e Z jcsl.bas-net.by/xfile/v_bio/2012/4/l6nqq1.pdf · Вашкевич И. И., Мартинович...

1

СЕРЫЯ БIЯЛАГIЧНЫХ НАВУК 2012 № 4

СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК 2012 № 4

ЗАСНАВАЛЬНIК – НАЦЫЯНАЛЬНАЯ АКАДЭМIЯ НАВУК БЕЛАРУСI

Часопіс выдаецца са студзеня 1956 г.

Выходзіць чатыры разы ў год

ЗМЕСТ

Володько И. К., Гулис А. Л., Рупасова Ж. А. Влияние уровней кислотности и влагообеспеченности суб-страта на параметры развития вегетативной сферы рода Rhododendron при интродукции в условиях Беларуси 5

Иванова Э. А., Вафина Г. Х., Иванов Р. С. Формирование специфических протеазочувствительных участков хроматина зрелых зародышей пшеницы (Triticum aestivum) при индукции ростового морфогенеза . . 11

Савчин Д. В., Панюш А. С., Картель Н. А. Создание и анализ трансгенных растений картофеля и табака с геном gox Penicillium funiculosum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

Дубовец Н. И., Сычева Е. А., Соловей Л. А., Штык Т. И., Бондаревич Е. Б. Создание и цитогенети-ческий анализ вторичных форм тетраплоидных тритикале (Triticosecale tetraploidii (Lebedevii) Kurk.) для ис-пользования в хромосомной инженерии злаков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

Шишлова Н. П., Шишлова А. М., Шишлов М. П. Биометрическая и физико-химическая характеристи-ка межродовых реципрокных гибридов между тритикале (Triticosecale Wittmack) и пшеницей (Triticum spelta и Triticum turgidum) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

Аверина Н. Г., Яронская Е. Б. , Недведь Е. Л., Тумилович А. В. Влияние экзогенной 5-аминолевулино-вой кислоты на ранние стадии развития растений озимого рапса (Brassica napus), обработанных сульфонилмо-чевинным гербицидом Магнум . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Циркунова Ж. Ф., Михайлова Р. В., Лобанок А. Г., Шахнович Е. В. Влияние термоадаптации на морфо-лого-биохимические свойства Penicillium adametzii ЛФ F-2044.1 – продуцента глюкозооксидазы . . . . . . . . . . . . 38

Бурко Д. В., Кухарская Т. А., Квач С. В., Зинченко А. И. Обратимая иммобилизация диаденозинтетра-фосфата в наночастицы Mg/Al-слоистых двойных гидроксидов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

Качан А. В., Евтушенков А. Н. Клонирование гена термостабильной a-амилазы Bacillus sp. 1–15 . . . . . . 47Верещако Г. Г., Чуешова Н. В., Гунькова Н. В. Состояние репродуктивной системы крыс-самцов после

длительного электромагнитного облучения мобильным телефоном в период ее формирования . . . . . . . . . . . . . 52

Национальная

академия наук

Беларуси

Вашкевич И. И., Мартинович В. П., Позняк Т. А., Свиридов О. В. Получение и свойства реагентов для иммуноферментного анализа хлорамфеникола в сырье и продукции животного происхождения . . . . . . . . . . . . 57

Ковалева М. В., Власенко А. К., Анисович М. В., Шафрановская Е. В., Афонин В. Ю. Действие эпигаллокатехин-3-галлата в условиях физической нагрузки у крыс линий WKY и SHR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

Кудра Н. В., Расюк Е. Д., Дмитриев В. В., Жукова М. В., Кисель М. А. Анализ фосфолипидного соста-ва образцов диагностических реагентов на основе тканевого тромбопластина различных производителей . . . 71

Асташонок А. Н., Полещук Н. Н., Рубаник Л. В., Жавнерко Г. К. Полиморфизм внеклеточных форм элементарных частиц Chlamydia transhomatis: ультраструктурная и наноскопическая характеристика . . . . . . . 76

Липинcкая Т. П., Макаренко А. И. Оценка удельной роли чужеродных видов в структуре сообщества макрозообентоса . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

Шляхтенок А. С. Изучение сукцессии сообществ ос (Hymenoptera, Aculeata) на зарастающем суходоль- ном лугу . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

Седловская С. М., Денисова С. И. Зависимость онтогенеза китайского дубового шелкопряда (Antheraea pernyi) от воздействия агонистов экдистероидов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

Шималов В. В. Гельминтофауна мелких насекомоядных млекопитающих и грызунов, обитающих вдоль автомагистралей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

Лукашанец Д. А. Фаунистические особенности бделлоидных коловраток (Rotifera, Bdelloidea) в водных экосистемах Беларуси . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

Анисимова Е. И., Пенькевич В. А. Инвазированность трематодами Opistorchis felineus дефинитивных и промежуточных хозяев в Полесском радиационно-экологическом заповеднике . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

ВУЧОНЫЯ БЕЛАРУСІ

Евгений Александрович Черницкий (К 80-летию со дня рождения) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

ИЗВЕСТИЯ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ 2012 № 4Серия биологических наук

на русском и белорусском языкахРэдактар Л. Л. Б а ж к о

Камп’ютарная вёрстка Н. І. К а ш у б а

Здадзена ў набор 09.08.2012. Падпісана ў друк 02.10.2012. Выхад у свет 15.10.2012. Фармат 60×841/8. Папера афсетная. Ум. друк. арк. 14,88. Ул.-выд. арк. 16,4. Тыраж 116 экз. Заказ 210.Кошт нумару: індывідуальная падпіска – 34 550 руб., ведамасная падпіска – 86 201 руб.

Рэспубліканскае ўнітарнае прадпрыемства «Выдавецкі дом «Беларуская навука». ЛИ № 02330/0494405 ад 27.03.2009. Вул. Ф. Скарыны, 40. 220141, Мінск. Пасведчанне аб рэгістрацыі № 395 ад 18.05.2009.

Надрукавана ў РУП «Выдавецкі дом «Беларуская навука».

© Выдавецкі дом «Беларуская навука». Весці НАН Беларусі. Серыя біялагічных навук, 2012



Беларуси

3

PROCEEDINGSOF THE NATIONAL ACADEMY

OF SCIENCES OF BELARUSBIOLOGICAL SERIES 2012 N 4

FOUNDER IS THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF BELARUS

The Journal has been published since January 1956

Issued four times a year

CONTENTS

Volodko I. K., Gulis A. L., Rupasova J. A. Effect of substrate properties on the parameters of the autonomic sphere with the introduction of Rhododendron in Belarus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Ivanova E. A., Vafina G. H., Ivanov R. S. Formation of specific proteasesensitives sites chromatin of mature germs of wheat (Triticum aestivum) at the induction of growth morphogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

Sauchyn D. V., Panush A. S., Kartel N. A. Transgenic potato and tobacco plants with gox gene of Penicillium funiculosum development and analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

Dubovets N. I., Sycheva Y. A., Solovey L. A., Shtyk T. I., Bondarevich Y. B. Creation and cytogenetic analysis of secondary forms of tetraploid triticale (Triticosecale tetraploidii (Lebedevii) Kurk.) to use it in chromosome engi-neering of cereals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

Shishlova N. P., Shishlova A. M., Shishlov M. P. Biometric and physicochemical characteristics of intergeneric reciprocal hybrids between triticale (Triticosecale Wittmack) and wheat (Triticum spelta and Triticum turgidum) . . . . 28

