ANALYSE IN COMPLEXE MATRICESmedchem.rega.kuleuven.be/acm/acm2018.pdfDe cursus 'Analyse in complexe...

ANALYSE INCOMPLEXE MATRICES

prof. dr. Jef RozenskiFaculteit Farmaceutische Wetenschappen

KU Leuven2018

INHOUD

1 inleiding 1

2 analyse van monsters in de praktijk 42.1 definiëren van de probleemstelling . . . . . . . . . . . . . . . 62.2 literatuuroverzicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82.3 keuze van een analysemethode . . . . . . . . . . . . . . . . . 92.4 een methode uittesten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

3 afname en eigenschappen van monsters 113.1 representativiteit van de monstername . . . . . . . . . . . . 113.2 technieken voor monstername . . . . . . . . . . . . . . . . . 133.3 transport . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163.4 monsteropslag en stabiliteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173.5 schoonmaken van glaswerk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.6 fysisch-chemische apecten van analiet en matrix . . . . . . . 203.7 biologische monsters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

4 technieken voor monsterbewerking 264.1 basisapparatuur en -technieken . . . . . . . . . . . . . . . . . 264.2 oplossen van stalen voor analyse . . . . . . . . . . . . . . . . 314.3 filtratie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354.4 oplosmiddel-reductietechnieken . . . . . . . . . . . . . . . . 404.5 distillaties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444.6 extractie van vaste monsters . . . . . . . . . . . . . . . . . . 454.7 extractie van oplossingen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514.8 eiwitprecipitatietechnieken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

FIGUREN

1.1 accuraatheid en precisie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.2 A: precies, niet accuraat, B: accuraat, niet precies . . . . . . . . . 3

2.1 monster analyseschema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.2 'Horwitz-trompet' . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3.1 VOST buisje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143.2 Schöniger verbranding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153.3 stabiliteitsonderzoek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183.4 interacties en hun energieën . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

4.1 filtratietechnieken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374.2 EVACS apparaat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424.3 sublatie apparaat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 434.4 fasediagramma voor een mengsel . . . . . . . . . . . . . . . . . . 454.5 Soxhlet extractie apparaat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 464.6 druppel extractor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 534.7 fasediagramma (druk in functie van temperatuur) . . . . . . . . 54

1

INLEIDING

De cursus 'Analyse in complexe matrices' maakt deel uit van hetopleidingsonderdeel 'Biofarmaceutisch Onderzoek: Toepassingen III'en telt mee voor 1.8 studiepunten (3 punten op 20).

In de studentenpractica Biofarmaceutisch Onderzoek: Toepassingen Ien II werden manuele en instrumentele analysetechnieken aangeleerdaan de hand van zuivere stalen. Meestal is enkel het te doserenbestanddeel aanwezig. Hierdoor wordt vermeden dat tijdens de analyse geensystematische fouten worden geïntroduceerd door de aard van het staal zelf.Het beoordelen en quoteren van de analyseresultaten gebeurt dus enkel opbasis van de afwijking ten opzichte van het werkelijke gehalte in de stalen.

Indien alle analyses enkel op zuivere bestanddelen uitgevoerd zoudenworden, kon men deze toevertrouwen aan robots of geautomatiseerdeanalyseapparaten. In laboratoria die zich bezighouden met bio-analyse ofanalyse van farmaceutische preparaten bestaan de stalen zelden uit slechtséén bestanddeel en is het meestal noodzakelijk om als eerste stap eenmonstervoorbereiding uit te voeren. Deze voorbereiding heeft tot doel dete analyseren bestanddelen te concentreren en/of om eventueel aanwezigeinterfererende substanties te verwijderen.

Een goede staalopzuivering heeft tot gevolg dat minder achtergrondruis

1 INLEIDING

aanwezig zal zijn bij de metingen waardoor de methode gevoeliger wordt.Voor de analyseapparatuur heeft het werken met gezuiverde stalen hetvoordeel dat de instrumenten minder snel vervuild geraken hetgeen tijd- enkostenbesparend is voor een analyselaboratorium.

Deze cursus is een voorbereiding op het gedeelte 'projectwerk' en volgendeaspecten van de staalvoorbereiding zullen besproken worden:

• Analyse van monsters in de praktijk• Staalname en eigenschappen van het monster• Technieken voor monsterbewerking

In deze cursustekst worden enkele termen gebruikt die even vooraftoegelicht moeten worden.

Ondermatrix verstaan we de omgeving waarin een te analyseren substantie(geneesmiddel, metaboliet) zich bevindt. We zullen ons in deze cursusbeperken tot de analyse uit farmaceutische preparaten (zalven, siropen,tabletten) en analyse uit biologische matrices zoals (bijvoorbeeld bloed,urine). Dit neemt niet weg dat de technieken die besproken wordenook toepasbaar zijn in bijvoorbeeld de voedingssector of op plantaardigmateriaal. In farmaceutische preparaten worden meestal hulpstoffengebruikt om het geneesmiddel te verwerken. Er kunnen stoffen gebruiktworden om de vloeieigenschappen van poeders te verbeteren of om deoplosbaarheid te verhogen. In biologische stalen zullen onvermijdelijkeiwitten, zouten of andere kleine moleculen aanwezig zijn.

Het analiet is de verbinding die kwalitatief of kwantitatief dient bepaald teworden. In ons geval wordt hiermee bedoeld: het actieve bestanddeel vaneen farmaceutisch preparaat, of een geneesmiddel en zijn metabolieten inlichaamsvochten zoals bloed.

Met precisie wordt de graad van reproduceerbaarheid bedoeld: wanneereen experiment herhaald wordt en men komt een kleine spreiding van deresultaten, dan zeggen we dat de methode precies is. De precisie wordtomschreven door de (relatieve) standaarddeviatie van experimenten die opidentieke wijze worden uitgevoerd.

2018 2

1 INLEIDING

Figuur 1.1: accuraatheid en precisie

De nauwkeurigheid is de maat van accuraatheid of anders gezegd: een maatvoor de afwijking of fout ten opzichte van de werkelijke waarde. Een grotenauwkeurigheid betekent niet altijd dat het resultaat precies is. Andersomkan het ook zijn dat een analyse zeer precies is, maar dat het resultaatdoor systematische fouten niet nauwkeurig is. De nauwkeurigheid van eenanalysemethode kan bepaald worden door de analyse van een referentiestaalwaarvan het gehalte of samenstelling volledig gekend zijn.

Figuur 1.2: A: precies, niet accuraat, B: accuraat, niet precies

2018 3

2

ANALYSE VAN MONSTERS IN DEPRAKTIJK

Meestal kan een staal niet als dusdanig geanalyseerd worden en zijner stappen nodig om de uiteindelijke analyse mogelijk te maken. Eenanalyseschema bestaat uiteindelijk uit meerdere stappen waarvan demonster-voorbereiding een essentieel onderdeel is. Na de monsternamemoet voorkomen worden dat het staal ontbindt of wijzigt. Hierbij wordentechnieken gebruikt om het staal te stabiliseren. Indien nodig, zullen doormonsterbewerking storende matrixcomponenten opgelost of verwijderdworden. Daarna kan het staal verder opgezuiverd of geconcentreerdworden.

Vaak is het in de praktijk zo dat het voorbereidend intellectuele werkmeer energie en tijd vraagt dan het uitvoeren van chemische analyses. Descheikundigemoet vaak een compromis zoeken tussen de tijd die besteed kanworden aan het optimaliseren van de procedure en de uiteindelijke residuelefout die verwacht kan worden na monsterbehandeling en uitvoeren van deanalyse. Met anderewoorden: soms loont het demoeite niet om tijd te stekenin het reduceren van de fout tot 1 per duizend en kan men gelukkig zijn meteen fout van 1%. Een procedure diemet succes gevolgdwerd voor het bepalenvan een substantie in matrix A moet vaak aangepast worden om dezelfdesubstantie in matrix B te analyseren. En zelfs indien de matrix dezelfde is,speelt bijvoorbeeld de aanwezige concentratie een rol in de keuze van de

2 ANALYSE VAN MONSTERS IN DE PRAKTIJK

Figuur 2.1: monster analyseschema

monstervoorbereiding. Het spreekt voor zich dat analyse van monsters inde praktijk grondig en doordacht aangepakt moet worden en het op puntstellen van analyseprocedures is voor de scheikundigen een grote uitdagingdie niet licht over het hoofd gezien mag worden. De basis voor de keuzevan een staalvoorbereidings- en analysemethode is een grondige kennisvan de voordelen en beperkingen van analysetechnieken en instrumenten.Nogmaals: ieder nieuw staal heeft een eigen methode nodig en er bestaangeen universeel werkende analyseprotocols.

2018 5


2.1 definiëren van de probleemstelling

Vooraleer aan het werk te gaan zal er een duidelijke omschrijving moetengebeuren van het het analytisch probleem dat voorligt. De keuze zalgebaseerd zijn op de antwoorden op volgende vragen:

• In welke concentratie is het analiet aanwezig?• Welke nauwkeurigheid is vereist op het resultaat?• Zijn er andere (storende) bestanddelen aanwezig?• Welke zijn de fysische en chemische eigenschappen van het staal?• Hoeveel stalen moeten er geanalyseerd worden?

Voor een bepaalde analysemethode kan men een zekere spreiding van deresultaten verwachten. Deze precisie hangt echter af van de concentratiein het staal. In stalen waar de hoeveelheid de detectielimiet benadert, zal destandaarddeviatie groter zijn dan voor stalen waar meer analiet aanwezig is.

Indien men verschillende laboratoria hetzelfde staal laat analyseren, merktmen dat voor de stalen waarin kleine hoeveelheden analiet aanwezig zijn,de spreiding van de analyseresultaten groter is en dus het eindresultaatminder betrouwbaar. De curve die deze afhankelijkheid aantoont, wordt ookwel eens de 'Horwitz trompet' genoemd (figuur 2.2) en wordt gegeven doorvolgende vergelijking:

RSD(predicted) = 2(1− 0.5 log10 C)

met C uitgedrukt in m/m.

Ook de nauwkeurigheid is een functie van de concentratie. Voor zeerkleine concentraties moet men de nodige voorzorgen nemen om geenproduct kwijt te spelen door bijvoorbeeld adsorptieverschijnselen. Devereiste nauwkeurigheid van het resultaat bepaalt in grote mate deanalysemethode en de monstervoorbereiding. Het is nutteloos om een zeergrote nauwkeurigheid na te streven indien het doel van de analyses was omsemikwantitatief het gehalte te weten te komen. Indien een scheikundige

2018 6


-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12RS

D (

%)

analiet concentratie (-log)

Figuur 2.2: 'Horwitz-trompet'

opteert ombepaalde stappen in te korten of over te slaan, danmagdit niet hetgevolg zijn van ondoordachtheid, maar wel van een realistische benaderingom tijd en geld te sparen.

De chemische samenstelling van het staal speelt ook een belangrijke rol inhet bepalen van de strategie om stalen op te zuiveren alvorens te analyseren.Indien de oorsprong van het staal gekend is, dan zal men meestal desamenstelling op voorhand kennen. Is dit niet het geval, moet men eersteen kwalitatieve analyse moeten uitvoeren op het staal. Al de beschikbareof bekomen informatie moet vervolgens gebruikt worden om de te volgenstappen te bepalen. Zo kunnen reactieomstandigheden of analysemethodendie voor een bepaalde verbinding relatief eenvoudig uit te voeren zijn zeermoeilijk worden in de aanwezigheid van gelijkaardig andere verbindingen.Solventen die geschikt zijn voor een product kunnen soms nietmeer gebruiktworden in aanwezigheid van een ander product. Men heeft er dus allevoordelen bij om de kwalitatieve samenstelling van het staal te kennenalvorens een analysemethode te ontwikkelen.

