Effect van microburst nervus vagus stimulatie op

limbische aanvallen in het acuut pilocarpinemodel

Wouter VAN LYSEBETTENS

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Kristl Vonck

Begeleidster: Lies Mollet, MSc, PhD student

Vakgroep Inwendige ziekten, neurologie

Academiejaar 2013-2014

ii

iii

Effect van microburst nervus vagus stimulatie op

limbische aanvallen in het acuut pilocarpinemodel

Wouter VAN LYSEBETTENS

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Kristl Vonck

Begeleidster: Lies Mollet, MSc, PhD student

Vakgroep Inwendige ziekten, neurologie

Academiejaar 2013-2014

iv

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar

te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de

beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum

(handtekening student) (handtekening promotor)

(Naam student) (Naam promotor)

v

Voorwoord

Graag wil ik mijn promotor, Prof. Dr. Kristl Vonck, bedanken voor mij de kans te geven te

proeven van wetenschappelijk onderzoek, alsook voor de opvolging en verbetering van deze

thesis, steeds op een geduldige en altijd vriendelijke wijze.

Ook bedank ik mijn begeleidster Lies Mollet, die vele kostbare uren besteed heeft aan het

aanleren van de nodige technieken en het beantwoorden van vragen.

In het bijzonder bedank ik Prof. Dr. Robrecht Raedt voor de kritische inbreng ondanks hij

hiertoe niet verplicht was.

Als laatste wil ik mijn ouders bedanken, voor mij de kans te geven deze richting in te slaan, voor

de steun tijdens de examenperiodes en voor de vele spellingscontroles van deze thesis.

vi

Inhoudstafel

Samenvatting 1

Summary 2

1 Inleiding 2

1.1 Epilepsie 2

1.2 Gegeneraliseerde epilepsieën 4

1.2.1 Absence epilepsie 4

1.2.2 Gegeneraliseerde epilepsieën met ion-kanaal mutaties. 4

1.3 Partiële epilepsieën 4

1.3.1 Mesiale temporale kwab epilepsie (MTLE) 4

1.4 Behandeling 6

1.5 Nervus vagus 7

1.5.1 De anatomische component van de n. vagus 7

1.5.2 De functionele component van de n. vagus 8

1.6 VNS 8

1.6.1 De achtergrond van VNS 8

1.6.2 Vezeltypes en elektrische stimulatie van de n. vagus 10

1.6.3 De neurochemische gevolgen van VNS 11

1.6.4 Vagale-NTS synaps 12

1.6.5 De rol van de LC in VNS 15

1.6.6 Invloed NE op HC 16

1.6.7 Parameters VNS 18

1.6.8 Standaard VNS vs. Microburst VNS 20

1.6.9 De rationale van microburst VNS 21

1.7 Diermodel 22

1.7.1 Het focale pilocarpine model 24

1.7.2 Werkingsmechanisme pilocarpine 24

1.8 Intracerebrale microdialyse 26

1.9 LMEP 26

1.10 Probleemstelling en doelstelling 27

2 Materiaal en methoden 27

2.1 Proefdieren 27

2.2 Chemicaliën en reagentia 27

2.3 Samenstelling elektroden 28

2.3.1 VNS elektrode 28

2.3.2 Scalp-, cannula/- en aardingselektroden 28

2.4 Operatie 29

2.5 Registratie van de laryngeale motor-evoked potentialen (LMEP) 30

2.6 EEG monitoring, VNS en intracerebrale microdialyse 30

2.7 Protocol van het experiment 31

2.8 Aanvalsernst en EEG analyse 32

2.9 Microdialysaat analyse 33

2.10 Histologie 33

2.11 Data analyse 34

3 Resultaten 34

3.1 Meten van de LMEP 34

3.2 Effect van microburst VNS op limbische epileptische aanvallen en hippocampale

noradrenaline concentratie 35

vii

3.3 Post mortem verificatie microdialyse probe 38

4 Discussie 39

5 Algemeen besluit 46

6 Referenties 47

Bijlage I: Lijst van afkortingen I

Bijlage II: Neurochemische analyse III

1

Samenvatting

Epilepsie is een van de meest voorkomende neurologische aandoeningen. 3% van de bevolking

zal ooit een epileptische aanval krijgen. Focale epilepsie is de meest voorkomende vorm

waarbij complex partiële aanvallen vaak ontstaan in de mesiale temporale regio (mTLE) van het

limbische systeem. Patiënten die refractair zijn aan anti-epileptische medicatie en geen

epilepsiechirurgie kunnen ondergaan zijn kandidaat voor neurostimulatie zoals diepe

hersenstimulatie en nervus vagus stimulatie (VNS). Bij deze laatste wordt via een subcutaan

thoracaal geïmplanteerd apparaat de 10e craniaalzenuw elektrisch gestimuleerd. Het

werkingsmechanisme van VNS is nog niet volledig gekend, maar geweten is dat de stimulatie

leidt tot een activiteitsstijging in de locus coeruleus, wat op zijn beurt leidt tot een verhoogde

concentratie aan noradrenaline in de hippocampus. Deze noradrenalinestijging is gecorreleerd

met een daling in aanvalsernst, -duur en -frequentie, en is een biomerker voor VNS efficaciteit

met standaard parameters. Optimalisatie van deze parameters zou kunnen leiden tot een verdere

verbetering van de aanvalscontrole, een daling van de neveneffecten en een stijging van de

levensduur van de geïmplanteerde batterij. Hiertoe werd een stimulatieprotocol met nieuwe

parameters opgezet, waarbij de elektrische pulsen in korte hoogfrequente uitbarstingen werden

toegediend, microbursts genaamd. De efficaciteit van deze microburst VNS werd getest in een

ratmodel voor limbische epileptische aanvallen uitgelokt door intrahippocampale perfusie van

het proconvulsief product pilocarpine. De duur, ernst en frequentie van epileptische aanvallen

werd bestudeerd via gedrags- en EEG analyse, en de concentratie noradrenaline werd gemeten

via in vivo microdialyse gevolgd door chromatografie. Hieruit bleek dat microburst geen

significante vermindering van epileptische activiteit teweegbracht, noch resulteerde in een

stijging van de hippocampale noradrenalineconcentratie. We hypothetiseren dat standaard VNS

een depressie uitlokt van de synaps tussen de n.vagus en de nucleus tractus solitarius (NST) op

een frequentie afhankelijke manier, wat leidt tot een desinhibitie van de LC. Het is reeds

bewezen dat microburst VNS aanvalsonderdrukkend werkt bij een frequentie van 100 Hz. Bij

een stimulatiefrequentie van 250 Hz zoals in deze studie echter was geen positief effect op de

epileptische activiteit waarneembaar. De reden hiervoor kan gevonden worden in een mogelijke

facilitatie van de n.vagus-NST synaps, wat in beperkte mate beschreven staat als mogelijk

gevolg van hoogfrequente stimulatie. Verder onderzoek is nodig om deze hypothese te

onderzoeken en om de microburst VNS parameters verder te optimaliseren.

2

Summary

Background. Vagus nerve stimulation (VNS) is an effective adjunctive treatment for medically

refractory epilepsy. VNS leads to an increased activity in the locus coeruleus (LC), the main

noradrenergic source of the brain, including the hippocampus. Hippocampal norepinephrine

increase is a biomarker for VNS. A new modality of VNS wherein the electrical pulses are

administered in a burstlike fashion has been proposed to increase VNS efficacy. This study

evaluates whether microburst VNS would result in an increased hippocampal norepinephrine

concentration in an animal model for limbic seizures

Methods. In vivo intracerebral microdialysis was used to measure the effect of microburstVNS

(250 µs, 250 Hz, 0.5mA, 4 pulses/burst, 0.5s interburst interval, 60s ON/5min OFF) on

hippocampal extracellular norepinephrine concentrations and pilocarpine-induced limbic

seizures in freely moving, male Wistar rats.

Results. Microburst VNS did not produce a significant increase in hippocampal noradrenaline

concentration, nor did it increase the latency between pilocarpine infusion and the onset of

epileptiform discharges, or reduce the duration and severity of limbic seizures. No correlation

was found between the noradrenergic and anticonvulsive effects of microburst VNS.

Conclusions. We hypothesize that standard VNS depresses the n.vagus-nucleus tractus

solitarius(NST) synaps in a frequency dependent manner, leading to a disinhibition of the LC.

Microburst VNS has been shown to be efficacious at 100 Hz frequency, yet our results show no

seizure parameter reduction nor hippocampal norepinephrine rise at 250 Hz. This might be due

to a possible facilitation of the n.vagus-NST synaps which has been shown to occur at high

frequencies.

1 Inleiding

1.1 Epilepsie

Epilepsie is een aandoening met als kenmerk de aanwezigheid van een abnormale verhoogde

voorbeschiktheid voor epileptische aanvallen. Dit gaat gepaard met neurobiologische,

cognitieve, psychologische en sociale gevolgen. Een epileptische aanval wordt gedefinieerd als

een transiënt voorkomen van tekenen of symptomen opgewekt door een abnormaal

overvloedige of synchrone neuronale activiteit in de hersenen (2). Per definitie wordt pas

gesproken van epilepsie bij het vervullen van een van de volgende condities: 1. Het voorkomen

3

van minstens twee niet uitgelokte (spontane) epileptische aanvallen gescheiden door meer dan

24u, 2. Een spontane epileptische aanval en een probabiliteit voor volgende aanvallen gelijk aan

het algemene herhalingsrisico (minstens 60%) na twee spontane aanvallen, voorkomend in een

tijdsspan van de volgende 10 jaar of 3. De diagnose van een epilepsie syndroom(3).

Een epileptische aanval is ‘transiënt’, afgebakend in de tijd, met een duidelijk begin en einde.

Dit laatste is soms minder evident vanwege een mogelijke maskering door de symptomen van

het postictaal stadium (tijdelijke verwardheid na de aanval). Een status epilepticus is een

speciaal (en uitzonderlijk) stadium met verlengde of wederkerende epileptische aanvallen.

Epileptische aanvallen presenteren zich onder verschillende klinisch waarneembare vormen

afhankelijk van de locatie waaruit de aanval ontstond (epileptische focus), het

propagatiepatroon van de epileptische activiteit, de mate van volgroeidheid van de hersenen

(maturiteit), simultaan aanwezige aandoeningen, slaap-waak cyclus, medicatie en andere

factoren. Epileptische aanvallen beïnvloeden sensorische, motorische en autonome functies,

alsook het bewustzijn, emotionele toestand, geheugen, cognitie en gedrag. Niet elke soort

epileptische aanval beïnvloedt al deze factoren, maar steeds minstens één (2).

De cerebrale cortex is de belangrijkste speler in het genereren van epileptische aanvallen, maar

niet de enige. Onder sommige omstandigheden kunnen epileptische aanvallen ontstaan vanuit

thalamocorticale interagerende systemen of vanuit de hersenstam (2).

Epilepsie is de tweede meest voorkomende neurologische aandoening na cerebrovasculaire

aandoeningen (4). Wereldwijd zijn minstens 65 miljoen mensen gediagnosticeerd met epilepsie

(5). De gerapporteerde cijfers van het voorkomen van epilepsie variëren aanzienlijk afhankelijk

van de bestudeerde populatie, maar over het algemeen vindt men een incidentie van 50 per 100

000 inwoners en een prevalentie van 0.7% (6). De cumulatieve incidentie, zijnde de proportie

van de populatie die epilepsie ontwikkelt over een bepaalde tijd, bedraagt 1% voor 20-jarigen

en 3% bij een leeftijd van 75 jaar (7).

Men kan de epilepsieën onderverdelen in twee grote categorieën; de gegeneraliseerde en

partiële (of focale) syndromen. In gegeneraliseerde epilepsieën begint het merendeel van de

epileptische aanvallen gelijktijdig in beide cerebrale hemisferen. De meeste van deze

syndromen hebben een sterk genetische component. Bij partiële epilepsie echter, beginnen de

4

aanvallen in één of meerdere gelokaliseerde foci. Deze kunnen nog uitbreiden naar de andere

hersenhelft en aldus het gehele brein aantasten, wat men secundaire generalisatie noemt. Er

wordt verondersteld dat aan de basis van de meeste partiële epilepsiesyndromen een of

meerdere trauma’s aan het centraal zenuwstelsel liggen, echter in vele gevallen kan de precieze

oorzaak niet achterhaald worden (5).

1.2 Gegeneraliseerde epilepsieën

1.2.1 Absence epilepsie

Absence epilepsie is een gegeneraliseerd epilepsiesyndroom dat ontstaat op de leeftijd van 4 tot

8 jaar en zich presenteert als absence- aanvallen, en in zeldzame gevallen gegeneraliseerde

tonisch-clonische aanvallen. Tijdens de absence-aanvallen staren de patiënten en stoppen ze

met de normale handelingen voor enkele seconden, gevolgd door het onmiddellijk verderzetten

van deze activiteiten zonder geheugensporen van deze gebeurtenis (5).

1.2.2 Gegeneraliseerde epilepsieën met ion-kanaal mutaties.

Alhoewel de meeste gegeneraliseerde epilepsieën een complex overervingspatroon hebben, zijn

sommigen geassocieerd met een mendeliaans overervingspatroon en single-gene mutaties.

Bijna al deze mutaties werden gevonden in genen die encoderen voor ion-kanaalproteïnen

leidend tot hyperexciteerbaarheid van de corticale neuronen. Gezien deze genen tot expressie

gebracht worden in het volledige brein wordt verondersteld dat een mutatie leidt tot een diffuus

effect en een algemene verhoogde susceptibiliteit voor een gegeneraliseerd epilepsiesyndroom

(5).

1.3 Partiële epilepsieën

1.3.1 Mesiale temporale kwab epilepsie (MTLE)

Partiële epileptische aanvallen zijn de meest voorkomende vorm van epilepsie bij volwassenen,

vaak afkomstig van een focale laesie zoals hoofdtrauma (trauma capitis), beroertes of tumoren.

De meest prevalente van deze syndromen is MTLE, waarbij complex partiële epileptische

aanvallen ontstaan vanuit de mesiale temporaalkwab, meer bepaald structuren zoals de

hippocampus, amygdala en de aansluitende parahippocampale cortex. De epileptische

aanvallen kunnen beginnen met olfactorische of gustatoire hallucinaties, een epigastrische

sensatie of psychische symptomen zoals déjà vu’s of depersonalisatie. Eens de aanval evolueert

naar bewustzijnsverlies kan de patiënt wezenloos voor zich uitstaren, onsamenhangend spreken

5

of automatismen vertonen zoals orofaciale bewegingen (smakken met de mond) of onbewust

kleren oprapen (5).

De meest voorkomende laesie

die kan gevonden worden bij

patiënten met MTLE is

hippocampale sclerose (HS)

(figuur 1). Dit wordt

gekenmerkt door selectief

neuronaal verlies in de hilus

van de gyrus dentatus en de

pyramidale cellaag, met een

relatief behouden van de

granulaire gyrus dentatus cellen

en een kleine zone in de

pyramidale cellen in het cornu

ammonis veld 2 (CA2) van de

hippocampus. De dense gliose

die gepaard gaat met het

neuronaal verlies veroorzaakt

verharding en inkrimping van

het weefsel. Vaak is er ook neuronaal verlies in de naburige entorhinale cortex en amygdala, wat

gedefinieerd wordt als mesiale temporale sclerose. Of HS een oorzaak of gevolg is van

epileptische aanvallen is niet geweten. Het is mogelijk dat HS een finale pathologische

gemeenschappelijke pathway representeert waarbij een aantal verschillende oorzaken leiden tot

MTLE (5).

De best beschreven verandering in het epileptogeen mechanisme is het ontspruiten van

mosvezel axonen van de granulaire cellen in de gyrus dentatus (mossy-fiber sprouting).

Normaal komt de excitatoire input vanuit de naburige entorhinale cortex de hippocampus

binnen langs de granulaire gyrus dentatus cellen. Inhibitoire input ontstaat lokaal vanuit de

interneuronen in de binnenste moleculaire laag. Vanuit de granulaire dentaatcellen ontstaan

mosvezelaxonen die uitlopen naar de pyramidale neuronen als deel van de hippocampale output

Figuur 1: postmortem coupe van de hippocampus van een neurologisch gezonde persoon (A) en een persoon met hippocampale sclerose door mTLE. (B) De cornu ammonis regio’s CA1 tot CA4 zijn aangeduid + het subicculum (SC). Een duidelijke gescleroseerde CA1 regio met een abrupte overgang van CA1 naar SC is zichtbaar. Figuur C toont de normale granulaire cellaag (GCL)van de gyrus dentatus, terwijl bij (D) er een duidelijke granulaire dispersie aanwezig is die de grenzen van de cellagen overschrijd. Figuur overgenomen van malmgren et al. (1)

6

pathway. Normaal gezien zijn deze granulaire dentaatcellen relatief resistent tegen

hypersynchrone activatie en zijn ze zelf in staat de propagatie van epileptische aanvallen tegen

te gaan. In de situatie van HS echter ontstaan vanuit deze cellen mosvezels die

teruggeprojecteerd worden naar de binnenste moleculaire laag, waarschijnlijk omdat de

neuronen waar ze normaal synaps op nemen verloren gegaan zijn. Er is bewijs dat deze

aberrante ontspruitingen een wederkerend excitatoir circuit vormen door synaps te nemen op

naburige granulaire dentaatcellen. Alhoewel dit een plausibele verklaring is voor

hyperexciteerbaarheid is de causatieve rol van mossy fibersprouting in epileptogenese nog sterk

speculatief. Er is namelijk duidelijk bewijs dat deze vezels ook synaps nemen met de inhibitoire

interneuronen als deel van een feedback mechanisme (5).

