ANA

VAKB, 09/02/2013

Lieve Van Hoovels

1. Definitie

2. Rol in diagnosestelling

3. Rol in follow-up

4. Laboratoriumdiagnose

5. Besluit

ANA

1. ANA definitieAnti-nucleaire en cytoplasmatische antistoffen

ENA = Extraheerbare nucleaire antigenen

dsDNA = Dubbelstrengig DNA

2. Rol in diagnose

Doria et al. Autoimmun Rev 2010; 10: 55-60

1) Very useful for the diagnosis of SLE en SSc

2) Somewhat useful for the diagnosis of primair SS and polymyositis

3) Very useful in monitoring or prognosis of juvenile chronic arthritis(to stratify the risk of uveitis)

4) A critical part of the diagnosis of drug-associated lupus, mixed connective tissue disease and autoimmune hepatitis

ACR (2010): Testing for ANA is

Niet-orgaan specifieke AIZ= connective tissue diseases (CTD), systemic rheumatic diseases (SRDs)

ANA Voornaamsteziekte associatie

dsDNA SLE (systemic lupus erythemosus)

Drug induced lupus Histonen

ENA

Sm

U1RNP

SS-A

SS-B

CENP-B

Scl-70

Jo-1

SLE

MCTD

Sjögren syndroom (SS)

Sjögren syndroom

CREST (limited form of SScl)

Systemic sclerosis (SScl)

PM/DM (Polymyositis/Dermatomyositis)

Prevalentie

Ribosomal P Protein

Andere associaties

PM/Scl PM/SScl overlap

SLE, SScl, PM/DM, RA

SLE, SScl, RA

SLE, SScl, RA

PBC, SScl

CREST

30-90%

SLE 5-20%

95%

5-30%

95-100%

40-95%

40-95%

80-95%

25-75%

25-35%

3%

-

-

SLE, RA

-

-

-

Klinische Phase

2. Rol in diagnose

Orgaanschade

Geen Minimaal Progressief

Disease specifieke AAb

Arbuckle et al. NEJM 2003; 349: 1526-1533

Titer

Tijd

Predictieve waarde

Preklinische faseInductie van AI

3. Rol in follow-up

• Geen correlatie tussen ANA IIF titer en CTD activiteit

⇒ verdwijnen van ANA is géén therapeutische doelstelling

uitzondering: geneesmiddel geïnduceerde SLE

• Opvolging van SLE patiënten d.m.v. opvolging inflammatie, perifeer bloedbeeld,

nierfunctie, urinesediment, C3 en C4

• Herhaling van ANA/ENA bepaling is aangewezen bij bepaalde patiënten

d.i. wijziging van het Ab-profiel bij asymptomatische patiënten is een criterium voor

het evolueren naar lupus

• Opvolging dsDNA Ab titer ⇒ merker van ziekte-activiteit

- afhankelijk van de kliniek elke 3-6 maanden

- steeds met dezelfde doseringstechniek!

EASI 2011

4. Laboratoriumdiagnose

Damoiseaux et al. Ned Tijdschr Klin Chem Labgeneesk 2010; 35: 234-239

Laboratoriumdiagnostiek van ANA, anti-ds-DNA en anti-ENA-antistoffen:Aanbevelingen naar aanleiding van een enquête.

Meroni et al. Ann Rheum Dis 2010; 69: 1420-1422

ANA screening: an old test with new recommendations.

European Autoimmunity standardisation Initiative (2011)

Autoantilichamen die nuttig zijn voor de diagnose en de opvolging vansystemische auto-immuunziekten.

4. Laboratoriumdiagnose

1. Screening

2. Confirmatie

3. Correlatie

Multispecifieke assay

IIF op HEp2 cellijn

Monospecifieke assay

Resultaat

dsDNA assay

NCCLS 1/LA2-A, 1996; Solomon et al. Arthritis Rheum 2002; 47: 434-444; Tozzoli et al. Am J Clin Pathol 2002; 117: 316-324

Algemene teststrategie

4.1 ANA IIF

Substraat met Ag

Specifiekhumaan Ab

Anti-humaanIgG Ab

FITC

Principe

Belangrijke intra- en interlaboratoriumvariatie m.b.t. ANA IIF:Substraat, conjugaat, lamp, subjectieve aflezing,…

= Humane epithelioma type 2 cellijn

Substraat

4.1 ANA IIF

Semikwantitatief : Licht positief (2+)Positief (3+)Sterk positief (4+)

� Fluorescentiepatroon kern

� Fluorescentiepatroon cytoplasma

1. Intensiteit 2. Patroon

Onafh. aflezing 2 ervaren pers.