De fysische eigenschappen van het staal en het analiet moeten ook gekendzijn. Indien er vluchtige bestanddelen aanwezig zijn die bepaald moetenworden, dan zal men best voorzorgen nemen om deze niet kwijt te rakentijdens de voorbehandeling van de stalen. Indien het staal niet homogeen is,

2018 7


moet men voorzichtig te werk gaan bij het nemen van een staal of moet menhet eerst homogeniseren. Factoren zoals oplosbaarheid, hygroscopiciteit enstabiliteit van het staal spelen ook een rol en men zou deze ook op voorhandmoeten kennen.

Het aantal stalen dat geanalyseerdmoetworden is ook een factor die de keuzevan de analysemethode zal beïnvloeden. Indien het aantal groot is, kan menzich veroorloven om een langere tijd en meer energie te steken in het oppunt stellen van de methode. Immers, de kennis die men hiermee opdoet zalzonder twijfel de totale analyseduur verkorten. Indien men slechts een paarstalen heeft zal het misschien rendabeler zijn om niet te veel tijd te steken inhet voorbereiden van de stalen.

Al deze puntenmoet men in ogenschouw nemen alvorens een strategie uit tedokteren en een uiteindelijke keuze te maken voor een analysemethode.

2.2 literatuuroverzicht

Vooraleer een analyse aan te vatten, wordt er best eerst een grondigeliteratuurstudie ondernomen. Er wordt aangeraden om te beginnen meteen algemeen naslagwerk over analytische chemie. Hierin kan men decourante of algemene methoden en technieken terugvinden. Ook kanmen uit de lijst van referenties enkele overzichtsartikelen vinden over hetbestanddeel dat men wil analyseren. Het kan zijn dat men specifiek ietsterugvindt over exact dezelfde verbinding waarmee men werkt, ofwel moetmen zoeken naar analoge verbindingen en de bestaande analysemethodengaan aanpassen. In een verdere stap kan men zich uiteindelijk verdiepenin specifieke literatuur en tijdschriftartikels waarin men gedetailleerd deanalyseprotocols kan lezen. In tijdschriften kan men vaak de beschrijvingvan specifieke problemen bij de analyse van een bestanddeel vinden. Het isaan de lezer om te oordelen of de beschreven situatie overeenkomt met hetanalyseprobleem dat voorligt.

2018 8


2.3 keuze van een analysemethode

Het kiezen van een mogelijke analysemethode is gebaseerd op de ervaringdie voorhanden is, de kennis van de chemische principes of soms gebruikmakend van de intuitie. Indien meerdere methoden in aanmerking komen,zullen economische factoren een rol spelen. Zoals reeds aangehaald, ook hetaantal stalen bepaalt de keuze van de techniek en de aanpak.

Indien men van oordeel is dat geen enkele methode die reeds beschrevenwerd geschikt is door de aard en samenstelling van de stalen, zullenaanpassing van analyseprotocols gemaakt moeten worden, of gezochtmoeten worden naar nieuwe methoden. Voor iedere stap zal men allemogelijkheden moeten beschouwen en afgewegen welke de meest geschiktebenadering of techniek zal zijn en welke mogelijke problemen of foutenverwacht kunnen worden. Uiteindelijk zal na het maken van een keuze demethode uitgetest en kritisch geëvalueerd moeten worden.

2.4 een methode uittesten

De gekozen methode zal eerst geëvalueerd en gevalideerd moeten worden,in elk geval indien het gaat om een totaal nieuwe methode. Hoe minderfrequent een bepaald protocol gebruikt en beschreven is geweest, hoevoorzichtiger men moet omgaan met het aannemen van resultaten ende precisie van de analysemethode. Hetzelfde geldt indien men eenanalysemethode overneemt en er wijzigingen in aanbrengt.

Een analytische methode valideren houdt in dat men de lineariteit van dedetector bepaalt, de LOD (limit of detection) and LOQ (limit of quantitation)meet en parameters zoals het matrix effect, reproduceerbaarheid,accuraatheid en precisie nagaat.

Men zal steeds beginnen met de analyse van standaardmonsters, dus stalenwaarvan de samenstelling en het gehalte zeer goed gekend zijn. Natuurlijkzal men trachten om de werkelijke situatie zo veel mogelijk te benaderen

2018 9


wat betreft de concentratie en samenstelling. Men kan zelf stalen aanmakendoor zuivere producten af te wegen. Referentiestalen zijn voor sommigetoepassingen ook beschikbaar van bureaus voor standaarden uit binnen-en buitenland. Indien men de werkelijke situatie niet kan reproduceren,dan zullen de bekomen gegevens weinig zeggen over de slaagkans van deuiteindelijke analyses.

Indien een andere methode bestaat voor het analyseren van de stalen kanmen de nieuwemethode vergelijken met de bestaande. De methodes moetengenoeg van elkaar verschillen om conclusies over de bekomen waardenkunnen trekken. Immers, wanneer de methoden zeer gelijkend zijn, kunnendezelfde systematische fouten optreden en aldus een vertekend beeld gevenover de werkelijke waarde van de protocols. Om bij een vergelijking vanmethoden tot een wetenschappelijk gefundeerd besluit te komen zal menstatistische analysen moeten uitvoeren.

Ook kanmen een standaardadditiemethode gebruiken voor het uittesten vaneen nieuwe methode. Hierbij herhaalt men de analyses mits toevoeging vaneen gekende hoeveelheid standaardoplossing. Het verschil in meetwaardenmoet overeenkomen met de hoeveelheid toegevoegd. Het geeft ookeen indicatie van eventuele verliezen die kunnen optreden bij analyses.Aangezien de standaard aan het staal zelf wordt toegevoegd, wordt de wareomgeving van het analiet het best benaderd.

Met andere woorden: iedere methode dient eerst grondig uitgetest engevalideerd te worden. Pas wanneer men weet welke de detectielimiet is enhoe groot de verwachte fout en spreiding van de resultaten zullen zijn, kanmen ernstig beginnen aan een analyse van een echt staal.

2018 10

3

AFNAME EN EIGENSCHAPPEN VANMONSTERS

3.1 representativiteit van de monstername

Het spreekt vanzelf dat het monster moet overeenkomen met de teanalyseren materie. Voor afname van biologische monsters of vloeistoffenis het meestal geen probleem om representatieve stalen af te nemen. Andersis het gesteld indien men tracht vaste stoffen of korrelige substanties tebemonsteren.

Verschillende parameters moeten in het oog gehouden en ook vermeldworden bij de staalname omdat deze grote invloed kunnen hebben op desamenstelling van de monsters. Denken we bijvoorbeeld aan het tijdstip vanbloedname of aan de plaats en diepte van bodemmonsters.

Een vraag die men zich moet stellen is welke hoeveelheid nodig is van eenstaal dat men moet afnemen. Enerzijds is de hoeveelheid die men nodigheeft voor de analyses afhankelijk van de technieken diemen gaat gebruiken,de hoeveelheden die afweegbaar zijn of de beschikbare totale hoeveelheid.Anderzijds moet een staal nemen dat representatief is voor het geheel. Voorvloeistoffen volstaat het meestal de hoeveelheid te nemen die voldoende isvoor al de analyses. Voor vaste stoffen of stoffen die uit een mengsel van

3 AFNAME EN EIGENSCHAPPEN VAN MONSTERS

korrels of partikels bestaan, moet men rekening houden met de kans dat dekorrel misschien het analiet niet bevat. De relatie kan beschreven wordendoor de standaarddeviatie voor een binomiale verdeling:

de variantie wordt gegeven door (p: kans op aanwezigheid, q: kans opafwezigheid, n: aantal deeltjes)

σ2 = n p q

en de standaarddeviatie door

σ =√n p q

het gemiddelde wordt gegeven door

µ = n p

voor de relatieve standaarddeviatie kan men dus schrijven

RSD =σ

µ=

√n p q

n p

na kwadrateren bekomen we

RSD2 =q

n p

vermits p+ q = 1

RSD2 =1− p

n p

kunnen we tenslotte de grootte van de monsters berekenen uit

2018 12


n =1− p

p RSD2

Deze formule is in de meeste gevallen slechts een benadering. Er kunnennamelijk meerdere componenten aanwezig zijn in het mengsel of het gehaltein de verschillende korrels kan niet overal gelijk zijn. Ook het niveau vanniet-homogeniteit kan sterk verschillend zijn. Bij vloeistoffen is dit meestalgeen probleem omdat de menging op moleculair niveau reeds aanwezig is,maar voor poeders of vaste stoffen dient men hier rekening mee te houden.

Men dient ook rekening te houden met de aard en vorm van het geheelwaaruit het staal dient genomen te worden. Bij grotere oppervlakten zalmen stalen op verschillendewillekeurige puntenmoeten nemen en in anderegevallen is het misschien nodig om regelmatig stalen te nemen om defluctuaties in functie van de tijd te elimineren.

Ook iedere behandeling na de staalname kan een invloed opanalyseresultaten hebben en daarom dienen niet alleen gegevensbeschikbaar te zijn over de herkomst en de staalname, maar ook overde wijze van transport en van bewaring in het laboratorium voorafgaandaan de analyse.

3.2 technieken voor monstername

3.2.1 gassen

Monstername van gassen en dampen isminder eenvoudig dan het nemen vanmonsters uit vloeistoffen. Om een goed monster te kunnen nemen moetenofwel het volume ofwel het debiet gekend zijn. Tijdens demonsternamemoetdan het debiet en de temperatuur ook nog constant zijn.

De stoffen in een gas of damp kunnen opgevangen worden door het telaten borrelen door een vloeistof die de bestanddelen kan oplossen en alduskan capteren. Men kan ook gebruik maken van een zogenaamde VOST

2018 13


Figuur 3.1: VOST buisje

(Volatile Organic Sampling Train). Dit zijn buisjes gevuld met een adsorbens(bijvoorbeeld Tenax). Men laat het gas gedurende een bepaalde tijd door hetbuisje vloeien. Daarna kunnen de geadsorbeerde stoffen er weer afgehaaldworden door op te warmen. Deze methode is geschikt voor monsternamevan vluchtige verbindingen met een kookpunt gelegen tussen 30 en 100 ◦C.

3.2.2 vloeistoffen

Indien watermonsters genomen moeten worden uit leidingen, zal men eerstde leiding spoelen door het water een tijd te laten stromen aangezienbestanddelen uit aansluitingen, kranen en leidingen opgelost kunnengeraken. De vloeistof wordt opgevangen in een zuiver recipiënt enafgesloten. Hierbij moet worden voorkomen dat het staal gecontamineerdwordt met bestanddelen uit de stop. Stoppen met een aluminium- ofteflon bekleding aan de binnenkant zijn hiervoor het meest geschikt. Derecipiënten worden ook best volledig gevuld zodat vluchtige bestanddelenniet kunnen terechtkomen in de luchtlaag boven de vloeistof. Indiener nog transport wordt voorzien, is het soms toch beter om eenbeetje lucht in de flessen te laten om uitzetting en inkrimping doortemperatuurschommelingen op te vangen.

