale gevoeligheid en tolerantie naar verschillende vaak voorkomende RT-PCR inhibitoren

Deze mastermix wordt geleverd in 4X concentratie.

2.6 DNA-EXTRACTIE

2.6.1 BENODIGDHEDEN

DNA-extracties worden uitgevoerd met de QiaSymphony van Qiagen. Hierbij kan gebruik

gemaakt worden van 2 extractieprotocollen: het pathogen complex 400 en het pathogen

complex 800. In deze thesis werd telkens gebruik gemaakt van het pathogen complex 800.

Hierbij wordt telkens 800 µl staal geëxtraheerd en geëlueerd in 110 µl.

2.6.2 WERKWIJZE

2.6.2.1 EXTRACTIE VAN FAECES MATERIAAL

Bij een lopend faeces-staal wordt ongeveer 100 µl staal overgebracht naar een Sarstedt-tube.

Wanneer het staal een vaste consistentie heeft, wordt met een oogentnaald een kleine

hoeveelheid overgebracht naar een Sarstedt-tube. Deze stalen worden dan aangelengd met

DNAzol Reagent (lifetechnologies) tot 1 ml. Hierbij wordt gezorgd dat de stalen steeds

https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4444432

52

gehomogeniseerd worden door te vortexen. Als het hierna nog niet mogelijk is om een

homogeen staal te verkrijgen, wordt er zoveel mogelijk van de vloeibare fase overgebracht in

een nieuwe Sarstedt-tube en opnieuw aangelengd tot 1 ml. Voor de Qiasymphony is het

belangrijk dat er minimaal 950 en maximaal 1300 µl aanwezig is in de Sarstedt-tube.

2.6.2.2 EXTRACTIE VAN REINCULTUREN

Voor reinculturen wordt er met een oogentnaald een kleine hoeveelheid overgebracht naar

een Sarstedt-tube. Deze stalen worden dan aangelengd met DNAzol Reagent

(lifetechnologies) tot 1 ml. Hierbij wordt gezorgd dat de stalen steeds gehomogeniseerd

worden door te vortexen. Voor de Qiasymphony is het belangrijk dat er minimaal 950 en

maximaal 1300 µl aanwezig is in de Sarstedt-tube.

2.6.2.3 EXTRACTIE OP QIASYMPHONY

De QIAsymphony wordt aangeschakeld. Dit wordt uitgevoerd door de reagent cartridges

“QIAsymphony Virus/Pathogen Midi kit en verbruiksgoederen te laden in de “Reagents and

Consumables” lade. De magnetische particles worden gevortexed en teruggeplaatst in de

cartridge. De deksels worden verwijderd en de proteïnase K wordt geplaatst op de cartridge.

Daarna wordt de ATL-buffer geplaats op het toestel en de cartridge in het toestel. Daarbij moet

gecontroleerd worden dat de “Waste” lade goed voorbereid is door een “inventory scan” uit te

voeren op de “Waste” lade.

Het vereiste elutie rek wordt geladen in de “Eluate” lade en de stalen in de “sample” lade. De

tube(s) die interne controle–carrier RNA–Buffer AVE mixture bevatten moeten in slot A van de

"Sample" lade geplaatst worden. Daarna wordt de nodige informatie voor iedere batch van

stalen ingegeven: staalinformatie, PDV, protocol en elutievolume. Om op te starten wordt op

de “Run” button gedrukt. Na extractie wordt het elutie rek met gezuiverd nucleïnezuur van de

“Eluate” lade verwijderd. Het eluaat wordt in de koelkast bewaard bij 4°C.

2.7 REAL-TIME PCR MET SYBR SELECT MASTERMIX + SMELTCURVEANALYSE

De aangekochte primers (100 pmol/µl) worden met molecular grade water 5 keer verdund tot

20 pmol/µl in Sarstedt-tubes. De PCR-mixen worden aangemaakt volgens tabel 18 en 19

naargelang de gewenste concentratie. Dit is de samenstelling voor 1 PCR-reactie.


Samenstelling 1 reactie (µl) Finale Concentratie

Forward primer (20 pmol/µl) 0,3 300 nM

Reverse primer (20 pmol/µl) 0,3 300 nM

SYBR select mastermix (2x) 10 1x

DNA extract 5

Molecular grade water 4,4

totaal 20

53



Forward primer (20 pmol/µl) 1 1000 nM

Reverse primer (20 pmol/µl) 1 1000 nM

SYBR secret mastermix (2x) 10 1x

DNA extract 5

Molecular grade water 3

totaal 20

Deze mix wordt aangemaakt voor het gewenste aantal reacties + 1. De mix wordt ook

gemengd door de tube een paar keer te inverteren. Daarna ondergaat de tube ook een short

spin centrifugatie zodat het totale volume naar de bodem zakt. Van deze mix wordt per PCR-

reactie 15 µl overgebracht naar MicroAmpTM optical 8-cap strips of naar een MicroAmpTM

Optical 96-Well reactieplaat. Hierna wordt aan iedere well het gewenste geëxtraheerde DNA-

staal toegevoegd. Er wordt telkens 5 µl toegevoegd aan elke well. De plaat of strips worden

afgesloten met optical covers of een optical seal, daarna worden ze eerst kort gevortexd en

ondergaan ze een short spin centrifugatie. De reactie wordt uitgevoerd met het ViiA7 RT-PCR

reactietoestel van Life Technologies. Hierna worden ze in de ViiA7 geplaatst voor de run. Deze

ondergaat een proces, terug te vinden in figuur 21.

Figuur 21: PCR cycli voor real-time PCR met SYBR select mastermix + smeltcurveanalyse

2.8 EFFICIËNTIEBEPALING

Per pathogeen wordt gewerkt met 1 of 2 reinculturen waarvan een reeks van 10-voudige

verdunningen wordt opgesteld. De reacties worden uitgevoerd in een Real-Time PCR reactie

met SYBR Select mastermix en een primerconcentratie van 1000 nM. De Ct-waarden die door

deze verdunningsreeks gegenereerd worden, hier met fictieve waarden voorgesteld in tabel

20, worden grafisch uitgezet. De richtingscoëfficient van deze grafiek wordt gebruikt om de

54

efficiëntie van de PCR te bepalen. De dynamische range stelt het aantal opeenvolgende Ct-

waarden voor die bekomen worden door amplificatie van opeenvolgende targetverdunningen.

Ze worden gebruikt om de resultaten te standaardiseren (Sigma-Aldrich, 2008;

Vandesompele, 2013).Hier wordt gebruik gemaakt van een dynamische range van 6 waarden.

Ideaal wordt er gebruik gemaakt van 7-8, maar 5 waarden zijn voldoende.

Tabel 20: Voorbeeld met fictieve waarden voor bepaling van de efficiëntie.

Verdunningen

primers staal 10x 100x 1000x 10000x 100000x 1000000x neg

FW-RV 1 20,01 23,55 28,31 32,07 34,95 NA NA

2 19,86 24,00 28,48 30,94 35,64 36,15 NA

Waarden uit bovenstaande tabel worden uitgezet in grafiek, voorgesteld hieronder in figuur 22.

Figuur 22: Grafische voorstelling efficiëntiebepaling.

De slope, ofwel de richtingscoefficiënt, die uit deze grafiek wordt gehaald, wordt gebruikt om

de efficiëntie te bepalen met volgende formule: 𝐸𝑓𝑓𝑖𝑐𝑖ë𝑛𝑡𝑖𝑒 = 101

𝑟𝑖𝑐𝑜 − 1 . Deze efficiëntie is

100% bij ideale omstandigheden. Factoren die een afwijking van 100% veroorzaken zijn de

lengte van de primers, het GC-gehalte van het amplicon, de secundaire structuren in primers,

probes en/of amplicon en de gebruikte concentraties (Vandesompele,2013).

Ook geeft de R2 of de correlatie coëfficiënt weer hoe goed de datapunten op de standaarcurve

liggen. Bij een R2-waarde lager dan 0.985 zijn de resultaten die bekomen zijn bij deze assay

niet betrouwbaar. De dynamische range is het verschil tussen de minimale en maximale

targetconcentratie die kan gedecteerd worden. De Y-intercept geeft aan welke theoretische

Ct-waarde bekomen zou worden wanneer één enkel target voor amplificatie zou zorgen. Er

y = -3,8408x + 16,261R² = 0,9939

y = -3,8512x + 16,235R² = 0,993

15

20

25

30

35

40

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0

Ct

Concentratie (log)

Efficiëntiebepaling

1

2

55

wordt een efficiëntie gewenst van 90%-110%. (vandesompele 2013)(Sigma-Aldrich, 2008;

Vandesompele, 2013).

Fig 24: Voorbeeld van een verkregen amplificatiecurve van een goede verdunningsreeks.

2.9 REAL-TIME PCR MET FAST MASTERMIX

De aangekochte primers worden gebruikt in de 100 pmol/µl oorspronkelijke concentratie. De

probes worden ook aangekocht in een concentratie van 100 pmol/µl en worden 5 keer verdund

met molecular grade water tot 20 pmol/µl. Dit gebeurt in tubes die het licht niet doorlaten,

aangezien probes lichtgevoelig zijn. De PCR-mixen worden aangemaakt volgens tabel 21. Dit

is de samenstelling voor 1 PCR-reactie.

Tabel 21: Samenstelling PCR-mix met probe


Forward primer (100 pmol/µl) 0,2 1000 nM Reverse primer (100 pmol/µl) 0,2 1000 nM Probe (20 pmol/µl) 0,25 250 nM FAST mastermix (4x geconcentreerd) 5 1x staal 10 water 4,35 totaal 20

Deze mix wordt aangemaakt voor het gewenste aantal reacties + 1. De mix wordt ook

gemengd door kort te vortexen. Daarna ondergaat de tube ook een short spin centrifugatie

zodat het totale volume naar de bodem zakt. Van deze mix wordt per PCR-reactie 15 µl

overgebracht naar MicroAmpTM optical 8-cap strips of naar een MicroAmpTM Optical 96-Well

reactieplaat. Hierna wordt aan iedere well het gewenste geëxtraheerde DNA-staal

toegevoegd. Van deze verdunning wordt 5 µl toegevoegd aan elke well. De plaat of strips

56

worden afgesloten met optical covers of een optical seal, daarna worden ze eerst kort

gevortexd en ondergaan ze een short spin centrifugatie. Hierna worden ze in de ViiA7

geplaatst voor de run. Deze ondergaat een proces, terug te vinden in figuur 23.

Figuur 23: PCR cycli voor real-time PCR met FAST mastermix

2.10 GELELEKTROFORESE

Eerst worden de wanden van de gelhouder goed afgeplakt met plakband. Daarna wordt het

kammetje in de houder geplaatst. Het gebruikt kammetje hangt af van het aantal stalen dat

men wenst te gebruiken. De 3% agarose-gel voor gelelektroforese wordt aangemaakt door 3g

agarose te mengen in 100 ml 0.5x TBE-buffer. Deze wordt lichtjes opgekookt door op te

warmen in een microgolfoven. Na opkoken wordt het mengsel lichtjes geschud zodat alle

agarose kan oplossen. Zolang er nog vaste agarose aanwezig is het mengsel wordt deze stap

herhaald. Nadat het mengsel lichtjes is afgekoeld wordt er 10 µl SYBR-safe toegevoegd en

gemengd. Dit mengsel wordt voorzichtig in de houder gegoten om luchtbellen te vermijden.

Deze gel heeft ongeveer een uur nodig om te stollen. Na het stollen worden de plakband en

het kammetje verwijderd en wordt de gel in de elektroforesetank geplaatst. Hieraan wordt 0.5x

TBE-buffer toegevoegd totdat de gel net ondergedompeld is. Nu kunnen de stalen op de gel

gebracht worden. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van geamplificeerde DNA-fragmenten,

bekomen na een PCR-reactie. Deze stalen bestaan uit 10 µl geamplificeerd staal waaraan 3

µl ladingsbuffer aan is toegevoegd. Het eerste en het laatste staal dat op de gel wordt gebracht

is een mengsel van 3 µl 100 bp DNA-ladder met 3 µl ladingsbuffer. De elektroforese loopt

gedurende 30 min tot een uur bij 100V. Als er na deze 30 minuten wordt geconstateerd dat de

stalen nog niet ver genoeg zijn gemigreerd, kan men de elektroforese nog wat langer laten

doorgaan. Hierna wordt de spanning afgezet en wordt de gel onder UV-licht geplaatst. Van de

57

belichte gel kan ook een foto worden genomen. De lengte van de DNA fragmenten kan geschat

worden met behulp van de basepaarladder.

2.11 DNA SEQUENTIEBEPALING

2.11.1 BENODIGDHEDEN

Geamplificeerd PCR product

PTC-200 Cycler

ABI3130 Genetic Analyzer of 3500xL Genetic Analyzer

MegaFuge 1.0R

Biofuge Pico

AmpliTaq Gold met 10 x PCR buffer-II en 25 mM MgCl2

dXTP-oplossing (5 mM per dXTP)

Specifieke forward en reverse primers

Molecular Grade water

BigDye terminator Ready Reaction mix v1.1

ExoSAP-IT

Sephadex G-50 superfine 100g

Gel loading buffer (5x)

100 bp ladder

2.11.2 WERKWIJZE

2.11.2.1 OPZUIVEREN PCR PRODUCT

In elke benodigde well van een 96-well plaat wordt 3.5 µl ExoSAP-IT gebracht waaraan telkens

7 µl PCR product aan wordt toegevoegd. Dit wordt onmiddellijk in de PTC-200 cycler gebracht

en het programma EXOSAP wordt gestart. Hierbij krijg je een degradatie van primers en

dNTP’s die 30 minuten doorgaat bij 37°C, gevolgd door een degradatie van enzymen die 20

minuten doorgaat bij 80°C. Het oorspronkelijke niet-gezuiverde PCR product wordt in de

tussentijd bewaard bij -20°C. Het opgezuiverde PCR product wordt bewaard bij 2-8°C als de

sequentie reactie op de dag zelf kan uitgevoerd worden. Zo niet wordt ze bewaard bij -20°C.

2.11.2.2 DNA SEQUENTIE REACTIE

De reagentiamix wordt voor elke primer apart gemaakt in 1.5 ml microcentrifuge tubes.De

mixen worden kort gevortexed en ondergaan een shortspin. Daarna worden ze uitverdeeld

over een 96-well plaat. Aan elke well wordt 1 µl primer en 1 µl opgezuiverd PCR product

toegevoegd. De 96-well plaat wordt in de PTC-200 cycler geplaatst en het programma SEQ

wordt opgestart.

58

Tabel 22: Temperatuursprofiel van het programma SEQ.

Sequentie programma # cycli

Hot start 6 min 98°C

Denaturatie 10 s 96°C 25 x

Annealing 10 s 50°C

Extensie 2 min 60°C

Bewaring ∞ 4°C

Na PCR kan de well bewaard worden bij 2-8°C.

