De invloed van klimaatverandering op de schadelijke ... · Academiejaar 2010 – 2011 De invloed...

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2010 – 2011

De invloed van klimaatverandering op de schadelijke effecten van chemische stoffen in aquatische milieus: gevolgen van

hypoxia en cyanobacteriën

Jeroen Baele Promotor: Prof. dr. ir. Karel De Schamphelaere Tutor: ir. Dieter De Coninck

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: milieutechnologie

De auteurs en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen

en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik.

Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking

tot de verplichting de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.

Gent, Juni 2011

De promotor De tutor De auteur Prof. dr. ir. Karel De Schamphelaere Dieter De Coninck Jeroen Baele

Woord Vooraf Het proefstuk van mijn bio-ingenieur opleiding was ongetwijfeld deze thesis tot een goed einde te

brengen. De wetenschappelijke kennis en inzicht vergaard gedurende de vijfjarige opleiding is een

eerste vereiste voor het welslagen ervan. Maar met alleen kennis en inzicht is de opdracht

onmogelijk. De steun, feedback en expertise van de mensen rondom mij hebben deze thesis

gemaakt. Een woord van dank is hier dan ook heel gepast.

Op de eerste plaats wil ik Prof. dr. ir. Karel De Schamphelaere bedanken om te mogen deel uitmaken

van zijn onderzoek. Uw wetenschappelijke kennis en ervaring stuurden mijn onderzoek op tijd bij om

zo de meest kwalitatieve resultaten te kunnen rapporteren die hopelijk voor u en uw

onderzoeksgroep een meerwaarde mogen betekenen.

Ir. Dieter De Coninck is ongetwijfeld de persoon die het dichtst bij mijn thesis stond. Uw

gedrevenheid, nauwkeurigheid en opmerkzaamheid waren mijn grootste inspiratiebron. Dankzij uw

toewijding en continue bereikbaarheid heb ik voor alle aspecten van de thesis de nodige motivering

en feedback gekregen. Ik wens u veel succes bij het beëindigen van uw doctoraat.

Het labowerk vormt de basis van deze thesis en bij deze wil ik alle personeel van het CMS bedanken,

in het bijzonder Nancy, Emmy, Leen, Gisèle en Mark. Hun technische kennis, optimisme en goede

werksfeer maakten het labowerk ook op de soms zeer drukke momenten aangenaam.

Ook een speciaal woord van dank aan ir. Jana Asselman wie altijd bereid was te helpen bij labowerk,

literatuurdiscussies en resultatenverwerking, alsook ing. Stefan Hoffman voor tips en advies bij het

schrijven.

Niet alleen voor mijn thesis maar doorheen mijn hele bio-ingenieur carrière heb ik op veel steun

kunnen rekenen van mijn moeder, vader en zus. Hun begrip, geduld en relativeringsvermogen zijn

onuitputbaar en waren onmisbaar om deze opleiding tot een goed einde te brengen.

Last but not least wil ik mijn vriendin Els bedanken die bij goede en slechte dagen altijd als eerste

paraat stond om mij te steunen. Alsook mijn vrienden van het boerekot die allen voor dezelfde

opdracht stonden en deze hopelijk ook tot een goed einde mogen brengen.

I

Lijst van afkortingen

AHA Artifical Humic Acid

BLM Biotisch Ligand Model

BOD Biochemical Oxygen Demand

DEB Dynamic Energy Budget

df Degrees of Freedom

DOC Dissolved Organic Carbon

ERA Environmental Risk Assessment

GLM General Linear Model

IPCC Intergovernmental Panel on Climate Change

𝑙𝑥 Leeftijdsspecifieke overleving

M Molair

MS Mean Square

𝑚𝑥 Reproductie gemeten op dag x

OECD Organisation for Economic Co-operation and Development

ROS Reactive Oxygen Species

Ro Netto reproductiesnelheid

Rm Intrinsieke reproductiesnelheid

rpm Rotaties Per Minuut

T Gemiddelde generatie tijd

TAM Totale Alkaliniteit tot omslag van Methylrood of Methyloranje

TOC Total Organic Carbon

Vit Vitamine

II

http://en.wikipedia.org/wiki/Organisation_for_Economic_Co-operation_and_Development

Samenvatting

Om de klassieke ecotoxicologie uit te breiden naar een meer accurate risicoschatting en –evaluatie is

er nood naar onderzoek over cotolerantie of cost-of-tolerance van organismen voor bepaalde

stressoren. Door de alsmaar grotere effecten ten gevolge van de klimaatverandering op aquatische

ecosystemen dient dit onderzoek zich voornamelijk te richten op de stressoren die een direct of

indirect effect zijn van deze klimaatverandering. In eerder onderzoek werd uit de historische

adaptatie van bepaalde Daphnia pulex klonen voor cadmiumstress reeds dergelijke cotolerantie voor

Microcystis aeruginosa gevonden (De Schamphelaere et al., 2010; Glaholt et al.,2010). In deze thesis

werd verder gezocht naar cotoleranties voor hypoxiastress en Microcystis aeruginosa-stress voor

Daphnia sp. klonen.

Het onderzoek gebeurde met twee testgroepen Daphnia sp.. Een eerste testgroep bestond uit 20

Daphnia magna klonen afkomstig uit verschillende populaties welke nog nooit blootgesteld werden

aan metaaldruk. De verhoogde tolerantie van bepaalde D. magna klonen voor metaaldruk is in dit

geval enkel te wijten aan de natuurlijk aanwezige genetische variatie binnen de populatie (standing

genetic variation). Een tweede testgroep is opgebouwd uit 18 Daphnia pulex klonen afkomstig uit

populaties uit 2 verschillende regio’s in Ontario (Canada). Een eerste regio, de Sudbury regio, staat

gekend om zijn jarenlange milieuvervuiling ten gevolge van metaal smeltindustrie. De klonen

afkomstig uit deze Sudbury regio vertonen een hogere cadmiumtolerantie dan de klonen uit meren

die verder van de smeltindustrie gelegen zijn, met name uit de Dorset regio. Uit genetisch onderzoek

bleek een grote genetische variatie tussen de Daphnia pulex klonen uit beide regio’s.

Uit de resultaten van de hypoxiatest met D. magna bleek geen correlatie tussen de hypoxia- en

cadmiumtolerantie. Uit de hypoxiatest met D. pulex werd bij de geadapteerde klonen voor de

parameter lengte geen significant effect van hypoxiastress waargenomen in tegenstelling tot de niet-

geadapteerde waar wel een effect werd waargenomen. De historische cadmiumadaptatie bij D. pulex

zou hierbij een invloed kunnen hebben op de tolerantie voor hypoxiastress op de lichaamslengte.

Een mogelijke cotolerantie voor hypoxiastress uit de reeds verworven cadmiumtolerantie zou aan de

basis kunnen liggen voor deze effecten op groei. Uit de resultaten van de cadmium-M. aeruginosa

test voor D. magna klonen bleek geen significante correlatie tussen cadmiumtolerantie en M.

aeruginosa-tolerantie. Voor D. magna werd net zoals bij de hypoxiatest geen cotolerantie gevonden

tussen beide stressoren. Uit de hypoxia en cadmium-M. aeruginosa testen blijkt de historische

cadmiumadaptatie van de D. pulex klonen hen in staat te stellen om hogere toleranties te vertonen

voor andere stressoren. In tegenstelling tot de D. magna klonen, waarbij geen onderscheid bestaat

tussen geadapteerde of niet-geadapteerde klonen maar de tolerantie voortkomt uit de aanwezige

standing genetic variation onder de populatie, werd voor zowel hypoxia- als Microcystis aeruginosa-

stress geen cotolerantie waargenomen.

III

Inhoudsopgave

1 Inleiding ......................................................................................................................................1

2 Literatuurstudie ..........................................................................................................................2

2.1 Ecotoxicologie en klimaatverandering .................................................................................2

2.1.1 Ecotoxicologie ..............................................................................................................2

2.1.2 Klimaatverandering .........................................................................................................3

2.1.3 Interactie tussen ecotoxicologie en klimaatverandering ...............................................3

2.2 Daphnia sp. .........................................................................................................................4

2.2.1 Inleiding .......................................................................................................................4

2.2.2 Fysiologie .....................................................................................................................5

2.2.3 Reproductie .................................................................................................................6

2.2.4 Daphnia sp. als modelorganisme ..................................................................................7

2.3 Stressoren : hypoxia, cyanobacteriën en cadmium...............................................................8

2.3.1 Inleiding .......................................................................................................................8

2.3.2 Hypoxia........................................................................................................................8

2.3.2.1 Inleiding: de invloed van de klimaatverandering op het zuurstofgehalte .....................8

2.3.2.2 Effecten op en aanpassingen van Daphnia ................................................................ 11

2.3.2.2.1 Morfo-fysiologische aanpassingen ......................................................................... 11

2.3.2.2.2 Regulatorische aanpassingen ................................................................................. 13

2.3.2.2.3 Metabolische aanpassingen ................................................................................... 13

2.3.3 Cadmium ................................................................................................................... 13

2.3.3.1 Speciatie en biobeschikbaarheid ............................................................................... 13


2.3.4 Cyanobacteriën .......................................................................................................... 15

2.3.4.1 Inleiding .................................................................................................................... 15


2.3.4.3 Gecombineerde effect cadmium en M. aeruginosa ................................................... 17

3 Materiaal en methoden ............................................................................................................ 18

3.1 Herkomst klonen ............................................................................................................... 18

3.1.1 Daphnia magna klonen .............................................................................................. 18

3.1.2 Daphnia pulex klonen ................................................................................................ 18

3.2 Fluctuatietest .................................................................................................................... 19

3.2.1 Testopzet ................................................................................................................... 19

3.2.2 Testmedium: aangerijkt carbongefilterd water........................................................... 19

3.2.3 Experimentele uitvoering ........................................................................................... 20

3.2.4 Algenkweek ............................................................................................................... 21

3.3 Hypoxiatesten ................................................................................................................... 22

IV

3.3.1 Hypoxiatest met Daphnia magna ............................................................................... 23

3.3.2 Hypoxiatest met Daphnia pulex ................................................................................. 23

3.4 Cadmium-M. aeruginosa test............................................................................................. 25

3.4.1 Testopzet ................................................................................................................... 25

3.4.2 Kweek van Microcystis aeruginosa ............................................................................. 25

3.4.3 Testmedium: modified M4-medium en modified M4-medium + Cd........................... 26

3.4.4 Experimentele uitvoering ........................................................................................... 26

3.5 Verwerking van de resultaten ............................................................................................ 27

3.5.1 Hypoxiatest Daphnia magna ...................................................................................... 28

3.5.2 Hypoxiatest Daphnia pulex......................................................................................... 29

3.5.3 Cadmium-M. aeruginosa test ..................................................................................... 30

4 Resultaten en Discussie ............................................................................................................. 32

4.1 Hypoxiatest met Daphnia magna....................................................................................... 32

4.1.1 Correlatie cadmium-hypoxia tolerantie ...................................................................... 32

4.1.2 Interpretatie van de fysiologische parameters ........................................................... 35

4.1.2.1 Lengte ....................................................................................................................... 35

4.1.2.2 Reproductie .............................................................................................................. 38

4.1.2.3 Mortaliteit ................................................................................................................ 39

4.2 Hypoxiatest met Daphnia pulex ......................................................................................... 41

4.2.1 Controle batch-effect ................................................................................................. 41

4.2.2 Interpretatie van de fysiologische parameters ........................................................... 41

4.2.2.1 Lengte ....................................................................................................................... 42

4.2.2.2 Reproductie .............................................................................................................. 45

4.2.2.3 Mortaliteit ................................................................................................................ 47

4.3 Cadmium-M. aeruginosa Test ............................................................................................ 49

4.3.1 Correlatie van de toleranties ...................................................................................... 49

4.3.2 Interpretatie van de parameters ................................................................................ 50

4.3.2.1 Lengte ....................................................................................................................... 50

4.3.2.2 Reproductie .............................................................................................................. 54

4.3.2.3 Mortaliteit ................................................................................................................ 62

4 Conclusies ................................................................................................................................. 64

5 Verder onderzoek ..................................................................................................................... 66

6 Referentielijst............................................................................................................................ 68

7 Bijlagen ..................................................................................................................................... 74

A. Cadmium-M. aeruginosa Test : resultaten Unequal N HSD post hoc test voor interactie-effect “Kloon(Batch)*Behandeling” voor Lengte ..................................................................................... 74

B. Cadmium-M. aeruginosa Test : resultaten Unequal N HSD post hoc test voor interactie-effect “Kloon(Batch)*Behandeling” voor Reproductie. ............................................................................ 76

V

1

1 Inleiding In het vakdomein van de ecotoxicologie bestuderen wetenschappers het effect van schadelijke

substanties op het ecosysteem. Dit onderzoek levert zo de wetenschappelijke basis voor

risicoschatting en –evaluatie. Maar in de klassieke ecotoxicologie wordt meestal onderzoek gemaakt

met populaties die weinig genetische variatie vertonen en ontbreekt onderzoek naar

langetermijneffecten. Deze klassieke aanpak kan leiden tot foutieve risicoschatting en –evaluatie

omdat in de natuur populaties wel genetische variatie hebben en gedurende meerdere generaties

kunnen blootgesteld zijn aan verschillende stressoren. Deze twee kenmerken stellen natuurlijke

populaties in staat om zich genetisch te adapteren. Als gevolg van deze adaptatie kunnen populaties

cotolerantie of cost-of-tolerance ontwikkelen voor nieuwe stressoren. Deze stressoren kunnen zowel

van natuurlijke als antropogene oorsprong zijn. Sinds het industriële tijdperk is vooral de

antropogene vervuiling een groeiend probleem. Bovendien zal de klimaatverandering ook een effect

uitoefenen op de toxiciteit van de antropogene vervuiling, wat belangrijke implicaties zou hebben

naar risico-evaluatie. In de wetenschappelijke literatuur is nog niet veel gekend rond deze

cotolerantie of cost-of-tolerance. Vandaar dat deze thesis gericht is tot het bijdragen aan inzicht in

deze problematiek.

Het onderzoek in deze thesis richtte zich vooreerst op de vraag of er een cotolerantie of cost-of-

tolerance optrad tussen de chemische stressor cadmium en de twee natuurlijke stressoren hypoxia

en cyanobacteriën in aquatische ecosystemen bij Daphnia sp.. Deze twee natuurlijke stressoren zijn

beide een indirect effect van de klimaatopwarming.

Het onderzoek gebeurde met twee testgroepen Daphnia sp.. Een eerste testgroep bestond uit 20

Daphnia magna klonen afkomstig uit verschillende Belgische natuurlijke populaties welke nog nooit

blootgesteld werden aan metaaldruk. De verhoogde tolerantie van bepaalde D. magna klonen voor

metaaldruk is enkel te wijten aan de natuurlijk aanwezige genetische variatie binnen de populaties.

Een tweede testgroep was opgebouwd uit 18 Daphnia pulex klonen afkomstig uit verschillende

populaties in Ontario (Canada). Een eerste groep populaties was afkomstig uit de Sudbury regio

welke gekend staat om zijn jarenlange milieuvervuiling ten gevolge van metaal smeltindustrie. De

klonen afkomstig uit deze Sudbury regio vertonen een hogere cadmiumtolerantie dan de klonen uit

de populaties uit meren die verder van de smeltindustrie gelegen zijn, met name uit de Dorset regio.

Uit genetisch onderzoek bleek een grote genetische variatie tussen de Daphnia pulex klonen uit

beide regio’s. Een tweede onderzoeksvraag richt zich op de mogelijk verschillende reactie tussen de

adaptatie bij D. pulex klonen en de standing genetic variation bij D. magna klonen.

2

2 Literatuurstudie

2.1 Ecotoxicologie en klimaatverandering

2.1.1 Ecotoxicologie

De ecotoxicologie is een relatief jonge tak van de exacte wetenschappen en wordt hierdoor nog op

vele verschillende manieren gedefinieerd. De vroegste definitie wordt door Rand in 1955 gegeven als

de wetenschap die de toxische effecten van chemische en fysische agentia op levende organismen

onderzoekt en, in het bijzonder, op populaties en gemeenschappen in gedefinieerde ecosystemen.

Meer recent werden nog een aantal andere definities gegeven door Newman en Unger in 2003 als de

wetenschap van verontreinigingen in de biosfeer en het effect ervan op de verschillende facetten van

deze biosfeer, waar de mens deel van uitmaakt. Ecotoxicologie werd meer recent gedefinieerd als de

studie van de schadelijke effecten van chemische agentia die in de onmiddellijke omgeving van een

organisme voorkomen en waaraan het organisme derhalve wordt blootgesteld (Van den Heede,

2008). Alhoewel tussen al deze definities subtiele verschillen bestaan, blijkt wel duidelijk dat

ecotoxicologie het resultaat is van de interactie tussen drie verschillende wetenschapstakken, met

name de chemie, de ecologie en de toxicologie. De onderlinge verwantschap tussen deze takken

wordt schematisch weergegeven in Figuur 2.1. Één van de belangrijkste toepassingen van de

ecotoxicologische wetenschap is de risico-evaluatie (ERA, ‘Environmental Risk Assessment’), waarin

nagegaan wordt of een bepaalde contaminant al dan niet een risico vormt voor het onderzochte

ecosysteem.

Figuur 2.1 : Ecotoxicologie als resultaat van de interactie tussen drie

wetenschapstakken (Van Leeuwen & Hermens, 1995)

3

2.1.2 Klimaatverandering

Sinds de Industriële Revolutie (eind 18de eeuw, begin 19de eeuw) wordt er een significante toename

van broeikasgassen in onze atmosfeer waargenomen, die voor een gemiddelde temperatuursstijging

van 0.74 °C heeft gezorgd (IPCC, 2007). De gevolgen van deze temperatuurstoename zijn zeer divers,

o.a. zeespiegelstijgingen en toenemende overstromingen, toenemende droogte en afname in

landbouwproductiviteit, snellere ziekteverspreidingen, afname van de biodiversiteit,

drinkwatertekort, verzuring van het zeewater, afname van de dikte van de ozonlaag, terugtrekken

van gletsjers, verandering in precipitatiepatronen, … (IPCC, 2007; Nature, 2002). Uit voorgaande

opsomming mag blijken dat er zowel economische, sociale als ecologische gevolgen verbonden zijn

aan klimaatverandering.

2.1.3 Interactie tussen ecotoxicologie en klimaatverandering

In dit onderzoek wordt getest of bepaalde natuurlijke stressoren die een gevolg zijn van

klimaatverandering een effect hebben op de toxiciteit van chemische stoffen, meerbepaald

cadmium. Ten gevolge van de klimaatverandering kunnen de stressfactoren hypoxia en Microcystis

aeruginosa een cotolerantie (cross-tolerance) of cost-of-tolerance voor toxiciteit van cadmium bij

Dapnia sp. met zich meebrengen. Als de populatie wordt blootgesteld aan chemische verontreiniging

zullen bij cost-of-tolerance de allelfrequenties veranderen en zal de genetische variabiliteit binnen de

populatie afnemen (genetic erosion) (De Schamphelaere et al., 2001). Er is met andere woorden een

daling in de kans op een resistente gencombinatie na seksuele voortplanting. In tegenstelling tot

cotolerantie zal bij cost-of-tolerance de adaptatie aan de stressconditie een kost met zich

meebrengen. Adaptatieprocessen zoals eliminatie of detoxificatie van de toxicanten vergt energie.

Het gevolg van deze energieallocatie is dat andere levensfuncties aan energie moeten inboeten, zoals

bijvoorbeeld groei of reproductie (Heugens et al., 2001).

De multidisciplinaire problematiek wordt in deze thesis beperkt tot de ecologische respons op

klimaatverandering, met name de invloed van de klimaatverandering op de schadelijkheid van

chemische stoffen in aquatische milieus. De gevolgen van de opwarming van de aarde die van belang

zijn voor deze ecotoxicologische risico-evaluatie beperken zich tot opwarming van en lagere

zuurstofconcentratie in aquatische ecosystemen en een toenemende algenbloei. Het onderzoek van

deze thesis spitst zich toe op de invloed van hypoxia en cyanobacteriën op de tolerantie van Daphnia

voor cadmium.

4

2.2 Daphnia sp.

2.2.1 Inleiding

Daphnia sp. (Figuur 2.2) is een veel voorkomend planktonisch zoetwaterorganisme (Classificatie:

Tabel 2.1). Plankton kan gedefinieerd worden als het geheel van levende én zwevende organismen in

water (Tirry, 2007). Met levend wordt het plantaardig (fytoplankton) of, in het geval van Daphnia sp.,

dierlijk (zoöplankton) karakter bedoeld. Zwevend wordt beschouwd als het niet kunnen

voortbewegen tegen de waterstroming in (Koivisto, 1995). Alhoewel Daphnia soorten wel beschikken

over een eigen voortbewegingsmechanisme, nl. de roeiantennen, kunnen ze niet tegen de

waterstroming in bewegen vermits deze antennen hiervoor niet krachtig genoeg zijn. De

voortbeweging is sprongsgewijs waaraan deze organismen hun Nederlandstalige benaming

‘watervlo’ te danken hebben.

