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JUTTA HEIM, THOMAS ØSTERGAARD TANGE, JENS KLEIN

EVOLVA S/A, REINACH, SCHWEIZ

One of the applications of the emerging synthetic biology field is theenzymatic production of chemicals, either by individual enzymes or bycascades of whole metabolic pathways. Here, the discovery of novelmetabolites from baker’s yeast transformed with yeast artificial chromo-somes is described. One particular class of compounds found repeatedlyare structurally diverse novel polyketides obtained by expression of mixesof PKSIII (polyketide synthase type III).

DOI: 10.1007/s12268-014-0462-x© Springer-Verlag 2014

Synthetische Biologie in Bäckerhefeó Synthetische Biologie wird vielfach alsneue, sich rasant entwickelnde Ingenieur-wissenschaft bezeichnet, die im Wesentlichenauf der Gentechnologie und den biologisch-chemischen Informatikwissenschaften auf-baut. Eines der großen Ziele der Syntheti-schen Biologie ist die Produktion neuer Bio-moleküle durch baukastenartiges Zusammen-

fügen einzelner enzymatischer Funktionen,die in ihrer Zusammenwirkung zu neuen Ver-bindungen führen sollen. Dabei sollen expli-zit taxonomische Grenzen der Spenderorga-nismen überschritten und neue Biosynthe-sewege generiert werden, die als solche nichtin der Natur vorkommen [1]. Die durch denMenschen seit Jahrtausenden zur Nahrungs-und Genussmittelproduktion eingesetzte Hefe(Saccharomyces cerevisiae) bietet sich un -

mittelbar als Wirtsorganismus für diesen neuen Ansatz der Synthetischen Biologie an.Das Hefegenom ist bestens bekannt. Hefe istgenetischen Manipulationen gut zugänglich,und als Eukaryot entsprechen viele Proteinein ihrer Funktionalität denjenigen höhererOrganismen. Zudem kann Hefe große DNA-Fragmente in Form von künstlichen Chro-mosomen aufnehmen, die es ermöglichen,gleichzeitig eine große Anzahl neuen geneti-schen Materials in Hefe einzuschleusen. Hefewächst robust auf einfachen Nährmedien, wasdie großtechnische Fermentation und Her-stellung größerer Mengen niedermolekularerZielmoleküle vereinfacht (Abb. 1). Der Trans-fer eines (nahezu) kompletten Biosynthese-weges und die Produktion einer Vorstufe despflanzlichen Malariamittels Artemisinin inHefe sind kürzlich beschrieben worden [2].Die Isolierung bislang unbekannter, struktu-rell neuer Verbindungen ist dagegen ein voll-ständig neues Gebiet.

Künstliche Hefe-ChromosomenDie in den 1980er-Jahren vor allem für dasSequenzieren großer DNA-Fragmente ent-wickelten künstlichen Hefe-Chromosomenwerden durch uns in ihrer einzigartigenKapazität genutzt, sowohl komplexe Gen-banken aufzunehmen wie auch längere vor-geformte Biosynthesewege in einem einzi-gen Transformationsschritt in Hefe einzu-bringen. Die Fremdgene werden zunächst inEingangsvektoren (konventionellen bakte-riellen Plasmiden) unter Kontrolle eines Sets

Synthetische Biologie

Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiaeals universelle chemische Mikrofabrik

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¯ Abb. 1: Arbeitsschritte zur Herstellung vonHefetransformanten, die neue Metabolitensekretieren. Genbanken unterschiedlichsterHerkunft werden zunächst in bakterielle Ein-gangsvektoren kloniert, die entstehendenExpressionskassetten ausgeschnitten und alsMischungen gemeinsam mit Chromosomen-Armen zu künstlichen Chromosomen ligiert, dieanschliessend in Bäckerhefe transformiert wer-den. Im letzten Schritt wird der Überstand dertransformierten Hefestämme mittels chromato-graphischer und spektroskopischer Verfahrenauf neue Verbindungen überprüft.