2.11.2.3 ZUIVERING DNA-SEQUENTIEREACTIEPRODUCTEN DOOR SEPHADEX

KOLOMZUIVERING

Sephadex kolommen worden aangemaakt door de wells van een Multiscreen 45 µl Column

loader met sephadex G-50 te vullen. De Sephadex kolom wordt gewelld door 300 µl

gedeïoniseerd water toe te voegen. Dit moet minstens 3 uur staan zodat de kolommen kunnen

vormen. De Multiscreen HV plate wordt geplaatst op een 96-well microtiterplaat met een

Multiscreen Align Frame Blue er tussenin. Dit wordt 5 minuten gecentrifugeerd bij 2500 rpm.

Op de 96-well plaat wordt een septa gebracht en dit geheel wordt geplaatst op een zwarte

plaathouder en afgesloten met een witte plaathouder. Daarna wordt de capillaire elektroforese

uitgevoerd met de ABI3130 Genetic Analyzer.

59

3. RESULTATEN EN BESPREKING

3.1 ALGEMEEN: STRATEGIE

In eerste instantie werd er een literatuurstudie uitgevoerd van de meest geconserveerde target

regio’s per pathogeen. Op basis van deze literatuur werd per gen dat men wou detecteren een

aantal primers en probes geselecteerd. Op deze gepubliceerde primers en probes werd een

BLAST search analyse uitgevoerd om te controleren of ze uniek en specifiek zijn waarna ze

verder gevalideerd werden in silico. Daarbij werd voor zowel de primers als de probes

nagegaan of deze voldeden aan volgende voorwaarden: bij primers is het belangrijk dat ze

een geschikte lengte en smelttemperatuur hebben. Ze moeten een GC-concentratie bevatten

van 40-60% en het is belangrijk dat er geen te lange opvolging is van identieke basen,

voornamelijk van G’s en C’s aan het 3’-uiteinde. Het is ook beter om te vermijden dat er zich

een T aan het 3’-uiteinde bevindt. Bij probes is het opnieuw belangrijk dat de sequentie een

optimale lengte heeft. Daarnaast kan hierbij gewerkt worden met een GC-gehalte van 30-80%

en wordt er geopteerd om te werken met de streng die meer C’s dan G’s bevat. De

smelttemperatuur van de probe moet een 8 tot 10°C hoger liggen dan deze van de

corresponderende primers. Ook is het opnieuw belangrijk om lange opeenvolgingen van

dezelfde basen te vermijden, voornamelijk sequenties van 4 of meer G’s. Een G aan het 5’

uiteinde moet vermeden worden omdat dit het signaal van fluoroforen zou kunnen uitdoven

(Vandesompele, 2013).

Tot slot werd er gecontroleerd of de primers en probes onderling geen primerdimers zouden

veroorzaken. Op basis van deze in silico validatie werden de geselecteerde primers en probes

aanvaard, aangepast of volledig verworpen en werden dan vervolgens nieuwe primers en

probes ontwikkeld. Deze reeks primers is per pathogeen en corresponderend doelwitgen terug

te vinden in tabellen 3 tot en met 8.

Daarna ging de aanpassing van deze primers en probes binnen de geselecteerde targetregio’s

door. Ten eerste werd de functionaliteit van de geselecteerde primerparen getest. Hierbij is

het de bedoeling om te testen of de bestelde primers effectief werken bij concentraties van

300 nM en 1000 nM forward en reversed primer (voor de samenstelling van deze reacties zie

tabellen 18 en 19) in een Real-Time PCR-reactie met SYBR Green Mastermix. De overgang

van 300 nM naar 1000 nM is belangrijk om aan te tonen of er geen extra reacties zouden

ontstaan wanneer er gewerkt wordt met een hoge concentratie aan primers, zoals aspecifieke

amplicons en primerdimers. Deze reacties werden uitgevoerd op extracten van reinculturen

(zie tabellen 9 tot en met 13), 1000 x verdund in molecular grade water of op de aangekochte

E. coli Vircell DNA controle stalen verdund tot 1000 copies/µl.

Op basis van de resultaten van deze reacties kon een eerste evaluatie van de primers

gebeuren. Het primerpaar wordt dus als functioneel aanzien wanneer een specifieke

amplificatiecurve verkregen wordt voor een bepaalde doelwitsequentie met een Ct-waarde

lager dan 35. Wanneer de Ct-waarde hoger ligt dan 35 kan dit erop wijzen dat er ongewenste

detectie plaatsvindt, zeker wanneer er gewerkt wordt met reinculturen waarvan kan worden

uitgegaan dat er een hoge concentratie aan targetsequentie zal aanwezig zijn. Een extra

60

manier om de functionaliteit van een primerpaar te bevestigen is door ook een

smeltcurveanalyse uit te voeren. Hierbij is het noodzakelijk dat telkens één unieke smeltpiek

verkregen wordt (Figuur 24). Wanneer er meerdere pieken worden verkregen of als de

smeltpiek zich vertoont bij een onverwachte temperatuur is dit een indicatie dat de primers

aspecifieke amplificatie teweegbrengen (Figuur 25).

Figuur 24: Voorbeeld van een mooie smeltcurve bij verschillende inputconcentratie van het targetgen. Hierbij is

te zien dat alle bekomen smeltcurves, uitgevoerd op éénzelfde primerpaar, elkaar overlappen waardoor een

éénduidige smelttemperatuur kan worden afgeleid.

Figuur 25: Voorbeeld van smeltcurve met aspecifieke amplificatie bij verschillende inputconcentraties van het

targetgen. Hierbij is te zien dat het smeltcurveprofiel bestaat uit meerdere pieken wat kan wijzen op de

aanwezigheid van meerdere aspecifieke amplicons in de reactie.

61

Dankzij het testen op de functionaliteit, kon er een betere selectie worden uitgevoerd op het

aantal mogelijke primerparen per pathogeen. Hierdoor konden een aantal primerparen worden

geschrapt wegens het niet functioneel zijn of door de aanwezigheid van aspecifieke

amplificatie. In een tweede stap worden de overgebleven primerparen getest op hun efficiëntie.

De primerparen die zullen worden uitgekozen om te worden gespot op de TaqMan Array Card

(TAC) hebben een hoge efficiëntie nodig.

Daarna zullen de primers getest worden op hun specificiteit in aanwezigheid van een overmaat

aan vreemd DNA, geëxtraheerd uit fecesstalen zoals beschreven onder 2.6. De cycli die de

qPCR doorliep zijn dezelfde als bij de testen op de reinculturen. Ook de gebruikte mastermix

is dezelfde en de gebruikte primerconcentratie was ook steeds 1000 nM. Het doel van dit

experiment was om te controleren of het vreemd DNA dat aanwezig is in de fecesstalen een

invloed zou hebben op het al dan niet bekomen van aspecifieke amplificaties. Bij de gebruikte

fecesstalen was het geweten voor welk gen deze positief zouden testen. Daarnaast werden

ook een aantal negatieve stalen getest, opnieuw om te controleren of deze niet voor

aspecifieke amplificaties zouden zorgen. Bij deze negatieve stalen mag geen

amplificatiereactie optreden.

Tot slot werd de functionaliteit, specificiteit en efficiëntie van de Real-Time PCR in

aanwezigheid van een TaqMan MGB probe en TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix

aangetoond.

Om onderzoek te doen naar de functionaliteit van deze combinatie van primers en probes werd

opnieuw een qPCR uitgevoerd, deze keer volgens de methode beschreven onder punt 2.9.

Hier is het opnieuw de bedoeling dat er geen al te hoge Ct-waarde bekomen wordt wanneer

het te onderzoeken gen aanwezig is in het staal. Net als de primers moeten ook de probes

getest worden op specificiteit in aanwezigheid van een overmaat aan vreemd DNA

geëxtraheerd uit fecesstalen zoals beschreven onder 2.6. Het doel van deze testen was

dezelfde als bij de primers: controle of het vreemd DNA aanwezig in fecesstalen al dan niet

invloed heeft op het bekomen van aspecifieke amplificaties. Ook hier was het van de gebruikte

fecesstalen bekend voor welk gen deze positief zouden testen. De cycli die de qPCR doorliep

zijn dezelfde als bij de testen op functionaliteit en hier werd opnieuw beoogd om een Ct-waarde

onder 35 te verkrijgen bij positieve stalen en geen reactie bij negatieve stalen.

Op basis van de resultaten van al deze voorgaande punten worden de meeste performante

qPCRs geselecteerd om op de TaqMan Array Card te spotten.

3.2 SELECTIE PRIMERS EN PROBES

Primers en probes werden geselecteerd voor stammen van Clostridium difficile, van species

van Salmonella, Campylobacter, Shigella, Yersinia en van Escherichia coli.


Er werden 10 primercombinaties uitgeprobeerd voor de detectie van C. difficile en de

specifieke toxinegenen (zie tabel 3) en dit op basis van reinculturen en het positief materiaal

opgelijst in tabellen 9 en 15. In tabel 23 wordt de selectie van primers en probes voorgesteld.

De methode om hiertoe te komen wordt hieronder besproken.

62

Tabel 23: Overzicht primers en probes C. difficile.

Sybr select QPCR Taq Man fast GI-TAC v1.0

Functionaliteit/

efficiëntie

specificiteit

FW RV FW RV FW RV probe FW RV Probe

Clostridium difficile

16S p503a p506 p503 p506 p503 p506 509b p503 p506 678

C. difficile Toxine A

enterotoxin

tcdA (3’) p510 p511

tcdA (5’) p512 p513 p512 p513

tcdA (5’) p514 p515 p514 p515 p514 p515 656 p514 p515 656

C. difficile Toxine B

cytotoxin

tcdB p516 p517 p516 p517

tcdB p518 p519 p518 p519 p518 p519 657 p518 p519 657

tcdB p526 p527

C. difficile Binair Toxine

C. difficile Binair Toxine A p520 p521 p520 p521 p520 p521 658 p520 p521 658

C. difficile Binair Toxine A p522 p523 p522 p523

C. difficile Binair Toxine B p524 p525 p524 p525 p524 p525 659 p524 p525 659 aPrimers en probes aangeduid in het groen zijn correct functionerend. bPrimers en probes aangeduid in het oranje zijn niet correct functionerend.

3.2.1.1 FUNCTIONALITEIT PRIMERS

Primerpaar p503-p506 die het C. difficile 16S gen detecteert, vertoonde bij alle stalen

(opgesomd in tabel 9) een amplificatiecurve met een lage Ct-waarde (17-21) die te verwachten

is bij een extract uit een reincultuur. Ook was er weinig variatie in smelttemperatuur. Dit

primerpaar kan gebruikt worden als positieve controle voor de aanwezigheid van C. difficile in

het klinisch monster. Het aantonen van een toxinogene stam wordt bereikt door de detectie

van de toxinegenen. Zonder 16S confirmatie is dit theoretisch onmogelijk.

Voor het tcdA gen werden drie primerparen getest, p510-p511, p512-p513 en p514-p515 op

de reinculturen weergegeven in tabel 9. Primerpaar 510-511 resulteerde echter in geen

amplificatiereactie bij staal 5476, dit in tegenstelling tot primerparen p512-p513 en p514-p515

waarvoor wel een correct amplicon en een smeltcurve verkregen werd bij dit staal. Dit resultaat

was in tegenstelling tot de te verwachten resultaten. Deze aberrante resultaten werden 3x

herhaald ter confirmatie, waarbij steeds een positief resultaat verkregen werd met eenzelfde

Ct-waarde (22) en smelttemperatuur (75°C). Ook ligt de Ct-waarde en de smelttemperatuur

binnen de range van de waarden bekomen voor de andere reinculturen. Daarom werd

aangenomen dat er een fout is gebeurd (door bv. staalwissel) tijdens de identificatie van 5476

in het labo waarvan we dit staal gekregen hebben, aangezien 2 verschillende PCRs

specifiekere technieken zijn en deze wel tcdA positief was. Hiermee rekening houdende werd

p510-p511 niet geselecteerd omdat deze dan vals negatief zou zijn. Ook werd voor staal 5475

63

bij p512-p513 een vals negatief resultaat bekomen. Daarnaast werden voor alle 3 de

primerparen bij de overige reinculturen correcte resultaten bekomen.

Voor de detectie van tcdA werd dus enkel primerpaar p514-p515 weerhouden voor verdere

evaluatie.

Voor het onderzoek naar het tcdB gen waren terug 3 primerparen ter beschikking (p516-p517,

p578-p519 en p526-p527). De 3 primercombinaties bleken functioneel bij alle tcdB postieve

stalen (zie tabel 9) zowel bij de 300 nM als bij de 1000 nM reactie behalve voor staal 898 dat

overal een negatief resultaat vertoonde. Voor tcdB gaat de voorkeur uit naar p518-p519

aangezien voor p526-p527 bij reinculturen 901 en 5477 te hoge Ct-waarden (> 35) verkregen

werden en omdat er voor p516-p517 een negatief resultaat verkregen werd bij reincultuur

5476. Evenals bij tcdA werd opgemerkt dat een staalwissel de afwijkende resultaten voor staal

898 kon verklaren.

Bij de drie primerparen uitgezocht voor het binair toxine is er nog een verdere onderverdeling:

zo zijn primerparen p520-p521 en p522-p523 geschikt voor het Clostridium difficile Binair

Toxine A enzymatisch component en is primerpaar p524-p525 geschikt voor het Clostridium

difficile Binair Toxine B bindingscomponent. Aangezien er voor deze laatste slechts 1

primerpaar beschikbaar was, werd deze ook geselecteerd. Bij het C. difficile Binair Toxine A

enzymatisch component zal de voorkeur uitgaan naar p520-p521 aangezien er voor p522-

p523 aspecifieke amplificatie ontstaat bij reincultuur 898 bij een primerconcentratie van 300

nM.

Op basis van bovenstaande functionaliteitsstudie werden bij de 6 stammen volgende genen

gedetecteerd, verzameld in tabel 24. Deze zijn afwijkend van de opgegeven resultaten door

het referentiecentrum.

Tabel 24: Overzicht reinculturen Clostridium difficile en de genen waarvoor ze positief/negatief zijn.

Clostridium difficile 16S tcdA tcdB binA binB

898 + - - - -

901 + + + + +

902 + + + - -

5475 + + + - -

5476 + + + - -

5477 + + + + +

3.2.1.2 EFFICIËNTIE PRIMERS

De efficiëntie werd bepaald voor alle primerparen, behalve voor p503-p506 aangezien deze al

onderzocht was door een vorige thesisstudent. Dit werd uitgevoerd op 2 reinculturen: een

cultuur die positief is voor zowel toxine A, toxine B als het binair toxine (901) en een cultuur

die enkel positief was voor toxine A (5475). De resultaten hiervan zijn terug te vinden in tabel

25.

64

Tabel 25: Ct-waarden van diverse C. difficile voor 16 primers met bijbehorende efficiëntie.