2018 14


3.2.3 vaste stoffen

Indien de deeltjes in een oplossing zitten, kunnen ze eerst afgefiltreerdworden om vervolgens bahandeld te worden als vaste stoffen.Bodemmonsters en gesteenten kunnen uitgeboord worden waarna zegemalen dienen te worden. Om contaminaties (pesticiden, herbiciden) inbodemmonsters temeten kanmen de bodemmonsters behandelenmetwater(al dan niet op pH gebracht naargelang de oplosbaarheid van het analiet)waardoor de producten oplossen in de waterfase en deze oplossingen verdergeanalyseerd kunnen worden. Indien nodig kunnen monsters die bestaanuit vaste stoffen opgelost worden door behandeling met geconcentreerdesterke zuren of door verbranding in een Schöniger kolf.

Figuur 3.2: Schöniger verbranding

De verbranding in een Schöniger kolf heeft tot doel om ionen vrij te zettenuit een matrix door oxidatie. Meestal wordt de methode gebruikt om zowelorganisch als mineraal N, F, Cl, I, P en S vrij te zetten. Men brengt het staalaan op een stukje asvrij filtreerpapier (voor vaste stoffen) of in een gelatinecapsule (voor vloeistoffen). Het staal wordt vervolgens in een platinamandje

2018 15


gebracht dat vastgemaakt is aan een geslepen stop die in een erlenmeyer past.In de erlenmeyer wordt de opvangvloeistof gebracht (meestal NaOH). Deerlenmeyer wordt gevuld met O2 en het monster wordt aangestoken en in deerlenmeyer gebracht. Wanneer het staal is opgebrand, wordt de erlenmeyergeschud zodat alle gassen opgelost worden in de opvangvloeistof. Hiernakan men de ionen in de vloeistof bepalen door ionenchromatografie of doortitraties. Deze methode staat ook beschreven in de Europese Farmacopee.

Het spreekt vanzelf dat onmiddellijk na demonstername, de stalen gelabeled(=voorzien van een etiket) moeten worden, om later misverstanden tevermijden. Wanneer een staal opgestuurd wordt voor analyse, moetenofwel op het recipiënt ofwel op een bijgevoegd document verdere detailsover het staal worden opgegeven. Zo zijn van belang: tijd en exacteplaats van staalname, wijze van staalname (apparatuur), aard (enkelvoudigof samengesteld staal) en, indien relevant, de kleur van het staal bij destaalname. Dit laatste wordt best opgegeven indien men kan verwachtendat door transport of stockering veranderingen kunnen optreden (denkmaaraan plantaardig materiaal).

3.3 transport

Tijdens het transportmag de samenstelling van demonsters niet veranderen.Hiervoor dienen de nodige voorzorgen genomen teworden. Voor biologischemonsters is het aan te raden deze onmiddellijk in te vriezen en de stalenin ingevroren toestand te transporteren en te bewaren om ontleding tevoorkomen. Wanneer het staal ontdooid wordt, kan de ontleding echterverder doorgaan.

De meeste monsters kunnen in bevroren toestand vervoerd worden in eenpolystyreen doos die gevuld wordt met droogijs (vast CO2, temperatuur =-78,5 ◦C). Indien het transport langer dan een vijftal dagen in beslag neemt,is het beter de stalen te lyofiliseren en ze in droge toestand te transporteren.

Vaak is het beter om onmiddellijk een extractie uit te voeren wanneer

2018 16


de monsters genomen zijn en vooraleer men ze transporteert naar hetanalyselaboratorium. De voordelen zijn dat eventuele degradatie van hetstaal wordt tegengegaan en dat het volume dat vervoerd moet wordengereduceerd kan worden.

3.4 monsteropslag en stabiliteit

Indien men niet kan vermijden dat de samenstelling in de loop vande tijd verandert, dan moeten bepaalde analyses onmiddellijk gedaanworden. Bijvoorbeeld voor watermonsters: temperatuur, opgeloste gassen,geleidbaarheid... Verder dienen al de verliezen van analiet tegengegaanworden. Deze verliezen kunnen verschillende oorzaken hebben:

• faseovergang (solvatatie, kristallisatie, verdamping, precipitatie)• transformatie (hydrolyse, oxidatie, reductie, adsorptie)• vrijmaken (verdamping, permeatie, diffusie, 'headspace')• ontleding (radiolytisch, autocatalyse, fotolyse)

Vaak zijn verbindingen in urinestalen minder stabiel dan in plasma. Ditkan verklaard worden door de aanwezigheid van proteïnen in plasma diede lipofiele stoffen kunnen solubiliseren. Uit urine zullen deze stoffengemakkelijker aan de wanden van de containers geadsorbeerd worden.

Om na te gaan of er verliezen zijn, kan men dezelfde stalen na een paarweken opnieuw analyseren. Door vergelijking van de bekomen waarden, kanmen de oorzaak van het probleem achterhalen. Men kan bijvoorbeeld decalibratiecurven voor vers en opgeslagen monsters op één grafiek zetten endan ziet men of de degradatie van de stalen te wijten is aan (figuur 3.3):

• instabiliteit van de matrix• instabiliteit van het analiet in een constante achtergrond• instabiliteit van analiet en van matrix

Volgende factoren kunnen effect hebben op de stabiliteit van monsters:

2018 17


Figuur 3.3: stabiliteitsonderzoek: - - - verse monsters, opgeslagenmonsters

3.4.1 licht

Fotodegradatie treedt regelmatig op. Men kan dit vermijden door de stalenonmiddellijk in het donker te plaatsen of om ze tegen zonlicht beschermendoor gebruik te maken van recipiënten uit amberkleurig (actinisch) glas ofdoor de stalen te wikkelen in aluminiumfolie. Invriezen van de stalen kanook helpen.

3.4.2 oxidatie

Zuurstof uit de lucht kan inhoudsstoffen van stalen oxideren. Men kan dittegengaan door containers volledig te vullen en goed af te sluiten of om dezuurstof uit de containers te vervangen door stikstof. Bij lage temperaturenvertragen chemische reacties, dus ook in dit geval kan men door invriezenvan de stalen degradatie vermijden.

2018 18


3.4.3 temperatuur

Ontleding van stalen kan het gevolg zijn van chemische of enzymatischeafbraak. In beide gevallen speelt de temperatuur een rol. Meestal is hetraadzaam om stalen in te vriezen en te bewaren bij -20 tot -80 ◦C. In sommigegevallen echter kunnen (vooral lipofiele) stoffen adsorberen aan dewand vande containers en kunnen hierdoor verliezen optreden. Ingevroren stalenlaat men best op kamertemperatuur komen alvorens deze te manipuleren.Tenslotte dient gewezen te worden op het feit dat herhaaldelijk invriezen enontdooien ook vermeden dient te worden. Bepaalde stoffen kunnen dit nietverdragen en kunnen ontleden.

3.4.4 conserveermiddelen

Soms worden aan de stalen conserveermiddelen toegevoegd. Dit kunnenantioxydantia of bewaarmiddelen (bacterieremmende stoffen) zijn. Vooriedere toegevoegde stof moet worden nagegaan of de aanwezigheid nietinterfereert met de analysemethode. Wanneer er geen interferentie is, kanmen zeggen dat de methode selectief is.

3.4.5 enzymatische effecten

Een gekend voorbeeld is de aanwezigheid van het enzyme urease datureum omzet in ammonia. Hierdoor stijgt de pH van het staal en kunnenproducten ontbinden die niet stabiel zijn in alkalisch milieu. Analoog kande aanwezigheid van esterasen in plasma voor problemen zorgen. Het ismogelijk inhibitoren toe te voegen die het enzyme inactiveren.

2018 19


3.5 schoonmaken van glaswerk

Uiteraard moet men vermijden dat de containers die men gebruikt voor hettransport en bewaring van monsters gecontamineerd zijn met chemicaliënof stoffen die kunnen interfereren met de analyse. Hetzelfde geldt voorstoffen die kunnen diffunderen uit de wanden van containers in het staal.Slecht sluitende stoppen kunnen ook een oorzaak zijn voor verliezen en nietreproduceerbare resultaten als gevolg.

Glaswerk kan goed gereinigd worden door een chroomzuuroplossing inzwavelzuur. Vanwege de toxiciteit en de impact op het milieu wordt dezeprocedure meer en meer vervangen door bijvoorbeeld een ethanolischeNaOH oplossing. Deze behandelingen zijn echter niet bruikbaar voorkunststofrecipiënten. Meestal zijn de kunststofrecipiënten bedoeld vooreenmalig gebruik en stellen er zich hierdoor geen problemen.

Er bestaan ook speciale detergenten voor het reinigen van glaswerk enkunststof containers.

Onoplosbare vette verontreinigingen kunnen door spoelen met eenorganisch solvent zoals methanol, dichloormethaan of aceton verwijderdworden. Deze solventen zijn niet geschikt voor de meeste kunststoffen.

Tenslotte kunnen we vermelden dat een ultrasoonbad ook geschikt is omrecipiënten proper te krijgen.

3.6 fysisch-chemische apecten van analiet en matrix

3.6.1 fysische aspecten

De fysische aspecten worden vooral bepaald door de mogelijke vormingvan waterstofbruggen met andere verbindingen die ook waterstofbruggenkunnen vormen. Zo zullen verbindingen met polaire functionele groepengoed oplossen in polaire solventen (tenzij er lange apolaire zijketens

2018 20


aanwezig zijn). Het kook- en smeltpunt worden ook bepaald doorde eventuele vorming van waterstofbruggen. Voor de analyse metchromatografie zijn waterstofbruggen vaak verantwoordelijk voor deretentie op de stationaire fase. Tenslotte kan hier nog vermeld wordendat de binding van geneesmiddelen aan eiwitten ook door middel vanwaterstofbruggen gebeurt.

De oplosbaarheid wordt ook bepaald door het dipoolmoment van deanalieten. In de chromatografie zijn verschillen in solventeigenschappen enretentietijden tussen methanol en acetonitrile grotendeels te verklaren doorhun verschil in dipoolmoment.

Voor de monsterbewerking spelen verder nog ionogene interacties eenrol. Zo kunnen positief en negatief geladen deeltjes interageren en deopzuivering of het chromatografieproces verstoren.

Figuur 3.4: interacties en hun energieën

Tenslotte kan hier nog vermeld worden dat de eigenschap om UV licht teabsorberen van belang is en gebruikt wordt bij de detectie van organischeverbindingen (bijvoorbeeld bij chromatografie). De meeste functionelegroepen absorberen bij een golflengte beneden 220nm, maar dit varieertnaargelang de substitutenten. Wanneer er aromatische structuurelementenaanwezig zijn, neemt de molaire absorptiecoëfficiënt sterk toe.

2018 21


3.6.2 chemische aspecten

De aanwezigheid van functionele groepen bepaalt de chemische aspectenvan de matrix. De zuursterkte van carbonzuren wordt bepaald door desubstituenten enwordtweergegevendoor de zuurdissociatieconstante (pKa).Zo zullen dichloorazijnzuur (1.3) en trifluoroazijnzuur (0.3) veel sterker zuurzijn dan azijnzuur (4.76). Analoog hieraan kan men de basesterkte vanaminen vergelijken.

De oplosbaarheid van organische verbindingen hangt af van de polariteitvan de moleculen en die is op zijn beurt afhankelijk van het aantalkoolstofgroepen (CH2) en het aantal functionele groepen. Als vuistregel kanmen stellen dat moleculen met 1 functionele groep per 6 koolstofatomenpolair zijn en dus wateroplosbaar. Indien er per 12 koolstofatomen minderdan 1 functionele groep aanwezig is, zijn de moleculen apolair. Dit is slechtseen vuistregel en de grens is dikwijls moeilijk te trekken.

Een duidelijkere weergave van de polariteit wordt gegeven door deverdelingscoëfficiënt tussen bijvoorbeeld octanol en water.