Eingangsvektoren

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Chromosomenarme

künstliche Chromosomen

neueVerbindungen

Hefe-Transformanten

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CH 3 NH

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O

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von Hefe-Promotoren wie auch -Terminato-ren gebracht. Danach schneidet man dieresultierenden Expressionskassetten mit sel-ten schneidenden Restriktionsenzymen ausund ligiert die Expressionskassettenmi-schungen anschließend zu langen DNA-Mole-külen. In einem letzten Schritt werden dieArme der künstlichen Chromosomen anli-giert. Die Arme enthalten zusätzlich zumReplikationsursprung, dem Centromer undden Telomer-Enden auch noch Selektions-marker, mit deren Hilfe das Wachstum erfolg-reich transformierter auxotropher Hefezel-len detektiert wird. Um der potenziellenInstabilität der künstlichen Chromosomendurch Rekombination entgegenzuwirken, ver-wenden wir in den Eingangsvektoren meh-rere Promotoren (und Terminatoren), dieallerdings in gleicher Weise reguliert wer-den. Ein bevorzugtes Promotorenset sind diePromotoren der Methioninbiosynthese, diesequenziell unterschiedlich, aber in gleicherWeise durch Entzug von Methionin induziertwerden. Southern Blots der Transformantenzeigen, dass die künstlichen Chromosomenminimal 50 Kilobasen groß sind und Größenbis zu 600 Kilobasen erreichen können [3].Unter Beachtung der bereits beschriebenenVorsichtsmaßnahmen sind sie sehr stabil,und es werden über 100 Millionen Transfor-manten, die mehrheitlich aufgrund derzufallsgetriebenen Kassettenligation unter-schiedliche Genkombinationen tragen,erzielt. Im Fall der Expression von bekanntenBiosynthesewegen nutzen wir die Kapazitätder künstlichen Chromosomen dazu, Dut-zende homologer Enzyme aus verschiedenenOrganismen zu integrieren. Um vorgeformteBiosynthesewege oder gesonderte, komple-xe Enzymreaktionen mit cDNA-Banken inter-essanter Spenderorganismen zu kombinie-ren, transformieren wir in der Regel Biosyn-theseenzyme in Hefen des Paarungstyps αund Genbanken in haploide a-Zellen. Dieanschließende Paarung der komplettenTransformantenpopulationen führt zu diplo-iden Zellen mit je zwei künstlichen Chromo-somen und zu verdoppelter Synthesekapa-zität.

Produktion, Reinigung und Struktur -aufklärung der neuen MetabolitenIm Gegensatz zu potenten Sekundärmetabo-litproduzenten, wie z. B. Streptomyzeten, ver-fügt die Hefe über einen sehr begrenzteneigenen Sekundärmetabolismus. Nach derFermentation kann daher der Überstanddirekt oder nach einer Ein-Schritt-Fraktio-

nierung auf neu gebildete und ausgeschie-dene Metaboliten mittels ultra-performanceliquid chromatography/Massenspektrometrie(UPLC/MS) analysiert werden. Alternativkann ein Hochdurchsatzscreening in die Hefeeingebaut werden, das Transformanten mitbiologisch aktiven Metaboliten selektioniert[4]. Abbildung 2 zeigt ein typisches Totalio-nenchromatogramm eines Hefeextrakts,einer aktiven HPLC-Fraktion und der aufge-reinigten neuen Verbindung im Vergleich zuridentischen Fraktion eines nicht-transfor-mierten Ausgangsstamms. Alle Strukturenwurden auf der Basis von ein- und zweidi-mensionalen Kernspinresonanz(NMR)-Spek-tren aufgeklärt.

Chemoinformatische AnalyseDer Vergleich von ca. 80 auf diese Art erhal-tenen Verbindungen mit Strukturdatenban-ken ergab eine Neuheit von über 75 Prozent.20 Prozent der Grundstrukturen wurden bis-her nicht beschrieben. Die von uns gefunde-nen neuen, durch Synthetische Biologieerzeugten Verbindungen besitzen komplexe-re Strukturen als Bestandteile herkömmlicherScreening-Archive. In dieser Eigenschaft sindsie, trotz ihres kleinen druchschnittlichenMolekulargewichtes von ca. 300 Dalton, klas-sischen Naturstoffen ähnlich. 90 Prozent derVerbindungen entsprechen Lipinskis empi-risch gefundener „Fünfer-Regel“, die eineAbschätzung der oralen Bioverfügbarkeit

