MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNE Prírodovedecká fakulta

BAKALÁRSKA PRÁCA

Brno 2006 Terézia Vojtylová

MASARYKOVA UNVERZITA V BRNE

PRÍRODOVEDECKÁ FAKULTA

KATEDRA ANALYTICKEJ CHÉMIE

STANOVENIE VYBRANÝCH BIOMOLEKÚL POMOCOU

FLUORESCEN!NÉHO SYNCHRÓNNEHO SKENU

BAKALÁRSKA PRÁCA

TERÉZIA VOJTYLOVÁ

Študijný odbor: Odborná chémia

Vedúci bakalárskej práce: Mgr. Peter Táborský, Ph.D.

Dátum odovzdania práce: 2006 – 05 – 19

Dátum obhajoby: 2006 – 05 – 30

Týmto prehlasujem, že som bakalársku prácu vypracovala samostatne, a že som

použila len uvedenú literatúru a experimentálne výsledky dosiahnuté v laboratóriu

Katedry analytickej chémie.

…………………………………………

Terézia Vojtylová

Po!akovanie

Rada by som po"akovala Mgr. Petrovi Táborskému, Ph.D. za odborné vedenie

a pomoc pri vypracovaní bakalárskej práce. Moje po"akovanie patrí taktiež ostatným

#lenom Katedry analytickej chémie za všetrannú pomoc a vrúcny prístup.

OBSAH

Úvod

1 Teoretická "as# 6

1.1 Luminiscencia 6

1.2 Základné vz$ahy luminiscen#nej analýzy 9

1.3 Luminiscen#né spektrá 10

1.4 Synchrónny fluorescen#ný sken 13

1.4.1 Všeobecné základy SFS 13

1.4.2 Použitie SFS v analytickej praxi 17

1.5 Biomolekuly 20

1.5.1 Aminokyseliny 20

1.5.2 Bielkoviny a peptidy 21

1.5.3 Fluorescencia biomolekúl 22

1.6 Inštrumentácia 24

2 Experimentálna "as# 26

2.1 Použité chemikálie 26

2.2 Prístroje 26

2.2.1 Spektrofluorimeter 26

2.2.2 pH meter 27

2.3 Experimenty 27

3 Diskusia a záver

4 Zoznam použitej literatúry

Úvod

Fluorescen#ná analýza patrí medzi najpoužíva%ejšie metódy stanovenia

organických látok a biomolekúl. Medzi jej výhody patrí citlivos$ a selektivita [1].

Stanovenie nieko&kých látok, s podobnými fluorescen#nými vlastnos$ami,

ved&a seba v zmesi je problematické. Pri analýze dochádza najmä k prekrytiu emisných

spektrier, preto je stanovenie pomocou emisného skenu zmesi, bez predošlej separácie,

nepresné. 'alšie negatívne efekty pri stanovení sú výmena excita#nej energie medzi

molekulami, premena alebo výmena energie pri zrážkach molekúl a zhasínanie

fluorescencie. [2]

Cie&om tejto práce je zistenie optimálnych podmienok pre použitie konštantne

vlnovo d(žkového synchrónneho fluorescen#ného skenu (SFS), aby sa dosiahlo #o

najvä#šej presnosti, selektivity a citlivosti pri stanovení vybraných biomolekúl, troch

fluoreskujúcich aminokyselín, v zmesi bez predošlej separácie [3].

1 TEORETICKÁ $AS%

1.1 Luminiscencia

Luminiscencia je jav, s ktorým sa stretávame pri vzájomnom pôsobení žiarenia

a analyzovanej látky. Hlavnou požiadavkou k vzniku luminiscencie je, aby látka

najskôr absorbovala žiarenie vhodnej vlnovej d(žky a prešla tak do excitovaného stavu.

Látka získanú energiu po ur#itom #ase a pri priaznivých podmienkach môže vyžiari$

ako luminiscenciu.

Pod&a zdroja excitácie rozde&ujeme luminiscenciu na:

! Fotoluminiscenciu

! Chemiluminiscenciu

! Elektroluminiscenciu

! 'a&šie typy (kryštáloluminiscencia, rádioluminiscencia, termoluminiscencia,

tribuloluminiscencia, at".)

Z analytického h&adiska je dôležitá najmä fotoluminiscencia, kde zdrojom

excitácie je svetlo v UV alebo vidite&nej oblasti.

Fotoluminiscencia je proces, pri ktorom chemická látka absorbuje fotón vhodnej

vlnovej d(žky (primárne elektromagnetické žiarenie), takto sa excituje do vyššieho

energetického stavu. Po ur#itej dobe dochádza k spätnému vyžiareniu fotónu

(sekundárne žiarenie) a návratu molekuly látky do základneho energetického stavu. Pri

luminiscencii je obvykle podstatná #as$ absorbovanej energie irreverzibilne premenená

na teplo, dochádza k zrážkam a iným pochodom, preto má emitované žiarenie spravidla

vyššiu vlnovú d(žku (tj. menšiu energiu), ako excita#né žiarenie vyvolávajúce

fotoluminiscenciu. Zostávajúca #as$ je vyžiarená ako luminiscen#né žiarenie.

