VIRUSNE BOLESTI PRENOSIVE HRANOM

Prof. dr Mirjana Dimitrijević

Prenos virusa i kontaminacija

hrane

RIZIČNA HRANA

Bolesti

Gastroenteritis Hepatitis Ostalo

Norovirus

Hepatitis A virus

Enterični adenovirusi

(tip 40/41)

Hepatitis E virus (prenosivi vodom)

Enterovirus

Humani Rotavirus

(grupe A–C)

Sapporo-like calcivirusi

Astrovirusi

Coronavirus

Aichi virus

ALIMENTARNI VIRUSI

ROD POPULARAN NAZIV BOLEST

Enterovirus Polio Paraliza, meningitis, groznica

Coxsackie A, B Herpangina,Meningitis, groznica,

Respiratorne bolesti, miokarditis,

srčane mane, osip, dijabetes

Echo Meningitis, groznica, Respiratorne

bolesti osip, gastroenteritis

Hepatovirus Hepatitis A Hepatitis

Reovirus Humani reovirus Nepoznata

Rotavirus Humani rotavirus

Gastroenteritis

Mastadenovirus Humani adenovirus Gastroenteritis, Respiratorne

bolesti, konjuktivis

Norovirus Norwalk-like virus Gastroenteritis

Sapovirus Sapporo-like virus Gastroenteritis

Hepervirus Hepatitis E Hepatitis

Mamastrovirus Humani astrovirus Gastroenteritis

Parvovirus Humani parvovirus Gastroenteritis

Coronavirus Humani coronavirus Gastroenteritis, respiratorne bolesti

Torovirus Humani torovirus Gastroenteritis

-Stari naziv „Norwalk-like virus“

-NoV grupa virusa, spada u porodicu Caliciviridae i sačinjava jedan od pet rodova. - Lagovirus, Nebovirus, Vesivirus i Sapovirus.

-NoV je mali okrugli virion, veličine 27- 35 nm, s jednolančanim pozitivno orijentisanim RNK genomom od 7400- 7700 nt

GII.4 – 2006b

EPIDEMIOLOGIJA

Postoji nekoliko faktora koji dovode do eksplozivnog izbijanja

epidemija izazvanih norovirusima:

• niska infektivna doza (10–100 virusnih čestica)

• visoka infektivnost

• prisustvo virusa u životnom okruženju

• otpornost u okolini

• mogućnost prenosa na više načina, kratka inkubacija (1–3

dana)

• prolongirano oslobaĎanje virusa od strane kako

asimptomatski tako i simptomatski obolelih osoba (108 – 1012

kopija virusa po gramu)

• izostanak stvaranja dugotrajnog imuniteta (max. 18 meseci)

• Deca • Trudnice • Starije i

imunokompromitovane osobe

“YOPI”

Epidemije su zabeležene nakon konzumacije:

- školjki (Dowell et al., 1995; Christensen et al., 1998; Berg et

al., 2000; Simmons et al., 2001),

- peciva (Kuritsky et al., 1984),

- delikatesnih proizvoda od mesa (Schwab et al., 2000),

- sendviča (Parashar et al., 1998; Daniels et al., 2000),

- malina (Ponka et al., 1999),

- vode i leda (Beuret et al., 2002).

CDC - od 284 epidemija gastroenteritisa izazvanih norovirusom, od jula 1997. do juna 2000., put prenosa nije ustanovljen kod 42 (24%) (Fankhauser et al., 2002).

SAPOVIRUSI Sapporo-like viruses -SLV Epidemija virusnog gastroenteritisa je prijavljena u 23 škole u Parkville, Mariland, 1997. Utvrđeno je da je hrana bila izvor, a Sapovirus kasnije je označen kao virus Parkville (Noel et al., 1997).

HUMANI ROTAVIRUS -HRV

- Porodica Reoviridae, rodu Rotavirus

11 segmenata dvolančane RNK.

Segmentirani genom objašnjava njihovu izrazitu genetičku

varijabilnost i mogućnost mešovitih infekcija u istom domaćinu.

Rotavirusi su svrstani u sedam seroloških grupa (A – G).

- akutni gastroenteritis

- najčešće virus grupe A

- kod dece (od 3 meseca do 2 godine) je poznata pod nazivom

dečiji proliv

HRV

. Fekalno-oralni put i izazivaju bolesti ljudi i životinja, posebno domacih. Iako se sojevi virusa koji izazivaju infekciju kod životinja i ljudi uglavnom razlikuju, neki sojevi su usko povezani pa se javljaju i unakrsne infekcije među vrstama (Satar i dr., 2001).

ADENOVIRUSI Entero-adenovirusi su nakon rotavirusa, drugi najvažniji uzročnik akutnog gastroenteritisa kod dece do 4 godine starosti (Allard et al., 1990, Bresee i Glass, 1999). Adenovirusi se mogu preneti sa čoveka na čoveka direktnim kontaktom ili fekalno-oralnim, respiratornim ili ekološkim putem. Identifikovani su u različitim uzorcima životne sredine, uključujuci otpadne vode, mulj, školjke, morsku vodu, površine i vodu za pice. Prijavljene su epidemije gde je hrana bila put prenosa, ali i gde nije, a takođe su negde izvori ostali neprepoznati. Nema dokaza o pojavi bolesti nakon konzumacije kontaminiranih školjki.