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˘ Abb. 2: Chromato-gramme von Ethyl -acetat-Extrakten vonHefe-Überständen.A, Totalionenchroma-togramm (TIC) desÜberstands einertransformiertenHefe. B, TIC einerFraktion (präparativeHPLC) eines Kontroll-hefestamms (ohnekünstliche Chromo-somen). Die HPLC-Fraktion des Kon-trollhefestamm-Extrakts entsprichtder Fraktion in C. C,TIC einer HPLC-Frak-tion des Ethylacetat-Extrakts in A. DieHPLC-Fraktion zeigteWirkung in einemsekundären Aktivi -täts test. D, TIC derisolierten, im Aktivi -täts test wirksamenVerbindung derHPLC-Fraktion in C.

A

B

C

D

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einer Verbindung erlaubt. Alle Substanzenweisen funktionelle Gruppen für chemischeModifikationen auf und eignen sich daher

sehr gut als optimierbare Leitstrukturen (füreine detaillierte chemoinformatische Analysesiehe [4]).

Neue Polyketide des PKS-III-TypsGemische von 34 Polyketid-Synthase-Typ-III-(PKS III)-Genen (Tab. 1) auf dem ersten künst-

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Phenylalanin-Ammoniak-Lyase Petroselinum crispum Y07654

Phenylalanin-Ammoniak-Lyase Rhodosporidium toruloides X51513

Phenylalanin-Ammoniak-Lyase Zea mays L77912

Phenylalanin-Ammoniak-Lyase Aspergillus niger XM_001401766

4-Cumarat-CoA-Ligase Aspergillus fumigatus BX649606

4-Cumarat-CoA-Ligase Nicotiana tabacum U50845

4-Cumarat-CoA-Ligase Petroselinum crispum X13325

4-Cumarat-CoA-Ligase Streptomyces coelicolor AL939119

Cinnamat-4-Hydroxylase Petroselinum crispum L38898

Cinnamat-4-Hydroxylase Amni majus AY219918

Cinnamat-4-Hydroxylase Arabidopsis thaliana U71081

Pinosylvin-Synthase Pinus densiflora AB030140

Pinosylvin-Synthase Pinus sylvestris S50350

Stilben-Synthase Arachis hypogaea AB027606

Stilben-Synthase Vitis vinifera S63227

Resveratrol-Synthase Arachis hypogaea X62299

Resveratrol-Synthase Rheum tataricum AF508150

Stilben-Synthase Pinus strobus Z46914

Cumaryl-Triessigsäure-Synthase Hydrangea macrophylla AB011468

Stilbencarboxylat-Synthase Hydrangea macrophylla AF456446

Curcuminoid-Synthase Oryza sativa AK109558

Octaketid-Synthase Aloe arborescens AY567707

2’-Oxoalkylresorcyclinsäure-Synthase Neurospora crassa XM_955334

Trihydroxybenzol-Synthase Pseudomonas fluorescens U41818

Typ-III-Polyketid-Synthase-RppA Streptomyces antibioticus AB084489

Biphenyl-Synthase Sorbus aucuparia DQ286036

Benzophenon-Synthase Hypericum androsaemum AF352395

Acridon-Synthase Ruta graveolens Z34088

4-Cumaryl-4’-hydroxyphenylmilchsäure-3-Hydroxylase Lithospermum erythrorhizon AB017418

Hydroxyphenylpyruvat-Reduktase Solenostemon scutellarioides AJ507733

Hydroxyphenylpyruvat-Reduktase Arabidopsis thaliana BX818677

Malonyl-CoA-Synthetase Rhizobium leguminosarum AF117694.1

NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase CPR1 Saccharomyces cerevisiae D13788

Cytochrom-P450-Reduktase ATR1 Arabidopsis thaliana NM_118585.3

Tab. 1: Polyketid-Synthase-Typ-III-Gene (PKS-III-Gene), als Gemische auf künstlichen Hefe-Chromosomen. Die Gene wurden teilweise in bevorzugtem Hefe-Codongebrauch synthetisiert. Gen-Nummern aus der Datebank NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Enzym Quelle Gen-Nr.