Verdunning

primers staal 10x 100x 1000x 10000x 100000x 1000000x Negatief Helling Efficiëntie(%) 510-511

901 20,06 23,49 27,94 31,86 35,05 NAa NA -3,83 82,3 5475 18,99 23,63 28,05 31,02 35,26 36,49 NA -3,58 90,2

512-513

901 20,13 23,69 28,15 32,50 35,38 NA NA -3,93 79,6 5475 19,69 23,83 28,23 31,11 37,01 NA NA -4,19 73,2

514-515

901 20,11 23,81 28,20 32,38 34,07 38,11 NA -3,65 88,0 5475 19,58 23,70 27,88 30,97 35,07 NA NA -3,82 82,5

516-517

901 19,81 24,26 27,75 31,96 34,34 36,96 NA -3,68 87,0 5475 NA NA NA NA NA NA NA -b -

518-519

901 20,13 23,29 27,97 32,32 34,66 38,13 NA -3,81 83,1 5475 19,56 23,46 28,12 31,06 NA 36,75 NA -3,91 80,0

520-521

901 19,95 23,33 27,86 31,89 34,01 NA NA -3,67 87,3 5475 NA NA NA NA NA NA NA - -

522-523

901 20,22 23,83 27,72 32,07 35,60 38,45 NA -3,90 80,5 5475 NA NA NA NA NA NA 43,01

524-525

901 20,27 23,79 28,22 32,45 34,71 NA / -3,75 84,7 5475 NA NA NA NA NA NA NA - -

aNo Amplification, doelwitsequentie is niet aanwezig. bNiet Uitgevoerd

Overal werd een efficiëntie bekomen die hoger lag dan 80%. Door deze verdunningsreeksen

werd de selectie van p514-p515 voor het tcdA gen bevestigd aangezien zijn efficiëntie hoger

lag dan deze van de 2 overige primerparen, alhoewel er geen uitgesproken verschil in

efficiëntie waar te nemen was. Ook voor de andere primerparen bleek de efficiëntie de initiële

keuze niet tegen te spreken. Het streefdoel is natuurlijk het bekomen van een 100% efficiënte

PCR, wat hier niet het geval was. Een foutje in de verdunningsreeks kan nooit worden

uitgesloten, waardoor de efficiëntie normaal gezien niet zal berekend worden op een

éénmalige bepaling van de verdunningsreeksen. Nu werd hier echter wel voor geopteerd om

de kosten te besparen.

3.2.1.3 SPECIFICITEIT PRIMERS IN AANWEZIGHEID VAN VREEMD DNA

Alle oorspronkelijke primerparen voor C. difficile, behalve primerpaar p526-p527, werden

getest. Er was slechts 1 primerpaar, p512-p513, waarbij een vals negatief resultaat verkregen

werd. Dit resultaat, in combinatie met de efficiëntie en functionaliteit verkregen bij de

reinculturen, zorgt ervoor dat er definitief gekozen kan worden voor p514-p515 als

aangewezen primerpaar voor het toxine A gen.

Daarnaast werd bij zo goed als alle primers af en toe een aspecifieke amplificatie verkregen,

waarbij de Ct-waarde telkens hoger lag dan 35 en waarbij de smelttemperatuur afweek van

deze die verwacht werd. De enige 2 primerparen die nergens aspecifieke amplificatie

vertoonden waren primers p503-p506 en p516-p517. Van p503-p506 stond al vast dat deze

zou worden gekozen voor het detecteren van het 16S gen. p516-p517 was bij de testen op de

reinculturen al verworpen omdat p518-p519 daar een betere functionaliteit vertoonde.

65

3.2.1.4 FUNCTIONALITEIT PROBES

Voor C. difficile werd deze functionaliteit uitgevoerd op de 6 verschillende reinculturen (zie

tabel 9). Hierbij werd telkens de verwachtte amplificatie verkregen en is er nergens aspecifieke

amplificatie. De bekomen gemiddelde Ct-waarde voor de primer-probe combinatie werkzaam

op het 16S is ongeveer 15, terwijl de gemiddelde Ct-waarden voor de overige genen tussen

24 en 25 liggen.

Ook werd de efficiëntie bepaald op reincultuur 901. De bekomen efficiënties zijn verzameld in

tabel 26.

Tabel 26: Bekomen efficiënties C. difficile uitgevoerd op reincultuur 901.

Gen Primers//probe Efficiëntie (%)

tcdA 514-515//656 82,2

tcdB 518-519//657 82,2

BinA 520-521//658 90,5

BinB 524-525//659 77,9

Daarnaast werd een additionele efficiëntiebepaling van de primer-probe combinaties

uitgevoerd op een plasmide. Om alle overgebleven primers en probes te kunnen testen op

deze manier, werden 5 verschillende plasmides ontwikkeld die elk bestonden uit 4 à 5 van de

targetsequenties die in deze masterproef besproken worden. Hierbij is het wenselijk dat een

efficiëntie boven 90% bekomen wordt. Deze efficiëntiebepaling werd opnieuw slechts

éénmalig uitgevoerd, behalve wanneer deze waarden te laag waren zodat een herhaling nodig

was, zowel bij de bepaling op de reinculturen als op de plasmides. De efficiënties die hierbij

bekomen werden zijn verzameld in tabel 27.

Tabel 27: Bekomen efficiënties van C. difficile uitgevoerd op plasmides.

Gen Primers Efficiëntie (%)

16S 503-506//509 108,0

tcdA 514-515//656 106,5

tcdB 518-519//657 97,5

BinA 520-521//658 107,1

BinB 524-525//659 90,5

3.2.1.5 SPECIFICITEIT VAN PROBES BIJ AANWEZIGHEID VAN VREEMD DNA

Hier werden 20 fecesstalen getest waarvan bij 16 correcte resultaten verkregen werden

(waarvan 12 Clostridium positief waren en 4 Clostridium negatief) behalve voor stalen

212404201 en 212410501 die volgens bacteriologisch onderzoek C. difficile negatief waren.

In Real-Time PCR werd echter een amplificatie met goede Ct-waarde (26 en 18 respectievelijk)

voor het 16S gen bekomen wat wijst op de aanwezigheid van niet toxinogene C. difficile. Hier

wordt ervan uitgegaan dat er een fout gebeurd was bij de detectie met antigenen en deze 2

stalen dus wel positief zijn voor Clostridium. Voor de overige 2 stalen, 212258801 en

212484301, die beide toxinegenen negatief waren, werd er daarnaast ook zeer zwakke

aspecifieke amplificatie verkregen bij de primers-probe voor het 16S gen. Staal 234337701

kon bij herhaling de resultaten van de antigeen bepaling niet confirmeren waardoor we

66

besluiten dat dit een correct negatieve stam is. Ook hierbij werd er vanuit gegaan dat dit

fecesstaal effectief negatief was voor alles behalve het 16S gen

Ten slotte werd de specificiteit van de probes getest op 4 mengsels, opgebouwd uit

verschillende reinculturen, en op nog een 11 extra fecesstalen (terug te vinden in tabel 29) die

ofwel positief zijn voor Clostridium, Campylobacter, Salmonella of Yersinia ofwel negatief zijn.

De precieze samenstelling van de reincultuurmengsels is terug te vinden in tabel 28.

Tabel 28: Samenstelling reincultuur mengsels voor test op specificiteit.

Mengsel Bestaande uit

1 MBC 022 (STEC) ATCC 33291 (C. jejuni) 898 (C. difficile) ATCC 23715 (Yersinia) 2 MBC 122 (EIEC) MBC 121 (EAEC) 3A9 75 (C. coli) 3A9 53 (Salmonella) 3 MBC 123 (EPEC) 901 (C. difficile) ATCC 14018 (Salmonella) 4 MBC 124 (ETEC) ATCC 12022 (Shigella) 904 (C. difficile)

Tabel 29: Gebruikte fecesstalen en de genen waarvoor ze verondersteld positief zijn.

Fecesstalen Positief voor

236400101 Alle Clostridium difficile genen

215548201 Clostridium difficile 16S, toxine A en B

219264001 Yersinia enterocolitica

208897001 Yersinia enterocolitica

209571701 Campylobacter jejuni

210635301 Geen bacteriële pathogenen geisoleerd

215985201 Campylobacter coli

209873401 Salmonella typhimurium

210945301 Geen bacteriële pathogenen geisoleerd

215252501 Campylobacter jejuni

217853301 Geen bacteriële pathogenen geisoleerd.

Bij de mengsels werden voor alle primer-probeparen de verwachtte resultaten verkregen. Bij

de testen op fecesstalen 23640010 en 215548201 werden echter vals negatieve resultaten

verkregen die werden verklaard door meerdere vries-dooi cycli die de detectielimiet kunnen

verhogen. Ook werd voor p503-p506-509 bij 6 van de C. difficile negatieve stalen aspecifieke

amplificatie verkregen, zelfs na herhaling. Daarom werd geopteerd om primers p503-p506 te

koppelen aan een nieuwe probe, 678, om deze specifieke amplificatie weg te werken. Bij deze

nieuwe probe bleef de aspecifieke amplificatie in stand, maar bij C. difficile positieve

fecesstalen gaf ze een lagere Ct-waarde waardoor geopteerd werd om toch met deze verder

te werken. Ook werd de functionaliteit getest van deze nieuwe probe op de 6 verschillende C.

difficile reinculturen en die gaven allemaal een goede Ct-waarde.

Door middel van alle voorgaande testen kunnen 5 primer-probecombinaties geselecteerd

worden voor C. difficile. Hiermee kan worden overgegaan tot validatie van de TAC-kaart. Deze

geselecteerde primers en probes zijn in het groen aangeduid in tabel 23.

67

3.2.2 SALMONELLA

Voor de detectie van Salmonella spp. en hun specifieke toxinegenen (zie tabel 4) werden 6

primercombinaties uitgeprobeerd. Dit werd uitgevoerd op basis van reinculturen en het positief

materiaal verzameld in tabellen 10 en 15. In tabel 30 wordt de selectie van primers en probes

voorgesteld. De methode om hiertoe te komen wordt hieronder besproken.

Tabel 30: Overzicht primers en probes Salmonella spp.

aPrimers en probes aangeduid in het groen zijn correct functionerend bPrimers en probes aangeduid in het oranje zijn niet correct functionerend


De functionaliteit van de 6 primerparen voor de detectie van Salmonella spp. werden

geëvalueerd aan de hand van 6 verschillende reinculturen (zie tabel 10). De bekomen

resultaten hiervan zijn terug te vinden in tabel 31.

Tabel 31: Resultaten functionaliteit Salmonella spp met primerconcentratie 1000 nM.

primers

ompF ttr ttr invA invA ssaN

p568 p570 p572 p574 p576 p578

Reinculturen p569 p571 p573 p575 p577 p579

Ct S. enterica ATCC 14028 20,43a 20,24 19,68 19,67 20,01 20,62

S. enteritidis 3A9 53 20,85 20,54 19,76 20,00 20,47 20,96

S. groep B 3A9 87 20,61 20,47 19,68 19,85 20,23 20,71

S. groep C 3A9 86 21,04 20,74 20,04 20,32 20,48 21,32

S. D 3A9 02 20,97 21,15 20,25 20,31 20,89 21,57

S. groep D 3A9 82 20,22 20,48 19,78 19,73 20,22 20,99

Tm S. enterica ATCC 14028 85,39 81,88 85,39 80,62 80,03 80,62

S. enteritidis 3A9 53 85,59 82,18 85,59 81,40 80,42 80,91

S. groep B 3A9 87 85,68 82,18 85,59 81,01 80,42 80,91

S. groep C 3A9 86 85,59 82,18 85,59 81,40 80,42 80,81

S. D 3A9 02 85,68 82,18 85,59 81,01 80,32 80,81

S. groep D 3A9 82 85,68 82,18 85,59 81,01 80,32 80,81

Gemiddelde Tm 85,60 82,13 85,56 81,06 80,32 80,81

Standaarddeviatie Tm 0,11 0,12 0,08 0,29 0,15 0,11

aGroene achtergrond geeft aan dat het primerpaar functioneel is voor dit staal.


Functionaliteit/

specificiteit efficiëntie


Salmonella spp

ompF p568a p569 p568 p569 p568 p569 667 p568 p569 667

ttr p570b p571 p570 p571

ttr p572 p573 p572 p573

invA p574 p575 p574 p575

invA p576 p577 p576 p577

ssaN p578 p579 p578 p579 p578 p579 668 p578 p579 668

68

Op basis van de bekomen resultaten kunnen nog geen primerparen geselecteerd worden

aangezien voor alle stalen positieve resultaten bekomen werden met goede Ct-waarden en

een weinig variërende smelttemperatuur.


Tabel 32: Ct-waarden voor Salmonella met bijbehorende efficiëntie.

Verdunning

primers staal 10x 100x 1000x 10000x 100000x 1000000x Negatief Helling Efficiëntie (%)

570-571

3a9 53 25,63 28,57 32,42 35,92 NA 39,76 NAa -3,47 94,2 atcc

14028 24,82 28,26 31,64 35,10 36,00 37,07 39,65 -3,41 96,5

572-573

3a9 54 25,34 28,44 32,32 36,13 NA NA NA -3,62 88,8 atcc

14029 24,86 28,58 31,77 34,70 35,95 NA NA -3,27 102,2

aNo Amplification, doelwitsequentie is niet aanwezig.

De efficiëntie werd enkel bepaald voor de 2 primerparen die testen op het ttr gen aangezien

zowel voor het ompF gen als voor het ssaN gen slechts 1 primerpaar werd geselecteerd

waardoor een selectie op basis van efficiëntiewaarden onmogelijk is. Op basis van deze

verdunningsreeksen, terug te vinden in tabel 32, zal voor het ttr gen eerder gekozen worden

voor p572-p573 omdat bij het ander primerpaar 2x aspecifieke amplificatie verkregen werd.


Voor Salmonella werden slechts de primerparen p568-p569, p570-p571, p572-p573 en p578-

p579 getest, op dezelfde manier als bij C. difficile. De invA primers werden niet meer

meegetest omdat al besloten werd dat deze niet zullen geselecteerd worden, hier wordt later

in dit hoofdstuk op teruggekomen.

Het S. typhimurium staal 209873401 gaf goede amplificatiecurves voor alle 4 de primerparen

met een juiste smelttemperatuur. Daarnaast werd voor de negatieve stalen wel vaak

aspecifieke amplificatie verkregen met telkens een hoge Ct-waarde en afwijkende smeltcurve.

Toch werd bij 2 stalen de juiste smelttemperatuur verkregen: voor staal 219264001 bij p568-

p569 en voor 215900401 bij p572-p573. Voor beide werden wel zeer hoge Ct-waarden

bekomen (>35). Misschien was in dit fecesstaal toch Salmonella aanwezig maar in zo’n lage

concentratie dat deze bij voorgaande testen niet werd gedetecteerd.

De voorkeur zal hier uitgaan naar de primers voor het ompF gen (p568-p569) en het ssaN gen

(p578-p579) aangezien in de literatuur aangetoond werd dat deze altijd aanwezig waren bij

alle geteste Salmonella stammen en ook telkens afwezig waren bij andere niet-Salmonella

stammen (Chen et al, 2010; Tatavarthy et al, 2010). Het invA gen daarentegen kan verworven

worden via horizontale gen transfer en is genetisch onstabiel of zelfs afwezig in bepaalde

Salmonella serotypen (Tatavarthy et al, 2010).