1.4 Behandeling

Meer dan 60% van de patiënten met focale aanvallen worden aanvalsvrij door therapie met

anti-epileptische drugs (AED). Het falen van de eerste AED om de aanvallen onder controle te

houden is de krachtigste predictor voor drug-resistentie, met minder dan 10 % van de patiënten

die aanvalsvrij worden bij overschakeling naar een tweede AED. Indien AED’s inefficiënt

blijken kan voor resectieve epilepsiechirurgie geopteerd worden, waarbij temporale lobectomie

voor drugresistente focale epilepsiesyndromen 2/3 van de neurochirurgische procedures

beslaat. Chirurgisch ingrijpen leidt tot een aanvalsvrijheid van 70% (8).

Neurostimulatie is een vorm van therapie die gekozen kan worden indien chirurgie geen optie

is. Ondanks de opkomst van nieuwe AED’s, de grotere beschikbaarheid aan resectieve epilepsie

chirurgie en het heropkomen van het ketogeen dieet, behoudt neurostimulatie zijn unieke rol in

de behandeling van refractaire MTLE. Deze therapie bestaat uit het toedienen van elektrische

pulsen op of in de nabijheid van neuraal weefsel. Een vorm van neurostimulatie is stimulatie

van de nervus vagus (9). De nervus vagusstimulator is geen curatieve behandeling met minder

dan 10% van de behandelden die aanvalsvrij worden. Een gemiddelde reductie in

aanvalsfrequentie van 25% tot 28% op 3 maand evolueert naar 40% bij 1 jaar behandeling.

Andere vormen van neurostimulatie omvatten thalamische diepe hersenstimulatie en de

responsieve neurostimulator. Deze laatste gebruikt subdurale of diepte-elektroden op één of

twee vooraf gedetermineerde epileptische foci. De stimulator wordt geprogrammeerd om een

individu’s abnormale elektrocorticografische activiteit te leren herkennen en hierop te

antwoorden met een gepaste elektrische stimulatie om de aanvalsfrequentie te reduceren (8).

7

1.5 Nervus vagus

1.5.1 De anatomische component van de n. vagus

De nervus vagus is de tiende en langste craniaalzenuw. Door zijn lange weg van de hersenstam

naar het abdomen werd hij vagus genoemd wat zwerver betekent in het Latijn. De nervus vagus

ontstaat vanuit de medulla en verlaat de schedel via het foramen jugulare, waar het een kleine

verdikking vormt, het zogenaamde ganglion jugulare. Net onder het foramen jugulare

expandeert de vagus opnieuw om het ganglion nodosum te vormen. Hierna daalt de vagus af in

de nek gelegen in het kapsel van de a. carotis. Op het niveau van het ganglion nodosum springen

de faryngeale takken af die samen met de faryngeale takken van de nervus glossopharyngeus en

het superior cervicaal sympathisch ganglion de faryngeale plexus vormen. Op hetzelfde niveau

takt de nervus laryngeus superior af van de vagus om de larynx te bezenuwen. Verder zijn er

nog vertakkingen naar de cardiale, pulmonaire, oesophagale en lienale plexi (8).

1.5.2 De functionele component van de n. vagus

De n. vagus bestaat uit 80% afferente sensorische vezels die informatie vanuit hoofd, nek,

thorax en abdomen naar de hersenen voeren, en 20 % efferente. De n. vagus bestaat uit A-, B-,

en C-vezels gebaseerd op hun geleidingssnelheid die, in perifere gemyeliniseerde vezels,

proportioneel is met de grootte. De drie vezeltypes spelen een verschillende fysiologische rol.

De vagale A-vezels zijn de grootste en gemyeliniseerd en dragen afferente viscerale en

motorische informatie. De B- vezels zijn kleine gemyeliniseerde vezels die parasympatische

input dragen. De C-vezels zijn klein, ongemyeliniseerd en dragen afferente viscerale

informatie. De vagale vezels zijn verbonden met 4 nuclei gelegen in de hersenstam (medulla):

de spinale nucleus van de nervus trigeminus, de nucleus tractus solitarius (NST), de nucleus

ambiguus (NA) en de dorsale motore nucleus van de nervus vagus (DMN) (8).

De nervus vagus draagt algemene viscerale afferenten van thoracale en abdominale viscera en

van baroreceptoren en chemoreceptoren vanuit de aortaboog. Deze afferenten spelen een

cruciale rol in de reflexregulatie van respiratoire, digestieve en cardiovasculaire functies. De

cellichamen van de primaire sensorische neuronen zijn gelegen in het ganglion nodosum en

signaleren naar het caudaal gedeelte van de NST (8).

8

1.6 VNS

1.6.1 De achtergrond van VNS

Nervus vagus stimulatie werd voorgesteld in de late 19e eeuw voor de behandeling van

epilepsie door de Amerikaanse neuroloog Corning. Dit was gebaseerd op het idee dat

epileptische aanvallen hun oorsprong vonden in veranderingen van de cerebrale bevloeiing. Zo

werd transcutane stimulatie van de nervus vagus voorgesteld om het hartritme te verlagen en de

cardiale output te verminderen (8).

Pas in 1952 werd door Zanchetti et al. een eerste duidelijke demonstratie gegeven van de rol van

centrale vagale afferenten in de directe modulatie van corticale activiteit. Gebruik makend van

een elegante experimentele aanpak onderzochten ze de effecten van vagale afferente stimulatie

op de EEG-patronen van de kat. Corticale potentiaalverschillen werden gemeten tijdens

afferente vagusstimulatie in gevagotomizeerde “encéphale isolées”, waardoor veranderingen in

systemische bloeddruk werden uitgesloten. Hieruit bleek dat 1. een breed spectrum van

frequenties van stimulatie van de nervus vagus (2-300 Hz) een EEG-desynchronisatie

veroorzaakt, 2. deze hoogfrequente stimulaties in staat waren epileptische activiteit na focale

strychninetoediening te onderdrukken en 3. deze effecten afhankelijk waren van het bereik van

de stimulatiefrequenties. Deze resultaten waren niet terug te vinden indien het proximale einde

van de nervus vagus afgesnoerd werd, wat de secundaire effecten van de bloeddruk uitsloot en

de corticale activiteitsverandering rechtstreeks koppelde aan de vagale afferenten. Hier

demonstreerden Zanchetti et al. voor het eerst dat de corticale effecten van nervus vagus

stimulatie neurogeen zijn en dat de vagale effecten mogelijks de cortex bereikten via

subcorticale associatieve mechanismen. Dit laatste werd bevestigd door Grastyan et al. die

bewezen dat de nervus vagus de cerebrale cortex beïnvloedt via het reticulair activerend

systeem in de hersenstam (8).

Het is geweten dat verschillende patronen van VNS leiden tot verschillende effecten. Zo blijkt

VNS met een frequentie lager dan 70 Hz te leiden tot EEG-desynchronisatie, terwijl een

frequentie hoger dan 70 Hz leidt tot EEG-synchronisatie. Ook ziet men een vertraagd effect in

de cerebrale cortex en thalamische nuclei, terwijl de hippocampale cortex veel sneller reageert

(8).

9

Het klinische potentieel voor VNS bij de behandeling van epilepsie werd voorgesteld door

Zabara et al. Specifiek werd in hondmodellen een anti-epileptisch effect van VNS vastgesteld

op aanvallen geïnduceerd door strychnine en pentyleentetrazol (PTZ). Dit effect werd ook

bekomen in aap- en knaagdiermodellen, waarbij zowel een daling in aantal aanvallen

(frequentie) als een vermindering van de ernst van deze aanvallen bekomen werd na VNS (8).

Initieel werd gedacht dat het effect van VNS te verklaren was door een vrijstelling van

inhibitoire neurotransmitters zoals GABA en glycine in de hersenstam en cerebrale cortex en

dat dit anti-epileptisch potentieel rechtstreeks afhankelijk was van het aantal gestimuleerde

vagale C-vezels. Destructie van de perifere C-vezels in een ratmodel lijkt echter geen invloed

hebben op de VNS-geïnduceerde aanvalsonderdrukking (8).

De eerste beschrijving van de implantatie van een

VNS-apparaat (Figuur 2) in mensen voor de

behandeling van drugresistente epilepsie verscheen in

de literatuur omtrent 1990. Verdere informatie rond de

rol van VNS in de behandeling van epilepsie werd

geleverd door experimentele studies op diermodellen.

Zo vond men in werk op honden dat VNS een

langdurige inhibitie veroorzaakte die vergrootte bij

aangehouden periodes van stimulatie om zo aanvallen

te reduceren. Uit het feit dat VNS zowel door

penicilline geproduceerde focale interictale spikes

beïnvloedt alsook secundair gegeneraliseerde

aanvallen door PTZ blijkt dat VNS een krachtige maar

niet specifieke methode is om corticale epileptiforme

activiteit te reduceren (8).

Ook heeft VNS een duidelijk anticonvulsief effect op spontane aanvallen in volledig amygdala

gekindlede ratten (een model voor spontane focale limbische aanvallen). Het totaal aan

experimentele data en de verschillende clinical trials leidden tot de goedkeuring van het FDA

(food and drug administration) voor het gebruik van VNS als een adjunctieve behandeling voor

Figuur 2: Het VNS apparaat bestaande uit een puls generator verbonden aan helicale elektroden via een bipolaire flexibele draad.

10

volwassen en kinderen vanaf 12 jaar met epileptische aanvallen van focale oorsprong die

refractair zijn aan anti-epileptische medicatie (8).

VNS heeft dus een significante invloed op verschillende soorten epileptische aanvallen van

sterk verschillende anatomische en neurofysiologische oorsprong. Het anticonvulsieve effect is

zichtbaar in species die fylogenetisch gezien sterk verschillen, zoals primaten, ratten, honden,

katten en de mens. Ook is het effect gevalideerd in verschillende bevolkingsgroepen zoals

kinderen, adolescenten, volwassenen, bejaarden en personen met een laag IQ of residenten van

een verzorgingscentrum (10). Het anticonvulsieve mechanisme is dus sterk gepreserveerd, met

een invloed op verschillende hersendelen en neuronale subklassen (8).

1.6.2 Vezeltypes en elektrische stimulatie van de n. vagus

De meest voorkomende vezels in de nervus vagus zijn de C-vezels, die 65% tot 80% van de

zenuw uitmaken. De A-vezels hebben de laagste amplitude-duur drempel die nodig is vooraleer

VNS in staat is een actiepotentiaal uit te lokken (gaande van 0.02 mA tot 0.2 mA). De B-vezels

hebben een hogere excitatiedrempel (0.04 mA tot 0.6 mA) terwijl de hoogste excitatiedrempel

(meer dan 2.0 mA) toebehoort aan de smalle ongemyeliniseerde C-vezels (8). Verdere

karakteristieken zijn weergegeven in tabel 1 (11).

Tabel 1: Karakteristieken van de vezeltypes in de n. vagus. A-vezels B-vezels C-vezels

Diameter 5-20 mm < 3 mm 0.4-2 mm

Hoofdfunctie Snelle pijn,

temperatuur, tast,

spiertonus

Vasomotorisch,

visceromotorisch

Vasomotorisch,

visceromotorisch,

trage pijn, temperatur,

tast

Geleidingssnelheid (m/s) 30-90 m/s 10-20 m/s 0.3-6 m/s

Amplitude drempel (mA) 0.02-0.2 0.04-0.6 >2.0

mA = milliampere, m/s = meter per seconde, mm = millimeter. Voor klinisch gebruik van VNS worden frequenties gaande van 20 Hz tot 30 HZ gebruikt

aangezien frequenties van 50 Hz en hoger ernstige en irreversibele schade aan de n. vagus

kunnen veroorzaken. Verschillende EEG-patronen kunnen uitgelokt worden bij stimulatie van

11

verschillende vezels van de n. vagus. Zo zal rekrutering van de A- en B-vezels door een zwakke

stimulatie een EEG-synchronisatie veroorzaken, terwijl bij een hogere stimulatie ook C-vezels

gerekruteerd worden, leidend tot een EEG-desynchronisatie. Onderdrukking van epileptische

aanvallen resulteert van A- en B-vezelactivatie aangezien therapeutische VNS onder de

drempel voor C-vezel excitatie stimuleert, en C-vezelvernietiging geen effect heeft op de

aanvalsonderdrukking (cfr supra) (8). Deze bevinding is belangrijk aangezien hoge intensiteit

en hoge pulsduur niet noodzakelijk zijn voor een anticonvulsief effect, gegeven dat C-vezels,

die een hogere stimulatie-intensiteit nodig hebben voor activatie, niet centraal staan in het

anticonvulsief mechanisme. Ervaring uit de praktijk suggereert dat als intensiteit stijgt, de

tolerantie daalt. Neveneffecten zoals verandering van de stem, hoesten, nauwheid van de keel,

kortademigheid verergeren ook bij een stijging in de intensiteit (12).

1.6.3 De neurochemische effecten van VNS

In de laatste decennia is VNS de meest gebruikte niet farmacologische behandeling van

refractaire epilepsie. Ook werd VNS reeds voorgesteld om stemmings- en cognitieve

stoornissen te behandelen, zoals majeure depressie en de ziekte van Alzheimer. Een mogelijk

werkingsmechanisme dat aan de basis kan liggen van de effecten van VNS op epileptische

aanvallen en stemming is de verandering van norepinephrine(NE)vrijstelling gemoduleerd door

de projecties van de NST naar de locus coeruleus (LC). De NST is een groot complex van

kernen, gesitueerd in het dorsale tegmentum. Zowel bij de mens als bij dieren gebruikt voor

experimenteel onderzoek, ontvangt de NST input van de tractus solitarius, een sterk

gemyeliniseerde vezelbundel die van het niveau van de nucleus facialis in de caudale pons tot

de spinomedullaire junctie loopt. In de volgroeide hersenen bestaat de tractus solitarius uit

vezels die de speciale en algemene viscerale afferente informatie van de corresponderende

componenten van de zevende, negende en tiende craniaalzenuwen dragen. De NST krijgt ook

informatie vanuit diverse somatische en viscerale sensorische afferente projecties van

verschillende bronnen, zoals het ruggenmerg (tractus spinosolitarius), verschillende

hersenstamstructuren (area postrema, periaqueductal grey, nucleus parabrachialis, nucleus van

Kölliker-Fuse) en cerebrale structuren ( regio’s van de hypothalamus en de centrale nucleus van

de amygdala). De NST projecteert op zijn beurt sensorische informatie naar verschillende delen

van de hersenen, waaronder de amygdala, cerebellum, hypothalamus, thalamus, nucleus

parabrachialis, de raphe nuclei (bron van 5-ht, niet gerefereerd) en de LC (8).

12

De n. vagus projecteert dus sensorische informatie via de NST naar NE en serotonine systemen,

die geassocieerd zijn met de regulatie van stemming, angst, emotie en epileptische

aanvalsactiviteit ( figuur 3).

Figuur 3: Projectie van vagale vezels naar de NTS en de upstream projectieregio's van de NTS. (HC = hippocampus, LC = locus coeruleus, DRN = dorsale raphe nucleï ).

1.6.4 Vagale-NTS synaps

Informatie over de activiteit van de viscerale organen wordt doorgegeven van de vagale A- en

B-vezels naar de mediale, ventrale en laterale NTS via de vrijstelling van glutamaat (13, 14).