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lichen Chromosom wurden mit verschiede-nen cDNA-Bibliotheken auf einem zweitenkünstlichen Chromosom kombiniert. Daserlaubte die Isolierung vieler neuer Verbin-dungen mit Polyketid-Grundgerüst. PKS IIIeignen sich speziell für unseren auf Diversitätausgerichteten Ansatz. Sie synthetisieren Poly-ketide durch wiederholte decarboxylative Clai-sen-Kondensation von Malonyl-CoA-Einhei-ten. Die Superfamilie ist außerdem in der Lage,die linearen Moleküle zu Endprodukten zutautomerisieren, zyklisieren und aromatisie-ren [5, 6]. Wir konnten vorwiegend Ketide desTriketidpyron-Typs isolieren (Abb. 3), aberauch Tetraketidpyrone (z. B. GC-332). Um dasverantwortliche PKS-III-Gen zu identifizierenund gezielt ein ausgewähltes Polyketid in grö-ßeren Mengen herzustellen, müssten in einemnächsten Schritt auf konventionelle Weise allePKS-III-Gene individuell überexprimiert wer-den. In unseren bisherigen Arbeiten habensich die neuen Verbindungen jedoch als inno-vative Strukturlieferanten herausgestellt,deren anschließende chemische Synthese oft-mals keine Probleme bereitete. Einmal nach-synthetisiert, eignen sich die so gefundenenStrukturen sehr gut für eine weiter gehendechemische Optimierung. Damit reiht sichunser durch die Synthetische Biologie getrie-bener Ansatz nahtlos in die vorhandene che-mische Infrastruktur von Unternehmen mitInteresse an neuen optimierten Leitstruktu-ren zur anschließenden großtechnischen Her-stellung ein.

AusblickDie enzymatische Herstellung neuer chemi-scher Verbindungen mithilfe SynthetischerBiologie ist ein Gebiet, das noch in seinenAnfängen steckt, aber bereits jetzt erstaunli-che Resultate zeigt. Die von uns zum erstenMal aus Hefe isolierten Strukturen sind über-wiegend neu, divers und haben ansprechen-de physikochemische Eigenschaften für einenachfolgende Optimierung zu Leitstrukturen.Das Hinzufügen weiterer Proteinfamilien, wiez. B. NRPS (nicht-ribosomale Peptid-Syntha-sen) oder PKS-Typ-I und -Typ-II, oder opti-mierter cDNA-Banken sollte die Diversität neuaufgefundener Strukturen weiter verbreiternund damit insgesamt die Attraktivität der Syn-thetischen Biologie als Chemielieferant sig-nifikant erhöhen.

DanksagungDie vorgestelllten Arbeiten wurden zum Teildurch Hoffmann-La Roche, Basel, Schweizfinanziert. Unser Dank gilt allen Wissen-schaftlern der Evolva-Forschungsabteilungfür ihren großen Einsatz. ó

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[4] Klein J, Heal JR, Hamilton WD et al. (2014) Yeast syntheticbiology platform generates novel chemical structures as scaf-folds for drug discovery. ACS Synth Biol 3:314–323[5] Li J, Luo Y, Lee J-K et al. (2011) Cloning and characteriza-tion of a type III polyketide synthase from Aspergillus niger.Bioorg Med Chem Lett 21:6085–6089[6] Stewart C Jr, Vickery CR, Burkart MD et al. (2013)Confluence of structural and chemical biology: plant polyketi-de synthases as biocatalysts for a bio-based future.Curr Opin Plant Biol 16:365–372

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˘ Abb. 3: Neue Poly-ketide des PKS-III-Typs. Hefestämmewurden mit einemGemisch von 34Polyketid-Synthasen-Typ-III-Genen (Tab. 1)auf künstlichen Chro-mosomen transfor-miert. Die Hefen ent-hielten zusätzlichnoch künstlicheChromosomen mitverschiedenencDNA-Bibliotheken(GC-125, GC-126,GC-153, GC-304, GC-336, GC-337: Cera-mium rubrum; GC-196: Brachionis pli-catilis; GC-281, GC-344: Curvularia inae-qualis; GC-331, GC-332: Azadirachtaindica).

Jutta Heim, Thomas Østergaard Tange undJens Klein (v. l. n. r.)

Korrespondenzadresse:Prof. Dr. Jutta HeimEvolva S/ADuggingerstraße 23CH-4153 ReinachTel.: +41-(0)795934337juttah@evolva.com