P =[organischefase]

[waterigefase]

Meestal wordt het logaritme van de verdelingscoëfficiënt gebruikt (log P).Hier kan men stellen dat moleculent met een log P < 1 polair zijn terwijlmoleculen met een log P > 3 apolaire eigenschappen hebben. Er is goedeovereenkomst tussen de verdelingscoëfficiënt (log P) en de retentiefactor(log kw) die verkregen wordt bij elutie op een C18 HPLC kolom. Vandeze correlatie kan men gebruik maken om de log P van verbindingen tevoorspellen aan de hand van HPLC experimenten.

2018 22


3.6.3 fysisch-chemische aspecten van de matrix

Bij complexe monsters zoals biologische vloeistoffen, farmaceutischepreparaten, voedingswaren en milieumonsters zijn de fysische-chemischeeigenschappen sterk verschillend. De kennis van de matrix is hierbij zeerbelangrijk en bij analyse moet er dan ook rekening gehouden worden met desamenstelling ervan.

Bij biologische monsters hangt de samenstelling van de matrix niet alleen afvan de aard van het monster (bloed, plasma, serum, urine,...) maar ook vande monstername (leeftijd, tijdstip van de dag, geslacht).

De aanwezigheid van eiwitten kan leiden tot problemen bij descheidingsmethoden die op de stalen uitgevoerd worden:

• denaturatie en/of precipitatie van de eiwitten waardoorverstoppingen kunnen ontstaan

• adsorberen van eiwitten aan de kolom met wijziging van deretentietijden tot gevolg

• reageren van eiwitten met analieten waardoor producten ontstaanmet andere chromatografische eigenschappen

• verstoring van het eiwit-analiet evenwicht waardoor de verhoudingtussen vrij en gebonden fractie wijzigt

Voor eiwitten zonder aromatische aminozuren ligt het UVabsorptiemaximum rond 200nm. De aanwezigheid van proteïnen kandus interfereren indien men wenst analieten te meten bij deze golflengte.

De pH van bijvoorbeeld plasma kan wijzigen in functie van de tijd (verse -oude stalen). Zo ook bij urinestalen waar door ontbinding van ureum CO2

wordt gevormd en het achtergebleven NH3 de pH doet stijgen.

2018 23


3.7 biologische monsters

3.7.1 bloed, plasma en serumBloed kan worden afgenomen via een veneuze (zelden arteriële) punctieof een vingerprik. Vacutainer buizen zijn voorzien van een naald envacuüm. Er bestaan verschillende types die, naargelang de analyse die mengaat uitvoeren, ook verschillende bloedstollende stoffen (heparine, EDTA,NaF, citraat-dextrose mengsel) of bewaarmiddelen (NaF als enzymeremmer,ascorbinezuur en thiolen als antioxidans) bevat.

Bloed moet men voorzichtig behandelen om geen bloedcellen te latenbarsten. Dit kan dan later problemen veroorzaken tijdens de analyse.

Serum wordt gemaakt door het centrifugeren van een bloedmonster na hetstollen van bloed. Hierdoor zijn fibrinogeen en stollingsfactoren afwezig.

Bij langdurig bewaren van plasma kan de pH wijzigen. Daarom is het somsnodig om buffers toe te voegen om de pH stabiel te houden. Aangeziende buffercapaciteit bepaald wordt door de proteïnen en door de aanwezigeionen zoals bicarbonaat, volstaat het vaak niet om de proteïnen neer te slaanom de pH constant te houden.

Precipitatie van proteïnen kan worden tegengegaan door toevoegen vandetergenten zoals natriumlaurylsulfaat (ionogeen), triton X-100 (nietionogeen).

In de routine klinische biologie worden stalen nagenoeg onmiddellijkgemeten en heeft men geen last van pH wijzigingen en neerslag vanproteïnen.

3.7.2 weefselhomogenaten

Weefselhomogenaten worden verkregen door monsters fijn te malenen te homogeniseren in een geschikt solvent zoals water, buffer oftrichloorazijnzuur. Indien er oplosbaarheidsproblemen zijn, kan als solvent

2018 24


ook methanol gebruikt worden. Meestal werkt men in gekoelde toestand omontbinding van het staal tegen te gaan.

3.7.3 urine en faeces

Urinemonsters worden vers gecollecteerd en kunnen gedurende enkele urentot enkele dagen in kunststof recipiënten bewaardworden. De stalenworden,indien nodig, gecentrifugeerd en ingevroren.

Faeces kunnen opgevangenworden in een zak van plastiek of aluminiumfolieen vervolgens, indien nodig, onteiwit worden met methanol en eventueelgevriesdroogd worden.

3.7.4 bioveiligheid

Aangezien men nooit op voorhand met zekerheid weet of biologischemonsters al dan niet geïnfecteerd zijn met een bacterie of een virus, moetenze steeds met voorzichtigheid worden behandeld. Daarom moeten volgendevoorzorgen genomen worden:

• Alle biologische stalen worden behandeld alsof ze geïnfecteerd zijn.Vooral gevaarlijk zijn bloed en cerebrospinaal (CSF) vocht, maar hetgeldt eveneens voor neusvocht, faeces, speeksel, zweet, tranen, urineen braaksel.

• Het gebruik van naalden en andere scherpe instrumenten tijdens demonstername moet tot een minimum worden beperkt.

• Beschermende kledij moet steeds gedragen worden, bestaande uit:latex of vinyl handschoenen, een laboratoriumjas. Ogen en gezichtmoeten bedekt zijn.

• Tijdens het werken met biologische stalen mag er niet gegeten,gedronken of gerookt worden. Het is evident dat pipetteren met demond ook niet toegelaten is.

• Bij het werken met aerosolen moeten er speciale maatregelengenomen worden.

• Werkplaatsen moeten regelmatig, zeker dagelijks worden gereinigden ontsmet met bleekmiddel of alcohol (70 ◦).

2018 25

4

TECHNIEKEN VOORMONSTERBEWERKING

4.1 basisapparatuur en -technieken

4.1.1 centrifugeren

In het algemeen kan centrifugeren gebruikt worden om partikels neer teslaan, om te filtreren bij verhoogde zwaartekracht of om solventen teverdampen of oplossingen te concentreren.

Om partikels te scheiden of neer te slaan worden centrifuges gebruikt. Demassa van de partikels bepaalt welke versnelling (a) hiervoor nodig is. Eenbelangrijk onderdeel van een centrifuge is de rotor (het draaiend gedeeltewaar de buisjes met stalen in worden geplaatst). Voorwerpen dienen ineen centrifuge steeds gebalanceerd geplaatst te worden. Hoe groter a, hoenauwkeuriger de uitbalancering moet gebeuren. Meestal worden de buisjeshiervoor gewogen.

Centrifuges kunnen ingedeeld worden naargelang de aard van de rotor:

• uitzwaaiend• vaste hoek

4 TECHNIEKEN VOOR MONSTERBEWERKING

• horizontaal• verticaal

Uitzwaaiende rotors verhinderen dat het neerslag (of pellet) tegen dezijwanden blijft kleven, wat het verwijderen van het supernatans zoubemoeilijken.

Doordat het precipitaat tegen de wanden blijft hangen bij vaste hoek rotorszijn deze minder geschikt voor het verwijderen van het supernatans. Zezijn daarentegen wel zeer geschikt voor het scheiden van niet-mengbarevloeistoffen.

Centrifugale kracht wordt gegeven door volgende vergelijkingen (met als rde straal en ω de hoeksnelheid):

F = mv2

r= m

(2 π r/t)2

r= m ω2 r

De relatieve centrifugale kracht (relative centrifugal force, RCF = F/g)wordt dan (g = 980.65cm/sec2):

RCF =ω2 r

980.65

Uitgerekend in toeren per minuut (RPM) wordt het (r in cm):

RCF = 11.17 r

(RPM1000

)2

Wanneer gecentrifugeerd wordt, is het belangrijk om te weten welke krachtgebruikt werd. Bij de beschrijving van zulk een experiment is het daarombeter de waarde van de RCF hiervoor te gebruiken. Zodoende kan eenexperiment herhaald worden op andere toestellen (met een ander diameteren andere RPM). Het opgeven van enkel RPM is niet voldoende omdat destraal ook gekend moet zijn.

Een eenheid die geassocieerd is met het centrifugeren is de Svedberg(S). Dit is een sedimentatiecoëfficient die weergeeft hoe snel een partikel

2018 27


sedimenteert. Grotere moleculen of deeltjes sedimenteren sneller en hebbendus een grotere S waarde. Deze S waarden zijn niet additief en wordenhoofzakelijk nog gebruikt om de grootte van RNA en zijn complexen metproteïnen weer te geven (zoals in ribosomen).

Centrifuges kunnen ook ingedeeld worden naargelang de rotatiesnelheid dieze kunnen bereiken:

• lage snelheid centrifuges (low speed): RPM tot 5000• superspeed (high speed/superspeed): RPM tot 20000,• ultracentrifuges (ultraspeed): RPM tot 150000, het toestel wordt ondervacuüm gezet tijdens het centrifugeren om de luchtweerstand teverminderen en om betere temperatuurscontrole mogelijk te maken.

Centrifugeerbuizen moeten bestand zijn tegen de krachten die ontstaan incentrifuges. De meest gebruikte kunststofmaterialen zijn:

• polypropyleen (PP)• polyallomer (PA) = ethyleen propyleen copolymeer• polycarbonaat (PC)• polyethyleen tereftalaat (PET)

Centrifuges kunnen niet alleen dienen om partikels neer te slaan uit eenoplossing, maar ook om door ultrafiltratie verbindingen te scheiden ofoplossingen te concentreren. Hiervoor kanmen gebruikmaken van een filterdie selectief moleculen boven een bepaalde massa kan tegenhouden.

Tegenwoordig kan de temperatuur in centrifuges constant gehoudenwordendoor ofwel te verwarmen ofwel te koelen. Ook kunnen centrifuges uitgerustzijn met een vacuümsysteem waardoor ze kunnen gebruikt worden voorcentrifugale verdamping (Speedvac). Het voordeel is dat de verdampingaan de oppervlakte gebeurt en hierdoor het borrelen tijdens het verdampenwordt vermeden. De centrifuge wordt aan een vacuümpomp aangesloten.Tussen pomp en centrifuge wordt een koudeval (cold trap) geplaatst. Dit iseen glazen recipiënt die geplaatst wordt in vloeibaar stikstof of vast CO2 endus op zeer lage temperatuur wordt gehouden. Hierdoor zullen de afgezogen

2018 28


dampen condenseren en niet in de pomp of het milieu terecht komen. Indiennodig kan nog een chemische val geplaatst worden om zuren of basen teverwijderen uit de dampen.

4.1.2 verwarmen en verdampen

Verwarmen van oplossingen wordt meestal met een elektrisch toestel meteen thermostaat uitgevoerd. Het bestaat uit een aluminium blok waarinzich uitsparing voor tubes of buisjes bevinden. Wanneer een toevoer van(verwarmde) lucht, stikstof of helium is voorzien, kan het toestel ookgebruikt worden om solventen te verdampen onder atmosferische druk.Hiervoor wordt op de proefbuizen een plaat aangebracht waar zich naaldenop bevinden. Via die naalden stroomt het gas op de oplossingen en wordt hetverdampen versneld. Verwarmingsblokken kunnen ook gebruikt worden om(derivatiserings)reacties op kleine schaal uit te voeren of om enzymatischereacties te incuberen.

Gethermostatiseerde waterbaden kunnen ook gebruikt worden om stalenop een constante temperatuur te houden, meestal wordt er verwarmd.Eppendorftubes worden dan in een vlotter geplaatst en op het water gelegd.