Figuur 2.2 A Daphnia magna, B Daphnia pulex (Sciencephoto, 2011)

Tabel 2.1 Classificatie van Daphnia sp. (Tirry, 2007)

Rijk Animalia

Fylumgroep Articulata

Fylum Arthropoda

Subfylum Crustacea

Classis Branchiopoda

Ordo Diplostraca

Subordo Cladocera

Familie Daphniidae

Genus Daphnia

A B

5

2.2.2 Fysiologie

De Arthropoda, het fylum waartoe Daphnia sp. behoort, worden gekenmerkt door een exoskelet,

heteronome segmentatie en gelede extremiteiten. Bij Daphnia sp. is dit exoskelet een tweekleppige

carapax rond de thorax en abdomen. Het cephalon (de kop) blijft vrij, zodat de segmentatie herleid is

tot kop en romp. De twee kleppen van de carapax zijn dorsaal vergroeid (de kiel) en lopen onderaan

uit op de schaalstekel of spina caudalis (Figuur 2.3). De vorm en lengte van deze schaalstekel is één

van de criteria om verschillende Daphnia species van elkaar te kunnen onderscheiden (Lampert,

2006). De carapax is onelastisch en heeft een beschermende functie. Deze inelasticiteit heeft tot

gevolg dat tijdens de groei een regelmatige vervelling (ecdysis) noodzakelijk is (O’Brien et al., 1991).

Watervlooien zijn filtervoeders, ze moeten hun voedsel uit de watermassa filteren en naar de

mondopening brengen. Het voedsel bestaat voornamelijk uit wieren, ééncelligen, bacteriën en

afvaldeeltjes van rottende planten. Door het op en neer slaan met de thoracopoden wordt binnen de

schaal een waterstroming opgewekt die voedseldeeltjes aanvoert (Lavens & Sorgeloos, 1996). Deze

deeltjes worden met behulp van de borstelkammen (tientallen lange evenwijdige haren op het derde

en vierde paar thoracopoden, zie Figuur 2.3) verzameld in een voedselgroeve tussen de

thoracopoden. Vanuit de voedselgroeve worden de deeltjes naar de mondopening getransporteerd.

Voor het voedsel in de spijsverteringsbuis opgenomen wordt, wordt het gemalen en verfijnd door de

mandibulae (bovenkaken). Het filterapparaat van watervlooien is enkel selectief naar grootte: het

neemt alle deeltjes groter dan 0.45 µm op die uit de watermassa kunnen gefilterd worden (Gillis et

al., 2005). Door deze aselecte voedselopname zullen, bij aanwezigheid, ook toxine producerende

algen mee opgenomen worden. Zoals reeds vermeld wordt in dit onderzoek getest naar de invloed

van cyanobacteriën op de cotolerantie of cost-of-tolerance voor toxiciteit van cadmium bij Daphnia.

Bij het toedienen van een toxine producerende cyanobacterie als voedselbron kunnen waargenomen

veranderingen in reproductie, groei en mortaliteit toegeschreven worden aan het effect van de

opname van dit toxine door de aselecte voedselopname door Daphnia.

Omdat het onderzoek in deze thesis zich o.a. toespitst op het effect van hypoxia, is het aangewezen

de fysiologie van de ademhaling en bloedsomloop van Daphnia sp. te bespreken. De ademhaling

gebeurt door het deel van de lichaamswand dat niet door de carapax bedekt is. Hier is de diffusie van

O2 en CO2 mogelijk. Er zijn echter ook gespecialiseerde ademhalingsstructuren aanwezig, de

kieuwblazen of kieuwzakjes, gelegen op de thoracopoden. Ter hoogte van deze kieuwblazen is de

cuticula zeer dun zodat zuurstofopname gemakkelijker wordt. De zuurstof wordt getransporteerd

door middel van hemoglobine in het bloed (Tirry, 2007). De bloedsomloop is zeer eenvoudig, er is

geen aderstelsel maar het bloed circuleert wel volgens een bepaald patroon door de lichaamsholte.

6

Via twee ostia (inlaatkleppen) komt het bloed het hart binnen en wordt via de aorta weer naar

buiten gepompt. Enkel ter hoogte van het hart en de aorta zit het bloed dus opgeborgen.

2.2.3 Reproductie

Daphnia sp. planten zich voort via zogenaamde cyclische parthenogenese, dit houdt in dat de

reproductie zowel seksueel als parthenogenetisch (aseksueel) kan verlopen. Bij gunstige

omstandigheden planten de watervlooien zich parthenogenetisch voort. De wijfjes ontwikkelen

onbevruchte eitjes (zomereitjes) waaruit genetisch identieke wijfjes voortkomen welke op hun beurt

weer onbevruchte eitjes produceren. Het duurt gemiddeld twee à drie dagen voor de ontwikkeling

van een nieuw broedsel. Het eerste broedsel wordt gemiddeld na zeven tot tien dagen afgelegd.

1 Roeiantenne 2 Leverhoorntjes 3 Spieren van roeiantenne 4 Darm 5 Mandibula 6 Maxillaklier 7 Hart 8 Kiel 9 Broedruimte 10 Ovarium 11 Embryo 12 Uitgroeiing rug 13 Schaalstekel 14 Staartharen 15 Postabdomen 16 Einddarm 17 Anus 18 Eindstekels 19 Thoracopood IV 20 Kieuwzakje 21 Borstelkam 22 Thoracopood I 23 Mondopening 24 Voordarm 25 Eerste paar antennen 26 Snavel 27 Ocellus 28 Hersenen 29 Complexoog

Figuur 2.3 Algemeen overzicht anatomie en fysiologie van Daphnia sp. (Thirry, 2007)

7

Door deze aseksuele voortplanting is de generatietijd heel kort en kan de omvang van de populatie

snel toenemen (Hughes, 1983).

Echter wanneer de omstandigheden ongunstiger worden door bv. lagere temperaturen,

voedselgebrek, uitdroging, te hoge populatiedichtheden of veranderingen in fotoperiode, en het

voortbestaan van de populatie wordt bedreigd, zal de reproductie omschakelen en seksueel

gebeuren (Kleiven et al., 1992). Via parthenogenese zullen door de ongunstige omstandigheden nu

ook mannetjes ontstaan. De vrouwtje ontwikkelen haploïde eitjes (wintereitjes of rusteitjes) die door

de mannetjes bevrucht worden. Op deze manier is er recombinatie van het genetisch materiaal. Via

afscheidingen door de broedkamerwand worden de rusteieren omgeven door een dik beschermend

kapsel, het ephippium (Zaffagnini, 1987). Bij de volgende vervelling van het moederdier komt dit

ephippium los en zakt naar de bodem van de watermassa. Het ephippium weerstaat vorst, uitdroging

en verteringsenzymen. Bij verbetering van de omstandigheden beginnen de rusteieren te

ontwikkelen en ontluiken opnieuw parthenogenetisch reproducerende wijfjes.

2.2.4 Daphnia sp. als modelorganisme

Daphnia sp. hebben een groot geografisch verspreidingsgebied en komen voor in bijna alle

zoetwaterecosystemen, zoals plassen, vijvers, poelen, sloten, oeverbochten en zijarmen van rivieren

(Hebert, 1978). Daphnia sp. vormen een onmisbare schakel in de zoetwatervoedselketen:

tegelijkertijd zijn ze grazers van algen en prooien voor hogere predatoren, zoals vissen (Lampert,

2006). Omwille van deze belangrijke positie in de voedselketen is de watervlo een belangrijke bio-

indicator voor de ecologische kwaliteit van aquatische systemen. Door de korte generatietijd van

watervlooien (5-10 dagen) is onderzoek naar adaptatie en acclimatisatie in korte tijdsperiodes

mogelijk. Bovendien ontwikkelen de wijfjes genetisch identieke nakomelingen wat van Daphnia sp.

ideale testorganismen maakt (Mark & Solbé, 1998). Door hun hoge gevoeligheid voor stress vanuit

het milieu en gemakkelijke handelbaarheid in het labo wordt wereldwijd het genus Daphnia gebruikt

voor toxiciteitstesten. In dit onderzoek worden twee verschillende soorten Daphnia gebruikt: D.

magna, de Europese watervlo en D. pulex, de Amerikaanse watervlo.

8

2.3 Stressoren : hypoxia, cyanobacteriën en cadmium

2.3.1 Inleiding

Vooreerst dient een onderscheid gemaakt te worden tussen stress en stressor. Een stressor is een

externe factor, zoals hypoxia of cadmium, die een verandering teweeg brengt in de interne toestand

van een organisme (Grime, 1989). Indien deze interne verandering het organisme buiten zijn

ecologische niche brengt, dan is het organisme niet langer in staat te groeien of te reproduceren. Het

organisme kan wel nog overleven, maar bevindt zich in een stresstoestand. Stress is dus een relatief

begrip en dient vergeleken te worden ten opzichte van een referentietoestand, ‘normale’ toestand

(Van Straalen, 2003). Figuur 2.4 verduidelijkt het begrip stress in de nichecontext.

Figuur 2.4 Stress in de nichecontext (Van Straalen, 2003)

2.3.2 Hypoxia

2.3.2.1 Inleiding: de invloed van de klimaatverandering op het zuurstofgehalte

Door de klimaatverandering steeg de globale luchttemperatuur met 0.74°C (IPCC, 2007). Maar de

klimaatverandering heeft ook een effect op de temperatuur van het oppervlaktewater. Dit wordt

voor meren en rivieren bevestigd door metingen en modelstudies (Gooseff et al. 2005; Livingstone,

2003; Schindler et al., 1996). Er is een sterk lineair verband tussen water- en luchttemperatuur.

Figuur 2.5 toont deze positieve correlatie voor weekgemiddelden van de water- en luchttemperatuur

in de Devon rivier (Groot-Brittannië) welke elk uur gemeten werden gedurende 1 jaar. De data zijn

Op de abscis wordt de sterkte van de aangelegde stressor weergegeven. Op de ordinaat de invloed

van de stressor op de prestatie van het organisme. De ecologische niche van organisme is het gebied

onder de volle curve. Bij stress (rode pijl) kan het organisme uit zijn niche gedwongen worden,

indien de stressor terug afneemt is er terugkeer naar de niche (blauwe pijl). Door adaptatie kan de

niche vergroot worden (groene pijl).

9

geplot in 4 perioden van 3 maanden, volgens de corresponderende seizoenen (1 = januari tot 12 =

december).

Figuur 2.5 Water-luchttemperatuur correlatie in Devon River (Webb et al., 2003)

De temperatuur van het water volgt die van de lucht met een bepaalde vertraging die afhankelijk is

van het watervolume en het stroomdebiet (Webb et al., 2003; Ward, 1985). Temperatuur is één van

de belangrijkste regulerende factoren in ecosystemen, ook in aquatische ecosystemen. De groei,

reproductie, fysiologie, levenscyclus, verspreiding, … van de waterorganismen worden rechtstreeks

beïnvloed door de watertemperatuur (Magnuson et al., 1997). Bij een stijgende temperatuur van het

water zal de oplosbaarheid van zuurstof dalen (Figuur 2.6). Dit is één van de chemische gaswetten

beschreven door William Henry (Battino en Clever, 1966) (Vgl. 2.1). De wet bevat een

temperatuursafhankelijke constante welke gedefinieerd wordt in Vgl 2.2.

p = kh T . c

kh T = kh Tθ . exp[ C. 1

T−

1

Tθ ]

Met p de partieeldruk van het gas boven het water (atm), kh(T) de Henry constante (L atm-1 mol-1) bij

een bepaalde temperatuur T (K), c de opgeloste gasconcentratie (mol l-1) en kh(TƟ) de Henry

constante bij 298 K welke voor zuurstof 769.23 L atm-1 mol-1 bedraagt.

Vgl. 2.1

Vgl. 2.2

10

In Figuur 2.6 is de temperatuursafhankelijkheid van de oplosbaarheid van zuurstof weergegeven bij

een atmosfeerdruk van 1 bar. Hieruit is af te leiden dat bij toenemende temperatuur de opgeloste

zuurstofconcentratie zal dalen.

Figuur 2.6 Temperatuursafhankelijke zuurstofoplosbaarheid (Geng & Duan, 2010)

Naast de temperatuur is de zuurstofconcentratie in het water ook afhankelijk van turbulenties,

stromingen en biologische processen, met name dissimilatie en fotosynthese voor reaeratie

(Wetterskip Fryslân, 2006). Bovendien moet de windsnelheid op regelmatige basis hoog genoeg zijn

om stratificatie van temperatuur en zuurstofgehalte in ondiepe meren te vermijden door

homogenisatie van de waterlagen en opwervelingen aan de oeverzone (Mooij et al., 2005). De

meeste zuurstof in water is afkomstig van de fotosynthese van algen en onderwaterplanten bij

voldoende lichtinval. Echter ’s nachts valt de zuurstofproductie weg en zullen alle levende

organismen respireren, inclusief de algen en onderwaterplanten, waardoor het globale

zuurstofgehalte daalt (Vannote en Sweeney, 1980). Bij een hogere temperatuur is de

respiratiesnelheid hoger, wat samen met de lagere zuurstofoplosbaarheid zal resulteren in een

sterker dalende zuurstofconcentratie (Wetterskip Fryslân, 2006). Zowel de zuurstofoplosbaarheid als

de biologische processen zijn temperatuursafhankelijk zodat bij stijgende temperatuur het

cumulatieve effect een dalende zuurstofconcentratie is. Dat de temperatuursimpact zo groot kan zijn

op de waterkwaliteit blijkt onder meer uit de strikte regelgeving omtrent de temperatuur en het

debiet van koelwater dat in het oppervlaktewater mag geloosd worden (Kaderrichtlijn Water, 2000).

Omdat klimaatverandering en milieuvervuiling onlosmakelijk met elkaar verbonden zijn, is het nodig

te vermelden dat naast temperatuur ook de vuilvracht, beter gekend als BOD-gehalte (Biochemical

Oxygen Demand), het zuurstofgehalte in het water beïnvloedt. Waterlopen met hoge

effluentlozingen kennen een hogere gevoeligheid voor de klimaatverandering op het gebied van

11

zuurstofgehalte. In deze vervuilde waterlopen is de snelheid van de deoxidatie, ten gevolge van de

hoge biochemische zuurstofvraag, hoger dan de snelheid van reaeratie. De extra zuurstofvraag zorgt

in vervuilde waterlopen voor een nog sneller dalende zuurstofconcentratie, waardoor deze

gevoeliger zijn voor klimaatverandering (Jenkins et al., 1993). Tot slot zorgt klimaatverandering ook

voor hogere evaporatiesnelheden waardoor de waterniveaus van meren en waterlopen ondieper

worden en de stroomsnelheid zal verlagen. Samen met de hogere temperatuur worden optimale

condities gecreëerd voor algenbloei. Deze algenbloei is één van de belangrijkste componenten van

het BOD (Arnell, 1998). Deze optimale condities voor algenbloei gelden ook voor de schadelijke

algensoorten zoals de toxine producerende cyanobacterie Microcystis aeruginosa, gebruikt in deze

masterproef.

De lagere zuurstofconcentraties hebben niet alleen ecologische consequenties maar ook

economische. In waterzuiveringsinstallaties is 45-75 % van de energiekosten toe te schrijven aan

aeratie. Wanneer als gevolg van de klimaatverandering het zuurstofgehalte daalt, zal de beluchting

moeten toenemen om dezelfde waterkwaliteit te behouden (Arnell, 1998).

2.3.2.2 Effecten op en aanpassingen van Daphnia

Omdat in dit onderzoek het effect van hypoxiastress op Daphnia sp. bestudeerd wordt, worden

hieronder de belangrijkste interne veranderingen besproken te wijten aan deze stressor. De

aanpassingen van Daphnia sp. om een bepaalde graad van zuurstofhomeostase te behouden kunnen

ingedeeld worden in drie groepen: morfo-fysiologische aanpassingen, regulatorische aanpassingen

en metabolische aanpassingen. Er dient opgemerkt te worden dat de grens tussen aanpassingen van

Daphnia sp. aan hypoxiastress en wat als toxicologische effecten beschouwd worden, dikwijls vaag is.

2.3.2.2.1 Morfo-fysiologische aanpassingen

Morfo-fysiologische aanpassingen zijn veranderingen op het anatomisch niveau. De lichaamsbouw

verandert als respons op de uitwendige stressor waardoor het effect van de stressor

geminimaliseerd wordt (Coëlho, 2009). Vooreerst zal Daphnia sp. onder hypoxiastress een kleinere

lichaamslengte ontwikkelen in vergelijking met normoxische condities. Een gemiddelde reductie van

ongeveer 8 % blijkt uit de experimenten van Seidl et al. (2005). Door de kleinere lichaamslengte is de

zuurstofvraag om de zuurstofhomeostase te onderhouden lager (22 %). Bovendien zal naast

ademhaling via kieuwzakjes op de thoracopoden, ook een aanzienlijk aandeel zuurstofmoleculen

worden opgenomen via diffusie doorheen de lichaamswand. Bij een kleinere lichaamsoppervlakte zal

het diffusief transport toenemen, wat extra voordelig is onder hypoxiastress (Pirow et al., 2004).

Daarenboven zal Daphnia sp. meer hemoglobine aanmaken. Bij chronische blootstelling aan

hypoxische condities is er inductie van aanpassingen op het genetisch niveau; hypoxia-induceerbare

12

hemoglobine genen zullen bij zuurstofstress tot expressie komen en voor een hogere concentratie

aan hemoglobine in het lichaam zorgen. Niettemin zijn er geen transgenerationele effecten van

hypoxia-acclimatisatie. Onder hypoxiastress werd een toename van de hemoglobineconcentratie

gemeten van 266 % (Seidl et al., 2005). Naast de hogere hemoglobineconcentratie neemt ook de

zuurstofaffiniteit van de haem-groep toe. De kritische zuurstofspanning die nodig is voor half-

saturatie van de hemoglobine-eiwitten daalt met 32 %. Er kan dus bij veel lagere

zuurstofconcentraties met eenzelfde efficiëntie zuurstoftransport plaatsgrijpen. Dit mechanisme

wordt zuurstofbuffering genoemd (Jones, 1972). Vanzelfsprekend zorgt deze toename in

hemoglobineproductie voor een veel efficiënter zuurstoftransport, maar door de rode kleur van het

hemoglobine-eiwit wordt het lichaam minder transparant en zal het risico op predatie stijgen (Confer

et al., 1978). Figuur 2.7 illustreert deze lichaamsverkleuring uit eigen experimenten.

Becker et al. (2009) onderzocht het effect van hypoxia op de accumulatie van reactive oxygen species

(ROS) in Daphnia magna. Onder hypoxiastress werd een hogere frequentie en amplitude

waargenomen in de hoeveelheid ROS in Daphnia magna. Er is een verband tussen cellulaire

verdedigingsmechanismen en hypoxiastress. De ROS zullen een verandering teweegbrengen in de

regulatie van de expressie van hemoglobinegenen. Daphnia magna kan via ROS het

zuurstoftransport regelen aan de hand van de zuurstofvraag onder variërende zuurstofconcentraties.

Figuur 2.7 Lichaamsverkleuring bij Daphnia sp.

Links: 21 dagen bij hypoxia behandeling van 3 mg l-1, Rechts: 21 dagen bij normoxia behandeling

van 8 mg l-1

13

2.3.2.2.2 Regulatorische aanpassingen

Een tweede groep omvat regulatorische aanpassingen, dit zijn aanpassingen van de toestand ter

herstel van een verbroken evenwicht (Coëlho, 2009). Daphnia sp. zijn filtervoeders en de snelheid

waarmee het water de filteren ademhalingsstructuren passeert wordt in de eerste plaats

gecontroleerd door voedselvraag in tegenstelling tot zuurstofvraag. Slechts bij voldoende hoge

voedselconcentraties, dus onder energierijke omstandigheden, zal het organisme in staat zijn om bij

hypoxiastress de thoracopoden sneller te bewegen zodat er meer zuurstofmoleculen opgenomen

kunnen worden ter hoogte van de kieuwblaasjes (Dejours, 1981). Deze respons wordt ook het

negatief-feedback mechanisme genoemd. Er heerst namelijk een inverse relatie tussen het slagritme

van de thoracopoden en de zuurstofconcentratie in het omgevende water. Eenzelfde negatief-

feedback mechanisme is terug te vinden tussen hartritme en zuurstofconcentratie. Het hartritme zal

toenemen bij een afnemende zuurstofconcentratie.

2.3.2.2.3 Metabolische aanpassingen

Tot slot beschikt Daphnia sp. over regulaties op metabolisch niveau voor hypoxia-acclimatisatie. Op

basis van inwendige zuurstofmetingen stelt Pirow (2004) dat hypoxiastress de densiteit en capaciteit

van mitochondriën doet afnemen. Een lagere zuurstofallocatie naar de mitochondriën kan dan ook

de verklaring zijn voor de kleinere lichaamslengte.

Daphnia sp. beschikt dus over verschillende manieren om aan hypoxia te acclimatisatiseren. Toch

worden deze eigenschappen niet overgedragen op de volgende generaties om zo meer resistente

populaties te krijgen. Zoals eerder vermeld zal hypoxiastress een invloed hebben op de somatische

groei, met name een kleinere lichaamslengte. Maar er werden tot dusver geen significante effecten

waargenomen op de reproductiviteit (Seidl et al., 2005).