Molekula látky absorbuje fotón žiarenia a elektróny presko#ia do niektorého z

excitovaného singletového stavu (S1; S2). !as absorpcie je 1×10-15 s a stredná doba

života excitovaného stavu je od 1×10-7 do 1×10-9 s. Pri preskoku do stavu S2 elektróny

najskôr prejdú nežiarivou vibra#nou relaxáciou (#as VR je 1×10-12 až 1×10-13 s) do

najnižšej vibra#nej hladiny stavu S2, z ktorej vnútromolekulovou konverziou (VK)

prechádzajú do stavu S1. Potom opä$ nežiarivou vibra#nou relaxáciou prechádzajú na

najnižšiu vibra#nú hladinu a deexcitácia molekuly látky nastáva vyžiarením fotónu

žiarenia, tzv. fluorescenciou (F). Elektróny z excitovaného stavu sa bez zmeny spinu

vracajú na základnú energetickú hladinu. Fluorescencia je preto spinovo dovolený

žiarivý prechod, oby#ajne z najnižšej vibra#nej hladiny do niektorej z vibra#ných

hladín základného stavu s #asom trvania zvy#ajne 1×10-8 až 1×10-5 s.

Ak sa uplat%uje pri emisii žiarenia metastabilná hladina, ide o fosforescenciu

(P). Teda dej, pri ktorom excitované elektróny prechádzajú z energetického stavu S1

tzv. medzisystémovým prechodom (MP) na niektorú z vyšších vibra#ných hladín

excitovaného tripletového stavu (T1). Medzisystémový prechod trvá 1×10-4 až 1×10-12

s, kedy v systéme existujú dva elektróny s rovnakým spinom. Molekula má nadbytok

vibra#nej energie, najskôr prejde nežiarivým vibra#ným prechodom (VR) na základnú

vibra#nú hladinu (T1). Prechodom na základnú hladinu by nebol dodržaný Pauliho

princíp a preto dochádza pri prechode k zmene elektrónového spinu a doba vyhasínania

je ove&a dlhšia, rádovo trvá milisekundy až sekundy (obr. 1.). [1]

Obr. 1. Jablonského diagram – energetické prechody pri vzniku fotoluminiscencie. VR

– vibra!ná relaxácia; VK – vnútromolekulová konverzia; MP – medzisystémový

prechod; F – fluorescencia; P – fosforescencia; A – absorpcia žiarenia; S1 a S2 –

excitované singletové stavy; T1 – tripletový stav, E – energia.

Luminiscencia organických molekúl sa vyskytuje vä#šinou pri molekulách látok

s konjugovanými dvojitými väzbami (najmä pri aromatických zlú#eninách) a látkach s

rigidnou planárnou multicyklickou štruktúrou. Skupiny v molekule, na ktorých

dochádza k luminiscencii (fluorescencii) sa nazývajú luminofory. Molekuly látok, ktoré

obsahujú luminofory, sú schopné fluorescencie a nazývajú sa fluorofory.

Fluorofory sa delia do dvoch tried:

! Vnútorné, ktoré sa prirodzene vyskytujú a nazývajú sa aj vlastné. [2]

! Vonkajšie, ktoré sa nevyskytujú prirodzene, niekedy sa nazývajú nevlastnými a

sú pridávané k látkam, ktoré nemajú vlastnú fluorescenciu. [2, 4]

Nevlastné fluorofory, ktoré sa viažu k sledovaným biomolekulám kovalentnou

väzbou, sa nazývajú fluorescen#né zna#ky. Používané sú aj tzv. fluorescen#né sondy,

ktoré sa nekovalentne viažu k sledovanej štruktúre a #asto menia popritom svoje

fluorescen#né vlastnosti. Reakcia nevlastného fluoroforu so sledovanou molekulou sa

nazýva derivatizácia (obr. 2.). [5]

Obr. 2. Derivatizácia biomolekuly fluoreskujúcim izothiokyanátovým derivátom. [5]

Luminiscencia molekúl látok organických a anorganických závisí okrem ich

štruktúry a skupenstva, v ktorom sa vyskytujú, aj od okolitého prostredia (v roztokoch

na charaktere rozpúš$adla a ostatných faktoroch ako pH, teplota, viskozita at".). [6 – 9]

1.2 Základné vz#ahy luminiscen"nej analýzy

Energetický vý$ažok fluorescencie & je pomer emitovanej a absorbovanej

energie, v ideálnom prípade & = 1. Používame ho na hodnotenie intenzity

luminiscencie.

& = EEmit. / EAbsorb. ' 1

Kvantový vý$ažok fluorescencie (F, #o je pomer po#tu svetelných kvánt

vyžiarených k celkovému po#tu kvánt pohltených sústavou za #asovú jednotku.

(F = NEmit. / NAbsorb.

Ak absorbuje a emituje len jeden druh molekuly, fluorescen#ný žiarivý tok je

priamoúmerný absorbovanému žiarivému toku.

)F = k × )Absorb.

Analógiou Lambert – Beerovho zákona je závislos$ intenzity fluorescencie na

koncentrácii aktívnej látky.

) = )0 × l × 10-*×c×l

Kde )0 je tok žiarenia na za#iatku a ) je tok po absorbcii, l je hrúbka vrstvy

roztoku a * je molový absorp#ný koeficient fluoreskujúcej látky. Pre )F potom platí:

)F = k` × )0 × (1 – 1 × 10-*×c×l)

Kde k` je konštanta zahr%ujúca vý$ažok fluorescencie ( k` < 1) a je závislá na

experimentálnych podmienkach.

Vz$ah medzi fluorescen#ným žiarivým tokom )F a koncentráciou c

fluoreskujúcej látky vyjadruje rovnica:

)F = k` × )0 × 2,3 × * × l × c

Rovnica platí, ak * × l × c ' 0,05. Pre vyššie koncentrácie rovnica neplatí,

pretože vysoká frekvencia zrážok a iné interakcie spôsobujú zhasínanie fluorescencie.

Závislos$ intenzity fluorescencie (IF) je spravidla priamoúmerná )F a teda i koncetrácii

fluoroforu, výnimka je pri pôsobení niektorých rušivých vplyvov ako napr.

fotovybie&ovanie. [2, 6, 9]

1.3 Luminiscen"né spektrá

Meranie luminiscencie vedie k získaniu rôznych spektier, pod&a použitej

techniky máme spektrá emisné, excita#né, spektrá SFS, spetrá totálnej luminiscencie.