ASTROVIRUS

Astrovirusi pripadaju porodici Astroviridae koja sadržava

dva roda: Astrovirus i Mamastrovirus

Malobrojni su epidemiološki dokazi o prenosu astrovirusa putem hrane, ali su prijavljene infekcije nakon konzumiranja kontaminiranih školjki i vode (Oishi et al., 1994; Appleton, 2001). Velika epidemija akutnog gastroenteritisa u Japanu bila je 1991., kada je obolelo hiljade dece i odraslih iz 14 različitih škola (Oishi et al., 1994). Postoji nekoliko izveštaja iz Japana da je astrovirus identifikovan u školjkama, kao i dokazi o pojavi gastroenteritisa prouzokovanog kontaminiranim kamenicama (Kitahashi et al., 1999).

Jedini pripadnik roda Hepatovirus, porodica Picornaviridae

HEPATITIS A

U SAD - vodeci uzročnik hepatitisa, sa mortalitetom od 0,3%. Međutim, stvarna incidenca je 10 puta veca od broja prijavljenih slučajeva. Između 1980. i 2001. godine, CDC je registrovao prosečno oko 25.000 slučajeva godišnje, ali kada su podaci korigovani, prosečan broj je iznosio oko 260.000 godišnje (Fiore, 2004).

Infekcija hepatitisom A javlja se širom sveta, a posebno u zemljama u razvoju, gde je zaraženo više od 90% dece starosti od 6 godina, pri čemu je infekcija kod njih često asimptomatska.

Inkubacija bolesti je u proseku 28 dana, a može biti od 15 do 50

Školjke – Kina, Australija, Brazil, Italija, Španija

1988.god. --- 300.000 ljudi

Rod Hepevirus, porodica Hepeviridae, kao jedini predstavnik.

HEPATITIS E

Naročito je rasprostranjen u Aziji, severnoj Africi i Latinskoj Americi, uključujuci Meksiko. Prenos infekcije je generalno preko fekalno zagađene vode. Epidemije gde je hrana put prenosa se javljaju u zemljama u razvoju, gde je neadekvatna sanitacija životne sredine. Zoonotski aspekt ?

PREVENCIJA VIRUSNIH INFEKCIJA PRENOSIVIH HRANOM

- sprečavanje direktnog kontakta fekalnog materijala (u nekim slučajevima i sadržaja izbačenog povracanjem) sa hranom. - prevencija izlivanja otpadnih voda u uzgajališta školjki.

- u proizvodnim pogonima je neophodno poštovanje zahteva GHP i GMP, s posebnim osvrtom na ličnu higijenu radnika. -pravilno održavanje lične higijene, uključujuci upotrebu zaštitne opreme i dekontaminaciju ruku i radnih površina. - kontinuirane edukacije radnika koji rukuju hranom

KORELACIJA IZMEĐU BAKTERIJA – INDIKATORA I VIRUSA U HRANI I VODI

Bakterije koriste kao indikatori virusa moraju posedovati sledece karakteristike : • da prisustvo bakterija bude u korelaciji sa prisustvom crevnih virusa u datom okruženju; • kada je bakterija indikator prisutna u malim koncentacijama ili je nema, ne bi trebalo da bude ni virusa u istom okruženju; • kada je broj indikatora visok, radi se češca detekcija virusa • bakterije indikatori ne bi trebalo da budu patogene, što pojednostavljuje procedure za njihovu identifikaciju i smanjuje rizik slučajnog zaražavanja laboratorijskih radnika.

Tabela 2. Korelacija između prisustva bakterija indikatora i virusa u vodi i školjkama

Bakterija indikator Virus Rezultat Referenca

Svi koliformi, fekalni

koliformi

Enterovirusi (infektivni) Virus je izolovan iz

ostriga i uzoraka vode

gde su gajene, iako je

voda zadovoljavala

uslove standarda za

bakterije indikatore

Goyal i sar. 1979.

Svi koliformi, fekalni

koliformi

Enterovirusi (infektivni) Virusi su izolovani iz

35% uzoraka vode za

uzgajanje ostriga, dok su

ostrige zadovoljavale

standarde

Gerba i sar. 1979.

Svi koliformi, fekalni

koliformi

Enterovirusi (infektivni) Virusi izolovani kod 12%

uzoraka ostriga iz

zatvorenih područja, ali

nisu nadjeni u ostrigama

otvorenih voda

Sobsey i sar., 1980.

Fekalni koliformi Enterovirusi (infektivni) Nivo fekalnih

koliformnih bakterija u

vodi nije odgovarao

nalazu virusa u vodi

Ellender i sar., 1980.

Svi koliformi, fekalni

koliformi

Enterovirusi (infektivni) Virusi su izolovani iz

školjki i sa zatvorenih i

otvorenih područja

Wait i sar., 1983.