Resultaat

Titer

4.1 ANA IIF

IIF Patroon Interfase Metafase Antigen- Homogeen

- Gespikkeld

- Nucleolair

- Centromeer

ds/ssDNAHistonenNucleosomen

RNP/Sm SS-A/Ro60 SS-B, Ku

Scl-70, PM-SclRNA-Pol.I,II,IIIFibrillarin

CENP (A,B,C,D)

Antigen- Cyt: fijn granulair

- Cyt: diffuse granulair

- Cytoskelet

- Cyt: homogeen

Jo-1

Mitochondriën(AMA-2)

Actine (vimentinetubuline, cytokeratine)

Ribosomen(Ribosomaal-P)

Associatie

SLE

PBC

AIH

SLE

IIF Patroon

4.1 ANA IIF

Opmerkingen

� orgaanspecifieke AIZ (AI thyroditis, AI chronische leverziekte)

� infecties (mononucleosis, HCV, HIV, malaria, …)

� lymfoproliferatieve aandoeningen (leukemie, lymfoom)

� maligniteit (tumor, melanoom)

� sommige medicatie

� gezonde personen: ≥ 1:40 20-30%

≥ 1:80 10-12%≥ 1:160 5%

≥ 1:320 3%

↑ ANA pos. met ↑ leeftijd

• Naast systemische AIZ, ook voorkomen van ANA positiviteit bij:

4.1 ANA IIF

Opmerkingen

• Niet alle met ziekte geassocieerde Ab worden gedetecteerd met IIF bv. Rib P (SLE), Jo-1 (PM/DM), Ro60 (SS, neonatale lupus, congenitale hartblok)

� orgaanspecifieke AIZ (AI thyroditis, AI chronische leverziekte)

� infecties (mononucleosis, HCV, HIV, malaria, …)

� lymfoproliferatieve aandoeningen (leukemie, lymfoom)

� maligniteit (tumor, melanoom)

� sommige medicatie

� gezonde personen: ≥ 1:40 20-30%

≥ 1:80 10-12%≥ 1:160 5%

≥ 1:320 3%

↑ ANA pos. met ↑ leeftijd

• Naast systemische AIZ, ook voorkomen van ANA positiviteit bij:

Bij verdachte kliniek ⇒⇒⇒⇒ anti-ENA bepaling onafh. van ANA IIF

4.2 ANTI-ENA

• Na elke positieve ANA test: anti-ENA bepaling uitvoeren

• Immunoassay methoden:

� FIA, LIA, RIA, ELISA, line blot, microarray

� belangrijke heterogeniteit tussen de beschikbare methoden

• ↑ geautomatiseerde, high volume throughput, vaste fase methoden

Tozzoli et al. Clin Chem Lab Med 2013; 51: 129-138

4.2 ANTI-ENA

• Gelijktijdige detectie van afzonderlijke Ab

• Afzonderlijke Ag: natuurlijk versus recombinant

� Afzonderlijke, kwalitatieve rapportering per Ab

� Als screeningstest negatief wordt gerapporteerd, volstaat om te vermeldenwelke ENA in die test voorhanden zijn

� Natuurlijk versus recombinant

� Min. 7 standaard ENA: SSa/Ro60, SSb, Sm, RNP, CENP-B, Scl-70, Jo-1

� SSa/Ro60 afzonderlijk van SSa/Ro52 detecteren

� Sm(D) specifieke detectie van Sm antistoffen

Multiplex immunoassay

4.2 ANTI-ENA

Op De Beéck et al. Autoimmun Rev 2012; 12: 137-143

Multiplex immunoassay

Prevalentie ≥ 1 Ab:

LR (95% CI) ≥ 2 Ab:

4.3 ANTI-DNA

Ghirardelloet al. Ann NY Acad Sci. 2007; 1109: 401-406

• Na positieve ANA test, zeker bij ‘homogeen patroon’: anti-dsDNA bepaling

Farr Assay Crithidia IF EIA

Hoge aviditeits Ab Hoge/medium aviditeits Ab Ook lage aviditeits Ab

Ab IgG / IgA / IgM Ab IgG Ab IgG

Specificiteit (95-99%) Specificiteit (80-100%) Specificiteit (19-82%)

Sensitiviteit (42-85%) Sensitiviteit (15-75%) Sensitiviteit (65-95%)

Kwantitatief Kwalitatief Kwantitatief

RIA IIF Automatisatie

4.3 ANTI-DNA

Negatief Positief

kinetoplast= ‘mitochrondrial-like’ structuurbevat puur dsDNA

Basaal lichaam

Kern

4.3 ANTI-DNA

• Gezien het belang van anti-dsDNA titer en ziekteactiviteit:

⇒ Resultaten van anti-dsDNA Ab moeten kwantitatief gerapporteerd worden

• Belangrijke heterogeniteit binnen dsDNA testen:

⇒ niet mogelijk om resultaten onderling te vergelijken (“IU/mL”)

opvolging van anti-dsDNA Ab titer: steeds met éénzelfde assay

• CLIFT verlaten als screeningstest voor anti-dsDNA Ab

4.3 ANTI-DNA

Anti-nucleosomen Ab

Bizarro et al. Autoimmun Rev 2012; 12: 97-106

4.3 ANTI-DNA

Anti-nucleosomen Ab

Bizarro et al. Autoimmun Rev 2012; 12: 97-106

• Anti-nucleosoom Ab zijn een zeer accurate diagnostische merker voor SLE

• Anti-nucleosoom Ab hebben een gelijke specificiteit maar hogere sensitiviteit,

positieve LR en diagnositische OR t.o.v. anti-dsDNA Ab voor SLE diagnose.

• meta-analyse van 44 studies: gemiddelde sensitiviteit = 0,61 (95% CI 0,60-0,62)gemiddelde specificiteit = 0,94 (95% CI 0,94-0,95)pooled diagn. odds ratio = 40,74 (95% CI 26,20-63,35)

4. Laboratoriumdiagnose

Wijziging teststrategie?

• Reden: de subjectiviteit in aflezen, lage graad van standaardisatie en automatisatie

• Oplossing:

� ELISA met als vaste fase een mengsel van nucleaire en cytoplasmatische Ag

⇒ ↓ analytische performantie met tot 35% ‘vals negatieve’ resultaten

� Multiplex immunoassay: ↓ sensitiviteit t.g.v. beperkt aantal Ag

Tozzoli et al. Clin Chem Lab Med 2013; 51: 129-138

Wijziging teststrategie?

Op De Beéck et al. Autoimmun Rev 2012; 12: 137-143

4. Laboratoriumdiagnose

Wijziging teststrategie?

Voorlopig niet• Belangrijke evolutie tot automatisatie en standaardisatie binnen ANA IIF

Tozzoli et al. Clin Chem Lab Med 2013; 51: 129-138

5. Conclusie

5.1 ANA detectie staat centraal in diagnosestelling van niet-orgaanspecifieke AIZ

5.2 IIF ANA blijft behouden als screenings strategie

5.3 Specifieke anti-ENA en dsDNA test ter identificatie van specifieke antistoffen, met afzonderlijke rapportering

5.4 Belangrijke heterogeniteit tussen anti-ENA en dsDNA testen

5.5 Standaardisatie en automatisatie voor ANA IIF in opmars

ANCA

VAKB, 09/02/2013

Lieve Van Hoovels

1. Definitie

2. Rol in diagnosestelling

3. Rol in follow-up

4. Laboratoriumdiagnose

5. Besluit

ANCA

1. ANCA definitieAnti-neutrophil cytoplasm-autoantibodies

Proteinase 3

Myeoloperoxidase

BPI

Elastase

Lysozyme

Cathespin G

Lactoferrin

Azurocidin

β-glucuronidasehLAMP-2

2. Rol in diagnose

Jennette et al. Arthritis Rheum 2013; 65: 1-11

Grote vaten Medium vaten Kleine vaten

Chapel Hill Consensus Conference 2012

2. Rol in diagnoseChapel Hill Consensus Conference 2012

Jennette et al. Arthritis Rheum 2013; 65: 1-11

ANCA geassocieerde vasculitis

2. Rol in diagnose

Granulomatosis with polyangiitis

Granulomateuze ontsteking van bovenste en onderste luchtwegenNecrotiserende vasculitis van de kleine bloedvatenincl. necrotiserende glomerulonefritis

ANCA geassocieerde vasculitis

2. Rol in diagnose

Granulomatosis with polyangiitis

Granulomateuze ontsteking van bovenste en onderste luchtwegenNecrotiserende vasculitis van de kleine bloedvatenincl. necrotiserende glomerulonefritis

Orgaanaantasting bij GPA:

Ear/Nose/Throat 99%

Kidney 70%

Lung 66%

Arthralgia 77%

Eye 61%

Peripheral nerves 40%

Skin 33%

Heart 25%

CNS 11%

GI 6%

Reinhold-Keller et al. Arthritis Rheum 2000; 43: 1021-1032

ANCA geassocieerde vasculitis

2. Rol in diagnose

Microscopische polyangiitis

Necrotiserende vasculitis van de kleine bloedvatenNecrotiserende glomerulonefritis en pulmonale capillaritis zijn frequent