Deze glutamaterge synaps kan gemoduleerd worden door presynaptische metabotrope

glutamaatreceptoren (figuur 4). Zo kan glutamaat binden op presynaptische autoreceptoren,

waardoor verdere glutamaatvrijstelling geïnhibeerd wordt (15). Vrijgesteld glutamaat kan ook

13

binden op de metabotrope glutamaatreceptoren van lokale GABA-erge uiteinden, leidend tot

vrijstelling van GABA (16). Dit leidt tot de modulatie van glutamaatvrijstelling vanuit de

vagale vezels door GABAA-receptor gemedieerde activatie enerzijds en GABAB metabotrope

receptor gemedieerde inhibitie anderzijds. Een in vitro studie toonde aan dat GABAA-receptor

gemedieerde excitatoire effecten op de EPSPC (excitatoire post synaptische stroom) dominant

waren, zelfs bij lage concentraties van GABA, en dus de GABAB-receptor gemedieerde

inhibitoire effecten overstijgen. Ook werd geconcludeerd dat vagale presynaptische GABAA

receptor activatie de presynaptische depolarisatie induceert via activatie van

spanningsafhankelijke ionkanalen wat de glutamaatvrijstelling faciliteert. Bij hoge

concentraties van een selectieve GABAA receptor agonist (muscimol) werd geen stijging in

EPSC-frequentie bekomen wat suggereert dat een sterke depolarisatie deze

spanningsafhankelijke ionkanalen inactiveert en glutamaatvrijstelling blokkeert (een fenomeen

gekend als terminale depolarisatieblock) (13).

Figuur 4: Schematische voorstelling van de relatie tussen vagale A en B vezels en de lokale GABAerge neuronen die de glutamaterge signalisatie naar de NTS beï nvloeden. (glutamaat: zwarte bolletjes, GABA: grijze bolletjes). Afferente vagale activiteit activeert de NTS. Presynaptische metabotrope glutamaatreceptoren (mGluR) type II en III inhiberen transmittervrijstelling, terwijl mGluR type I de lokale GABAerge neuronen stimuleert tot vrijstelling. GABAA receptoren stimuleren glutamaatvrijstelling terwijl GABAB receptoren vrijstelling inhiberen. Deze complexe heterosynaptische interacties tussen presynaptisch glutamaat en GABA

beïnvloeden het netto effect van excitatie van de NTS-neuronen. Wij hypothetiseren dat

elektrische stimulatie van de cervicale vagale afferente A- en B-vezels zal leiden tot een

14

frequentie-afhankelijke inhibitie van de mediale, ventrale en laterale NTS-neuronen. Bij een

lage afferente stimulatiefrequentie zou de glutamaatvrijstelling niet voldoende zijn om de

presynaptische metabotrope glutamaatreceptoren te activeren, waardoor er geen vermindering

van synaptische transmissie optreedt. Bij hogere afferente stimulatiefrequenties echter wordt

voldoende glutamaat vrijgesteld om deze presynaptische receptoren te activeren wat een

verdere glutamaatvrijstelling inhibeert en zo de synaptische transmissie reduceert. Deze

hypothese wordt gestaafd door in vivo en in vitro studies waarbij vagale afferente stimulatie aan

1 Hz een excitatoire postsynaptische respons uitlokt in de NTS, terwijl vagale afferente

stimulatie aan 20 Hz een synaptische depressie uitlokt (17-19). Aangezien VNS in de kliniek

meestal een frequentie van 30 Hz bedraagt, hypothetiseren we dat VNS met klinische

parameters de mediale, ventrale en laterale NTS inhibeert.

Het is geweten dat veranderingen in GABAerge en glutamaterge transmissie in de NST de

susceptibiliteit voor epileptische aanvallen kan reguleren. Zo zal een stijging in

GABA-transmissie en een daling in glutamaattransmissie in de NST de susceptibiliteit voor

limbische convulsies uitgelokt door systemische en focale bicuculline en systemische PTZ

verlagen bij ratten (8).

De activatie van de LC na VNS impliceert een direct effect op de cerebrale cortex gezien de

wijdverspreide connecties die de LC-axonen vormen. De LC vormt de grootste groep NE

neuronen in het menselijk brein. De LC heeft een cruciale rol voor waakzaamheid, specifiek

voor selectieve aandacht en flexibiliteit in het gedrag of “scanningsaandacht”.

De LC innerveert bijna alle delen van het centraal zenuwstelsel, en het is de enige noradrenerge

innervatie van de cerebrale en cerebellaire cortices. De projecties afkomstig van de LC maken

geen gebruik van de thalamische nuclei als schakelstation en zorgen hierdoor voor een sneller

effect op de EEG-activiteit. De projecties afkomstig van de LC vertonen diverse diffuse

boutons/verdikkingen wat leidt tot een paracriene invloed op de geïnnerveerde structuren. Dit

ziet men duidelijk in de allocortex van het limbische systeem, waar de aanwezigheid van NE

veel groter is dan deze in vergelijking met isocortex. Dit leidt tot de hypothese dat de regulatie

van de corticale synchronisatie binnen de allocortex meer afhankelijk is van monoaminerge

controle dan van thalamische afferenten. Opvallend is dat de meest duidelijke effecten van VNS

als een anti-epileptische behandeling zijn gerelateerd aan limbische aanvallen. De grootste

input naar de LC is te vinden in de nucleus paragigantocellularis (PGi) en de perifasciculaire

15

area van de nucleus prepositus hypoglossi (PrH), twee structuren gelegen in de rostrale medula.

De vagale afferenten schakelen door van de NST naar de LC via disynaptische pathways; een

via excitatoire aminozuren bevattende vezels van de PGi en een via GABA-erge vezels vanuit

de PrH (8). De LC staat dus onder inhibitoire GABA-erge controle vanuit de PrH in de medulla.

Het inhibitoire effect wordt vooral gemedieerd door het hyperpolariserende effect van GABAA

receptor activatie. Er zijn verschillen in de GABAA receptor subtypes als we mensen

vergelijken met knaagdieren wat de translatie van dierexperimenten bemoeilijkt (20).

Een tweede inhibitoire regulatie van de NTS op de LC vindt men terug in een derde indirecte

disynaptische pathway. Hierbij connecteert de NTS naar een populatie GABA-erge neuronen in

de perifere regio rond de LC (peri-LC) die een regulatoire controle over de LC uitvoeren via

projecties naar de nucleus proper enerzijds en synaptische input naar de extranucleaire

dendrietenboom van de LC anderzijds (21).

Ook is er een directe monosynaptische verbinding van de NST naar de LC (in de rat), meer

specifiek van de caudale NTS naar de rostrolaterale peri-LC. Deze verbinding komt tot stand

door beide types synaptische verbinding, alhoewel excitatoire synapsen meer frequent

geobserveerd worden dan inhibitoire (22).

De NTS heeft gebaseerd op deze bevindingen een netto inhiberend effect op de LC. Volgens

onze hypothese reduceert VNS de activiteit van NTS op een frequentie afhankelijke manier. Zo

zou de NTS meer geinhibeerd worden naarmate de vagale afferente activiteit stijgt. Dit zou

leiden tot een desinhibitie van de LC gevolgd door een stijging in de noradrenerge modulatie

van de hersendelen geïnnerveerd door de LC.

1.6.5 De Rol van de LC in VNS

Het eerste bewijs voor een prominente rol van de LC in het anticonvulsief effect van VNS

dateert van 1998, toen Krahl et al. demonstreerden dat het anticonvulsief effect van VNS

geblokkeerd werd bij laesie van de LC in ratten. De LC blijkt van kritiek belang in het beperken

van de verspreiding en duur van epileptische aanvallen, gezien schade aan de LC spontane

sporadische epileptische aanvallen kan converteren naar status epilepticus. Dit

aanvalsmodifiërend effect lijkt gebonden aan de activiteit/effect van de LC neuronen op

corticale exciteerbaarheid via modulatie van de synaptische plasticiteit en geheugen (8).

16

Zo lijkt VNS via LC activatie de plasticiteit van het epileptisch circuit te moduleren, waardoor

verondersteld wordt dat er lang aanhoudende corticale veranderingen optreden door VNS. Dit

wordt ook teruggevonden in de belangrijke rol van de LC in de modulatie van epilepsie

gerelateerde plasticiteits afhankelijke genexpressie. Deze LC afhankelijke synaptische

plasticiteit kan een verklaring zijn voor een aantal van de beschreven effecten na VNS-therapie,

zoals het antidepressieve effect, de cognitieve verbetering en het verbeteren van het geheugen,

alsook het bizarre tijdsschema en temporeel patroon van VNS. Dit wordt nog gestaafd door de

redenering dat indien VNS enkel een stimulatie-afhankelijke EEG-desynchronisatie zou

veroorzaken, de efficaciteit van VNS op corticale activiteit slechts te merken zou zijn tijdens de

stimulatie. Dit is echter niet zo aangezien epileptische patiënten een intermittente stimulatie

onafhankelijk van de mogelijke aanwezigheid van een aanval ontvangen (8).

Het is geweten dat VNS leidt tot een stijging in de vuursnelheid van 5-HT en NE-neuronen.

Deze stijging is ook relatief afhankelijk van de lengte van de behandeling, de vuursnelheid van

5-HT en NE-neuronen stijgt naarmate de VNS-therapie aanhoudt. Zo is de basale vuursnelheid

in zowel de dorsale raphe nucleus (DRN) als de LC significant verhoogd na een langetermijns-

behandeling met VNS, terwijl een korte periode van VNS enkel de vuursnelheid van de LC

significant verhoogde (bij 1u en 3 dagen). De NE-neuronen van dieren 90 dagen behandeld met

VNS vertonen een burstpatroon dubbel zoveel als controleratten. De lengte van de bursts stijgt

met 110% en het gemiddelde aantal spikes per burst stijgt met 80 % (8).

Gezien de LC, maar niet de DRN, rechtstreekse input van de NST ontvangt, werd gepostuleerd

dat VNS initieel en vooral via de LC werkt, en indirect via afferenten van de LC de DRN

activeert. De combinatie van een aanzienlijke stijging in noradrenerge en serotonerge

neurotransmissie en de afwezigheid van een verlies aan sensitiviteit van de 5-HT1A receptoren

is een mogelijk mechanisme voor de antidepressieve werking van VNS (8).

1.6.6 Invloed NE op HC

De exciteerbaarheid van neuronale netwerken wordt gemoduleerd door diffuse subcortical

projecties die neuromodulatoren zoals acetylcholine, dopamine en NE vrijstellen.

Neuromodulatoren bepalen de algemene neuronale activiteitsstatus en kunnen bepaalde

oscillatie frequenties bevorderen of beperken zowel in vivo als in vitro. Verschillende studies

tonen aan dat de normale NE-activiteit kritiek is voor het modificeren van interstructurele

activatie en dient als anticonvulsant bij VNS patiënten. NE moduleert grotendeels de

17

theta-frequenties in vivo, maar de exacte modulatoire mechanismen tijdens VNS zijn

ongeweten. Studies suggereren dat het NE effect op theta-ritmes hoofdzakelijk gemoduleerd

wordt via beta-adrenoreceptoren (AR). Activatie van beta-AR reduceert de propagatiesnelheid

van synchrone bursts tussen CA3 en CA1 regio’s leidend tot een potentiële desynchronisatie

van de distale verbonden circuits en een sterkere lokale activiteit. De beperking van de spatiale

omvang van de spontane synchrone bursts gaat gepaard met een stijgende variabiliteit en

desynchronisatie van zowel enkelvoudige cellen als onderling verbonden regions of interest.

Ook werd aangetoond dat elektrisch geïnduceerde repetitieve sharp wave-ripple (SPW-R)

activiteit in de hippocampus gemoduleerd wordt door NE. Zo zal NE het voorkomen van

SPW-R’s verlagen. Hoog frequentie oscillaties (zoals SPW-R’s) bij zowel mens als dier

worden verondersteld essentiële schakels te zijn in snelle epileptiforme netwerksynchronisatie

(23).

Op moleculaire basis toonden verschillende studies aan dat de acties van beta-adrenoreceptor

(beta-AR) signalisatie gemedieerd wordt door zowel cyclische AMP proteïnekinase A (PKA)-

afhankelijke als of –onafhankelijke moleculaire signalering. Beide pathways activeren mitogen

geactiveerd proteïne kinase en leiden zo tot verhoogde fosforylatie van het extracellulair signaal

gereguleerd kinase (pERK), een molecule cruciaal voor verschillende vormen van leren en

geheugen. 4-aminopyridine (4-AP), een ictogene stof, zorgt ook via ongekende cellulaire

mechanismen tot een verhoogde ERK-fosforylatie, wat een oorzaak-gevolg relatie tussen

pERK-concentratie en ictogenese impliceert. Er wordt verondersteld dat de regulatie van het

moleculaire ERK via beta-AR-cascades ook de netwerksynchroniciteit en neurale

activiteitspropagatie reguleert. Deze fundamentele intracellulaire signaalcascade staat dus op

het kruispunt van ictogenese, synchroniciteit en synaptische plasticiteit. Zo werd geconcludeerd

dat beta-AR activatie de ruimtelijke en temporele activiteitspatronen in hyperexciteerbare

circuits hervormt door het ontstaan van het ritme in een netwerk (network rhythmogenesis), de

propagatiesnelheid en de intercellulaire en regionale synchronisatie aan te passen (23).

Het effect van NE moet echter genuanceerd worden, gezien NE zowel proconvulsieve als

anti-epileptische effecten uitoefent afhankelijk van de bestudeerde hersenregio en het gebruikte

epilepsiemodel. Ook schrijven verschillende contradictorische studies het anti-epileptische

effect van NE aan alpha1 of alpha2 activatie toe. Zo is er farmacologisch bewijs voor een alpha2

adrenoreceptor gemedieerde inhibitie van hippocampaal CA3 netwerk activiteit. Deze studie

18

toonde ook bifasische concentratiegerelateerde effecten van NE op hippocampale CA3

epileptiforme burst activiteit aan. Zo werd een stijging in het aantal burst ontladingen gevonden

bij lage NE concentraties (<1µM) en een daling van de frequentie bij hogere NE concentraties

(>1µM). Hun resultaten suggereerden dat deze bifasische effecten gemedieerd werden via beta-

(excitatoire) en alpha- (inhibitoire) AR (24).

1.6.7 Parameters VNS

In tegenstelling tot AED’s is een exacte dosis-respons relatie voor VNS-therapie nog steeds te

bepalen. De drie volgende punten duiden op het bestaan van deze relatie. Als eerste hebben

twee RCT’s reeds bewezen dat “hoge” parameters (30s ON, 5 min OFF, 30 Hz, 0.25 mA tot 3.5

mA) significant efficiënter zijn dan lage parameters (30s ON, 180 min OFF, 1 Hz, 0.25 mA tot

3.5 mA). Ten tweede, indien patiënten die initieel gerandomiseerd waren voor lage

parameterinstellingen overgedragen werden naar de hoge stimulatieparameters, was een

significante stijging in efficaciteit op te merken. Ten derde, indien de arbeidscyclus opgedreven

wordt tot boven 22% of als de OFF tijd gereduceerd wordt tot minder dan 1.1 minuten is ook

een significante efficaciteitsstijging te zien. De hoeveelheid energie toegediend aan de n. vagus

kan gedefinieerd worden als de amplitude*puls breedte per tijdseenheid. De hoeveelheid

energie hangt af van de intensiteit en stijgt met hoge stimulatieparameters en daalt met lage

parameterinstellingen. Hieruit kan men concluderen dat de apparaatinstellingen een duidelijke

invloed hebben op de respons. Gezien de meeste patiënten niet aanvalsvrij worden met

standaard parameters, is een zoektocht naar alternatieve instellingen voor nonresponders van

groot belang (12).

Bij de mens hangt veilige en efficiënte VNS-therapie af van de output-stroom, frequentie,

pulsduur en arbeidscyclus (ON/OFF time). De volgende sectie bespreekt deze componenten. De

output-stroom moet boven het minimale niveau dat voor effectieve stimulatie zorgt blijven, en

onder het niveau dat leidt tot bradycardie, vernauwing van de keel en ademnood. Een veilig

stimulatiebereik gaande van 0.25 tot 3.5 mA werd gebruikt voor alle RCT’s en de FDA keurde

de stimulatie goed voor output-stroom van 3.5 mA of minder. Het is niet geweten of hogere

output-stroom, indien ze getolereerd wordt, de efficaciteit zou verbeteren (12). Recent werd in

een ratstudie aangetoond dat VNS op het laagste stroomniveau (0.25 mA), wat net onder het

niveau voor een stijging in de vuursnelheid van de LC te bekomen (0.3 mA) ligt, niet in staat

19

was een significante verandering in de NE-concentratie in hippocampus of cortex te

veroorzaken (10). Om deze reden wordt 0.5 mA gekozen voor deze studie.

Klinisch gezien kan de pulsduur de tolereerbaarheid beïnvloeden. Zo kan een reductie van de

standaard 500 µs naar 250µs leiden tot een verhoogde tolerantie voor VNS. Dierstudies hebben

getoond dat de efficaciteit onaangetast blijft bij deze verlaging. Humane intra-operatieve data

indiceren dat een pulsduur van minder dan 200 µs leidt tot een stijging van de threshold van

elektrische stroom die nodig is voor n. vagusactivatie. Weinig exacte data zijn beschikbaar voor

pulsduren minder dan 250 µs in de mens. Deze lage pulsduren worden daarom niet aangeraden

tenzij de patiënt de laagste intensiteit niet kan tolereren bij een pulsduur van 250 µs.