69

3.2.2.4 FUNCTIONALITEIT VAN PROBES

Primerpaar 568-569 werkzaam op het ompF gen werd gecombineerd met probe 667 en

primerpaar 578-579 werkzaam op het ssaN gen werd gecombineerd met probe 668. Deze

werden op functionaliteit getest op reincultuur ATCC 14028, volgens dezelfde methode als bij

C. difficile. Bij beide werd een goede amplificatie verkregen met een Ct-waarde van ongeveer

20.

De efficiëntie werd hier enkel uitgevoerd op plasmides. Hierbij werd voor het ompF gen een

efficiëntie verkregen van 100.5% en voor het ssaN gen een efficiëntie van 95.7%.


De specificiteit van de probes werd getest op 4 mengsels, opgebouwd uit verschillende

reinculturen, en 11 fecesstalen. De gebruikte mengsels en fecesstalen zijn verzameld in tabel

28 en 29.

Bij zowel de reincultuurmengsels als bij de fecesstalen werd voor beide primer-

probecombinaties overal de verwachtte resultaten verkregen en werd er nergens aspecifieke

amplificatie geconstateerd.

Dankzij deze voorgaande testen werden 2 primer-probecombinaties overgehouden voor

Salmonella spp. Met deze kan er worden overgegaan tot validatie van de TAC-kaart. Deze


3.2.3 CAMPYLOBACTER

Voor de detectie van Campylobacter spp. en hun specifieke toxinegenen (zie tabel 5) werden

8 primercombinaties uitgeprobeerd. Dit werd uitgevoerd op basis van reinculturen en het

positief materiaal verzameld in tabellen 11 en 15. In tabel 33 wordt de selectie van primers en

probes voorgesteld. De methode om hiertoe te komen wordt hieronder besproken.

Tabel 33: Overzicht primers en probes Campylobacter spp.


Functionaliteit/



Campylobacter spp

16S (5 species) p556b p558 p556 p558

16S (5 species) p556 p559 p556 p559

16S (5 species) p557 p558 p557 p558

16S (5 species) p557 p559 p557 p559

16S (All) p560a p561 p560 p561 p560 p561 664 p560 p561 664


cadF p562 p563 p562 p563 p562 p563 665 p562 p563 665

mapA p564 p565 p564 p565

Campylobacter coli

ceuE p566 p567 p566 p567 p566 p567 666 p566 p567 679 aPrimers en probes aangeduid in het groen zijn correct functionerend

bPrimers en probes aangeduid in het oranje zijn niet correct functionerend

70


Voor het onderzoek naar de primers voor Campylobacter spp. werd gebruik gemaakt van 6

verschillende reinculturen, waarvan 3 C. jejuni en de andere 3 C. coli waren. Het experiment

werd op dezelfde manier uitgevoerd als bij de voorgaande bacteriën. Hier was het de bedoeling

om een primerpaar te selecteren voor het 16S gen, 1 specifiek voor C. jejuni en een andere

specifiek voor C. coli.

Tabel 34: Resultaten functionaliteit Campylobacter spp met primerconcentratie 1000 nM.

16S (5 species) 16S (all) cadF mapA ceuE

p556 p556 p557 p557 p560 p562 p564 p566

Reincultuur p558 p559 p558 p559 p561 p563 p565 p567

Ct C.

jejuni 3A9 15 17,17a 17,41 17,30 17,14 17,41 19,37 19,87 NA

C. jejuni 3A9 23 16,27 16,25 16,43 16,34 16,31 18,40 18,42 NA

C. jejuni

ATCC 33291 15,98 16,04 16,09 15,98 16,06 17,62 18,39 NA

C. coli 3A9 42 17,38 17,33 17,42 17,20 17,45 NA NA 19,04

C. coli 3A9 75 17,35 16,65 17,31 16,80 16,88 NA 38,64c 17,92

C. coli 3A9 89 NAb 17,17 17,09 16,92 17,32 NA NA 18,84

Tm C.

jejuni 3A9 15 79,74 80,42 79,64 80,32 81,60 75,72 76,60 NA

C. jejuni 3A9 23 79,64 80,32 79,64 80,32 81,60 75,72 76,50 NA

C. jejuni

ATCC 33291 79,64 80,42 79,64 80,42 81,60 75,72 76,60 NA

C. coli 3A9 42 79,54 80,32 79,64 80,23 81,50 NA NA 76,11

C. coli 3A9 75 79,64 80,42 79,74 80,32 81,60 NA 74,25 76,11

C. coli 3A9 89 NA 80,42 79,74 80,23 81,60 NA NA 76,21

Gemiddelde Tm 79,64 80,39 79,67 80,31 81,58 75,72 75,99 76,14

Standaarddeviatie Tm 0,07 0,05 0,05 0,07 0,04 0 1,16 0,06 aGroene achtergrond geeft aan dat het primerpaar functioneel is voor dit staal. bNo Amplification, de doelwitsequentie is niet aanwezig. cRode achtergrond geeft aan dat het primerpaar niet functioneel is voor dit staal. Dit kan voorkomen wanneer de doelwitsequentie wel aanwezig is maar dat er geen amplificatie verkregen wordt of wanneer de doelwitsequentie niet aanwezig is en er dus aspecifieke amplificatie verkregen wordt.

Zoals te zien is in tabel 34 geeft voor het 16S gen enkel p556-p558 een vals negatief resultaat

bij 1 cultuur: 3A9 89. Hier zal eerder geopteerd worden voor p560-p561 aangezien deze werkt

voor alle Campylobacter species terwijl de andere 4 slechts 5 species zullen detecteren. Ook

geeft dit primerpaar goede Ct-waarden (16-17) en wordt telkens dezelfde smelttemperatuur

bekomen.

Specifiek voor C. jejuni gaat de voorkeur uit naar p562-p563 aangezien voor dit primerpaar

nergens aspecifieke amplificatie bekomen wordt.

Alleen primerpaar p566-p567 was specifiek voor C. coli. Hierbij werd enkel bij C. coli culturen

een amplificatiecurve bekomen met een goede Ct-waarde en liggen de smelttemperaturen

steeds dicht bij elkaar.

71

3.2.3.2 EFFICIËNTIE PRIMER

De efficiëntie werd hier niet bepaald aangezien de 3 primers al geselecteerd werden na de

test op functionaliteit, waardoor de efficiëntie geen bijdrage meer levert aan de selectie.


Voor Campylobacter werd dezelfde techniek gebruikt als bij voorgaande bacteriën. Dit werd

echter alleen op de 3 geselecteerde primerparen uitgevoerd: p560-p561, p562-p563 en p566-

p567.

Bij deze test werden een aantal problemen geconstateerd. Zo werd er voor de primer voor het

16S gen (p560-p561) bij 6 van de 7 negatieve Campylobacter stalen een amplificatie

verkregen met Ct-waarde hoger dan 35. Bij 3 van deze gevallen lag de smelttemperatuur dicht

bij de smelttemperatuur die voor dit primerpaar verkregen werd bij de reinculturen. Van alle 7

Campylobacter-negatieve stalen waren er 4 bij waarop geen bacteriologische testen waren

uitgevoerd en het dus niet bekend was of ze al dan niet effectief Campylobacter negatief

waren. Ook gaven deze 4 allemaal een positief resultaat voor het 16S gen. Hierdoor ontstond

het vermoeden dat er een aspecifiek amplicon gegenereerd wordt tijdens amplificatie. Daarom

werden de bekomen amplicons van deze stalen gesequeneerd om te kijken of het hier toch

gaat om positieve Campylobacter stalen. Hier wordt later onder punt 3.4 en 3.5 op

teruggekomen.

Voor primerpaar p562-p563, specifiek voor C. jejuni, werden de minste problemen

geconstateerd. De fecesstalen positief voor C. jejuni gaven een goede amplificatiecurve met

juiste smelttemperatuur. Daarnaast gaven alle 4 de onbekende negatieve fecesstalen en het

Salmonella fecesstaal (209873401) aanleiding tot aspecifieke amplificatie, waarbij voor staal

236704101 zelfs een smelttemperatuur aangaf die overeen kwam met de verwachtte

smelttemperatuur voor dit primerpaar.

Ook het primerpaar specifiek voor C. coli gaf problemen. Voor dit primerpaar werd bij vele

fecesstalen een aspecifieke amplificatie bekomen, maar deze gaven wel steeds een zeer late

Ct-waarde en een afwijkende smelttemperatuur. Echter was er ook een fecesstaal getest

(215985201) waarvan men wist dat het positief was voor C. coli door middel van voorgaande

bacteriologische testen. Voor dit staal werd bij zowel p560-p561 (werkzaam op het 16S gen)

als bij p566-p567 (specifiek voor C. coli) een vals negatief resultaat verkregen. Dit werd verder

gecontroleerd om duidelijk te maken of het probleem lag bij de gebruikte primers of bij de

staalvoorbereiding. Daarom werd er opnieuw gebruik gemaakt van het oorspronkelijke

fecesstaal en werd deze aangerijkt met Campylobacter reinculturen alvorens de extractie te

ondergaan. Dezelfde procedure werd uitgevoerd op een Campylobacter-negatief staal ter

controle. Om dit te kunnen doen werden van beide fecesstalen telkens 3 monsters genomen,

waarvan 1 aangerijkt werd met een C. jejuni reincultuur, 1 met een C. coli reincultuur en 1 met

beide. Zo werden 6 nieuwe stalen verkregen. Deze 6 stalen werden geëxtraheerd en het

72

bekomen DNA onderging dezelfde PCR reactie als de fecesstalen hiervoor. Deze resultaten

zijn verzameld in tabel 35.

Tabel 35: Resultaten voor functionaliteit in aanwezigheid van vreemd DNA voor Campylobacter.

p560-p561 p562-p563 p566-p567

16S (all) cadF (C. jejuni) CeuE (C. coli)

Ct 208897001 + C. jejuni 18,92a 26,86 NA

208897001 + C. coli 19,3 38,98b 26,23

208897001 + C. jejuni en C.

coli 19,4 26 25,69

215985201 + C. jejuni NAc NA NA

215985201 + C. coli NA NA NA

215985201 + C. jejuni en C.

coli NA NA NA

Tm 208897001 + C. jejuni 80,95 72,55 75,97

208897001 + C. coli 81,15 75,38 NA

208897001 + C. jejuni en C.

coli 81,34 75,68 75,97

215985201 + C. jejuni NA NA NA

215985201 + C. coli NA NA NA

215985201 + C. jejuni en C.

coli NA NA NA

a Groene achtergrond geeft aan dat het primerpaar functioneel is voor dit staal. bOranje achtergrond geeft aan dat het primerpaar waarschijnlijk niet functioneel is voor dit staal. cNo Amplification, de doelwitsequentie is niet aanwezig.

Uit deze resultaten bleek dat het fecesstaal positief voor C. coli (215985201) zelfs na injectie

met reinculturen een vals negatief resultaat geeft voor alle 3 de genen. Hierbij kan het zijn dat

het Campylobacter DNA wordt afgebroken door andere componenten aanwezig in de feces of

door inhibitie.

Bij het geïnjecteerde negatieve staal (208897001) zijn de resultaten grotendeels zoals

verwacht. Er worden overal goede resultaten verkregen, behalve bij p562-p563 voor het staal

geïnjecteerd met C. coli. Hierbij wordt aspecifieke amplificatie verkregen.


De functionaliteit werd uitgevoerd op de 6 Campylobacter reinculturen, op dezelfde manier als

bij voorgaande bacteriën. Voor detectie op C. coli werd eerst gewerkt met probe 666. Deze

gaf echter heel vaak aspecifieke amplificatie. Na verder in silico onderzoek bleek dat de probe

zal annealen met de forward primer. Hierbij wordt een ΔG-waarde verkregen van

-9.99 kcal/mol, terwijl normaal gezien wordt gewerkt met ΔG-waarden hoger dan -6 kcal/mol

om heterodimeren te vermijden. Door deze lage waarde zullen primer en probe moeilijker van

elkaar loskomen bij de temperatuur die gehanteerd wordt tijdens de PCR, waardoor

aspecifieke amplificatie verkregen wordt. Daarom werd geopteerd om met een nieuwe probe

te werken, probe 679.

73

Tijdens de testen werd overal amplificatie met een goede Ct-waarde verkregen waar verwacht,

echter werd er ook zeer zwakke en daardoor verwaarloosbare aspecifieke amplificatie

verkregen (Ct > 38) bij cultuur 3A9 89 voor primer-probe combinatie p562-p563-665 en bij de

negatieve controle voor primer-probe combinatie p566-p567-679.

De efficiëntiebepaling met behulp van reinculturen werd niet gedaan voor C. coli. Deze

bepaling werd wel uitgevoerd op stam ATCC 33291. Voor de overige 2 genen wordt bij p560-

p561-664 93.9% verkregen en bij p562-p563-665 98.4%.

De efficiëntiebepaling met behulp van plasmides werd wel op alle 3 de combinaties uitgevoerd.

Deze waarden zijn verzameld in tabel 36.

Tabel 36: Bekomen efficiëntiewaarden voor Campylobacter, uitgevoerd op plasmides.

Gen Primers//probe Efficiëntie (%) Herhaling Gemiddelde

16S 560-561//664 90,1 118,8 104,5 CadF - C.

jejuni 562-563//665 95,4

ceuE - C. coli

566-567//679 101,6




28 en 29.

Zoals al gedeeltelijk besproken werd bij functionaliteit, gaven de probes een aantal problemen

bij de Campylobacter spp. De primers werkzaam op het 16S gen werden gekoppeld met probe

664. Deze gaf bij zowel de reincultuurmengsels als bij de fecesstalen een aantal keer

aspecifieke amplificatie. Echter was het wel zo dat bij stalen positief voor Campylobacter er

ook een mooie amplificatiecurve ontstond. Om dit tegen te gaan werden de primers gebruikt

in combinatie met een nieuwe probe, 680. Deze gaf echter ook een aantal keer zwak vals

positieve resultaten waardoor er toch werd geopteerd om eerder verder te werken met probe

664.

Het primerpaar (p562-p563) specifiek werkzaam voor C. jejuni werd gebruikt in combinatie met

probe 665 en deze gaf overal de gewenste resultaten, behalve bij staal 215985201 waarvoor

er aspecifieke amplificatie verkregen werd.

Tot slot is er nog het primerpaar (p566-p567) werkzaam voor C. coli. In eerste instantie werd

de specificiteit nog getest met probe 666. Deze gaf echter, zoals al verwacht werd door de

resultaten bij de functionaliteit, heel vaak aspecifieke amplificatie. Wanneer de specificiteit dan

getest werd op probe 679 was al deze aspecifieke amplificatie weggewerkt. Ook bij deze

nieuwe probe werd er getest op de functionaliteit met behulp van de Campylobacter

74

reinculturen. Deze gaven opnieuw een mooie amplificatiecurve met goede Ct-waarde voor de

C. coli stalen en een negatief resultaat voor de C. jejuni stalen.


Campylobacter spp. Met deze kan er worden overgegaan tot validatie van de TAC-kaart. Deze


3.2.4 SHIGELLA

Er werden 2 primercombinaties getest voor de detectie van Shigella spp. en hun specifieke

toxinegenen (zie tabel 6), uitgevoerd op basis van reinculturen en het positief materiaal

verzameld in tabellen 12 en 15. In tabel 37 wordt de selectie van primers en probes


Tabel 37: Overzicht primers en probes Shigella spp.