Absorb#né spektrum je závislos$ absorbancie na vlnovej d(žke (+). Absorbancia

je definovaná Lambert – Beerovým zákonom ako sú#in koncentrácie aktívnej látky, jej

molového absorp#ného koeficientu pre danú vlnovú d(žku a hrúbky absorbujúcej

vrstvy.

Excita#né spektrum zobrazuje závislos$ fluorescen#ného toku danej látky na

vlnovej d(žke (energii, vlno#te alebo frekvencii) excitujúceho žiarenia pri konštantnej

vlnovej d(žke emitovaného žiarenia. Z tohto spektra sa dá ur#i$ vlnová d(žka

primárneho toku, ktorou sa dosiahne maximálneho fluorescen#ného toku. Excita#né a

absorb#né spektrum je identické iba vtedy, ak absorbuje tá istá funk#ná skupina, ktorá

emituje fluorescen#né žiarenie.

Emisné spektrum molekuly látky schopnej fluorescencie vykazujú

fluorescen#né (emisné) spektrum, tj. závislos$ intenzity fluorescencie na + (energii,

vlno#te alebo frekvencii) pri konštantnej vlnovej d(žke excitácie. Fluorescen#né emisné

spektrum je spravidla posunuté k vä#ším vlnovým d(žkam oproti excita#nému spektru.

Tento jav sa nazýva Stokesov posun (obr. 4.), #o sú straty energie po#as excitovaného

stavu na nežiarivé prechody. Emisné spektrum býva pri organických látkach #astokrát

zrkadlovým obrazom excita#ného (teda aj absorp#ného) spektra. So stúpajúcou teplotou

sa emisné spektrum rozširuje a naopak, s klesajúcou teplotou sa pásy zúžujú. V málo

polárnom rozpúš$adle je možné pozorova$ tiež anti – Stokesov posun, #o je posun

emisného spektra k menším vlnovým d(žkam pri sú#asnom zvýšení intenzity

fluorescencie. Pod&a Vavilovho zákona doba trvania excitovaného stavu molekúl a tvar

emisného spektra nezávisí na vlnovej d(žke excita#ného žiarenia. [10]

Fosforescen#né emisné spektrum je oproti fluorescen#nému spektru (a teda aj

absorp#nému a excita#nému spektru) posunuté k vä#ším vlnovým d(žkam (obr. 3.). [11]

0

5

10

15

20

25

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

! [nm]

I F [

a.

u.]

Emisné spektrum

Excita!né spektrum

Obr. 3. Ukážka absorp!ného, fluorescen!ného a fosforescen!ného spektra [11].

Pokia& je zahrnutá v emisnom spektre aj vlnová d(žka excitácie, detekovaná

intenzita fluorescencie pri tejto vlnovej d(žke môže by$ ovplyvnená rozptylom na

molekulách. Tento jav sa nazýva Rayleighov rozptyl (obr. 4.). Alebo môže nasta$

rozptyl na makroskopických #asticiach, ktorý sa volá Tyndalov rozptyl. [4]

Obr. 4. Ukážka Stokesovho posunu. Ostré píky sú Rayleighov rozptyl.

Moderné spektrofluorimetre môžu mera$ tiež tzv. totálne fluorescen#né

spektrum, ktoré má tri rozmery (emisná vlnová d(žka × excita#ná vlnová d(žka ×

intenzita fluorescencie) (obr. 5.).

Obr. 5. Spektrum totálnej fluorescencie Trp, pH = 4,0.

1.4 Synchrónny flourescen"ný sken

1.4.1 Všeobecné základy SFS [3]

Vo vz$ahu k totálnemu luminiscen#nému spektru je SFS jeho dvojrozmerný

výrez.

Obr. 6. Spektrum totálnej fluorescencie Trp, pH = 4,0.

Pod&a uhla výrezu rozlišujeme:

! Konštantne – energetický SFS (izopotenciálový sken), pri ktorom excita#ná aj

emisná vlnová d(žka sú sú#asne rôzne menené, v tomto spôsobe je udržiavaný

konštantný frekven#ný (resp. energetický) rozdiel medzi nimi. Vo výslednom

spektre sú potom spojené miesta s rovnakou hodnotou energie (obr. 7.).

! Rôznouhlový SFS, kedy excitácia a emisia je meraná pri rôznych vlnových

d(žkach a pri rôznej rýchlosti, rozdiel rýchlosti nám dovo&uje prevedenie skenu

v rovine uhlov 45° – 90° k excita#nej osi cez celé spektrum.

! Konštantne – vlnovo d(žkový SFS, pri ktorom rozdiel medzi vlnovými d(žkami

je udržiavaný konštantne (,+ = konšt.). Tento druh merania je v"aka

nenáro#nosti na prístroj najviac používaný.

Obr. 7. Izopotenciálový sken Trp pri pH = 4,0. Rovnakou farbou sú ozna!ené oblasti

s rovnakou energetickou hladinou.

Molekula látky môže by$ excitovaná v celom páse absorp#ného spektra (A1 –

A6) a poskytova$ fluorescenciu v páse vlnových d(žok F1 – F6. V prípade konšatne –

vlnovo d(žkového SFS je #asto volený rozdiel vlnových d(žok, tak aby bol signál

pozorovaný iba ak rozdiel vlnových d(žok excitácie a emisie je zhodný s intervalom

medzi excita#ným a emisným pásom, teda rozdiel vlnových d(žok sa rovná hodnote

Stokesovho posunu. Pri analýze zmesí sa volí rozdiel vlnových d(žok excitácie a emisie

tak, aby píky jednotlivých látok boli #o najlepšie vidite&né.

