Thesisvoorstellenopleiding ApothekerAcademiejaar 2007-2008Dienst FABI

Prof. J. Smeyers-Verbeke Prof. Y. Vander HeydenProf. J. Plaizier-Vercammen

Vakgroep Analytische Scheikunde en Farmaceutische Technologie

– Prof. J. Smeyers-Verbeke– Prof. Y. Vander Heyden

– Prof. J. Plaizier-Vercammen

Vakgroep Analytische Scheikunde en Farmaceutische Technologie

  Wat doen wij?

Chemometrie

Metrologie

Scheidings-technieken

FarmaceutischeTechnologie

Vakgroep Analytische Scheikunde en Farmaceutische Technologie

Doel onderzoek: Evaluatie van nieuwemethodologieën in scheidingstechnieken

Methodeontwikkeling en -optimalisatie– Technieken: HPLC, CE, capillaire electrochromatografie– Toepassingen: Chirale scheidingen, “snelle”

scheidingen, fingerprinting, geneesmiddelenanalyse

Data evaluatieBv. - Gebruik van experimenteel design

- Voorspellen membraanpassage van geneesmiddelen

  Thesisvoorstel   professor

  Plaizier-Vercammen

Onderscheid van de Chinese kruiden Rhizoma Chuanxiong en Rhizoma Ligustici a.d.h.v. VINGERAFDRUK ANALYSEGoedele Alaerts

  Belang onderzoek   kwaliteit van kruiden:

Onderscheid Chinese kruiden

Vermageringskuur

op basis van

chinese kruiden

Nefropathie:

nierdialyse

niertransplantatie

Verwisseling

Aristolochia fangchi i.p.v.Stephania tetrandra

1990-1992

  Nood aan identificatie kruidenkwaliteitscontrole kruiden

Kruid = complex mengsel !

Onderscheid Chinese kruiden

Bepaling enkele componenten

Onvoldoende voor intrinsieke kwaliteit

?

Onderscheid Chinese kruiden

  Oplossing: fingerprintsKarakteristieke vingerafdruk

Infra Rood (IR)Massa spectrofotometrie (MS)Dunne laag chromatografie (DLC)Hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC)Capillaire Electroforese (CE)

Chromatografische fingerprint Geaccepteerd door WHO !

Onderscheid Chinese kruiden

  Rhizoma Chuanxiong Rhizoma Ligustici Fam. Umbellifera

> 0.05 % ferulic acid<<< 0.05 % ferulic acid

Onderscheid Chinese kruiden

  Identificatie van analoge species of subspecies en differentiatie van gelijkende kruiden.

Uiterlijk ? DLC analyse ?

Gaf reeds problemen voor bedrijf (Conforma N.V.)

Fingerprint analyse dmv HPLC/DAD:

☻HPLC: hoog scheidingsvermogen (t.o.v. DLC)

☻DAD: 3D beeld componenten kruid

Chuanxiong/Liqustici 254nm

0

500

1000

1500

2000

2500

10 15 20 25 30 35 40

Retention time (min)

Onderscheid Chinese kruiden

Chuanxiong Ligustici

Onderscheid Chinese kruiden

  VINGERAFDRUK ANALYSE => Onderscheid Rhizoma Chuanxiong en Rhizoma Ligustici Experimenteel deel:

Fingerprint ontwikkeling en optimalisatie d.m.v. HPLC/DAD

Gehaltebepaling Ferulic acid en methodevalidatie

Dataverwerking: Hoe kruiden onderscheiden op basis van hun fingerprints ? (Correlatiecoëfficienten of PCA)

Onderscheid Chinese kruiden

  Onderscheid van de Chinese kruiden Rhizoma Chuanxiong en Rhizoma Ligustici a.d.h.v. VINGERAFDRUK ANALYSE

 

  Vragen / info : Goedele Alaerts

  Bureau G 037

  Tel 02/477 45 13

  Goedele.Alaerts@vub.ac.be

Experimenteel design in methode optimalisatieBieke Dejaegher

Experimenteel design

Experimenteel design set-up waarbij de onderzochte factoren tegelijkertijd

gevariëerd worden factoren één voor één variëren

Exp F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11

1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1

2 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1

3 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1

4 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1

5 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1

6 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1

7 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1

8 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1

9 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1

10 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1

11 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1

12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1

Experimenteel design

Experimenteel design set-up waarbij de onderzochte factoren tegelijkertijd

gevariëerd worden factoren één voor één variëren

In optimalisatie « screening » factoren met grootste invloed of effect op

de onderzochte respons(en) bepalen belangrijkste factoren verder onderzoeken mbv « response

surface designs »

Modelleren van de respons als functie van de factorenVoorbeelden: three-level full factorial designs, central composite designs, Box-Behnken designs, Doehlert designs, uniform designs

Doel

Verschillende « response surface designs » in optimalisatie vergelijken, welke meest geschikt?

