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Escherichia coli “O que vale para E. coli vale para elefantes” Jacques Lucien Monod (1910 –1976) Práticas microbiológicas

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Escherichia coli

“O que vale para E. coli vale para elefantes”

Jacques Lucien Monod (1910 –1976)

Práticas microbiológicas

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Escherichia coli

-Presente no intestino-Caracterizada em 1855 pelo Dr

Theodor Escherich– Cepa O157:H7 patogênica a

humanos– Cepa K-12 comensal– Auxilio nos estudos

pioneiros da biologia molecular• 100 mil publicações

(Lederberg, 2004)

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Escherichia coli

• Unicelular na forma de bastão• Cresce rapidamente a 37oC

– ciclo de 20 min• Pouco exigente nutricionalmente• Meio mínimo ou rico

– Glicose - melhor fonte de C– Extrato de levedura - essenciais– Triptona e Peptona: fonte aminoácidos

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Escherichia coli• Todas cepas derivam da K-12 • Denominação

– Nome do Laboratório e números representam sequencia de obtenção da cepa

– Cepas mais utilizadas (DH10, BL21, JM 109, HB 101, DH5a, XL blue,......)

• Nomenclatura para genes e marcas genéticas- 3 letras em itálico ou sublinhado indica locus

genético auxotrófico (his ou his -1)- Varias enzimas usa letras maiúsculas para

indicar locus (hisA, hisB)- O fenótipo é escrito em letra maiúscula His+ ou

His

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Escherichia coli-DH10B

F- endA1 recA1 galE15 galK16 deoR nupG rpsL ΔlacX74 Φ80lacZΔM15 araD139 Δ(ara,leu)7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) λ-

- BL21 (AI) F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])

http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#BL21.28AI.29

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4.609.221 pares de base

Mapa de marcas e genético

SequenciamentoConjugação e mutantes auxotroficos

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Plasmídeo

• DNA extra cromossomial– São menores que o principal– Alto replicativos– tamanho de 1 a > 200 Kpb– Determinam característica com resistência a

antibióticos ou síntese de enzimas de restrição

• Deles derivam os vetores utilizados na biologia molecular– Clonar fragmentos

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Tipos de plasmídeos

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Vetores de clonagem

• Plasmídeo - 0,1 a 10 Kb– pBR322; pUC; pGEM; pBluescript; pET

• Insertos: genômico, transcrito reverso de mRNA (cDNA), subclonagem ou sintético

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Vetores de clonagemPlasmídeo

• Características para uso:– origem de replicação– marcadores de seleção

• resistência a antibiótico (ampR, tetR, CamR, KanR, )• gene lacZ - amino terminal b-galactosidase

(complementa)– IPTG e X - Gal

– sítio múltiplo de clonagem (MCS)– tamanho (quanto menor melhor!)

• Manipulação após purificacão– larga escala– “mini-prep” ou lise alcalina

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Clonagem

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pBR3221o plasmídeo -1977Bolivar et al 1977

Plasmídeos naturais

pBR322 = R1 + R6.5 + pMB1

4363 pb

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Seleção Transformação Placa Réplica

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pUC81982

Vieira & Messing(pBR322 and M13mp8)

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Plasmídeo pUC

• Mutanção no gene rop– Permite um maior numero de copias por celula

• Sistema lacZ’• Adicionar ao meio

– IPTG = isopropil thio galactose– X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-d-

galactopiranosídeo (branco/azul)

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Bactérias para Transformação

• Células não apresentam fator de conjugação

• Não apresentam DNA plasmidial

• Precisam ser preparadas– Tornar-se competentes

• Transformação– Quimiotransformação– Eletroporação

F-

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Prática Microbiológicas

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Condições

• Estéril– Ambiente de

manipulação– Regentes e meio de

cultivo– Vidraria– Práticas devem

manter o ambiente estéril

Fluxo Laminar

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Cultivo e conservação

• Meio cultivo– Indefinido– definido

• Consevação de microrganismos – Meses – placa de petri a 4oC, tubo inclinado.– 1ano – “stab”– 4 ano –

•glicerol 15-20% a -70 oC•DMSO entre 7-8% a -70 oC

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Inoculação

• Inoculação– Estoque ou de um

cultivo

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Isolamento

• Colônia isolada– formada a partir de

1 UFC (unidade formadora de colônia)

– Estoque ou de um cultivo

– Certificar da pureza do isolado

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Curva de Crescimento

• Trabalhar com DNA recombinante priorizar fase exponencial (107 UCF, 109 UCFdificulta aeração)

• Inoculo inicial, colônia isolada, pré-cultivo (109), diluir de 10 ou 100 vezes, avaliar curva de crescimento por algumas horas

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Curva de Crescimento

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Pratica Microbiológicas-Contagem

– Diluição Serial• 1UCF entre 8-

16hs forma uma colônia visível ao olho nu

– Absorbância• 400-600 nm• 0,7 limite

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Transferência horizontal de DNA