2.3.3 Cadmium

2.3.3.1 Speciatie en biobeschikbaarheid

Het zware metaal cadmium kan zowel op natuurlijke wijze als via antropogene bronnen in het water

terecht komen. De natuurlijke bronnen zijn hoofdzakelijk erosie van cadmiumhoudende ertsen,

voornamelijk zinkertsen, en atmosferische depositie uit vulkanische aswolken en bosbranden. De

belangrijkste antropogene bronnen zijn het gebruik van meststoffen, pesticiden, batterijafval en de

staalindustrie (US-EPA, 1980). Gegevens voor de ecotoxiciteit van cadmium zijn opgenomen in het

Metals Environmental Risk Assessment Guidance (MERAG, 2007). Bij de invertebraten blijkt Daphnia

sp. een van de meest gevoelige soorten te zijn voor cadmiumtoxiciteit. Cadmium kan zowel via het

14

voedsel als via het water opgenomen worden. Vooral bij hoge concentraties speelt de opnameroute

via water de belangrijkste rol (Goulet et al., 2007).

De biobeschikbaarheid van zware metalen hangt enerzijds af van de metaalspeciatie. Het metaal kan

in het milieu voorkomen in vrije vorm of gebonden op gesuspendeerde partikels. Algemeen wordt

het vrije metaal ion beschouwd als de meest toxische vorm (Campbell, 1995). Anderzijds zullen de

fysico-chemische waterkarakteristieken de toxiciteit van een contaminant in aquatische ecosystemen

beïnvloeden: pH, hardheid, DOC, … . Hiervoor is het Biotisch Ligand Model (BLM) een duidelijke

manier om bij de interpretatie van resultaten van toxiciteitstesten rekening te houden met

biobeschikbaarheid en fysico-chemische waterkarakteristieken (Janssen et al., 2003). Het BLM rekent

zowel met data over metaalspeciatie alsook de interacties van het metaal ter hoogte van het

biotische ligand van het organisme, schematisch weergegeven voor het metaal koper (Cu2+) in Figuur

2.8.

Figuur 2.8 Biotisch Ligand Model (BLM) voor koper (Janssen et al., 2003)

Daphnia sp. zijn ectotherme organismen, hun lichaamstemperatuur is afhankelijk van de

omgevingstemperatuur. Door de klimaatverandering zal niet alleen de gemiddelde temperatuur van

het water stijgen, maar ook grotere variabiliteit en regelmatiger voorkomen van extrema in

temperatuur zijn eigen aan deze klimaatverandering (Pertoldi & Bach, 2007). De

omgevingstemperatuur heeft bij ectotherme organismen een invloed op de fysiologische processen,

de voedings- en metabolische activiteit van de organismen zal toenemen bij stijgende temperatuur.

Bijgevolg zal in een omgeving gecontamineerd met cadmium ook de opnamesnelheid ervan

15

toenemen, wat leidt tot een verhoogde toxiciteit bij hogere temperaturen. Naast verhoogde

opnamesnelheid is er ook hoger actief transport van cadmium in het lichaam, hetgeen een

verhoogde accumulatie geeft in het lichaam (Heugens et al., 2003).


Zoals eerder vermeld zijn Daphnia sp. één van de gevoeligste soorten van de invertebraten voor

cadmium. Al vanaf een concentratie van 1 µg Cd per liter worden toxische effecten waargenomen.

Deze hoge toxiciteit is toe te schrijven aan de gelijkaardige ion radius van cadmium en calcium.

Doorheen de celmembranen kan cadmium even gemakkelijk opgenomen worden als calcium via de

daartoe voorziene opname kanalen. De toxiciteit van cadmium vertaalt zich bijgevolg ondermeer in

een verstoring van het calciummetabolisme (Craig et al., 1999).

Naast de verstoring van het calciummetabolisme heeft cadmium ook een effect op de groei. De

lichaamslengte en het lichaamsgewicht van Daphnia magna blootgesteld aan cadmium was

significant kleiner dan de controle behandelingen (Connon et al., 2008; Bodar et al., 1988).

Cadmiumblootstelling heeft ook een effect op reproductie. Vanaf een cadmiumconcentratie groter

dan 1 µg per liter daalt het aantal en de grootte van de juvenielen (Muyssen et al., 2010). Verder zijn

effecten op allocatie van de celenergie, zuurstoftransport, digestie en cuticulair metabolisme bij

Daphnia magna waargenomen (Connon et al., 2008).

Het belangrijkste cadmium-detoxificatieproces is dat van de metallothioneïnes. Dit zijn

laagmoleculaire enzymen met hoge hoeveelheden cysteïne. Dit aminozuur met zijn kenmerkende

thiolgroep zorgt ervoor dat metalen aan de metallothioneïnes kunnen binden. Zoals eerder vermeld

is het vrije metaal de meest toxische vorm. Dankzij de metallothioneïnebinding verschuift deze

metaalspeciatie naar een minder toxische gebonden vorm. Zowel de concentratie als de duur van de

cadmiumblootstelling induceert de synthese van metallothioneïnes (Shaw et al., 2007).

2.3.4 Cyanobacteriën

2.3.4.1 Inleiding

Cyanobacteriën of blauwwieren behoren tot de groep van de Prokaryoten. Hun naam is afgeleid van

de kenmerkende blauwgroene kleurstof fycocyanine. Het zijn fotosynthetiserende bacteriën en

sommige soorten produceren toxines (Woese, 1977). In deze thesis worden toxiciteitstesten

uitgevoerd met de toxine producerende cyanobacterie Microcystis aeruginosa. Als Daphnia sp. wordt

gevoed met M. aeruginosa zal bij de vertering in het spijsverteringskanaal microcystine uit de cellen

worden vrijgesteld, met toxische effecten als gevolg (zie verder). Door de klimaatverandering

ontstaan meer gunstige groeiomstandigheden voor M. aeruginosa. Bij hogere temperaturen zal een

16

bloei van M. aeruginosa en andere cyanobacteriën ontstaan en in hogere competitie treden met het

overige fytoplankton. Hierdoor zal het voedselweb in aquatische ecosystemen een verschuiving

ondergaan, met als gevolg dat Daphnia sp. voor eenzelfde voedselopname meer toxine

producerende M. aeruginosa opneemt (Jöhnk, 2007). De klimaatverandering zal naast de

temperatuursverhoging nog andere positieve groeicondities creëren voor M. aeruginosa. Minder

bewolking resulteert in meer invallend licht en een hogere fotosynthese capaciteit van de

blauwwieren. Hogere temperatuur en lagere windsnelheid verhogen bovendien de stabiliteit van de

waterkolom en deze lagere verticale menging werkt opnieuw de competitiviteit van de blauwwieren

in de hand (Jöhnk, 2007).


Uit een studie van Wilson et al. (2006) waar Daphnia werd blootgesteld aan twee M. aeruginosa

varianten (een genetisch gemodificeerde microcystine-vrije variant en een toxische variant) bleek

geen verschil in groei tussen beide behandelingen. De negatieve effecten door het M. aeruginosa-

dieet zijn dus niet alleen toe te schrijven aan het microcystine toxine. M. aeruginosa moet dus nog

andere toxische substanties bevatten. Een andere hypothese stelt dat een slechte smaak en

slijmproductie eigen aan de cyanobacteriën een afschrikwekkende houding bij Daphnia veroorzaakt

en zo lagere voedselopname met zich meebrengt. Bovendien bevat M. aeruginosa lagere

hoeveelheden essentiële vetzuren. Deze lagere voedingswaarde behoort dan ook tot een van de

redenen die bijdragen tot de negatieve effecten van het M. aeruginosa-dieet (Lürling, 2003).

Indien M. aeruginosa in het dieet van Daphnia voorkomt zijn de effecten vooral terug te vinden in de

fitnessparameters. Deze zijn hogere mortaliteit, kleinere lichaamslengte en gewicht en lagere

reproductie (Lürling, 2003).

In tegenstelling tot de bespreking van de andere stressoren heeft Daphnia tot dusver in de literatuur

gekend geen aanpassingsmechanismen ontwikkeld tegen de negatieve effecten ten gevolge van het

toxische M. aeruginosa-dieet.

17

2.3.4.3 Gecombineerde effect cadmium en M. aeruginosa

Uit recente studies over het gecombineerde effect van cadmium en M. aeruginosa op Daphnia pulex

blijkt dat cadmium-geadapteerde klonen een hogere tolerantie vertonen voor M. aeruginosa in

vergelijking met niet cadmium-geadapteerde klonen (De Schamphelaere et al., 2010). Figuur 2.9

toont duidelijk een cotolerantie tussen cadmium en M. aeruginosa, in plaats van de verwachte cost-

of-tolerance.

Figuur 2.9 Aantal juvenielen in functie van controle-, cadmium- en M. aeruginosa-behandeling voor een cadmium geadapteerde (K10) en niet-geadapteerde kloon (BH14) (De schamphelaere et

al., 2010)

Uit Figuur 2.9 blijkt voor zowel de cadmium en M. aeruginosa-behandeling (respectievelijk rode en

groene kolom) voor de tolerante kloon, K10, geen significante daling in het aantal juvenielen in

vergelijking met de controlebehandeling (blauwe kolom). In tegenstelling met de niet-tolerante

kloon, BH14, waarbij beide stressbehandelingen een 50 % reductie werd waargenomen. De

genetische adaptatie uit eerdere blootstelling aan metaalverontreiniging leidde niet alleen tot

hogere tolerantie voor cadmium, maar ook tot hogere tolerantie voor M. aeruginosa blootstelling. Er

is in dit voorbeeld een cotolerantie tussen chemische verontreiniging en een stressfactor gerelateerd

aan de klimaatverandering (De Schamphelaere et al., 2011). Uit dit voorbeeld blijkt dat resistentie

tegen een stressor via genetische adaptatie niet onmiddellijk een cost-of-tolerance betekent voor

nieuwe stressoren. Verder onderzoek naar de genen die verantwoordelijk zijn in de cotolerantie van

Daphnia pulex klonen voor beide stressoren is een must voor een wetenschappelijk verantwoorde

risico-evaluatie te kunnen maken van de cyanobacterie Microcystis aeruginosa.

a

B

a

C

a

C

0

10

20

30

40

50

60

70

80

K10 (adapted) BH14 (non-adapted)

# ju

ve

nile

s/f

em

ale

Control

Cd

MC

18

3 Materiaal en methoden

In deze thesis werd de mogelijke cotolerantie tussen twee natuurlijke stressoren die een gevolg zijn

van klimaatverandering, nl. hypoxia en cyanobacteriën, en cadmium in Daphnia sp. onderzocht.

Omdat de hypoxia testen uitgevoerd werden in gesloten systemen werd in een eerste, preliminaire

test de fluctuatie in zuurstofconcentratie tengevolge van fotosynthese door de toegevoegde algen,

respiratie van de algen bij nacht, respiratie van Daphnia sp. en grazing van Daphnia sp. op de algen,

onderzocht. Aan de hand van de resultaten uit deze test werd de best mogelijke dagelijkse

algenconcentratie gedurende 21 dagen afgeleid om de fluctuaties in het zuurstofgehalte tot een

minimum te beperken. Nadien werden twee experimenten uitgevoerd met betrekking tot de stressor

hypoxia. Een chronische 21 dagen test met 20 Daphnia magna klonen en vervolgens eenzelfde test

met 18 Daphnia pulex klonen. Een vierde experiment had betrekking op de stressoren cadmium en

M. aeruginosa (cyanobacteriën). Hierbij werden gedurende 21 dagen 20 Daphnia magna klonen,

dezelfde als in het hypoxia-experiment, blootgesteld aan cadmium, M. aeruginosa en een

gecombineerde behandeling met beide stressoren. Vermits zowel testen gedaan werden met

verschillende Daphnia magna klonen als Daphnia pulex klonen, wordt de herkomst van deze klonen

eerst kort geschetst.

3.1 Herkomst klonen

3.1.1 Daphnia magna klonen

De 20 Daphnia magna klonen gebruikt in de experimenten hieronder beschreven zijn afkomstig uit

11 verschillende meren, meerbepaald 8 in Vlaams-Brabant (Leuven) en 3 in West-Vlaanderen

(Knokke). De meren zijn geselecteerd in samenspraak met het Laboratorium voor Aquatische

Ecologie en Evolutionaire Biologie van de KULeuven. Geen enkel van de 11 geselecteerde meren is

verontreinigd geweest met zware metalen. De geselecteerde Daphnia magna klonen zijn bijgevolg

nooit blootgesteld aan zwaar metaal selectiedruk. De hogere of lagere tolerantie van bepaalde

klonen voor de metaaldruk is enkel te wijten aan natuurlijk aanwezige genetische variatie van de

Daphnia magna populaties binnen elk meer. Op basis van eerder onderzoek van M. Messiaen naar

het verschil in cadmiumtolerantie werd in deze thesis onderzoek mogelijk met klonen met

verschillende cadmiumtolerantie (persoonlijke communicatie).

3.1.2 Daphnia pulex klonen

De 18 Daphnia pulex klonen zijn afkomstig uit 2 verschillende regio’s in Ontario (Canada). De Sudbury

regio staat gekend om zijn jarenlange milieuvervuiling ten gevolge van metaal smeltindustrie. De

19

aangrenzende meren zijn decennia lang gecontamineerd met onder meer cadmium. Uit onderzoek

bleek dat de Daphnia pulex klonen afkomstig uit de meren van de Sudbury regio een hogere

cadmiumtolerantie vertonen dan de klonen uit meren die verder van de smeltindustrie gelegen zijn,

met name uit de Dorset regio. Uit genetisch onderzoek bleek een grote genetische variatie tussen de

Daphnia pulex klonen uit beide regio’s. De klonen uit de Sudbury regio genereren een hogere

synthese van metallothioneïnes in vergelijking met klonen uit de Dorset regio (De Schamphelaere et

al., 2010).

3.2 Fluctuatietest

3.2.1 Testopzet

Om de eigenlijke hypoxiatest voor te bereiden diende eerst onderzocht te worden in welke mate de

zuurstofconcentratie gedurende 21 dagen fluctueerde. In deze test werd als testorganisme Daphnia

magna, kloon K6 gebruikt. Deze kloon is oorspronkelijk afkomstig van een meer in Kiel, Antwerpen

en wordt reeds gedurende tientallen jaren onder gestandaardiseerde omstandigheden in het labo

voor Milieutoxicologie en Aquatische Ecologie gekweekt. Om zo accuraat mogelijke data te

verwerven werden dagelijks 3 zuurstofmetingen uitgevoerd: om 9u, om 12u en om 17u van telkens 3

replica’s wat een totaal van 9 flessen per dag maakt. Er werden 2 batches van 9 flessen voorzien

zodanig dat elke batch om de 48 uur diende ververst te worden. De gemiddelde zuurstofconcentratie

van de 3 replica’s werd dan als representatieve genomen voor een bepaald tijdstip.

3.2.2 Testmedium: aangerijkt carbongefilterd water

Het testmedium gebruikt in de fluctuatietest was carbongefilterd tapwater aangerijkt met vitamines

(1 ml per liter medium) en selenium (0.5 ml per liter medium). De toegediende vitamineoplossing

bestond uit 75 mg thiamine(HCl) (Fluka 04573), 1 mg cyanocobalamine (vit B12, Merck 5.24950.100)

en 0.75 mg biotine (vitamine H, Sigma B-4639) per liter gedesioniseerd water. Deze stockoplossing

werd diepgevroren (-20 °C) in fracties van 90 ml in 100 ml polyethyleen potjes en bij 4 °C ontdooid

indien nodig. De seleniumoplossing bestond uit 4.38 mg natriumseleniet (Na2SeO3, Sigma S-1382) per

liter gedesioniseerd water. Deze stockoplossing werd diepgevroren (-20 °C) in fracties van 40 ml in 50

ml polyethyleenpotjes. Het medium werd aangemaakt in 25 liter vaten en bewaard in een

gethermostatiseerde kamer op 20 ± 1 °C. Het medium werd minstens 24 uur vooraf aangemaakt en

belucht met een glazen buis aangesloten op een centraal overdruksysteem.

Om een constante samenstelling van het medium te controleren, werden 24 uur na de aanmaak van

een nieuw vat medium stalen genomen voor cadmium, zink, calcium en magnesium. Ook werd de

20

pH, alkaliniteit en hardheid opgemeten. De alkaliniteit of buffercapaciteit werd titrimetrisch bepaald

met 0.01 M HCl tot het equivalentiepunt tegenover methyloranje (TAM) volgens de

referentiemethode “Compendium voor analyse van water (WAC/III/A/006)”. De hardheid werd

bepaald met een “Aquamerck kit” (nr 1.111104.0001 van VWR) uitgedrukt in Duitse hardheidsgraden

(°d, met 1 °d = 10 mg CaO l-1).

Voor de fluctuatietest dient het medium in volledig afgesloten BOD-flessen van 250 ml (Scott)

overgeheveld te worden zodat contact en zuurstofuitwisseling met de atmosfeer onmogelijk wordt.

Voor de hypoxiabehandeling werd het medium belucht met zuiver N2-gas. Hiervoor werd het

medium uit de 25 liter vaten afgetapt in een 8 liter polyethyleen aquarium. Via een

beluchtingsysteem van geperforeerde plastiekbuisjes werd N2-gas doorheen het medium geborreld.

Met behulp van een magnetische roerstaaf werd voor een homogene verdeling van het medium in

het aquarium gezorgd. De zuurstofconcentratie in het medium werd continu gemeten via een O2-

electrode (WTW330, Wissenschaftlich Technische Werkstätten GmbH, BA22211). Deze werd

dagelijks gekalibreerd waarbij een gemiddelde regressieconstante van ± 0,98 opgetekend werd. Als

de zuurstofconcentratie 3 mg l-1 bereikte werd via een plastiek buisje het medium overgeheveld in de

BOD-flessen waarbij een zo laminair mogelijk stromingsregime werd beoogd zodat geen

zuurstofaanrijking van het medium bij de overheveling plaatsgreep.

3.2.3 Experimentele uitvoering

Op dag 0 van het 21 dagen durende experiment werden 3 juvenielen tussen de 0 en 24 uur oud

overgebracht in een BOD-fles gevuld met 3 mg l-1 zuurstofconcentratie. Er werden, zoals al eerder

vermeld, 2 batches voorzien van elk 9 flessen zodat per dag de zuurstofconcentratie van 3 replica’s

gemeten werd per tijdstip (9u, 12u en 17u). De zuurstofconcentratie werd opnieuw gemeten met

dezelfde O2-electrode besproken onder punt 3.2.2 ‘Testmedium: aangerijkt carbongefilterd water’.

Om de 48 uur werd 1 batch ververst waarbij een algenmix bestaande uit een 3:1 verhouding van

Chlamydomonas reinhardtii en Pseudokirchneriella subcapitata gebaseerd op celaantal, werd

toegevoegd als voedingsbron. Voor de kweek van de algen wordt verwezen naar punt 3.2.4

‘Algenkweek’. Voor de eerste 7 dagen werd 125 µg drooggewicht algenmix per Daphnia per dag

toegediend. Voor de tweede en derde week respectievelijk 250 en 375 µg drooggewicht algenmix

per Daphnia per dag.

Maximaal 15 uur voor de verversing werden de BOD-flessen gevuld met medium met een

zuurstofconcentratie van 3 of 9 mg l-1 (controle). Bij het verversen werden telkens uit 1 replica (1

koppel van 3 en 9 mg l-1) met een glazen pipet de testorganismen overgebracht in twee glazen

21

tabletflesjes van 50 ml, om vervolgens zo vlug mogelijk in de respectievelijke nieuwe BOD-flessen

overgebracht te worden. Om de tijd nodig voor overbrenging te minimaliseren werden de BOD-

flessen op een lichtbak geplaatst. Daphnia sp. vertoont namelijk een oriëntatie op een ruimtelijke

lichtverdeling en zal naar de lichtbron toe bewegen (Flik, 2010). Op het moment van de overbrenging

werd ook de aangepaste algenconcentratie toegevoegd. Indien één van de 3 testorganismen dood

was, werd de algenconcentratie aangepast naar het aantal individuen in de BOD-fles.

De BOD-flessen werden geplaatst in houten testbakken en bewaard in dezelfde gethermostatiseerde

ruimte als waar het medium werd bewaard en een lichtcyclus d.m.v. TL-licht van 16:8 licht-donker

ratio werd voorzien. De testbakken waren bekleed met een witte folie om het invallend licht van de

lampen zoveel mogelijk te reflecteren over alle BOD-flessen aanwezig in de betreffende testbak. Om

de test zoveel mogelijk te randomiseren en het effect van ongekende factoren die toevallig de test

beïnvloeden niet op dezelfde replica’s te laten inwerken werden dagelijks de BOD-flessen op

willekeurige manier in de testbakken hergeoriënteerd.

Het doel van de fluctuatietest was na te gaan of deze toegevoegde algenconcentraties volstonden

om de fluctuaties in zuurstofgehalte in de BOD-fles tot een minimum te beperken en tegelijkertijd

toch toerijkend genoeg waren om Daphnia sp. toe te laten om te reproduceren.