Zandbaden zijn ook bruikbaar om stalen op temperatuur te houden. Dezekunnen dan in een verwarmingsoven geplaats worden. De oven dient welbestand te zijn tegen de eventuele (solvent)dampen die kunnen vrijkomen.

Om grotere hoeveelheden solvent te verdampen kan men een roterendverdampingstoestel (Rotovapor) gebruiken. Met dit toestel kunnenoplosmiddelen onder verminderde druk afgedampt worden. Om deoplossingen te verwarmen is een waterbad voorzien en om spatten tevermijden wordt het kolfje of buisje rondgedraaid. Het toestel is verbondenmet een vacuümpomp en staat tijdens het gebruik onder vacuüm. Ook hieris het aangewezen om tussen toestel en pomp een koudeval te plaatsen omde vrijgekomen dampen op te vangen.

Recent werden ook microgolfovens in laboratoria geïntroduceerd voor het

2018 29


verwarmen van stalen. In combinatie met een vacuümsysteem kunnen deapparaten ook solventen uitdampen.

Voor de volledigheid kunnen we nog vermelden dat kleine hoeveelhedensolventen en vocht verwijderd kunnen worden in een droogoven,(vacuüm)exsiccator of droogpistool (van Abderhalden).

4.1.3 verdunnen en pipetteren

In analyselaboratoria worden doorgaans twee soorten pipetten gebruikt:glazen volumetrische pipetten en micropipetten met verwisselbare(wegwerp)tips.

Glazen volumetrische pipetten kunnen gegradueerd zijn of volpipetten. Erbestaan verschillende kwaliteitsklassen met elk hun specifieke toleranties,die terug te vinden zijn op de pipetten zelf.

Micropipetten met verwisselbare tips kunnen van het type zijn metvariabele volumeïnstelling of met een vast volume. Wat betreft hetwerkingsmechanisme zijn er 2 soorten te onderscheiden: pipetten diewerken op basis van luchtverplaatsing. Deze zijn eenvoudiger engoedkoper, echter minder nauwkeurig.

Nadelen van pipetten op basis van luchtverplaatsing zijn de mogelijkheid totcontaminatie, problemen bij pipetteren van viskeuze en vluchtige solventen.De pipetten die werken met een (wegwerp)piston worden vooral gebruiktvoor PCR en hebben deze nadelen niet. Ze zijn echter duurder.

Factoren die pipetteerfout beïnvloeden:

• densiteit van de vloeistof• temperatuur• hoogte (boven zeespiegel) / luchtdruk

Pipetten dienen regelmatig gecalibreerd te worden. Een veel gebruiktemethode is om water te pipetteren en de hoeveeldheid die afgeleverd wordt

2018 30


te wegen. Er dient natuurlijk rekening gehouden te worden met de densiteitvan water en deze varieert in functie van de temperatuur.

4.1.4 mengen en roeren

Metmengen en roerenwil men bereiken dat een oplossing of staal homogeenwordt. Men kan op verschillende manieren bekomen:

• vortexen: 50 tot 1500 RPM• microgolven: < 1 minuut• ultrasoon• magnetische roerder• mengen schudtoestellen

4.2 oplossen van stalen voor analyse

4.2.1 vermalen

De oplossnelheid hangt af van de initiële deeltjesgrootte van monsters. Fijnepoeders lossen dus veel vlugger op dan grotere brokken. Het materiaalwaarmee gemalen wordt moet natuurlijk harder zijn dan het materiaal datgemalen wordt. Het is daarom nuttig om de hardheid van de materialen nate gaan. Producenten geven vaak de hardheid weer met een waarde, volgensde hardheidsschaal van Mohs. Deze geeft een relatieve hardheid weer doorbepaalde referentiematerialen volgens hardheid te rangschikken.

Men kan stalen vermalen met behulp van een mortier en stamper. Dezekunnen vervaardigd zijn van onder andere porcelein, agaat, zirconium, glasof brons. Door afwisselend te verwrijven met de stamper en af te schrapenworden grovere korrels herleid tot poeder. Er bestaan ook elektrischemaaltoestellen gebaseerd op het mortier met stamper principe.

Een kogelmolen bestaat uit een pot waarin zich keramische of stalen ballenbevinden samen met de te malen substantie. Bij traagdraaiende modellen

2018 31


hardheid materiaal absolutehardheid

1 talk 12 gips 23 calciet 94 fluoriet 215 apatiet 486 orthoclaas 727 kwarts 1008 topaas 2009 safier 40010 diamant 1500

vallen de ballen naar beneden en verkleinen aldus de korrelgrootte van hetpoeder. Sneldraaiende excentrische modellen maken gebruik van de inertievan de ballen om poeder te vermalen. Er zijn ook varianten in de handeldie bestaan uit schijven en ringen. Het principe is hetzelfde als bij eenkogelmolen.

Een driewals of walsmolen bestaat uit drie ronddraaiende cilinders. Deruimte tussen de cilinders kan ingesteld worden en bepaalt de fijnheid vanhet eindresultaat. Het wordt in de apotheek vooral gebruikt om zalven fijnte malen die vaste bestanddelen bevatten, bijvoorbeeld zinkoxide zalven.

4.2.2 oplossen van anorganisch materiaal met zuren

M + nH+ −−→ Mn+ + n2H2

Wanneer men metalen of metaalionen wil bepalen, zal men de te bepalenbestanddelen moeten omzetten in dezelfde geoxideerde toestand. Metalenkunnen voorkomen onder vorm van slecht oplosbare oxiden of in gebondentoestand met anorganische of organische moleculen. Het vrijmaken van eenverbinding uit een matrix wordt ook ontsluiten genoemd.

2018 32


Metalen met een negatieve redoxpotentiaal zullen geoxideerd worden inniet-oxiderende zuren zoals HCl, HBr, HF, H3PO4, verdund H2SO4 en verdundHClO4. Carbonaten en sulfiden zullen in deze omstandigheden verloren gaanaangezien ze bij aanzuren vluchtige verbindingen vormen. Sn en Hg vormenvluchtige Cl zouten en zullen ook vervluchtigen.

Bestanddelen die niet oplossen in niet-oxiderende zuren, kunnen metoxiderende zuren zoals HNO3 of geconcentreerd H2SO4 behandeld worden.Een gekend voorbeeld is het gebruik van koningswater (aqua regia, HCl:HNO3

3:1 vol/vol) om goud op te lossen.

4.2.3 oplossen van anorganisch materiaal met basen

Materiaal dat niet oplost in zuur milieu kan opgelost worden door teversmelten in een platina/goud bekertje. Hiervoor worden verbindingenzoals NaOH, KOH of Na2O2 toegevoegd. Het nadeel van deze methode ishet feit dat door gebruik te maken van de hulpstoffen, ook onzuiverhedenkunnen geïntroduceerd worden.

4.2.4 verassen van organisch materiaal

Wanneer men anorganische bestanddelen wil analyseren, is het soms nodigom organisch materiaal te verwijderen omdat het kan interfereren met deanalyse. Organisch materiaal kan verwijderd worden door droge of natteverassing. Wanneer er een vloeistof aan te pas komt, spreken we van natteverassing. De best gekende methode is de natte verassing met H2SO4 voor deanalyse van stikstof (Kjeldahl digestie).

4.2.5 solubilisering van biologische monsters

Het in oplossing brengen (solubiliseren) van biologische monsters is nodigom ontleding door enzymen tegen te gaan. Het toevoegen van NaF als

2018 33


enzymeremmer helpt immers niet altijd en zeker niet wanneer de ontledinghet gevolg is van chemische reacties.

Aangezien stoffen vaak gebonden zijn aan eiwitten kunnen ze hierdoorjuist beschermd zijn tegen enzymatische afbraak. Proteïnen kunnen onderinvloed van bijvoorbeeld solventen, bewaring of temperatuur veranderenvan conformatie waardoor de binding met producten kan veranderen en alsgevolg hiervan ook de ontleding versneld of vertraagd wordt. Het is dusbelangrijk om eerst de enzymatische activiteit stil te leggen om daarna overte gaan tot het oplossen van het monster.

Weefselhomogenaten kunnen in oplossing gebracht worden door volgendetechnieken te gebruiken:

• bestraling met microgolven• chemische reacties• ultrasoon trillen• toevoegen van enzymen

Het gebruik van microgolven heeft het voordeel dat het oplossenrelatief snel kan gebeuren. Aangezien het meestal in gesloten vatenwordt uitgevoerd, is de kans op contaminatie ook klein. Er kan opkleine hoeveelheden en op veel stalen tegelijk gewerkt worden en menkan de solubilisering ook automatiseren. Het nadeel is dat er somswarmteontwikkeling optreedt waardoor thermolabiele stoffen kunnenontleden.

Indien de analiet gebonden is aan eiwitten, kunnen enzymen gebruiktworden om de matrix af te breken en om de stoffen vrij te zetten. Bruikbaarvoor de afbraak van proteïnen in plasma of serum zijn proteasen zoalspepsine, proteïnase K en subtilisine. De pH moet echter aangepast worden(rond pH 8). Sommige bestanddelen zijn bij deze pH echter niet stabiel.

Men kan ook chemisch solubiliseren door eiwitten te ontbinden bij 90 ◦C inaanwezigheid van fosforzuur, TRIS buffer, 50% zwavelzuur, perchloorzuur entetramethylammonium hydroxide. De oplossingen kunnen na afkoelen meteen geschikt solvent geëxtraheerd worden.

2018 34


4.3 filtratie

4.3.1 inleiding

Filtratie is fysisch-chemische scheidingmethode gebaseerd op een continuestroom van medium doorheen een poreus filter of membraan. Men pasteen filtratie toe om onopgeloste deeltjes uit een oplossing te verwijderenof om oplossingen te concentreren. Om te kunnen filtreren heeft men eenmembraan nodig en maakt men gebruik van drukverschil om de vloeistofdoor het membraan te duwen. Tijdens het proces worden de deeltjesvastgehouden op het oppervlak of in de poriën van de filter. We beperkenons in dit gedeelte tot de niet selectieve filtermethoden.

Naargelang de poriegrootte kan men filtraties onderverdelen in:

• microfiltratie: 100 - 1000 nm• ultrafiltratie: 1 - 100 nm• hyperfiltratie (of omgekeerde osmose): 0.1 - 1 nm

Naargelang de aard van de te scheiden deeltjes en medium kunnen weonderscheiden:

• scheiding van vaste deeltjes van gassen• scheiding van vloeistofdruppels van gassen (aërosolen)• scheiding van vloeistoffen in vloeistoffen (emulsies)• scheiding van vaste deeltjes van vloeistoffen (suspensies)

Naargelang het filtratieproces kan men onderscheiden:

• dieptefiltratie• oppervlaktefiltratie• extractiekous filtratie

2018 35


4.3.2 dieptefiltratie

• deeltjes worden zowel op het oppervlak als in de poriën vastgehouden• random georiënteerde vezels of bolletjes• katoen, glasvezel, wol, cellulose, gesinterd metaal• hoge belaadbaarheid• groot intern volume

Cellulosefilters kunnen gebruikt worden tot een poriegrootte van 2.5µm ofgroter. Glasfilters kunnen lager gaan.

4.3.3 oppervlaktefiltratie

• werken als een rooster en deeltjes worden bijna uitsluitend op hetgladde filteroppervlak vastgehouden

• poriegrootte vanaf 0.1µm

Membraanfilters zijn meestal opppervlaktefilters.

4.3.4 extractiekous filtratie (thimble)

• gemaakt van cellulose, glas of kwarts• voor verzameling van vaste deeltjes uit lucht- of gasmonsters

Worden ook gebruikt bij Soxhlet extracties.