Fluorofor v zmesi sa ožiari vnovou d(žkou zo zvoleného intervalu vhodných

vlnových d(žok a s vopred zvoleným konštantným rozdielom excita#nej a emisnej

vlnovej d(žky. Zmes sa excituje prvou vlnovou d(žkou z intervalu a vyžiarené

luminiscen#né žiarenie sa sníma po priechode emisným monochromátorom, ktorý je

nastavený tak, aby bol rozdiel excitácie a emisie konštantný (obr. 8.) (tab. 1.). [3]

Tab. 1. Meranie konštantne – vlnovo d(žkového SFS pre )* = 10 nm.

Excitácia [nm] Emisia [nm]

201 211

202 212

. .

. .

500 510

Obr. 8. Jablonského diagram pre vysvetlenie konštantne – vlnovo d"žkového SFS. S0 –

základná hladina, S1 – excita!ná hladina, A1 až A6 – absorb!ný pás (A6 < A1), F1 až F6

– fluorescen!né žiarenie, E – energia, !" – konštantný posun vlnových d"žok.

Konštantne – vlnovo d(žkové SFS spektrum je získané sú#asným meraním

excita#ných a emisných vlnových d(žok s ich konštantným rozdielom. Jednotlivé

zložky v analyzovanej zmesi sú lepšie selektívne pozorovate&né, ako v emisnom alebo

excita#nom spektre, a poskytuje i viac informácii o fluoroforoch. Zvolený rozdiel

medzi excita#nou a emisnou vlnovou d(žkou ur#uje intenzitu a tvar spektra (obr. 9.).

Obr. 9. Spektrum konštantne – vlnového SFS Trp, pri pH = 4,0 a pre !" od 10 do 100

nm.

Výhody tejto metódy sú:

! Rozlíšenie viac fluoroforov s podobným emisným, #i excita#ným spektrom

v zmesi a ich stanovenie – redukuje sa prekryv signálov patriacich jednotlivým

zložkám nachádzajúcich sa v analyzovanej zmesi [12].

! Rozdiel vlnových d(žok je nastavite&ný pod&a druhu stanovovanej látky.

! Kombinácia s inými analytickými metódami (napr. separa#nými).

! Znižovanie vplyvu Rayleighovo rozptylu na minimum.

1.4.2 Použitie SFS v analytickej praxi

Príkladom je použitie vo fluorescen#nej spektroskopii pre charakterizáciu

a rozdelenie pív [12]. SFS v analýze piva slúži k citlivému kvantitatívnemu spoznaniu

tejto zložitej zmesi rôznych látok v rôznych skupenstvách. Tieto látky spolu interagujú,

#o je ve&mi dôležité v hodnotení a klasifikácii druhov pív. Kvôli prekrytiu píkov pri

klasickej fluorescen#nej analýze sa pristupuje #oraz #astejšie k tejto metóde, v"aka

ktorej sa rozpoznajú vo&né fluoreskujúce aminokyseliny, peptidy, proteíny a vitamíny

(B1, B2, B3, B6) rozpustené v meranej vzorke. Dôležité je i prostredie pri meraní,

optimálna hodnota pH je na hodnote 4,0; vplyv etanolu na stanovenie je minimálne a

pre lepšie rozlíšenie signálov je potrebné vzorku riedi$ (obr. 10.; obr. 11.).

Obr. 10. SFS zriedenej (1:5) vzorky piva (Pilsner Urquell – svetlé vý!apné 10

stup#ové) "# = 10 – 100 nm; pH = 4,0.

Obr 11. SFS zriedenej (1:5) vzorky piva (Stella – ležiak svetlý) "# = 10 – 100 nm; pH

= 4,0.

'alší príklad využitia SFS v analytickej praxi je klasifikácia pokrmového

a lampového panenského olivového oleja založená na sychrónnej fluorescencii

a totálnej luminiscen#nej spektroskopii [13]. Základné kritérium rozdelenia olivových

olejov na konzumný a lampový je ich kyslos$. Kyslos$ ovplyv%uje prítomnos$ vo&ných

mastných kyselín, olejovej, palmitovej a linoleovej. !isté panenské oleje obsahujú pod

3,3 % vo&ných mastných kyselín. Oleje obsahujúce vyššie množstvo sa "alej pre#is$ujú

až na oleje pokrmové. Pri meraní vyšších koncentrácii sa používa namiesto kyseliny

palimitovej kyselina butánová, lebo je rozpustná v olivovom oleji.

Majoritne luminisce#nými látkami v olivových olejoch sú tokoferol (vit. E),

chlorofyl a fenolické antioxidanty. Použitím SFS sa rozdelil panenský olej na dva druhy

v spekrálnej oblasti 429 – 545 nm. Panenský olej konzumný má ve&mi slabú intenzitu

pri 370 nm a lampový ma intenzívnejšie vyžarovanie v oblasti 385 – 450 nm (obr. 12.;

obr. 13.).

Obr. 12. SFS panenského oleja pokrmového (A) a lampového (B) pri !" = 80 nm [13].

Obr. 13. SFS !istej kys. butánovej (a); linoleovej (b) a olejovej (c) merané pri !" = 80

nm [13].

Príklad využitia SFS v klinickej analýze je súbežné ur#enie albumínu a

imunoglobínu G fluorescen#nou spektroskopiou a multideriva#nou kalibráciou [14].

+udské sérum sa skladá najmä z dvoch proteínov, a to imunoglobínu G a albumínu.