3.2.4 Algenkweek

Voor de kweek van de algenmix bestaande uit een 3:1 verhouding van Chlamydomonas reinhardtii en

Pseudokirchneriella subcapitata worden beide algen gekweekt volgens het standaardprotocol in het

labo milieutoxicologie en aquatische ecologie. De kweek gebeurd in hetzelfde testmedium

beschreven onder punt 3.2.2 ‘Testmedium: aangerijkt carbongefilterd water’. Om contaminaties te

vermijden werd dit medium eerst geautoclaveerd. De algen werden hierin onder steriele condities

geënt en bij het enten ook voorzien van dezelfde concentratie en samenstelling van de

vitamineoplossing besproken onder punt 3.2.2 ‘testmedium: aangerijkt carbongefilterd water’. De

algen werden gedurende tiental dagen opgekweekt in kleine erlenmeyers van 50 ml waarbij ze

continu gezwenkt werden op een roerplaat om een zo homogene verdeling te krijgen tussen medium

en algen. Vervolgens wordt 1 erlenmeyer overgebracht in een met 3 liter medium gevulde

polyethyleenzak met continu aeratie voor opnieuw tien dagen. De kweek gebeurd in een

gethermostatiseerde ruimte van 20 ± 1 °C bij een constante fotoperiode, d.i. een 24:0 licht-donker

ratio. De algen worden nadien geoogst via twee opeenvolgende centrifugaties van 12 minuten bij

3600 rpm om overtollig medium te verwijderen. Na homogenisatie van deze opgeconcentreerde

oplossing werd het aantal cellen bepaald via telling in een Bürker telkamer. Het drooggewicht werd

bepaald door het wegen van een staal van 2 ml algensuspensie dat 24 uur gedroogd is bij 60 °C. Aan

22

de hand van deze gegevens is het mogelijk het volume te bepalen nodig voor 125, 250 of 375 µg

algen toe te dienen aan de testflessen.

3.3 Hypoxiatesten

Er werden 2 chronische (21 dagen) testen uitgevoerd om potentiële cotolerantie tussen hypoxia- en

cadmiumstress te onderzoeken bij Daphnia sp. In deze thesis werd het effect van hypoxiastress

bestudeerd bij een zuurstofconcentratie van 3 mg O2 l-1 en als controlebehandeling 9 mg O2 l-1, beide

bij een temperatuur van 20 °C.

Een eerste test werd uitgevoerd met 20 Daphnia magna klonen, een tweede met 18 Daphnia pulex

klonen. Voor de beide hypoxiatesten werden van elke kloon 3 replica’s genomen voor beide

behandelingen. Op dag 0 werden opnieuw juvenielen tussen de 0 en 24 uur genomen en voor elke

replica kwamen de juvenielen van een andere moeder. Via scheiding van moeders tussen de replica’s

kan een deel van de residuele fout op statistische conclusies uit de gemeten data toegeschreven

worden aan maternale effecten. Voor meer gedetailleerde beschrijving van de maternale effecten

wordt verwezen naar het hoofdstuk ‘Resultaten en Discussie’. De klonen werden geïsoleerd uit

stockculturen, welke reeds gedurende enkele jaren (D. magna) of generaties (D. pulex) in het

laboratorium voor Milieutoxicologie en Aquatische Ecologie onder gestandaardiseerde

omstandigheden gekweekt worden en vervolgens gedurende één generatie geacclimatiseerd aan de

testomstandigheden. De test werd opgezet met juvenielen van het derde of vierde broed omdat

deze broedsels minder variabel zijn dan de eerste twee. De klonen werden gekweekt in 40 ml

medium (hetzelfde als gebruikt in de uiteindelijke test) in 50 ml polyethyleen borrelglaasjes in

dezelfde testbakken en gethermostatiseerde ruimte onder dezelfde lichtcondities zoals eerder

beschreven onder punt 3.2.3 ‘Experimentele uitvoering’ van de fluctuatietest.

De procedure om de BOD-flessen te vullen met medium met zuurstofconcentratie van 3 of 9 mg l-1 is

opnieuw dezelfde als beschreven onder punt 3.2.3 ‘Experimentele uitvoering’ van de fluctuatietest.

Ter controle van de zuurstoffluctuaties werd na elke verversing van 8 willekeurige replica’s de

zuurstofconcentratie opgemeten van zowel de hypoxia- als de controlebehandeling.

Naast mortaliteit werden bij de hypoxiatesten ook reproductie en lengte na 21 dagen opgemeten.

Voor de reproductie werd om de twee dagen na de verversing het medium uit de oude BOD-fles over

een zeef gegoten met maasgrootte 250 µm zodat de juvenielen per replica geteld konden worden.

Na afloop van de test werd de lengte van de 21 dagen oude testindividuen gemeten. De

watervlooien werden uit het medium op een petrischaaltje onder de microscoop gebracht. Via het

23

programma ‘Launch Image Focus v2.0.0.0’ (Euromex Microscopes Holland) werd per individu de

lengte gemeten tussen de top van het oog en het begin van de schaalstekel zoals getoond in Figuur

3.1. De lengte van de schaalstekel zelf werd niet meegenomen omdat deze in sommige gevallen

gedurende de test kan afgebroken zijn.

Figuur 3.1 Lengtebepaling bij Daphnia sp.

3.3.1 Hypoxiatest met Daphnia magna

De Daphnia magna klonen voor deze hypoxiatest werden geselecteerd uit het eerder onderzoek van

M. Messiaen op basis van hun (verschil in) cadmiumtolerantie (persoonlijke communicatie). Voor de

herkomst van deze klonen wordt verwezen naar punt 3.1 ‘Herkomst klonen’. De klonen zijn:

KNO15-F3 KNO17-NF8 MO11 OM3-8 TER2-20

KNO15-F7 LRV19 OM2-24 OM3-12 TER2-25

KNO15-NF13 LRV30 OM2-25 TER1-13 ZW4-F7

KNO17-51 MO5 OM3-5 TER1-25 ZW4-NF10

Het testmedium voor de hypoxiatest met Daphnia magna was hetzelfde medium beschreven onder

punt 3.2.2 ‘Testmedium: aangerijkt carbongefilterd water’ van de fluctuatietest. De toegediende

algenconcentraties waren voor de eerste, tweede en derde week respectievelijk 125, 250 en 375 µg

algenmix. Deze algenmix is dezelfde als besproken onder punt 3.2.4 ‘Algenkweek’.

3.3.2 Hypoxiatest met Daphnia pulex

Voor de tweede hypoxiatest werden zowel cadmium geadapteerde en als niet-geadapteerde

Daphnia pulex klonen (persoonlijke communicatie met Dieter De Coninck) blootgesteld aan

24

hypoxiastress met als doel een positieve correlatie te vinden tussen de stressoren cadmium en

hypoxia. Voor de herkomst van deze klonen wordt verwezen naar punt 3.1 ‘Herkomst klonen’.

De cadmiumtolerante klonen zijn:

K2 K13 MF4 S9

K3 MC8 MF6 S14

K10 MC13 S1

De niet-tolerante klonen zijn:

BH3 BR16 G12 L7

BR1 G10 J4

Het testmedium voor de hypoxiatest met Daphnia pulex was COMBO-medium. Voor de uitvoerige

beschrijving van de samenstelling van het medium word verwezen naar Kilham et al. (1998).

In deze test werd de algenconcentratie niet meer van week 1 tot 3 verhoogd van 125-250-375 µg alg

per testorganisme per dag, maar werd gekozen voor een algenconcentratie toe te voegen op basis

van de koolstofconcentratie inherent aan de algenmix. Tijdens week 1 werd 1 mg C per liter

toegediend en voor week 2 en 3 werd de koolstofconcentratie verhoogd naar respectievelijk 1.5 en 2

mg C l-1. Uit het celaantal, bepaald via telling in een Bürker telkamer, de massa van de algen en een

koolstof conversiefactor van 0,5 mg C per mg celmassa, werd de uiteindelijke concentratie in mg C

ml-1 bepaald.

Een tweede belangrijk verschil met de hypoxiatest op Daphnia magna was dat in de hypoxiatest op

Daphnia pulex de toegevoegde algenconcentratie niet aangepast werd naargelang het aantal

testindividuen in de BOD-fles. De algenconcentratie bleef hier als constante op 1, 1.5 of 2 mg C l-1.

Door de algenconcentratie constant te houden zal bij de statistische verwerking van de resultaten

met grotere zekerheid conclusies kunnen gemaakt worden. Voor een meer gedetailleerde

beschrijving van het effect van een constante algenconcentratie wordt verwezen naar het hoofdstuk

‘Resultaten en Discussie’.

Een laatste verschil tussen de hypoxiatest met D. magna en D. pulex is dat bij de D.pulex test het

toegevoegd volume algensuspensie 5 maal verdund werd. De kleine volumes algenmix konden na de

verdunning veel verspreider toegediend worden in de BOD-flessen en ook de fout op het afmeten

van kleine volumes verkleint hiermee.

25

3.4 Cadmium-M. aeruginosa test

3.4.1 Testopzet

Een tweede belangrijke natuurlijke stressor als gevolg van de klimaatverandering die in deze thesis

getest werd zijn cyanobacteriën. Het zijn vooral de toxineproducerende cyanobacteriën die het

grootste risico vormen in het verstoren van aquatische ecosystemen indien deze exoten de

bovenhand halen in de inter-specifieke competitie met ander fytoplankton. In deze thesis werden

chronische toxiciteitstesten uitgevoerd met de toxine producerende cyanobacterie Microcystis

aeruginosa (strain PCC7806), afkomstig van het ‘Institut Pasteur, Collection Nationale De Cultures de

Microorganisme’, uit Parijs. Als testorganismen werden de 20 Daphnia magna klonen gebruikt die

eerder ook in de hypoxiatest onderzocht werden (zie punt 3.1.1 ‘Herkomst van de Daphnia magna

klonen’).

3.4.2 Kweek van Microcystis aeruginosa

De kweek van de toxische Microcystis aeruginosa gebeurde in afgescheiden kamers om besmetting

van de gewone algen met deze toxine producerende soort te voorkomen. De Microcystis aeruginosa

werd in BG11 medium gekweekt zoals aangeraden door het Institut Pasteur. Voor de gedetailleerde

beschrijving van de samenstelling van BG11 wordt verwezen naar Stanier et al. (1971). De algen

werden gedurende tiental dagen opgekweekt in kleine erlenmeyers van 50 ml waarbij ze minimaal 1

keer per dag gezwenkt werden om een homogene verdeling te krijgen tussen medium en algen. Bij

de overgang naar de kweek op grote schaal werd 1 kleine 50 ml erlenmeyer overgeheveld in een

steriele erlenmeyer van 1 of 5 liter, respectievelijk gevuld met 0.5 of 3 liter BG11 medium. De kweek

gebeurd in een gethermostatiseerde ruimte van 20 ± 1 °C bij een constante fotoperiode, d.i. een 24:0

licht-donker ratio.

Microcystis aeruginosa werd na 10 dagen geoogst zoals de algen beschreven onder punt 3.2.4

‘Algenkweek’ en vervolgens bewaard bij 4 °C. Doordat de oogst gedurende het experiment gebruikt

kon worden voor meerdere weken werd om de 7 dagen het stockvolume opnieuw gecentrifugeerd

(12 minuten bij 3600 rpm) en heropgelost in eenzelfde volume gedesioniseerd water. Door de

bewaring op lange termijn kunnen M. aeruginosa cellen afsterven en hun toxine vrijgeven in het

omringende medium. Dit laatste wilden we vermijden omdat het onderzoek zich toespitst op het

effect van de opname van het mycrocystine toxine via het spijsverteringskanaal en niet op het effect

van vrij opgeloste toxines in het medium. De berekening van het volume M. aeruginosa dat dient

toegevoegd te worden aan de behandeling (zie punt 3.4.4 ‘Experimentele uitvoering’) is gebaseerd

op het aantal cellen. Door het afsterven van een hoeveelheid cellen, werd na elke nieuwe

26

centrifugatie de berekening aangepast via een nieuwe telling van het aantal overblijvende cellen in

een Coulter Counter.

Om rekening te kunnen houden met eventuele fluctuaties in de concentratie aan vrij microcystine in

het medium werd na elke nieuwe centrifugatie 2 ml van de algensuspensie afgecentrifugeerd (3

minuten bij 9000 rpm). De gevormde pellet werd opnieuw opgelost in 2 ml gedesioniseerd water, om

het microcystinegehalte in de cellen te controleren. Het ± 2 ml afgecentrifugeerde supernatans werd

mee bewaard als controlestaal voor het vrije microcystine-gehalte te kunnen bepalen.

3.4.3 Testmedium: modified M4-medium en modified M4-medium + Cd

Voor de cadmium-M. aeruginosa test waren twee testmedia nodig : controlemedium (modified M4-

medium) en toxisch medium (modified M4-medium + Cd), elk gestockeerd in een 25 liter vat in de

gethermostatiseerde ruimte van 20 ± 1 °C.

Het modified M4-medium + Cd kent dezelfde samenstelling als gewoon modified M4-medium, maar

is gecontamineerd met een cadmiumconcentratie van 8 µg l-1 (toegevoegd als CdCl2). Vermits

cadmium complexeert met het in het medium aanwezige Artifical Humic Acid werden bij de aanmaak

van ieder nieuw vat medium stalen genomen om de werkelijke vrije cadmiumconcentratie te

bepalen. Daarnaast werden ook stalen voor TOC (Total Organic Carbon) genomen. De stalen werden

telkens na 24 uur beluchting bij 20 °C genomen.

De samenstelling van het modified M4-medium is weergegeven in Tabel 3.1:

Tabel 3.1: Samenstelling van modified M4-medium

Component mg l-1 Component mg l-1 Component mg l-1

CaCl2.2 H2O 293,8 RbCl 0,071 KI 0,00325 MgSO4.7 H2O 123,3 SrCl2.6 H2O 0,152 Na2SeO3 0,00219 KCl 5,8 NaBr 0,016 NH4VO3 0,000575 NaHCO3 64,8 Na2MoO4.2 H2O 0,063 Na2SiO3.5 H2O 7,464 H3BO3 2,8595 CuCl2.2 H2O 0,0165 NaNO3 0,274 MnCl2.4 H2O 0,3605 ZnCl2 0,026 KH2PO4 0,143 LiCl 0,306 CoCl2.6 H2O 0,01 K2HPO4 0,184 Thiamine(HCl) 0,075 Cyanocobalamine (vit B12) 0,001 S Biotine (vit H) 0.00075 AHA 4

Het DOC, onder de vorm van AHA, werd bij de aanmaak van M4 medium als laatste toegediend om

neerslag- en complexatiereacties te vermijden.

3.4.4 Experimentele uitvoering

De testorganismen werden blootgesteld aan 3 behandelingen en een controlebehandeling. De

controlebehandeling bestond uit zuiver modified M4 medium en 100 % niet-toxische algenmix. De

27

cadmiumbehandeling bestond uit modified M4 medium met een toegevoegd cadmiumgehalte van ±

8 µg Cd l-1. Voor M. aeruginosa-behandeling werd zuiver modified M4 medium gebruikt en 50 %

Microcystis aeruginosa en 50 % niet-toxische algenmix toegediend. Voor de gecombineerde

cadmium + M. aeruginosa-behandeling werd modified M4 medium + Cd gebruikt en 50 % Microcystis

aeruginosa en 50 % niet-toxische algenmix toegediend.

De test werd uitgevoerd met 20 Daphnia magna klonen waarvan elk 10 replica’s voor de 4

behandelingen. Elk individu werd in 40 ml medium gebracht in 50 ml polyethyleen borrelglaasjes in

dezelfde testbakken en gethermostatiseerde ruimte onder dezelfde lichtcondities zoals eerder

beschreven onder punt 3.2.3 ‘Experimentele uitvoering’ van de fluctuatietest.

Het OECD (2008) schrijft een voedselconcentratie van minstens 0.1-0.2 mg C per Daphnia per dag

voor. In dit onderzoek werd gedurende de 21 dagen durende test voor de controlebehandeling en de

cadmiumbehandeling tijdens week 1, 2 en 3 respectievelijk 250, 500 en 750 µg drooggewicht

algensuspensie toegevoegd per Daphnia per dag. Volgend voorbeeld verduidelijkt de berekening :

wanneer 250 µg algenmix met een celdichtheid van 9.108 cellen ml-1 en een massadichtheid van 35

mg ml-1 wordt toegevoegd, is na omrekening met een C-conversiefactor van 0.5 mg C per mg

algenmix, 0.125 mg C toegevoegd. Deze waarde ligt binnen de voorgeschreven grenzen van het

OECD. Voor de M. aeruginosa- en cadmium + M. aeruginosa-behandeling werd, zoals eerder

beschreven, het dieet opgedeeld in 50 % gewone algenmix en 50 % Microcystis aeruginosa

gebaseerd op mg C.

Als fitness-parameters werden zoals bij de hypoxiatesten de mortaliteit, reproductie en lengte na 21

dagen opgemeten. In tegenstelling tot bij de hypoxiatesten werd elke dag het aantal juvenielen

geteld en drie maal per week ververst. De lengtemeting gebeurde volgens dezelfde procedure

beschreven onder punt 3.3 ‘Hypoxiatesten’.

Elke week werden stalen genomen voor de Cd, TOC en M. aeruginosa bepaling van het oude

medium. Tevens werden 2 borrelglaasjes gevuld met nieuw zuiver modified M4 medium en zuiver

modified M4 medium + Cd waarbij 50 % zuiver algenmix en 50 % Microcystis aeruginosa werd

toegevoegd. Hiervan werden ook stalen genomen voor de Cd, TOC en M. aeruginosa bepaling, maar

dan van het nieuwe medium.

3.5 Verwerking van de resultaten

In deze thesis gebeurde de verwerking van de resultaten aan de hand van het programma

“STATISTICA 7”. Hieronder worden de gebruikte statistische analysemethoden per experiment

toegelicht.

28

3.5.1 Hypoxiatest Daphnia magna

Vooreerst werd een correlatieplot gemaakt tussen de cadmiumtolerantie en hypoxiatolerantie. Beide

toleranties werden berekend als de verhouding van het gemiddeld aantal juvenielen na 21 dagen per

overlevend testorganisme voor de stressbehandeling ten opzichte van de controlebehandeling. De

correlatieplot (scatterplot) werd gemaakt via Casewise Missing Data Deletion. Hierbij worden alleen

de datapunten die voor alle variabelen een waarde kennen opgenomen in de analyse. Bij de

correlatieplot is een ‘Pearson r’ correlatiecoëfficiënt gegeven, een waarde (van -1 tot +1) voor de

proportionaliteit (lineaire relatie) van de twee onderzochte variabelen tot elkaar. Waarbij de waarde

-1 voor een perfect negatieve correlatie, +1 voor een perfect positieve correlatie en 0 voor geen

correlatie staat.

Daarna werden de drie fysiologische parameters lengte, reproductie en mortaliteit geanalyseerd. Bij

de verwerking van de resultaten voor lengte en reproductie werd gebruik gemaakt van het GLM

(General Linear Model). De voorwaarden voor het GLM zijn normaliteit en homoscedasticiteit. De

normaliteit werd gecontroleerd op elke subset van datapunten, ingedeeld volgens het onderzocht

hoofdeffect, via de Kolmogorov Smirnov test. Na toepassing van het GLM werd de voorwaarde voor

normaliteit nogmaals gecontroleerd op de residuelen aan de hand van de Shapiro Wilk W-test. De

voorwaarde voor homoscedasticiteit werd getest aan de hand van de Levene test voor gelijkheid van

varianties.

In het GLM wordt aan de hand van multivariate ANOVA (Analysis of Variance) significanties tussen de

verschillende variabelen gezocht. Hierbij geldt de nulhypothese H0 = er is geen significant effect en

de alternatieve hypothese H1 = er is wel een significant effect. Er wordt getest op het 95 %

significantieniveau waarbij de nulhuypothese wordt verworpen bij een p-waarde ≤ 0,05 en de

alternatieve hypothese wordt aangenomen.

Voor de lengte werd in het GLM getest voor de hoofdeffecten Kloon, Behandeling en Moeder(Kloon)

en voor het interactie-effect tussen Kloon en Behandeling. Het effect Moeder werd genest in Kloon.

Het model is bijgevolg : “Kloon” + “Behandeling” + “Moeder(Kloon)” + “Kloon*Behandeling”. Hierbij

zijn Kloon en Moeder random factoren en Behandeling een fixed factor.

Voor de reproductie werd in het GLM getest voor de hoofdeffecten Kloon, Behandeling en voor het

interactie-effect tussen Kloon en Behandeling. Het model is bijgevolg : “Kloon” + “Behandeling” +

“Kloon*Behandeling”. Hierbij is opnieuw Kloon een random factor en Behandeling een fixed factor.

29

Indien uit de algemene samenvatting van het GLM significanties blijken voor een bepaald hoofd- of

interactie-effect, kunnen deze significante effecten aan de hand van een Unequal N HSD post hoc

test naderhand bestudeerd worden. Deze Unequal N HSD post hoc test is een gemodificeerde Tukey

HSD test voor de vergelijking (pairwise comparison) van groepsgemiddelden die gebaseerd zijn op

een verschillend aantal waarden N.