Averina N. G., Yaronskaya E. B. , Nedved E. L., Tumilovich A. V. Influence of exogenous 5-aminolevulinic acid on early stages of development of winter rape (Brassica napus) treated with sulfonilurea herbicide Magnum . . . . 34

Tsirkunova Zh. F., Mikhailova R. V., Lobanok A. G., Shakhnovich E. V. Effect of thermal adaptation on morphological-biochemical properties of glucose oxidase producer penicillium adametzii ЛФ F 2044.1 . . . . . . . . . . . 38

Burко D. V., Kucharskaya Т. A., Kvach S. V., Zinchenko A. I. Reversible diadenosine tetraphosphate intercala-tion into Mg/Al-layered double hydroxides nanoparticles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

Kachan A. V., Evtushenkov A. N. Cloning of the thermostable a-amylase gene from Bacillus sp. 1–15 . . . . . . . 47Vereshchako G. G., Тshueshova N. V., Gunkova N. V. State of reproductive system rats-males after long-term

electomagnetic radiation from mobile phone on period its formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52Vashkevich I. I., Martinovich V. P., Poznyak T. A., Sviridov O. V. Preparation and properties of the reagents

for chloramphenicol immunoassay in foodstuffs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57Kavaliova M. V., Vlasenko A. K., Anisovich M. V., Shafranovskaya E. V., Afonin V. Yu. Effects of the

epigallocatechin-3-gallat in WKY and SHR rats with physical activity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66Kudra N. V., Rasjuk E. D., Dmitriev V. V., Zhukova M. V., Kisel M. A. Analysis of phospholipid composition

samples of diagnostic reagents on the basis of tissue thromboplastin different producers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71Astashonok A. N., Poleshchuk N. N., Rubanik L. V., Zhavnerko G. K. Ultrastructural description and

investigation of organisation the surface antigens of the elementary bodies Chlamydia trachomatis by atomic-force microscopy technique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

Lipinskaya T. P., Makarenko A. I. The assessment specific role of alien species in the structure of macrozooben-thos community . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83



Беларуси

Shlyakhtenok A. S. The study of wasps communities’ succession (Hymenoptera, Aculeata) on overgrowing dry meadow . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

Sedlovskaya S. M., Denisova S. I. Dependence of Antheraea pernyi ontogenesis on the influence some ecdysone agonists . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

Shimalov V. V. The helminth fauna of small insectivora mammals and rodents that lives along the main roads . . 106Lukashanec D. A. The peculiarities of Bdelloidea rotifer fauna (Rotifera, Bdelloidea) in water ecosystems

of Belarus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112Anisimova E. I., Penkevich V. A. The invasive by trematodes Opistorchis felineus desises in indefinit and

intermediate host in Polesski state radiation-ecological reserve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

SCIENTISTS OF BELARUS

Eugeny Alexandrovich Chernitsky (To the 80-th Anniversary) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121



Беларуси

5

ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2012СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК

УДК 634.737:581.19: 631.445.124(476)

И. К. ВОЛОДЬКО, А. Л. ГУЛИС, Ж. А. РУПАСОВА

ВЛИЯНИЕ УРОВНЕЙ КИСЛОТНОСТИ И ВЛАГООБЕСПЕЧЕННОСТИ СУБСТРАТА НА ПАРАМЕТРЫ РАЗВИТИЯ ВЕГЕТАТИВНОЙ СФЕРЫ РОДА RHODODENDRON

ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В УСЛОВИЯХ БЕЛАРУСИ

Центральный ботанический сад НАН Беларуси, Минск, e-mail: J. Rupasova@cbg. org. by

(Поступила в редакцию 24.05.2012)

Введение. Одним из важнейших абиотических факторов, в значительной мере определяю-щим темпы развития интродуцентов в новой среде обитания, наряду с климатическим является эдафический фактор, к основным характеристикам которого следует отнести водно-физические свойства, а также уровни кислотности и естественного плодородия почвы.

В связи с интродукцией рододендронов в Беларуси возникла необходимость в исследовании параметров развития их надземных частей в зависимости от данных характеристик свойствен-ного региону почвенного покрова. Поскольку представители данного рода обладают весьма ком-пактной корневой системой, сосредоточенной в незначительном объеме почвы, то ее верхний слой должен быть достаточно плодородным, умеренно влажным, отличаться рыхлым сложени-ем и обладать при этом высокой водо- и воздухопроницаемостью, что и характерно для мест их естественного произрастания. Вместе с тем рододендроны, как и все виды сем. Ericaceae, связа-ны в питании с эндотрофной микоризой, требующей для своего развития кислой среды, в связи с чем для подавляющего большинства из них оптимальной является реакция почвенного раство-ра в пределах 4,5-5,5 единиц рНKCl [2]. По общепринятому мнению, идеальный субстрат для вы-ращивания рододендронов - слаборазложившийся сфагновый торф верховых или переходных болот, но вполне подходящими для этого могут быть также хорошо аэрируемые почвы легкого гранулометрического состава с примесью торфа, но непременным условием при этом должна быть слабо- или среднекислая реакция почвенного раствора.

Целью данной работы явилось определение оптимальных диапазонов ряда свойств субстрата в районе интродукции рододендронов, обеспечивающих наиболее активное развитие растений, в связи с чем в 2008–2010 гг. было проведено сравнительное исследование биометрических пара-метров вегетативных органов растений в зависимости от уровней кислотности и влагообеспе-ченности субстрата.

Объекты и методы исследования. В качестве объектов исследований были привлечены од-нолетние сеянцы 5 листопадных (Rh. japonicum, Rh. luteum, Rh. schlippenbachii, Rh. calendulaceum, Rh. canadence) и 5 вечнозеленых (Rh. brachycarpum, Rh. catawbiense, Rh. smirnowii, Rh. dauricum, Rh. maximum) рододендронов. Экспериментальная часть исследования была выполнена в рамках двух вегетационных опытов: первый – с изменением обменной кислотности субстрата в интер-вале 3,0–6,5 единиц рНKСl (7-вариантная схема) и второй – с изменением влажности субстрата в диапазоне 60–90% полной полевой влагоемкости (ППВ) (4-вариантная схема). В качестве суб-страта использовали верховой торф с рНKСl 4,5, зольностью 5,3–8,6% и содержанием подвижных форм фосфора и калия в пределах 8–11 и 14–23 мг/кг соответственно. В первом эксперименте регуляцию уровня кислотности субстрата в заданных диапазонах осуществляли с помощью вне-сения корректирующих доз мела и серной кислоты, во втором же эксперименте предусмотрен-ные параметры относительной влажности субстрата обеспечивали путем полива водой с после-дующим взвешиванием вегетационных сосудов. В конце каждого вегетационного сезона опре-



Беларуси

6

деляли среднюю величину годичного прироста побегов и биометрические параметры ново - образованных листьев. Повторность опытов – 4-кратная. Данные статистически обработаны с использованием программы Excel.