3 factoren verschillend aantal experimenten !

Three-level full factorial designs: 33=27 exp.

Central composite designs: 23+6+min1= min 15 exp.

Box-Behnken designs: 13 exp.

Doehlert designs: 13 exp.

Uniform designs: 6 exp.

Doel

Verschillende « response surface designs » in optimalisatie vergelijken, welke meest geschikt?

3 factoren verschillend aantal experimenten !

Three-level full factorial designs: 33=27 exp.

Central composite designs: 23+6+min1= min 15 exp.

Box-Behnken designs: 13 exp.

Doehlert designs: 13 exp.

Uniform designs: 6 exp.

Doel

Verschillende « response surface designs » in optimalisatie vergelijken, welke meest geschikt?

3 factoren verschillend aantal experimenten !

Three-level full factorial designs: 33=27 exp.

Central composite designs: 23+6+min1= min 15 exp.

Box-Behnken designs: 13 exp.

Doehlert designs: 13 exp.

Uniform designs: 6 exp.

Doel

Verschillende « response surface designs » in optimalisatie vergelijken, welke meest geschikt?

3 factoren verschillend aantal experimenten !

Three-level full factorial designs: 33=27 exp.

Central composite designs: 23+6+min1= min 15 exp.

Box-Behnken designs: 13 exp.

Doehlert designs: 13 exp.

Uniform designs: 6 exp.

Doel

Verschillende « response surface designs » in optimalisatie vergelijken, welke meest geschikt?

3 factoren verschillend aantal experimenten !

Three-level full factorial designs: 33=27 exp.

Central composite designs: 23+6+min1= min 15 exp.

Box-Behnken designs: 13 exp.

Doehlert designs: 13 exp.

Uniform designs: 6 exp.

12

34

56

0

2

4

61

2

3

4

5

6

(4,1,5)

X1

(5,3,1)

(6,5,4)

(2,4,6)

(1,2,3)

X2

(3,6,2)

X3

)6( 36U

Doel

Verschillende « response surface designs » in optimalisatie vergelijken Gebruikte toepassing?

Optimalisatie scheiding HPLC/CEOptimalisatie derivatisatiereactie

Invloed van ↓ aantal exp ? Welk optimum wordt voorspeld uit elk design?

Welke voorspelde optima leveren praktisch ook goede resultaten op?

Vergelijken voorspelde waarde met experimentele waarde bij gevonden optima

Optimisation of CE separation methods for viral compounds

Iulia Oita

Who?

Model organisms :• small, • readily available, • easy to manipulate, • quick breeder

Poliovirus - about 50 nm

(nanometer = one-billionth of a meter)

Human Rhinovirus - about 30 nm

Picornaviridae

Why?

• need to understand the molecular infection mechanisms of picornaviruses → prevent and treat viral diseases

• development of new antiviral drugs,

• more efficient and safer vaccines

• strong curiosity for viruses, small “living” chemical entities

• not all replication steps can be fully explained or linked

• application of analytical (separation) techniques is only seldom used in virological research

Polio virus studded with 60 twig-like structures, the

receptors.

How?

• Using capillary electrophoresis

Electropherograms of two Human Rhinovirus serotypes

• characterize complete, intact viruses

• distinguish serotypes

• execute fast concentration- and purity determinations of viral preparations

• monitor the interaction between virus and:• antiviral agents•biological molecules

• detect viral structural changes and separate viral particles

Virus peak serotype 14

Virus peak serotype 2

Practical

• Optimize CE separation method for virus and/or virus components using experimental design

• Buffer • Voltage• Temperature • Detection

• Validate the optimized method

Ontwikkelen van onzuiverheids-profielen m.b.v. orthogonale chromatografische systemen

Melanie Dumarey

Onzuiverheidsprofielen

  ICH-richtlijnAlle componenten aanwezig als onzuiverheid in een farmaceutische stof in een hoeveelheid die bepaalde grenzen overschrijdt moeten geïdentificeerd en/of gekwantificeerd worden.

  Waarom?Patiënt beschermen tegen ongewenste neveneffecten.

VoorbeeldSalicylzuur in aspirine.

Ontwikkelen onzuiverheidsprofielen

  Complex analytisch probleem:– Slechts kleine hoeveelheden aanwezig.– Bij- of degradatieproducten gelijkaardige structuur als

hoofdbestanddeel.– Onzuiverheden zijn ongekend (structuur en aantal).

  Oplossing: gebruik van orthogonale chromatografische systemen.

Strategie

  1) Screening op een set van orthogonale chromatografische systemen (≠ SF, pH, OM)

– Kans dat alle onzuiverheden gevonden worden groter.

– Beste chromatografisch systeem kan weerhouden worden voor verdere optimalisatie.