Spolo#ne tieto dva proteíny tvoria 70 % z proteínov prítomných v sére. Albumín sa

skladá z 585 aminokyselín, jedného Trp a osemnás$ Tyr. Imunoglobín sa skladá z 450

aminokyselín, jedenás$ Trp a dvadsa$osem Tyr. V"aka rôznemu zastúpeniu

aminokyselín, najmä Trp a Tyr sa použitím izopotenciálového skenu dajú ur#i$ na

základe odlišností v spektrách (obr. 14.).

R C

NH2

COOH

H

Obr. 14. Izopotenciálový SFS (A) albumínu a (B) imunoglobínu G pri excitácii 250 –

400 nm, emisii 300 – 450 nm. Bodkovaná !iara horizontálna reprezentuje emisný sken

a diagonálna reprezentuje SFS [14].

Okrem uvedených príkladov sa dá metóda SFS použi$ aj pri stanovení

motorových olejov [15] a pri iných kvantitativných stanoveniach.

1.5 Biomolekuly

1.5.1 Aminokyseliny [16]

Amimokyseliny sú základnou stavebnou jednotkou bielkovín.

Všeobecný vzorec aminokyselín je:

Sú to substitu#né deriváty karboxylových kyselín s amino skupinou na , –

uhlíku, kde R je aromatický alebo alifatický nasýtený, #i nenasýtený skelet. Môže

obsahova$ vo svojej štruktúre jednu alebo viac karboxylových a amino skupín,

poprípade substituenty heterocyklického charakteru alebo i heteroatómy.

" – emisia [nm]

" –

excitá

cia

[n

m]

Aminokyseliny môžu by$ kyslé (Glu, Gln, Asp, Asn), bazické (Lys, Arg),

hydrofóbne (Leu, Ile, Val), hydrofilné (Ala, Ser), aromatické (Phe, Tyr, His, Trp),

alifatické (Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Ser, Thr), môžu obsahova$ síru (Cys, Met), selén

(Sec) alebo –OH skupinu (Ser, Thr).

Sú opticky aktívne, kvôli prítomnosti chirálneho uhlíka v molekule. Biologicky

dôležité formy sú L – izoméry.

V bielkovinách je obsiahnutých 21 aminokyselín, nazývajú sa bielkovinové.

Nebielkovinové aminokyseliny sú sú#as$ou rôznych bielkovinových metabolizmov.

Esenciálne aminokyseliny si nedokáže živý organizmus syntetizova$, dodáva ich v

potrave. Esenciálne sú Val, Leu, Ile, Met, Thr, Phe, Try, His.

Vo&né aminokyseliny obsahujú vo svojej štruktúre aspo% dve ionizovante&né

skupiny, preto môžu existova$ vo forme katiónu, aniónu a zwitteriónu.

Izoelektrický bod je taká hodnota pH, pri ktorej aminokyselina nesie nulový

náboj, správa sa elektroneutrálne.

pI = [pKa1 + pKa2]/2

Ak pH = pI, potom aminokyselina nesie nulový náboj, pH < pI nesie kladný náboj a

pH > pI, amimokyselina nesie záporný náboj. [16, 17]

1.5.2 Bielkoviny a peptidy [16]

Tieto zlú#eniny sú charakteristické obsahom peptidickej väzby. Je to formálne

kondenzáciou vzniknutá amidová väzba, ktorá ma trans konfiguráciu. Kondenzácia

prebehla medzi karboxylovou skupinou a aminoskupinou dvoch aminokyselín. Pod&a

po#tu spojených aminokyselinových jednotiek poznáme dipeptidy, tripeptidy, at". Do

po#tu jednotiek desa$ ich nazývame oligopeptidy, pri po#te nad desa$ do dvadsa$

jednotiek, ukon#ené skupinou –NH2 a –COOH, sa ozna#ujú ako polypeptidy.

Bielkoviny (proteíny) sú polypeptidickou väzbou viazané aminokyseliny do

lineárnych polymérov. Proteíny sú charakteristické svojou štruktúrou (primárna,

sekundárna, terciálna, kvartérna). Majú taktiež izoelektrický bod pI, pod&a ktorého sa

delia na kyslé, zásadité a neutrálne.

HO

OH

NH2

O

NH

H2N

OH

O

OH

NH2

O

Bielkoviny v tele majú najmä stavebnú funkciu a slúžia aj na katalýzu a

reguláciu rôznych životne dôležitých procesov, potrebné sú pri transporte živín,

sprostredkovaní pohybu, obrane organizmu a poznáme funkcie i štrukurálne a zásobné.

[18]

1.5.3 Fluorescencia biomolekúl [2, 19]

Z dvadsa$jeden bielkovinových aminokyselín obsahujú vnútorný fluorofor len

tri aromatické aminokyseliny: tryptofán, tyrozín a fenylalanín (tab. 2.).

Tab. 2. Fluoreskujúce aminokyseliny [16]. Kde pKa1 je hodnota kyslej disocia!nej

konštanty $ – karboxylovej skupiny, pKa2 je hodnota kyslej disocia!nej konštanty $ –

aminoskupiny, pKa3 je hodnota kyslej disocia!nej konštanty bo!ného re%azca a pI je

izoelektický bod.

Názov Skratka Vzorec Mr pKa1 pKa2 pKa3 pI

Tryptofán Trp W

204,2 2,38 9,39 -- 5,98

Tyrozín Tyr Y

181,2 2,20 9,11 10,07 5,66

Fenylalanín Phe F

165,2 1,83 9,13 -- 5,48

Tryptofán má z uvedených aminokyselín najvyššiu fluorescenciu a kvantový

vý$ažok. IF tryptofánu, tak ako aj kvantový vý$ažok a vlnová d(žka maximálnej emisie,

sú ve&mi ovplyv%ované použitým rozpúš$adlom. So znižujúcou sa polaritou

rozpúš$adla sa IF zvyšuje a fluorescen#né spektrum sa posúva ku kratším vlnovým

d(žkam. Ak sa v proteíne, v ktorom sa sleduje tryptofánová fluorescencia, vyskytujú

protonované kyslé skupiny (kys. asparágovej, kys. glutámovej), môžu zhasína$ meranú

flourescenciu.