4.3.5 microfiltratie

Microfiltratie is een niet-selectieve techniek om grote moleculen ofonopgeloste deeltjes te verwijderen uit oplossingen. Hierdoor kan destabiliteit van monsters verhoogd worden en zullen er verstoppingen in

2018 36


Figuur 4.1: filtratietechnieken

2018 37


bijvoorbeeld bij LC systemen vermeden worden. Meestal wordt gebruikgemaakt van membranen.

Belangrijke factoren die een rol spelen bij de efficiëntie van microfiltratie:

• de drijvende kracht is drukverschil aan beide zijden van de filter• viscositeit van het oplosmiddel• temperatuur• pH heeft invloed op stabiliteit van membraan• chemische verenigbaarheid• oppervlaktespanning

De keuze van het meest geschikte membraanmateriaal hangt af van deporiëngrootte die men wil gebruiken en van de aard van het solvent. Enkelevoorbeelden van filtermateriaal:

Membranen gemaakt door anodische oxidatie van aluminium zijn zeersterk en een porositeit vanmeer dan 50%. Hierdoor zijn ze zeer geschikt voorhoge filtratiesnelheden (vergeleken met polymere membranen). Ze zijn nietgevoelig voor UV licht en gammastraling en worden daarom veel gebruikt inde biotechnologie. Het materiaal is stabiel tussen pH 2 en 10.

Polycarbonaatmembranen zijn hydrofiel en hebben een lage niet-specifiekeeiwitbinding. Ze zijn daarom bruikbaar voor het filtreren van eiwithoudendebiologische stalen.

Polyether sulfon membranen hebben het voordeel dat er nauwelijkseiwitten gebonden worden. Het zijn hydrofiele membranen bestand tegenverschillende oplosmiddelen en bestaan in poriëngrootte van 0.2 - 5 µm.

Nylon 66 membranen zijn hydrofiel en geschikt voor vele organische enwaterige vloeistoffen.

Zilver membranen zijn zeer geschikt voor filtratie van LC solventen omdatze chemisch heel intert zijn.

Het filtreren van HPLC solventen is belangrijk om volgende problemen tevoorkomen:

2018 38


• optreden van spookpieken• verstoppingen met als gevolg een te laag debiet• drukschommelingen• beschadiging van het pompsysteem• vorming van gasbellen in de detectoren• onvoorspelbare variaties in de basislijn

Vergeleken met de ruimte tussen de partikels van het kolommateriaal,hebben de leidingen een veel grotere diameter en raken ze dus minder vlugverstopt. Het is daarom ook aan te raden om een zogenaamde guard kolomte gebruiken. Dit zijn korte prekolommen met dezelfde stationaire fase dievoor een kolom worden gemonteerd. Ze beschermen de analytische kolomen zijn minder duur om te vervangen indien ze beschadigd geraken.

Hydrofobe filters kunnen gebruikt worden voor de scheiding van organischeen waterige fasen.

Filters in de vorm van vlakke membranen worden in filterhoudersgemonteerd. Deze kunnen opzetbaar zijn op spuiten. In de vorm vanholle vezel filters worden ze toegepast wanneer grote volumes gefiltreerdmoeten worden aan een hoger debiet. De oppervlakte is meestal veel groterdan bij vlakke filters. Buisvormige filters kunnen vervaardigd worden vanhydrofiele (cellulose esters) of hydrofobe (polypropyleen) materialen.

4.3.6 ultrafiltratie

Ultrafiltratie is gebaseerd op het selectief tegenhouden van moleculen dooreenmembraan dat moleculen doorlaat met eenmolecuulgewicht kleiner daneen 'cut-off' waarde. De filtratie wordt uitgevoerd door een drukverschil datkan verkregen worden door de vloeistof te pompen, door luchtdruk of doorcentrifugeren. Tegenwoordig bestaan er membranen met cut-off waardendie beginnen bij molecuulgewicht 500 tot over 500000. De poriëngrootte ishierbij 0.0015 tot 0.1 µm. Ultrafiltratie kan gebruikt worden om het analietaf te zonderen van grote moleculen (proteïnen, DNA) of om grote moleculenop te zuiveren of te concentreren. Ultrafiltratie is vergelijkbaar met dialyse,

2018 39


maar daar is de drijvende kracht het concentratieverschil aan beide zijdenvan het membraan.

4.3.7 hyperfiltratie

Bij hyperfiltratie gebruikt men filters waar enkel solvent wordt doorgelaten.Men spreekt hier ook over omgekeerde osmose. Het wordt toegepastom water uit oplossingen te verwijderen en monsters te concentreren.Membranen van cellulose en polyamide zijn hiervoor bruikbaar.

4.3.8 selectieve filtermaterialen

Materialen kunnen ook geïmpregneerd of chemisch gebonden worden ofgederivatiseerd worden om selectiviteit te verkrijgen voor een bepaaldanaliet.

PVDF (polyvinylideendifluoride) membranen worden gebruikt om eiwittente binden. Analoog hieraan zijn er immunoaffiniteitsmembranen. Dezebestaan uit Nylon 66 waarop monoclonale of polyclonale antilichamenworden aangebracht.

Membranen kunnenook beladenwordenmet ionenwisselaarmateriaal. Dezefiltermembranen worden voor gebruik gespoeld en geconditioneerd met eenbepaalde buffer. Daarna wordt het mengsel aangebracht, gewassen metbuffer en tenslotte geëlueerd met bijvoorbeeld een zoutgradiënt. Ze kunnenzowel off-line (met een spuit) als in-line (met een pomp, bijvoorbeeld bij LC)gebruikt worden.

4.4 oplosmiddel-reductietechnieken

Tijdens het monsterbehandelingsproces is het soms nodig om solventen teverwijderen. Dit is het geval indien men:

2018 40


• oplossing wenst te concentreren• van solvent moet te veranderen (polair-apolair of omgekeerd) bijHPLC analyses

• stalen wil drogen (betere bewaring)

4.4.1 verdampen

Verdampen onder atmosferische druk houdt het risico in dat ookanaliet wordt kwijtgespeeld of dat er ontbinding optreedt door de hogetemperaturen. Vandaar dat er mildere technieken worden toegepast.

Het blazen van een verwarmde lucht of gas kan op verschillende stalentegelijk worden uitgevoerd, maar het is moeilijk automatiseerbaar.

Voor grotere hoeveelheden kan gebruik worden gemaakt van een RotaVap.Hierin kunnen monsters onder verminderde druk worden drooggedampt.Het gevaar bestaat dat vluchtige analieten uit de stalen kunnen verdampen.

Een Kuderna-Danish apparaat bestaat uit een erlenmeyer met daaropeen vigreux of snyder kolom. Deze verhindert dat vluchtige verbindingenoverkoken en hierdoor kan men selectief het solvent afdampen. De nadelenzijn dat heftig koken niet kan worden tegengegaan (in een RotaVap wordthet kolfje rondgedraaid) en men kan niet tegengaan dat het staal volledigdroogdampt (en beschadigd wordt door de grote temperatuur).

Om de nadelen van het Kuderna-Danish apparaat weg te werken, is er eenvariant ontwikkeld, namelijk de EVACS (evaporative concentration system).Met dit apparaat verloopt de verdamping echter trager.

4.4.2 vriesdrogen

Door te vriesdrogen (of lyofiliseren) kan men water en andere vluchtigebestanddelen verwijderden. Het is vooral bruikbaar wanneer het analietvluchtige componenten bevat die met ander technieken verloren zouden

2018 41


Figuur 4.2: EVACS apparaat

gaan. Het resultaat van vriesdrogen zijn watervrije monsters diegemakkelijker te verwerken zijn. De oplossing wordt eerst ingevroren.Daarna vermindert men de druk (men legt een vacuüm aan) waardoor het ijsonmiddellijk in de gasfase overgaat zonder eerst te smelten. Gelyofiliseerdestalen kunnen terug opgelost worden in water of een ander solvent.

4.4.3 vacuümsublimatie

Onder sublimatie verstaatmen het overgaan van de vaste naar de gasvormigetoestand en de condensering zonder dat men de vloeibase fase passeert. Hetonderliggend proces is hetzelfde als bij vriesdrogen. Het verschil is dat bijvriesdrogen het solvent sublimeert, terwijl bij vacuümsublimatie men hetanaliet laat sublimeren. Het is een techniek die niet zo vaak wordt toegepastomwille van het feit dat ze enkel geschikt is voor een kleine groep analieten.

2018 42


4.4.4 sublatie

Figuur 4.3: sublatie apparaat

Oplossingen die oppervlakteactieve stoffen bevatten zijn vaak moeilijk teconcentrerenmet de gangbare technieken. Men kan hiervoor gebruikmakenvan sublatie. Dit is een techniek waarbij men schuim genereert door stikstofte blazen door het monster. Het schuim wordt geëxtraheerd door eenorganisch solvent (bijvoorbeeld ethylacetaat) dat boven op de waterige laagwerd aangebracht. De ethylacetaat laag kan dan verder verdampt wordenmet een RotaVap. Aangezien men kan vertrekken van grote hoeveelhedenstaal, is deze methode geschikt om verdunde oplossingen te extraheren. Zewordt toegepast bij het opsporen van detergenten in water (figuur 4.3).

2018 43


4.4.5 vriesconcentreren

Bij vriesconcentreren laatmen het solvent (meestal water) bevriezen waarnamen de ijskristallen van de rest afzondert. Het gevaar voor verlies aananaliet bestaat omdat occlusie kan optreden van product in de ijskristallen.Vriesconcentreren wordt onder andere ook gebruikt om geconcentreerdfruitsap, koffie extract en ahornsiroop (esdoornsiroop) te produceren.

4.5 distillaties

4.5.1 algemeen

Distilleren is een techniek om vluchtige verbindingen te scheiden vanminder vluchtige verbindingen. Wanneer men een mengsel van vloeistoffenkookt, zullen er solventdampen ontstaan. Deze dampen hebben een hogergehalte aan het solvent met het lagere kookpunt. Wanneer dit proceséénmaal wordt toegepast, is het niet mogelijk om de vloeistoffen volledigzuiver te verkrijgen. Een meervoudige evenwichtsinstelling tussen dampen vloeistoffase kan men bekomen door gebruik te maken van een vigreuxkolom. Dit is een glazen buis die instulpingen bevat of gevuld is metglasringetjes. Vacuümdistillatie is het distilleren onder verminderde druk.Hierdoor wordt het mogelijk om vloeistoffen met een hoog kookpunt tochover te distilleren. Bij verminderde druk is het kookpunt immers lager danbij atmosferische druk.

4.5.2 stoomdistillatie

Polaire verbindingen zijn moeilijk met een organisch solvent te extraheren,tenzij men als organische fase een meer polair solvent gebruikt en hierdoorde verdelingscoëfficiënt gunstiger maakt. De selectiviteit zal echter eenprobleem blijven en stoomdestillatie is in deze gevallen een aangewezenalternatief.

2018 44


Figuur 4.4: fasediagramma voor een mengsel

Het staal wordt aan de kook gebracht door op te warmen of door stoom doorde oplossing te borrelen. De ontstane dampen worden naar een condensorgevoerd en het condensaat wordt opgevangen.

Aangezien het staal wordt opgewarmd tot kooktemperatuur van water,is deze methode niet geschikt voor thermolabiele verbindingen. Deverbindingen moeten ook kleine moleculen zijn die relatief vluchtig zijn.Voor heel wat endogene verbindingen en geneesmiddelen is deze methodedus niet bruikbaar.