Результаты и их обсуждение. Нашими исследованиями было установлено, что у большин-ства таксонов рододендронов, участвовавших в эксперименте, максимальные значения годично-го прироста побегов текущего года наблюдались при показателе кислотности субстрата в интер-вале 3,5–4,0 единиц рНKСl, что указывало на его соответствие оптимальным значениям, близким к рекомендуемым для данной культуры также другими авторами [1,2] (рис. 1). Исключением из этого ряда явились лишь Rh. schlippenbachii и Rh. smirnowii, у которых оптимальный диапазон данного признака соответствовал области значений 4,0–4,5 единиц рНKСl. При отклонении же уровня кислотности субстрата от показанного оптимума в ту и другую стороны отмечено сни-жение величины годичного прироста побегов, наиболее выраженное у Rh. schlippenbachii и Rh. dauricum. Наибольшей же толерантностью к изменению данного фактора характеризовались Rh. luteum и Rh. catawbiense. Вместе с тем при показателе кислотности, превышавшем 6,0–6,5 еди-ниц рНKСl, у всех исследуемых таксонов рододендронов наблюдалось существенное угнетение ростовой функции.

Аналогичная этой зависимость от уровня кислотности субстрата установлена также для пло-щади листовой поверхности опытных растений (рис. 2). Как и для годичного прироста побегов, максимальные ее значения у большинства таксонов рододендронов были достигнуты при ве- личине рНKСl почвенного раствора в интервале 3,5–4,0. При этом у Rh. japonicum и Rh. brachycarpum оптимальные значения данного признака соответствовали области значений 3,0–3,5, а у Rh. schlippenbachii – 4,0–4,5 единиц рНKСl. Вместе с тем зависимость площади листовой поверхности рододендронов от уровня кислотности почвы, особенно при его значениях, превы-шавших 6,0–6,5 единиц рНKСl, проявилась намного выразительнее, по сравнению с таковой го-дичного прироста побегов. Именно при слабокислой, близкой к нейтральной реакции почвенно-го раствора, наблюдалось наиболее значительное в эксперименте ингибирование развития асси-милирующих органов. Наибольшую же чувствительность к данному фактору обнаружили Rh. schlippenbachii, Rh. smirnowii и Rh. japonicum, у которых при снижении кислотности почвы до 6,0–6,5 единиц рНKСl отмечено уменьшение площади листовой поверхности на 89–95% относи-тельно таковой при оптимальных значениях данного фактора. Наиболее же толерантными к изменению кислотности субстрата в условиях эксперимента оказались Rh. luteum и Rh. catawbiense.

Важнейшей характеристикой субстрата, в значительной мере определяющей водный режим культивируемых растений, является его влагообеспеченность. В природных местообитаниях ро-додендроны занимают территории с повышенной влажностью воздуха и почвы, но при этом не переносят близкого залегания грунтовых вод и избыточного увлажнения субстрата.

Рис. 1. Величина годичного прироста побегов у видов Rhododendron L. при разном уровне кислотности субстрата



Беларуси

7

Исследование в опытной культуре влияния разных уровней относительной влажности суб-страта в диапазоне 60–90% ППВ на биометрические параметры побегов и ассимилирующих ор-ганов опытных растений так же, как и в предыдущем эксперименте, выявило наличие опреде-ленной видоспецифичности в характере ответной реакции растений на изменение данного фак-тора.

Как следует из табл. 1, максимальные значения средней площади листовой поверхности у большинства видов рододендрона, в том числе у Rh. brachycarpum, Rh. catawbiense, Rh. japo-nicum, Rh. luteum, Rh. maximum, Rh. schlippenbachii, Rh. smirnowii, были достигнуты при влаж-ности почвы, составлявшей 80% ППВ и лишь у двух таксонов - Rh. dauricum и Rh. canadense – при 70%, что и свидетельствует об определенной видоспецифичности ответа растений на изме-нение данного фактора. Наименьшие же значения анализируемых признаков у тестируемых объектов, не превышавшие у большинства из них 50–70% от максимальных значений, наблюда-лись при относительной влажности субстрата на уровне 60 и 90% ППВ. Наиболее выраженным ингибированием развития ассимилирующих органов при избыточном увлажнении субстрата ха-рактеризовались Rh. dauricum, Rh. luteum и Rh. brachycarpum, у которых в условиях эксперимен-та средняя площадь листовой поверхности сократилась примерно вдвое относительно макси-мальной. Наименее же выраженной отрицательной реакцией на переувлажнение субстрата были отмечены Rh. schlippenbachii, Rh. catawbiense и Rh. smirnowii, причем у двух первых таксонов она оказалась также весьма ослабленной и на недостаточное увлажнение, что указывает на более выраженные в таксономическом ряду адаптивные возможности в этом плане обозначенных ин-тродуцентов.

Наблюдения за побегообразованием опытных растений, проводившиеся в рамках этого эксперимента, также показали зависимость данного процесса от влажности субстрата. Как сле-дует из табл. 2, наибольшее количество побегов текущего года у большей части тестируемых таксонов рододендронов (Rh. canadense, Rh. dauricum, Rh. luteum, Rh. brachycarpum и Rh. maxi-mum) было сформировано при избыточной влажности субстрата, равной 90% ППВ, тогда как у Rh. japonicum – при 80%-ной влажности и лишь в трех случаях – у Rh. schlippenbachii, Rh. catawbiense и Rh. smirnowii – подобный результат был получен при минимальных ее значениях в пределах 60% ППВ.

Максимальные показатели средней длины побегов, как и площади листовой поверхности, у большинства видов рододендронов установлены в варианте опыта с 80%-ной влажностью суб-страта и лишь у Rh сanadense и Rh. dauricum – при ее 70%-ном уровне. Вместе с тем наибольшая величина суммарной протяженности побегов при 80%-ной влажности субстрата отмечена лишь у 5 таксонов рододендрона (Rh. dauricum, Rh. japonicum, Rh. luteum, Rh. catawbiense и Rh. smirnowii), тогда как у Rh. canadense и Rh. schlippenbachii – при 70%-ной, а у Rh. brachycarpum и Rh. maximum – при 90%-ной, что указывает на выраженную видоспецифичность темпов раз-

Рис. 2. Средняя площадь листовой поверхности у видов Rhododendron L. при разном уровне кислотности субстрата



Беларуси

8

Т а б л и ц а 1. Усредненные в многолетнем цикле наблюдений биометрические параметры листовых пластинок у видов Rhododendron L. при разном уровне относительной влажности субстрата

Влажность субстрата,%

Биометрические параметры листовых пластинок Средняя площадь листо-вой поверхностиобщее количество средняя длина средняя ширина средняя площадь

шт. % от макси-мума мм% от макси-

мума мм% от опти-

мума см2 % от опти-

мума см2 % от опти-

мума

Rh. canadense60 179,1 82,4 34,2 87,0 14,7 86,1 3,5 74,9 632 61,870 217,4 100,0 39,3 100,0 17,1 100,0 4,7 100,0 1023 10080 209,1 96.2 39,1 99,5 17,0 99,2 4,6 98,7 972 95,090 164,2 75,5 37,5 95,4 15,1 88,3 4,0 84,3 651 63,7

Rh. dauricum60 190,0 80,3 38,7 87,4 15,7 86,5 4,3 75,6 809 60,770 236,6 100,0 44,3 100,0 18,2 100,0 5,6 100,0 1333 10080 230,1 97,3 42,3 99,9 17,7 94,7 5,2 93,0 1205 90,590 190,3 80,4 36,5 82,5 15,2 83,4 3,9 68,8 737 55,3