Voor de parameter mortaliteit werden de resultaten niet verwerkt met het GLM, maar aan de hand

van een niet parametrische gepaarde Wilcoxon Signed Rank Test waarbij getest wordt of de

controlebehandeling significant verschilt van de hypoxiabehandeling. Omdat per kloon en per

behandeling slechts 9 organismen werden getest, is het survivalpercentage per kloon per

behandeling het gemiddelde gebaseerd op deze 9 waarden. Deze gemiddelde survivalpercentages

werden boogsinus getransformeerd. Voor de toepassing van een niet parametrische dataverwerking

zijn de voorwaarden voor normaliteit en homoscedasticiteit niet meer nodig.

3.5.2 Hypoxiatest Daphnia pulex

Bij de uitvoering van de hypoxiatest met Daphnia pulex werden de 18 Daphnia pulex klonen

willekeurig opgedeeld in 2 batches omwille van praktische redenen. Om mogelijke batcheffecten te

kunnen opsporen werden 2 klonen in beide batches opgenomen. Nadien werd aan de hand van een

onafhankelijke T-test voor significante verschillen bij de drie gemeten fysiologische parameters

lengte, reproductie en mortaliteit tussen beide batches getest.

Analoog aan de hypoxiatest met Daphnia magna zijn de fysiologische parameters lengte en

reproductie in de hypoxiatest met Daphnia pulex geanalyseerd met het GLM. In het onderzoek met

Daphnia pulex klonen kan een onderscheid gemaakt worden met geadapteerde (A) en niet-

geadapteerde (NA) klonen. In de dataset werd een extra hoofdeffect “Adaptatie” opgenomen. Het

hoofdeffect “Moeder” werd omwille van vereenvoudiging van het model weggelaten.

Voor de lengte werd in het GLM getest voor de hoofdeffecten Kloon(Adaptatie), Adaptatie en

Behandeling en voor het interactie-effect tussen Kloon(Adaptatie) en Behandeling en Adaptatie en

Behandeling. Het effect Kloon werd genest in Adaptatie. Het model is bijgevolg : “Kloon(Adaptatie)” +

“Behandeling” + “Adaptatie” + “Kloon(Adaptatie*Behandeling)” + “Adaptatie*Behandeling”. Hierbij

is Kloon een random factor en Behandeling en Adaptatie fixed factoren.

Voor de reproductie werd in het GLM getest voor de hoofdeffecten Kloon(Adaptatie), Adaptatie en

Behandeling en voor het interactie-effect tussen Kloon(Adaptatie) en Behandeling en Adaptatie en

Behandeling. Het effect Kloon werd genest in Adaptatie. Het model is bijgevolg : “Kloon(Adaptatie)” +

30

“Behandeling” + “Adaptatie” + “Kloon(Adaptatie*Behandeling)” + “Adaptatie*Behandeling”. Hierbij

is Kloon een random factor en Behandeling en Adaptatie fixed factoren.

De analyse van de data voor mortaliteit is analoog aan de methode beschreven onder de hypoxiatest

met Daphnia magna.

3.5.3 Cadmium-M. aeruginosa test

Bij de Cadmium-M. aeruginosa test werden opnieuw de drie fysiologische parameters lengte,

reproductie en mortaliteit geanalyseerd. Bij dit experiment werden de 20 Daphnia magna klonen

willekeurig opgedeeld in 2 batches omwille van praktische uitvoerbare redenen. Om met mogelijke

batcheffecten te kunnen rekening houden werd in het GLM een extra parameter toegekend aan elk

datapunt, met name Batch 1 of Batch 2 en werd de parameter “Kloon” genest in deze parameter

“Batch”.

Voor de lengte werd in het GLM getest voor de hoofdeffecten Kloon(Batch), Batch en Behandeling en

voor het interactie-effect tussen Kloon(Batch) en Behandeling. Het effect Kloon werd genest in Batch.

Het model is bijgevolg : “Kloon(Batch)” + “Batch” + “Behandeling” + “Kloon(Behandeling*Batch)”.

Hierbij zijn Kloon en Batch random factoren en Behandeling fixed factor.

Bij de verwerking van de data voor reproductie werd gekozen om deze weer te geven in drie

hieronder beschreven afgeleide parameters.

1. 𝑟𝑚 , de intrinsieke reproductiesnelheid (juvenielen dag-1) (Lotka, 1913) :

𝑙𝑥 𝑚𝑥 𝑒−𝑟𝑚 𝑥 = 1

21

𝑥=0

Met 𝑥 de leeftijd in dagen, 𝑙𝑥 de leeftijdsspecifieke overleving en 𝑚𝑥 de reproductie gemeten op dag

𝑥.

2. 𝑅0 , de netto reproductiesnelheid (juvenielen organisme-1) (Walthall & Stark, 1997) :

R0 = lx mx

21

x=0

3. 𝑇, de gemiddelde generatie tijd (dag) (Walthall & Stark, 1997) :

T = x lx mx

21x=0

R0

De drie afgeleide parameters werden op dezelfde wijze geanalyseerd met het GLM voor de

hoofdeffecten Kloon(Batch), Batch en Behandeling en voor het interactie-effect tussen Kloon(Batch)

31

en Behandeling. Het effect Kloon werd genest in Batch. Het model is bijgevolg : “Kloon(Batch)” +

“Batch” + “Behandeling” + “Kloon(Behandeling*Batch)”. Hierbij zijn Kloon en Batch random factoren

en Behandeling fixed factor.

Voor de parameter mortaliteit werden de resultaten niet verwerkt met het GLM, maar aan de hand

van een niet parametrische gepaarde Wilcoxon Signed Rank Test omdat per kloon en per

behandeling slechts 10 organismen werden getest, is het survivalpercentage per kloon per

behandeling het gemiddelde gebaseerd op deze 10 waarden. Deze gemiddelde survivalpercentages

werden boogsinus getransformeerd. Voor de toepassing van een niet parametrische dataverwerking

zijn de voorwaarden voor normaliteit en homoscedasticiteit niet meer nodig. Met de niet

parametrische gepaarde Wilcoxon Signed Rank Test werden de 4 behandelingen in alle mogelijke

onderlinge binaire combinaties getest op significante verschillen.

Tot slot werd voor de cadmium en M. aeruginosa-behandeling een tolerantie berekend voor de

parameter lengte en reproductie. Voor de parameter lengte werd de tolerantie berekend als de

verhouding van de gemiddelde lengte voor de stressbehandeling ten opzichte van de

controlebehandeling. Voor de parameter reproductie werd de tolerantie berekend als de verhouding

van de gemiddelde netto reproductiesnelheid, 𝑅0 , voor de stressbehandeling ten opzichte van de

controlebehandeling. Voor de twee parameters werden beide toleranties uitgezet in een

correlatieplot met de “Casewise Missing Data Deletion” methode beschreven onder verwerking van

de resultaten voor hypoxiatest met Daphnia magna.

32

4 Resultaten en Discussie

4.1 Hypoxiatest met Daphnia magna

4.1.1 Correlatie cadmium-hypoxia tolerantie

Een eerste doelstelling van het hypoxia-experiment was testen of er een correlatie was tussen de

hypoxia- en cadmiumtolerantie. Beide toleranties werden berekend als de verhouding van het

gemiddeld aantal juvenielen na 21 dagen per overlevend testorganisme voor de stressbehandeling

ten opzichte van de controlebehandeling. De cadmiumtolerantie werd reeds eerder door M.

Messiaen experimenteel bepaald (persoonlijke communicatie). De data voor zowel hypoxia- als

cadmiumtolerantie zijn weergegeven in Figuur 4.1.

Figuur 4.1 Cadmium- en hypoxiatolerantie per kloon

Uit de correlatieplot (Figuur 4.2) met bijhorende regressievergelijking (Tabel 4.1) blijkt geen

correlatie tussen de hypoxia- en cadmiumtoleranties van de desbetreffende klonen. Voor verdere

interpretatie van deze statistieken wordt verwezen naar punt 3.5 ‘Verwerking van de resultaten’.

Tabel 4.1 Regressievergelijking voor correlatie cadmium- en hypoxiatolerantie (Std. Dv.: standaard afwijking; dep: dependent)

Constant Slope Constant Slope

Mean Std.Dv. r(X,Y) r² t p N dep: Y dep: Y dep: X dep: X

Cd Tolerantie 0,610 0,274

Hypoxia Tolerantie 0,777 0,513 0,184 0,034 0,792 0,438 20 0,568 0,344 0,534 0,098

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Tole

ran

tie

Kloon

Relatieve Cd - Hypoxia TolerantieCadmium Toleratie

Hypoxia Tolerantie

33

Figuur 4.2 Correlatieplot cadmium- en hypoxiatolerantie

Met een p-waarde van 0.438 kan besloten worden dat er geen significante correlatie bestaat tussen

de cadmium- en hypoxiatolerantie. Een van de gekende mechanismen voor cadmiumtolerantie is de

productie van metallothioneïnes (Shaw et al., 2007). Connon et al. (2008) vonden een verband tussen

de productie van deze metallothioneïnes en hypoxiastress in Daphnia sp. waarbij de stressrespons

ten gevolge van hypoxiacondities zich weerspiegelt in hogere metallothioneïne synthese. De hogere

of lagere tolerantie voor de metaaldruk is bij de Daphnia magna klonen enkel te wijten aan natuurlijk

aanwezige genetische variatie die mogelijk voor een hogere synthese van metallothioneïnes zou

kunnen zorgen. In dit opzicht zou voor cadmiumtolerante klonen een hogere hypoxiatolerantie

verwacht worden, wat echter in dit experiment weerlegd wordt door de afwezigheid van een

correlatie tussen beide toleranties. Waarschijnlijk wordt camdiumtolerantie door meer dan alleen

een hogere metallothioneïne synthese bepaald en mogen conclusies rond correlatie tussen

cadmiumtolerantie en hypoxiastress zich niet beperken tot deze factor. Het feit dat meerdere

factoren een rol kunnen spelen in een verhoogde tolerantie t.o.v. cadmium kan een verklaring

vormen waarom hier geen correlatie werd waargenomen.

Verder is enige omzichtigheid bij het interpreteren van deze resultaten nodig. Ten eerste is de

cadmium- en hypoxiatolerantie berekend op basis van de verhouding van het aantal juvenielen uit de

34

respectievelijke stressbehandeling ten opzichte van de controlebehandeling. De toleranties zijn

gebaseerd op slechts 1 meetpunt, met name reproductie. Daarnaast zijn lengte en overleving ook

twee relevante indicatoren om de tolerantie voor een bepaalde stressor in beeld te brengen. Echter

de data bij cadmiumtolerantie voor deze twee meetpunten ontbrak.

Ten tweede gelden conclusies rond deze cadmium- en hypoxiatolerantie enkel voor

laboratoriumomstandigheden. Dit onderzoek gebeurde in afgesloten BOD-flessen waardoor contact

met de atmosfeer voor diffusieve ademhaling via de lichaamswand onmogelijk werd gemaakt.

Volgens Nebeker et al. (1992) is de overlevingskans onder hypoxiacondities ongeveer 70 % lager

indien er geen toegang tot het wateroppervlak is. Hierdoor kan de tolerantie voor hypoxiastress

hoger liggen in natuurlijke omstandigheden waar uitwisseling aan het oppervlak wel mogelijk is. De

resultaten van Nebeker et al. (1992) dienen echter genuanceerd te worden. De 70 % lagere

overlevingskans werd gemeten in laboratoriumomstandigheden. In natuurlijke omstandigheden

zullen de watervlooien lagere overlevingskans hebben aan het wateroppervlak omdat onder

hypoxiastress de hemoglobineconcentratie stijgt (Seidl et al., 2005). Hierdoor worden de

watervlooien minder transparant en stijgt het risico op predatie in natuurlijke omstandigheden

omdat de minder transparante watervlooien meer zichtbaar worden aan het wateroppervlak (Confer

et al., 1978). In natuurlijke omstandigheden zou dus het verschil in overlevingskans tussen al dan niet

toegang hebben tot het wateroppervlak kleiner kunnen zijn dan 70%.

De conclusies uit dit experiment kunnen een goede basis vormen als uitgangspunt voor de

extrapolatie naar populatieniveau in een reëel ecosysteem, maar al de natuurlijke invloeden die

toleranties kunnen beïnvloeden zijn op laboschaal geëlimineerd. Uit dit voorbeeld blijkt dat voor een

correcte conclusie over correlatie tussen verschillende stresstoleranties een veel bredere

interpretatie nodig is dan de resultaten uit het labo-experiment. Verder onderzoek naar hoe de

experimenten meer waarheidsgetrouw kunnen uitgevoerd worden kan meer accurate data

opleveren rond toleranties voor bepaalde stressoren. Hierdoor zouden mogelijke correlaties tussen

verschillende toleranties ook een meer praktische invalshoek en grotere meerwaarde kennen naar

ecomanagement van verontreinigde gebieden die lijden onder de gevolgen van klimaatverandering.

35

4.1.2 Interpretatie van de fysiologische parameters

Gedurende het hypoxia-experiment werden drie fysiologische parameters opgemeten : lengte na 21

dagen, reproductie en mortaliteit (zie punt 3.3 ‘Hypoxiatesten’).

4.1.2.1 Lengte

De resultaten van het GLM voor de hoofdeffecten Kloon, Behandeling en Moeder(Kloon) en voor het

interactie-effect tussen Kloon en Behandeling zijn weergegeven in Tabel 4.2. Het effect Moeder werd

genest in Kloon.

Uit Tabel 4.2 blijkt dat de drie hoofdeffecten “Kloon”, “Behandeling” en “Moeder(Kloon)” statistisch

significant zijn (alle p-waarden < 0,05). Het interactie-effect tussen “Kloon” en “Behandeling”

daarentegen is niet significant (p = 0,57).

Op het 95 % significantieniveau kan besloten worden dat tussen de 20 geteste klonen een significant

verschil in lengte na 21 dagen gemeten werd (hoofdeffect “Kloon”). De resultaten, na post hoc

analyse van dit effect, zijn in Figuur 4.3 weergegeven. In Figuur 4.3 staan de gemiddelde lengtes per

kloon en per behandeling afgebeeld. Klonen met eenzelfde letter vertonen geen significant verschil

in lengte. De rode pijl boven de klonen MO11 en ZW4-F7 duidt op het feit dat deze significante

verschillen vertonen met alle andere 19 klonen.

Op het 95 % significantieniveau kan besloten worden dat tussen de 2 verschillende behandelingen,

hypoxiabehandeling (3 mg O2 l-1) en controlebehandeling (9 mg O2 l-1), een significant verschil in

lengte na 21 dagen werd gemeten (hoofdeffect “Behandeling”). Dit lijkt de gemiddelde reductie in

lichaamslengte van 8 % bij Daphnia magna uit de experimenten van Seidl et al. (2005) te bevestigen.

Het voordeel van een kleinere lichaamslengte onder hypoxiastress is een lagere zuurstofvraag om de

zuurstofhomeostase te onderhouden (tot 22 % lager). Bovendien is bij een kleinere

lichaamsoppervlakte het diffusief transport van zuurstofmoleculen doorheen de lichaamswand hoger

in vergelijking met een grotere lichaamslengte (Pirow et al., 2004). Tenslotte, kan ook, op het 95 %

Tabel 4.2 Algemene samenvatting GLM voor lengte (SS: Sums of Squares; MS: Mean Square; Den. Syn.: Denominator Synthesis; df: vrijheidsgraden)

Effect SS Degr. of MS Den.Syn. Den.Syn. F p

(F/R) Freedom Error df Error MS

Intercept Fixed 2225,91 1 2225,91 19,25 0,50 4419,88 0,00

Kloon Random 11,51 19 0,61 39,64 0,27 2,24 0,02

Behandeling Fixed 0,22 1 0,22 22,71 0,02 12,68 0,00

Moeder(Kloon) Random 12,15 40 0,30 197,00 0,02 16,14 0,00

Kloon*Behandeling Random 0,29 17 0,02 197,00 0,02 0,90 0,57

Error

3,71 197 0,02

36

significantieniveau, besloten worden dat tussen de moeders een significant verschil in lengte na 21

dagen werd gemeten. Echter het hoofdeffect “Moeder” werd hier onderzocht als een geneste

variabele in de variabele “Kloon”. De relevante significanties zijn enkel diegene tussen de moeders

van eenzelfde kloon. De klonen waarbij tussen de verschillende moeders significanties gevonden

werden, zijn in Figuur 4.3 aangeduid met een rood kader op de abscis. Deze significanties tussen de 3

moeders kunnen toegeschreven worden aan maternale effecten, waaraan een deel van de fout op

de gemeten waarden kan toegeschreven worden.

Uit de resultaten van het GLM blijkt een afwezigheid van het interactie-effect “Kloon*Behandeling”.

Hieruit kan besloten worden dat alle 20 geteste klonen eenzelfde reactie vertoonden op de

hypoxiabehandeling in termen van lengte.

37

Figu

ur

4.3

Gem

idd

eld

e le

ngt

e p

er k

loo

n e

n p

er

be

han

de

ling

na

21

dag

en

me

t si

gnif

ican

ties

vo

or

"Klo

on

" en

"M

oed

er"

38

4.1.2.2 Reproductie

Figuur 4.4 toont de gemiddelde reproductie per individu voor elke kloon en behandeling. De

resultaten na toepassing van het GLM zijn weergegeven in Tabel 4.3.

Figuur 4.4 Gemiddelde reproductie per individu per kloon en per behandeling

Uit Tabel 4.3 blijkt dat het hoofdeffect “Kloon” en het interactie-effect tussen “Kloon” en

“Behandeling” niet statistisch significant zijn (p-waarden > 0,05). Alleen het hoofdeffect

“Behandeling” vertoont een significantie (p = 0,00). Op het 95 % significantieniveau kan besloten

worden dat tussen de 2 verschillende behandelingen, hypoxiabehandeling (3 mg O2 l-1) en

controlebehandeling (9 mg O2 l-1), een significant verschil in reproductie werd waargenomen. Het

valt eenvoudig te verklaren dat in de controlebehandeling de reproductie hoger ligt doordat de

Tabel 4.3 Algemene samenvatting GLM voor reproductie (SS: Sums of Squares; MS: Mean Square; Den. Syn.: Denominator Synthesis; df: vrijheidsgraden)



Intercept Fixed 311780,10 1,00 311780,1 19,00 692,79 450,03 0,00

Kloon Random 13163,00 19,00 692,8 19,00 618,87 1,12 0,40

Behandeling Fixed 10684,80 1,00 10684,8 19,00 618,87 17,27 0,00

Kloon*Behandeling Random 11758,50 19,00 618,90 80,00 455,31 1,36 0,17

Error

36424,90 80,00 455,30

39

energieallocatie in het geval van de controlebehandeling vlugger naar reproductie kan gebeuren, in

tegenstelling tot de hypoxiabehandeling waar Daphnia magna meer energie nodig heeft voor de

aanpassingsmechanismen tegen de stressfactor. Meerbepaald de energie nodig voor hogere

hemoglobineproductie, hoger slagritme van de thoracopoden, hoger hartritme, …. gaat ten koste van

de reproductie (Nisbet et al., 2010). In tegenstelling met de bevindingen van Seidl et al. (2005) wordt

in dit onderzoek wel degelijk een significant effect van hypoxiastress op reproductiviteit

waargenomen.

Voor het hoofdeffect “Kloon” werd op het 95 % significantieniveau geen significant verschil in

reproductie waargenomen. Echter, bij de hypoxiatest met 18 Daphnia pulex klonen waarvan

sommige geadapteerd zijn aan cadmium na jarenlange blootstelling aan zware metalen, blijkt een

significant effect op reproductie tussen geadapteerde en niet-geadapteerde klonen (zie punt 4.2

‘Hypoxiatest met Daphnia pulex’).

4.1.2.3 Mortaliteit

Figuur 4.5 geeft de percentages voor overleving per kloon en per behandeling weer.

Figuur 4.5 Procentuele overleving per kloon per behandeling

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100%

Kloon

% Overleving na 21d9 mg/l

3 mg/l

40

De resultaten voor de niet parametrische gepaarde Wilcoxon Signed Rank Test zijn samengevat in

Tabel 4.4.

Tabel 4.4 Resultaten niet parametrische gepaarde Wilcoxon Signed Rank Test voor % overleving per kloon



mortaliteit werd waargenomen (p = 0,001715).

Nonparametric comparisons of two variables dialog

Wilcoxon Matched Pairs Test (GLM % Overleving Bgsin)

Marked tests are significant at p <0,05000

Pair of Variables Valid N T Z p-level

3 mg/l & 9 mg/l 20 13,50000 3,135626 0,001715

41

4.2 Hypoxiatest met Daphnia pulex

4.2.1 Controle batch-effect

Bij de uitvoering van de hypoxiatest met Daphnia pulex werden de 18 Daphnia pulex klonen

willekeurig opgedeeld in 2 batches omwille van praktische redenen. Het aantal klonen en replica’s

was te hoog om in één test op te nemen en tweedagelijks te verversen, zie punt 3.3 ‘Hypoxiatesten’.