4.6 extractie van vaste monsters

4.6.1 soxhlet extractie

Deze techniek werd uitgevonden door Franz von Soxhlet in 1879 en is eenmethode om vaste en halfvaste monsters continu te extraheren. Het is eenkwantitatieve methode die toelaat kleine concentraties aan bestanddelenvolledig te recupereren. De extractie kan onbewaakt uitgevoerd worden.

2018 45


Figuur 4.5: Soxhlet extractie apparaat

Het apparaat werkt door het opkoken van het extractiesolvent. Desolventdampen condenseren in de koeler en druppelen in de extractiekous(thimble) waarin het staal zich bevindt. Er bestaan 2 varianten glaswerk,namelijk modellen met een filter waar de extractiekous op rust (het principeis hier de continue infusie) en waardoor het solvent kan terugvloeien enmodellen met een hevel. De hevel zorgt ervoor dat wanneer het solvent eenbepaalde hoogte bereikt heeft in het extractiecompartiment, het solvent metde geëxtraheerde producten terugvloeit naar de kolf.

Het staal wordt dus continu geëxtraheerd met vers solvent waardoor hetmogelijk is om kwantitatief te extraheren. Het solvent dat op het eindeoverblijft in de extractiekous zal dus geen analiet meer bevatten.

De keuze van de extractievloeistof is heel belangrijk. Natuurlijk moet hetanaliet er in oplossen en de matrix liefst niet. Wanneer men gebruik maaktvan apolaire solventen zoals hexaan of petroleumether, zal men moeten

2018 46


werkenmet droog materiaal omdat deze vloeistoffen niet mengbaar zijn metwater en gemakkelijk emulsies kunnen vormen. Andere mogelijkheden zijnhet toevoegen van droogmiddel (bijvoorbeeld watervrij natriumsulfaat) ofhet werken met solventen die mengbaar zijn met water (acetonitrile) of hettoevoegen van polaire solventen die mengen met water (aceton).

De nadelen van deze extractiemethode is dat de extracties nogal tijdrovendzijn en dat de analieten stabiel moeten zijn bij het kookpunt van hetextractiesolvent. De methode werkt ook niet wanneer het analiet vluchtigis en een kookpunt heeft in de buurt van het solvent waarmee geëxtraheerdwordt.

Er bestaat een geautomatiseerd systeem (Soxtec) waarbij de extractiekousondergedompeld wordt in kokend solvent, vervolgens gespoeld wordt doorhet condensaat van het solvent en tenslotte geconcentreerd wordt. Hetsolvent wordt opgevangen en gerecycleerd.

De Soxhlet extractiemethode wordt nog steeds aanzien als standaard-methode omvaste stalen te extraheren ennieuwemethodenwordenhiermeevergeleken.

4.6.2 schudfles methoden

Deze eenvoudige methode waarbij het monster gesuspendeerd wordt inde extractievloeistof kan bijvoorbeeld worden gebruikt bij de analysevan grondmonsters. Indien nodig wordt meerdere malen achtereengeëxtraheerd. Het probleem dat zich kan stellen is dat het analiet in dematrix is verankerd of geadsorbeerd is aan het oppervlak van dematrix. Menkanmicrogolven gebruiken om de efficiëntie van deze methode te verhogen.

4.6.3 homogeniseren

Het principe is hetzelfde als de schudflesmethode, maar er wordt gebruikgemaakt van een homogenisator (blender). Het vaste staal wordt gemengd

2018 47


met het extractiesolvent en vervolgens gehomogeniseerd. Door hetvergrootte oppervlak zal de vloeistof gemakkelijker in contact komenmet het analiet. Eventueel kunnen vaste partikels toegevoegd worden(droogijs, diatomeeën) om het contact tussen extractievloeistof en monsterte verbeteren. Door de voortdurende beweging krijgen we ook beteremenging en contact tussen het monster en solvent waardoor betereextracties verkregen worden.

Biologische monsters worden gehomogeniseerd en verdund in buffers.Hierbij zijn er enkele punten die aandacht vragen:

• De keuze van bufferionen hangt af van de pH die men wenst in testellen. Om een optimale buffercapaciteit te hebben, werkt men bij depH die in de buurt ligt van de pKa. De tegenionen zijn van belangomdat ze kunnen storen bij de analyse die men gaan uitvoeren en deconcentratie mag niet te hoog zijn omdat men danoplosbaarheidsproblemen kan hebben met precipitatie tot gevolg.

• De temperatuur van het homogeniseren mag niet te hoog zijn (besttussen 0 en 4 ◦C) omdat er proteolytische enzymen aanwezig kunnenzijn die het staal gaan afbreken.

• Enzymatisch hydrolyse kan voorkomen worden door protease- ofnuclease-inhibitoren toe te voegen.

• Voor de isolering van celorganellen werkt men best in isotonecondities. In hypotoon milieu zullen celorganellen openbarsten. NaCl0.15M (=0.9%) en saccharose 0.3M zijn voorbeelden van isotoneoplossingen.

• Thiolgroepen (-SH) kunnen gemakkelijk zwavelbruggen vormen dooroxidatie. Dit kan men verhinderen door toevoeging vananti-oxidantia zoals glutathion, mercaptoethanol en dithiothreitol.

• Door te verdunnen met bufferoplossing zal demetaalionenconcentratie verlagen. Hierdoor kan de activiteit of destructuur van macro-moleculen veranderen. Indien men destructuren wenst te behouden zullen er ook magnesium encalciumionen toegevoegd moeten worden aan de buffers. Indien mendeactivering wenst, kan men EDTA toevoegen om de metaalionen tecomplexeren.

2018 48


4.6.4 ultrasoon trillen

Het gebruik van ultrasoon trillen of ultrageluid kan op twee manierentoegepast worden: ofwel kan men het monster in een ultrasoon bad stekenofwel kan men een probe die ultrasoon geluid voortbrengt in het monstersteken. Ultrageluid wordt gekarakteriseerd door frequenties van ongeveer16kHz tot 200MHz.

Ultrageluid is een manier om energie aan een monster toe te voegenen kan gebruikt worden om deeltjes te verkleinen, om ze sneller op telossen, om chemische reacties te versnellen. Het kan gebruikt wordenom te homogeniseren, te steriliseren, om membranen af te breken of omrecipiënten schoon te maken. Bij vloeistof-vloeistof extracties kan het deverdeling van het analiet tussen de twee lagen versnellen en kan het eenalternatief zijn voor het schudden.

4.6.5 verzepen

Verzeping, of de hydrolyze van vetten in alcoholen en vetzuren, is eenefficiënt proces om neutrale lipiden te verwijderen uit biologische monsters.Aangezien men hiervoor geconcentreerd NaOH of KOH gebruikt, is hetbelangrijk om rekening te houden met het feit dat het analiet in dit sterkalkalisch milieu stabiel moet zijn. Uit het reactiemengsel kan het analiet dangeëxtraheerd worden met een organisch solvent.

4.6.6 microgolfextractie

Microgolven zijn niet ioniserende elektromagnetische golven met eengolflengte van ongeveer 1cm (10-100GHz). In de keuken worden ze toegepastin de magnetron oven. Ook in laboratoria worden magnetrons gebruiktvoor de destructie van biologische monsters, voor extracties van organischeen anorganische verbindingen, in toxicologisch onderzoek. Ze kunnen ook

2018 49


ingezet worden voor het ontdooien en drogen van monsters of om eiwittente denatureren.

Meestal worden destructies tegenwoordig met een magnetron uitgevoerden de Kjeldahl methode is hierdoor in onbruik geraakt. Ook als alternatiefvoor Soxhlet extractie wordt ze steeds vaker gebruikt. Bij destructies wordthet monster in een geconcentreerd zuur in een inert vat (open of dicht)gebracht en verhit in eenmicrogolfoven. De vroegeremethode (opwarmen inaanwezigheid van een anorganisch zuur) had heel wat nadelen: de methodevergt veel tijd, het zuur kan verdampen en dus gevaar vormen voor deomgeving, vluchtige verbindingen kunnen verloren gaan, verontreinigingenkunnen ingebracht worden en sporenmetalen kunnen vrijkomen uit het glasvan de recipiënten.

Microgolven zijn efficiënter om te verwarmen omdat ze van binnenuitwerken terwijl bij opwarmen door warmte eerst de temperatuur van hetrecipiënt moet stijgen en het langer duurt vooraleer de inhoud opgewarmdis. De golven resoneren in de oven en de staande golven versterken destralingen. Laboratoriummicrogolfovens zijn voorzien van eenmogelijkheidom dampen te verwijderen en zijn bekleed met teflon om corrosie tegente gaan. Het vermogen is nauwkeuriger en beter regelbaar dan bij dekeukenuitvoeringen en kan geprogrammeerd worden in functie van de tijd.Er bestaan ook versies waarbij de microgolven niet verspreid worden in deoven, maar wel gefocusseerd worden op het monster waardoor men eenefficiëntere en snellere verwarming bekomt.

Microgolven worden sterk geabsorbeerd door polaire of polariseerbaremoleculen zoals water of anorganische zouten. In een wisselendelektromagnetisch veld draaien de moleculen met hun dipool met derichting van het elektromagnetisch veld mee. In een vloeistof is hiervoorongeveer 1 picoseconde (ps) nodig. Dit komt overeen met een frequentievan ongeveer 100GHz. Niet alle moleculen kunnen die frequentie volgen enliggen achter op de veldrichting. Hierdoor absorberen zij energie en stijgtde temperatuur.

2018 50


4.7 extractie van oplossingen

4.7.1 vloeistof-vloeistof extracties

Bij vloeistof-vloeistof extracties (LLE, liquid-liquid extractions) wordt hetmonster opgeschud met een solvent dat niet mengbaar is met hetoplosmiddel van het staal. De analieten zullen zich verdelen tussen de tweefasen op basis van hun verdelingscoëfficiënt.

Voordelen:

• selectiviteit is regelbaar door keuze van solventen• toepasbaar voor zowel polaire als apolaire verbindingen• toepasbaar voor alle soorten waterige matrices• ionogene verbindingen kunnen als ion-paar geëxtraheerd worden• gemakkelijk uit te voeren• ook toepasbaar op kleine hoeveelheden• viscositeit en vaste deeltjes storen niet

Nadelen:

• er kan emulsievorming optreden• solventen kunnen toxisch en brandbaar zijn• het extractiemiddel moet achteraf verdampt worden• analieten kunnen adsorberen aan glas• automatisering is niet eenvoudig• relatief hoge kosten en bewerkelijkheid

Voor de keuze van de extractievloeistof spelen volgende parameters een rol:

• affiniteit voor analiet: het verschil in oplosbaarheid tussen de 2fasen (verdelingscoëfficiënt) moet groot genoeg zijn voor het analiet,terwijl onzuiverheden of niet gewenste bestanddelen moetenachterblijven in de waterfase

• mengbaarheid: de organische laag mag niet mengbaar zijn met dewaterige laag

2018 51


• polariteit: het verschil in polariteit tussen de organische fase en dewaterige fase moet groot genoeg zijn anders is het rendement van deextractie niet optimaal

• oplosbaarheid van het analiet: het analiet moet goed bevochtigdkunnen worden en oplosbaar zijn in het organisch solvent

• het kookpunt van het organisch solventmag niet te hoog zijn zodathet achteraf door indampen verwijderd kan worden

• de dichtheid van de organische fasemoet verschillend zijn van dievan de waterfase. Aangezien organische solventen zowel zwaarder(chloroform, dichloormethaan) of lichter (ether, ethylacetaat) kunnenzijn dan water, kan men zijn keuze nemen naargelang de fase die menwenst af te zonderen: de onderste fase is gemakkelijker teverwijderen uit een scheitrechter en de bovenste laag kan in descheitrechter blijven bij meervoudige extracties. Wanneer de fasengescheiden worden door centerifugeren, is het dan weergemakkelijker om de bovenste laag af te pipetteren.