Preklinische studies toonden aan dat de optimale stimulusfrequentie tussen 20 Hz en 30 Hz ligt.

De n.vagus geëvokeerde potentialen zijn maximaal bij een lage stimulatiefrequentie van 20 Hz

en verminderen bij frequenties vanaf 200 Hz. Interessant is dat EEG-desynchronisatie (een

merker voor anticonvulsieve werking) versterkt is bij lage frequenties (25 Hz). Men vond dat

het maximale anticonvulsieve effect plaatsvindt bij frequenties tussen 20 Hz en 30 Hz en dat

frequenties groter dan 60 Hz leiden tot een daling in efficaciteit.

De VNS RCT’s toonden aan dat een arbeidscyclus van 30 seconden On en 5 minuten OFF

veilig en efficiënt was, wat leidde tot de goedkeuring van de FDA in 1997. Bij patiënten waarbij

de standaard arbeidscyclus ineffectief is kan een vermindering van de OFF tijd tot 1.1 minuten

of minder of een stijging in arbeidscyclus van meer dan 22% leiden tot een verbeterde respons

(12).

In deze studie zal gebruik gemaakt worden van een bifasische golfpuls, doch studies op de

n.vagus van honden toonden aan dat de stimulatiegolfvorm (monofasisch vs. asymetrische

ladingsgebalanceerde bifasische stimulatie) de drempel voor vagale vezelrecrutering niet

beïnvloedt (25).

De resultaten van prospectieve gerandomiseerde studies tonen aan dat standaardarbeidscycli

van 30 seconden ON/ 5 minuten OFF, 20 tot 30 Hz met intensiteit gaande van 0.25 mA tot 3.5

mA veilig en efficiënt zijn. Neveneffecten zijn vooral een gevolg van intensiteit, en in mindere

20

vorm van pulsduur en arbeidscyclus. De efficaciteit van VNS verbetert na het eerste jaar van

therapie. Dit kan gelegen zijn aan een stijging in intensiteit, een stijging van de arbeidscyclus

(daling van de OFF tijd) of zoals ook gezien bij proefdieren door de cumulatieve blootstelling

(12).

1.6.8 Standaard VNS vs. Microburst VNS

Enhanced of versterkte VEP’s (eVEP’s) refereren in deze context naar de elektrische

potentialen uitgelokt in de voorhersenen door neurostimulatie die hoger zijn dan deze

geproduceerd door conventionele neurostimulatie, meer specifiek de conventionele VNS met

een interpuls frequentie van 20-30 Hz (resulterend in 140-1800 pulsen per burst met een burst

duur van 7-60 s). Het elektrisch signaal voor deze verbeterde therapie (figuur 6) is fundamenteel

verschillend van de elektrische signalen in conventionele VNS (figuur 5).

Figuur 5. ON/OFF Standaard VNS: grafische voorstelling van het elektrische signal voor intermitterende standard stimulatie (s= seconden, min = minuten, A = amplitude, t = tijd). Zo wordt het namelijk gekarakteriseerd door een zeer korte ‘uitbarsting’ van een beperkt aantal

elektrische pulsen. Deze korte uitbarstingen van minder dan een seconde noemt men

‘microbursts’. Door het toedienen van een elektrisch signaal bestaande uit een serie van

microbursts aan de n.vagus worden eVEP’s uitgelokt in therapeutisch significante delen van de

hersenen. Deze eVEP’s worden niet geproduceerd door conventionele VNS. De

interburstperiode, zijnde het tijdsinterval waarin een serie van microburst van elkaar gescheiden

wordt, laat een refractoir interval toe waarin de zenuw kan herstellen van de vorige microburst

en opnieuw receptief kan worden voor eVEP stimulatie door een volgende microburst. De

aansluitende pulsen in een microburst zijn van elkaar gescheiden door een tijdsinterval dat het

‘interpulsinterval’ genoemd wordt. Het interpuls interval, samen met het aantal pulsen en de

pulsbreedte bepaalt de microburstduur, zijnde de lengte van een microburst vanaf het begin van

de eerste puls tot het einde van de laatste puls (en dus het begin van een nieuwe

21

interburstperiode). De parameters die geselecteerd kunnen worden om de microburstefficaciteit

te altereren zijn de interburstperiode, de microburstduur, het aantal pulsen per microburst, het

interpulsinterval, de stroomamplitude, de pulsduur, de ON/OFF tijd en ratio (26).

Figuur 6: parameters microburst VNS. (A = Amplitude, t = tijd, s = seconden, min = minuten).

1.6.9 De rationale van microburst VNS

Gezien het exogeen elektrisch signaal bij VNS typisch toegediend wordt via een geïmplanteerd

apparaat dat gevoed wordt door een batterij, kan de toediening van irrelevante stimuli zorgen

voor onnodig batterijverbruik. Verder kan een pulsburst ervoor zorgen dat de stembanden van

de patiënt contraheren waardoor de stem hees kan worden, wat oncomfortabel kan zijn en

spreken moeilijk maakt. Zelden kan de pulsburst nekpijn en cardiale problemen veroorzaken.

Om deze redenen kan het verminderen van aantal pulsen een positief resultaat geven voor het

comfort en/of veiligheid van de patiënt (27).

De centrale vagale afferente pathways ondervinden meerdere synapsen alvorens activiteit in de

voorhersenen te kunnen uitvoeren. Elk van deze synapsen zijn een potentiële site voor facilitatie

en een niet lineaire temporele filter, waarvoor de sequentie van inter-microburstintervals en/of

interpulse-intervals binnen een microburst geoptimaliseerd kan worden. Microbursts worden

geacht de VNS efficaciteit te verhogen door synaptische facilitatie en het ‘tunen’ van de input

stimulustrein om zo de uitgelokte potentiaal in de voorhersenen te maximaliseren (27).

Het gebruik van gepaarde pulsen (twee of meerdere elektrische stimulaties zeer snel na elkaar

toegediend) is een standaard fysiologische techniek om efficiënte centrale responses te

veroorzaken na stimulatie van afferente vezels met een kleine diameter. Een pulse burst met

22

microbursts van pulsen die een gepaste sequentie van interpulsintervallen hebben vergroten zo

het effect van VNS sterk. Bij een selectie van gepaste signaalparameters ( puls wijdte,

frequentie, interpulsinterval, microburstfrequentie, microburstduur, aantal pulsen microbursts)

kan het exogene elektrische signaal dat de nervus vagus bereikt bestaan uit een serie

microbursts die elk een versterkte vagaal uitgelokte potentiaalverandering (eVEP)

teweegbrengen (27). Gepaarde puls-stimulatie van de n.vagus met een frequentie van 300 Hz

lokten reeds multi-unit ontladingen uit in de central vagale projectieregio’s bij mensapen , meer

specifiek in de nucleus parafascicularis en de basale ventromediale nucleus van de thalamus

(28). Ook werd bevonden dat de probabiliteit van het uitlokken van een respons in de thalamus

van apen stijgt met het aantal van hoogfrequente vagale stimulatiepulsen (gaande van

enkelvoudige, gepaarde tot drievoudige stimuli). Hierop gebaseerd kan men verwachten dat

microbursts meer potent zijn de projectieregio’s van VNS te beïnvloeden en mogelijks te leiden

tot een sterker anti-epileptisch effect dan standaard VNS (29).

Een duur van een microburst langer dan 10 ms (wat correspondeert met 4 pulsen met een

interpulsinterval van ongeveer 3 ms) produceert een maximale eVEP in de thalamus van

mensapen en een interpulsinterval van 6 tot 9 ms leidt tot een maximale facilitatie door de eerste

puls van de tweede puls. Zo kan een optimale VEP bekomen worden met een korte microburst

van pulsen met een totale duur van 10 ms tot 20 ms en een initiële interpulsinterval van 6 tot 9

ms gevolgd door intervallen met gelijke of langere duur. Dit komt omdat een patroon van

microburstpulsen het natuurlijk voorkomend patroon van actiepotentialen in vezels met kleine

diameter simuleert. Selectie van een gepast inter-microburstinterval om de ene microburst te

scheiden van de volgende moet experimenteel bepaald worden, maar een periode van minstens

100 ms (beter 500 ms en bij voorkeur 1 s) en op zijn minst evenredig aan de duur van de

microburst is gewenst (27).

1.7 Diermodel

De hoofdkenmerken van mTLE zijn: 1. de lokalisatie van de epileptische foci in het limbische

systeem, en dan vooral in de hippocampus, entorhinale cortex en amygdala. 2. het frequent

voorkomen van een ‘initieel precipiterend trauma’ dat het ontstaan van mTLE voorafgaat. 3.

een aanvalsvrij interval dat dit precipiterend trauma volgt gekend als ‘de latente periode’. 4. een

hoge incidentie van mesiale of Cornu Ammonis (CA) sclerose, zijnde een unilaterale

23

hippocampale laesie leidend tot atrofie, typisch veroorzaakt door neuronaal verlies en gliose in

Sommer’s sector (subiculim-CA1 transitie zone) en het eindfolium (hilus dentatus). De meeste

van deze eigenschappen kunnen gereproduceerd worden in chronische diermodellen van

mTLE, en dan vooral Kindling of post status epilepticusmodellen. Het pilocarpine model

behoort normaal gezien tot de SE-modellen. Het vertoont hierbij een hoog isomorfisme met het

menselijk ziektebeeld en wordt hierdoor in vele laboratoria gebruikt (30).

Enkele belangrijke kenmerken van het pilocarpinemodel zijn: 1. de snellere inductie van SE dan

bij intraperitoneaal kainaat, de andere convulsante drug die vaak gebruikt wordt om mTLE te

modelleren. 2. de aanwezigheid van een latente periode gevolgd door het verschijnen van

spontane wederkerende epileptische aanvallen. 3. wijdverspreide laesies waarvan sommigen

gelokaliseerd in dezelfde hersendelen die aangetast zijn bij mTLE-patiënten, en geassocieerd

met neuronaal netwerkreorganisatie in de hippocampale en parahippocampale regio’s. (zo zijn

mossy fiber sprouting, interneuron verlies en ectopische granulaire dentaat celproliferatie

aanwezig bij zowel mTLE-patiënten als proefdieren behandeld met pilocarpine) . 4. het feit dat

de epileptische aanvallen moeilijk te controleren zijn met AED’s zowel bij patiënten als bij met

pilocarpine behandelde epileptische proefdieren (30).

Het epileptogeen effect van pilocarpine ligt in de mogelijkheid de muscarinereceptor M1 te

activeren, gezien een proefdier met een knockout voor dit receptor subtype geen epileptische

aanvallen ontwikkelt na pilocarpinetoediening. Andere cholinomimetica zoals carbachol en

oxotremorine zijn ook in staat epileptische aanvallen te induceren na systemische of cerebrale

injectie. Een pilocarpine geïnduceerde SE kan ook geblokkeerd worden door systemische

toediening van de muscarine antagonist atropine. Eens de epileptische aanvallen zijn geïnitieerd

blijkt de voortzetting af te hangen van andere mechanismen gezien atropine ineffectief wordt.

Experimenten op hippocampale neuronen in cultuur toonden aan dat pilocarpine, werkend via

de muscarine receptoren, een disbalans tussen excitatoire en inhibitoire neurotransmissie

veroorzaakt. In vivo microdialyse studies toonden aan dat pilocarpine een stijging in

glutamaatconcentratie in de hippocampus volgend op het ontstaan van epileptische aanvallen

induceert. Een substantiële hoeveelheid aan bewijs ondersteunt nu de suggestie dat, volgend op

de initiatie door M1-receptoractivatie, de epileptische aanvallen in stand gehouden worden door

NMDA-receptoractivatie (30).

24

1.7.1 Het focale pilocarpinemodel

Het focale pilocarpinemodel is een acute variant van het chronische intraperitoneale pilocarpine

model. In dit model worden limbische epileptische aanvallen uitgelokt in wakkere, vrij

bewegende dieren door intrahippocampale pilocarpine toediening via een microdialyse probe.

Focaal uitgelokte pilocarpine geïnduceerde epileptische aanvallen bootsten complex partiële

aanvallen nog beter na dan limbische epilepsie geïnduceerd door systemische toediening van

een drug (31). De aanwezigheid van de microdialyse probe op dezelfde locatie van de

aanvalsinductie laat simultane monitoring toe van lokale extracellulaire concentraties van

endogene stoffen zoals glutamaat en GABA, in dieren bij bewustzijn. Studies uitgevoerd in dit

model toonden een stijging in hippocampale extracellulaire aminozuurconcentraties aan tijdens

focaal geïnduceerde pilocarpine aanvallen. Deze neurochemische veranderingen kunnen

gebruikt worden als merker voor een stijging in netwerkactiviteit (32).

1.7.2 Werkingsmechanisme pilocarpine

De mechanismen waardoor pilocarpine epileptische aanvallen induceert zijn nog niet volledig

begrepen, maar duidelijk is dat veranderingen in ionaire conductantie en 2nd messenger

systemen betrokken zijn. Pilocarpine is een agonist van de M1-receptor. M1 induceert

hydrolyse van fosfoïnositiden en de vorming van inositol trifosfaat en diacylglycerol. De M1-

en M2-receptoren komen voor in de hippocampus, waar M1 meer uitgesproken is in de

CA1-regio en de gyrus dentatus. Een van de elektrofysiologische effecten van activatie van de

muscarinereceptor op K+ geleiding is de blokkering van de persisterende K+ stroom gekend als

Im, waardoor er een trage depolarisatie ontstaat. Een tweede is de blokkering van de calcium

afhankelijke trage K+ stroom die verantwoordelijk is voor de hyperpolarisatie die een

burstontlading volgt. Een derde is de blokkering van een transiënte uitwaarts gerichte K+

stroom die de exciteerbaarheid van de hippocampale neuronen reguleert. Deze drie effecten

tezamen verhogen de exciteerbaarheid en dragen bij tot epileptogenese.

Ook is geweten dat acetylcholine dat de muscarinereceptoren in de hippocampus activeert leidt

tot een langdurige facilitatie van de excitatoire postsynaptische potentialen die afhankelijk zijn

van de verhoogde responsiviteit voor NMDA. Dit effect is niet afhankelijk van veranderingen

in de kaliumgeleding maar wel van de second messenger functie van inositol 1,4,5-trifosfaat.

Dat dit second messengersysteem een belangrijk deel is van het convulsante effect kan men zien

25

aan het krachtige proconvulsieve effect van co-administratie van pilocarpine en lithium, een

inhibitor van inositol fosfatase.

De 2nd messengerfunctie van diacylglycerol is ook betrokken bij het convulsant mechanisme.

Activatie van proteïnekinase-C leidt tot een functionele modificatie door fosforylatie van

verschillende receptoren. In het geval van de NMDA-receptor potentieert proteïnekinase-C

activatie de respons op glutamaat. Activatie van proteïnekinase-C leidt ook tot een stijging van

de glutamaat opname in de gliale cellen. Via dit mechanisme leidt pilocarpinetoediening tot een

daling van de extracellulaire glutamaatconcentratie (33).

Pilocarpine kan zowel ictale als interictale epileptische gebeurtenissen uitlokken waarbij de

EEG patronen gecorreleerd zijn met de gedragsveranderingen. Laag gevolteerde snelle activiteit

is als eerste zichtbaar in de neocortex en amygdala, terwijl een duidelijk patroon met theta-ritme

zichtbaar is in de hippocampus. Als de gedragsmanifestaties ernstiger worden zal het

hippocampaal theta-ritme vervangen worden door hoog gevolteerd snelle EEG-activiteit. Op

latere stages ontwikkelen de dieren elektrografische aanvallen, gekarakteriseerd door hoog

gevolteerde snelle activiteit en prominente hoge voltagespikes die de aanvallen voorafgaan

(figuur 7), waarschijnlijk door de activatie van het muscarinerg systeem. Deze activatie ontstaat

in de hippocampus en propageert naar de amygdala en neocortex (30).

Figuur 7. EEG alteraties door pilocarpine A: basisactiviteit. B: lage voltage activiteit in cortex (ctx) en

26

theta ritme in hippocampus (HC). C: Hoge voltage spikes in HC. D: Hoge voltage spikes in zowel ctx als HC. E: elektrografische epileptische aanval. S = seconde, µV = microvolt. Figuur aangepast uit (30).

Het is aangetoond dat intrahippocampale pilocarpinetoediening even efficiënt is als de

intraperitoneale toediening. Niet alleen vindt men dezelfde gedrags-, elektrografische en

neuropathologische veranderingen terug, intrahippocampaal pilocarpine blijkt ook nog gepaard

te gaan met een daling in mortaliteit in vergelijking met systemische injectie (34).