Functionaliteit/



Shigella spp

ipaH p627a p628 p627 p628

virA p629 p630 p629 p630 p629 p630 677 p629 p630 geen

aPrimers en probes aangeduid in het oranje zijn niet correct functionerend


Voor het onderzoek naar de primers voor Shigella spp. werd gebruik gemaakt van 4

verschillende reinculturen. Ook dit experiment werd op dezelfde manier uitgevoerd als bij

voorgaande bacteriën.

De reactie voor het virA gen werd 4 keer uitgevoerd, waarbij slechts éénmalig een positief

resultaat bekomen werd voor alle 4 de reinculturen. Wel werd S. boydii telkens gedetecteerd

met dit primerpaar.

Uit deze resultaten blijkt dat enkel voor het ipaH gen een goede functionaliteit bekomen werd.

Toch werd deze niet geselecteerd aangezien er bij E. coli al een primerpaar geselecteerd werd

die actief was voor dit gen. De functionaliteit van de E. coli primers p624-p626 werd dan ook

getest op de Shigella reinculturen. Deze waren allemaal positief met goede Ct-waarden (19-

20) en een smelttemperatuur die dicht lag bij deze van de EIEC stam.


De efficiëntie werd enkel uitgevoerd voor primerpaar p629-p630, werkzaam op het virA gen,

op staal ATCC 12022. Deze vertoont een goede efficiëntie van meer dan 95%. Het primerpaar

actief op ipaH werd niet meer getest, aangezien deze sowieso niet zal geselecteerd worden.

75


Voor Shigella werd dezelfde techniek gebruikt als bij voorgaande bacteriën. Dit werd

uitgevoerd op beide primerparen. Hierbij werd er geconstateerd dat bij 3 van de 4 negatieve

stalen en bij staal 215900401 aspecifieke amplificatie ontstaat, weliswaar met een lage Ct-

waarde (43) en een afwijkende smelttemperatuur. Alle geteste fecesstalen waren negatief voor

Shigella waardoor uit deze test niet kan worden afgeleid of er een goede amplificatie met een

juiste smelttemperatuur ontstaat bij Shigella positieve fecesstalen.

Om verder te werken met MGB probes werd enkel virA overgehouden, al lijkt deze niet de

beste keuze aangezien deze vals negatieve resultaten gaf bij 3 van de 4 stalen wanneer getest

werd op functionaliteit.


De functionaliteit werd uitgevoerd op de 4 Shigella reinculturen, op dezelfde manier als bij

voorgaande bacteriën, maar er werd enkel amplificatie verkregen bij cultuur 3A8 74. Ook hier

werd de efficiëntie enkel uitgevoerd op plasmides, waarbij een efficiëntie bekomen wordt van

93.3%.



reinculturen, en 11 fecesstalen. De gebruikte mengsels en fecesstalen worden voorgesteld in

tabel 29 en 29.

In mengsel 4 werd gebruik gemaakt van een reincultuur van S. flexneri. Bij testen op

functionaliteit en specificiteit van enkel de primers werd al geconstateerd dat de primers

werkzaam op het virA gen hier geen amplificatie tot stand konden brengen. Ook bij het

toevoegen van probe 677 werd hetzelfde resultaat verkregen. Wel werd er bij de overige 3

mengsels en de gebruikte fecesstalen nergens aspecifieke amplificatie verkregen. Daarna

werd er een poging gedaan om de primers te testen met een nieuwe probe, 683, maar ook

deze gaf geen amplificatie voor S. flexneri. Deze nieuwe probe werd ook getest op de 4

reinculturen, waar hij enkel amplificatie vertoonde bij S. boydii.

Tot slot werden beide probes getest op 6 fecesstalen positief voor Shigella. Hierbij gaven ze

enkel bij 1 staal een positief resultaat. Daarom werd er besloten om geen primer-probes te

selecteren die specifiek zouden werken op het virA gen van Shigella. Voor de validatie van de

TAC- kaart zal geopteerd worden om Shigella samen te detecteren met EIEC aangezien beide

ipaH bevatten.

3.2.5 YERSINIA

Er werden 5 primercombinaties getest voor de detectie van Yersinia spp. en hun specifieke




76



Functionaliteit/



Yersinia spp

yst p646b p647 p646 p647 p646 p647

yst p648 p650 p648 p650 p648 p650

yst p649 p651 p649 p651 p649 p651

yst p652a p653 p652 p653 p652 p653 662 p652 p653 662

ail p654 p655 p654 p655 p654 p655 663 p654 p655 663 aPrimers en probes aangeduid in het groen zijn correct functionerend bPrimers en probes aangeduid in het oranje zijn niet correct functionerend


Voor het onderzoek naar de primers voor Yersinia spp. werd gebruik gemaakt van 10

verschillende reinculturen. Ook dit experiment werd op dezelfde manier uitgevoerd als bij

voorgaande bacteriën.

Hierbij werd er voor het yst gen gekozen voor p652-p653 aangezien deze het minste

aspecifieke amplificatie vertoonde. Voor het ail gen moet er wel gekozen worden voor p654-

p655. Uit deze waarden kan er al worden aangenomen dat beide primers vooral werkzaam

zijn op Y. enterocolitica. Zoals al werd aangegeven in de literatuurstudie, kunnen Yersinia

stammen onderverdeeld worden in verschillende subtypes. Naargelang ze binnen deze

subtypes vallen zijn ze ofwel niet-pathogeen, pathogeen met een lage virulentie en pathogeen

met een hoge virulentie. Er was aangegeven dat niet alle reinculturen, voorgesteld in tabel 13,

behoorden tot de hoog virulente biogroep 1B. Slechts ATCC 23715, 1C6 87 en 1C6 88

behoorden tot biogroep 1B en bij deze stammen werd dan ook een goede amplificatie

verkregen met lage Ct-waarden (13-21) en weinig variërende smelttemperaturen. Reinculturen

3A9 68, 1C6 93, 1C6 97, 1C6 99 en 1C8 02 behoorden echter allemaal tot biogroep 1A en

deze zijn niet pathogeen. Dit is dus een verklaring waarom er voor deze culturen zoveel

resultaten werden gegenereerd met hoge Ct-waarden. Daarnaast bleven reinculturen 3A8 89

en 1C6 92 over. 3A8 89 is een Yersinia met lage virulentie waarbij dan ook telkens hoge Ct-

waarde (>32) werd verkregen. Bij 1C6 92 was het ongekend tot welke biogroep deze behoorde

en bij deze werd voor geen enkele primer een amplificatie verkregen waardoor er wordt

verondersteld dat het hier gaat om een niet-pathogene Yersinia stam.


De efficiëntie werd niet meer uitgetest voor de Yersinia primers aangezien de selectie al

gebaseerd was op de resultaten die bekomen werden bij de functionaliteitstest.

77


Voor Yersinia werd dezelfde techniek gebruikt als bij voorgaande bacteriën. Dit werd bij de 1ste

4 negatieve stalen echter op slechts 3 van de primerparen uitgevoerd: voor het yst gen werd

gekozen voor primerparen p648-p650 en p652-p653 aangezien deze het minste aspecifieke

amplificatie vertoonden wanneer ze getest werden op functionaliteit met reinculturen. Bij de

andere fecesstalen werd p648-p650 geëlimineerd en dus enkel verder gewerkt met p652-

p653. Voor het ail gen werd verder gewerkt met p654-p655. De gekozen positieve fecesstalen

waren beide positief voor Y. enterocolitica omdat bij dit pathogeen de beste resultaten

verkregen werden bij voorafgaande testen.

Hier werd opnieuw aspecifieke amplificatie verkregen bij 3 van de 4 negatieve fecesstalen.

Deze amplificaties hadden opnieuw een hoge Ct-waarde en een afwijkende smelttemperatuur.

Daarnaast werd ook geconstateerd dat bij staal 219264001 hoge Ct-waarden verkregen werd,

met een smelttemperatuur die licht afweek van de verwachtte smelttemperatuur. Bij het 2de

positieve fecesstaal werd echter wel een goede amplificatiecurve verkregen met Ct-waarde

die varieert van 20 tot 22 en een correcte smelttemperatuur. Voor staal 209571701 werd bij

p652-p653 een zeer late aspecifieke amplificatie geconstateerd, waarvoor geen smeltcurve

werd verkregen. Voor staal 215900401 werd bij p654-p655 aspecifieke amplificatie

geconstateerd, deze keer wel met smeltcurve maar de smelttemperatuur was afwijkend.


De uitvoering van het onderzoek naar functionaliteit van de combinatie van primers en probes

werkzaam op Yersinia werd op dezelfde manier uitgevoerd als bij voorgaande bacteriën. Dit

werd uitgevoerd op 3 reinculturen: 3A8 89, 3A9 68 en ATCC 23715. Net zoals bij voorgaande

testen werd voor beide primer-probes geen amplificatie verkregen bij 3A8 89 en 3A9 68. Voor

ATCC 23715 werd bij beide primer-probes wel amplificatie verkregen zoals verwacht werd,

echter was deze voor de primers werkzaam op het ail gen laat, met een Ct-waarde van 31.94.

Bij herhaling werd wel een betere Ct-waarde verkregen. Na verder in silico onderzoek op de

gebruikte probe, werd gezien dat deze een lage fluorescentie vertoonde, een G had

ingebouwd op zijn 2de base en dat de probe 23 nt lang was. Dit verklaart de eerder bekomen

hoge Ct-waarde.

Enkel voor de primer werkzaam op het yst gen werd een verdere efficiëntie-bepaling

uitgevoerd op een reincultuur. Hierbij werd opnieuw gewerkt zoals bij voorgaande bacteriën.

Voor de efficiëntie werd echter enkel rekening gehouden met de Ct-waarden voor de 10x, 100x

en 1000x verdunning, wat neerkomt op slechts 3 verschillende stalen. Dit komt doordat de Ct-

waarde die bekomen werd voor de 1000x en de 10000x verdunning nagenoeg dezelfde was.

Hierdoor zal er uit de bekomen efficiëntie van 80% geen concreet besluit kunnen worden

getrokken.

Bij verdere efficiëntiebepaling op plasmides werd voor p652-p653-662 94.0% efficiëntie

bekomen en voor p654-p655-663 98.1% efficiëntie bekomen.

78



reinculturen en 11 fecesstalen. De gebruikte mengsels en fecesstalen zijn verzameld in tabel

28 en 29.

Beide primer-probeparen gaven goede resultaten voor zowel de reincultuurmengsels als voor

de fecesstalen. Enkel bij staal 219264001 gaven beide een vals negatief resultaat. Er wordt

van uitgegaan dat het hier gaat om een niet-pathogene Yersinia stam.


Yersinia spp. Met deze kan er worden overgegaan tot validatie van de TAC-kaart. Deze



Er werden 32 primercombinaties getest voor de detectie van E. coli en hun specifieke




Tabel 39: Overzicht primers en probes E. coli.


Functionaliteit/



E. coli

EPEC

eae p580b p581 p580 p581

eae p582a p583 p582 p583 p582 p583 669 p582 p583 669

bfpA p584 p585 p584 p585

bfpA p586 p587 p586 p587 p586 p587 670 p586 p587 670

bfpA p588 p589 p588 p589

EAEC

aggR p590 p591 p590 p591 p590 p591 671 p590 p591+592 671

STEC

stx1 p593 p596 p593 p596

stx1 p594 p596 p594 p596

stx1 p595 p596 p595 p596

stx1 p597 p599 p597 p599

stx1 p598 p600 p598 p600 p598 p600 672 p598 p600 672

stx2 p601 p603 p601 p603

stx2 p602 p603 p602 p603 p602 p603 673 p602 p603 673

stx2 p604 p605 p604 p605

79

ETEC

estA p606 p608 p606 p608

estA p606 p609 p606 p609

estA p606 p610 p606 p610

estA p606,1 P610 p606,1 P610 p606,1 P610 674 p606,1 + p606,2 P610 674

estA p606,2 p610 p606,2 p610

estA p607 p608 p607 p608

estA p607 p609 p607 p609

estA p607 p610 p607 p610

estB p611 p612 p611 p612

estB p611 p613 p611 p613

eltB p614 p615 p614 p615 p614 p615 675 p614 p615 675

eltB p616 p617 p616 p617

eltB p618 p619 p618 p619

eltB p618 p620 p618 p620

eltB p621 p622 p621 p622

eltB p621 p623 p621 p623

EIEC

ipaH p624 p626 p624 p626 p624 p626 676 p624 p626 676

ipaH p625 p626 p625 p626 aPrimers en probes aangeduid in het groen zijn correct functionerend

bPrimers en probes aangeduid in het oranje zijn niet correct functionerend


Voor het onderzoek naar de primers voor E. coli werd gebruik gemaakt van 5 verschillende

DNA extracten van reinculturen, elk van een andere categorie waar DEC toe kunnen behoren.

Dit experiment werd opnieuw op dezelfde manier uitgevoerd als bij voorgaande bacteriën.

Door het grote aantal te testen primers werd niet voor elk primerpaar getest op alle stalen.

Voor elke E. coli type zijn er telkens 1 of 2 plaatsen voorzien op de TaqMan Array kaart,

afhankelijk van de genen waarop zal getest worden. In eerste instantie werden de primerparen

enkel getest op het E. coli waarvoor ze actief zijn (bv. De EPEC primerparen enkel op het

EPEC staal). Daarna werd er voor elk van de genen waarvoor een plaats beschikbaar is op

de TAC 1 primerpaar uitgekozen en die werd getest op de overige 4 E. coli stalen.

Voor ETEC wordt er op 2 genen getest: estA en eltB. Alle 8 primerparen complementair aan

het estA gen werden getest met MBC 124. Hierbij werd overal een amplificatiecurve

waargenomen met te hoge Ct-waarden. Uit deze primerparen werd primerpaar p606-p610

gekozen om ook te testen op de 4 andere E. coli stalen, waarbij telkens aspecifieke amplificatie

werd verkregen met een hoge Ct-waarde. Aangezien op de 4de base van primer 606 zowel

een A als een G kon worden ingebouwd, werd besloten om 2 nieuwe primers te bestellen:

606.1 waarbij op de 4de base een A werd ingebouwd en 606.2 waarbij op de 4de base een G

werd ingebouwd. Beide primers werden opnieuw gepaard met primer 610 en ook uitgetest op

MBC 124, in de hoop dat deze een betere amplificatiecurve zouden generen. Dit was echter

80

niet het geval, er werd opnieuw bij beide primerparen een hoge Ct-waarde (>38) verkregen.

Bij verdere onderzoeken in combinatie met probes wordt geopteerd om bij de aanmaak van

de PCR mix telkens gebruik te maken van een mengsel waarbij een even grote hoeveelheid

aan 606.1 als 606.2 aanwezig is.

Daarnaast werden ook de 8 primerparen complementair aan het eltB gen uitgetest op MBC

124. Hiervoor onstond bij de positieve stalen telkens een mooie amplificatiecurve. Wanneer er

met p614-p615 verder getest werd op de overige E. coli stalen, werd er nergens aspecifieke

amplificatie geconstateerd.