• de organische vloeistof moet chemisch stabiel en inert zijn• de organische vloeistof moet geschikt zijn voor het detectiesysteem(bijvoorbeeld UV detectie)

• de organische fase mag geen emulsies vormen, en het wordtaangeraden om niet te krachtig te schudden om emulsies tevoorkomen

• de organische fase moet goedkoop zijn, liefst niet brandbaar en nietgiftig

Indien tijdens het extraheren toch emulsies gevormd worden, kunnen dezegebroken worden door:

• toevoegen van een zout aan de waterfase (uitzouten, salting out)• verwarmen of afkoelen van het extractievat• filtreren door glaswol• filtreren door een fase-scheidend filtreermateriaal• toevoegen van een kleine hoeveelheid tweede organisch oplosmiddel• centrifugeren

Omadsorptie aan de glaswanden tegen te gaan kunnen volgendemaatregelengenomen worden:

• toevoegen van een tertiair amine• silylering van het glaswerk

2018 52


• gebruik van kunststof of Teflon extractievaten• gebruik van een tweede organisch oplosmiddel

Vloeistof-vloeistof extracties worden meestal uitgevoerd in eenscheitrechter. Hierbij worden volumes van enkele mililiter tot een litergebruikt. Kleinere volumes kunnen met een eppendorf tube geëxtraheerdworden. Daarna kunnen de fasen gescheiden worden met een centrifuge ende bovenste laag kan afgepipetteerd worden.

Figuur 4.6: druppel extractor

Een voorbeeld van een systeem voor continu extracties is de druppelextractor (figuur 4.6). Er bestaan types voor organische fasen die zwaarderzijn dan water en types voor organische fasen die lichter zijn dan water.De extractievloeistof wordt gedruppeld door de waterige fase en via eenoverloop opgevangen in een kolf.

2018 53


4.7.2 versnelde vloeistof extractie

Voor vaste en halfvastemonsters kanmen versnelde vloeistof extractie (ASE,accellerated solvent extraction) toepassen. Bij deze methode wordt hetstaal met een organisch solvent in een extractiecel gebracht bij verhoogdetemperatuur (50 tot 200 ◦C) en verhoogde druk (150 tot 2000 psi). Bij dezeextremere omstandigheden wordt de extractiekinetiek versneld en wordthet koken van de extractievloeistof vermeden. De grote voordelen zijn detijdswinst en de kleine volumes solvent die verbruikt worden.

4.7.3 superkritische fase extractie

Figuur 4.7: fasediagramma (druk in functie van temperatuur)

Als alternatief voor organische oplosmiddelen als extractiemiddel wordtsinds een aantal decennia superkritisch CO2 gebruikt. In dit geval wordthet voorbehandelde substraat (bijv. hop, koffie) in een hogedrukvatgebracht waarna gecomprimeerd koolzuur onder drukken groter dan 75bar (superkritisch CO2) wordt doorgevoerd. De gewenste verbindingen

2018 54


lossen selectief op in het superkritische CO2, afhankelijk van de gebruiktetemperatuur en druk (figuur 4.7). Het extract (bijvoorbeeld caffeïneuit koffie) wordt gescheiden van het koolzuur door de druk te verlagenwaarbij ontmenging van extract en koolzuur plaatsvindt. Het koolzuur kanvervolgens opnieuw worden samengeperst en hergebruikt. Tot op heden istoepassing van superkritisch CO2 alleen toepasbaar in batch-configuraties.

4.7.4 vaste fase extracties

Vaste fase extractie (SPE, solid phase extraction) is een extractietechniekwaarbij zowel een vaste fase (sorbens) als een vloeibare fase betrokkenzijn. Net zoals bij vloeistofchromatografie wordt de scheiding bekomen doorverschil van affiniteit voor de mobiele fase en voor de stationaire fase van deverschillende componenten. Meestal worden de componenten geëulueerdvan de kolom door de solventsterkte van de mobiele fase te wijzigen. Hetgrote voordeel van deze techniek is het feit dat men grote hoeveelhedenongezuiverd staal kan aanbrengen en reeds heel wat ballast uit het staal kanverwijderen. Alhoewel de techniek veel gelijkenis toontmet chromatografie,is het niet mogelijk om verbindingen zeer selectief van elkaar te scheiden.Meestal worden analoge producten samen geëlueerd.

Men kan deze techniek onderverdelen naargelang de aard van de vastefase die gebruikt wordt. De vaste fase is vaak analoog aan deze vanvloeistofchromatografie:

• gewone fase (silicagel)• omgekeerde fase (C8, C18)• ionenwisselaars (kationenwisselaar, anionenwisselaar)

Er bestaan verschillende vormen waarin de vaste fase aangekocht kanworden. Vaak is het mogelijk om niet alleen via gravitatie de mobiele fasete laten lopen door het adsorberend materiaal, maar kan men het doorlopenook versnellen door onderdruk (vacuüm). Volgende vormen worden meestgebruikt:

• filters (schijfvormig)

2018 55


• in microtiterplaten (automatisering en grotere doorvoer)• in cartridges (spuitvorm of kolom)

Er dient ook vermeld te worden dat een SPE opzuivering niet alleen off-line(manueel) kan gebeuren, maar dat er ook systemen bestaan die SPE on-linecombineren met een analytische techniek zoals HPLC.

Een vaste fase extractie wordt in het algemeen in verschillende stappenuitgevoerd:

• Eerst wordt de kolom geconditioneerd en gesolvateerd. In deze stapwordt het dragermateriaal gespoeld om resten van vorige analyses ofonzuiverheden van het dragermateriaal te verwijderen. Door tesolvateren wordt de kolom voorbereid om het staal aan te brengen.Hierbij dient vermeden te worden dat de kolom uitdroogt.

• Opbrengen van het staal (retentiestap). De vaste fase weerhoudt hetanaliet en eventueel andere componenten uit het staal. Belangrijk ishierbij dat de interactie tussen analiet en sorbens sterker is dan deneiging om met de mobiele vloeibase fase te elueren. Er dient ookvoldoende sorbens aanwezig te zijn. Indien dit niet het geval is, zal dekolom verzadigd worden en zullen er componenten niet weerhoudenkunnen worden.

• Tijdens de wasstap worden matrixcomponenten geëulueerd die menwenst te verwijderen en die samen met de te analyseren bestanddelenwerden geadsorbeerd. Hiervoor gebruikt men een solvent met lageelutiekracht zodat deze stap geen invloed heeft op de retentie van deanaliet.

• In de elutiestap wordt het analiet uiteindelijk van de kolom gespoelden opgevangen.

Indien er niet te veel stoffen neergeslagen zijn of onomkeerbaar gebondenzijn aan de stationaire fase, kan men SPE materiaal meerdere kerengebruiken. Na de elutie dient dan de kolom degelijk gespoeld en teruggeconditioneerd te worden.

4.7.5 vaste fase microëxtractie

Bij vaste fase microëxtractie (SPME, solid phase microextraction) is hetsorbens bevestigd aan de buitenkant van een glazen capillair. Door dit glazen

2018 56


capillairtje in het staal te dompelen adsorbeert men componenten uit hetmonster. Daarna kan men de analieten terug vrijzetten door te spoelen ofdoor het capillair rechtstreeks in de injector van een gaschromatograaf teplaatsen. Door de stroom van verwarmd gas komen de componenten terugvrij en kunnen dan gescheiden worden in de chromatograaf.

4.8 eiwitprecipitatietechnieken

Eiwitten storen in veel analysemethoden en tijdens de monsterbewerkingdient de nodige aandacht besteed te worden aan het verwijderen vande aanwezige eiwitten. Zo kunnen proteïnen verstoppingen van hetchromatografisch systeem veroorzaken, ze kunnen componenten uit destalen afbreken of wijzigen door hun enzymatische activiteit. Hetverwijderen heeft vaak tot gevolg dat analieten stabieler zijn in de stalenwanneer eiwitten verwijderd zijn. Indien de analieten gebonden zijn aaneiwitten is het vaak ook nuttig om de eiwitten te verwijderen zodat hetanaliet vrijkomt, maar men moet voorzichtig zijn om geen analiet kwijt tespelen tijdens het precipiteren van de eiwitten.

De oplosbaarheid van proteïnen wordt bepaald door de aard van aminozurendie zich aan de buitenkant van het proteïne bevinden. Hydrofieleaminozuren zorgen ervoor dat het proteïne oplosbaar is in polaire solventen.Het is dus erg handig als men de samenstelling van de aminozuren in eeneiwit kent indien men de oplosbaarheid wil wijzigen.

Proteïnen in oplossing zijn steeds geassocieerd met ionen die de ladingenvan de proteïnen neutraliseren. Hierrond bevindt zich de solvatatielaagdie minder stevig is gebonden. Watermoleculen verhinderen dat deaantrekkingskrachten de geladen moleculen naar elkaar toe trekken en dusprecipiteren.

Wanneer men de hydratatielaag verstoort of afbreekt, zullen deeiwitmoleculen elkaar aantrekken en precipiteren. Men kan volgendetechnieken gebruiken om proteïnen te precipiteren:

2018 57


4.8.1 precipitaties in zuur midden

Meestal gebruikt men hiervoor sterke zuren zoals trichloorazijnzuur,perchloorzuur of wolfraamzuur. Deze werken het best indien detemperatuur verlaagd wordt. De zuren neutraliseren de positieveladingen waardoor de eiwitmoleculen kunnen aggregeren en neerslaan.Trichloorazijnzuur heeft het voordeel dat het achteraf uit het staalverwijderd kan worden door extractie met diethylether.

4.8.2 precipitaties met een organisch solvent

Het toevoegen van organische solventen zoals aceton, methanol, ethanolof acetonitrile zal de solvatatielaag rond de proteinen afbreken omdatde watermoleculen vervangen worden door de organische moleculen dieminder efficiënt zijn in de bescherming tegen precipitatie.

4.8.3 precipitaties met een anorganisch solvent

Het toevoegen van eenneutraal zout zoals ammonium sulfaat heeft tot gevolgdat de solvatatielaag samengedrukt wordt en de proteïnen dichter bij elkaarkunnen komen. Vermits de watermoleculen zich in een ionenrijke omgevingbevinden, zullen ze minder beschikbaar zijn om de hydratatielaag te vormenen bescherming te bieden tegen precipitatie. De toevoeging van zouten omde oplosbaarheid te verminderen noemt men uitzouten.

Metaalionen zoals koper of zink worden ook gebruikt om proteïnen neer teslaan. Zij vormen weinig oplosbare zouten, maar kunnen ook complexerenmet het analiet en hierdoor problemen opleveren bij de analyse.

2018 58

GERAADPLEEGDE WERKEN

• Henk Lingeman, Monsterbewerking - chromatografie in de praktijk (april1997).

• Douglas A. Skoog en Donald M. West, Fundamentals of AnalyticalChemistry, Holt, Rinehard & Winston (1972).

• Daniel C. Harris, Quantitative Chemical Analysis, W.H. Freeman, NewYork (1998).

2018 59

ANALYSE IN COMPLEXE MATRICESmedchem.rega.kuleuven.be/acm/acm2018.pdfDe cursus 'Analyse in complexe...

Documents

Transcript of ANALYSE IN COMPLEXE MATRICESmedchem.rega.kuleuven.be/acm/acm2018.pdfDe cursus 'Analyse in complexe...