1.8 Intracerebrale microdialyse

Microdialyse wordt gebruikt voor in vivo bemonstering van farmaca en metabolieten of

endogene stoffen vanuit lichaamsvloeistof of interstitiëel vocht in specifieke weefsels, alsook

toediening van exogene stoffen. De microdialyse opstelling bestaat uit een pomp, een katheter

of probe, en een recipiënt waarin het monster wordt gecollecteerd. De probe is concentrisch

bestaande uit een dunne dialyse tube met een binnenste diameter van 0.15-0.3 mm en een

semipermeabel membraan aan het uiteinde. Een perfusie vloeistof stroomt binnen langs de inlet

tubing aan een constant debiet, passeert langs het membraan en bereikt via de outlet tubing het

recipiënt. Het perfusaat is een waterachtige oplossing die de samenstelling van de fysiologische

omgeving nabootst. Hierdoor wordt overtollige migratie in of uit de periprobe vloeistof

vanwege osmotische druk vermeden. De diffusierichting is afhankelijk van de

concentratiegradiënt. Zo zal wanneer het perfusaat het membraan passeert, moleculen (tot een

zeker moleculair gewicht) in (recovery) of uit (delivery)het perfusaat diffuseren (35).

1.9 LMEP

Er bestaat een grote variabiliteit tussen patiënten onderling wat betreft de respons op VNS

therapie. Verschillende factoren kunnen leiden tot deze interindividuele variabiliteit (36). Een

grote bijdragende factor kan het verschil in activatie van de n.vagus in respons op VNS zijn. Zo

kan het gebeuren dat VNS niet in staat is de n.vagus te activeren wegens tijdelijke schade aan

de zenuw geïnduceerd door de electrode implantatie. Om hiervoor te corrigeren zal gebruik

gemaakt worden van LMEP’s. De LMEP (laryngeal muscle evoked potential) is het resultaat

van VNS-geïnduceerde co-activatie van Aα-motorische vezels die de laryngeale spieren

bezenuwen en kan gebruikt worden om 1. de hersteltijd van de n.vagus na elektrode-implantatie

te bepalen en 2. een adequate VNS-gerelateerde activatie van de n.vagus te verifiëren (37, 38).

27

1.10 Probleemstelling en doelstelling

Omdat de responder rate van VNS onder andere afhangt van parameteroptimalisatie werd een

studie opgezet om de effecten van microburst VNS, een nieuwe en experimentele modaliteit

van VNS, in het focale pilocarpinemodel te bestuderen. Hierbij zal geëvalueerd worden of

microburst VNS in staat is enerzijds een stijging van de hippocampale

noradrenalineconcentratie te bekomen en anderzijds te leiden tot een vermindering van de

pilocarpine geïnduceerde epileptische activiteit.

2 Materiaal en methoden

2.1 Proefdieren

20 mannelijke Wistar ratten (Charles River Laboratories, België) met een gewicht van 250-275

g werden gebruikt in het Laboratorium voor Klinische en Experimentele Neurofysiologie,

Neurobiologie en Neuropsychologie (LKEN3) in het universitair ziekenhuis Gent (UZGent).

De dieren werden behandeld volgens de richtlijnen goedgekeurd door het Europees ethisch

comité (Decree 86/609/EEC). Het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door het ‘Animal

Experimental Ethical Commitee’ van het UZGent. Alle dieren werden onder gecontroleerde

omgevingscondities gehouden (Een dag- en nachtcyclus van 12u/12u werd aangehouden bij een

temperatuur van 20-23°C met een luchtvochtigheid van 50-60%). Voedsel en water werden ad

libitum voorzien. Als kooiverrijking werden nestlets en knaagblokken voorzien.

2.2 Chemicaliën en reagentia

Pilocarpine HCl werd aangekocht van Sigma (St. Louis, MO, USA). Alle andere chemicaliën

waren van de kwaliteitsgraad van analytische reagentia of beter en werden verkregen via Merck

(Darmstadt, Germany). Waterige oplossingen werden gemaakt met gezuiverd water (Seralpur

pro 90 CN, Belgolabo, Overijse, België) en gefilterd door een 0.2 µm membraanfilter. De

waterige perfusie oplossing voor de microdialyse experimenten, hierna beschreven als

gemodifiëerde Ringer’s oplossing, bestaat uit 147 mM NaCl, 2.3 mM CaCl2 en 4 mM KCl. Een

antioxidante oplossing bestaande uit 3.3 mM L-cysteine, 0.27 mM Na2EDTA, 12.5 lM

ascorbinezuur en 100 mM watervrij azijnzuur werd gebruikt om het noradrenaline in de

dialysaten te stabiliseren. Pilocarpine HCl (10 mM) werd opgelost in gemodifieerde Ringer’s

28

oplossing en toegediend via de microdialyseprobe.

2.3 Samenstelling elektroden

2.3.1 VNS elektrode

Twee platina rechthoekjes van 1mm op 3mm (Alfa

Aesar, USA, 99.9% metal basis, 0.25 mm dik)

gesoldeerd aan zilverdraad met silicone elastomeer

coating (MED-4210, Nusil Technology, USA)

worden via een polymeriserend adhesief (Part A and

B MED4-4210, Nusil) aan een siliconeblad gehecht

(MED-4750, Statice Santé, France, NuSil

components). Hierop wordt een tweede siliconeblad

bevestigd met een stretchfactor 0.5 en twee rechthoekjes (0.7mm op 2mm) worden via een

hypodermische naald uit de bovenste siliconelaag verwijderd. De uiteindelijke cuff-elektrodes

worden afgesneden op een lengte van 5mm (figuur 8).

2.3.2 Scalp-, cannula/- en aardingselektroden

De cannula/diepte elektrode (figuur 9) die zowel epileptische aanvallen zal registreren als

microdialyse zal uitvoeren bestaat uit een bipolaire elektrode (polyimide coated stainless steel

wires 70 μm, Bilaney, Germany) met 0.5mm afstand tussen de uiteinden, met krimpdraad

bevestigd aan de cannula. De afstand tussen het langste uiteinde van de bipolaire elektrode en

het uiteinde van de cannula is 3.5 mm. Scalp elektrodes voor EEG registratie bestaan uit vijsjes

(1.57mm, Bilaney, Germany) via een metaaldraad (RS) verbonden met een connectiepin en

geïsoleerd met een krimptube.

Figuur 9: Canulla/diepte-elektrode complex.

Figuur 8: Cuff-elektrode voor VNS.

29

2.4 Operatie

De chirurgische site werd gedesinfecteerd met ethanol. Na

prechirurgische evaluatie waarbij bekeken werd of het dier niet

ziek is werden nek en hoofdregio geschoren. Gedurende de

volledige operatie werd het dier verwarmd via een heatingpad

met rectale probe. Inductie van anesthesie gebeurde met 5%

isofluraan, onderhouden gebeurde met 2% isofluraan. De huid

wordt ventraal in de nekregio ontsmet met isobetadine (10%

polyvidoniodine), gevolgd door een incisie in de linker

anterieure cervicale regio. De linker cervicale n. vagus werd zorgvuldig losgemaakt van de

aortaschede. Hierna werd de cuff-electrode met twee platina contactpunten (elk 3 mm² met 1

mm ruimte tussen beiden) rond de linker cervicale nervus vagus gewikkeld met de anode

caudaal geplaatst (figuur 10).

Na implantatie werd de impedantie gemeten tussen de platina plaatjes en de n. vagus om een

goed contact tussen de platina plaatjes en de nervus vagus te verzekeren. De uiteinden van de

electroden werden subcutaan naar dorsaal

geleid tot achter het linkeroor en treden naar

buiten langs een incisie in de gedesinfecteerde

schedelhuid. De cervicale wonde werd gehecht

met Silkam R 5/0 wire en xylocaine gel en

neobacitracine werden lokaal toegediend. De

dieren werden vervolgens in een stereotactisch

kader geplaatst (Bilaney Consultants,

Düsseldorf, Germany) en geïmplanteerd

(figuur 11) met twee epidurale opname

elektroden in het linker en rechter os frontale, een aardings (referentie) elektrode dicht bij de

sutura lambdoidea en vier ankervijzen bilateraal in het os frontale en os pariëtale. Een bipolaire

diepte elektrode werd gekoppeld aan een microdialyse begeleidingscannula

(CMA/Microdialysis, Solna, Sweden) en beiden werden stereotactisch geïmplanteerd in de

linker hippocampus (coördinaten relatief ten opzichte van bregma: rostrocaudaal: -5.6 mm;

mediolateraal: -4.6 mm; dorsoventraal: -4.6 mm, zijnde 3 mm boven de uiteindelijke positie

Figuur 10: VNS elektrode rond n. vagus tijdens de operatie.

Figuur 11: posities elektroden weergegeven op de schedel van een rat.

30

van het membraan van de microdialyse probe). De uiteinden van de cuff-elektroden, epidurale

elektroden en hippocampale diepte elektrode werden geassembleerd in een hoofdcapsule dat op

schedel van de rat bevestigd werd met acryl cement. Om postoperatieve pijn te reduceren

werden een intradermale injectie van xylocaine 2% (0.1-0.2 ml) en een subcutane injectie van

0.05-0.1 mg/kg buprenorphine (Temgesic) toegediend en 2% xylocaïne gel werd rechtstreeks

op de incisiewondes aangebracht. De NSAID metacam (1mg/kg) werd dagelijks subcutaan

geïnjecteerd tot 3 dagen na de operatie. Postoperatief herstel werd bevorderd door het plaatsen

van de dieren onder een infraroodlamp. Correcte positionering van de microdialyseprobe in de

linker hippocampus en de cuff-elektrode rond de linker cervicale n.vagus werd post-mortem

geverifieerd.

2.5 Registratie van de laryngeale motor-evoked potentialen (LMEP)

Een week na de operatie werden de dieren geanestheseerd met isofluraan (inductie: 5%,

onderhouden: 1-2%) en werden VNS geïnduceerde LMEP’s gemeten. De ratten werden

geconnecteerd aan een externe stroomstimulator (CP, model 103, Cyberonics Inc., Houston, TX,

USA) en de n.vagus werd gestimuleerd met bifasiche ladingsgebalanceerde, vierkante pulsen

met de volgende microburststimulatieparameters: pulsbreedte = 250 µs, frequentie = 250 Hz,

intensiteit = 0.5 mA, arbeidscyclus = 60s ON/5min OFF, interburst interval = 0.5s, aantal

pulsen = 4 pulsen/burst. De LMEP registratie werd bekomen door gebruik van een haak

elektrode subcutaan geplaatst op het niveau van de laryngeale spieren. De LMEP-opnames

werden 500 maal versterkt en gefilterd met een band-pass filter van 3 Hz- 3 kHz. De data

werden gedigitaliseerd aan 100 kHz via een National Instruments Acquisition board (NI USB

6259) en opgeslagen op een desktopcomputer. Matlab (2007b, The Math-Works, Natick,

Massachusetts) werd gebruikt voor het opnemen van de LMEP signalen. De LMEPs werden

wekelijks gemeten tot een stabiel signaal verkregen werd.

2.6 EEG monitoring, VNS en intracerebrale microdialyse

Eens er stabiele LMEP-signalen werden gemeten, werden de dieren in neuromonitoring kooien

geplaatst. De hardware bestaat uit een PCB-bord (PCB, vooraf gesensitiseerd bord, enkelzijdig,

100x160mm, dikte 0.8mm, koper 35mm, RS onderdelen, 159-5773) waarop het elektrisch

circuit (getekend met CADSoft Eagle) geëtst wordt. Deze werd gesoldeerd op een

voorversterker (compenseert voor het verschil in impedantie tussen diepte en oppervlakte

elektroden.) De voorversterker connecteert via een wartelkabel (Plastics One, Roanoke, USA.)

31

naar een flatkabel (Plastics One, Roanoke, USA.) en vervolgens met een versterker die het

signaal 510X versterkt. Deze werd verbonden met een 9Vdc stroomvoorziening (NCP, model

103, Cyberonics Inc., Houston, TX, USA) en een NI-DAQ6259 data acquisition card (National

Instruments, Austin, TX, U.S.A). Aanzetten van de VNS gebeurt via dezelfde software voor

EEG-recording (Matlab applicatie 'Neuron'). De microdialyse cannula obturator werd

vervangen door een microdialyseprobe (CMA12, 3 mm membraan lengte, theoretische cut-off

20 kDa, CMA/Microdialysis, Solna, Sweden) die continu geperfuseerd werd met gemodifieerde

Ringer’s oplossing aan een debiet van 2 µl/min. Een 15u-20u interval tussen probe-implantatie

en start van het experiment werd gerespecteerd om de integriteit van de bloed-hersenbarrière,

de afwezigheid van reactieve gliose in het weefsel dat de microdialyseprobe omgeeft, en een

stabiel basale neurotransmitterconcentratie in het dialysaat te verzekeren. Die dieren konden

vrij bewegen in de kooien. Alle dieren werden onder gecontroleerde omgevingscondities

gehouden (cfr. Supra).

2.7 Protocol van het experiment

Tijdens elk experiment werd de microdialyseprobe continue geperfuseerd aan een debiet van 2

µl/min en hippocampale dialysaat stalen (40 µl) werden elke 20 min. gecollecteerd. De effecten

van microburst-VNS op pilocarpine-geïnduceerde limbische convulsies en hippocampale

noradrenaline niveaus werden bestudeerd. Het experimenteel protocol is weergegeven in figuur

12 en hieronder beschreven.

Placebo groep (n=4): de microdialyseprobe werd geperfuseerd met gemodifiëerde Ringer’s

oplossing (R) tijdens de eerste 15 collectieperiodes. Tijdens collectieperiode 16 en 17 werd 10

mM pilocarpine (P) toegevoegd aan de perfusievloeistof. Vervolgens werd opnieuw

geperfuseerd met gemodifiëerde Ringer’s oplossing en werden stalen afgenomen voor de vijf

volgende collectie periodes (collectie periode 18-22).

VNS groep (n=8): hetzelfde protocol als de placebogroep, behalve dat microburst-VNS

uitgevoerd werd vanaf collectieperiode 10 tot het einde van het experiment (zijnde collectie

periode 22). Microburst-VNS werd toegediend met de volgende stimulatieparameters: puls

breedte = 250 µs, intensiteit = 0.5 mA, arbeidscyclus = 60 s On/ 5 min OFF, interburstinterval

= 0.5 s, aantal pulsen = 4 pulsen per burst, burstfrequentie = 250 Hz.

32

De tijd tussen de start van de pilocarpineperfusie en het moment waarop de pilocarpine de

linker hippocampus bereikt bedroeg 6.6 min. Voor de start van de microdialyse experimenten

werd de impedantie tussen de twee n. vaguselektrodecontactpunten gemeten.

2.8 Aanvalsernst en EEG analyse

De ernst van de epileptische aanvallen werd geëvalueerd aan de hand van de aangepaste Racine

schaal. Deze is geadapteerd om gedragsveranderingen gezien in focale limbische epileptische

aanvalsmodellen te includeren. De verschillende epileptische ernst scores (EES) worden

weergegeven in tabel 2.

Tabel 2: Aangepaste Racine schaal voor epileptisch gedrag. EES = epileptische ernst score. EES Gedrag

0 Normale niet epileptische activiteit.

1 Orofaciale bewegingen, hyperactiviteit, wasgedrag, snuffelen, krabben, “wet dog” shakes.

2 Knikken van hoofd, staren, tremor.

3 Voorpoot clonus, voorpoot uitstrekken.

4 Rechtopstaan, salivatie, tonisch-clonische activiteit.

5 Omvallen, status epilepticus.

Figuur 12| Schematische voorstelling van het experimentele protocol. Elk vierkantje stelt 20 minuten perfusie van de microdialyseprobe met gemodifiëerde Ringer’s oplossing (R) voor of 10 mM pilocarpine (P) opgelost in gemodifiëerde Ringer’s oplossing. Microburst-VNS werd gestart vanaf collectieperiode 10 tot het einde van het experiment.

33

Voor elk van de zeven collectieperiodes na de start van pilocarpineperfusie (zijnde

collectieperiodes 16 tot 22) werd de hoogste epileptische ernst score (EES) behouden. De totale

epileptische ernst score (TEES) werd berekend als de som van de zeven behouden EESen en

gebruikt als een maatstaf voor de ernst van de aanvallen tijdens het experiment. Hippocampaal

en corticaal EEG werden bestudeerd om de latentie tot het voorkomen van de eerste

epileptiforme activiteit (spikes) en de totale duur van de epileptiforme activiteit vanaf de start

van de pilocarpineperfusie te bepalen (zijnde collectieperiodes 16 tot 22). Bij sommige dieren

ging de epileptische activiteit over in een status epilepticus en werden nog epileptiforme

ontladingen geobserveerd op het einde van collectieperiode 22. In dat geval werd EEG-opname

verdergezet tot de volgende dag. Indien dit gebeurde in de VNS-groep werd ook de

microburststimulatie verdergezet.