Voor EIEC werd onderzoek gedaan naar 2 verschillende primerparen, p624-p626 en p625-

p626. Uit de 1ste test waarbij enkel gewerkt werd met MBC122 kwam voort dat voor beide een

goede amplificatiecurve werd verkregen met een lage Ct-waarde op het EIEC staal. Daarna

werd p624-p626 verder getest op alle andere E. coli DNA, waarbij nergens een amplificatie

werd verkregen. Daarom werd er besloten om dit primerpaar te behouden.

Voor EPEC zijn primerparen p580-p581 en p582-p583 werkzaam voor het eae gen. Ook E.

coli die vallen onder de STEC categorie hebben dit gen. De primers moeten dus een

amplificatie vertonen voor zowel MBC 123 als MBC 022. Dit werd bekomen bij p582-p583,

maar hij krijgt wel een aspecifieke amplificatie bij het ETEC staal. Deze is echter zeer laat

tijdens de amplificatie, bij Ct-waarde 40. p580-p581 vertoonde enkel een amplificatiecurve

voor MBC 123. De 3 overige EPEC primerparen zijn complementair aan het bfpA gen. Deze

primerparen zouden enkel een positief resultaat mogen vertonen voor MBC 123. Wanneer

hierop getest werd, werd echter een vals negatief resultaat verkregen voor zowel p586-p587

als p588-p589. Bij p584-p585 werd voor MBC 123 aspecifieke amplificatie bekomen met een

hoge Ct-waarde (40) en een afwijkende smelttemperatuur. Om te testen op de overige E. coli

stalen werd gekozen voor p586-p587. Hierbij werd nergens aspecifieke amplificatie bekomen.

Voor EAEC werd er op slechts 1 primerpaar getest: p590-p591. Deze gaf bij alle E. coli stalen

het gewenste resultaat, behalve bij MBC 124 waarbij er aspecifieke amplificatie geconstateerd

werd. Toch werd er geen smeltcurve verkregen.

Wanneer er voor STEC alleen getest werd op MBC 022 werd overal een goede amplificatie

bekomen, behalve voor p594-p596. Hierbij werd een zeer hoge Ct-waarde bekomen. Om te

testen op de overige E. coli stalen werd gekozen voor p598-p600 en p602-p603, die beide

nergens aspecifieke amplificatie vertoonden.


Enkel bij STEC en ETEC was het door de voorgaande test nog niet volledig duidelijk welke

primers zouden weerhouden worden. Daarom werden er enkel voor deze 2 E. coli categorieën

verdunningsreeksen aangemaakt. Hierbij werden voor alle primerparen, met uitzondering van

primerpaar 618-620, slechts Ct-waarden bekomen tot en met de 1000x verdunning. Hierdoor

was het onmogelijk om een accurate bepaling te maken van de efficiëntie.

81


In het labo wordt er niet getest op E. coli waardoor het onmogelijk is om te weten of een

fecesstaal positief of negatief zal zijn. Daardoor was het niet mogelijk om deze test uit te

voeren.


De uitvoering van het onderzoek naar functionaliteit van de combinatie van primers en probes

werkzaam op E. coli werd op dezelfde manier uitgevoerd als bij voorgaande bacteriën. Hier

werd dit uitgevoerd op de Vircell DNA controles; elke primer-probe werd uitgetest op de Vircell

DNA controle waarop hij positief zou moeten reageren. Daarnaast werd elke primer-probe ook

getest op molecular grade water, dat dienst doet als negatieve controle. Nergens werd er

aspecifieke amplificatie verkregen voor de negatieve controle. Echter werd er wel driemaal

een vals negatief resultaat verkregen: bij p586-p587-670, getest op MBC 123 en bij zowel

p606-p610-674 als bij p606.1-p606.2-p610-674, getest op MBC 124.

Bij E. coli werd de efficiëntiebepaling enkel uitgevoerd op plasmides. De bekomen waarden

hiervan zijn verzameld in tabel 40.

Tabel 40: Bekomen efficiëntiewaarden voor E.coli.

Gen Primers//probe Efficiëntie (%) Herhaling Gemiddelde

EPEC eae 582-583//669 103,5

EPEC bfpA 586-587//670 114,2

EAEC aggR 590-591//671 95,1

STEC stx1 598-600//672 107,9

STEC stx2 602-603//673 108,6

ETEC ST(estA) 606,1&2-610//674 83,2 122,0 102,6

ETEC LT(eltB) 614-615//675 105,6

EIEC ipaH 624-626//676 96,1




28 en 29.

Alle gebruikte primerparen voor E. coli gaven juiste resultaten wanneer ze getest werden op

specificiteit met de reincultuurmengsels. Ook werd hierbij aangetoond dat Shigella

gedetecteerd wordt met de primer voor EIEC.

Ook bij de fecesstalen werden zo goed als overal de juiste resultaten verkregen, enkel p582-

p583-669 vertoonde 2 keer aspecifieke amplificatie met hoge Ct-waarde: voor stalen

209873401 en 209873401. Aangezien het labo niet test op het feit of fecesstalen positief of

negatief zijn voor E. coli hadden we geen E. coli positieve fecesstalen. Daarom werd geopteerd

om de specificiteit van de primers en probe voor het eae gen te testen op fecesstalen die

gespiked werden met de STEC vircell DNA controle, aangezien het eae gen ook aanwezig is

82

in STEC. Dit werd enkel voor dit primer-probe paar gedaan omdat deze de enige was die

aspecifieke amplificatie veroorzaakte. Bij deze gespikede fecesstalen werd een goede

amplificatie verkregen.

Door middel van alle voorgaande testen kunnen 8 primer-probecombinaties geselecteerd

worden voor E. coli. Hiermee kan worden overgegaan tot validatie van de TAC-kaart. Deze


In totaal bleven 20 primerparen over voor de 6 pathogenen en die zullen aangebracht worden

op een TAC-kaart ter verdere validatie. De overgebleven primerparen en hun probe zijn

verzameld in tabel 41.

Tabel 41: Overgebleven geschikte primerparen met hun probe

Pathogeen Target primer selectie probe

Clostridium difficile 16 S p503-p506 678

Clostridium difficile Toxin A tcdA p514-p515 656

Clostridium difficile Toxin B tcdB p518-p519 657

Clostridium difficile binair Toxin A cdtA p520-p521 658

Clostridium difficile binair Toxin B cdtB p524-p525 659

Campylobacter spp. 16S p560-p561 664

Campylobacter jejuni cadF p562-p563 665

Campylobacter coli ceuE p566-p567 679

Salmonella spp. ompF p568-p569 667

Salmonella spp. ssaN p578-p579 668

STEC stx1 p598-p600 672

STEC stx2 p602-p603 673

EPEC eae p582-p583 669

EPEC bfpA p586-p587 670

EAEC aggR p590-p591 671

ETEC LT (eltB) p614-p615 675

ETEC ST (estA) p606.1-606.2-p610 674

EIEC/Shigella ipaH p624-p626 676

Yersinia enterocolitica yst p652-p653 662

Yersinia enterocolitica ail p654-p655 663

3.4 ELEKTROFORESE

In punt 3.2.5.1 werd gezien dat voor sommige Yersinia reinculturen geen goede amplificatie

verkregen werd. Vooraleer tot de verklaring werd gekomen, ook uitgeschreven onder punt

3.2.5.1, werd besloten om dit fenomeen te proberen verklaren door middel van elektroforese.

In figuur 26 zijn laan 2 tot en met 5 de Yersinia culturen. Hierbij werd voor ATCC 23715 telkens

een goede amplificatie verkregen en voor 3A9 68 een slechte amplificatie. Er werd besloten

om beide reinculturen te amplificeren met 2 verschillende primerparen en deze op gel te zetten.

Er wordt verwacht dat wanneer de PCR reactie goed doorgaat, er één duidelijk bandje zal

worden verkregen. Zoals te zien in de figuur werd er voor ATCC 23715, zoals verwacht werd,

83

een duidelijk bandje verkregen terwijl bij 3A9 68 aspecifieke bandjes worden verkregen. Voor

3A9 68 is de amplificatie dus duidelijk niet goed doorgegaan en deze is waarschijnlijk geen

pathogene stam.

Ook werd op dezelfde gel een aantal Campylobacter stalen uitgetest in laan 6 tot en met 11.

Bij een herhaling van de test op functionaliteit van de primers werd voor 3A9 79 en 3A9 89 bij

p562-p563 en p564-p565 aspecifieke amplificatie verkregen aangezien beide reinculturen

positief zijn voor C. coli en deze primers specifiek zijn voor C. jejuni. De 96-well die hiervoor

gebruikt werd, werd bijgehouden en deze stalen werden op gel gezet. Hierbij wordt bij elk

laantje een bandje verkregen, wat wijst op aspecifieke amplificatie voor p562-p563 en p564-

p565.

Figuur 26: Resultaat na elektroforese van de amplicaons van Campylobacter en Yersinia. Laan 1 en 12 zijn de

ladders. Laan 2 is het amplicon van ATCC 23715 met p646-p647. Laan 3 is het amplicon van 3A9 68 met p646-

p647. Laan 4 is het amplicon van 3A9 68 met p649-p651. Laan 5 is het amplicon van ATCC 23715 met p649-p651.

Laan 6 is het amplicon van 3A9 78 met p560-p561. Laan 7 is het amplicon van 3A9 78 met p562-p563. Laan 8 is

het amplicon van 3A9 78 met p564-p565. Laan 9 is het amplicon van 3A9 89 met p560-p561. Laan 10 is het

amplicon van 3A9 89 met p562-p563. Laan 11 is het amplicon van 3A9 89 met p564-p565.

Zoals eerder vermeld onder punt 3.2.3.3 waren er 4 fecesstalen waarvan verondersteld werd

negatief te zijn voor Campylobacter maar die toch amplificatie vertoonden bij de detectie

hiernaar. Daarom werd er gekozen om een sequenering van het amplicon uit te voeren voor

deze fecesstalen om dan later met behulp van BLAST te controleren of de bekomen DNA

sequentie overeenkomstig is met Campylobacter sequenties. Vooraleer deze sequenering

84

uitgevoerd kan worden is het nodig om een elektroforese uit te voeren. Enkel voor stalen

waarbij één duidelijk bandje wordt bekomen zal een sequenering worden uitgevoerd. Het

resultaat van deze elektroforese wordt voorgesteld in figuur 27. Hierbij zijn de 4 met rood

omcirkelde bandjes de bekomen bandjes van de Campylobacterstalen. Er wordt telkens

slechts 1 bandje verkregen met sterke fluorescentie, waardoor het mogelijk is om de

sequenering uit te voeren.

Figuur 27: Resultaat elektroforese van amplicons ter voorbereiding van sequenering.

3.5 DNA SEQUENERING

Zoals vermeld onder punt 3.2.3.3 werd er gewerkt met 4 fecesstalen die mogelijks toch positief

waren voor Campylobacter spp. Daarom werden deze gesequeneerd met primerpaar p560-

p561 voor het 16S gen. Deze sequenering was echter niet heel erg succesvol, bij 3 van de 4

stalen was er na het sequeneren te veel achtergrond aanwezig waardoor analyse onmogelijk

werd. Voor fecesstaal 236704101 werd volgende sequentie verkregen: CTTTAATC-

GGGACGAAACATGACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACT.

Deze sequentie werd onderzocht met een nucleotide BLAST. Ook dit was niet succesvol

aangezien er alleen hits werden gevonden voor “uncultured bacteria” waardoor het nog steeds

onmogelijk was om hieruit een conclusie te trekken. Wel werd er gecontroleerd of de sequentie

van de probe voor dit primerpaar of zijn reversed complement aanwezig waren in de verkregen

sequentie. Dit was niet het geval.

85

3.6 KWALITEITSCONTROLE

Tijdens het extractieproces van fecesstalen wordt een kleine contratie van Phocine Distemper

Virus (PDV) of Seal Herpes Virus (SHV) toegevoegd aan het geëxtraheerde staal. Wanneer

er geen inhibitie optreedt, en er dus een goede staalextractie is doorgegaan, moet er steeds

SHV of PDV, afhankelijk van de extractiemethode, teruggevonden worden in het staal met een

bepaalde Ct-waarde. Daarom wordt er een extractiecontrole uitgevoerd: 2 qPCRs die

amplificatie zullen vertonen wanneer er ofwel PDV ofwel SHV aanwezig is in het fecesstaal.

Ook kan het zijn dat het tijdens de voorbereiding op extractie van het fecesstaal nodig is om

dit fecesstaal te verdunnen. Dit kan gebeuren met AVE buffer (Qiagen) of DNAzol reagent

(lifetechnologies). Daarom is het nodig om bij deze kwaliteitscontrole ook na te gaan of deze

reagentia geen inhibitie kunnen veroorzaken. De kwaliteitscontrole werd uitgevoerd met

fecesstalen 208897001 en 216009201. Van beide werden drie verdunningen uitgevoerd: 20x

verdund, 10x verdund en 5x verdund. Elke verdunning werd 2 maal uitgevoerd met DNAzol

reagent (lifetechnologies) en 2 maal met AVE buffer (Qiagen). Ook werden er blanco stalen

aangemaakt van zowel DNAzol reagent (lifetechnologies) en AVE buffer (Qiagen). De helft

van deze stalen werden geëxtraheerd met PDV en de anderen met SHV. Daarna werd de

kwaliteitscontrole uitgevoerd op deze geëxtraheerde stalen. Bij de controle op PDV werd een

gemiddelde Ct-waarde verkregen van 31.9 en bij de controle op SHV werd een gemiddelde

Ct-waarde verkregen van 32.4.

86

4. SAMENVATTEND BESLUIT

In deze masterproef werden telkens minimaal twee functionele qPCRs geselecteerd voor de

detectie van 6 bacteriële veroorzakers van gastro-enteritis met het ultieme doel deze te spotten

op een TaqMan Array Card (TAC) voor de detectie van virale, bacteriële en parasitaire

oorzaken van infectieuze gastro-enteritis. De primerparen voor de detectie van virale en

parasitaire pathogenen komen in dit eindwerk niet aan bod. De TAC maakt het mogelijk om

op een snelle, routinematige en effectieve manier de oorzaak van gastro-enteritis te kunnen

verklaren uit fecesstalen met behulp van een Real-Time PCR. De bekomen eerste versie van

deze TaqMan Array kaart wordt hieronder weergegeven in figuur 28.

