Marina Macagnan

Martha Arnold

Paula Golin

Rafael Soares

Roberta Rohde

Saulo Mabilde

Era uma vez...

No seu consultório...

• Uma criança de 1 ano de idade é trazida devido a retardo no crescimento

• A mãe reclama que a pele de seu filho parece “amarelada”

• Ela e seu marido são primos oriundos da Sardenha no Mediterrâneo

• Ela refere que vários familiares em seu país de origem têm “sangue fino” e que as vezes precisam de “injeções especiais”

Você notou que a criança:

• estava abaixo do desenvolvimento esperado

• estava ictérica

• apresentava deformidade no crânio

• seu maxilar era bem pronunciado

• tinha esplenomegalia

Os exames mostraram que:A criança tem anemia hemolítica severa com níveis reduzidos de hemoglobina no sangue

ELETROfORESE DA HEMOGLOBINA

O sangue contém níveis aumentados de hemoglobina fetal- Hb F

Eritrócitos são deformados, pequenos, e mostram anormalidades estruturais.

• O Rx de crânio mostrou o padrão “cabelo-em-escovinha” associado com aumento do espaço medular

?

-talassemia

Etiologia

Histórico: - Von Jakhs

- Thomas Cooley

- Origem do Nome

Definição de talassemia

Definição de β-talassemia

Características Iniciais

Distribuição geográfica : - origem

- mutações talassêmicas

- movimentos migratórios

Mutações com efeitos semelhantes:

Países mediterrâneos

África tropical

Sudeste da Ásia

Índia

Sul da China

Epidemiologia

Grandes Correntes Migratórias:

- tráfico negreiro

- migração italiana

- migração de caribenhos e africanos

- indianos, cipriotas e paquistaneses

- asiáticos

Diagnóstico Intra-uterino

Dados da O.M.S.: α-talassemia

β-talassemia

Epidemiologia

Β-talassemia pelo mundo:

- Itália : 2 a 15 %

- Grécia : 8 %

- Chipre : 18 %

- Península Ibérica : 0,1 a 2 %

- Sul da Europa : mais de 4 milhões de heterozigotos.

- Am. Latina e Caribe : 1 a 2 % de heterozigotos.

Epidemiologia

Três tipos diferentes de apresentação fenotípica

TALASSEMIA MAIOR

- anemia de Cooley

- reduzida síntese de HbA

- dados clínicos: 1°. ano de vida (características peculiares)

anemia intensa (hemoglobina<6,5 g/dl)

esplenomegalia volumosa

redução da massa muscular

alterações craniofaciais

atraso no crescimento

Apresentação Clínica

obs.: transfusões crônicas de sangue

crianças tratadas inadequadamente ou tardiamente

não tratado

Apresentação Clínica

TALASSEMIA INTERMEDIÁRIA

β-talassemia heterozigótica

mutações e combinações complexas

manifestações clínicas:

- anemia leve á moderada(hemoglobina entre 7 e 11 g/dl)

- esplenomegalia

- redução da massa muscular

- alterações faciais

- úlceras crônicas na perna

- sintomas compressivos

Apresentação Clínica

TALASSEMIA MENOR

β-talassemia heterozigótica Uma única mutação β-talassêmica

Dados clínicos: - anemia moderada a mínima

- microcitose profunda

- normalmente assintomáticos

Obs.: diminuição dos níveis de hemoglobina

diagnóstico difícil de ser estabelecido

Apresentação Clínica

Fisiologia

Síntese da Hemoglobina

Duas cadeias de globina ( e “não ”)Com exceção das primeiras semanas de embriogênese, uma cadeia é sempre .Feto: cadeia não chamada Depois do nascimento: cadeia β se pareia com a globina.Hemoglobina completa: 2 cadeias α e+ 2 cadeias não .

Hemoglobina A

Síntese da Hemoglobina

Genes que codificam a cadeia da

α globina estão no cromossomo

16.

Genes que codificam a produção

de cadeias não estão no

cromossomo 11.