2.9 Microdialysaat-analyse

De dialysaat stalen (40µl) werden geanalyseerd voor noradrenaline. Om de noradrenaline te

stabiliseren werd 10 µl antioxidante oplossing toegevoegd (cfr. supra). Er werd een off-line

microbore vloeistofchromatografie assay (C8, 5µm, 100 X 1 mm) uitgevoerd gebaseerd op

ion-gepaarde omgekeerde fase chromatografie, gekoppeld aan een enkelvoudig-kanaal

elektrochemische detectie met een laag oxidatiepotentiaal (+450 mV vs. Ag/AgCl) (Decade,

Antec, Leiden, Nederland).

2.10 Histologie

De ratten werden opgeofferd m.b.v. een overdosis Nembutal (3 ml/kg, i.p.). Na een

antistollingsbehandeling met heparine (0.1 ml intracardiaal) werden de ratten transcardiaal

geperfuseerd met 4% paraformaldehyde(PFA) in fosfaatbuffer (0.1M NaHPO4, pH 7.4). De

hersenen werden verwijderd en overnacht gefixeerd in PFA. Cryoprotectie werd bekomen door

de hersenen opeenvolgend op 10%, 20% en tenslotte 30% glucose te leggen. Invriezen gebeurde

d.m.v. de hersenen even in met vloeibaar stikstof gekoeld isopentaan onder te dompelen en

vervolgens te bewaren op -80°C. 24u voor de cryosecties werden de hersenen verplaatst naar

-20°C bewaring. Cryosecties werden genomen op -18°C met een dikte van 80 µm.

34

2.11 Data-analyse

Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS 22 voor Windows. De data worden

uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie van het gemiddelde. Als significantie niveau

werd α=0.05 gebruikt. Het effect van microburst-VNS op pilocarpine geïnduceerde limbische

epileptische activiteit werd bepaald door de TEES te vergelijken (Mann-Whitney U test) en de

latentie tot en duur van de epileptiforme ontladingen op het hippocampaal EEG (Student’s

T-test voor vergelijking van onafhankelijke variabelen) tussen de Placebo en microburst VNS

groep. VNS-geïnduceerde veranderingen in de hippocampale noradrenalineconcentratie

werden geëvalueerd door de gemiddelde noradrenalineconcentratie tijdens de baseline

collectieperiodes 4 tot 9 te vergelijken met de gemiddelde noradrenalineconcentraties tijdens de

VNS-collectie periodes 10 tot 15 in de microburstgroep via een Student’s T-test voor

paarsgewijze vergelijking. Een Pearson correlatietest werd uitgevoerd om de correlatie tussen

de VNS-geïnduceerde stijgingen in hippocampale noradrenalineconcentraite en de epileptische

aanvalsparameters (ernst, latentie, duur) te analyseren.

3 Resultaten

3.1 Meten van de laryngeal muscle evoked potential (LMEP)

Microburst-VNS lokte reproduceerbare laryngeale spiercontracties uit, elektrofysiologisch

waarneembaar als een opwaartse piek 2 ms tot 3 ms na de start van elke stimulatiepuls, bij 13

van de 20 dieren. Deze piek werd reeds eerder geïdentificeerd als de LMEP (Figuur 13 A, B).

Een stabiele LMEP kon gemeten worden één week na de operatie bij 7/13 dieren. Bij de overige

dieren was een herstelperiode van 2 weken (5/13 dieren) of 3 weken (1/13 dieren) nodig na de

operatie. Enkel de dieren met een stabiele LMEP werden meegenomen in het microdialyse

experiment. Een dier met een stabiele LMEP werd geëxcludeerd wegens teveel storing op het

hippocampaal en scalp EEG.

35

Figuur 13 A; 4 microbursts met LMEP's. B; 1 microburst met 4 pulsen, 1 LMEP zichtbaar na elke puls.

3.2 Effect van microburst-VNS op limbische epileptische aanvallen en

hippocampale noradrenaline concentratie

Het bereik van impedantie tussen de twee n. vaguselektrodecontactpunten viel binnen de

normale waarden (minder dan 10kΩ) bij alle dieren (1-7 kΩ). Bij de placebo groep lokte een 40

minuten durende intrahippocampale perfusie van 10 mM pilocarpine opgelost in gemodifieerde

Ringer’s oplossing epileptische activiteit uit die toeneemt in ernst (tabel 3). Bij twee dieren in

de placebo groep (50%) evolueerden de aanvallen naar een status epilepticus, terwijl in de

microburst VNS groep drie dieren (37.5%) een status epilepticus ondergingen. Bij zowel de

placebo- als de VNS behandelde groep waren continue epileptische spikes en intermitterende

ritmische epileptiforme ontladingen zichtbaar op het hippocampaal EEG, dat occasioneel

generaliseerde naar de cortex. Geen van de placebo- of VNS-behandelde dieren zijn gestorven.

36

Tabel 3 Resultaten EES (collectieperiode 16-22), TEES, latentie en duur epileptische activiteit. PLACEBO EES TEES Latentie (min) Duur (min)

(n=4) P16 P17 R18 R19 R20 R21 R22

1 0 2 2 4 4 4 5 21 10 1069

2 2 2 5 2 4 2 1 18 11 190

3 1 2 4 4 4 5 5 25 7 1103

4 0 2 4 2 2 1 1 12 23 91

mVNS EES TEES Latentie (min) Duur (min)

(n=8) P16 P17 R18 R19 R20 R21 R22

1 1 2 2 2 4 4 2 17 11 149

2 1 2 2 2 2 1 1 11 11 190

3 1 2 4 4 4 5 5 25 8 1102

4 1 2 2 1 1 1 0 8 9 99

5 1 2 2 2 4 1 1 13 10 136

6 1 2 4 4 4 4 5 24 9 1074

7 1 2 4 4 5 5 5 26 8 1075

8 1 2 2 2 1 1 0 9 9 97

Tabel 4. Invloed microburst VNS op hippocampaal NE. nM = nanomolair. mVNS NE Basisconcentratie (nM) NE na VNS (nM) NE stijging (%)

(n=8)

1 0,325 0,284 -13

2 0,338 0,408 21

3 0,304 0,326 7

4 0,350 0,356 2

5 0,365 0,319 -13

6 0,272 0,317 17

7 0,443 0,419 -5

8 0,233 0,270 16

Tabel 5. Samenvatting resultaten. behandeling Aanvalsernst

(TEES)

Aanvalslatentie

(min)

Aanvalsduur

(min)

Noradrenaline

stijging (%)

placebo 19 ± 3 13 ± 4 613 ± 274 n.v.t.

mVNS 17 ± 3 9 ± 1 490 ± 174 4 ± 9

De resultaten van de microdialyse voor en na microburst VNS worden weergegeven in tabel 4.

De limbische epileptische activiteitskarakteristieken en het percentage VNS-geïnduceerde

noradrenaline stijging zijn weergegeven in tabel 5. De aanvalsernst in de VNS-behandelde

37

groep (TSSS = 17 ± 3) was niet significant verschillend van de placebobehandelde groep (TSSS

= 19 ± 3) (p > 0.05) (figuur 14). De latentie tussen de start van pilocarpineperfusie en het

voorkomen van de eerste epileptiforme activiteit op het hippocampaal EEG was gelijkaardig in

de VNS-behandelde groep (9 ± 1 min) en de placebogroep (13 ± 4 min) (p > 0.05). Ook de totale

aanvalsduur verschilde niet significant tussen de VNS behandelde (490 ±174 min) en de

placebogroep (613 ± 274 min) (p>0.05). In de microburst VNS groep was de gemiddelde

noradrenaline basisconcentratie voor de stimulatie (0.329 ± 0.045 nM) niet significant groter

dan de gemiddelde noradrenalineconcentratie tijdens en na de microburst VNS behandeling (

0.338 ± 0.019 nM) (4 ± 9 % VNS geïnduceerde stijging in noradrenaline concentratie) (p >

0.05). Er werd geen correlatie gevonden tussen de VNS-geïnduceerde

noradrenalineverandering in de dialysaten (data per rat: zie bijlage II) en de parameters van de

limbische epileptische aanvalsactiviteit (figuur 15).

Figuur 14. Van linksboven naar rechtsonder: grafische weergave van de alteratie van de noradrenalineconcentratie (nM) na microburst VNS en de vergelijking van aanvalsernst (TEES), aanvalsduur (min) en latentie (min) tussen placebo en microburst VNS.

38

Figuur 15: Verhouding tussen noradrenalinestijging(%) enerzijds, en aanvalsernst (TEES), latentie (min) of duur (min) anderzijds.

3.3 Post mortem verificatie microdialyse probe

Bij alle dieren werden de elektroden op de correcte hippocampale positie teruggevonden.

Voorbeeld zie figuur 16.

Figuur 16: A. Hersencoupes met elektrodenlaesie in de linker hippocampus. B. microscopisch vergroot beeld van omkaderde regio in A.

39

4 Discussie

Deze studie vond geen correlatie tussen microburst-VNS en een vermindering in de

epileptische activiteit. Ook is er geen correlatie tussen de microburst-VNS en de

noradrenalineconcentratie in de hippocampus te vinden in het focale pilocarpinemodel.

Recent zijn anti-epileptische effecten van VNS (30 Hz, 1 mA, 250 µs, 7s ON/ 18s OFF) en een

significante VNS-geïnduceerde stijging (69%) van de extracellulaire hippocampale

noradrenalineconcentratie gevonden in het focale pilocarpinemodel (36). Dit in contrast tot

onze studie waarbij microburst-VNS (250 Hz, 0.5 mA, 250 µs, 60s ON/ 5min OFF, 4 pulsen/

burst, 0.5s interburst interval) de ontwikkeling van pilocarpine-geïnduceerde limbische

aanvallen niet kon tegenhouden noch een significante stijging in extracellulaire

noradrenalineconcentratie kon veroorzaken. Een mogelijke verklaring voor de discrepantie

tussen deze twee studies kan gevonden worden in het feit dat Raedt et al. een intensiever

stimulatieprotocol hanteerden, resulterend in een toediening van 30 240 pulsen aan de n. vagus

per uur in vergelijking met 4 651 pulsen in onze studie. In onze studie werd gekozen voor een

klinisch relevante arbeidscyclus (60 s ON/ 5min OFF) tegenover het rapid cycling paradigma

gebruikt door Raedt et al. (7s ON/ 18s OFF) aangezien het rapid cycling paradigma enkel

gebruikt wordt als laatste optie bij patiënten waarbij de klinisch relevante arbeidscyclus geen

adequate aanvalsreductie veroorzaakte. Ook werd bij onze studie een lagere intensiteit gebruikt

(0.5 mA i.p.v. 1 mA), dit werd echter reeds bewezen als voldoende voor een optimale activatie

voor de n.vagus en het centrale anti-epileptische mechanisme van VNS (39).

Echter ook Roosevelt et al. (10) vonden dat een behandeling van één uur VNS met standaard

parameters (20 Hz, 0.5 mA, 500 µs, 30s ON/10 min OFF) voldoende was voor een significante

stijging (23%) van de extracellulaire hippocampale noradrenalineconcentratie te bekomen. In

het stimulatieprotocol van Roosevelt et al. werd een totaal van 3 600 pulsen toegediend aan de

n. vagus, wat lager is dan de 4 651 pulsen per uur in onze studie. Hierop gebaseerd lijkt het

gebruikte microburst-VNS paradigma minder efficiënt te zijn in het bekomen van een stijging

van de extracellulaire hippocampale noradrenalineconcentraties in vergelijking met

standaard-VNS.

40

Slechts één studie evalueerde reeds het anti-epileptische potentieel van microburst-VNS in het

kindling model (40). In dit model wordt de amygdala elektrisch gestimuleerd om zo

epileptische aanvallen uit te lokken. Een therapie die de drempel voor het uitlokken van deze

aanvallen verhoogt heeft anti-epileptische eigenschappen. In de studie van Alexander et al.

verhinderde continue microburst-VNS voor 1 uur of 1 week (100 Hz, 0.5 mA, 250 µs, 4 pulsen

per burst met een interburstinterval van 3s) de daling van de amygdala kindling drempel zoals

gezien in de placebostimulatie. Dit positieve effect staat in contrast met onze studie ondanks

een gelijkaardig aantal pulsen toegediend aan de n. vagus (4 736 pulsen/uur t.o.v. 4651

pulsen/uur). Dit kan gelegen zijn aan het feit dat Alexander et al. een continu stimulatieprotocol

gebruikten terwijl in ons model de aanvallen ook voorkwamen in de OFF-periode van de VNS.

Zo reduceerde standaard VNS ook de interictale spike frequentie met 33% in een

penicilline/PTZ model, een effect dat het grootste was in een continu stimulatieprotocol en

verminderde op een tijdsafhankelijke manier na de stimulatie (41). Ook gebruikten Alexander

et al. geanestheseerde ratten, wat een grote invloed heeft op de LC. Enerzijds worden

verschillende fysiologische functies die toegeschreven zijn aan de LC onderdrukt tijdens

anesthesie, zoals de stress respons, nociceptie, geheugen en aandacht. Dierexperimenten tonen

aan dat anesthetica die de GABAA-receptoren activeren de noradrenerge neuronen inhiberen

(42). Anderzijds werd recentelijk aangetoond dat noradrenaline een belangrijke rol speelt in

anesthesie mechanismen en dat deze kritiek gereguleerd wordt door de LC (43). Gebruik

makend van een genetische techniek (DREADD) om selectieve LC-neuronactivatie te bekomen

vond Vazey et al. dat LC-activatie voldoende was om de EEG-parameters specifiek voor

anesthesie te veranderen en het herstel van waken te versnellen. Ook inductie van anesthesie

wordt significant vertraagd door LC-NE activatie. Deze wisselwerking tussen anesthesie en LC

activatie impliceert dat de relevantie van de bevindingen afkomstig van geanestheseerde ratten

van Alexander et al. ten opzichte van wakkere vrij bewegende ratten twijfelachtig is.

Een tweede, zeer recente studie (29) onderzocht het effect van acute microburst VNS (300 Hz,

variabele mA ( hoogste stroom die geen hoest uitlokte), 500 µs, 3 pulsen per burst met een

interburstinterval van 0.4s, 7s ON/18s OFF) en standaard VNS op de regionale cerebrale

bevloeiing bij gezonde honden. Hierbij werd een hypoperfusie gevonden in de linker frontale en

rechter partiëtale cortex (die niet teruggevonden werd bij de standaard VNS), echter geen van

beide stimulaties kon een significante alteratie van de thalamische en hippocampale perfusie

aantonen, hoewel deze de meest voorkomende regio’s zijn waarbij alteratie gevonden wordt

41

door VNS in SPECT en PET studies. De gevonden betrokkenheid van de corticale regio’s werd

ook reeds gedetecteerd in verschillende humane studies die het effect van acute VNS op de

regionale cerebrale bevloeiing van patiënten met epilepsie of depressie bestudeerden. Of deze

bevloeiingsalteraties gerelateerd zijn aan het anti-epileptische werkingsmechanisme van VNS

kon met deze studie niet bevestigd worden, maar het lijkt plausibel dat onderdrukking van de

regionale cerebrale bevloeiing, en indirect de neuronale activiteit in bepaalde corticale regio’s,

een aanvalsonderdrukkend effect kan hebben.

De meest plausibele verklaring voor het gebrek aan anti-epileptische of noradrenerge effecten

in onze studie kan gevonden worden op het niveau van de n.vagus-NTS synaps. De synaps

tussen de vagale afferente vezels en de NTS-neuronen vertonen een grote mate aan plasticiteit

op diverse stimuli (44). Een frequentie-afhankelijke depressie van de n.vagus-NTS synaps werd

reeds beschreven in zowel in vitro als in vivo experimenten waarbij vagale afferente stimulatie

met een frequentie van 1 Hz een excitatoire post-synaptische respons uitlokte in de NTS, terwijl

vagale afferente stimulatie met een frequentie van 20 Hz een synaptische depressie uitlokte

(13-16, 45-47). Zo zal een stijging in de frequentie van n.vagus afferente stimulatie leiden tot

een reductie van de NTS-output en zo een desinhibitie en dus versterking van de

LC-noradrenerge activiteit. Dit is een mogelijke verklaring waarom Roosevelt et al. en Raedt et

al. een significante VNS-geïnduceerde hippocampale noradrenalineconcentratie stijging

waarnamen en Alexander et al. een VNS-geïnduceerd aanvalsaborterend effect zagen in het

amygdala kindling model (10, 36). Echter, al zij het veel minder beschreven, ook facilitatie van

de n.vagus-NTS synaps kan voorkomen. Zo toonde Mifflin et al.(48) aan dat in geanestheseerde

ratten twee minuten stimulatie van de n.vagus aan een frequentie van 100-300 Hz leidt tot een

verhoging van de NTS output. Het is dus mogelijk dat ons hoogfrequente (250 Hz)

microburstprotocol geen depressie van de n.vagus-NTS synaps uitlokte maar eerder een

facilitatie. Verder onderzoek is nodig om de invloed van de VNS-parameters op de complexe

plasticiteit van de n.vagus-NTS synaps te begrijpen. Duidelijk is echter dat enkel het aantal

pulsen toegediend aan de n.vagus niet altijd alle geobserveerde effecten kan verklaren.