Tyrozín vykazuje fluorescenciu v"aka fenolovému kruhu vo svojej štruktúre a

jeho emisné spektrum je omnoho užšie v porovnaní s emisným spektrom tryptofánu. Pri

rovnakej intenzite žiarenia pri excitácii molekúl tryptofánu a tyrozínu je intenzita

fluorescencie tyrozínu približne desa$krát nižšia ako pri tryptofáne. Napriek tomuto

faktu významne ovplyv%uje meranie fluorescencie proteínu, lebo sa v štruktúre

proteínov vyskytuje vo vä#šom množstve, ako silnejší žiari#, tryptofán.

Fenylalanín je najslabší žiari# z týchto troch aminokyselín, intenzita v porovnaní

s tryptofánom je približne stokrát nižšia. Vzh&adom k jeho nízkej fluorescencii sa meria

v neprítomnosti tyrozínu a tryptofánu. [16, 17, 20, 21]

IF ovplyv%uje:

! Prítomnos$ aromatického systému (#ím viac aromatických systémov, tým

vyššia intenzita).

! Prítomnos$ elektrón – donorných skupín. Ak je takýto substituent viazaný na

bo#nom re$azci, má menší vplyv na výslednú intenzitu, ako substituent viazaný

priamo v aromatickom kruhu ako heteroatóm.

Preto fluorescencia klesá v rade:

Tryptofán > Tyrozín > Fenylalanín

Tab. 3. Fluorescen!né parametre tryptofánu, tyrozínu, fenylalanínu [21].

Fluorofor "exmax [nm] "em

max [nm] Kvant. vý#ažok $as vyhasínania [ns]

Tryptofán 295 353 0,13 3,1

Tyrozín 275 304 0,14 3,6

Fenylalanín 260 282 0,02 6,8

1.6 Inštrumentácia

K meraniu luminiscen#ných spektier látok sa spravidla používajú

spektrofluorimetre a fluorimetre.

Fluorimetre sa skladajú zo zdroja excitujúceho (primárneho) žiarenia, pokia& je

to laser, tak neobsahujú excita#ný monochromátor, na izoláciu žiarenia o potrebnej

vlnovej d(žke, ktoré potom vchádza do kyvety s roztokom analyzovanej látky.

Vznikajúce polychromatické žiarenie dopadá na fotonásobi#, na ktorom sa mení na

elektrický signál a po zosílení sa registruje prístrojom. Namiesto emisného

monochromátora je spravidla umiestnený filter, ktorý vymedzuje interval vlnových

d(žok, v ktorom sa meria intenzita emitovaného žiarenia.

Spektrofluorimetre sa skladajú zo zdroja primárneho žiarenia (laser, lampa),

primárneho monochromátora (v prípade, ak zdroj je lampa). Emitované

polychromatické žiarenie vstupuje do sekundárneho monochromátora, ktorým sa

izoluje fluorescen#né (sekundárne) žiarenie s príslušnou vlnovou d(žkou. Toto

fluorescen#né žiarenie sa izoluje spravidla pod uhlom 90° na smer primárneho žiarenia.

Zvolený lú# žiarenia dopadá na fotonásobi# a elektrický signál zaznamenávame (obr.

15.). [22]

Spektrofluorimetre dokážu pracova$ v rôznych módoch, a tak zmera$ rôzne

charakteristiky analyzovanej látky v 2D (exita#né, emisné spektrá, SFS) a aj 3D

analýze (totálny luminiscen#ný sken).

Obr. 15. Schéma spektrofluorimetra.

2 EXPERIMENTÁLNA $AS%

2.1 Použité chemikálie

Tab. 4. Tabu&ka chemikálií [23].

Názov Dodávate% $istota

[%]

Spôsob stan.

&istoty

c zásobného

roztoku [mol.l-

1]

L – tryptofán Sigma –

Aldrich

Min. 98 TLC 1,29 . 10-4

L – fenylalanín Fluka - 99 NT 1,14 . 10-4

L – tyrozín FLuka - 99 NT 0,94 . 10-4

Tetrafenylbutadién Optiglass -- -- 3 . 10-7

Na úpravu pH sa použili roztoky NaOH a HCl o pripravenej koncentrácii pod&a

potreby.

2.2 Prístroje

2.2.1 Spektrofluorimeter

Fluorescen#né experimenty boli prevádzané na spektrofluorimetre AMINCO –

Bowman Series 2 (Thermospectronic, USA). [24] Prístroj je vybavený 150 W

kontinuálnou a 7 W zábleskovou xenónovou lampou. Interval vlnových d(žok pri

použitej lampe mohol by$ volený v rozsahu 220 – 850 nm. Presnos$ vlnovej d(žky bola

$ 0,5 nm a opakovate&nos$ merania $ 0,25 nm. Rýchlos$ snímania sa dala nastavi$

v intervale 3 – 6000 nm.min-1. Ako detektor je používaný fotonásobi#.

Spektrofluorimeter je kompatibilný s po#íta#om a použitý program na vyhodnocovanie

0

50

100

150

200

250

250 300 350 400 450 500

! [nm]

I F [

a.u

.]

Zmes Trp : Tyr

Tyr

Trp

spektier bol AB – 2. Pri meraní sa používala kremíková kyveta s optickou d(žkou 10

mm od firmy Optiglass.