  2) Sequentiële optimalisatie1. pH2. Organische modifier3. Temperatuur en gradiënthelling

Doel

  Stap 1: pH optimalisatieHoe optimale pH voor geselecteerd systeem voorspellen?

  Stap 2: OM optimalisatieHoe optimale ratio’s aan organische modifiers bepalen m.b.v. de Snyder’s solventendriehoek?

100% MeOH

100% ACN

1

2 3 100% THF

4 5

6

79

8

10

Praktisch

1. 32 ≠ RPLC systemen (2 orthogonale SF bij 16 ≠organische samenstellingen).

– Injectie mengsel representatief voor onzuiverheidsprofiel.

2. Optimale samenstelling van de organische fase (in MF) voorspellen a.d.h.v. 7 tot 10 experimenten→gelijkaardige resultaten?

3. Welke benadering geeft beste resultaat?

Applicatie-ontwikkeling in (pressurized) Capillaire Electrochromatografie

Indiana Tanret

Techniek: pCEC

  HPLC  Miniaturisatie CLC: capillair

  CE  CEC = combinatie HPLC + CE

  pCEC = combinatie CLC + CE

Praktisch

SF in capillaire kolom: monolieten

Je leert hoemonolietengemaakt worden

EOF

Pomp

Doel

  Applicatie-ontwikkeling

  Transfereren van een bestaande HPLC-applicatie naar (p-)CEC

  of  Ontwikkelen van een farmaceutische

applicatie op een monolitische SF in p-CEC en/of CEC

Je ontwikkelt een strategie, voert ze uit en je verwerkt je resultaten

Praktisch

  Farmaceutische applicatie: bv. Kwantitatieve analyses van geneesmiddelen in

tabletten/plasma Analyse van een geneesmiddel en zijn onzuiverheden/

afbraakproducten Scheiding van biopolymeren Analyse van pesticiden ...

  Kolommen: monolieten

  Eventueel optimalisatiestappen doorvoeren

Praktisch

HPLC

(p-)CEC

Voordelen:↑ efficientie?

↑ selectiviteit?↑ resolutie?

snellere runs?...

Scheiden van Chirale Geneesmiddelen door middel van HPLCHasret Ates

OVERZICHT

• Wat is chiraliteit?

• Belang?

• Thesisvoorstel

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2001/illpres/game.html

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2001/illpres/game.html

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2001/illpres/game.html

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2001/illpres/game.html

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2001/illpres/game.html

CHIRALITEIT

• Centraal C-atoom

• 4 verschillende substituenten

• Spiegelbeelden niet identiek Enantiomeren!

BELANG

• Verschillend gedrag van enantiomeren in chirale media

• Gevolg • Minder werking• Geen werking• Antagonistische werking• Toxische werking

THESISVOORSTEL

• Wetgeving FDA en EMEA• Distomeer als

onzuiverheid in eutomeer

• Scheiden racemische mengsels

• Gebruikte methode• HPLC met polysaccharide

gebaseerde SF

THESISVOORSTEL

• Toepasbaarheid van bestaande strategieën controleren

• Nieuwe kolommen implementeerbaar?

• Nieuwe strategieën definiëren indien nodig

Opstellen van chirale scheidingsstrategieën met behulp van capillaire electroforese Debby Mangelings

Implicaties van chiraliteit

– Chiraliteit: het bestaan van twee of meerdere vormen -enantiomeren- van een asymmetrische molecule die spiegelbeeld zijn van elkaar.

– Enantiomeren: dikwijls een verschillende activiteit in het lichaam (Softenon® )

Best een geneesmiddel ontwikkelen dat enkel het actieve enantiomeer (eutomeer) bevat

– Industrie ontwikkelt meestal racematen, achteraf scheiden scheidingsstrategiëen zijn heel nuttig

Capillaire electroforese

EOF

Capillaire electroforese

  - Migratie van de stoffen onder invloed van een electrisch veld (electroforetische migratie)

  - Drijvende kracht = EOF

  - Weinig consumptie van staal en buffer tijdens de analyse milieuvriendelijk

  - Meestal: waterige buffers

  - Maar: weinig toepassingen voor slecht oplosbare stoffen wegens precipitatieproblemen in H2O

CE in niet-waterig milieu

Chirale scheidingen met CE

  Gebruik van chirale selectoren in de buffer om enantioselectiviteit te bekomen

  Voorbeeld: cyclodextrines

Project - Doel

  - Evalueren van CE in niet-waterig milieu

als chirale scheidingstechniek

  - Kan een generische scheidingsstragie

gedefinieerd worden m.b.v deze techniek?

  - Opstellen van de strategie en evaluatie

  Bedankt voor jullie aandacht !!

  OVERZICHT op http://www.vub.ac.be/fabi

  Thesis proposals (linker kolom)