Gezien de complexiteit van het n.vagus-NTS-LC-HC circuit het moeilijk maakt een directe link

te vinden tussen de microburst stimulatie en de hippocampale NE-stijging, zou men kunnen

opteren dit circuit op te splitsen. Standaard VNS induceert reeds na 1 uur stimulatie een

significante stijging van de vuurfrequentie van de neuronen in de LC (49). Men kan dus in vivo

42

diverse parameterinstellingen (zoals een frequentie in het bereik 100-250 Hz) van microburst

VNS testen via een vergelijking van de basale vuursnelheid van LC neuronen en de

vuursnelheid na stimulatie. Gezien de VNS stimulatie kan leiden tot een interferentie met de

elektrode in de LC voor het meten van de vuursnelheid, is het niet mogelijk een simultane VNS

stimulatie en LC registratie uit te voeren, echter de stijging in LC vuursnelheid blijft tijdelijk

behouden ondanks de afwezigheid van stimulatie. Via deze methode kan men eerst het effect

van een optimalisatie van de microburst parameters op de LC vuursnelheid bepalen in gezonde

dieren, vervolgens kan men deze parameters bestuderen en verifiëren in experimenten op acute

of chronische epileptische modellen.

Een mogelijke optie om de efficaciteit van microburst-VNS te verbeteren zou het randomiseren

van de interburstintervallen kunnen zijn. Zo werd recentelijk aangetoond dat periodische

stimulatie van de amygdala de pentyleentetrazoldrempel voor voorpootclonus verlaagt, terwijl

gerandomiseerde interpulsintervalstimulatie de drempel voor voorpootclonus en

gegeneraliseerde tonisch-clonische convulsies verhoogt. Hierbij werd gehypothetiseerd dat

periodische stimulatie de voorpootclonus faciliteert door te resoneren met de epileptogene

circuits in het limbische systeem, terwijl de gerandomiseerde intervalstimulatie de

voorpootcloni en gegeneraliseerde tonisch-clonische aanvallen reduceert door de epileptische

neurale netwerken in het voorhersenen-middenhersenen-achterhersenencircuit te

desynchroniseren (50). Hoewel men in deze studie een rechtstreekse interferentie op het

epileptische netwerk onderzocht, is het plausibel deze lijn door te trekken naar microburst VNS.

Een meer gerandomiseerde stimulatie van de LC kan leiden tot een gerandomiseerde invloed op

de HC, wat resonantie met het epileptische netwerk zou tegengaan.

Dat een optimalisatie van de efficaciteit complex is vindt men ook terug in het feit dat

astrocytaire regulatie van de vagale nuclei de efficaciteit van VNS beïnvloeden. Zo werd recent

astrocytaire activatie aangetoond in de NST indien afferente stimulatie van de n.vagus werd

toegepast. Deze stimulatie resulteerde in een stijging van intracellulaire calciumconcentraties

bij zowel astrocyten als neuronen in hersenstam slices. Het effect op de astrocyten bleef

behouden na NMDA- en metabotrope glutamaatreceptor antagonisme, maar werd geblokeerd

door AMPA-receptor antagonisme. De astrocytaire activatie was dus afkomstig van

extracellularie calcium influx doorheen AMPA-receptoren. Hieruit werd geconcludeerd dat de

NST-astrocyten actief deelnemen aan de regulatie van de vagale activiteit. Dit ondersteunt ook

43

eerder werk dat concludeerde dat neuronen in de NST gereguleerd worden via astrocytaire

glutamaterge signalering onder pathologische en potentieel fysiologische condities (41). Uit

onderzoek op astrocyten in de CA1 regio van hippocampale slices blijkt dat de efficiëntie en

snelheid waarmee de astrocytaire transporters glutamaat verwijderen uit de extrasynaptische

ruimte niet aangetast wordt door hoogfrequente stimulatie van 100 Hz (51). Of dit mechanisme

echter stand houdt bij een stimulatiefrequentie van 250 Hz in de vagale-NTS synaps is niet

geweten.

Zoals hoger beschreven is er een grote inter-patiënt variabiliteit, met als één van de mogelijke

oorzaken het verschil in activatie van de n.vagus als respons op VNS. Om deze mogelijke

oorzaak van variabiliteit uit te sluiten werden de microdialyse-experimenten enkel uitgevoerd

indien een stabiele LMEP (d.i. waarbij de amplitude van de elektrofysiologische respons niet

significant verschilde in twee opeenvolgende dagelijkse metingen) gemeten kon worden, en

werden elektrodebreuken en stimulator defecten uitgesloten door het meten van impedantie.

Ook werd een correcte positionering van de cuff-elektrode rond de n.vagus post-mortem

geverifieerd. Zoals verwacht was in een deel van de dieren pas een VNS-geïnduceerde LMEP

zichtbaar na een vertraging van enkele weken. Gezien de LMEP echter het resultaat is van

efferente stimulatie en VNS gefocust is op stimulatie van de afferente vezels blijft de LMEP een

indirecte surrogaatmerker. De LMEP kan dus enkel gebruikt worden voor verificatie van het

herstel van de n.vagus na implantatie en niet als een richtlijn voor individuele VNS-parameter

titratie. Een mogelijke oplossing hiervoor zou het implementeren van het meten van

samengestelde (compound) actiepotentialen (CAP) van de afferente vagale vezels kunnen zijn

(37, 38). Het postoperatief meten van CAP’s kan zowel onderzoekers als clinici helpen de

individuele optimale intensiteit te bepalen waarbij er volledige activatie van de afferente vagale

vezels plaatsvindt. De laatste jaren is de aandacht gegroeid voor het ontwikkelen van

VNS-apparaten met een elektrode voor zowel stimulatie als opname. Een feasibility-studie

heeft aangetoond dat het mogelijk is afferente CAP’s te meten door gebruik te maken van zo

een apparaat (52).

Op experimenteel niveau kan het LMEP-protocol nog geoptimaliseerd worden. Gezien in deze

studie stimulatie-input niet getitreerd werd tegenover activatie-output kan suboptimale

zenuwactivatie niet uitgesloten worden. Chronische metingen en analyse van de evolutie van de

44

LMEP metingen zouden hiervoor kunnen leiden tot optimale stimulatieparameters. Optimaal

zouden LMEP’s gemeten moeten worden op chronische basis in wakkere dieren.

Naast de presynaptische metabotrope glutamaatreceporen spelen nog verschillende frequentie

afhankelijke mechanismen mee op het niveau van de NTS-synaps om de sensorische afferente

signaaltransmissie te reguleren, waaronder AMPA-receptordesensitisatie, depletie van

synaptische blaasjes op de actieve zones, presynaptische calciumstroominactivatie of activatie

van inhibitoire interneuronen (17). Hoe hoogfrequente microburststimulatie inspeelt op deze

mechanismen is niet gekend. In vitro studies waarbij de vagale-NTS synaps gemodelleerd

wordt en de frequentie van microburst getitreerd wordt met als outcome parameter de depressie

van deze synaps zouden kunnen helpen het vraagstuk op te lossen.

Een mogelijkheid om genetische variaties in de n.vagus–NTS synaps (prevalentie van

metabotrope glutamaatreceptoren op zowel pre als postsynaptische sites, contributie van

specifieke subtype metabotrope glutamaatreceptoren enz.(17)) uit te schakelen als

beïnvloedende factor voor microburstefficaciteit is in hetzelfde dier zowel de standaard-VNS

modaliteit als de microburst-VNS modaliteit toe te dienen met een wash-outperiode tussen

beide stimulatieprotocols. Zo schakelt men de intra-individuele variabiliteit uit en bestudeert

men enkel het zuivere efficiëntieverschil tussen beide modaliteiten. De duur van deze

wash-outperiode zou eerst moeten bepaald worden om geen overlap van de alteraties van de

hippocampale noradrenalineconcentratie door beide modaliteiten als confounding factor te

ervaren. Op deze manier kan men ook bestuderen of er een verschil is in responder rate tussen

standaard en microburst VNS.

Ook kan de in vivo basisconcentratie en het stijgingspotentieel van hippocampaal noradrenaline

verschillen tussen de generaties ratten door genetische variaties. Om deze confounder uit te

sluiten en zo het vergelijken van verschillende studies te vergemakkelijken kan men na het

microdialyse-experiment en na een washout-periode waarbij de VNS gerelateerde NE stijging

terug naar baseline is geëvolueerd, een specifieke noradrenaline-heropnameremmer voor zoals

reboxetine (53) toedienen. Op deze manier kan men de VNS geïnduceerde

noradrenalinestijging bestuderen in het licht van de farmacologisch geïnduceerde

noradrenalinestijging zodat voor deze parameter gestandaardiseerd kan worden en de relatieve

eerder dan de absolute VNS geïnduceerde noradrenalinestijging kan gemeten worden.

45

Als laatste moet ook de potentiele invloed van NE-cotransmitters op de modulerende rol van

LC-neuronen op epileptische aanvallen in acht genomen worden. Zo synthetiseren

LC-neuronen een variëteit van peptiden zoals enkephaline, neurotensine, vaspopressine,

somtatostatine, neuropeptide Y en galanine (gal). Enkele van deze NE-contransmitters hebben

duidelijke anticonvulsieve effecten. Gal is de meest efficiënte in het tegengaan van SE en is

gecolokaliseerd met NE in meer dan 80% van de LC-neuronen. Intrahippocampale en i.c.v.

toediening van gal vermindert epileptische aanvallen geïnduceerd door zowel picrotoxine als

perforante pad stimulatie. NPY-concentratie is verhoogd in de gebieden gerekruteerd door

limbische aanvallen en heeft anti-epileptische eigenschappen (54). In hoeverre deze

cotransmitters bijdragen aan het anticonvulsieve effect van NE-LC axonen en of ze ook

gerekruteerd worden tijdens VNS moet nog onderzocht worden.

Een mogelijk hiaat van deze studie is de beperkte temporele resolutie van de microdialyse

techniek. Robuuste stijgingingen in noradrenaline kunnen gemeten worden, maar het is

moeilijk te filteren voor acute noradrenalinestijgingen gerelateerd aan externe factoren als een

dialysaat overeenstemt met een meting van twintig minuten. Acute stress geïnduceerd door

onder meer interactie met de onderzoeker kan een stressrespons uitlokken. Deze stressrespons

bestaat uit verschillende neurobiologische mechanismen, waaronder activatie van de LC en de

hieraan gerelateerde hippocampale noradrenalinestijging. Ook wordt de

hypothalamo-hypofysaire-adrenocorticale (HPA) as geactiveerd waarbij CRF (corticotropine

releasing factor) vrijgesteld wordt wat leidt tot hypofysaire secretie van adrenocorticotroop

hormoon (ACTH) en uiteindelijk vrijstelling van glucocorticoiden zoals cortisol in de mens en

corticosterone in knaagdieren (55). Dit uit zich in een signaaloverdracht van de hypothalamus

naar de adrenale medula wat leidt tot vrijstelling van noradrenaline, die ook de hersenen bereikt.

i.c.v. toediening van CRF resulteert in een stijging van de activiteit van de noradrenerge

neuronen in de LC, en hieruit volgend een stijging in hippocampaal noradrenaline (56). Het

meten van hippocampaal CRF/corticosterone tijdens het experiment zou een oplossing kunnen

zijn voor het differentiëren tussen noradrenalinestijging gerelateerd aan VNS enerzijds of aan

externe stressoren anderzijds.

Een oplossing voor het brede tijdsinterval van de microdialysetechniek is het gebruik van in

vivo voltammetrie voor het meten van hippocampaal noradrenaline (56). Via deze techniek

wordt gebruik gemaakt van het oxidatiepotentiaal van noradrenaline (+0.55V) tegenover een

46

referentie elektrode om de concentratie te meten met een resolutie in het bereik van seconden.

Specificiteit voor noradrenaline kan bekomen worden door verschillende parameters,

waaronder bijvoorbeeld het coaten van de elektrode met Nafion wat leidt tot een

selectiviteitsratio van 250:1 ten opzichte van ascorbinezuur. Deze seconden resolutie zou de

mogelijkheid voor het correleren van video beelden (interactie met onderzoeker, schrikreflexen,

enz..) en de acute noradrenalinestijging bieden, waardoor deze kunnen gefilterd worden en

enkel het zuivere effect van VNS op hippocampaal noradrenaline kan bestudeerd worden.

Hoewel het moeilijk is het amperometrisch signaal voor noradrenaline te onderscheiden van dat

van dopamine, blijk de contributie van dopampine aan het noradrenerg signaal niet meer dan

10% te kunnen bedragen, gebaseerd op hippocampale metingen in de muis (57). Specificiteit

kan verder bekomen worden aan de hand van farmacologische verificatie (bijvoorbeeld door

gebruik van de alpha2-AR antagonist idazoxan).

Als laatste kan het geslacht van de onderzoeker (in dit geval mannelijk) een belangrijke

confounder zijn in deze studie alsook in het vergelijken met andere studies. Zo is namelijk zeer

recent aangetoond dat het blootstellen van ratten (en muizen) aan mannelijke maar niet aan

vrouwelijke onderzoekers leidt tot een verhoogde pijn-inhibitie. Mannelijk-gerelateerde stimuli

(alsook kleding gedragen door een man, nestmateriaal van niet familiare dieren en humane

mannelijke okselsecreten) induceren een robuuste fysiologische stressrespons die leidt tot

stress-geïnduceerde analgesie. Gezien de belangrijke invloed van stress op hippocampaal

noradrenaline kan dit een grote confounder zijn waarvoor in de toekomst gecontroleerd dient te

worden. Zo blijkt de simultane aanwezigheid van een vrouwelijke onderzoekster deze

stressrespons te attenueren (58). De resultaten van deze studie moeten echter met

voorzichtigheid benaderd worden, gezien deze nog niet gerepliceerd zijn door andere

onderzoeksgroepen.

5 Algemeen besluit

We kunnen concluderen dat in het focale pilocarpinemodel voor MTLE microburststimulatie

van de n.vagus niet leidt tot een anti-epileptisch effect. Ook was geen microburst VNS

gerelateerde significante hippocampale noradrenalinestijging te bemerken.

Verder onderzoek is nodig om de frequentieafhankelijke depressie van de n.vagus-NTS synaps

en de invloed van microburst-VNS hierop in kaart te brengen.