A Hemoglobina e seus genes

Ontogenia da Síntese da Hemoglobina

No cromossomo 11 os genes das globinas são ativados em seqüência durante o desenvolvimento, da extremidade 5´para 3´.ε embriogênese desenvolvimento fetal perto do nascimento

Ontogenia da Síntese da Hemoglobina

Hemoglobinas no Adulto

2 cadeias α + 2 cadeias β Hb A (97%)

2 cadeias α + 2 cadeias

Hb A2 (2%)2 cadeias α + 2 cadeias

Hb F (1%)

Fisiopatologia

Fisiopatologia

Produção de β globina: anemia microcítica hipocrômica globina : importância só no período pós- natal beta talassemia evidente meses após nascimento

Fisiopatologia

Cadeias em excesso insolúveis precipitação lesão membrana perda potássio síntese de DNA prejudicada destruição de precursores eritrocitários na MO (eritropoiese ineficaz)70 a 85 % dos normoblastos podem ser destruídosGene intacto níveis elevados

Fisiopatologia

Nível de Hb F aumentado devido à sobrevida seletiva e por produção aumentada da população de hemácias adultas que contém Hb F.

Alterações Morfológicas

Expansão da MO adelgaçamento do osso cortical neoformação óssea na face externa do osso (maxilar, ossos frontais da face e crânio)Hepatoesplenomegalia devido à hiperplasia do SRE e à hematopoiese extramedular.Hemossiderose, Hemocromatose secundária (transfusões, absorção intestinal de ferro)

Alterações Morfológicas

Mecanismos da Anemia

Eritropoiese pode aumentar + de 10 vezes, 95% pode ser ineficaz.Efeitos deletérios do excesso relativo de cadeias de globina.O excesso interfere na maturação eritropoiética normal: morte intramedular de precursores das células vermelhas por parada na fase G1; apoptose intramedular acelerada dos eritroblastos tardios

Mecanismos da Anemia

Acúmulo de cadeias na membrana das células vermelhas: anormalidades bioquímicas danosas ao citoesqueleto Presença de ferro na membrana pode agravar efeitos deletérios.

Conseqüências clínicas da Anemia

Expansão da medula vermelha : 30X > que o normal volume plasmático (shunting através da medula expandida) e a progressiva esplenomegalia exacerbam a anemia. eritropoetina formação tecido extramedular massas extra-ósseas no abdome tórax e pelve

Conseqüências clínicas da Anemia

Expansão MO deformidades do crânio e face, osteopenia e defeitos na mineralização óssea podem agravar uma síndrome periarticular dolorosa microfraturas e osteomalácia.

Genética Molecular da -talassemia

SEQ.CAP

PROMOTOR

EXON1

EXON2

SEQ 5´UTR

INTRON1

INTRON2

EXON3

CODON TERM.

3´UTR

• Presente no cluster do gene

HBB, juntamente com os genes da

γ-globina, ε-globina e δ-globina.

Gene da β-Globina Humana

(HBB)• Locus 11p15.5

• Produto cadeia de β-globina

humana

PROMOTOR

5 Regiões de regulação tecido-específicas:

• CACCC proximal (motif)• CACCC distal

• CAAT• TATA

• GATA I

SEQ.CAP

PROMOTOR

ACATTTG• Início da transcrição

• Recebe um cap nucleotídeos

necessário para o RNAmligar-se ao ribossomo

para subseqüente tradução.

SEQ.CAP

PROMOTOR

SEQ 5´UTR

• Seqüência transcrita e posteriormente não

traduzida• Importante para a estabilidade do RNA

SEQ.CAP

PROMOTOR

EXON1

SEQ 5´UTR

• 90 pares de bases• aminoácidos 1-30

SEQ.CAP

PROMOTOR

EXON1

SEQ 5´UTR

INTRON1

• 130 pares de bases• importante no

processamento do RNAm nuclear e saída do núcleo

SEQ.CAP

PROMOTOR

EXON1

EXON2

SEQ 5´UTR

INTRON1

• 130 pares de bases• aminoácidos 31-104

SEQ.CAP

PROMOTOR

EXON1

EXON2

SEQ 5´UTR

INTRON1

INTRON2

• 850 pares de base

SEQ.CAP

PROMOTOR

EXON1

EXON2

SEQ 5´UTR

INTRON1

INTRON2

EXON3 • 126 pares de bases• aminoácidos 105-146

SEQ.CAP

PROMOTOR

EXON1

EXON2

SEQ 5´UTR

INTRON1

INTRON2

EXON3

CÓDON TERM.