Fekalni koliformi Enterovirusi, rotavirusi i

hepatitis A (detektovani

RT-PCR)

Nije pronađena veza

između virusa i bakterija-

indikatora u školjkama

E Guyader i sar.,

1993.,1994.

Fekalni koliformi,

fekalne streptokoke

Enterovirusi, rotavirusi i

hepatitis A (detektovani

RT-PCR)

Virusna kontaminacija

rečnih voda je odgovarala

nalazu bakteriofaga, ali

ne i bakterija indikatora

Baggi i sar. 2001.

Fekalni koliformi Enterovirusi i norovirusi

(detektovani RT-PCR)

Infektivni enterovirusi

nisu detektovani u rečnoj

vodi, koncentracija

koliforma nije odgovarala

virusnom genomu

Skraber i sar. 2004.

Za međunarodno usaglašenu procenu širenja alimentarnih virusnih patogena formirana je saradnja između 12 laboratorija u 9 zemalja u Evropi. Projekat je koordinisan od strane Nacionalnog instituta za javno zdravlje i životnu sredinu u Bilthovenu, Holandija.

Microbiology of food and animal feed

- Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using

real-time RT-PCR

ISO/TS 15216-1

PCR - Polymerase Chain Reaction (lančana reakcije polimeraze)

Revolucionarni metod koji je osmislio Kary Mullis (1983.) - 1993. Nobelova nagrada

Polimeraza lančana reakcija (polymerase chain reaction - PCR) - in vitro metod, prajmerom dirigovano umnožavanje kratke specifične sekvence nukleinske kiseline

RT-PCR se koristi za kvalitativno detekciju ekspresiju gena kroz stvaranje komplementarna DNK (cDNK) transkripata iz RNK, nakon toga novosintetisana cDNK amplifikuje metodom tradicionalnog PCR.

RT - PCR (Reverse transcription - PCR)

One Step / Two Step

Real Time PCR

Reakciona smeša za PCR

Real Time PCR reakcija

sadrži :

-DNK polimerazu -dNTP -par prajmera (forward & reverse) -Mg2+, pufer

-PROBA

Real Time PCR je modifkovni PCR koji omogućuje praćenje amplifikacije (akumulacije amplifikata) u „realnom vremenu“, tj. u/kroz svaki ciklus.

Materijal za pregled

DIGESTIVNA ŽLEZDA

Mediteranska dagnja ( M. Galloprovincialis)

2 g

OSLOBAĐANJE VIRUSA IZ TKIVA UZ POMOĆ PROTEINAZE K, KOJA SE UZORKU DODAJE U ODNOSU 1:1

IZOLACIJA RNK VIRUSA Izolacija intaktne RNK iz celijskih linija i tkiva, kao i njena karakterizacija neophodan je korak u izučavanju celijski specifične genske ekspresije, mehanizama koji regulišu gensku ekspresiju, kao i u svim procedurama koje iziskuju pravljenje komplementarne DNK (cDNK).

Eliminisati svaku potencijalnu mogucnost za dejstvo endogenih ili egzogenih RNaza

guanidin izotiocijanat ( GITC )

„NucliSens magnetic extraction kit“

NucliSENS® miniMAG®

1. Pripremimo i obeležimo epruvete

2. Odlijemo supernatant

3. NucliSens Lysis buffer (GITC)

Čuvanje i stabilizacija startnog materijala za izolaciju RNK

RNK u tkivu nije zaštićena nakon izolacije tkiva ili ćelija, sve dok se uzorak ne tretira sa RNK stabilizujućim reagensom (t.zv. RNAlater RNA stabilization reagent). Uzorci se čuvaju uranjanjem u odgovarajuću količinu RNK stabilizujućeg reagensa, ODMAH nakon izolacije startnog materijala. Ovaj postupak sprečava svaku nepoželjnu promenu u genskoj ekspresiji, RNK degradaciju, kao i indukciju novih gena, tokom perioda čuvanja RNK.

Uzorci tretirani RNAlater-om stabilni su: • 1 dan na 37˚C • 7 dana na 18-25˚C • 4 nedelje na 2-8˚C (u frižideru) • Neograničeno dugo na -20˚C ili -70˚C

Fluorescentne probe

1. Interkalirajuce fluorescentne boje koje se nespecifično vezuju za dvolančani DNK molekul - SYBR®Green

2. Fluorescentne probe koje su sekvencno-specificne. Takve fluorescentne probe sadrže oligonukleotid obeležen reporterskim molekulom na 5’-kraju koji emituje fluorescentni signal, i „quencher“, na drugom 3’-kraju, koji prigušuje (suprimira) fluorescentni signal. (*Taq Man probe )

Aparatura za Real Time RT PCR metodu

Osnovni elementi:

1. amplifikacijska kriva 2. treshold 3. Ct vrednost (Cycle threshold)

Ct vrednost definiše broj ciklusa kada amplifikacijska kriva preseče threshold

Amplifikacijska kriva

Što je polazna količina matrice (DNK) veca, to se ranije dostiže Ct. Zbog toga što je moguce pratiti amplifikaciju polazne količine target sekvence u svakom ciklusu, za ovu reakciju se kaže da se odigrava u realnom vremenu.

HVALA VAM NA PAŽNJI