Een eerste selectie uit de meerdere species specifieke targetgenen voor de 6 behandelde

pathogenen werd gemaakt op basis van een literatuurstudie. Hiervoor werden 63 primerparen

en 23 probes ontwikkeld die 22 verschillende targetsequenties konden detecteren. In een

eerste fase van de selectie werden enkel de primers op deze targetgenen getest op zowel

functionaliteit, efficiëntie als specificiteit bij hoge primerconcentratie met behulp van een PCR

reactie met de SYBR Select Mastermix. Om daarna de specificiteit te kunnen bepalen werd er

gewerkt met fecesstalen. Volgens Salonen et al, 2010, zorgen fecale stalen voor niet-invasief

materiaal voor analyse van gastro-intestinale micro-organismen. De lyse van de bacteriële

cellen aanwezig in deze stalen kan gebeuren op een aantal manieren, zoals mechanische,

enzymatische, chemische of een combinatie hiervan. In dit werk wordt geopteerd voor een

fysische lyse. Hierbij worden de fecale stalen eerst ingevroren zodat de stalen een vries-dooi

cyclus kunnen ondergaan. Hierdoor kunnen de sporen en cellen van de bacteriën makkelijker

openbreken bij extractie. De volledige extractiemethode werd verder uitgediept in hoofdstuk

2.6.

Op basis van de bekomen gegevens werden voor C. difficile vijf, voor Salmonella spp. twee,

voor Campylobacter spp. drie, voor Shigella spp. één, voor Yersinia spp. twee en voor E. coli

acht primerparen geselecteerd.

87

Organism

Target gene

Target gene

Organism

Norovirus GI

Norovirus GII

Norovirus GIV

Adenovirus

Adenovirus

Astrovirus

Sapovirus

Sapovirus

Sapovirus

Cntr 18S

Cntr PDV

Cntr hDNA

Rotavirus A

Rotavirus A

Enterovirus

Hepatitis E virus

Giardia lamblia

Cryptosporidium spp.

Entamoeba spp.

Entamoeba histolytica

Entamoeba dispar

Strongyloides stercoralis

Strongyloides stercoralis

Dientamoeba fragilis

ORF1-ORF2

ORF1-ORF2

ORF1-ORF3

hexon

hexon

capsid

RdRp/VP1 junction

RdRp/VP1 junction

RdRp/VP1 junction

18S

PDV

hDNA

NSP3

NSP3

5'UTR (192 nt)

ORF3 regio

18S

DNA J-like protein

18S

18S

18S

18S rRNA

28S rRNA

18S-rRNA

5.8S-rRNA

18S

16S

tcdA

tcdB

cdtA

cdtB

16S

cadF

ceuE

ompF

ssaN

stx1

stx2

eae

bfpA

aggR

LT (eltB)

ST (estA)

ipaH

yst

ail

28S rRNA

28S rRNA

Dientamoeba fragilis

Blastocystis

Clostridium difficile

C. difficile Toxin A

C. difficile Toxin B

C. difficile binair Toxin A

C. difficile binair Toxin B

Campylobacter sp.


Campylobacter coli

Salmonella sp.

Salmonella sp.

STEC

STEC

EPEC

EPEC

EAEC

ETEC

ETEC

EIEC/shigella

Yersinia enterocolitica

Yersinia enterocolitica

Schistosoma mansoni , intercalatum ,

haematobium, guineensis

Schistosoma mekongi , japonicum

Figuur 28: Schematische voorstelling van de gewenste indeling van de Taqan array kaart. De genen aangeduid

in het blauw zijn de genen die in deze masterproef onderzocht werden.

88

Deze 20 primerparen werden gecombineerd met een Minor Groove Binders (MGB) probe ter

verdere optimalisatie. Van deze combinatie moest opnieuw de functionaliteit, efficiëntie en

specificiteit bepaald worden, ditmaal met behulp van een PCR reactie met de TaqMan Fast

Virus 1-step MasterMix. Hieruit bleek dat de meeste primer-probecombinaties functioneel

waren. Voor het C. difficile 16S gen en voor het C. coli ceuE gen was het nodig om de probe

aan te passen. Ook werd er besloten om de primer-probecombinatie voor Shigella te laten

vallen. De test op Shigella zal doorgaan samen met EIEC aangezien deze beide het ipaH gen

bevatten.

Aan de hand van de resultaten van dit eindwerk, het eindwerk van Jeroen Haers, die naast de

optimalisatie van de extractiemethode ook een aantal qPCRs geevalueerd heeft voor de

detectie van parasitaire organismen in zijn eindwerk in academiejaar 14-15, en de selectie van

een aantal virale qPCR, zijn we uiteindelijk tot de bovenstaande eerste versie van de gastro-

intestinale TAC gekomen.

Hiermee is de optimalisatie van de TAC nog niet beëindigd. De verschillende primer-

probecombinaties moeten gespot worden door middel van lyofilisatie op een TAC waarna een

validatie kan worden uitgevoerd. Een eerste validatiestap gebeurt dan met behulp van

plasmides die samen alle targetgenen bevatten waarop er met de TAC kan worden getest.

Van deze plasmides wordt een verdunningsreeks gemaakt. Deze verdunningsreeksen worden

gespot op de TAC en doorlopen een PCR. Aangezien er wordt gewerkt met plasmides

waarvan de sequenties gekend zijn, kan er snel worden aangetoond of de TAC al dan niet

zorgt voor aspecifieke amplificatie. Ook kan, door het werken met een verdunningsreeks, de

efficiëntie van elk primerpaar worden bepaald, waarbij het opnieuw de bedoeling is om een

waarde tussen 90% en 110% te verkrijgen. Daarna wordt de validatie uitgevoerd met behulp

van een groot aantal klinische fecesstalen, die opnieuw op de TAC zullen worden aangebracht

en een PCR zullen doorlopen.

89

5. BRONNENLIJST

Abbasi P., Kargar M., Doosti A., Mardaneh J. Ghorbani-Dalini S. & Dehyadegari M.A. (2014). Characterization of Shiga-toxin producing E. coli (STEC) and enteropathogenic E. coli (EPEC) using multiplex Real-Time PCR assays for stx1, stx2, eaeA. Iranian journal of microbiology. 6(3):169-174

Al-Talib H., Latif B.& Mohd-Zain Z. (2014). Pentaplex PCR Assay for Detection of Hemorrhagic Bacteria from Stool Samples. Journal of Clinical Microbiology. 52(9):3244-3249

Auvray F., Lecureuil C., Dilasser F., Tache J. & Derzekke S. (2008). Development of a real-time PCR assay with an internal amplification control for the screening of Shiga toxin-producing Escherichia coli in foods. The Society for Applied Microbiology, Letters in applied microbiology.48:554-559

Barletta F., Ochoa T.J. & Cleary T. G. (2013). Multiplex Real-Time PCR (MRT-PCR) for Diarrheagenic. PCR Detection of Microbial Pathogens; Second Edition

Bélanger S.D., Boissinot M., Clairoux N., Picard F.J. & Bergeron M. G. (2003). Rapid Detection of Clostridium difficile in Feces by Real-Time PCR. Journal of Clinical Microbiology. 41(2):730-734

Best E.L., Powell E.J., Swift C., Grant K.A. & Frost J.A. (2003). Applicability of a rapid duplex real-time PCR assay for speciation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli directly from culture plates. FEMS Microbiology Letters. 229:237-241

Bielaszewska M., Idelevich E. A., Zhang W., Bauwens A., Schaumburg F., Mellmann A., Karch H. (2012). Effects of Antibiotics on Shiga Toxin 2 Production and Bacteriophage Induction by Epidemic Escherichia coli O104:H4 Strain. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56(6):3277–3282

Bottone E.J. (2015). Yersinia enterocolitica: Revisitation of an Enduring Human Pathogen. Clinical Microbiology Newsletter. 37(1):1-8.

Bowen R.A. (2000). Principles of Gel Electrophoresis. Geraadpleegd op 12 december 2015 via <http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/principles.html>.

Bugarel M., Martin A., Fach P. & Beutin L. (2011). Virulence gene profiling of enterohemorrhagic (EHEC) and enteropathogenic (EPEC) Escherichia coli strains: a basis for molecular risk assessment of typical and atypical EPEC strains. BMC Microbiology. 11:142

Carter G.P., Rood J.I. & Lyras D. (2012). The role of toxin A and toxin B in the virulence of Clostridium difficile. Trends in microbiology. 20(1):21-29

Chen J., Zhang L., Paoli G. C., Shi C., Tu S. & Shi X. (2010). A real-time PCR method for the detection of Salmonella enterica from food using a target sequence identified by comparative genomic analyses. International Journal of Food Microbiology. 137:168-174

Cohen S.H., Gerding D.N., Johnson S., Kelly C.P., Loo V.G., McDonald C., Pepin J. & Wilcox M.H. (2010). Clinical Practice Guidelines for Clostridium difficile Infection in Adults: 2010 Update by the Society for Healthcare Epidemiology of America (SHEA) and the Infectious Diseases Society of America (IDSA). Infection Control and Hospital Epidemiology. 31(5):431-455

Corpus G. (2010). Get in the “groove” with new molecular technology. Medical laboratory observer.

Cremonesi P., Pisani L.F., Lecchi C., Ceciliani F., Martino P., Bonastre A.S., Karus A., Balzaretti C. & Castiglioni B. (2015). Development of 23 individual TaqMan_real-

90

time PCR assays for identifitying common foodborne pathogens usin a singles set of amplification conditions. Food Microbiology. 43:35-40

Crocker J. & Murray P.G. (2003). Molecular biology in cellular pathology. (2de druk). West Sussex: John Wiley & Sons ltd.

Croxen M.A., Law R.J., Scholz R., Keeney K.M., Wlodarska M. & Finlay B.B. (2013). Recent Advances in Understanding Enteric Pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26(4):822-880

Crump J.A., Sjölund-Karlsson M., Gordon M.A. & Parry C.M. (2015). Epidemiology, Clinical Presentation, Laboratory Diagnosis, Antimicrobial Resistance, and Antimicrobial Management of Invasive Salmonella Infections. Clinical Microbiology Reviews. 28(4):901-937

Davis J., Wang J., Tropea J.E., Zhang D., Dauter Z., Waugh D.S. & Wlodawer A. (2008). Noel fold of virA, a type III secretion system effector protein from Shigella flexneri. Protein science. 17 (12):2167-2173

de Boer R. F., Ott A., Kesztyu B., Kooistra-Smid A. M. D. (2010). Improved Detection of Five Major Gastrointestinal Pathogens by Use of a Molecular Screening Approach. Journal of Clinical Microbiology. 48(11):4140-4146

de Jong E., de Jong A.S., Bartels C.J.M., van der Rijt-van den Biggelaar C., Melchers W.J.G. & Sturm P.D.J. (2012). Clinical and laboratory evaluation of a real-time PCR for Clostridium difficile toxin A and B genes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31:2219-2225

Elfving K., Andersson M., Msellem M.I., Welinder-Olsson C., Petzold M., Björkman A., Trolfors B., Martensson A. & Lindh M. (). Real-Time PCR Threshold Cycle Cutoffs Help To Identify Agents Causing Acute Childhood Diarrhea in Zanzibar. Journal of Clinical Microbiology. 52(3):916-923

Fàbrega A. & Vila J. (2012). Yersinia enterocolitica: pathogenesis, virulence and antimicrobial resistance. Enfermedades infecciosas y microbiologia clinica. 30(1):24-32

Fàbrega A. & Vila J. (2013). Salmonella enterica Serovar Typhimurium Skills to Succeed in the Host: Virulence and Regulation. Clinical Microbiology Reviews. 26(2):308-341

Fei Y. (2014). DNA Sequencing, Sanger and Next-Generation Sequencing. Applications of Molecular Genetics in Personalized Medicine.

Feng P., Weagant S.D. & Jinneman K. (2011). Diarhaegenic Escherichia coli. Bacteriological analytical manual Chapter 4A.

Hardegen C., Messler S., Henrich B., Pfeffer K., Würthner J. & MacKenzie C.R. (2010). A set of novel multiples Taqman real-time PCRs for the detection of diarrhoeagenic Escherichia coli and its use in determining the prevalence of EPEC and EAEC in a university hospital. Clinical Microbiology and Antimicrobials. 9:5-11

Hazen T.H., Humphrys M.S., Ochieng J.B., Parsons M., Bopp C.A., O’Reilly C.E., Mintz E. & Rasko D.A. (2014). Draft Genome Sequences of Nine Enteropathogenic Escherichia coli Strains from Kenya. Genome announcements. 2(3):1-2

Hebbelstrup Jensen B., Olsen K.E.P., Struve C., Angeliki Krogfelt K. & Munk Petersen A. (2014). Epidemiology and Clinical Manifestations of Enteroaggregative Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 27(3):614-630

Hensel M., Shea J.E., Raupach B., Monack D., Falkow S., Gleeson C., Kubo T. & Holden D.W. (1997). Functional analysis of ssaJ and the ssaK/U operon, 13 genes encoding components of the type III secretion apparatus of Salmonella pathogenicity island 2. Molecular microbiology. (24)1:155-167

Hoffmann M., Hurlebause J. & Weilke C. (2007). High-Performance Melting Curve Analysis. Using the lightcycler 480 system for discovery and analyses of genetic variation. Genetic engineering and biotechnology news. 27(21).

91

Hsu W., Wang J., Chen P., Lu Y. & Chen J. (2007). Detecting Low Concentrations of Shigella sonnei in Environmental Water Samples by PCR. Federation of European Microbiological Societies. 270:291–298

Humphries R. M. & Linscott A. J. (2015). Laboratory Diagnosis of Bacterial Gastroenteritis. Practical Guidance for Clinical Microbiology. 28(1):3-31

Jamal W., Pauline E.M. & Rotimi V.O. (2014). Comparative performance of the GeneXpert C. difficile PCR assay and C. diff Quik CHek Complete kit assay for detection of Clostridium difficile antigen and toxins in symptomatic community-onset infections. International Journal of Infectious Diseases. 29:244-248

Jensen M. B. F., Olsen K. E. P., Nielsen X. C., Hoegh A. M., Dessau R. B., Atlung T. & Engberg J. (2014). Diagnosis of Clostridium difficile: real-time PCR detection of toxin genes in faecal samples is more sensitive compared to toxigenic culture. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases.

Jiménez K. B., McCoy C. B. & Achí R. (2010). Detection of Shigella in Lettuce by the Use of a Rapid Molecular Assay with Increased Sensitivity. Brazilian Journal of Microbiology. 41: 993-1000

Jinneman K.C., Yoshitomi K.J. & Weagant S.D. (2003). Multiples real-time PCR method to identify Shiga toxin genes stx1 and stx2 and Escherichia coliO157:H7/H- serotype. Applied and Environmental Microbiology. 69(10):6327-6333

Josefsen M.H., Jacobsen N.R. & Hoorfar J. (2004). Enrichment Followed by Quantitative PCR both for Rapid Detection and as a Tool for Quantitative Risk Assessment of Food-Borne Thermotolerant Campylobacters. Applied and Environmental Microbiology. 70(6):3588-3592

Kaakoush N.O., Castaño-Rodríguez N., Mitchell H.M., Man S.M. (2015). Global Epidemiology of Campylobacter Infection. Clinical Microbiology. 28(3):687-720

Karger B.L. & Guttman A. (). DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30(1):196–202.