Rh. japonicum60 104,3 80,1 66,5 76,4 21,7 86,1 10,1 69,0 1053 55,270 107,2 82,3 73,5 84,4 25,1 99,6 13,3 91,0 1429 74,980 130,3 100,0 87,0 100,0 25,2 100,0 14,6 100,0 1908 10090 100,6 77,0 82,2 94,4 24,0 96,8 13,8 94,4 1391 72,9

Rh. luteum60 84,6 68,2 73,6 79,9 18,9 90,0 9,7 71,9 823, 49,170 91,6 73,8 82,6 89,7 19,3 91,9 11,2 82,4 1021 60,880 124,0 100,0 92,1 100,0 21,0 100,0 13,5 100,0 1678 10090 81,4 65,7 73,4 79,8 21,0 99,9 10,8 80,07 878 52,3

Rh. schlippenbachii60 117,2 100,0 53,7 77,6 26,6 85,7 10,0 66,5 1172 91,770 105,4 89,9 57,6 83,2 29,7 95,7 12,0 79,6 1262 98,780 85,1 72,6 69,2 100,0 31,0 100,0 15,0 100,0 1279 10090 90,7 77,4 60,3 87,2 27,6 89,0 11,7 77,6 1058 82,7

Rh. brachycarpum60 18,5 69,3 90,4 88,6 42,9 88,2 27,1 78,2 502 54,270 19,1 71,5 97,4 95,5 46,2 95,1 31,5 90,8 602 64,980 26,7 100,0 102 100 48,6 100,0 34,7 100,0 927 10090 17,7 66,4 92,4 90,6 43,7 89,8 28,2 81,4 501 54,0

Rh. catawbiense60 41,4 90,1 100 95,3 43,4 94,1 30,5 89,9 1265 81,070 43,9 95,4 102 97,4 44,9 97,3 32,2 94,8 1412 90,480 46,0 100,0 105 100,0 46,2 100,0 33,9 100,0 1561 10090 43,7 95,1 103 98,0 43,6 94,5 31,4 92,7 1375 88,1

Rh. maximum60 103,2 97,9 90,6 89,6 29,4 84, 9 18,6 76,06 1922 76,570 105,4 100,0 96,4 95,4 33,3 96,2 22,5 91,75 2368 94,280 102,7 97,4 101 100,0 34,6 100,0 24,5 100,0 2514 10090 85,1 80,7 92,4 91,5 32,3 93,2 20, 9 85,3 1777 70,7

Rh. smirnowii60 18,1 79,1 90,6 88,1 29,4 84,9 18,6 74,8 337,4 59,170 18,8 82,1 93,9 91,2 33,3 96,2 21,9 87,7 411,3 72,180 22,9 100,0 103 100,0 34,6 100,0 24,9 100,0 570,8 10090 22,6 98,7 99 96,1 32,3 93,2 22,3 89,5 504,1 88,3



Беларуси

9

Т а б л и ц а 2. Усредненные в многолетнем цикле наблюдений биометрические параметры побегов текущего года у видов Rhododendron L. при разном уровне относительной влажности субстрата

Влажность субстра-та, %

Биометрические параметры побегов

Среднее количество Средняя длина Суммарная длина

шт. % от максимально-го см % от максимальной см % от максимальной

Rh. canadense60 8,0 90,1 3, 8 58,7 30,2 68,070 6,9 77,7 6,4 100 44,5 10080 6,5 73,2 5,9 91,3 38,2 85,990 8,9 100 3,3 50,9 29,1 65,4

Rh. dauricum60 12,3 78,8 9,6 87,4 118,2 86,670 10,8 69,2 11,0 100 118,8 87,180 14,2 91,1 9,6 87,2 136,5 10090 15,6 100 7,9 72,2 112,9 82,7

Rh. japonicum60 10,8 85,8 2,8 57,3 30,5 49,170 10,8 85,8 3,0 60,9 32,5 52,380 12,6 100 4,9 100 62,1 10090 10,1 80,6 3,4 69,8 34,9 56,3

Rh. luteum60 8,0 73,5 3,3 33,4 26,0 41,170 6,9 63,4 4,2 42,9 28,8 45,580 6,5 59,7 9,7 100 63,2 10090 10,9 100,0 2,5 25,4 26,8 42,5

Rh. schlippenbachii60 14,4 100 2,5 78,1 36,5 95,270 13,2 91,6 2,6 81,8 38,3 10080 11,8 81,7 3,2 100 38,2 99,690 11,4 78,9 2,7 78,2 30,3 79,0

Rh. brachycarpum60 4,0 88,9 3,9 62,9 15,7 69,770 2,8 62,7 5,7 90,9 16,0 70,980 2,6 57,8 6,2 100 16,2 71,990 4,5 100 5,0 80,3 22,5 100

Rh. catawbiense60 4,5 100 7,4 68,1 33,4 86,470 4,3 94,9 8,7 79,9 37,2 96,280 3,6 78,9 10,9 100 38,7 10090 3,8 84,9 9,1 83,8 34,9 90,2

Rh. maximum60 4,0 88,8 3,9 62,9 15,7 69,770 2,8 62,7 5,7 90,9 16,0 70,980 2,6 57,8 6,2 100 16,2 71,990 4,5 100 5,0 80,3 22,5 100

Rh. smirnowii60 3,0 100 2,8 33,7 8,4 72,070 2,7 90,0 3,2 38,1 8,6 73,580 1,4 46,7 8,4 100 11,7 10090 2,2 73,3 5,3 63,1 11,6 99,2



Беларуси

вития побегов у исследуемых таксонов рододендронов при изменении влажности субстрата. Весьма отчетливо уменьшение средней длины и общей протяженности побегов проявилось при отклонении последней от оптимального уровня, особенно в сторону его снижения, обусловив-шем выраженное в разной степени ингибирование их роста. Наиболее выразительно это прояви-лось у некоторых листопадных видов –Rh. canadense, Rh. japonicum, Rh. luteum и вечнозеленого Rh. smirnowii. Наименее восприимчивыми к изменению влажности субстрата как в сторону сни-жения, так и увеличения оказались параметры развития побегов у Rh. catawbiense, Rh. schlippenbachii и Rh. dauricum (см. табл. 2), что свидетельствует о наиболее выраженной в таксо-номическом ряду экологической пластичности данных видов.

Заключение. В результате многолетних исследований параметров развития вегетативных органов 5 листопадных (Rh. japonicum, Rh. luteum, Rh. schlippenbachii, Rh. calendulaceum, Rh. canadence) и 5 вечнозеленых (Rh. brachycarpum, Rh. catawbiense, Rh. smirnowii, Rh. dauricum, Rh. maximum) рододендронов в широком интервале изменения уровней кислотности и влагообеспе-ченности почвенного субстрата были установлены их оптимальные диапазоны, соответствую-щие областям значений 3,5–4,0 единиц рНKСl и 80% соответственно. Вместе с тем были выявле-ны существенные различия ответной реакции исследуемых таксонов рододендронов на измене-ние приведенных параметров, что свидетельствует о наличии определенной видоспецифичности их отношения к данным факторам среды, что необходимо учитывать при введении рододендро-нов в культуру. Показано, что наибольшей экологической пластичностью в ряду тестируемых таксонов рододендрона обладает Rh. catawbiense, оказавшийся наряду с Rh. luteum наиболее то-лерантным к уровню кислотности субстрата и наряду с Rh. schlippenbachii – к уровню его влаго-обеспеченности.