Tabel 4.5 toont de indeling van de klonen in beide batches. Om met mogelijke batcheffecten

rekening te kunnen houden in de verwerking van de resultaten werden een geadapteerde kloon

(MF4) en een niet-geadapteerde kloon (G12) opgenomen in beide batches. Voor de drie gemeten

fysiologische parameters, met name : lengte, reproductie en mortaliteit kon dan aan de hand van

een onafhankelijke T-test mogelijke significante batcheffecten opgespoord worden. In Tabel 4.6

worden de p-waarden voor de 3 T-testen voor beide klonen weergegeven.

Tabel 4.6 p-waarden uit de onafhankelijke T-test van de batcheffecten voor de 3 gemeten

fysiologische parameters

Uit Tabel 4.6 blijkt dat er geen significante batcheffecten zijn voor de drie fysiologische parameters

(alle p-waarden > 0,05). Bijgevolg kunnen de resultaten van beide batches opgenomen worden in

eenzelfde dataset welke aan de hand van het GLM verder verwerkt wordt in punt 4.2.2 ‘Interpretatie

van de fysiologische parameters’.

4.2.2 Interpretatie van de fysiologische parameters

Gelijkaardig aan het hypoxia-experiment met Daphnia magna werden voor het hypoxia-experiment

met Daphnia pulex drie fysiologische parameters opgemeten : lengte na 21 dagen, reproductie en

mortaliteit (zie punt 3.3 ‘Hypoxiatesten’).

Tabel 4.5 Indeling van de klonen in 2 batches

Batch 1 MF4 G12 S9 BH3 S1 MC13 K10 J4 MF6 K13 S14 K3 MC8

Batch 2 MF4 G12 BR1 K2 L7 BR16 G10

Independent T test

Lengte Reproductie Survivaltime

G12 Batch 1 vs Batch 2 0,164 0,172 0,305

MF4 Batch 1 vs Batch 2 0,535 0,544 0,113

42

4.2.2.1 Lengte

De resultaten van het GLM voor de hoofdeffecten Kloon(Adaptatie), Adaptatie en Behandeling en

voor het interactie-effect tussen Kloon(Adaptatie) en Behandeling en Adaptatie en Behandeling zijn

weergegeven in Tabel 4.7. Het effect Kloon werd genest in Adaptatie.



Intercept Fixed 407,69 1 407,69 16,55408 0,1830 2227,6 0,000000

Kloon(Adaptatie) Random 3,4828 16 0,2177 15,40562 0,0157 13,853 0,000003

Adaptatie Fixed 4,8149 1 4,8149 16,59087 0,1810 26,588 0,000085


Kloon(Adaptatie*Behandeling) Random 0,2181 14 0,0156 71,00000 0,0189 0,820 0,644866

Adaptatie*Behandeling Fixed 0,1686 1 0,1686 17,07528 0,0158 10,638 0,004575

Error

1,3484 71 0,0190

Het eerste hoofdeffect dat duidt op een effect van de hypoxiastress op de lengte van de Daphnia

pulex klonen gemeten na 21 dagen is het hoofdeffect “Behandeling”. Op het 95 % significantieniveau

kan besloten worden dat tussen de 2 verschillende behandelingen, hypoxiabehandeling (3 mg O2 l-1)

en controlebehandeling (9 mg O2 l-1), een significant verschil in lengte na 21 dagen werd gemeten (p =

0,024758).

Een tweede hoofdeffect dat onderzocht werd is “Adaptatie”. Op het 95 % significantieniveau kan

besloten worden dat tussen de geadapteerde (A) en niet-geadapteerde (NA) klonen een significant

verschil in lengte na 21 dagen werd gemeten (p = 0,000085).

Tussen beide effecten “Behandeling” en “Adaptatie” werd ook een significant interactie-effect

genoteerd (p = 0,004575). De resultaten van een verdere Unequal N HSD post hoc analyse voor dit

interactie-effect zijn weergegeven in Tabel 4.8. Ter verdere verduidelijking werd het interactie-effect

ook schematisch afgebeeld in Figuur 4.6.

Tabel 4.7 Algemene samenvatting GLM voor lengte (SS: Sums of Squares; MS: Mean Square; Den. Syn.: Denominator Synthesis; df: vrijheidsgraden)

43

Tabel 4.8 Unequal N HSD post hoc analyse voor het interactie-effect tussen “Adaptatie” en

“Behandeling” (Voor iedere behandeling wordt horizontaal de gemiddelde gemeten waarde

weergegeven. MS: Mean Square; df: vrijheidsgraden)

Uit de waarden weergegeven in Tabel 4.8 blijkt dat binnen beide behandelingen, hypoxiabehandeling

(3 mg O2 l-1) en controlebehandeling (9 mg O2 l

-1), een significant effect in lengte bestaat tussen de

geadapteerde en niet-geadapteerde klonen (p = 0,000150). De twee groepen van klonen verschillen

dus niet alleen in hun reactie op hypoxiabehandeling, maar ook in de controlebehandeling. Verder

blijken de geadapteerde klonen geen significante verschillen te hebben tussen de behandelingen (p =

0,996727), in tegenstelling tot de niet-geadapteerde klonen die wel een significant effect vertonen

tussen beide behandelingen (p = 0,024564). Deze waarneming bevestigt nogmaals de hypothese dat

Unequal N HSD; variable Lengte (GLM Lengte)

Approximate Probabilities for Post Hoc Tests

Error: Between MS = ,01899, df = 71

Adaptatie

Behandeling {1} 1,8991

{2} 2,0506

{3} 2,4755

{4} 2,4686

NA 3 {1}

0,024564 0,000150 0,000150

NA 9 {2} 0,024564

0,000150 0,000150 A 3 {3} 0,000150 0,000150

0,996727

A 9 {4} 0,000150 0,000150 0,996727

Figuur 4.6 Plot van het interactie-effect “Adaptatie*Behandeling”

44

de geadapteerde klonen geen significant effect ondervinden van hypoxiastress op hun lengte na 21

dagen, en dus voor deze parameter toleranter zijn voor hypoxiastress, terwijl dit bij niet-

geadapteerde klonen wel het geval is.

Uit Tabel 4.7 blijkt ook het hoofdeffect “Kloon(Adaptatie)” significanties te vertonen voor de

parameter lengte. Op het 95 % significantieniveau kan dus besloten worden dat er tussen de

geadapteerde klonen onderling en de niet-geadapteerde klonen onderling een significant verschil in

lengte na 21 dagen gemeten werd. De resultaten van een Unequal N HSD post hoc test zijn in Figuur

4.7 weergegeven. In Figuur 4.7 staan de gemiddelde lengtes per kloon (geadapteerd of niet) en per

behandeling afgebeeld. Klonen binnen de groep “geadapteerd” en “niet-geadapteerd” met eenzelfde

letter vertonen geen significant verschil in lengte.

Figuur 4.7 Gemiddelde lengte per kloon en per behandeling met significanties voor "Kloon(Adaptatie)"

Uit de resultaten van het GLM blijkt een afwezigheid van het interactie-effect

“Kloon(Adaptatie)*Behandeling”. Hieruit kan besloten worden dat alle geadapteerde klonen

gelijkaardig op de hypoxiastress reageren. Hetzelfde geldt voor de niet-geadapteerde klonen.

45

4.2.2.2 Reproductie

De resultaten van het GLM voor de hoofdeffecten Kloon(Adaptatie), Adaptatie, Behandeling en voor

het interactie-effect tussen Kloon(Adaptatie) en Behandeling en Adaptatie en Behandeling zijn

weergegeven in Tabel 4.9.

In de data voor reproductie werd opnieuw een significant effect gevonden voor het hoofdeffect

“Adaptatie”. Op het 95 % significantieniveau kan besloten worden dat tussen de geadapteerde (A) en

niet-geadapteerde (NA) klonen een significant verschil in reproductie geldt (p = 0,000003). De

cadmiumgeadapteerde klonen reproduceren meer waardoor de geadapteerde populatie hogere

overlevingskansen heeft in een milieu met hypoxia-omstandigheden. In tegenstelling met de

bevindingen voor de parameter lengte, werd bij reproductie voor het interactie-effect tussen

“Adaptatie” en “Behandeling” geen effect waargenomen (p = 0,288629). Geadapteerde en niet-

geadapteerde klonen reageren op het niveau van de reproductie dus gelijkaardig op hypoxiastress.

Ter verdere verduidelijking werd het interactie-effect ook schematisch afgebeeld in Figuur 4.8.

Tabel 4.9 Algemene samenvatting GLM voor Reproductie (SS: Sums of Squares; MS: Mean Square; Den. Syn.: Denominator Synthesis; df: vrijheidsgraden)



Intercept Fixed 121732,9 1 12173 16,125 1022,83 119,01 0,000000 Kloon(Adaptatie) Random 16826,6 16 1051,7 16,000 135,372 7,7687 0,000087 Adaptatie Fixed 49748,4 1 49748 16,122 1023,38 48,611 0,000003 Behandeling Fixed 1572,2 1 1572,2 16,981 135,126 11,635 0,003332 Adaptatie*Behandeling Fixed 162,2 1 162,2 16,962 135,130 1,2000 0,288629 Kloon(Adaptatie*Behandeling) Random 2166,0 16 135,4 84,000 127,472 1,0620 0,403740 Error

10707,7 84 127,5

46

Figuur 4.8 Plot van het interactie-effect “Adaptatie*Behandeling”

Uit deze bevindingen zou men kunnen stellen dat het eerder beschreven waargenomen significante

hoofdeffect “Adaptatie” tussen de geadapteerde en niet-geadapteerde klonen niet het gevolg is van

de aangelegde hypoxiastress (behandeling), maar eerder een gevolg is van variatie tussen beide

groepen van klonen.

De hypothese dat het effect bij “Adaptatie” geen gevolg is van de hypoxiastress maar eerder dient

toegeschreven te worden aan variatie tussen beide groepen klonen wordt bovendien bevestigd door

het significant effect gevonden voor het hoofdeffect “Kloon(Adaptatie)” (p = 0,000087) en het niet

significant effect voor de interactie “Kloon(Adaptatie)*Behandeling”. Hieruit blijkt opnieuw dat de

geadapteerde klonen onderling en niet-geadapteerde klonen onderling significante verschillen tonen

voor reproductie en beide groepen (geadapteerd en niet-geadapteerd) gelijkaardig reageren op

hypoxiastress. De resultaten van een Unequal N HSD post hoc test voor het hoofdeffect

“Kloon(Adaptatie)” zijn in Figuur 4.9 weergegeven. In Figuur 4.9 staat de gemiddelde reproductie per

kloon en per behandeling afgebeeld en de klonen met eenzelfde letter vertonen geen significant

verschil in reproductie.

47

Figuur 4.9 Gemiddelde Reproductie per kloon en per behandeling met significanties voor "Kloon(Adaptatie)"

4.2.2.3 Mortaliteit


Figuur 4.10 Procentuele overleving per kloon

48


Tabel 4.10.

Tabel 4.10 Resultaten niet parametrische gepaarde Wilcoxon Signed Rank Test voor % overleving

per kloon



mortaliteit werd waargenomen (p = 0,006490).

Nonparametric comparisons of two variables dialog

Wilcoxon Matched Pairs Test (GLM % Overleving Bgsin)

Marked tests are significant at p <0,05000


3 mg/l & 9 mg/l 18 19,00000 2,721941 0,006490

49

4.3 Cadmium-M. aeruginosa Test

4.3.1 Correlatie van de toleranties

Voor de parameters lengte en reproductie werd de relatieve cadmium- en M. aeruginosa-tolerantie

voor de 20 Daphnia magna klonen berekend als respectievelijk de ratio van de gemiddelde lengte bij

cadmiumbehandeling tot de gemiddelde lengte bij controlebehandeling en de ratio van de

gemiddelde waarde voor R0 bij cadmiumbehandeling tot de gemiddelde waarde voor R0 bij

controlebehandeling. De correlatie plots voor beide parameters zijn gegeven in Figuur 4.11.

Met een p-waarde van 0,922 en 0,372 kan besloten worden dat er geen significante correlatie

bestaat tussen de cadmium- en hypoxiatolerantie voor respectievelijk lengte en reproductie. In

tegenstelling met de bevindingen van Glaholt et al. (2010), waar voor de cadmiumgeadapteerde

Daphnia pulex klonen een cotolerantie gevonden werd tussen cadmium- en M. aeruginosa-stress,

werd in het experiment met de Daphnia magna klonen dergelijke correlatie tussen de tolerantie voor

beide stressoren niet gevonden. Deze bevinding is een aanwijzing dat de geadapteerde D. pulex

klonen een zelfde aanpassingsmechanisme zouden gebruiken voor beide stressoren en dat de

historische cadmiumadaptatie hen in staat stelt tolerantie te vertonen tegen de nieuwe M.

aeruginosa-stressor. De D. magna klonen beschikken niet over een historisch geadapteerde

cadmiumtolerantie en het effect van M. aeruginosa-stress op de verschillende klonen is niet

gecorreleerd met de cadmiumtolerantie eigen aan elke kloon.

Figuur 4.11 Correlatieplot (Casewise MD deletion): cadmium (Cd) tolerantie vs. M.aeruginosa (MC)

tolerantie voor lengte (links) en voor reproductie op basis van R0 (rechts).

50

4.3.2 Interpretatie van de parameters

Gedurende de cadmium-M. aeruginosa test werden drie fysiologische parameters opgemeten :

lengte na 21 dagen, reproductie en mortaliteit (zie punt 3.4 ‘Cadmium-M. aeruginosa test’).

Gelijkaardig aan de hypoxiatest met Daphnia pulex werden in de Cadmium-M. aeruginosa test de 20

Daphnia magna klonen willekeurig opgedeeld in 2 batches omwille van praktische uitvoerbare

redenen. Het aantal klonen en replica’s was te hoog om in één test op te nemen en tweedagelijks te

verversen, zie punt 3.4 ‘Cadmium-M. aeruginosa Test’. Tabel 4.11 toont de indeling van de klonen in

beide batches. Om met mogelijke batcheffecten te kunnen rekening houden in de verwerking van de

resultaten werd in het General Linear Model (GLM) een extra parameter toegekend aan elk

datapunt, met name Batch 1 of Batch 2 en werd de parameter “Kloon” genest in deze parameter

“Batch”.

Tabel 4.11 Willekeurige indeling van de klonen in 2 batches

Batch 1 KNO15-NF13 KNO17-51 KNO17-NF8 MO5 TER2-20 TER2-25

MO11 OM3-5 OM3-12 TER1-22 ZW4-F7 ZW4-NF10

Batch 2 KNO15-F3 KNO15-F7 LRV-19 LRV-30

OM2-24 OM2-25 OM3-8 TER1-13

4.3.2.1 Lengte

De resultaten van het GLM voor de hoofdeffecten Kloon(Batch), Behandeling en Batch en voor het

interactie-effect tussen Kloon(Batch) en Behandeling zijn weergegeven in Tabel 4.12. Het effect

Kloon werd genest in Batch.

Tabel 4.12 Algemene samenvatting GLM voor lengte(SS: Sums of Squares; MS: Mean Square; Den.

Syn.: Denominator Synthesis; df: vrijheidsgraden)



Intercept Fixed 5376,5 1 5376,5 0,9920 5,030385 1068,8 0,019986 Kloon(Batch) Random 43,159 18 2,398 59,895 0,252502 9,496 0,000000 Behandeling Fixed 157,28 3 52,428 60,912 0,249294 210,30 0,000000 Batch Random 4,969 1 4,969 18,239 2,082376 2,386 0,139572 Kloon(Behandeling*Batch) Random 14,968 57 0,263 584,00 0,099810 2,631 0,000000 Error

58,289 584 0,100

51

Voor de parameter lengte zijn er geen significante verschillen gevonden tussen de 2 batches (p-

waarde = 0,139572). Bijgevolg kunnen de resultaten uit het GLM algemeen aanvaard worden voor de

gehele dataset van de 20 Daphnia magna klonen.

Uit Tabel 4.12 blijkt dat de twee hoofdeffecten “Kloon(Batch)”, “Behandeling” en het interactie-

effect tussen “Kloon(Batch)” en “Behandeling” statistisch significant zijn (alle p-waarden = 0). Op het

95 % significantieniveau kan uit het hoofdeffect “Kloon(Batch)” besloten worden dat tussen de 20

geteste klonen een significant verschil in lengte na 21 dagen gemeten werd.


met name : controle (Ctrl), cadmium (Cd), M. aeruginosa (MC), cadmium + M. aeruginosa (Cd+MC)

behandeling een significant verschil in lengte na 21 dagen werd gemeten. De p-waarden voor deze

Unequal N HSD post hoc test zijn weergegeven in Tabel 4.13.

Tabel 4.13 p-waarden voor de Unequal N HSD post hoc test voor het hoofdeffect "Behandeling".

(Voor iedere behandeling wordt horizontaal de gemiddelde gemeten waarde weergegeven. MS:

Mean Square; df: vrijheidsgraden.)

Uit de resultaten van het GLM en de post hoc testen hierboven beschreven kan besloten worden dat

de cadmium-, M. aeruginosa- en cadmium + M. aeruginosa-behandeling significant verschillen met

de controlebehandeling en bovendien ook onderling (in alle mogelijke binaire combinaties)

significante verschillen vertonen. De stress als gevolg van de aanwezigheid van cadmium, M.

aeruginosa of een combinatie van beide stressoren oefent een significant effect uit op de groei van

de Daphnia magna klonen na 21 dagen blootstelling aan de desbetreffende stressor(en). Indien de

behandelingen gerangschikt worden volgens toenemende gemiddelde lengte geldt de rangschikking

“cadmium + M. aeruginosa – M. aeruginosa – cadmium – controle”. Deze rangschikking en de

hierboven besproken significante verschillen tussen de vier behandelingen bewijst dat de cadmium +

M. aeruginosa-behandeling gevolgd door de M. aeruginosa-behandeling het meest negatieve effect

hebben voor de lengte. De stress bij de cadmiumbehandeling is minder nefast voor de lengte in

vergelijking met de twee andere stressbehandelingen. Deze waarnemingen kunnen mogelijks

verklaard worden aan de hand van de energieallocatie in de testorganismen blootgesteld aan deze

Unequal N HSD; variable Lengte Approximate Probabilities for Post Hoc Tests Error: Between MS = ,09981, df = 584,00

Behandeling {1} 3,8906 {2} 3,5104 {3} 3,0802 {4} 2,5846

Ctrl {1}

0,000008 0,000008 0,000008

Cd {2} 0,000008

0,000008 0,000008

MC {3} 0,000008 0,000008

0,000008

Cd+MC {4} 0,000008 0,000008 0,000008

52

stressfactoren (Nisbet et al., 2010). In de cadmiumbehandeling dienen de testorganismen één toxine,

cadmium, te bestrijden. Voor de M. aeruginosa-behandeling zullen ze waarschijnlijk naast het

hoofdtoxine (microcystine) ook de toxische effecten van andere, niet gedefinieerde toxines

geproduceerd door Microcystis aeruginosa bestrijden. Daarenboven hebben ze daarvoor minder

energie beschikbaar want de helft van het aanwezige voedsel bestaat uit Microcystis aeruginosa, wat

van mindere kwaliteit is (Lürling, 2003). Vanzelfsprekend volgt uit deze energieallocatie theorie dat

de gecombineerde cadmium + M. aeruginosa-behandeling de meeste energie vergt voor onderhoud

en bestrijding tegen alle toxines tesamen en bijgevolg de testorganismen de minste energiereserves

hebben voor te investeren in hun groei.

Tot slot werd voor het interactie-effect tussen “Kloon(Batch)” en “Behandeling” ook significanties

gevonden. De resultaten van een Unequal N HSD post hoc test voor dit interactie-effect zijn in Figuur

4.12 en Tabel 4.14 en 4.15 (zie Bijlage A) weergegeven. Figuur 4.12 geeft de gemiddelde lengte na 21

dagen per kloon en per behandeling weer. Indien significante verschillen werden waargenomen

tussen de behandelingen voor dezelfde kloon zijn deze bovenaan de figuur weergegeven. In Tabel

4.14 en 4.15 (zie Bijlage A) zijn de p-waarden van de post hoc test weergegeven voor respectievelijk

de controle- en cadmiumbehandeling en de M. aeruginosa- en cadmium + M. aeruginosa-

behandeling. Elke tabel bevat de p-waarden voor 2 behandelingen telkens boven en onder de

hoofddiagonaal. Indien significante verschillen waargenomen werden tussen de klonen bij een

behandeling zijn deze in het rood weergegeven.

53

Figu

ur

4.12

Len

gte

na

21

dag

en

pe

r kl

oo

n p

er

be

han

de

ling

me

t si

gnif

ican

ties

per

klo

on

54

4.3.2.2 Reproductie

De resultaten na toepassing van het GLM voor de 3 afgeleide parameters, besproken onder punt 3.4

‘Cadmium-M. aeruginosa test’, zijn weergegeven in Tabel 4.16, 4.17 en 4.18.