• Códon de terminação

SEQ.CAP

PROMOTOR

EXON1

EXON2

SEQ 5´UTR

INTRON1

INTRON2

EXON3

CODON TERM.

3´UTR

• Transcrito e não traduzido

• Sítio de ligação da Poli(A) do

RNAm

CAP

EXON1 EXON2

INTRON1 INTRON2

EXON3

POLI(A)

RNAm nuclear• Adição de um CAP de guanosina-metilada na extremidade 5´• Adição da cauda POLI(A), na extremidade 3´

RNAm maduro• Processamento dos introns (splice)

CAP

EXON1EXON2EXON3

POLI(A)

Sumário dos passos envolvendo a produção da β-globina e da

hemoglobina

Base Molecular da ß-Talassemia

São classificadas em , , , , , e dependendo da cadeia ou cadeias cuja síntese é defeituosa

As -talassemias podem ser divididas de acordo com a ausência completa ou apenas deficiência na síntese de cadeia de -globina humana em:

- 0-talassemia

- +-talassemia

Bases moleculares das β-talassemias simplesA maior parte das mutações

causam diminuição na produção de mRNA ou formação de mRNA não funcionaisUm pequeno grupo de mutações, nonsense ou frameshift, ocorrem na região codificante do gene (exons)Grandes deleções no cluster do gene HBB podem resultar em talassemias complexas

Classificação das mutações beta-talassêmicasMutações que podem causar:

Defeito na síntese de mRNA:splice junctions;introns;exons;

Formação de mRNA não funcionais;Alteração na adição da cauda poli-A ou no caping; Mudança em áreas regulatórias.

Mutações nas splice junctions

Podem causar alteração nas regiões doadora 5’ou aceptora 3’ dos introns ou em seqüências consensuais que rodeiam as junções;

Ocorre a formação de locais de splice crípticos, que nada mais são do que áreas alternativas de splice, que competem com áreas normais;

Fenótipo é de β+-talassemia.

IntronExon

Mutações em Introns

Qualquer mutação que torne uma região críptica de splice mais parecida ou até mesmo idêntica à região de splice normal

Ocorre então competição entre a região críptica ativada e a região de splice normal

Fenótipo de β+-talassemia

IntronExon

Mutações em Exons afetando o Splicing

Causam alteração na região codificante do gene HBB

Podem resultar em mudança tanto na seqüência de aminoácidos da cadeia de β-globina quanto na quantidade de formação de RNAm específicos

Fenótipo de variante estrutural. Exemplo HB E

IntronExon

Splicing

Mutações que causam formação de RNAm não funcional

Exemplo são mutações que formam um código de parada prematuro

Podem ser causadas por substituição de um único aminoácido ou por frameshift

Exon

Mutações que causam alteração na cauda Poly(A) ou no capping do RNAm

Impedem as modificações pós-transcricionais do mRNA, ou pelo capping não correto na extremidade 5’ ou por não poliadenização da extremidade 3’

Afetam a estabilidade do mRNA formado

Fenótipo geralmente de β+-talassemia

Mutações que Afetam a Área do Promotor

Geralmente deleções ou mutagênese pontual

O fenótipo depende dos boxes (seqüências consensuais) onde ocorreu a mutação

No CACCC principal proximal fenótipo mais severo, enquanto no CACCC distal o fenótipo pode ser silencioso

– Mutação Fenótipo Origem Étnica

• Promoter Mutantes• -101 (C to T) B(+) Turquia• -88 (C to A) B(+)

Mediterrnea• -87 (C to G) B(+) Negro

Americana• Mutantes que causam códon de parada• Códon 1 (-1 bp) B(0) Chinesa• Códon 6 (-1 bp) B(0) Mediterrânea• Códon 114 (-2, +1 bp) B(+) Francesa• Mutações na Splice Junction• IVS-1, position 1 (G to A) B(0) Mediterrânea• IVS-1, position 2 (T to G) B(0) Indiana, Chinesa• Novo Local de Splice • IVS-1 110 (G to A) B(+) Mediterrânea• Defeito no Cleavage do RNA

• AATAAA to AACAAA B(+) Negro Americana

Fatores Genéticos que Afetam a Severidade Clínica:

Natureza das mutações no gene HBB;Co-herança de -talassemia;Quantidade de hemoglobina fetal produzida.