Eosinophilic granulomatosis with polyangiitis

Eosinofiel rijke granulomateuze ontsteking van de luchtwegenAstma en bloed eosinofilie

Anti-proteïnase 3 Anti-myeloperoxidase

Granulomatosis withpolyangiitis

66% 24%

Microscopic polyangiitis 26% 58%

Eosinophilic granulomatosiswith polyangiitis

<5% 50%

2. Rol in diagnoseZiekte associatie

Hagenet al. Kidney Int 1998; 53: 743-753

2. Rol in diagnoseZiekte associatie

Cohen Tervaert, Damoiseaux. Clin Rev Allergy Immunol 2012; 43: 211-219; Lyons et al. NEJM 2012; 367: 214-223

“Genetica, klinische manifestaties en therapierespons zijn meer gerelateerd met het ANCA serotype dan met het klinisch subtype”

2. Rol in diagnoseGenetica

Lyons et al. NEJM 2012; 367: 214-223

HLA-DPSERPINA1PRTN3

HLA-DQ

2. Rol in diagnoseKlinische manifestaties

Lionakiet al. Arthritis Rheum 2012; 64: 3452-3462

2. Rol in diagnoseTherapie respons

Lionakiet al. Arthritis Rheum 2012; 64: 3452-3462

2. Rol in diagnoseZiekte associatie

Cohen Tervaert, Damoiseaux. Clin Rev Allergy Immunol 2012; 43: 211-219; Lyons et al. NEJM 2012; 367: 214-223

“Genetica, klinische manifestaties en therapierespons zijn meer gerelateerd met het ANCA serotype dan met het klinisch subtype”

⇒⇒⇒⇒ Patiënt classificatie o.b.v. ANCA subtype?

Nadelen:

� ANCA negatieve AAV

� Geen invloed op therapie

IIF patroon Antigenen

Rheumatoïde arthritis pANCAatypisch

- lactoferrin- cathepsin G- elastase- lysozyme- unknown

SLE

Sjögren’s syndroom

Juveniele chronische arthritis

Reactieve arthritis

Scleroderma

Antifosfolipiden syndroom

2. Rol in diagnoseAndere rheumatische aandoeningen

2. Rol in diagnoseAI gastro-intestinale aandoeningen

IIF patroon Antigenen

Ulceratieve colitis (60-80%) (pANCA)atypisch

- (PR3)- BPI- lactoferrin- cathepsin G- elastase- lysozyme

Ziekte van Crohn (10-30%)

Primair scleroserencecholangitis + UC (85-95%)

Primair scleroserencecholangitis – UC (15-20%)

Autoimmuun hepatitis type I

pANCA + en ASCA - => PPV UC= 82-100%

pANCA – en ASCA + => PPV CD= 75-96%

Gaffo et al. Rheum Dis Clin North Am 2010; 36: 491-506

2. Rol in diagnoseCavé: anderen …

Categorie

Vasculitis CryoglobulinemieGiant cell arteritisBehçet syndroomPolyarteritis nodosaAnti-GBM ziekte

Infecties Mycobacterium tuberculosisHIVHepatitis CEndocarditis

Allerlei SarcoïdosisInterstitiële longfibroseGeneesmiddelen (oa. propylthiouracil)MucoviscidoseCocaïne misbruik…

Ziekte activiteit

o goede correlatie tussen ANCA titer en ziekte activiteit: controversieel

Tomasson et al. Rheumatology 2012; 51: 100-109

3. Rol in follow-up

Ziekte activiteit

o goede correlatie tussen ANCA titer en ziekte activiteit: controversieel

BESLUIT:

o ANCA titer mag nooit op zich alleen gebruikt worden om de behandeling te bepalen

o Een duidelijke titerstijging of opnieuw optreden van ANCA, moet de clinicus alarmeren en aanzetten tot een striktere patiëntopvolging.