Tabel 4.16 Algemene samenvatting GLM voor de intrinsieke reproductiesnelheid rm. (SS: Sums of

Squares; MS: Mean Square; Den. Syn.: Denominator Synthesis; df: vrijheidsgraden)



Intercept Fixed 29,14 1 29,14 0,9986 0,194596 149,7 0,052068 Kloon(Batch) Random 0,271 18 0,015 57,361 0,005996 2,514 0,004272 Behandeling Fixed 3,265 3 1,088 57,859 0,005845 186,2 0,000000 Batch Random 0,193 1 0,193 18,064 0,014644 13,18 0,001901 Kloon(Behandeling*Batch) Random 0,348 57 0,006 583,00 0,000857 7,127 0,000000 Error

0,499 583 0,000

Tabel 4.17 Algemene samenvatting GLM voor de netto reproductiesnelheid R0. (SS: Sums of

Squares; MS: Mean Square; Den. Syn.: Denominator Synthesis; df: vrijheidsgraden)



Intercept Fixed 1169321 1 1169321 0,9992 67084,2 17,43 0,149811 Kloon(Batch) Random 60890 18 3383 54,037 2275,25 1,486 0,131592 Behandeling Fixed 706086 3 235362 2,9919 13022,6 18,07 0,020203 Batch Random 66553 1 66553 3,4819 14018,2 4,747 0,104990 Kloon(Behandeling*Batch) Random 122970 54 2277 688,00 655,10 3,476 0,000000 Error

450712 688 655

Tabel 4.18 Algemene samenvatting GLM voor de gemiddelde generatietijd T. (SS: Sums of Squares;

MS: Mean Square; Den. Syn.: Denominator Synthesis; df: vrijheidsgraden)



Intercept Fixed 138799,6 1 138799 0,9799 10,5737 13126 0,006089

Kloon(Batch) Random 218,2 18 12,1 57,364 18,3849 0,66 0,835193


Batch Random 10,6 1 10,6 18,249 11,8321 0,90 0,356446

Kloon(Behandeling*Batch) Random 1068,2 57 18,7 583,00 2,65494 7,06 0,000000

Error

1547,8 583 2,7

55

Voor de afgeleide parameters R0 en T werd op het 95 % significantieniveau geen batcheffect

waargenomen (p-waarde respectievelijk 0,104990 en 0,356446). Daarentegen werd voor rm op het

95 % significantieniveau wel een batcheffect waargenomen (p = 0,001901). Dit batcheffect kan

toegeschreven worden aan persoonseffecten en/of licht variabele labo-omstandigheden.

Uit de algemene resultaten van het GLM blijkt voor de afgeleide parameter rm voor het hoofdeffect

“Kloon(Batch)” een significant effect (p = 0,004272). Voor de afgeleide parameters R0 en T zijn er

geen significanties waargenomen voor het hoofdeffect “Kloon(Batch)” (p-waarden respectievelijk

0,131592 en 0,835193). Enkel voor de intrinsieke reproductiesnelheid rm tonen de 20 geteste klonen

significante verschillen. Voor deze populatie van Daphnia magna klonen worden significante

verschillen waargenomen in intrinsieke reproductiesnelheid. Een mogelijke verklaring is gebaseerd

op dezelfde bevindingen van Muyssen (2002) met de ‘metabolic cost’ hypothese. Als gevolg van

toxische stress verandert de homeostatische regulatie waardoor energiereserves worden verbruikt

ten koste van onder meer de reproductie. Verschillen in de homeostatische regulatie tussen de

klonen, verklaard het verschil in rm. In dit voorbeeld wordt het belang van behoud van de genetische

variatie binnen een populatie benadrukt. Het zorgt voor een variatie aan regulaties tegenover

stressoren en de meest energie-efficiënte adaptatietechnieken resulteren in de hoogste rm en met

de garantie op het voortbestaan van de populatie.

Op het 95 % significantieniveau werd voor het hoofdeffect “Behandeling” een effect voor de drie

afgeleide parameters waargenomen (p-waarden voor rm, R0 en T zijn respectievelijk 0; 0,020203 en

0). De resultaten van een Unequal N HSD post hoc test voor het hoofdeffect “Behandeling” voor de

drie afgeleide parameters zijn weergegeven in Tabel 4.19, 4.20 en 4.21.

Tabel 4.19 p-waarden voor de Unequal N HSD post hoc test voor rm voor hoofdeffect "Behandeling". (Voor iedere behandeling wordt horizontaal de gemiddelde gemeten waarde weergegeven. MS: Mean Square; df: vrijheidsgraden)

Unequal N HSD; variable Rm (GLM Reproductie)


Error: Between MS = ,00086, df = 583,00

Behandeling {1} 0,31 {2} 0,22 {3} 0,26 {4} 0,11

Ctrl {1} 0,000008 0,000008 0,000008

MC {2} 0,000008

0,000008 0,000008

Cd {3} 0,000008 0,000008

0,000008

Cd+MC {4} 0,000008 0,000008 0,000008

56

Tabel 4.20 p-waarden voor de Unequal N HSD post hoc test voor R0 voor hoofdeffect "Behandeling" (Voor iedere behandeling wordt horizontaal de gemiddelde gemeten waarde weergegeven. MS: Mean Square; df: vrijheidsgraden)

Tabel 4.21 p-waarden voor de Unequal N HSD post hoc test voor T voor hoofdeffect "Behandeling" (Voor iedere behandeling wordt horizontaal de gemiddelde gemeten waarde weergegeven. MS: Mean Square; df: vrijheidsgraden)

Uit de Tabellen 4.19, 4.20 en 4.21 kan op het 95 % significantieniveau besloten worden dat tussen de

4 verschillende behandelingen (in alle mogelijke onderlinge binaire combinaties), met name :

controle-, cadmium-, M. aeruginosa-, cadmium + M. aeruginosa-behandeling een significant verschil

in intrinsieke reproductiesnelheid, netto reproductiesnelheid en de gemiddelde generatie tijd werd

waargenomen. De stress als gevolg van de aanwezigheid van cadmium, M. aeruginosa of een

combinatie van beide stressoren heeft algemeen een significant effect op de reproductie van de

Daphnia magna klonen na 21 dagen blootstelling aan de desbetreffende stressor(en).

Opvallend uit de resultaten van de post hoc test voor het hoofdeffect “Behandeling” is de

rangschikking van de gemiddelde waarde voor de drie afgeleide parameters. Voor zowel rm als R0

geldt van hoog naar laag de rangschikking “controle – cadmium – M. aeruginosa – cadmium + M.

aeruginosa”. Voor T geldt van hoog naar laag de rangschikking “cadmium + M. aeruginosa – M.

aeruginosa – controle – cadmium”. Deze rangschikking en de hierboven besproken significante

verschillen tussen de vier behandelingen voor elk van de drie afgeleide parameters bewijst dat de

cadmium + M. aeruginosa-behandeling gevolgd door de M. aeruginosa-behandeling het meest

Unequal N HSD; variable Ro (GLM Reproductie)


Error: Between MS = 655,10, df = 688,00

Behandeling {1} 96,15 {2} 29,21 {3} 36,51 {4} 7,49

Ctrl {1} 0,000008 0,000008 0,000008

MC {2} 0,000008

0,027304 0,000008

Cd {3} 0,000008 0,027304

0,000008

Cd+MC {4} 0,000008 0,000008 0,000008

Unequal N HSD; variable T (GLM Reproductie)


Error: Between MS = 2,6549, df = 583,00

Behandeling {1} 14,69 {2} 15,41 {3} 13,45 {4} 17,10

Ctrl {1} 0,000207 0,000008 0,000008

MC {2} 0,000207

0,000008 0,000008

Cd {3} 0,000008 0,000008

0,000008

Cd+MC {4} 0,000008 0,000008 0,000008

57

negatieve effect hebben voor de reproductie. De stress bij de cadmiumbehandeling is minder nefast

voor de reproductie dan de M. aeruginosa- en cadmium + M. aeruginosa-behandeling. Het dient

opgemerkt te worden dat voor de gemiddelde generatietijd, T, de cadmiumbehandeling significant

lagere waarden vertoont dan de controlebehandeling. Een mogelijke verklaring is dat de organismen

in de cadmiumbehandeling een langere tijd nodig hebben om het adultstadium te bereiken in

vergelijking met de controlebehandeling en voldoende energiereserves te hebben opgebouwd voor

reproductie. Maar eens dit stadium bereikt, is de reproductie voldoende regelmatig en hoog genoeg

om een gemiddelde generatietijd lager dan de controlebehandeling te bekomen.

Voor alle drie de afgeleide parameters zijn op het 95 % significantieniveau voor het interactie-effect

“Kloon(Batch)*Behandeling” significante effecten waargenomen (p = 0). In Figuur 4.13, 4.14 en 4.15

staan respectievelijk de gemiddelde waarden voor rm, R0 en T per kloon en per behandeling. De

symbolen bovenaan de figuur geven significante verschillen weer tussen de behandelingen voor

eenzelfde kloon gevonden in de Unequal N HSD post hoc test voor het interactie-effect

“Kloon(Batch)*Behandeling”. In Tabel 4.22, 4.23, 4.24, 4.25 en 4.26 (zie Bijlage B) zijn de p-waarden

van de post hoc test weergegeven voor verschillen tussen klonen bij eenzelfde behandeling. Elke

tabel bevat de p-waarden voor 2 behandelingen telkens boven en onder de hoofddiagonaal voor

respectievelijk de controle- en cadmiumbehandeling en de M. aeruginosa- en cadmium + M.

aeruginosa-behandeling. Indien significante verschillen waargenomen werden tussen de klonen bij

een behandeling zijn deze in het rood weergegeven. Voor R0 zijn enkel de controle- en

cadmiumbehandeling gegeven vermits voor de M. aeruginosa- en cadmium + M. aeruginosa-

behandeling geen significante verschillen werden gevonden.

58

Figu

ur

4.13

: G

em

idd

eld

e in

trin

sie

ke r

ep

rod

uct

iesn

elh

eid

rm

pe

r kl

oo

n e

n p

er b

ehan

del

ing

met

sig

nif

ican

ties

per

klo

on

.

59

Figu

ur

4.14

: G

em

idd

eld

e n

ett

o r

ep

rod

uct

iesn

elh

eid

R0 p

er

klo

on

en

per

beh

and

elin

g m

et s

ign

ific

anti

es p

er k

loo

n.

60

Figu

ur

4.15

: G

em

idd

eld

e ge

ne

rati

eti

jd T

pe

r kl

oo

n e

n p

er

be

han

de

ling

met

sig

nif

ican

ties

per

klo

on

.

61

Uit onderzoek van De Schamphelaere et al. (2011) met cadmium geadapteerde en niet-geadapteerde

Daphnia pulex klonen bleek een positieve correlatie tussen de tolerantie voor cadmium en M.

aeruginosa blootstelling. In tegenstelling tot deze D. pulex klonen, waren de 20 D. magna klonen

gebruikt in dit experiment niet geadapteerd aan cadmium. Verschillen in cadmiumtolerantie tussen

deze klonen zijn het gevolg van standing genetic variation, genetische variatie aanwezig in de

populatie. Uit de resultaten met Daphnia magna kwam geen duidelijk onderscheid naar voor tussen

bepaalde klonen voor hun tolerantie voor één van de drie behandelingen. Er was een duidelijk

significant verschil tussen de vier behandelingen voor de drie afgeleide parameters omtrent

reproductie maar geen duidelijk patroon werd weergevonden in significante verschillen tussen de

klonen binnen een behandeling. Deze bevindingen bevestigen dat de gevonden cotolerantie tussen

cadmium- en M. aeruginosa-behandeling bij de geadapteerde Daphnia pulex klonen niet gevonden

kan worden bij de Daphnia magna klonen. De mate van tolerantie tegen één van de drie stressoren

vertoont geen wederkerig patroon.

62

4.3.2.3 Mortaliteit


Figuur 4.16 Procentuele overleving per kloon per behandeling


Tabel 4.27.

Tabel 4.27 Resultaten niet parametrische gepaarde Wilcoxon Signed Rank Test voor % overleving per kloon

Wilcoxon Matched Pairs Test (BgSin(% Overleving))

Marked tests are significant at p <,05000


Controle & M. aeruginosa 20 56,50 0,595 0,552077

Controle & Cadmium 20 16,00 2,864 0,004184

Controle & Cd+M. aeruginosa 20 35,00 0,314 0,753684

M. aeruginosa & Cadmium 20 31,00 2,373 0,017621

M. aeruginosa & Cd+M. aeruginosa 20 34,50 0,353 0,724082

Cadmium & Cd+M. aeruginosa 20 27,00 2,343 0,019118

Op het 95 % significantieniveau kan besloten worden dat alleen de cadmiumbehandeling significante

verschillen vertoont met de controle-, M. aeruginosa- en cadmium + M. aeruginosa-behandeling.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100%

Kloon

% Overleving na 21dControle Microcystis

Cadmium Cd+MC

63

Deze bevindingen zijn ook te zien op Figuur 4.16, waar de curve van de cadmiumbehandeling

beduidend lager ligt in vergelijking met de curven voor de andere behandelingen.

Uit de resultaten voor reproductie bleek de cadmiumbehandeling een minder groot effect te

vertonen in vergelijking met de M. aeruginosa- en cadmium + M. aeruginosa-behandeling. Voor

mortaliteit is het omgekeerde waar en vertoont cadmium het grootste effect. Deze vaststellingen

zouden verklaard kunnen worden met de energieallocatie in de testorganismen blootgesteld aan

deze stressfactoren (Nisbet et al., 2010). De organismen uit de cadmiumbehandeling dienen één

toxine, cadmium, te bestrijden. Voor de M. aeruginosa-behandeling zullen ze waarschijnlijk naast het

hoofdtoxine (microcystine) ook de toxische effecten van andere, niet gedefinieerde toxines

geproduceerd door Microcystis aeruginosa bestrijden. Daarenboven hebben ze daarvoor minder

energie beschikbaar want helft van het aanwezige voedsel bestaat uit M. aeruginosa, wat van

mindere kwaliteit is (Lürling, 2003). Vanzelfsprekend volgt uit deze energieallocatie theorie dat de

gecombineerde cadmium + M. aeruginosa-behandeling de meeste energie vergt voor onderhoud en

bijgevolg de minste energiereserves hebben. In dit opzicht zullen de testorganismen van de

cadmiumbehandeling de grootste energiereserve hebben bovenop de energie nodig voor hun

onderhoud. Deze energie kan gespendeerd worden in een significant grotere lichaamslengte en

hogere reproductie (zie punt 3.2.1 ‘Lengte’ en 3.2.2 ‘Reproductie’). Maar de investering van deze

extra energie zal in een tijdsspanne van 21 dagen wel leiden tot een hogere mortaliteit in vergelijking

met de M. aeruginosa- en cadmium + M. aeruginosa-behandeling. Daarentegen is de extra energie

bij M. aeruginosa- en cadmium + M. aeruginosa-behandeling te schaars om te kunnen ingezet

worden bij reproductie. De organismen in deze twee behandelingen investeren meer energie in hun

onderhoud en groei vooraleer ze fysisch in staat zijn te reproduceren en overleven bijgevolg langer

dan de organismen uit de cadmiumbehandeling. Echter op populatieniveau weegt deze hogere

mortaliteit bij de cadmiumbehandeling niet op tegen het in stand houden van de populatie. De

investering in meer energie voor reproductie ten koste van de levensduur is in het geval van de

cadmiumbehandeling een overlevingsstrategie die bij de M. aeruginosa- en cadmium + M.

aeruginosa-behandeling niet gebeurt en tot uitsterving van de populatie zou kunnen leiden.

Deze verklaring voor de hogere cadmiummortaliteit aan de hand van de energieallocatie zou

gestaafd kunnen worden met onderzoek naar de energiereserves (suikers, koolhydraten, vetten) van

de testorganismen uit de verschillende behandelingen op verschillende tijdstippen gedurende de

chronische test. Onderzoek naar energieallocatie binnen de drie verschillende behandelingen in

combinatie met DEB (Dynamic Energy Budget, Nisbet, 2010) modellering zou deze hypothese veel

bijval kunnen opleveren.

64

4 Conclusies

Om de klassieke ecotoxicologie uit te breiden naar een meer accurate risicoschatting en –evaluatie is

er nood naar onderzoek over cotolerantie of cost-of-tolerance van organismen voor bepaalde

stressoren. Door de alsmaar grotere effecten ten gevolge van de klimaatverandering op aquatische

ecosystemen dient dit onderzoek zich voornamelijk te richten op de stressoren die een direct of

indirect effect zijn van deze klimaatverandering. In eerder onderzoek werd uit de historische

adaptatie van bepaalde Daphnia pulex klonen voor cadmiumstress reeds dergelijke cotolerantie voor

Microcystis aeruginosa gevonden (De Schamphelaere et al., 2010; Glaholt et al.,2010). In deze thesis

werd verder gezocht naar cotoleranties voor hypoxiastress en M. aeruginosa-stress voor meerdere

Daphnia magna en pulex klonen.

Uit de resultaten van de hypoxiatest met D. magna bleek het effect van de hypoxiastress een

significant effect te hebben op de parameters lengte, reproductie en mortaliteit. De correlatie tussen

de cadmiumtolerantie en hypoxiatolerantie voor de 20 geteste klonen bleek niet significant. Er werd

geen cotolerantie gevonden voor beide stressoren. Uit de hypoxiatest met D. pulex klonen bleek voor

de parameters lengte en reproductie een significant verschil tussen de geadapteerde en niet-

geadapteerde klonen. Voor de niet-geadapteerde klonen had de hypoxiastress effect op de lengte,

daar deze bevinding niet geldt voor de geadapteerde. Voor zowel geadapteerde als niet-

geadapteerde werd geen significant effect van de hypoxiastress op de reproductie gevonden. Uit

deze waarnemingen geldt voor de D. magna klonen geen verband tussen cadmiumtolerantie en

hypoxiatolerantie, daar bij D. pulex voor de geadapteerde klonen voor de parameter lengte het effect

van hypoxiastress geen significant effect heeft in tegenstelling tot de niet-geadapteerde waar wel

een effect werd waargenomen. De historische cadmiumadaptatie bij D. pulex zou hierbij een invloed

kunnen hebben op de tolerantie voor hypoxiastress op de lichaamslengte.

Bij de cadmium-M. aeruginosa test voor D. magna klonen hadden de cadmium-, M. aeruginosa- en

gecombineerde cadmium + M. aeruginosa-behandeling een significant effect op de lengte en de

reproductie. Enkel voor de cadmiumbehandeling was ook een effect gevonden op de mortaliteit.

Indien voor lengte en reproductie (in termen van R0) een correlatieplot gemaakt werd tussen

cadmiumtolerantie en M. aeruginosa-tolerantie bleek geen significante correlatie. Voor D. magna

werd net zoals bij de hypoxiatest geen cotolerantie gevonden tussen beide stressoren. Uit onderzoek

van Glaholt et al. (2010) met D. pulex klonen werd voor de cadmiumgeadapteerde klonen wel een

cotolerantie gevonden voor cadmium- en M. aeruginosa-stress.

65

Uit de hypoxia- en cadmium-M. aeruginosa testen blijkt de historische cadmiumadaptatie van de D.

pulex klonen hen in staat te stellen om hogere toleranties te vertonen voor andere stressoren. In

tegenstelling tot de D. magna klonen, waarbij geen onderscheid bestaat tussen geadapteerde of

niet-geadapteerde klonen maar de tolerantie voortkomt uit de aanwezige standing genetic variation

in de populaties, werd voor zowel hypoxia- als M. aeruginosa-stress geen cotolerantie

waargenomen.

Het belang van deze thesis is deel uit maken van de studie van schadelijke effecten van chemische

stoffen in aquatische milieus in combinatie met de invloed van klimaatverandering om op een

wetenschappelijk gefundeerde wijze deze hedendaagse problematiek objectief te benaderen. De

eerste stap naar een duurzaam risicomanagement is een zo accuraat en uitgebreid mogelijke risico-

evaluatie die het beleid in staat stelt om milieu en gemeenschap op een aanvaardbaar niveau te

verzoenen. De resultaten van deze thesis dragen bij tot het onderzoek naar de cotolerantie tussen

chemische stressoren en invloed van klimaatverandering en sporen aan tot grootschalig onderzoek

met een correcte vertaling van de resultaten naar een duurzamere toekomst.

66

5 Verder onderzoek

Om de resultaten bekomen uit de experimenten uitgevoerd op laboschaal een grotere

toepasbaarheid toe te kennen naar de praktijk zou men veranderingen kunnen maken aan de

testopzet om zo meer realistische situaties na te bootsen. Een paar voorbeelden die de testopzet een

meer reële situatie maken zijn o.a. een kunstmatige stroming of turbulentie invoeren, schaduwzones

voorzien in de testflessen, continue verversing van het medium, bij de hypoxiatesten het

wateroppervlak toegankelijk maken, … De resultaten bekomen uit deze meer reële experimenten

maken de extrapolatie van de effecten op individueel niveau naar populatieniveau betrouwbaarder

aangezien op populatieniveau het aantal interacties met externe factoren nog groter is.