Работа выполнена при финансовой поддержке Белорусского республиканского фонда фунда-ментальных исследований по гранту № Б11об-012 (2011-2013 гг., № ГР20115367 от 19.12.2011 г.).

Литература

1. Вострикова Т. В. // Вестн. Крас ГАУ. 2011. № 44. С. 27–30.2. Кондратович Р. Я. Рододендроны в Латвийской ССР. Биологические особенности культуры. Рига, 1981.

I. K.VOLODКO, A. L.GULIS, J. A. RUPASOVA

EFFECT OF SUBSTRATE PROPERTIES ON THE PARAMETERS OF THE AUTONOMIC SPHERE WITH THE INTRODUCTION OF RHODODENDRON IN BELARUS

Summary

As a result of years of research parameters of vegetative organs of 10 species of evergreen and deciduous Rhododendron L. a wide range of changes in the levels of acidity and moisture of the soil substrate revealed their optimum ranges, corresponding to ranges of values of 3.5-4.0 units pHKci and 80% respectively. It is shown that the greatest ecological plasticity have Rh. catawbiense and to a lesser extent Rh. luteum and Rh. schlippenbachii.



Беларуси

11


УДК 576.315.42:581.14322:633.11

Э. А. ИВАНОВА, Г. Х. ВАФИНА, Р. С. ИВАНОВ

ФОРМИРОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРОТЕАЗОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ УЧАСТКОВ ХРОМАТИНА ЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ ПШЕНИЦЫ (TRITICUM AESTIVUM)

ПРИ ИНДУКЦИИ РОСТОВОГО МОРФОГЕНЕЗА

Институт биологии Уфимского научного центра РАН, Уфа, e-maill: evilina@anrb. ru


Введение. Значительное место в исследовании механизмов экспрессии продолжает занимать изучение свойств тотального хроматина. Основное внимание уделено изучению свойств хрома-тина в системах с индуцированной пролиферацией [1, 2]. В настоящее время считают, что в эу-кариотическом геноме есть три регуляторных уровня [3]: на первом представлены все регуля-торные гены, а также цис- и транс-регуляторные элементы; второй уровень – хроматиновый, третий – соответствует интерфазному ядру – 3D организации (nuclear level). При реорганизации клеточного ядра в процессе онтогенеза клетки возможна динамика преобразования химических связей между супраструктурами тотального хроматина. В 1990 г. вышла статья G. Albrecht-Buhler [4] о том, что цитоплазма клетки высоко структурирована, с этой точки зрения внутри-клеточные реакции более адекватно может описывать только надмолекулярная химия иммоби-лизованных ферментов, где уже интегрированы взаимодействия многих макромолекул. В том числе специальные белки шаперонины, некоторые из них выполняют протеолитические функ-ции [5]. Каждый надмолекулярный функциональный блок, сформировавшись на начальных этапах эволюции, выполняет одну функцию, которая не меняется или мало меняется на протя-жении длительных интервалов эволюции [6]. В этом плане представляют интерес белковые ком-плексы, содержащие аргинин. Известно, что характерной особенностью в организации гене -тических структур эукариотов является эволюционная стабильность аргининбогатых гистонов. Молекула гистона IV (богатого аргинином) практически вся активна и облигатно взаимодей-ствует как с ДНК, так и с другими гистонами [7]. По-видимому, такая конструкция обеспечивает векторную стабильность в онто- и филогенезе эукариотов. Аргинин – это аминокислота, которая к составе нуклеосомной конструкции располагается на ее поверхности, а ее гуанидиновая груп-па подвергается различного рода модификациям, следствием этого является формирование ди-намических белковых комплексов в пространственной реорганизации тотального хроматина. Кроме того, продуктом метаболизма аргинина является биогенный амин – агматин. В зависимо-сти от дозы он способствует экспрессии соответствующих протекторных белков за счет взаимо-действия с ДНК [8]. Эти свойства аргинина могут иметь место в постгеномных технологиях, где возникло новое направление – пептидомика [9]. Цель данной работы – поиск динамики форми-рования Арг-Х протеазочувствительных участков в негистоновых и гистоновых блоках как воз-можных зон, влияющих на крупномасштабную пространственно-временную реорганизацию то-тального интерфазного хроматина, при индукции ростового морфогенеза зародышей пшеницы в условиях гиперацетилированного состоянии протеома клеточных ядер.

Объекты и методы исследования. Объектом исследования служили элитные семена пше-ницы (Triticum aestivum L.) сорта Артемовка (яровая), полученные из коллекции Всероссийского института растениеводства им. Н. И. Вавилова. Для замачивания семян и индукции прораста-ния зародышей соответственно в контрольном варианте использовалась дистиллированная вода, в опытном варианте – 0,004 мМ NaB (бутират натрия) [10]. В определенные интервалы времени



Беларуси

12

(0 ч (воздушно-сухое семя, находящееся в состоянии биологического покоя) и от начала замачи-вания семян (3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 ч)) из зародышей выделяли клеточные ядра и их надмолекуляр-ные супраструктуры: нуклеоплазму (Нп), хроматин непрочно- (Хр-I) и прочно- (Хр-II) связан-ный с ядерным матриксом (ЯМ), а также ЯМ по способу, подробно описанному в работах [11, 12]. Количество белка в ядрах и ядерных супраструктурах определяли методом Бредфорд в нашей модификации [12]. Разделение негистоновых белков (НГБ) и гистонов из выделенных супра-структур клеточных ядер проводили по способу [13]. Суть способа заключается в том, что через колонку с полиметакриловой синтетической смолой, носящей название ИРЦ-50 (Amberlite, IRC-50, Serva, Heidelberg), пропускаются гетерополимерные блоки, вышеописанных супраструктур. Подготовка смолы для ионообменной хроматографии проводилась по методике [14]. Элюирова-ние белков вели в ступенчатом градиенте (6,0; 8,9; 10,6; 40%) гуанидин-гидрохлорида (Диаэм). Арг-Х протеазочувствительность в НГБ и гистоновых блоках оценивали по расщеплению Арг-Х связей в аргининбогатом белке – протамине- Salmine-A-I («Merck») (молекула которого состоит из 33 аминокислот: 22 молекул Арг; 4 молекул Сер; 3 молекул Про; по 2 молекулы Глу и Вал) во всех вышеперечисленных фракциях ядер [12]. Активность протеолиза выражали в нмоль аргинина·с-1·мкг-1 белка.