3. Rol in follow-up

1999/2003 International consensus statementon testing and reporting ANCA

Savige et al. Am J Clin Pathol 1999; 111: 507-13 ; Savige et al. Am J Clin Pathol 2003; 120: 312-8

Kliniek suggestief voor small-vessel vasculitis

IIF ANCA= screeningstestPPV IIF ANCA niet-geselecteerde populatie < 5%PPV IIF ANCA juiste klinische context > 90%

4. Laboratoriumdiagnose

1999/2003 International consensus statementon testing and reporting ANCA

Savige et al. Am J Clin Pathol 1999; 111: 507-13 ; Savige et al. Am J Clin Pathol 2003; 120: 312-8

Kliniek suggestief voor small-vessel vasculitis

- Glomerulonephritis, especially RPGN- Pulmonary hemorrhage, especially pulmonary renal syndrome- Cutaneous vasculitis with systemic features- Multiple lung nodules- Chronic destructive disease of the upper airways- Long-standing sinusitis or otitis- Subglottic tracheal stenosis- Mononeuritis multiplex or other peripheral neuropathy- Retro-orbital mass

*

* When there is no other obvious cause

4. Laboratoriumdiagnose

4. Laboratoriumdiagnose

IIF ANCA

4. Laboratoriumdiagnose

Nomenclatuur pANCA

Perinucleaire fluorescentie,met of zonder nucleaire extensie

ethanol formol

4. Laboratoriumdiagnose

Nomenclatuur pANCA

ethanol formol

4. Laboratoriumdiagnose

Nomenclatuur cANCA

ethanol formol

Granulaire cytoplasmatische fluorescentie met centrale of interlobulaire accentuatie

4. Laboratoriumdiagnose

Nomenclatuur atypical ANCA

ethanol ethanol

Atypische pANCA Atypische cANCA

IIF ANCA

pANCA cANCA

Vnl. MPO Vnl. PR3

Non c- en p-ANCA= atypische pANCAatypische cANCACathepsine G

BPILactoferrinLysozymeElastase

…

4. Laboratoriumdiagnose

1999/2003 International consensus statementon testing and reporting ANCA

Savige et al. Am J Clin Pathol 1999; 111: 507-13 ; Savige et al. Am J Clin Pathol 2003; 120: 312-8

Kliniek suggestief voor small-vessel vasculitis

IIF ANCA= screeningstestmin. ethanol gefixeerde granulocytenmin. verdunning 1/20

Antigen-specifieke test: MPO/PR3Specificiteit ELISA MPO + en IIF pANCA= 98,6%Specificiteit ELISA PR3 + en IIF cANCA= 87-99%

4. Laboratoriumdiagnose

1999/2003 International consensus statementon testing and reporting ANCA

Savige et al. Am J Clin Pathol 1999; 111: 507-13 ; Savige et al. Am J Clin Pathol 2003; 120: 312-8

Kliniek suggestief voor small-vessel vasculitis

IIF ANCA= screeningstestmin. ethanol gefixeerde granulocytenmin. verdunning 1/20

Antigen-specifieke test: MPO/PR3Specificiteit ELISA MPO + en IIF pANCA= 98,6%Specificiteit ELISA PR3 + en IIF cANCA= 87-99%= afhankelijk van ELISA

Trevisin et al. Immunopathology 2008; 129: 42-53

4. Laboratoriumdiagnose

4. Laboratoriumdiagnose

Cohen Tervaert, Damoiseaux. Clin Rev Allerg Immunol 2012; 43: 211-219

1ste generatie:

2de generatie:

3de generatie:

4. Laboratoriumdiagnose

Holle et al. Clin Exp Rheumatol 2012; 30: S66-69

� Capture en anchor ELISA’s superieur aan directe ELISA’s

� Capture en anchor ELISA’s vergelijkbare performantie met IIF

� Standaardisatie m.b.v. MPO en PR3 referentie sera

4. Laboratoriumdiagnose

Snelle diagnosestelling

EUROIMMUN Diagnostics

1999/2003 International consensus statementon testing and reporting ANCA

Kliniek suggestief voor small-vessel vasculitis

IIF ANCA= screeningstest

Antigen-specifieke test: MPO/PR3

Histologie

Savige et al. Am J Clin Pathol 1999; 111: 507-13 ; Savige et al. Am J Clin Pathol 2003; 120: 312-8

4. Laboratoriumdiagnose

Conclusions: A strategy based on screening for ANCA with ELISA or FEIA(without prior IIF) is a valuable alternative to screening with IIF andconfirming with ELISA or FEIA.

Richtlijnen aan vernieuwing toe?

4. Laboratoriumdiagnose

Vermeersch et al. Clin Chim Acta 2008; 397: 77-81

5. Conclusie

5.1 ANCA centraal in small vessel vasculitis

5.2 IIF ANCA blijft behouden als screenings strategie, maar 2de en

3de generatie PR3/MPO ELISA’s vormen alternatief

5.3 Na positieve IIF, steeds PR3/MPO ELISA als confirmatie assay

5.4 Titer stijging alarmeert clinicus tot striktere patiëntopvolging

Vragen?