Ten tweede is er nood aan verder onderzoek naar de meest geschikte manier om de gevonden data

zo correct en volledig mogelijk te gebruiken in risicomanagement. Daar op het niveau van

risicomanagement naar een verzoening tussen enerzijds het milieu en anderzijds de gemeenschap

gezocht wordt, dient men als wetenschapper een correct beeld te vormen over de consequenties van

de gevonden resultaten. Meer specifiek dient in deze thesis onderzocht te worden in welke mate de

al dan niet gevonden cotoleranties tussen verschillende stressoren een impact hebben op het

aquatisch ecosysteem dat steeds meer de gevolgen van de klimaatverandering ervaart. Verder

grootschalig onderzoek of de genetische adaptatie van natuurlijke populaties aan chemische stress

leidt tot lagere of hogere tolerantie aan toekomstige klimaatverandering kent een steeds groeiende

prioriteit. Onderzoek naar de genen die verantwoordelijk zijn in de cotolerantie van Daphnia sp. voor

bepaalde stressoren is een must voor een wetenschappelijk verantwoorde risico-evaluatie te kunnen

maken van de gecombineerde actie van de stressoren. Correcte interpretatie van deze resultaten

met het oog op toenemende klimaatverandering moeten het beleid in staat stellen de toekomst van

de ecosystemen veilig te stellen.

Uit de resultaten van zowel de hypoxiatesten als cadmium-M. aeruginosa test kan afgeleid worden

dat het hoofdeffect Kloon veelal significante effecten vertoont. Deze onderlinge verschillen tussen de

klonen wijzen op de nood naar grootschaliger onderzoek gebaseerd op meer klonen. Het in kaart

brengen van deze effecten zal de wetenschap helpen bij een meer accurate interpretatie van de

risico-evaluatie naar populatieniveau.

Om de effecten ten gevolge van de M. aeruginosa- en cadmium + M. aeruginosa-behandeling beter

te kunnen interpreteren is meer onderzoek nodig naar specificatie van de toxines geproduceerd door

Microcystis aeruginosa. Bovendien is er nood naar meer duidelijkheid over de lagere

voedingskwaliteit van het M. aeruginosa-dieet. Heeft deze lagere kwaliteit enkel te maken met de

67

toxiciteit of zijn de effecten van het M. aeruginosa-dieet deels te wijten aan een beperkte opname in

spijsverteringsstelsel? In de hoop dat verder onderzoek hieromtrent duidelijkheid schept zal men

mogelijke adaptatiemechanismen voor de waargenomen cotoleranties tussen cadmium- en M.

aeruginosa-stress kunnen opsporen.

Tot slot zou men kunnen onderzoeken hoe bij de interpretatie van de resultaten aan de hand van

een geïntegreerd model direct socio-economische consequenties kunnen opgenomen worden. De

invloed van klimaatverandering berekent op experimentele data wordt dan gekoppeld aan niet

alleen ecologische gevolgen, maar toont ook onmiddellijke consequenties voor de samenleving. De

bewustwording bij het grote publiek en de beleidsmakers is dan niet enkel gebaseerd op het

ecologische aspect, maar kent een directe weerslag op het meer voelbare socio-economische. Indien

men via het model voorspelling kan maken omtrent het visbestand, (drink)waterkwaliteit, … wordt

de multidisciplinariteit van de milieutoxicologie extra benadrukt.

68

6 Referentielijst

Arnell, N. W. (1998). Climate change and water resources in Britain. Climatic Change 39(1): 83-110.

Battino, R. &Clever, H. L. (1966). Solubility of gases in liquids. Chemical Reviews 66(4): 395-&.

Bodar, C. W. M., Vanleeuwen, C. J., Voogt, P. A. &Zandee, D. I. (1988). Effect of cadmium on the

reproduction strategy of daphnia-magna. Aquatic Toxicology 12(4): 301-309.

Campbell, P. (1995). Interactions between trace metals and aquatic organisms: A critique of the free-

ion activity model. Metals Speciation and Bioavailability in Aquatic Systems : 45-102.

Coëlho, M.B., Jochems, A. A. F., Joosten, F.W.F.G. (2009).Coëlho zakwoordenboek der geneeskunde.

Vol. 29: Elsevier.

Confer, J. L., Howick, G. L., Corzette, M. H., Kramer, S. L., Fitzgibbon, S. &Landesberg, R. (1978). Visual

predation by planktivores. Oikos 31(1): 27-37.

Connon, R., Hooper, H. L., Sibly, R. M., Lim, F. L., Heckmann, L. H., Moore, D. J., Watanabe, H.,

Soetaert, A., Cook, K., Maund, S. J., Hutchinson, T. H., Moggs, J., De Coen, W., Iguchi, T.

&Callaghan, A. (2008). Linking molecular and population stress responses in Daphnia magna

exposed to cadmium. Environmental Science & Technology 42(6): 2181-2188.

Craig, A., Hare, L. &Tessier, A. (1999). Experimental evidence for cadmium uptake via calcium

channels in the aquatic insect Chironomus staegeri. Aquatic Toxicology 44(4): 255-262.

Dejours, P. &Truchot, J. P. (1989).Comparative respiratory physiology - quantities, dimensions and

units. In Techniques in Comparative Respiratory Physiology - an Experimental Approach, Vol.

37, 3-19 (Eds C. R. Bridges and P. J. Butler). Cambridge: Cambridge Univ Press.

De Schamphelaere, K.A., Asselman, J., Glaholt, S., Colbourne, J., Janssen, C., Shaw, J.R. (2010).

Unraveling the genomic basis of the cross-tolerance of Cd-adapted Daphnia pulex to

cyanobacterial stress. Platform presentation at 31th SETAC-NA conference Portland: 7-11.

De Schamphelaere K.A., Glaholt, S., Asselman, J., Messiaen, M., De Coninck, D., Janssen, C.R.,

Colbourne, J.K. &Shaw, J.R. (2011). Will genetic adaptation of natural populations to

chemical pollution result in lower or higher tolerance to future climate change? Integrated

Environmental Assessment and Management (7): 141-143.

Flik, B. J. G. &Ringelberg, J. (1994). Increased phototaxis in the field leads to enhanced diel vertical

migration. Limnology and Oceanography 39(8): 1855-1864.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22De%20Schamphelaere%20KA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Glaholt%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Asselman%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Messiaen%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22De%20Coninck%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Janssen%20CR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Colbourne%20JK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shaw%20JR%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%22%5BAuthor%5D

69

Geng, M. &Duan, Z. H. (2010). Prediction of oxygen solubility in pure water and brines up to high

temperatures and pressures. Geochimica Et Cosmochimica Acta 74(19): 5631-5640.

Gillis, P. L., Chow-Fraser, P., Ranville, J. F., Ross, P. E. &Wood, C. M. (2005). Daphnia need to be gut-

cleared too: the effect of exposure to and ingestion of metal-contaminated sediment on the

gut-clearance patterns of D-magna. Aquatic Toxicology 71(2): 143-154.

Glaholt, S., De Schamphelaere, K.A., Asselman, J. &Shaw, J.R. (2010). How the industrial revolution

prepared Daphnia for global warming. Poster presentation at SETAC-NA Conference, 7-11

Nov. 2010.

Goulet, R. R., Krack, S., Doyle, P. J., Hare, L., Vigneault, B. &McGeer, J. C. (2007). Dynamic

multipathway modeling of Cd bioaccumulation in Daphnia magna using waterborne and

dietborne exposures. Aquatic Toxicology 81(2): 117-125.

Grime, J. P. (1989). The stress debate - symptom of impending synthesis. Biological Journal of the

Linnean Society 37(1-2): 3-17.

Gooseff, M. N., Strzepek, K. &Chapra, S. C. (2005). Modeling the potential effects of climate change

on water temperature downstream of a shallow reservoir, Lower Madison River, MT.

Climatic Change 68(3): 331-353.

Hebert, P. D. N. (1978). Population biology of daphnia (crustacea, daphnidae). Biological Reviews of

the Cambridge Philosophical Society 53(3): 387-426.

Heugens, E. H. W., Hendriks, A. J., Dekker, T., van Straalen, N. M. &Admiraal, W. (2001). A review of

the effects of multiple stressors on aquatic organisms and analysis of uncertainty factors for

use in risk assessment. Critical Reviews in Toxicology 31(3): 247-284.

Heugens, E. H. W., Jager, T., Creyghton, R., Kraak, M. H. S., Hendriks, A. J., Van Straalen, N. M.

&Admiraal, W. (2003). Temperature-dependent effects of cadmium on Daphnia magna:

Accumulation versus sensitivity. Environmental Science & Technology 37(10): 2145-2151.

Hughes, R. N. &Carvalho, G. R. (1983). The effect of food availability, female culture-density and

photoperiod on ephippia production in daphnia-magna straus (crustacea, cladocera).

Freshwater Biology 13(1): 37-46.

IPCC (2007). Fourth Assessment Report: Climate Change 2007 (AR4) - Synthesis Report. In

Assessment Reports IPCC: 104.

70

Janssen, C. R., Heijerick, D. G., De Schamphelaere, K. A. C. &Allen, H. E. (2003). Environmental risk

assessment of metals: tools for incorporating bioavailability. Environment International

28(8): 793-800.

Jenkins, A., McCartney, M. &Sefton, C. (1993). Impacts of climate change on river water quality in

the United Kingdom, Institute of Hydrology, Wallingford, Report to Department of the

Environment: 39.

Johnk, K. D., Huisman, J., Sharples, J., Sommeijer, B., Visser, P. M. &Stroom, J. M. (2008). Summer

heatwaves promote blooms of harmful cyanobacteria. Global Change Biology 14(3): 495-512.

Jones, J.D. (1972). Comparative physiology of respiration. Special Topics in Biology Series. London:

Edward Arnold.

Kaderrichtlijn Water (2003). Decreet Integraal Waterbeleid Artikel 3; 1° Kaderrichtlijn Water. In

Richtlijn 2000/60/EG van het Europees Parlement: publicatie: 14-11-2003 van kracht: 24-11-

2003 afkondiging: 18-07-2003.

Kersting, K. (1983). Bimodal diel dissolved-oxygen curves and thermal stratification in polder ditches.

Hydrobiologia 107(2): 165-168.

Kilham, S. S., Kreeger, D. A., Lynn, S. G., Goulden, C. E. &Herrera, L. (1998). COMBO: a defined

freshwater culture medium for algae and zooplankton. Hydrobiologia 377: 147-159.

Kleiven, O. T., Larsson, P. &Hobaek, A. (1992). Sexual reproduction in Daphnia magna requires 3

stimuli. Oikos 65(2): 197-206.

Koivisto, S. (1995). Is daphnia magna an ecologically representative zooplankton species in toxicity

tests. Environmental Pollution 90(2): 263-267.

Lampert, W. (2006). Daphnia: Model herbivore, predator and prey. Polish Journal of Ecology 54(4):

607-620.

Lavens, P. &Sorgeloos, P; (1996). Manual on the production and use of live food for aquaculture. FAO

Fisheries Technical Paper 306: 295.

Livingstone, D. M. (2003). Impact of secular climate change on the thermal structure of a large

temperate central European lake. Climatic Change 57(1-2): 205-225.

Lurling, M. (2003). Daphnia growth on microcystin-producing and microcystin-free Microcystis

aeruginosa in different mixtures with the green alga Scenedesmus obliquus. Limnology and

Oceanography 48(6): 2214-2220.

71

Lotka, A. (1913). A natural population norm. J. Wash. Acad. Sci. (3): 241-248.

Magnuson, J. J., Webster, K. E., Assel, R. A., Bowser, C. J., Dillon, P. J., Eaton, J. G., Evans, H. E., Fee, E.

J., Hall, R. I., Mortsch, L. R., Schindler, D. W. &Quinn, F. H. (1997). Potential effects of climate

changes on aquatic systems: Laurentian Great Lakes and Precambrian Shield Region.

Hydrological Processes 11(8): 825-871.

Mark, U. &Solbe, J. (1998). Analysis of the ECETOC aquatic toxicity (EAT) database - V - The relevance

of Daphnia magna as a representative test species. Chemosphere 36(1): 155-166.

MERAG (2007). Metals Environmental Risk Assessment Guidance. International Council on Mining

and Metals (ICMM) : 84.

Mooij, W. M., Hulsmann, S., Domis, L. N. D., Nolet, B. A., Bodelier, P. L. E., Boers, P. C. M., Pires, L. M.

D., Gons, H. J., Ibelings, B. W., Noordhuis, R., Portielje, R., Wolfstein, K. &Lammens, E. (2005).

The impact of climate change on lakes in the Netherlands: a review. Aquatic Ecology 39(4):

381-400.

Muyssen, B.T.A., Messiaen, M., De Coninck, D.I.M., Janssen, C. R., &De Schamphelaere, K.A.C. (2005).

Combined hypoxia and cadmium stress in Daphnia magna: are the effects predictable? Laboratory of Environmental Toxicology and Aquatic Ecology, Ghent University.

Muyssen, B. T. A., Messiaen, M. &Janssen, C. R. (2010). Combined cadmium and temperature

acclimation in Daphnia magna: Physiological and sub-cellular effects. Ecotoxicology and

Environmental Safety 73(5): 735-742.

Walther, G. R., Post, E., Convey, P., Menzel, A., Parmesan, C., Beebee, T. J. C., Fromentin, J. M.,

Hoegh-Guldberg, O. &Bairlein, F. (2002). Ecological responses to recent climate change.

Nature 416(6879): 389-395.

Nebeker, A. V., Onjukka, S. T., Stevens, D. G., Chapman, G. A. &Dominguez, S. E. (1992). EFfects of

low dissolved-oxygen on survival, growth and reproduction of Daphnia, Hyalella and

Gammarus. Environmental Toxicology and Chemistry 11(3): 373-379.

Newman, M. C. &Unger, M.A. (2003). Fundamentals of Ecotoxicology. Boca Raton, London, New

York, Washington, D.C. Lewis Publishers: 458.

Nisbet, R. M., McCauley, E. &Johnson, L. R. (2010). Dynamic energy budget theory and population

ecology: lessons from Daphnia. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological

Sciences 365(1557): 3541-3552.

72

O’Brien, J.J., Kumari, S.S. &Skinner, D.M. (1991). Proteins of Crustacean exoskeletons: I. Similarities

and differences among proteins of the fout exoskeletal layers of four Brachyurans. The

Biological bulletin 181(3): 427-441.

OECD (2008).Guidelines for the testing of chemicals. Vol. 211, 23: OECD.

Pertoldi, C. &Bach, L. A. (2007). Evolutionary aspects of climate-induced changes and the need for

multidisciplinarity. Journal of Thermal Biology 32(3): 118-124.

Pirow, R., Baumer, C. &Paul, R. J. (2004). Crater landscape: two-dimensional oxygen gradients in the

circulatory system of the microcrustacean Daphnia magna. Journal of Experimental Biology

207(25): 4393-4405.

RAND, G.M. (1995). Fundamentals of aquatic toxicology: effects, Environmental fate and risk

assessment. Second Edition. Washington D.C., Taylor and Francis : 1125.

Science Photo Library. http://www.sciencephoto.com/ , Ltd. 327-329 Harrow Road, London, UK, W9

3RB. Registered in England and Wales no.1550520, geraadpleegd op 24/02/2011.

Schindler, D.W., Bayley, S.E., Parker, B.R. Beaty, K.G., Cruikshank, D.R., Fee, E.J., Schindler, E.U.

&Stainton, M.P. (1996). The effects of climate warming on the properties of boreal lakes and

streams at the Experimental Lakes Area, Northwestern Ontario. Limnology and

Oceanography, 41: 1004-1017.

Seidl, M. D., Paul, R. J. &Pirow, R. (2005). Effects of hypoxia acclimation on morpho-physiological

traits over three generations of Daphnia magna. Journal of Experimental Biology 208(11):

2165-2175.

Shaw, J. R., Colbourne, J. K., Davey, J. C., Glaholt, S. P., Hampton, T. H., Chen, C. Y., Folt, C. L.

&Hamilton, J. W. (2007). Gene response profiles for Daphnia pulex exposed to the

environmental stressor cadmium reveals novel crustacean metallothioneins. Bmc Genomics

8.

Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M. &Cohenbaz.G (1971). Purification and properties of

unicellular blue-green algae (order cchroococcales). Bacteriological Reviews 35(2): 171-&.

Tirry, L. (2006). Dierkunde 1: Invertebraten (IBBIOR01000003). Universiteit Gent Faculteit bio-

ingenieurswetenschappen: 368.

US-EPA (1980). Ambient water quality criteria for cadmium. EPA-450/5-80-025.

73

Vannote, R. L. &Sweeney, B. W. (1980). Geographic analysis of thermal equilibria - a conceptual-

model for evaluating the effect of natural and modified thermal regimes on aquatic insect

communities. American Naturalist 115(5): 667-695.

Van den Heede, M. (2008). Opleidingsonderdeel ecologische risico-evaluatie partim relatie met

effecten op de mens. Universiteit Gent Faculteit bio-ingenieurswetenschappen: 168.

Van Leeuwen, C. & Hermens, J. (1995). Risk assessment of chemicals: an introduction. Kluwer

Academic Publishers : 374.

Van Sraalen, N.M. (2003). Ecotoxicology becomes stress ecology. Environmental science and

technology, 37(17): 324A-330A.

Walthall, W. K. &Stark, J. D. (1997). A comparison of acute mortality and population growth rate as

endpoints of toxicological effect. Ecotoxicology and Environmental Safety 37(1): 45-52.

Ward, J.V. (1985). Thermal characteristics of running water. Hydrobiologia, 125(1): 31-45.

Ward, T. J. &Robinson, W. E. (2005). Evolution of cadmium resistance in Daphnia magna.

Environmental Toxicology and Chemistry 24(9): 2341-2349.

Webb, B. W., Clack, P. D. &Walling, D. E. (2003). Water-air temperature relationships in a Devon river

system and the role of flow. Hydrological Processes 17(15): 3069-3084.

Wetterskip Fryslân (2006). Klimaatverandering en waterkwaliteit. Water Future science for solutions :

108.

Wilson, A. E., Sarnelle, O. &Tillmanns, A. R. (2006). Effects of cyanobacterial toxicity and morphology

on the population growth of freshwater zooplankton: Meta-analyses of laboratory

experiments. Limnology and Oceanography 51(4): 1915-1924.

Woese, C. R. &Fox, G. E. (1977). PHYLOGENETIC STRUCTURE OF PROKARYOTIC DOMAIN - PRIMARY

KINGDOMS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America

74(11): 5088-5090.

Zaffagnini, F. &Zeni, C. (1987). Ultrastructural investigations on the labral glands of Daphnia-obtusa

(crustacea, cladocera). Journal of Morphology 193(1): 23-33.

74

7 Bijlagen

A. Cadmium-M. aeruginosa Test : resultaten Unequal N HSD post hoc test

voor interactie-effect “Kloon(Batch)*Behandeling” voor Lengte Ta

bel

4.1

4 p

-waa

rden

uit

po

st h

oc

test

vo

or

vers

chill

en

tu

sse

n d

e k

lon

en

vo

or

de

co

ntr

ole

en

cad

miu

m b

ehan

del

ing

75

Tab

el 4

.15

p-w

aard

en u

it p

ost

ho

c te

st v

oo

r ve

rsch

ille

n t

uss

en

de

klo

ne

n v

oo

r d

e M

icro

cyst

is (

MC

) en

cad

miu

m +

Mic

rocy

stis

(C

d +

MC

) b

ehan

del

ing

76

B. Cadmium-M. aeruginosa Test : resultaten Unequal N HSD post hoc test

voor interactie-effect “Kloon(Batch)*Behandeling” voor Reproductie.

Tab

el 4

.22

p-w

aard

en u

it p

ost

ho

c te

st v

oo

r R

m v

oo

r ve

rsch

ille

n t

uss

en

de

klo

ne

n v

oo

r d

e c

on

tro

le e

n c

adm

ium

beh

and

elin

g

77

Tab

el 4

.23

p-w

aard

en u

it p

ost

ho

c te

st v

oo

r R

m v

oo

r ve

rsch

ille

n t

uss

en

de

klo

ne

n v

oo

r d

e M

icro

cyst

is (

MC

) en

cad

miu

m +

Mic

rocy

stis

(C

d +

MC

) b

ehan

del

ing

78

Tab

el 4

.24

p-w

aard

en u

it p

ost

ho

c te

st v

oo

r R

0 v

oo

r ve

rsch

ille

n t

uss

en

de

klo

ne

n v

oo

r d

e c

on

tro

le e

n c

adm

ium

beh

and

elin

g

79

Tab

el 4

.25

p-w

aard

en u

it p

ost

ho

c te

st v

oo

r T

voo

r ve

rsch

ille

n t

uss

en

de

klo

ne

n v

oo

r d

e c

on

tro

le e

n c

adm

ium

beh

and

elin

g

80

Tab

el 4

.26

p-w

aard

en u

it p

ost

ho

c te

st v

oo

r T

voo

r ve

rsch

ille

n t

uss

en

de

klo

ne

n v

oo

r d

e M

icro

cyst

is (

MC

) e

n c

adm

ium

+ M

icro

cyst

is (

Cd

+ M

C)

beh

and

elin

g

De invloed van klimaatverandering op de schadelijke ... · Academiejaar 2010 – 2011 De invloed...

Documents

Transcript of De invloed van klimaatverandering op de schadelijke ... · Academiejaar 2010 – 2011 De invloed...