Результаты и их обсуждение. Поскольку клетка и ее органоиды – это сложнейшая организа-ция атомных, молекулярных, надмолекулярных систем, то любое изменение внешних факторов окружающей среды затрагивает пространственно-временные биохимические уровни организа-ции живых систем. В данном случае нас интересовала взаимозависимость внутриядерных си-стем (нуклеоплазмы, Хр-I непрочно- и ХрII прочносвязанных с ЯМ, а также самого ЯМ), по-строенных на основе сильных (т. е. ковалентных) и слабых связей. На рис. 1 представлены физио-логические особенности прорастания зрелого зародыша. Горизонтальная линия, разделенная на пять периодов, отражает временной интервал выделения клеточных ядер из зародышей, ин-дуцированных к прорастанию. Эти периоды связаны с особенностями физиологического состоя-ния зародыша: 0 ч – воздушно-сухой зародыш, находящийся в состоянии биологического покоя; 3–6 ч – происходит активное набухание семени, увеличение массы зародыша; 9–12 ч, 15–18 ч – характеризуются лаг-периодом в набухании семени и остановки увеличения массы зародыша; 21 ч – период вступления в онтогенетический этап роста клеток за счет растяжения тканей (про-клевывается зародышевый корешок). В эксперименте для выделения клеточных ядер использо-вались одинаковые по массе зародыши, как в контрольном варианте опыта, так и в присутствии бутирата натрия. На основании подробных данных по состоянию хроматина в клеточных ядрах пшеницы [2, 15] известно, что в период биологического покоя (0 ч) плотные конденсированные хромонемные тяжи равномерно распределены по всему объему ядра. В процессе набухания се-мени и зародыша (3–6 ч) происходит вакуолизация внутреннего состояния ядра, разрыхление хромонемных структур, начало деконденсации хроматина. Далее (9 ч) наступает резкое умень-шение деконденсации хроматина и вновь новый виток увеличения его деконденсации (12 ч) с последующей протяженностью до 15 ч; 18-часовой период характеризуется подготовкой к S-фазе клеточного цикла. В 21 ч происходит активация меристематических клеток, инициация

Рис. 1. Масса прорастающих зародышей пшеницы сорта Артемовка в нормальных условиях (контроль) и в условиях ингибирования деацетилирования белков (опыт): 1 - контроль; 2 -опыт



Беларуси

13

репликации и синтеза ДНК. Таким образом, сформировавшийся зародыш представляет собой форму хранения онтогенетической информации в виде целостности развития, способной к гене-тической реализации и самоорганизации [16]. Данных касательно ростового морфогенеза и осо-бенностей его генетики развития у растений очень мало и они фрагментарны, считает Л. В. Бе-лоусов [17]. Эта проблема остается актуальной до настоящего времени. Мы специально сфокуси-ровали свое внимание на Арг-Х протеазочувствительных сайтах, исходя из роли аргинина,

Рис. 2. Динамика формирования Арг-Х протеазочувствительных сайтов в негистоновых и гистоновых блоках супра-структур клеточных ядер зрелых зародышей пшеницы сорта Артемовка, индуцированных к инициации ростового морфогенеза в контрольном варианте опыта (а) и при ингибировании деацетилирования белков (б): Нп — нуклео-

плазма; Хр-I — хроматин непрочносвязанный, Хр-II – хроматин прочносвязанный с ЯМ; ЯМ – ядерный матрикс



Беларуси

14

участвующего в эволюционной стабильности аргининбогатых гистонов, а также активности его гуанидиновой группы, способной дать резонирующий эффект биополимерной структуре. Де-тальный характер активации хроматина в прорастающих семенах пшеницы на основе связыва-ния акридинового оранжевого и синтеза ДНК представлен в работе [2]. Приведенные данные [2, 15] мы сравнили с результатами нашего эксперимента по локализации Арг-Х протеазочув-ствительных сайтов в НГБ и гистоновых белках, выделенных из наногетерополимерных струк-тур интерфазных ядер, инициированных к росту зрелых зародышей пшеницы (в отсутствии и присутствии бутирата натрия), соответственно рис. 2, а и б. Представляя графическое изображе-ние рис. 2, мы специально разделили его на три горизонтальных сектора, чтобы нагляднее выя-вить участки в наногетерополимерных структурах хроматиновой матрицы, где происходят ди-намические изменения ядерного протеома и выявляются гиперчувствительные сайты к Арг-Х протеолизу (рис. 2). По «сути дела» хроматиновая матрица – это физиологически важный суб-страт, на котором развертывается ремоделинг и механизм транскрипции. Сравнивая суммарное соотношение НГБ и гистоновых белков, выделенных из всех супраструктур на протяжении все-го временного периода от 0 ч до 21 ч, можно отметить, что их динамика в интерфазных клеточ-ных ядрах находится на одном уровне до 18 ч, затем происходит резкое изменение в сторону увеличения гистоновых блоков и уменьшения содержания НГБ (рис. 3). Это свидетельствует о том, что на хроматиновой матрице началась инициация нуклеосомной полимеризации, связан-ной с синтезом ДНК, причем в контрольном варианте она происходит более интенсивно (рис. 3, а), чем в присутствии ингибитора деацетилирования протеома (рис. 3, б). Возможно, ингибирова-ние деацетилирования связано с пролонгированием какого-то физиолого-биохимического про-цесса, происходящего на уровне клеточного ядра. Ранее на уровне нефракционированного про-теома супраструктур клеточных ядер мы определили пространственно-временные зоны Арг-Х активности [18–20]. На рис. 2 представлены пространственно-временные зоны НГБ и гистоно-вых белков супраструктур интерфазного клеточного ядра, которые открылись для проявления Арг-Х протеазочувствительности. Как показывает рис. 2, на уровне тотального хроматина в не-гистоновых и гистоновых белках супраструктур клеточных ядер циклически выявляются сайты Арг-Х протеазочувствительности. Однако нас интересовали главным образом только временные точки гиперчувствительности НГБ и гистонов, которые на рис. 2 отражены в верхних третьих горизонтальных секторах. То, что отображено на нижних двух секторах, мы отнесли к фоновому

Рис. 3. Динамика содержания общего белка в негистоно-вых (1) и гистоновых (2) блоках клеточных ядер зрелых зародышей пшеницы сорта Артемовка, индуцирован-ных к инициации ростового морфогенеза в контрольном варианте опыта (а) и в присутствии ингибирования деа-цетилирования белков (б). Обозначения фракций блоко-вых белков, элюируемых разнопроцентным раствором гуанидин-гидрохлорида с колонки ИРЦ-50: 1 – негисто-новые (6%); обогащенные гистонами: 2 – лизинбогатыми (HI) (8,9%); умеренно лизинбогатыми (H2A + H2B)

(10,6%); аргининбогатыми гистонами (H3 + H4) (40%)



Беларуси

отображению. Как видно из рис. 2, а, первые часы набухания семян (рис. 1) и увеличения объема ядер [15], по-видимому, сопровождаются формированием гиперчувствительных к протеолити-ческой активности Арг-Х сайтов в НГБ (3 ч) и аргининбогатых (Н3 +Н4) блоках (6 ч) нуклеоплаз-мы. Эта чувствительность затем переходит на ядерный матрикс НГБ (12 ч) и гистоны Н1 (12 ч). Таким образом, 12-часовой пространственно-временной период хроматиновой матрицы, период, готовящийся к синтезу ДНК, открывает путь к реорганизации гистоновых блоков Н1 (15 ч) и Н2А+Н2В (15 ч) на уровне структур клеточных ядер, обогащенных эухроматином (Хр-1), т. е. хроматином, непрочносвязанным с ЯМ. Возможно, Арг-Х гиперчувствительные зоны пред-ставляют собой один из элементов LCR (locus control regions), которые связаны с HAT (histoneacetyltransferase).