2.2.2 pH meter

Meranie pH bolo vykonávané na pH – metre ORION model 720 A s 5 mm

sklenenou elektródou z Monokrystalu Turnov, !R.

2.3 Experimenty

Použitie klasického emisného skenu pri stanovení tyrozínu, fenylalanínu

a tryptofánu nevedie k uspokojivým výsledkom [25], kvôli prekrtiu emisných spektier

jednotlivých aminokyselín, a tiež prenosom excita#nej energie z molekúl s nižším

maximom excitácie (Phe, Tyr) na Trp (obr. 16.).

Obr. 16. Emisné spektrum zmesi tyrozín : tryptofán, pH = 4,0; excitácia 260 nm.

Na nameranom emisnom spektre zmesi, nieje jasne pozna$, #i v meranom

roztoku je prítomných jedna alebo viac látok. Neskorším meraním jednotlivých

štandardov a spojením spektier vidie$, že látka obsahuje dve látky. Ostrý prvý pík

v&avo je Rayleighov rozptyl. Na nameranom SFS spektre pri "# = 30 nm (obr. 18.)

vidie$, že použitím SFS sa stráca Rayleighov rozptyl a dochádza k zdvojeniu píku, a

teda v zmesi zis$ujeme prítomnos$ dvoch látok.

Úlohou tejto práce je minimalizova$ vzájomné interakcie pri stanovení zmesi

Phe, Tyr a Trp, zárove% zisti$ vhodné podmienky pre ich stanovenie metódou SFS. Pre

tvorbu kalibra#ných kriviek boli vytvorené zmesné roztoky (Trp, Tyr, Phe), aby mohli

by$ zárove% posúdené možnosti vzájomného ovplyvnenia aminokyselín.

Zmes aminokyselín bola meraná pri pH udržiavanom na hodnote 4,0. Táto

hodnota pH bola zvolená preto, lebo pri nej nedochádza k zrážaniu aminokyselín a

v blízkom rozsahu tejto hodnoty pH nedochádza k disociácii aminoskupín a ani

karboxylových skupín. Napätie na fotonásobi#i bolo konštantne udržiavané na hodnote

605 V.

Intenzita lampy bola nastavená referen#ne, v #ase sa excita#ný svetelný tok

udržiaval konštantný. Kalibra#né krivky boli zostrojené pre najvýhodnejšie ,+ od 10 do

100 nm (tab. 5.), ktoré boli zistené experimentálne (obr. 18.; obr. 19.). Intenzity

jednotlivých aminokyselín, použité do kalibra#nej krivky, boli od#ítavané pri

maximálnych intenzitách jednotlivých štandardných roztokov aminokyselín (tab. 5.).

Tab. 5. Experimentálne zistené !" a navýhodnejšie " od!ítania v maximách intenzít

jednotlivých aminokyselín.

Aminokys. !" [nm] "od&ítania [nm]

Phe 10 273

Tyr 30 304

Trp 30 320

Obr. 17. SFS zmesi Phe : Trp : Tyr (1:1:1) a SFS jednotlivých štandardov pri !" = 10

nm.

Experimnetálne sa zizstilo, že pri ,+ = 10 nm je meranie Phe najvýhodnejšie.

Pri vyšších ,+ už dochádzalo k vysokému prekrytiu píku patriacemu Phe a píkom

patriacich Tyr a Trp. Hodnota + pre od#ítanie IF patriacej Phe, bola zárove% aj

hodnotou +, pri ktorej intenzita jeho fluorescencie bola maximálna.

0

10

20

30

40

50

60

200 250 300 350 400 450

! [nm]

I F [

a.

u.]

Zmes

Phe

Trp

Tyr

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

200 220 240 260 280 300 320 340 360 380

! [nm]

I F [

a.

u.]

Zmes

Phe

Trp

Tyr

Obr. 18. SFS zmesi Phe : Trp : Tyr (1:1:1) a SFS jednotlivých štandardov pri !" = 30

nm.

Na obr. 18. vidie$ jednotlivé maximá pre Trp a Tyr, pri ktorých sa od#ítavali

hodnoty IF. Pre Phe sa nedal tento ,+ použi$, kvôli vysokému prekrytiu píkov, ktorý

spôsoboval nerozlíšite&nos$ Phe v roztoku.

Pre kalibra#né krivky boli použité body namerané zo vzoriek a boli otestované

Studentovým t – testom. Limity detekcie (LOD) jednotlivých aminokyselín boli

vypo#ítané z podielu intenzity najmenej koncentrovaného roztoku príslušnej

aminokyseliny a trojnásobku smerodajnej odchýlky šumu (tab. 6.).

y = 1721,5x + 6,6415

R2 = 0,9995

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1

c [mmol/l]

I F [

a.

u.]

Tab. 6. LOD jednotlivých aminokyselín.

Aminokyselina LOD [mol.l-1

] LOD [ng.ml-1

]

Trp 1,05×10-7 21,44

Tyr 8,86×10-8 16,05

Phe 1,27×10-5 2097,91

Obr. 19. Kalibra!ná krivka pre Tyr !" = 30 nm.

y = 1172,3x + 8,2186

R2 = 0,9922

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07

c [mmol/l]

I F [

a.

u.]

Obr. 20. Kalibra!ná krivka pre Trp !" = 30 nm.

Obr. 21. Kalibra!ná krivka pre Phe !" = 10 nm.

y = 33,404x

R2 = 0,9895

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

c [mmol/l]

I F [

a.

u.]

3 Diskusia a záver

Fluorescen#né stanovenie Tyr, Trp a Phe v zmesi po excitácii jednotnou

vlnovou d(žkou, bez použitia predchádzajúcej separácie je nevhodné, najmä kvôli

prekrytiu emisných spektier, výrazne vyššej intenzite fluorescencie Trp a výmene

excita#nej energie, ku ktorej dochádza medzi aminokyselinami v zmesi.