47

6 Referenties

1. Malmgren K, Thom M. Hippocampal sclerosis--origins and imaging. Epilepsia. 2012 Sep;53 Suppl 4:19-33. PubMed PMID: 22946718. Epub 2012/09/14. eng. 2. Fisher RS, van Emde Boas W, Blume W, Elger C, Genton P, Lee P, et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 2005 Apr;46(4):470-2. PubMed PMID: 15816939. Epub 2005/04/09. eng. 3. Fisher RS, Acevedo C, Arzimanoglou A, Bogacz A, Cross JH, Elger CE, et al. ILAE Official Report: A practical clinical definition of epilepsy. Epilepsia. 2014;55(4):475-82. 4. Ramani R. Vagus nerve stimulation therapy for seizures. Journal of neurosurgical anesthesiology. 2008 Jan;20(1):29-35. PubMed PMID: 18157022. Epub 2007/12/25. eng. 5. Chang BS, Lowenstein DH. Epilepsy. New England Journal of Medicine. 2003;349(13):1257-66. PubMed PMID: 14507951. 6. Thurman DJ, Beghi E, Begley CE, Berg AT, Buchhalter JR, Ding D, et al. Standards for epidemiologic studies and surveillance of epilepsy. Epilepsia. 2011 Sep;52 Suppl 7:2-26. PubMed PMID: 21899536. Epub 2011/10/18. eng. 7. Browne TR, Holmes GL. Handbook of Epilepsy: Lippincott Williams & Wilkins; 2008. 8. Ruffoli R, Giorgi FS, Pizzanelli C, Murri L, Paparelli A, Fornai F. The chemical neuroanatomy of vagus nerve stimulation. Journal of Chemical Neuroanatomy. 2011 Dec;42(4):288-96. PubMed PMID: WOS:000297830400009. 9. Boon P, Raedt R, de Herdt V, Wyckhuys T, Vonck K. Electrical stimulation for the treatment of epilepsy. Neurotherapeutics. 2009 Apr;6(2):218-27. PubMed PMID: 19332313. Epub 2009/04/01. eng. 10. Roosevelt RW, Smith DC, Clough RW, Jensen RA, Browning RA. Increased extracellular concentrations of norepinephrine in cortex and hippocampus following vagus nerve stimulation in the rat. Brain Res. 2006 Nov 13;1119:124-32. PubMed PMID: WOS:000242309600013. 11. Groves DA, Brown VJ. Vagal nerve stimulation: a review of its applications and potential mechanisms that mediate its clinical effects. Neuroscience &amp; Biobehavioral Reviews. 2005 5//;29(3):493-500. 12. Heck C, Helmers SL, DeGiorgio CM. Vagus nerve stimulation therapy, epilepsy, and device parameters: scientific basis and recommendations for use. Neurology. 2002 Sep 24;59(6 Suppl 4):S31-7. PubMed PMID: 12270966. Epub 2002/09/25. eng. 13. Kang YH, Sun B, Park YS, Park CS, Jin YH. GABA(A) and GABA(B) receptors have opposite effects on synaptic glutamate release on the nucleus tractus solitarii neurons. Neuroscience. 2012 May 3;209:39-46. PubMed PMID: 22410341. Epub 2012/03/14. eng. 14. Bailey TW, Hermes SM, Andresen MC, Aicher SA. Cranial visceral afferent pathways through the nucleus of the solitary tract to caudal ventrolateral medulla or paraventricular hypothalamus: target-specific synaptic reliability and convergence patterns. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2006 Nov 15;26(46):11893-902. PubMed PMID: 17108163. Epub 2006/11/17. eng. 15. Fernandes LG, Jin YH, Andresen MC. Heterosynaptic crosstalk: GABA-glutamate metabotropic receptors interactively control glutamate release in solitary tract nucleus. Neuroscience. 2011 Feb 3;174:1-9. PubMed PMID: 21129447. Pubmed Central PMCID: PMC3020236. Epub 2010/12/07. eng. 16. Jin YH, Bailey TW, Andresen MC. Cranial afferent glutamate heterosynaptically modulates GABA release onto second-order neurons via distinctly segregated metabotropic glutamate receptors. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2004 Oct 20;24(42):9332-40. PubMed PMID: 15496669. Epub 2004/10/22. eng. 17. Liu Z, Chen CY, Bonham AC. Metabotropic glutamate receptors depress vagal and aortic baroreceptor signal transmission in the NTS. The American journal of physiology. 1998 Nov;275(5 Pt 2):H1682-94. PubMed PMID: 9815076. Epub 1998/11/14. eng.

48

18. Glaum SR, Miller RJ. Metabotropic glutamate receptors depress afferent excitatory transmission in the rat nucleus tractus solitarii. J Neurophysiol. 1993 Dec;70(6):2669-72. PubMed PMID: 7907134. Epub 1993/12/01. eng. 19. Bailey TW, Appleyard SM, Jin YH, Andresen MC. Organization and properties of GABAergic neurons in solitary tract nucleus (NTS). J Neurophysiol. 2008 Apr;99(4):1712-22. PubMed PMID: 18272881. Epub 2008/02/15. eng. 20. Chandley MJ, Ordway GA. Noradrenergic Dysfunction in Depression and Suicide The Neurobiological Basis of Suicide. Dwivedi Y, editor. Boca Raton FL: Llc.; 2012. 21. Aston-Jones G, Zhu Y, Card JP. Numerous GABAergic afferents to locus ceruleus in the pericerulear dendritic zone: possible interneuronal pool. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2004 Mar 3;24(9):2313-21. PubMed PMID: 14999082. Epub 2004/03/06. eng. 22. Van Bockstaele EJ, Peoples J, Telegan P. Efferent projections of the nucleus of the solitary tract to peri-locus coeruleus dendrites in rat brain: evidence for a monosynaptic pathway. The Journal of comparative neurology. 1999 Sep 27;412(3):410-28. PubMed PMID: 10441230. Epub 1999/08/11. eng. 23. Hazra A, Rosenbaum R, Bodmann B, Cao S, Josic K, Ziburkus J. beta-Adrenergic modulation of spontaneous spatiotemporal activity patterns and synchrony in hyperexcitable hippocampal circuits. Journal of Neurophysiology. 2012 Jul;108(2):658-71. PubMed PMID: WOS:000306416400023. 24. Jurgens CW, Boese SJ, King JD, Pyle SJ, Porter JE, Doze VA. Adrenergic receptor modulation of hippocampal CA3 network activity. Epilepsy Res. 2005 Aug-Sep;66(1-3):117-28. PubMed PMID: 16140503. Epub 2005/09/06. eng. 25. Castoro MA, Yoo PB, Hincapie JG, Hamann JJ, Ruble SB, Wolf PD, et al. Excitation properties of the right cervical vagus nerve in adult dogs. Experimental Neurology. 2011 Jan;227(1):62-8. PubMed PMID: WOS:000286367800010. 26. Craig AD. Microburst electrical stimulation of cranial nerves for the treatment of medical conditions. Google Patents; 2007. 27. Craig AD. Vagus nerve stimulation method. Google Patents; 2012. 28. Ito SI, Craig AD. Vagal-evoked activity in the parafascicular nucleus of the primate thalamus. Journal of Neurophysiology. 2005 Oct;94(4):2976-82. PubMed PMID: WOS:000231834200060. 29. Martlé V, Peremans K, Raedt R, Vermeire S, Vonck K, Boon P, et al. Regional brain perfusion changes during standard and microburst vagus nerve stimulation in dogs. Epilepsy Research. 2014 5//;108(4):616-22. 30. Curia G, Longo D, Biagini G, Jones RSG, Avoli M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 2008 Jul 30;172(2):143-57. PubMed PMID: WOS:000258200300001. 31. Smolders I, Khan GM, Manil J, Ebinger G, Michotte Y. NMDA receptor-mediated pilocarpine-induced seizures: characterization in freely moving rats by microdialysis. Br J Pharmacol. 1997 Jul;121(6):1171-9. PubMed PMID: 9249254. Pubmed Central PMCID: PMC1564791. Epub 1997/07/01. eng. 32. Meurs A, Clinckers R, Ebinger G, Michotte Y, Smolders I. Substantia nigra is an anticonvulsant site of action of topiramate in the focal pilocarpine model of limbic seizures. Epilepsia. 2006 Sep;47(9):1519-35. PubMed PMID: 16981869. Epub 2006/09/20. eng. 33. Millan MH, Chapman AG, Meldrum BS. Extracellular amino acid levels in hippocampus during pilocarpine-induced seizures. Epilepsy Res. 1993 Feb;14(2):139-48. PubMed PMID: 8095893. Epub 1993/02/01. eng. 34. Furtado Mde A, Braga GK, Oliveira JA, Del Vecchio F, Garcia-Cairasco N. Behavioral, morphologic, and electroencephalographic evaluation of seizures induced by intrahippocampal microinjection of pilocarpine. Epilepsia. 2002;43 Suppl 5:37-9. PubMed PMID: 12121293. Epub 2002/07/18. eng. 35. Plock N, Kloft C. Microdialysis--theoretical background and recent implementation in applied life-sciences. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 2005 May;25(1):1-24. PubMed PMID: 15854796. Epub 2005/04/28. eng. 36. Raedt R, Clinckers R, Mollet L, Vonck K, El Tahry R, Wyckhuys T, et al. Increased

49

hippocampal noradrenaline is a biomarker for efficacy of vagus nerve stimulation in a limbic seizure model. Journal of Neurochemistry. 2011 May;117(3):461-9. PubMed PMID: WOS:000289464500010. 37. El Tahry R, Mollet L, Raedt R, Delbeke J, De Herdt V, Wyckhuys T, et al. Repeated assessment of larynx compound muscle action potentials using a self-sizing cuff electrode around the vagus nerve in experimental rats. Journal of Neuroscience Methods. 2011 Jun 15;198(2):287-93. PubMed PMID: WOS:000292435900018. 38. Mollet L, Raedt R, Delbeke J, El Tahry R, Grimonprez A, Dauwe I, et al. Electrophysiological responses from vagus nerve stimulation in rats. International journal of neural systems. 2013 Dec;23(6):1350027. PubMed PMID: 24156670. Epub 2013/10/26. eng. 39. Mollet L, Grimonprez A, Raedt R, Delbeke J, El Tahry R, De Herdt V, et al. Intensity-dependent modulatory effects of vagus nerve stimulation on cortical excitability. Acta Neurol Scand. 2013 Dec;128(6):391-6. PubMed PMID: 23614853. Epub 2013/04/26. eng. 40. Alexander GM, McNamara JO. Vagus nerve stimulation elevates seizure threshold in the kindling model. Epilepsia. 2012 Nov;53(11):2043-52. PubMed PMID: WOS:000310975400024. 41. Witcher MR, Ellis TL. Astroglial networks and implications for therapeutic neuromodulation of epilepsy. Frontiers in Computational Neuroscience. 2012 Aug 29;6. PubMed PMID: WOS:000308061700001. 42. Kushikata T, Yoshida H, Kudo M, Kudo T, Kudo T, Hirota K. Role of coerulean noradrenergic neurones in general anaesthesia in rats. British journal of anaesthesia. 2011 Dec;107(6):924-9. PubMed PMID: 21965049. Epub 2011/10/04. eng. 43. Vazey EM, Aston-Jones G. Designer receptor manipulations reveal a role of the locus coeruleus noradrenergic system in isoflurane general anesthesia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Mar 11;111(10):3859-64. PubMed PMID: 24567395. Pubmed Central PMCID: PMC3956184. Epub 2014/02/26. eng. 44. Kline DD. Plasticity in glutamatergic NTS neurotransmission. Respir Physiol Neurobiol. 2008 Dec 10;164(1-2):105-11. PubMed PMID: 18524694. Pubmed Central PMCID: PMC2666915. Epub 2008/06/06. eng. 45. Hermes SM, Mitchell JL, Silverman MB, Lynch PJ, McKee BL, Bailey TW, et al. Sustained hypertension increases the density of AMPA receptor subunit, GluR1, in baroreceptive regions of the nucleus tractus solitarii of the rat. Brain Res. 2008 Jan 2;1187:125-36. PubMed PMID: 18031714. Pubmed Central PMCID: PMC2225988. Epub 2007/11/23. eng. 46. Chen CY, Ling Eh EH, Horowitz JM, Bonham AC. Synaptic transmission in nucleus tractus solitarius is depressed by Group II and III but not Group I presynaptic metabotropic glutamate receptors in rats. The Journal of physiology. 2002 Feb 1;538(Pt 3):773-86. PubMed PMID: 11826164. Pubmed Central PMCID: PMC2290096. Epub 2002/02/05. eng. 47. Andresen MC, Fawley JA, Hofmann ME. Peptide and lipid modulation of glutamatergic afferent synaptic transmission in the solitary tract nucleus. Frontiers in neuroscience. 2012;6:191. PubMed PMID: 23335875. Pubmed Central PMCID: PMC3541483. Epub 2013/01/22. eng. 48. Mifflin SW. Short-term potentiation of carotid sinus nerve inputs to neurons in the nucleus of the solitary tract. Respiration physiology. 1997 Nov;110(2-3):229-36. PubMed PMID: 9407615. Epub 1998/01/04. eng. 49. Dorr AE, Debonnel G. Effect of vagus nerve stimulation on serotonergic and noradrenergic transmission. J Pharmacol Exp Ther. 2006 Aug;318(2):890-8. PubMed PMID: 16690723. Epub 2006/05/13. eng. 50. Cota VR, Medeiros DdC, Silva da Pascoa Vilela MR, Doretto MC, Dutra Moraes MF. Distinct patterns of electrical stimulation of the basolateral amygdala influence pentylenetetrazole seizure outcome. Epilepsy & Behavior. 2009 Jan;14:26-31. PubMed PMID: WOS:000262800100008. 51. Diamond JS, Jahr CE. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J Neurophysiol. 2000 May;83(5):2835-43. PubMed PMID: 10805681. Epub 2000/05/11. eng. 52. El Tahry R, Raedt R, Mollet L, De Herdt V, Wyckuys T, Van Dycke A, et al. A novel implantable vagus nerve stimulation system (ADNS-300) for combined stimulation and

50

recording of the vagus nerve: Pilot trial at Ghent University Hospital. Epilepsy Research. 2010 Dec;92(2-3):231-9. PubMed PMID: WOS:000285657300015. 53. Sacchetti G, Bernini M, Bianchetti A, Parini S, Invernizzi RW, Samanin R. Studies on the acute and chronic effects of reboxetine on extracellular noradrenaline and other monoamines in the rat brain. Br J Pharmacol. 1999 Nov;128(6):1332-8. PubMed PMID: 10578149. Pubmed Central PMCID: PMC1571760. Epub 1999/12/01. eng. 54. Fornai F, Ruffoli R, Giorgi FS, Paparelli A. The role of locus coeruleus in the antiepileptic activity induced by vagus nerve stimulation. European Journal of Neuroscience. 2011 Jun;33(12):2169-78. PubMed PMID: WOS:000292525000001. 55. Heinrichs SC. Neurobehavioral consequences of stressor exposure in rodent models of epilepsy. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 2010 Jun 30;34(5):808-15. PubMed PMID: WOS:000280031900009. 56. Palamarchouk VS, Zhang J, Zhou G, Swiergiel AH, Dunn AJ. Hippocampal norepinephrine-like voltammetric responses following infusion of corticotropin-releasing factor into the locus coeruleus. Brain Res Bull. 2000 Mar 1;51(4):319-26. PubMed PMID: 10704782. Epub 2000/03/08. eng. 57. Yavich L, Jakala P, Tanila H. Noradrenaline overflow in mouse dentate gyrus following locus coeruleus and natural stimulation: real-time monitoring by in vivo voltammetry. J Neurochem. 2005 Nov;95(3):641-50. PubMed PMID: 16248883. Epub 2005/10/27. eng. 58. Sorge RE, Martin LJ, Isbester KA, Sotocinal SG, Rosen S, Tuttle AH, et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature methods. 2014 Apr 28. PubMed PMID: 24776635. Epub 2014/04/30. Eng.

I

I

BIJLAGE I

Lijst van afkortingen 5-HT serotonine

µl microliter µm micrometer µs microseconde

AED anti-epileptische drug

AMPA R α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor,

Beta-AR beta adrenoreceptoren

CA cornu ammonis DMN dorsale motore nucleus van de nervus vagus DRAEDD designer receptors exclusively activated by designer drugs DRN dorsale raphe nucleus EEG elektro-encefalogram EES epileptische ernst score eVEP enhanced vagal evoked potential FDA food and drug administration GABA gamma amino-boterzuur gal galanine HS hippocampale sclerose Hz Hertz i.c.v. Intracerebroventriculair i.p. Intraperitoneaal i.p.v. In plaats van K+ kaliumion kDA kilodalton kg kilogram kΩ kilo ohm LC locus coeruleus LMEP laryngeal muscle evoked potential M1 muscarinereceptor subtype 1 mA milliampère

ml milliliter mm millimeter mM millimolair mTLE mesiale temporale kwab epilepsie n.vagus nervus vagus NA nucleus ambiguus NE norepinephrine NMDA N-methyl-D-aspartaat, NPY neuropeptide Y NSAID niet-steroidale anti-inflammatoire drug NTS nucleus tractus solitarius PCB printed circuit board Peri-LC perifere regio rond de LC pERK extracellulair signaal gereguleerd kinase (gefosforyleerd)

PET positron emission tomography PFA paraformaldehyde

II

Pgi nucleus paragigantocellularis PKA cyclisch AMP proteïne kinase A PrH perifasciculaire area van de nucleus prepositus hypoglossi PTZ pentyleen tetrazol RCT randomized controlled trial

SE status epilepticus

SPECT single-photon emission computed tomography SPSS statistical package for the social sciences SPW-R sharp wave-ripple TEES totale epileptische ernst score Vdc volt, gelijkstroom VEP vagal evoked potential

VNS nervus vagus stimulatie

III

BIJLAGE II: NEUROCHEMISCHE ANALYSE

Legende voor alle grafieken: Blauw = basis noradrenalineconcentratie

Rood = noradrenalineconcentratie na microburst VNS

Figuur 17 neurochemische analyse van rat met identificatienr "L3".

Figuur 18: neurochemische analyse van rat met identificatienr "L6".

Figuur 19: neurochemische analyse van rat met identificatienr "L12" VOOR FILTEREN VOOR OUTLIER.

Figuur 20: neurochemische analyse van rat met identificatienr "L12" NA FILTEREN VOOR OUTLIER.

IV

1

Figuur 21: neurochemische analyse van rat met identificatienr "L13".

Figuur 22: neurochemische analyse van rat met identificatienr "L15".

Figuur 23: neurochemische analyse van rat met identificatienr "L16".

Figuur 24: neurochemische analyse van rat met identificatienr "L18".

Figuur 25: neurochemische analyse van rat met identificatienr "L19".

V