Литература

1. Зеленин А. В., Кущ А. А. // Молек. биология. 1985. Т. 19, № 1. С. 285–294.2. Троян В. М., Калинин Ф. Л. // Физиол. и биохим. культ. растен. 1985. Т. 17, № 3. С. 219–230.3. Смирнов А. Ф. Структурно-функциональная организация хромосом. СПб., 2009.4. Albrecht-Buhler G. // Int. Rev. of Cytology. 1990. № 120. P. 191–241.5. Ellis R. // Science. 1990. Vol. 250, № 4983. P. 954–959.6. Курганов Б. И., Любарев А. Е. // Биохимия. 1991. Т. 56, № 1. С. 19–32.7. Волькенштейн М. В. // Молек. биология. 1985. Т. 19, № 1. С. 55–65.8. Bode-Boger S. M., Scalera F., Ignarro L. J. // Pharmacol. Ther. 2007. Vol. 114, № 3. P. 295–306.9. Карелин А. Е., Иванов В. Т. // Вестн. РАН. 2005. Т. 75, № 2. С. 139–149.10. Иванова Э. А., Вафина Г. Х. Способ оценки влияния ингибитора деацетилирования белков на индукцию ро-

стового морфогенеза растений: патент на изобретение № 2404585 от 27 ноября 2010 г.11. Иванова Э. А., Вафина Г. Х. Способ выделения растительных клеточных ядер: авторское свидетельство №

1701747 от 01 сентября 1991 г.12. Иванова Э. А., Вафина Г. Х. Способ получения ядерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирую-

щей активностью: авторское свидетельство № 1733471 от 15 января 1992 г.13. Иванова Э. А., Вафина Г. Х. Способ препаративного выделения основных белков из супраструктур клеточ-

ных ядер растений: патент № 2408602 от 10 января 2011.14. Иванова Э. А. // Материалы третьей науч. конф. молодых ученых. Уфа, 1972. С. 54–55.15. Аветисова Л. В., Шапошников Я. Д., Кадыков В. А. // Онтогенез. 1988. Т. 19, № 2. С. 181–190.16. Иванов А. И. Генетические механизмы целостности развития. М., 1987. С. 116–125.17. Белоусов Л. В. Биол. морфогенез. М., 1987.18. Иванова Э. А., Вафина Г. Х. // Физиол. и биохим. культ. растен. 1992. Т. 24, № 6. С. 577–583.19. Иванова Э. А., Вафина Г. Х., Иванов Р. С. // Докл. РАН 2008. Т. 422, № 3. С. 427–429.20. Иванова Э. А., Вафина Г. Х., Иванов Р. С. // Физиол. и биохим. культ. растен. 2011. Т. 43, № 4. С. 316–323.

E. A. IVANOVA, G. H. VAFINA, R. S. IVANOV

FORMATION OF SPECIFIC PROTEASESENSITIVES SITES OF CHROMATIN OF MATURE GERMS OF WHEAT (TRITICUM AESTIVUM) AT THE INDUCTION OF GROWTH MORPHOGENESIS

Summary

The extraction of nonhistone and histone proteins from the dynamic suprastructures at spatial-temporal reorganization of interphase cell nucleus of mature wheat germs during the biological rest (0 h) and during the induced to the growth at: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 hours till germination was described. Dynamic formation of Arg-X proteasesensitive sites in the nonhistone and histone blocks of interphase chromatin suprastructures during the initiation of germs growth morphogenesis in a control variant and under the inhibition deacetylation of proteome was determined.



Беларуси

16


УДК 604.6:635.21

Д. В. САВЧИН, А. С. ПАНЮШ, Н. А. КАРТЕЛЬ

СОЗДАНИЕ И АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ И ТАБАКА С ГЕНОМ GOX PENICILLIUM FUNICULOSUM

Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск, e-mail: [email protected]


Введение. Получение форм растений с повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды – актуальная задача на сегодняшний день. Благодаря современ-ным методам генетической инженерии появилась возможность создавать растения, обладающие принципиально новыми признаками, которых невозможно добиться использованием селекцион-ных методов. Большинство экспериментов по созданию трансгенных растений направлено на повышение их продуктивности и получение растений, устойчивых к грибным и бактериальным патогенам. Исключением потерь, вызванных этими патогенами, можно повысить урожай в сред-нем на 10–20 %, а у таких ценных видов, как пшеница, рис, кукуруза, картофель и соя – на 50–80 % [1].

В ряде научных работ [2, 3] показано, что увеличение концентрации пероксида водорода в растительных тканях приводит к повышению устойчивости растений к самым разнообразным биотическим и абиотическим факторам, в том числе и к воздействию грибных и бактериальных патогенов. Такого эффекта можно добиться путем введения гена глюкозооксидазы (gox) в геном растения. В результате действия фермента глюкозооксидазы (b-D-глюкозо: O2–1-оксидоредуктаза, КФ 1.1.3.4) происходит реакция окисления b-D-глюкозы до b-D-глюконо-d-лактона и сопряжен-ное восстановление молекулярного кислорода до пероксида водорода. В свою очередь пероксид водорода является сигнальной молекулой для запуска защитных реакций растения и обладает прямым бактерицидным действием.

Цель нашего исследования – изучение экспрессии гена глюкозооксидазы в трансгенных рас-тениях картофеля и табака и анализ их устойчивости к некоторым фитопатогенам.

Материалы и методы исследования. В данной работе использован ген глюкозооксидазы высокоактивного грибного штамма 46.1 Penicillium funiculosum. Для стабильной интеграции гена глюкозооксидазы в геном растений и его экспрессии созданы векторные конструкции (pBI-L-GOX и pBI-F-GOX) [4] на базе векторной плазмиды pBI121, которая эффективно используется для трансформации широкого круга растений, в том числе растений табака и картофеля [5]. Век-торные конструкции использованы в экспериментах по агробактериальной трансформации рас-тений картофеля сорта Скарб как основного объекта и культуры табака Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1 как модельного объекта.

Трансформацию растений картофеля и табака проводили по методикам, описанным ранее [4]. Эксперименты по определению уровня устойчивости растений картофеля к фитопатогенам Phytophtora infestans и Erwinia carotovora ssp. Carotovora проводили в лабораторных условиях на базе Научно-практического центра НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству по методическим указаниям, разработанным в центре [6].

Результаты и их обсуждение. В результате проведения агробактериальной трансформации отобрано 120 регенерантов растений картофеля, трансформированных векторной конструкцией pBI-L-GOX, и 80 регенерантов, трансформированных векторной конструкцией pBI-F-GOX, уко-ренившихся на среде с селективным агентом канамицином. Однако следует отметить, что не все



Беларуси

17

отобранные на селективной среде регенеранты могут нести в своем геноме трансгенную встав-ку, поэтому отбор необходимо проводить с помощью дополнительных молекулярно-генетиче-ских и биохимических исследований.

Отбор регенерантов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и мультиплекс-ПЦР. ПЦР-анализ ДНК, отобранных на канамицине, регенерантов проводили с использованием прай-меров, специфичных к нуклеотидной последовательности гена gox и образующих фрагмент дли-ной 811 п. н., что позволяет определить присутствие целевого гена.

Поскольку в ряде случаев может осуществляться неполный перенос трансгенной вставки, подобрана пара праймеров для определения наличия последовательности nos-терминатора, ге-нерирующая фрагмент 180 п. н. Использование данной пары праймеров с праймерами к гену gox позволяет подтвердить полноту переноса целевой вставки.

Для контроля качества выделенной ДНК и прохождения ПЦР-реакции подобраны праймеры для детекции контрольного резидентного гена actin, генерирующие фрагмент 550 п. н., который экспрессируется во всех растениях картофеля и может быть использован как положительный эндогенный контроль.