Po experimentálnom zistení vhodných podmienok pre použitie konštantne –

vlnovo d(žkového SFS (pH, rozdielu medzi excita#nou a emisnou vlnovou d(žkou pre

jednotlivé aminokyseliny), viedlo k ich rozlíšeniu v zmesi a eliminácii nežiadúcich

efektov ako Rayleighovho rozptylu a prekrytie signálov patriacich Trp, Tyr a Phe.

Pre jednotlivé aminokyseliny boli zhotovené kalibra#né krivky, ktoré boli

podrobené testovaniu Studentovým t – testom. Dynamický rozsah bol pre Trp od 3×10-

6 mol.l-1 do 6×10-5 mol.l-1; pre Tyr od 2×10-6 mol.l-1 do 9×10-5 mol.l-1 a pre Phe od

3×10-5 mol.l-1 do 1×10-4 mol.l-1. Boli spo#ítané aj jednotlivé limity detekcie. Spo#ítaná

hodnota LOD pre Trp bola 1,05×10-7 mol.l-1, pre Tyr 8,86×10-8 mol.l-1 a pre Phe

1,27×10-5 mol.l-1. Z #oho vyplýva, že zvolenou metódou sa dá stanovi$ Tyr i v prebytku

Trp.

Navrhnutá analytická metóda je, až na niektoré nedostatky, vhodná pre

stanovenie Tyr, Trp a Phe v zmesi. Táto metóda poskytuje výsledky pre Tyr

pä$desiatkrát lepšie a pre Trp trikrát lepšie, ako komer#ne vyrábané a dodávané

prístroje [25]. Najvä#ší nedostatok stanovenia je energetický prenos medzi molekulami,

ktorého vplyv na výsledky sa nepodarilo úplne eliminova$.

4 Zoznam použitej literatúry

[1] – A. Sharma, S. G. Schulman, Introduction to Fluorescence Spectroscopy,

John Wiley and Sons, Inc., New York (1999).

[2] – P. Pekárková, Studium luminiscen#ních vlastností peptid., protein.

a aminokyselin, Masarykova univerzita, P/írodov0decká fakulta, Katedra

analytické chemie, Bakalá/ska práce (2005).

[3] – D. Patra, A. K. Mishra, Recent developments in multi – component

synchronous fluorescence scan analysis, Trends in analytical chemistry, 12

(21), 787 – 789 (2002).

[4] – O. Peš, Studium fluorescen#ních barviv pro aplikace v kapilárni

elektroforéze s LIF detekcí, Masarykova univerzita, P/írodov0decká fakulta,

Katedra analytické chemie, Bakalá/ska práce (2004).

[5] – P. Vrábel, P. Táborský, M. Ryvolová, J. Havel, J. Preisler, Sensitive

detection and separation of fluorescenet derivates using capillary

electrophoresis with laser – inducet fluorescence detection with 532 nm Nd:

YAG laser, Journal of Luminescence, 118, 283 – 292 (2006).

[6] – J. Zýka a kol., Analytická p/íru#ka II. díl, STNL, Praha (1980).

[7] – G. Tranter, J. Holmes, J. Lindon, Encyclopedia of Spectroscopy and

Spectrometry, Hardbound (2000).

[8] – J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic

Publisher (1999).

[9] – I. N0mcová, L. !ermáková, P. Rychlovský, Spektrometrické analytické

metody I, Karolinum, Praha (1997).

[10] – D. Harvey, Modern Analytical Chemistry, Quebecor Printing Book Group,

Kingsport (2000).

[11] – http://orion.chemi.muni.cz (5/2006).

[12] – E. Sikorska, T. Górecki, I. V. Khmelinskii, M. Sikorski and D. De

Keukeleire, Fluorescence Spectroscopy for Characterization and

Differentiation of Beers, J. Inst. Brew., 110(4), 267 – 275 (2004).

[13] – K. I. Pouli, G. A. Mousdis, A. Georgiou, Classification of edible and

lampante virgin olive oil based on synchronous fluorescence and total

luminiscence spectroscopy, Analytica Chimica Acta, 542, 151 – 156 (2005).

[14] – K. Wiberg, A. Sterner-Molin, S. P. Jacobsson, Simultaneous determination

of albumin and immunoglobulin G with fluorescence spectroscopy and

multivariate calibration, Talanta, 62, 567 – 574 (2004).

[15] – D. Patra, A. K. Mishra, Concetration depend red shift: qualitative and

quantitative investigation of motor oils by synchronous fluorescence scan,

Talanta, 53, 783 – 790 (2001).

[16] – Z. Vodrážka, Biochémia, Academia, Praha (1996).

[17] – http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/pps99.cryst.bbk.ac.uk

/projects/gmocz/fluor.htm (5/2006).

[18] – V. Mikeš, Záklaní pojmy z biochemie, Masarykova univerzita v Brn0,

P/írodov0decká fakulta, Katedra biochemie, 2. vydání (2001).

[19] – A. S. Ladhokin, Fluorescence Spectroscopy in Peptide and Protein Analysis,

Encyclopedia of Analytical Chemistry, Chichester (2000).

[20] – http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/pps99.cryst.bbk.ac.uk/

projects/gmocz/gfp.htm (5/2006).

[21] – http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm (5/2006).

[22] – M. !akrt a kol., Praktikum z analytickej chémie, Alfa, Bratislava (1989).

[23] – www.sigmaladrich.com (5/2006).

[24] – http://www.thermo.com (5/2006).

[25] – http://www.biotek.com/resources/tech_res_detail.php?id=130 (5/2006).