LCR – Locus Control Region

Super-enhancer

Estabelecem a abertura da cromatina, inibindo a repressão normal da transcrição

Localizado aproximadamente 20 Kb anteriormente ao cluster

Contém cinco locais que são hipersensíveis à DNase, apenas nas células eritróides precursoras

A presença do LCR inteiro é fundamental para a transcrição dos genes presentes no cluster do HBB

Pacientes com deleções nos LCR falham em expressar todos os genes do cluster do HBB

Essencial para terapia gênica

LCR – Locus Control Region

Padrão de Herança

Autossômico recessivo;

Recentemente foi relatado em algumas famílias padrão de herança autossômico dominante.

Fenótipos

TalassemiaMenor

TalassemiaMaior

Normal

Se ambos os pais não forem portadores então todos os seus filhos serão normais.

Padrão de herança recessivo

Padrão de herança recessivoSe apenas um dos pais é portador e o outro normal, os filhos terão 50% de chance de ter Talassemia menor, porém nenhum deles terá Talassemia maior.

Padrão de herança recessivoSe ambos os pais forem portadores, seus filhos terão 25% de chance de herdarem talassemia maior; 50% talassemia minor e 25% de chance de nascerem normais.

Padrão de herança autossômica dominante

Resultam de uma família de mutações, geralmente envolvendo o exon 3 do gene HBB

Ocorre produção de cadeias de globina hiper-instáveis, com tamanhos variados, que se precipitam junto com as cadeias em em excesso de -globina nas células precursoras hemáticas

Diagnóstico

Diagnóstico Clínico

Diagnóstico Clínico-laboratorial

Eletroforese

Cromatografia

Análise Molecular

Diagnóstico Diferencial

Diagnóstico ClínicoHistória médica individual- idade de início clínico

História médica familiarOrigem étnicaExame físico

- crescimento e desenvolvimento - palidez e icterícia - tamanho hepático e esplênico

- estrutura óssea

Diagnóstico Clínico-laboratorial

Hemograma completo -VCM -HCM / CHCM -RBC -RDW

Esfregaço de sangue periférico

-VCM-

Elemento

<72 fL diagnóstico

presuntivo

Diagnóstico Clínico-laboratorial

-HCM/CHCM-

Talassemia menor : 11-14

g/dL

Talassemia maior : <7 g/dL

Diagnóstico Clínico-laboratorial

-RBC-Na anemia microcítica

Talassemia RBCX

Ferropenia RBC

Diagnóstico Clínico-laboratorial

-RDW-

Talassemia : RDW

X

Ferropenia : RDW

Diagnóstico Clínico-laboratorial

Esfregaço de sangue periférico

- microcitose

- hipocromia

- anisocitose

- poiquilocitose

- eritroblastos

- inclusões de cadeias α

Diagnóstico Clínico-laboratorial

Esfregaço

Esfregaço

Objetivo: qualificar e quantificar a Hb

- Hb A

- Hb F

- Hb A2

Eletroforese

Normal + o

Hb A (%) 97.5 73 0Hb F (%) 0.8 24 97.5

Hb A2 (%) 1.6 3 2.5

Eletroforese

Cellulose Acetate Electrophoresis

Pouca distinção entre Hb A e

Hb F

Citrate AgarElectrophoresis

Teste confirmatório e pós-natal

Thin Layer Isoelectric Focusing

Gradiente de pH e boa resolução

Cromatografia

Objetivo: maior precisão

HPLC - High Performance Liquid

Cromatography

Screening

Custo elevado

HPLC-cromatografia

HPLC-cromatografia

Análise molecular

Objetivo: identificar mutações

específicas

Diferencia alelos

Embasar aconselhamento genético

Pós-diagnóstico

clínico-laboratorial/pré-natal

PCR

Seqüenciamento (eletroforese)

Análise molecular

Diagnóstico Diferencial

Talassemia

Anemia Ferropriva

HEMOGRAMAX

Mentzer index: VCM/RBC<13 talassemia>13 ferropenia

Eletroforese perde valor

Diagnóstico Diferencial

Tratamento

Primeiro passo é distinguir entre:

Talassemia Maior Talassemia Menor Talassemia Intermediária

Tratamento da-talassemia

Transfusão Sangüínea

Terapêutica Quelante

Transplante de Medula Óssea

Esplenectomia

Apoio Psicológico

Tratamento da-talassemia Maior

Transfusão Sangüínea

Objetivo: HB > 10gdL

Quando: precocemente

Efeitos Favoráveis: crescimento, atividade física, hiperplasia medula óssea, deformidades ósseas, esplenomegalia

Precauções: vacinação contra a Hepatite B, controle do sangue transfundido

Tratamento da-talassemia Maior

Terapêutica Quelante Objetivo: evitar hemossiderose

Quando: após 1 ano do início das transfusões / após 10-12 transfusões Como: infusão subcutânea lenta

Efeitos Favoráveis: evitar lesões orgânicas graves como insuficiência de glândulas endócrinas, fígado e miocárdio provocadas pelo acúmulo de ferro

Efeitos Colaterais: rarosUso da vitamina C associada

Tratamento da-talassemia Maior

Transplante de Medula Óssea

Objetivo: cura

Quando: antes que apareçam as complicações

Como: irmão(ã) HLA idêntico

Sucesso: 80%

Riscos

Tratamento da-talassemia Maior

Esplenectomia

Objetivo: medida auxiliar

Quando: benefícios maiores que a manutenção do baço

Precauções: vacina anti-pneumococo

Antibioticoterapia profilática

Febre

Tratamento da-talassemia Maior

Acompanhamento do Tratamento

exame físico mensal ALT bimensal ferritina sérica a cada 3 meses crescimento e desenvolvimento audiometria e ofltalmo anualmente avaliação cardíaca completa, US

fígado, tireóide, pâncreas, adrenal, paratireóide e hipófise

Tratamento da-talassemia Maior

Apoio Psicológico

Esclarecer a natureza da doença, sua evolução, tratamento e complicações

Reforçar a terapia quelante

AdolescênciaPrognóstico Transfusões regulares

Ferritina sérica abaixo de 2500 ng/mL

Tratamento da-talassemia Maior

Tratamento Sintomático

Esplenectomia

Suplementação ácido fólico

Radioterapia de massas extramedulares

Transfusões – quelantes

Úlceras maleolares

Tratamento da-talassemia Intermediária

Geralmente assintomático

Confusão

Gravidez

Tratamento da-talassemia Menor

Três estratégias:

Transferência de Genes

Correção da seqüência DNA/RNA mutante

Diminuição da expressão do gene da-globina

Tratamento Experimental da -talassemia

Diagnóstico Pré-natal

Objetivos

Sistematizar o tratamentoMelhorar prognóstico

Exames-padrão

PCR e seqüenciamento de DNA: amniocenteseEletroforese ou HPLC: cordocentese ou coleta de sangue fetal

Método

População de Risco

Exames

Aconselhamento Genético

Desvantagens

Impossibilidade de coletaAborto espontâneo em 1-2% dos casos

Balanço

Apesar de haver riscos, há grandes vantagens em fazer-se uso do diagnóstico pré-natal

Rastreamento

Definição

Método pelo qual se busca, numa população de risco, indivíduos portadores de uma doença

Eficácia

-talassemia: informação e métodos rápidos e acessíveis para realizar o rastreamento

Diagnóstico Neo-natal

Teste do pezinho

Método

Métodos hematológicos e análise de DNA

Resultados

Aparentemente o status de portador não causa ansiedadeRedução do nascimento de crianças beta-talassêmicas no Mediterrâneo

Aconselhamento Genético

Definição

O aconselhamento genético é o processo de providência individual e familiar de informações sobre a natureza, hereditariedade e implicações de doenças genéticas para ajudá-los a tomar decisões informadas de caráter médico e pessoal

Objetivo

Esclarecer:- Evolução da doença- Riscos para futuros filhos

Obs.: Não é objetivo do aconselhamento genético a erradicação da doença

Influências

InúmerasModulam o caráter do serviçoPodem, mas não devem, mudar o desfecho

Enfoques

Depende de:PopulaçãoFamíliaPessoa

Exemplos

Princípio

A decisão final sempre é do paciente e não deve ser influenciada pelo orientador do serviço

Benefício

Prevenção de novos casos de -talassemia, pela prevenção de gravidezes de risco

Obrigado