Поскольку устойчивость к селективному агенту у трансген-позитивных растений может обуславливаться не только совершившимся актом трансформации, но и присутствием в сосуди-стой системе растений агробактериальных клеток, экспрессирующих ген селективного маркера, растения, используемые для дальнейших экспериментов, тестировали методом ПЦР-анализа ДНК с праймерами, специфичными к агробактериальному гену VirE2 [7], генерирующими фраг-мент длиной 620 п. н. Отсутствие продукта амплификации VirE2 свидетельствует об отсутствии агробактерий в проводящих путях растений.

Для проведения более качественного и быстрого анализа регенерантов разработана система мультиплекс-ПЦР с четырь-мя парами праймеров (gox, actin, nos-терминатор, VirE2) (рис. 1).

Таким образом, в результате проведения одной реакции мультиплекс-ПЦР можно определить наличие и целостность вставки целевого фрагмента и отсутствие агробактериально-го заражения растений.

Анализ транскрипционной активности методом ОТ-ПЦР. Подтверждение факта транскрипции целевого гена осущест-влялось методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). В некоторых случаях сигнал транскрипта глюкозооксидазы от-сутствовал, что может свидетельствовать о проявлении фено-мена сайленсинга, или «замолкания» трансгена.

Определение глюкозооксидазной активности. Для дока-зательства того, что в трансгенных растениях картофеля и табака эффективно синтезируется рекомбинантный белок, проведен чашечный тест для определения глюкозооксидаз-ной активности [4]. Данный тест является наиболее объек-тивным и качественным по сравнению с ПЦР-анализом, по-скольку позволяет провести эффективный отбор лишь тех растений, в которых происходит синтез глюкозооксидазы. Так же по интенсивности окрашивания можно судить об уровне синтеза фермента глюкозооксидазы (рис. 2).

Исходя из полученных данных, можно предположить, что уровень синтеза целевого фермента у линий 1 и 2 значи-тельно выше, чем у линии 3, так как они образуют более ин-тенсивное окрашивание. Контрольные образцы не образуют окрашивания вовсе.

Следует отметить, что данный чашечный тест позволяет проводить отбор трансгенных линий с наивысшим уровнем

Рис. 1. Электрофоретическое разделе-ние продуктов мультиплекс-ПЦР ДНК трансгенного растения картофеля: 1 – маркер молекулярного веса, 2 – продук-

ты амплификации

Рис. 2. Определение активности глюко-зооксидазы чашечным тестом. 1–3 – ли-стовые диски трансгенных растений картофеля, 4 – листовые диски картофе-

ля исходного сорта



Беларуси

18

экспрессии гена глюкозооксидазы без использования других молекулярно-генетических методов, что позволяет значи-тельно сократить расход материалов и время проведения ис-следования.

Нативный электрофорез белков. Синтез функционально активного фермента глюкозооксидазы в трансгенных расте-ниях определен с помощью проведения нативного электро-фореза белковых экстрактов в полиакриламидном геле. В ходе эксперимента можно визуализировать целевой фер-мент, который проявляет глюкозооксидазную активность. Так же по интенсивности окрашивания белковых фрагментов можно судить о количестве синтеза фермента глюкозоокси-дазы. Линии 1 и 2, используемые в предыдущем эксперимен-те, показали более интенсивное окрашивание, чем линия 3. В исходном сорте данный белок не детектирован.

Детекция пероксида водорода в растительных тканях. Детектировать пероксид водорода в растительных тканях позволяет 3,3-диаминобензидин, образуя коричневое окрашивание, в присутствии пероксида водорода. У исходного сорта происходит лишь незначительное окра-шивание растительных тканей, а у трансгенных образцов – массивное окрашивание тканей, что свидетельствует о повышенном содержании пероксида водорода по сравнению с контрольными образцами (рис. 3).

В результате проведенных биохимических исследований отобраны 53 линии растений карто-феля, трансформированных вектором pBI-L-GOX, и 24 линии растений картофеля, трансформи-рованных вектором pBI-F-GOX, что составляет 44 и 30 % среди отобранных на канамицине рас-тений.

Оценка устойчивости растений картофеля к фитофторозу методом отделенных листьев. Оценка устойчивости трансгенных образцов картофеля к фитофторозу методом отдельных ли-стьев вычисляли по шкале от 1 балла (очень низкая устойчивость) до 9 баллов (очень высокая устойчивость). Среди 87 образцов трансгенных растений был выявлен 1 образец (1,1 %) с высо-кой устойчивостью (8 баллов), 16 образцов (18,4%) с относительно высокой устойчивостью (7 баллов), 28 образцов (32,2 %) со средней устойчивостью (5 баллов). Нетрансгенные растения кар-тофеля сорта Скарб характеризуются низкой устойчивостью (3 балла). Результаты представлены в таблице.

Оценка устойчивости трансгенных растений картофеля к заболеванию фитофторозом

Интенсивность спороношения Степень устойчивости Балл устойчивости Количество линий

Отсутствие спороношения Очень высокая 9 -Единичные конидиеносцы Высокая 8 1 (1,1 %)Спороношение занимает до 25 % площади листа Относительно высокая 7 15 (17,2 %)

Спороношение занимает 25–50 % площади листа Средняя 5 28 (32,2 %)

Спороношение занимает 50–75 % площади листа Низкая 3

12 (13,8 %)5 (100 %)

контрольные растения сорта СкарбСпороношение занимает более 75 % площади листа Очень низкая 1 31 (35,6 %)

Исходя из полученного результата, отобрано 16 наиболее перспективных линий, характери-зующихся относительно высокой и высокой устойчивостью к Phytophtora infestans.

Оценка устойчивости растений картофеля к заболеванию черная ножка. В ходе проведен-ного эксперимента была выявлена 1 трансгенная линия, показавшая относительно высокую устойчивость к фитопатогену Erwinia carotovora. Остальные линии показали среднюю устойчи-вость, как и исходный сорт.

Рис. 3. Детекция пероксида водорода в растительных тканях растений таба-ка. Слева – трансгенное растение, спра-

ва – исходный сорт



Беларуси

Заключение. Тестирование методом ПЦР регенерантов растений картофеля, полученных в результате агробактериальной трансформации с векторными конструкциями pBI-L-GOX и pBI-F-GOX, показало присутствие в геноме целостной трансгенной инсерции. Отсутствие про-дукта амплификации VirE2 гена свидетельствует об отсутствии агробактерии в проводящих пу-тях исследуемых растений и подтверждает достоверность результатов, полученных в ходе про-ведения молекулярно-генетических исследований.

С помощью биохимического теста проведен эффективный отбор трансгенных растений, экс-прессирующих ген глюкозооксидазу, и исключены растения, в которых имеется трансгенная вставка, но синтеза целевого фермента не происходит. Показано, что только 44 и 30 % среди ото-бранных на канамицине растений с векторными конструкциями pBI-L-GOX и pBI-F-GOX соот-ветственно эффективно синтезируют фермент глюкозооксидазу. Можно заключить, что биохи-мический тест является наиболее оптимальным решением для первичного отбора трансгенных растений и позволяет исключить проведение дополнительных молекулярно-генети

e Z jcsl.bas-net.by/xfile/v_bio/2012/4/l6nqq1.pdf · Вашкевич И. И., Мартинович...

Documents

Transcript of e Z jcsl.bas-net.by/xfile/v_bio/2012/4/l6nqq1.pdf · Вашкевич И. И., Мартинович...