Knight D.R., Elliott B., Chang B.J., Perkins T.T. & Riley T.V. (2015). Diversity and Evolution in the Genome of Clostridium difficile. Clinical Microbiology Reviews. 28(3):721-741

Kutyavin V., Afonina I.A., Mills A., Gorn V.V., Lukhtanov E. A., Belousov E. S., Singer M. J., Walburger D. K., Lokhov S. G., Gall A. A., Dempcy R., Reed M. W., Meyer R. B. & Hedgpeth J. (2000). 3’-Minor Groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Research. 28(2):655-661

Lambertz S.T., Nilsson C., Hallanvuo S. & Lindblad M. (2008). Real-Time PCR Method for Detection of Pathogenic Yersinia enterocolitica in Food. Applied and Environmental Microbiology. 74(19):6060-6067

Lamps L.W., Havens J.M., Gilbrech L.J., Dube, P.H. & Scott M.A. (2006). Molecular Biogrouping of Pathogenic Yersinia enterocolitica, Development of a Diagnostic PCR Assay with Histologic Correlation. American Society for Clinical Pathology. 125:658-664

Life technologies (2012). TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix. Geraadpleegd op 10 december 2015 via <http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents /generaldocuments/cms_084608.pdf>.

Life technologies (2015). SYBR® Select Master Mix. Geraadpleegd op 10 december 2015 via <http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4472903>.

Lin L.H., Tsai C.Y., Hung M.H., Fang Y.T. & Ling Q.D. (2011). Rectal swab sampling followed by an enrichment culture-based real-time PCR assay to detect Salmonella enterocolitis in children. Clinical Microbiology and Infection. 14:1421-1425

Liu J., Gratz J., Amour C., Kibiki G., Becker S., Janaki L., Verweij J.J., Taniuchi M., Sobuz S.U., Haqua R., Haverstick D.M. & Houpta E.R. (2013). A Laboratory-Developed TaqMan Array Card for Simultaneous Detection of 19 Enteropathogens. Journal of Clinical Microbiology. 51(2):472-480

92

Lothigius Å., Janzon A., Begum Y., Sjöling Å., Qadri F.,Svennerholm A.-M. & Bölin I. (2008). Enterotoxigenic Escherichia coli is detectable in water samples from an endemic area by real-time PCR. Journal of Applied Microbiology. 104:1128-1136

Maervoet V. (2014). Moleculaire bioctechnologie [cursus]. Universiteit Gent, Faculteit Bio-Ingenieurswetenschappen.

Maervoet V. & Van Hoorde K. (2015). Biochemische en moleculaire analyse [cursus]. Universiteit Gent, Faculteit Bio-Ingenieurswetenschappen.

Maher M., Finnegan C., Collins E., Ward B., Carroll C. & Cormican M. (2003). Evaluation of Culture Methods and a DNA Probe-Based PCR Assay for Detection of Campylobacter Species in Clinical Specimens of Feces. Journal of Clinical Microbiology. 41(7):2980-2986

Med-info (2011). Gastro-enteritis. Geraadpleegd op 7 december 2015 via <http://www.med-info.nl/Afwijking_MDL%20-%20Algemeen%20 -%20gastroenteritis.html>.

Morin N., Santiago A.E., Ernst R.K., Guillot S.J. & Nataro J.P. (2013). Characterization of the AggR Regulon in Enteroaggregative Escherichia coli. Infection and Immunity. 81(1):122-132

Mutters R., Nonnenmacher C., Susin C., Albrecht U., Kropatsch R. & Schumacher S. (2009). Quantitative detection of Clostridium difficile in hospital environmental samples by real-time polymerase chain reaction. Journal of Hospital Infection. 71:43-48

Nielsen E.M. & Andersen M.T. (2003). Detection and Characterization of Verocytotoxin-Producing Escherichia coli by Automated 5’ Nuclease PCR Assay. Journal of Clinical Microbiology. 41(7)2884-2893

Niyogi S.K. (2007). Increasing Antimicrobial Resistance – An Emerging Problem In The Treatment Of Shigellosis. Clinical Microbiology and Infection. 13(12):1141-1143

Omiccioli E., Amagliani G., Brandi G. & Magnani M. (2009). A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli 0157 in milk. Food Microbiology. 26:615-622

Persson S., Torpdahl M. & Olsen K. E. P. (2008). New multiplex PCR method for the detection of Clostridium difficile toxin A (tcdA) and toxin B (tcdB) and the binary toxin (cdtA ⁄ cdtB) genes applied to a Danish strain collection. European Society of Clinical Microbiology and Infectious diseases. 14:1057–1064

Prakash V.P., Leblanc L., Alexander-Scott N.E., Skidmore J., Simmons D., Quiliam D. & Chapin K.C. (2015). Use of a Culture-Independent Gastrointestinal Multiplex PCR Panel during a Shigellosis Outbreak: Considerations for Clinical Laboratories and Public Health. Journal of Clinical Microbiology. 53(3):1048-1049

Rainey F.A., Ward-Rainey N.L., Janssen P.H., Hippe H. & Stackebrandt E. (1996). Clostridium paradoxum DSM 730aT contains multiple 16s rRNA genes with heterogeneous intervening sequences. Microbiology. 142:2087-2095

Rohlke F. & Stollman N. (2012). Fecal Microbiota Transplantation in Relapsing Clostridium difficile Infection. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 5(6):403-420

Rosner B.M., Werber D., Höble M. & Stark K. (2013). Clinical aspects and self-reported symptoms of sequelae of Yersinia enterocolitica infections in a population-based study, Germany 2009-2010. BMC infectious diseases. 13:236

Sansonetti P.J. (2001). III. Shigellosis: From Symptoms to Molecular Pathogenesis. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 280(3):319:323

Sharma V.K. & Dean-Nystrom E.A. (2003). Detection of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 by using a multiplex real-time PCR assay for genes encoding intimin and Shiga toxins. Veterinary Microbiology. 93:247-260

93

Shin J., Oh S., Oh K., Park J. Jang E.J., Chung G.T., Yoo C., Bae G. & Cho S. (2015). An outbreak of foodborne illness caused by enteroaggregative Escherichie coli in a high school, South Korea. Japanese Journal of Infectious Diseases.

Sigma-Aldrich (2008). qPCR technical Guide.

Soli K.W., Maure T., Kas M.P., Bande G., Bebes S., Luang-Suaria D., Siba P.M., Morita A., Umezaki M., Greenhill A.R. & Horwood P.F. (2014). Detection of enteric viral and bacterial pathogens associated with paediatric diarrhea in Goroka, Papua New Guinea. International Journal of Infectious Diseases. 27:54-58

SourceBioscience (2016). Solid Phase DNA Extraction Methods. Geraadpleegd op 30 januari 2016 via <http://www.sourcebioscience.com/resources/solid-phase-dna -extraction-methods/>.

Souza dos Reis R. & Horn F. (2010). Enteropathogenic Escherichia coli, Salmonella, Shigella and Yersinia: cellular aspects of hostbacteria interactions in enteric diseases. Gut pathogens. 2:8

Spina A., Kerr K.G., Cormican M., Barbut F., Eigentler A., Zerva L., Tassios P., Popescu G.A., Rafila A., Eerola E., Batista J., Maass M., Aschbacher R., Olsen K.E.P. & Allerberger F. (2015). Spectrum of enteropathogens detected by the FilmArray GI Panel in a multicenter study of community-acquired gastroenteritis. Clinical Microbiology and Infection. 21:719-728

Szmolka A., Wiener Z., Elsheimer Matulova M., Varmuzova K. & Rychlik I. (2015). Gene Expression Profiles of Chicken Embryo Fibroblasts in Response to Salmonella Enteritidis Infection. Plos one. 1-10

Tatavarthy A. & Cannons A. (2010). Real-time PCR detection of Salmonella species using a novel target: the outer membrane porin F gene (ompF). The Society for Applied Microbiology. Letters in Applied Microbiology. 50:645-652

Tawe J. (2014). Validation of PCR assays for detection of STEC O104:H4 and O121 in food.

Thiem V.D., Sethabutr O., von Seidlein L., Tung T.V., Canh D. G., Chien B.T., Tho L.H., Lee H., Houng H., Hale T.L., Clemens J.D., Mason C. & Trach D.D. (2004). Detection of Shigella by a PCR Assay Targeting in the ipaH Gene Suggests Increased Prevalence of Shigellosis in Nha Trang, Vietnam. Journal of Clinical Microbiology. 42(5):2031-2035

Thoerner P., Bin Kingombe C.I., Boëgli-Stuber K., Bissig-Choisat B., Wassenaar T.M., Frey J. & Jemmi T. (2003). PCR Detection of Virulence Genes in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis and Investigation of Virulence Gene Distribution. Applied and Environmental Microbiology. 69(3):1810-1816

Uyeda J., Harmon K. & Wesley I. (1997). A PCR ELISA Method For The Detection Of Yersinia Enterocolitica. Swine Research Report, 1996. Paper 52.

van den Berg R.J., Kuijper E.J., Bruijnesteijn van Coppenraet L.E.S. & Claas E.C.J. (2006). Rapid diagnosis of toxinogenic Clostridum difficile in faecal samples with internally controlled real-time PCR. Clinical Microbiology and Infection. 12(2):184-186

Vandesompele J. (2013). qPCR Guide. Eurogentec.

Van Houdt S. (2012). Biochemische analysetechnieken [cursus]. Hogeschool Gent, Faculteit Natuur en Techniek.

Větrovský T. & Baldrian P. (2013). The Variability of the 16S rRNA Gene in Bacterial Genomes and Its Consequences for Bacterial Community Analyses. PLOS ONE. 8(2):1-10

Vital P.G., Dimasuay K.G.B., Widmer K.W., Rivera W.L. (2014). Microbiological Quality of Fresh Produce from Open Air Markets and Supermarkets in the Philippines. The Scientific World Journal. 1:7

Voss T. (2014). Method for isolating nucleic acids. Geraadpleegd op 30 januari 2016 via <https://www.google.com/patents/US20140199689>.

94

Wang J., Duan R., Liang J. Huang Y., Xiao Y., Qiu H., Wang X., Jing H. (). Real-Time TaqMan PCR for Yersinia enterocolitica Detection based on the ail land foxA Genes. Journal of Clinical Micobiology. 52(12):4443-4444

Wroblewski D., Hannett G. E., Bopp D. J., Dumyati G.K., Halse T. A., Dumas N.B. & Mussen K. A. (2009). Rapid Molecular Characterization of Clostridium difficile and Assessment of Populations of C. difficile in Stool Specimens. Journal of Clinicial Microbiology. 47(7): 2142–2148

Yoshida Y., Miki T., Ono S., Haneda T., Ito M., Okada N. (2014). Functional Characterization of the Type III Secretion ATPase SsaN Encoded by Salmonella Pathogenicity Island 2. PLOS ONE. 9(4):1-12

Zhang G., Brown E.W., Gonzalez-Escalona N. (2011). Comparison of Real-Time PCR, Reverse Transcriptase Real-Time PCR, Loop-Mediated Isothermal Amplification, and the FDA Conventional Microbiological Method for the Detection of Salmonella spp. In Produce. Applied and Environmental Microbiology. 77(18):6495-6501

95

6. BIJLAGEN

Vanwege de grote omvang van de gebruikte tabellen zijn alle bijlagen terug te vinden op

bijgevoegde CD-ROM. Hieronder wordt de volgorde van de bijlagen weergegeven.

Bijlage 1: Functionaliteit primers

Tabblad 1: Clostridium difficile: Alle bekomen Ct-waarden en smelttemperaturen

omtrent de functionaliteit van de geselecteerde primers werkzaam op C. difficile.

Tabblad 2: Campylobacter: Alle bekomen Ct-waarden en smelttemperaturen omtrent

de functionaliteit van de geselecteerde primers werkzaam op Campylobacter.

Tabblad 3: Salmonella: Alle bekomen Ct-waarden en smelttemperaturen omtrent de

functionaliteit van de geselecteerde primers werkzaam op Salmonella.

Tabblad 4: E. coli: Alle bekomen Ct-waarden en smelttemperaturen omtrent de

functionaliteit van de geselecteerde primers werkzaam op E. coli.

Tabblad 5: Shigella: Alle bekomen Ct-waarden en smelttemperaturen omtrent de

functionaliteit van de geselecteerde primers werkzaam op Shigella.

Tabblad 6: Yersinia: Alle bekomen Ct-waarden en smelttemperaturen omtrent de

functionaliteit van de geselecteerde primers werkzaam op Yersinia.

Bijlage 2: Efficiëntiebepaling primers

Tabblad 1: Clostridium difficile: Resultaten bekomen uit de efficiëntiebepaling van

geselecteerde primers werkzaam op C. difficile.

Tabblad 2: Salmonella: Resultaten bekomen uit de efficiëntiebepaling van

geselecteerde primers werkzaam op Salmonella.

Tabblad 3: E. coli: Resultaten bekomen uit de efficiëntiebepaling van geselecteerde

primers werkzaam op E. coli.

Tabblad 4: Shigella: Resultaten bekomen uit de efficiëntiebepaling van geselecteerde

primers werkzaam op Shigella.

Bijlage 3: Specificiteit primers:

Tabblad 1: Primerspecificiteit: Alle bekomen resultaten omtrent de specificiteit van de

geselecteerde primers.

96

Bijlage 4: Functionaliteit probes:

Tabblad 1: Clostridium difficile: Alle bekomen Ct-waarden omtrent de functionaliteit

van de geselecteerde primers en probes werkzaam op C. difficile.

Tabblad 2: Campylobacter: Alle bekomen Ct-waarden omtrent de functionaliteit van

de geselecteerde primers en probes werkzaam op Campylobacter.

Tabblad 3: Salmonella: Alle bekomen Ct-waarden omtrent de functionaliteit van de

geselecteerde primers en probes werkzaam op Salmonella.

Tabblad 4: E. coli: Alle bekomen Ct-waarden omtrent de functionaliteit van de

geselecteerde primers en probes werkzaam op E. coli.

Tabblad 5: Shigella: Alle bekomen Ct-waarden omtrent de functionaliteit van de

geselecteerde primers en probes werkzaam op Shigella.

Tabblad 6: Yersinia: Alle bekomen Ct-waarden omtrent de functionaliteit van de

geselecteerde primers en probes werkzaam op Yersinia.

Bijlage 5: Efficiëntiebepaling probes:

Tabblad 1: Reinculturen: Bekomen efficiënties van geselecteerde primers en probes

uitgevoerd op reinculturen.

Tabblad 2: Plasmides: Bekomen efficiënties van geselecteerde primers en probes

uitgevoerd op plasmides.

Bijlage 6: Specificiteit probes:

Tabblad 1: Mengsels: Alle bekomen resultaten omtrent de specificiteit van

geselecteerde primers en probes uitgevoerd op reincultuurmengsels.

Tabblad 2: Fecesstalen: Alle bekomen resultaten omtrent de specificiteit van

geselecteerde primers en probes uitgevoerd op fecesstalen.

Bijlage 7: Controle PDV en SHV:

Tabblad 1: PDV: Alle bekomen resultaten van de controletest uitgevoerd op PDV.

Tabblad 2: SHV: Alle bekomen resultaten van de controletest uitgevoerd op SHV.

Evaluatie van meerdere Real-Time PCR voor de …...Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen...

Documents

Transcript of Evaluatie van meerdere Real-Time PCR voor de …...Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen...