UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Laboratorium voor Analytische ChemieAcademiejaar 2008-2009
VALIDATIE VAN EEN GC METHODE VOOR DE BEPALING VAN DI-N-OCTYLFTALAAT
Jeroen GEERAERTS
Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling
Promotor
Prof. Dr. Apr. L.Thienpont
Commissarissen
Prof. Dr. B. De Spiegeleer
Dr. K. Van Uytfanghe
DANKWOORD
Graag zou ik Prof. Dr. Apr. Thienpont, Dr. Van Uytfanghe en Dr. Stöckl bedanken voor hun welgekomen begeleiding, hulp en ondersteuning bij het uitvoeren van de experimenten in het laboratorium en het schrijven
van deze masterproef.
INHOUDSOPGAVE
1. INLEIDING 1
1.1 Achtergrond 1
1.1.1 Algemeen 1
1.1.2 Di-n-octylftalaat 2
1.2 Chemisch bekeken 3
1.3 Methodevalidatie 4
2. OBJECTIEVEN 6
3. MATERIAAL EN METHODEN 7
3.1 Apparatuur 7
3.2 Reagentia 8
3.3 Opstarten van de GC 8
3.4 Testmengsel 9
3.5 Oplossingen 11
3.6 Protocollen 14
3.7 Statistiek 15
3.8 Literatuurstudie 17
4. RESULTATEN EN DISCUSSIE 18
4.1 Experimenteel onderzoek 18
4.1.1 Lineariteit 18
4.1.2 Imprecisie 21
4.1.3 Terugvinding 26
4.1.4 Aantoonbaarheidsgrens 28
4.1.5 Methodevergelijking 29
4.1.6 Besluit experimenteel onderzoek 36
4.2 Literatuurstudie 36
4.2.1 Analysemethoden voor ftalaten 38
4.2.1.1 Staalvoorbereiding 38
4.2.1.2 Chromatografie en detectoren 39
4.2.2 Betekenis van ftalaten in de farmaceutische 40
context
4.2.3 Validatie van analytische methoden in het 41
domein van het milieu
5. LITERATUURLIJST 46
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
AUC: Oppervlakte onder de piek
AUCDNOP/AUCC29: Oppervlakte onder de DNOP-piek tot de oppervlakte
onder de C29-piek
C26: Hexacosaan
C28: Octacosaan
C29: Nonacosaan
CAP: Cellulose-acetatoftalaat
Chi²exp: Experimentele Chi²-waarden
Chi²krit: Kritische Chi²-waarden
CI: Betrouwbaarheidsinterval
CL: Betrouwbaarheidsgrens
CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute
CMA: Compendium voor Monstername en Analyse
CV: Variatiecoëfficiënt
CVBA: Binnen-analyse variatiecoëfficiënt
CVT: Totale variatiecoëfficiënt
DEHP: diëthylhexylftalaat
df: Aantal vrijheidsgraden
DNOP: Di-n-octylftalaat
GC: Gaschromatograaf
HIV: Human Immunodefficiency Virus
IMP2: Imprecisiestaal 2
IMP4: Imprecisiestaal 4
LLE: Vloeistof-vloeistof extractie
LoD: Aantoonbaarheidsgrens
LMPE: Vaste-fase microextractie
MS: Massaspectrometer
PVC: Polyvinylchloride
REC1: Terugvindingsstaal 1
REC2: Terugvindingsstaal 2
REC3: Terugvindingsstaal 3
RSCA: Resource Conservation and Recovery Act
SD: Standaarddeviatie
SDBA: Standaarddeviatie binnen analyse
SDDD: Standaarddeviatie tussen dagen
SDT: Totale standaarddeviatie
S/N: Signaal tot ruis verhouding
SE: Systemische fout
SPE: Vaste-fase extractie
SPME: Vaste-fase microextractie
SOA: Sexueel overdraagbare aandoening
TE: Totale fout
TQD: Warmtegeleidbaarheidsdetector
UCL: Bovenste grens van het betrouwbaarheidslimiet
USEPA: US Environmental protection agency
VITO: Vlaamse instelling voor technologisch onderzoek
1. INLEIDING
1.1 Achtergrond
1.1.1 Algemeen
Commerciële producten die gebruik maken van ftalaten, bestaan reeds 75
jaar. Gedurende die periode is het toepassingsgebied alsmaar groter
geworden. Van speelgoed, medische apparatuur, cosmetica, kledij tot
bouwmaterialen maar we vinden ze vooral terug als weekmaker in
polyvinylchloride (PVC). Elk jaar wordt er wereldwijd meer dan 3 miljoen
ton ftalaten geproduceerd (Schettler, 2005).
Gezien de massale en wijd verspreide aanwezigheid is er nood aan
zekerheid over hun veiligheid. En alhoewel bij hun intrede ook meteen
toxicologische studies werden uitgevoerd, zijn de zorgen over hun
negatieve effecten slechts 25 jaar oud.
Uit resultaten van een recente review blijkt nu echter, de blootstelling
eraan in rekening gehouden, dat deze totaal ongegrond zijn: “analyse van
alle beschikbare data leidt tot de conclusie dat de risico’s laag zijn, zelfs
lager dan oorspronkelijk gedacht, en dat er geen overtuigend bewijs is
van negatieve effecten op mensen” (Kamrin, 2009).
Oorspronkelijk werd de aandacht gericht op diëthylhexylftalaat (DEHP),
dat kanker zou veroorzaken in knaagdieren na een hoge, levenslange
blootstelling (Kluwe et al., 2002). En aangezien ftalaten kunnen lekken uit
plastieken voorwerpen is de vergelijking met patiënten die een intensieve
medische behandeling zoals dialyse ondergaan eenvoudig te maken. In de
loop van het volgend decennium nam de publieke aandacht voor het
onderwerp dan ook toe. Wat zijn de mogelijke effecten van
milieucontaminanten? Zijn er gevaren bij het gebruik van cosmetica? Maar
vooral, wat zijn de risico’s van bootstelling aan plastieke objecten voor
kinderen? In het bijzonder deze die veel in de mond gestopt worden.
- 1/55 -
Het Koninklijk besluit van 25 februari 1996, dat Richtlijn 2005/84/EG van
het europees parlement omzet in Belgisch recht, legt de volgende
regelgeving op:
‐ DEHP, dibutylftalaat en benzylbutylftalaat mogen niet worden
gebruikt als stoffen of als bestanddelen van preparaten in
concentraties van meer dan 0,1 % massaprocent van het week
gemaakte materiaal in speelgoed- en kinderverzorgingsartikelen.
‐ Di-isononylftalaat, di-isodecylftalaat en di-n-octylftalaat (DNOP)
mogen niet worden gebruikt als stoffen of als bestanddelen van
preparaten in concentraties van meer dan 0,1 % massaprocent van
het week gemaakte materiaal in speelgoed- en
kinderverzorgingsartikelen die door kinderen in de mond kunnen
worden gestopt.
1.1.2 Di-n-octylftalaat
Er zijn geen commerciële toepassingen voor zuiver DNOP bekend. Het
commerciële mengsel C6-C10 ftalaat bestaat voor 20% uit DNOP. Dit
mengsel heeft een brede waaier van toepassingen: PVC, vloeren,
schoenen en tuinslangen. In de voedingsindustrie komt het vooral terug in
schroefdoppen, sluitingsnaden en transportbanden. Medische apparaten
die DNOP bevatten, bestaan tot op heden nog niet. De overgang van
DNOP naar het milieu vanuit deze producten kan voorkomen gedurende
productie, gebruik of de afvalverwerking ervan aangezien het niet
gebonden is aan de plastics (Kavlock et al., 2002).
- 2/55 -
En alhoewel het Koninklijk besluit van 25 februari 1996 ook beperkingen
oplegt aan DNOP, is het bewijs daartoe verwaarloosbaar:
‐ Het is duidelijk, rekening houdend met onzekerheden en het
ontbreken van data, dat het risico van DNOP niet significant is.
(Kamrin, 2009)
‐ De zorgen over de mogelijke negatieve effecten van DNOP op
mensen zijn te verwerpen. (Kavlock et al., 2002)
Desalniettemin is een gevalideerde methode voor de bepaling van DNOP
een noodzaak aangezien controles op het naleven van de wetgeving
dienen te gebeuren.
1.2 Chemisch bekeken
De synthese van ftalaatesters, de eigenlijke weekmakers, begint bij
ftalaatanhydride dat via een alcoholyse een dubbele esterificatie
ondergaat.
Ftalaatester
C6H4(CO)2O + ROH → C6H4(CO2H)CO2R
C6H4(CO2H)CO2R + ROH C6H4(CO2R)2 + H2O
Met R=C8H17 bij de synthese van DNOP (Lorz, 2002)
- 3/55 -
Het ftalaatanhydride zelf, wordt gevormd vanuit naftaleen door oxidatie
met een mengsel van kwiksulfaat (HgSO4) en kopersulfaat (CuSO4) in de
aanwezigheid van zwavelzuur (H2SO4).
Ftalaatanhydride
Tabel 1.1: Fysicochemische eigenschappen van DNOP (Merck Index)
Chemische formule C24H38O4
Moleculair gewicht 390,54
Smeltpunt -25°C
Kookpunt 390°C
Oplosbaarheid in water Praktisch onoplosbaar (0,5 µg/l)
1.3 Methodevalidatie
Volgens de ISO 9000 norm is validatie: “een bevestiging, door het leveren
van objectief bewijs, dat de vereisten voor een specifiek bedoeld gebruik
of toepassing vervuld zijn”.
Volgens Stöckl (2007) moeten we dus:
‐ het vooropgesteld doel van de methode specifiëren
‐ de prestatievereisten definiëren
‐ een dataset aanmaken door het uitvoeren van validatie-
experimenten
‐ interpreteren en evalueren van de bekomen dataset aan de hand
van de specificaties
- 4/55 -
Bij een methodevalidatie evalueren we dus of de prestatieparameters
voldoen om een bepaald analytisch probleem op te lossen. Dit is
essentieel wanneer een nieuwe methode wordt ontwikkeld voor een
specifiek probleem, bij indicaties dat de huidige methode varieert in
functie van de tijd, wanneer er veranderingen worden aangebracht aan
een bestaande methode of gewoon om de equivalentie tussen twee
methoden aan te tonen (Chandran & Singh, 2007).
De experimenten die moeten uitgevoerd worden hangen af van de
prestatiekenmerken die we willen valideren (Stöckl, 2007). In deze
masterproef wordt hoofdzakelijk het experimenteel protocol van het
“Clinical and Laboratory Standards Institute” ofwel CLSI (Suite 1400
Wayne, PA, VS) gevolgd.
De specificaties waaraan de methode dient te voldoen worden vooraf door
de onderzoeker vastgelegd. Ze kunnen opgelegd worden door
regelgevende instanties of worden bepaald afhankelijk van het
toepassingsgebied van de methode, wat het resultaat van statistisch of
analytisch onderzoek is.
- 5/55 -
2. OBJECTIEVEN
Het hoofobjectief van deze masterproef is de methodevalidatie voor de
GC-bepaling van DNOP. Daarnaast wordt er nog een literatuuronderzoek
uitgevoerd.
Via de methodevalidatie proberen we objectief bewijs te leveren dat de
vereisten voor een specifiek bedoeld gebruik of toepassing vervuld zijn
(ISO 9000).
Het proces is onder te verdelen in 4 belangrijke stappen:
- het vooropgesteld doel van de methode specifiëren.
- de prestatievereisten definiëren.
- een dataset aanmaken door het uitvoeren van validatie-experimenten.
- interpreteren en evalueren van de bekomen dataset aan de hand van de
specificaties.
Een methodevalidatie is essentieel alvorens een analytische methode in
gebruik kan genomen worden als routinemethode. De cursus “Method
validation With Confidence” (Stöckl, 2007), werd hiervoor gebruikt als
leidraad. Hij beschrijft de verschillende prestatiekenmerken, bijhorende
protocollen, specificaties en gebruikte statistiek. De meetresultaten dienen
dan getoest te worden aan de vooropgestelde specificaties door middel
van statistische testen, waarbij de cursus “Laboratory Statistics & Grapics
with Excel®” (Stöckl, 2007) gebruikt werd als handleiding.
Het literatuuronderzoek behandelt drie thema’s die nauw aansluiten bij
het experimenteel onderzoek. Ze werden zo opgesteld dat de context van
bovenstaande methodevalidatie beter geplaatst kon worden.
- Alternatieve analysemethoden voor ftalaten
- Betekenis van ftalaten in de farmaceutische context
- Validatie van analytische methoden in het domein van het milieu
- 6/55 -
3. MATERIAAL EN METHODEN
3.1 Apparatuur
De metingen werden uitgevoerd met een gaschromatograaf (GC)
(Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). Het toestel beschikt over een
direct inlet, warmtegeleidbaarheidsdetector (TQD) en een methylsilicone
kolom, type DB1 (J&W Scientific, Folsom, CA, VS) met een lengte van
15m, een interne diameter van 0,53mm en een filmdikte van 1µm. De
meetresultaten werden verwerkt met het Shimadzu GC Solution-
programma.
De TQD is een vaak gebruikte detector bij gaschromatografie, die
verschillen in warmtegeleidbaarheid registreert tussen het kolomeffluens
en een referentiestroom van zuiver dragergas (hier stikstof, N2).
Aangezien de meeste verbindingen een lagere warmtegeleidbaarheid
hebben dan het doorgaans gebruikte dragergas zal, wanneer het analyt
elueert van de kolom, de warmtegeleidbaarheid dalen en een
detecteerbaar signaal produceren.
Het staal wordt op de kolom gebracht via een direct inlet systeem
waardoor de injectietechniek van groot belang is. Dit kan variatie
veroorzaken in de meetresultaten aangezien manueel werd geïnjecteerd
(splitless).
De injectie van het staal gebeurde met een microliter spuit (Hamilton,
Zwitserland). Het geïnjecteerde volume bedroeg ongeveer 0,5 µl;
onafhankelijk van het staal dat gemeten werd.
Afwegen van reagentia gebeurde op een Mettler Toledo AT261 Delta
Range balans (Greifensee, Zwitserland), met een nauwkeurigheid van
10-5g.
- 7/55 -
3.2 Reagentia
Alle reagentia (hexacosaan(C26), octacosaan(C28), nonacosaan(C29) en
DNOP) werden aangekocht via Sigma-Aldrich (Steinheim, Duitsland). Zij
hadden een zuiverheid van respectievelijk 99%; 98,5%; 99,5% en 98%.
Cyclohexaan pro analyse, gebruikt als oplosmiddel, werd aangekocht bij
Merck (Darmstadt, Duitsland) met een zuiverheid van 99,5%. Bij de
berekening van de concentraties werd hiermee telkens rekening
gehouden.
3.3 Opstarten van de GC
De opstartprocedure is kritiek voor de levensduur van de TQD en de
kwaliteit van het geproduceerde signaal. Na het aanschakelen van de GC
moet het systeem eerst volledig op temperatuur gebracht worden.
Ondertussen is de detectorcel gespoeld met voldoende dragergas en kan
de stroom ingeschakeld worden (45mA).
Alvorens de metingen kunnen beginnen, moeten we zeker zijn dat het
systeem geen afwijkingen vertoont. Om dit te garanderen werden er 2
controlestappen ingebouwd. De ruis van de basislijn mag niet groter zijn
dan 3µV en het interval ervan over een tijdspanne van 5 minuten niet
meer dan 10µV; dit om na te kijken of de basislijn (en dus het signaal van
de detector) wel stabiel is. Als laatste stap van de systeemcontrole, wordt
nog een testmengsel gemeten (zie 3.4 Testmengsel).
In Tabel 3.1 staan alle instellingen van het Shimadzu GC Real Time-
programma, waarmee alle metingen werden uitgevoerd, samengevat.
- 8/55 -
Tabel 3.1 Instellingen van het GC Real Time-programma
Referentiegas N2
Debiet 15 ml/min
Injector Temperatuur 290,0°C
Rate Flow Hold Time
- 20,0 ml/min 0,00 min
4,00 min 22,0 ml/min 0,00 min
-0,71min 20,0 ml/min 0,02 min
Kolom Temperatuur 238,0°C
Detector Temperatuur 260°C
3.4 Testmengsel
Nog voor het aanvatten van de experimenten moet eerst een testmengsel
aangemaakt worden. Deze cyclohexaanoplossing met C26 en C28 is
representatief (inzake concentratie, retentietijd en chemische structuur)
voor de experimentele stalen met DNOP en C29, en dus ook voor de
metingen hiermee. Het Shimadzu GC Postrun-programma berekent de
eigenschappen zoals retentietijd, resolutie en oppervlakte van de gemeten
chromatogrammen. Via herhaalde metingen van het testmengsel kunnen
we voor elke van deze eigenschappen aanvaardingslimieten opstellen, die
werden samengevat in Tabel 3.2. Deze worden dan elke dag vergeleken
met de resultaten van het testmengsel.
- 9/55 -
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
uV(x100)
Chromatogram
Figuur 3.1: Voorbeeldchromatogram van het testmengsel
Tabel 3.2 Aanvaardingslimieten voor het testmengsel
Resolutie Minimum 3,5
Retentie Tijd (min) C26
C28
2,8 +/- 0,2
4,9 +/- 0,2
Oppervlakte Minimum 1000
Hoogte Minimum 100
Theoretisch Aantal
Platen
C26
C28
Minimum 500
Minimum 750
Tailing Factor C26
C28
Maximum 1,35
Maximum 1,25
k’ C26
C28
Minimum 7,5
Minimum 9,0
- 10/55 -
Bereiding van het testmengsel: 5,11mg C26 en 6,20mg C28 werd
opgelost in 2,1ml cyclohexaan.
3.5 Oplossingen
Alle DNOP-oplossingen werden gemaakt in een 2,496 mg/ml interne
standaardoplossing. Deze werd aangemaakt door 250,90mg C29 af te
wegen in 100ml cyclohexaan.
Een eerste stockoplossing, met hoge concentratie, werd aangemaakt door
122,76mg DNOP op te lossen in 50ml (2,406 mg/ml). De tweede
stockoplossing, met lage concentratie, is een 1 op 10 verdunning van de
eerste stockoplossing (0,241 mg/ml).
Tabel 3.3 geeft een overzicht van de stalen gebruikt in de experimenten.
Alle aangemaakte stalen, reeds voor beide stockoplossingen, werden
onderverdeeld in kleine vials om contaminatie na veelvuldig gebruik of bij
het aanmaken van verschillende stalen te vermijden.
Tabel 3.3: Concentratie van de stalen per experiment
EXPERIMENT STAAL CONCENTRATIE
Lineariteit Stockoplossing 1 2,406 mg/ml
Stockoplossing 2 0,241 mg/ml
Imprecisie IMP2 0,782 mg/ml
IMP4 1,865 mg/ml
Terugvinding REC1 0,818 mg/ml
REC2 1,330 mg/ml
REC3 1,837 mg/ml
Aantoonbaarheidsgrens Tussenverdunning 0,498 mg/ml
- 11/55 -
Voor het lineariteitsexperiment werd een standaardreeks gemaakt vanuit
stockoplossing 1 en 2 welke overeenkomen met respectievelijk standaard
5 en 1. Tabel 3.4 beschrijft het gebruikte mengprotocol.
Tabel 3.4: Mengprotocol lineariteit model 1, CLSI EP-6
STAAL #delen
stockoplossing 1
#delen
stockoplossing 2
Concentratie
DNOP
Standaard 1 1 - 0,241 mg/ml
Standaard 2 3 1 0,782 mg/ml
Standaard 3 2 2 1,324 mg/ml
Standaard 4 1 3 1,865 mg/ml
Standaard 5 - 1 2,406 mg/ml
De standaardreeks werd eenmaal voor en eenmaal na een experiment
gemeten. Eventuele variaties van de meetomstandigheden werden zo
gecompenseerd aangezien de standaardreeks hieraan ook onderhevig is.
Elke meetwaarde, met uitzondering van deze voor het
aantoonbaarheidsexperiment, wordt weergegeven als de verhouding van
de oppervlakte onder de piek (AUC) van DNOP tot de oppervlakte onder
de piek van de interne standaard (AUCDNOP/AUCC29).
Voor elke standaard werd het gemiddelde van AUCDNOP/AUCC29 uitgezet in
functie van de concentratie. Een passende trendlijn werd door de punten
getrokken. De keuze tussen een 1e of 2e orde regressiemodel wordt
bepaald naargelang de uitkomst van het lineariteitsexperiment. Door het
invullen van de AUCDNOP/AUCC29 van een gemeten staal in de inverse
vergelijking van de trendlijn, kan de concentratie berekend worden.
- 12/55 -
De 2 stalen van het imprecisie-experiment IMP2 en IMP4 zijn dezelfde als
standaard 2 en 4. Ze werden aangemaakt volgens het mengprotocol van
de standaardreeks hierboven beschreven, doch aangemaakt uit aparte
vials van beide stockoplossingen.
Voor het terugvindingsexperiment werden de stalen (REC1, REC2 en
REC3) met gekende concentratie aan DNOP gemeten, deze bedroegen
respectievelijk 0,818 mg/ml; 1,330 mg/ml en 1,837 mg/ml.
De stalen voor het aantoonbaarheidsexperiment werden dagelijks vers
aangemaakt. Ze werden bereid als een 1 op 8 tussenverdunning van een
0,498 mg/ml oplossing (0,241mg DNOP in 5ml interne
standaardoplossing).
De aantoonbaarheidsgrens (LoD) wordt hier berekend aan de hand van
het laag geconcentreerd staal met een signaal tot ruis verhouding (S/N)
van ongeveer 6 (lagere verhoudingen zijn slecht te onderscheiden van de
basislijn).
Van elk chromatogram werd de S/N telkens manueel bepaald zoals
geïllustreerd in Figuur 3.2. Vervolgens werd de concentratie berekend die
correspondeert met een S/N van 3. Hiertoe werd in het voorbeeld de
concentratie van het gemeten staal, met signaal 6 en ruis 1, gehalveerd.
Via de berekening van de standaarddeviatie kan dan ook de LoD bepaald
worden.
- 13/55 -
1.2uV(x10)
Figuur 3.2: Manueel bepalen van de signaal tot ruis verhouding
3.6 Protocollen
Het uitvoeren van de experimenten gebeurde volgens verschillende
protocollen, deze staan in Tabel 3.5 samengevat met bijhorende
specificaties.
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 min-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
Chromatogram Signaal/Ruis=6
Ruis=0,9
Signaal=5,4
- 14/55 -
Tabel 3.5: Gehanteerde protocollen en specificaties per experiment
PROTOCOL SPECIFICATIES
Lineariteit CLSI EP6
Model 1
- 5 concentraties
- Reeks 4 maal meten
binnen 1 serie
- Metingen in
verschillende volgorde
- Afwijking van
lineariteit<5%
- Regressieanalyse (2e
orde)
Imprecisie CLSI EP5
- 2 concentraties
- Metingen in duplicaat
- 20 dagen
- Binnen-analyse
variatiecoëfficiënt
CVBA=1,5%
- Totale
variatiecoëfficiënt
CVT=3%
Terugvinding - 5 concentraties
- 5 dagen
- Relatieve terugvinding
<5%
Aantoonbaarheidsgrens - 20 metingen
- Staal met S/N~6 LoD <0,030 mg/ml
Methodevergelijking CLSI EP9
- Minstens 40 stalen
- In duplicaat
- 1/meerdere dagen
- Systematische fout
SE<2,2%
- Totale fout TE<6,9%
3.7 Statistiek
De data werden statistisch verwerkt in Microsoft Office Excel (2000,
Microsoft Corporation, Verenigde Staten) met behulp van het “Data
analysis toolpack”. De statische testen stonden voorgeprogrammeerd in
het Methval templaat, opgemaakt door Dr. Stöckl (STT Consulting).
Het Methval templaat werd verder verduidelijkt in de cursussen
“Laboratory Statistics & Grapics with Excel®” (Stöckl, 2007) en “Method
validation With Confidence” (Stöckl, 2007). Alle data werden
gecontroleerd op uitschieters met de Grubb’s-test, die werd geïntegreerd
in een Microsoft Office Excel templaat door Dr. Stöckl. - 15/55 -
Een tweedegraads-polynomiale regressieanalyse werd bij het
lineariteitsexperiment uitgevoerd met het programma CB Stat (versie 5.1,
K.Linnet & Riskov, Denemarken). Een overzicht van de gebruikte statistiek
per experiment werd samengevat in Tabel 3.6.
Tabel 3.6: Gebruikte statische testen per experiment
EXPERIMENT STATISTISCHE TEST*
Lineariteit Tweedegraads-polynomiale,
Regressieanalyse
Imprecisie Eenzijdige F-test (Chi²-test)
ANOVA
Terugvinding CL van het gemiddelde
Aantoonbaarheidsgrens CL van het 3SD-centiel
Methodevergelijking Regressieanalyse, Bland & Altman
Met: *alle datasets werden gecontroleerd op uitschieters met de Grubb’s-
test
- 16/55 -
3.8 Literatuurstudie
In de literatuurstudie werden drie thema’s verder gedocumenteerd:
‐ Analysemethoden voor ftalaten
‐ Betekenis van ftalaten in de farmaceutische context
‐ Validatie van analytische methoden in het domein van het milieu
De eindresultaten hiervan werden verder besproken in het hoofdstuk 4
“Resultaten en discussie”. Naargelang het soort informatie dat gezocht
werd, konden we 4 werkwijzen onderscheiden:
‐ Algemeen: Google (www.google.com)
‐ Wetenschappelijk: Electronische databanken zoals Web of Science
en Pubmed, ter beschikking gesteld door de Universiteit Gent
‐ Regelgeving en richtlijnen: Europese Unie (www.europa.eu), VITO
(www.vito.be), USEPA (www.epa.gov), ...
‐ Chemisch: De Merck index
- 17/55 -
4. RESULTATEN EN DISCUSSIE
Alle meetresultaten worden weergegeven als AUCDNOP/AUCC29. C26, C28
en C29 werden getest als interne standaard. C29 werd gekozen aangezien
de retentietijd van de C29-piek het beste lag tegenover die van DNOP. Te
dicht zou voor interferentie kunnen zorgen, te ver zou onze meettijd
onnodig langer maken.
7.5
uV(x100)
Figuur 4.1: Chromatogram van C29 en DNOP
4.1 Experimenteel onderzoek
4.1.1 Lineariteit
Om de lineariteit te onderzoeken werd de AUCDNOP/AUCIS voor een
standaardreeks met 5 standaarden 4 maal in een verschillende volgorde
gemeten binnen één serie. Tabel 4.1 geeft de AUCDNOP/AUCIS voor alle
standaarden.
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
Chromatogram
- 18/55 -
Alle data werden met behulp van de Grubb’s-test gecontroleerd op
uitschieters, die bleek negatief.
Tabel 4.1: Bekomen resultaten van het lineariteitsexperiment
Meting 1 Meting 2 Meting 3 Meting 4 STAAL
Concentratie
(mg/ml) AUCDNOP/AUCIS
Standaard 1 0,241 0,149 0,149 0,157 0,149
Standaard 2 0,782 0,452 0,441 0,455 0,445
Standaard 3 1,324 0,713 0,706 0,695 0,713
Standaard 4 1,865 0,922 0,930 0,933 0,931
Standaard 5 2,406 1,126 1,110 1,125 1,120
y = 0.447x + 0.0792
R2 = 0.9926
0.0
0.5
1.0
1.5
0 1 2 3-0.1
0.0
0.1
0 1 2 3
AUC D
NOP
/ A
UC IS
Concentratie (mg/ml)
AUC D
NOP
/ A
UC IS
Concentratie (mg/ml)
Figuur 4.2: Spreidingsdiagram, Figuur 4.3: Residuediagram, data lineariteitsexperiment verschil tussen data en 1e orde regressielijn
- 19/55 -
De ligging van de datapunten tegenover de 1e orde regressielijn (Figuur
4.2) doen een niet-lineair verband vermoeden. De middelste 3 punten
liggen boven de curve en de 2 buitenste eronder, een 2e orde vergelijking
zou de punten beter bevatten. Het feit dat de residuen (Figuur 4.3) een U-
vormig verloop vertonen staaft dit vermoeden.
De statistische software CB Stat werd aangewend om de data te
verwerken via een tweedegraads polynomiale regressieanalyse. We
maken hier dus de afweging tussen het lineair en het tweedegraads
model. De bekomen resultaten met bijhorende verschillen staan hieronder
samengevat in Tabel 4.2. Hierbij wordt getest of de X²-coëfficiënt uit een
2e orde vergelijking significant verschillend is van nul.
Tabel 4.2: Verschil tussen het 1e en 2e orde regressie model
Concentratie
standaard
(mg/ml)
Gemeten
gemiddeldea
Voorspelling
via 1e orde
regressieb
Voorspelling
via 2e orde
regressiec
Verschil
(c-b)
%Verschil
(c-b)
0,241 0,151 0,187 0,152 -0,035 -18,845
0,782 0,448 0,429 0,446 0,018 4,109
1,342 0,706 0,671 0,706 0,035 5,253
1,865 0,929 0,913 0,930 0,018 1,929
2,406 1,120 1,155 1,119 -0,035 -3,052
Tabel 4.3: Resultaat t-test voor de X²-coëfficiënt
Standaard fout van de X²-coëfficiënt 0,0026
t-waarde -21,8661 P 0
Tabel 4.2 toont aan dat het gemiddelde beter aansluit bij de voorspelling
via een 2e orde regressie dan bij die van een 1e orde regressie (c-a>b-a).
Tabel 4.3 staaft dit vermoeden statistisch: de t-test toont aan dat de X²-
coëfficiënt significant verschillend is van nul (P=0). Onze ijklijn zal dus
- 20/55 -
een 2e orde functie zijn aangezien de X²-component niet wegvalt uit de
vergelijking.
Men kan nu afwegen of de afwijking tegenover 1e orde regressie
verwaarloosbaar is en dus toch een lineair verband mag gebruiken; dit
zou het verwerken van data op basis van een kalibratiecurve
vereenvoudigen. Er werd een maximale afwijking van 5% vooropgesteld.
In Tabel 4.2 zien we dat 2 van de 5 concentraties de specificatie van 5%
overschrijden (Figuur 4.4).
- - - - - - 5% limiet, verschil (%) tussen het 1e en 2e orde regressiemodel
Figuur 4.4: Absoluut verschil tussen 1e en 2e orde regressie model
Er is statistisch bewijs geleverd dat de verhouding tussen de
concentratiestaal en AUCDNOP/AUCIS van niet-lineaire aard is. Bij herhaling
van dit lineariteitsexperiment werden deze resultaten bevestigd.
4.1.2 Imprecisie
Voor het imprecisie-experiment worden 2 stalen, IMP2 en IMP4,
gedurende 20 dagen in duplicaat gemeten. Als specificaties gelden een
binnen-analyse variatiecoëfficiënt (CVBA) van 1,5% en een totale
- 21/55 -
variatiecoëfficiënt (CVT) van 3,0%. Tabel 4.4 vat de resultaten samen, die
vergeleken worden met de specificaties via een Chi²-test.
Tabel 4.4: Resultaten van het imprecisie-experiment
STAAL IMP2 (0,782 mg/ml) IMP4 (1,865 mg/ml)
Meting 1 Meting 2 Meting 1 Meting 2
DAG AUCDNOP/AUCIS
1 0,784 0,789 1,88 1,90
2 0,796 0,804 1,94 1,86
3 0,814 0,785 1,87 1,80
4 0,785 0,787 1,87 1,87
5 0,779 0,773 1,94 1,94
6 0,780 0,769 1,89 1,87
7 0,784 0,780 1,90 1,91
8 0,772 0,808 1,91 1,95
9 0,785 0,802 2,04 1,91
10 0,820 0,798 1,88 1,88
11 0,815 0,791 1,95 1,93
12 0,774 0,756 1,95 1,89
13 0,797 0,816 1,91 1,88
14 0,769 0,776 1,89 1,93
15 0,786 0,774 1,91 1,93
16 0,791 0,796 1,92 1,92
17 0,788 0,785 1,90 1,91
18 0,773 0,780 1,86 1,85
19 0,775 0,770 1,88 1,85
20 0,786 0,794 1,94 1,91
- 22/55 -
De gemiddelden van de duplicaten voor IMP2 (Figuur 4.5) geven mooi
verdeelde meetresultaten. Volgens het CLSI-protocol (een uitschieter is
een waarde die meer dan 4SD verwijderd is van het gemiddelde) is er
geen uitschieter aanwezig, een Grubbs-test bevestigt dit. Bij het verschil
tussen de duplicaten (Figuur 4.6) bleek de Grubbs-test eveneens negatief.
0.7
0.8
0.9
Gemiddelde
Con
cent
ratie
(mg/
ml)
-0.1
0.0
0.1
1
∆(meting1-meting2)
Con
cent
ratie
(mg/
ml)
Figuur 4.5: Puntdiagram van de Figuur 4.6: Puntdiagram van
gemiddelden van de duplicaten verschil tussen de duplicaten
voor IMP2 voor IMP2
Figuur 4.7, die de gemiddelden van de duplicaten voor IMP4 weergeeft,
geeft een symmetrisch verdeeld puntendiagram rond de doelwaarde van
1,865 mg/ml. Zowel het CLSI protocol als de Grubb’s-test bevestigen dat
er geen uitschieters zijn. Ook voor het verschil tussen de duplicaten
(Figuur 4.8) wordt geen uitschieter gevonden (Grubb’s-Test).
- 23/55 -
Uit de data werden voor IMP2 en IMP4 de standaarddeviatie binnen
analyse (SDBA), de standaarddeviatie tussen dagen (SDDD), de totale
standaarddeviatie berekend (SDT), de binnen analyse variatiecoëfficiënt
(CVBA) en de totale variatiecoëfficiënt (CVT) berekend (Tabel 4.5).
1.7
1.8
1.8
1.9
1.9
2.0
2.0
2.1
2.1
Con
cent
ratie
(mg/
ml)
Gemiddelde
-0.2
-0.1
0.1
0.2
1
∆(meting1-meting2)C
once
ntra
tie (m
g/m
l)
Figuur 4.7: Puntdiagram van de Figuur 4.8: Puntdiagram van
gemiddelden van de duplicaten verschil tussen de duplicaten
voor IMP4 voor IMP4
Tabel 4.5 vergelijkt de resultaten met de specificaties. Via een Chi²-test
wordt geverifiëerd of aan de specificaties voldaan is.
Chi²exp=(SD²exp*df)/SD²claim (Formule 4.1)
Met df: het aantal vrijheidsgraden
SD²exp: hier SD²BA of SD²T, afhankelijk van de berekening
SD²claim= CVspecificatie*(doel/100)
Via Formule 4.1 wordt de onderste grens van het eenzijdige 95%
betrouwsbaarheidsinterval van de Chi²-verdeling voor de experimentele
- 24/55 -
waarden berekend. Vervolgens wordt in het Methval templaat de kritische
Chi²-waarde berekend.
Tabel 4.5: Resultaten van de berekeningen uitgevoerd op de
imprecisiedata
STAAL IMP2 IMP4
SDBA (mg/ml) 0,011 0,031
SDDD (mg/ml) 0,009 0,021
SDT (mg/ml) 0,015 0,038
Experimenteel Specificatie Experimenteel Specificatie
CVBA (%) 1,4 1,5 1,7 1,5
CVT (%) 1,8 3,0 2,0 3,0
Chi²exp Chi²krit Chi²exp Chi²krit
Binnen-analyse 17,0 31,4 23,4 31,4
Totaal 12,1 46,2 16,0 37,4
Voor IMP2 zijn zowel de CVBA als de CVT kleiner dan de specificatie. De
CVBA voor IMP4 is groter dan zijn specificatie, waar de CVT dan weer onder
blijft.
Zowel voor het binnen-analyse als het totale imprecisie-experiment zijn de
experimentele Chi²-waarden lager dan de kritische. We kunnen nu
besluiten dat de experimenteel bepaalde variatiecoëfficiënten voor IMP2
en IMP4 voldoen aan de specificaties.
- 25/55 -
4.1.3 Terugvinding
Bij het terugvindingsexperiment worden 5 stalen respectievelijk IMP2,
IMP4, REC1, REC2 en REC3 gedurende 5 dagen gemeten.
Tabel 4.6: Resultaten van het terugvindingsexperiment
Concentratie (mg/ml)
Staal Meting 1 Meting 2 Meting 3 Meting 4 Meting 5
IMP2 0,779 0,780 0,784 0,808 0,798
IMP4 1,944 1,887 1,903 1,910 1,882
REC1 0,822 0,839 0,811 0,838 0,835
REC2 1,359 1,315 1,362 1,362 1,343
REC3 1,837 1,893 1,877 1,911 1,867
-0.05
-0.04
-0.03
-0.02
-0.01
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
IMP 2 IMP 4 REC 1 REC 2 REC 3
Con
cent
ratie
(mg/
ml)
Figuur 4.9: Puntdiagram, verschil tussen de meetresultaten en het
gemiddelde.
- 26/55 -
De maximale afwijking tegenover het gemiddelde, van de 5 metingen per
staal die voorkomt in het puntdiagram (Figuur 4.9), is 0,04 mg/ml met
daarbij een gelijkmatige verdeling van zowel positieve als negatieve
waarden. De Grubb’s-Test bevestigt dat er geen uitschieters zijn.
Figuur 4.10 toont de procentuele terugvinding van elk staal tegenover de
doelwaarde, voorgesteld door de 100% lijn. Verder zijn ook voor elk staal
de bijhorende betrouwbaarheidslimieten weergegeven, berekend met
Formule 4.2.
CI=±t(0.1,4) × SD/√5 (Formule 4.2)
IMP 2IMP 4 REC 1 REC 2 REC 3
90
95
100
105
110
Bovenste 5% betrouwbaarheidslimiet
Onderste 5% betrouwbaarheidslimiet
Figuur 4.10: Procentuele terugvinding per staal samen met de 5%
limiet
Alle punten liggen boven de target waarde. Geen enkele foutenvlag en
bijgevolg ook geen enkele betrouwbaarheidslimiet overschrijdt de 5%
specificatielimiet.
De methode voldoet aan de vooropgestelde specificaties en mag dus
aanvaard worden.
- 27/55 -
4.1.4 Aantoonbaarheidsgrens
De LoD wordt bepaald volgens een algemeen model waarbij een staal met
een S/N van ongeveer 6 gedurende 20 verschillende dagen eenmaal wordt
gemeten.
Tabel 4.7: Resultaten van het
aantoonbaarheidsexperiment
De meerderheid van de waarden in het puntdiagram liggen mooi
gegroepeerd, de marginale waarden zijn evenwichtig verdeeld aan beide
zijden. Er is geen indicatie voor een uitschieter, de Grubb’s-test is
negatief.
Dag Concentratie
(mg/ml)
1 0,036 2 0,026 3 0,026 4 0,033 5 0,034 6 0,028 7 0,030 8 0,031 9 0,029 10 0,031 11 0,029 12 0,028 13 0,029 14 0,029 15 0,030 16 0,030 17 0,029 18 0,032 19 0,030 20 0,030
0.02
0.03
0.03
0.04
0.04
LoD
Con
cent
ratie
(mg/
ml)
Figuur 4.11: Puntdiagram
van de resultaten
- 28/55 -
De LoD is 0,0376 mg/ml, berekend met Formule 4.3. De data hebben een
gemiddelde van 0,0300 mg/ml met een SD van 0,0023 mg/ml. Daaruit
werd met behulp van Formule 4.4 de bovenste grens van het 95%
betrouwbaarheidsinterval rond het gemiddelde (UCL) bepaald (0,0390
mg/ml).
LoD=Gemiddelde + 3.3×SD (Formule 4.3)
UCL=Gemiddelde + t(0.1,19)*SD/√(n) (Formule 4.4)
De UCL (0,0390 mg/ml) ligt boven de specificatie van 0,0300 mg/ml voor
de LoD, de prestatiekenmerken van de methode voldoen niet.
4.1.5 Methodevergelijking
Voor de methodevergelijking wordt een dataset gebruikt, gemeten door
Dr. K. Van Uytfanghe. De bepaling van DNOP gebeurde met GC/MS als
referentiemethode en GC/TQD als routinemethode. De limieten voor de
systematische fout (SE) en totale fout (TE) zijn respectievelijk 2,2% en
6,9%.
- 29/55 -
Tabel 4.8: Opgegeven dataset voor de methodevergelijking
Referentie Routine Referentie Routine Referentie Routine Referentie Routine Concentratie DNOP (mg/ml)
3,365 3,244 8,127 9,164 13,11 13,54 16,08 15,77 3,389 3,469 8,352 8,364 13,42 13,84 16,95 16,65 4,152 4,655 8,847 9,723 13,54 13,27 17,33 15,19 4,374 4,500 9,544 10,20 13,56 11,71 17,34 15,67 4,647 4,654 9,812 9,234 13,69 13,15 17,68 17,81 4,764 4,445 9,944 10,38 13,93 15,39 17,79 18,32 4,967 5,071 10,31 11,05 14,38 14,49 17,86 20,00 5,322 5,486 10,42 10,66 14,39 14,08 18,85 21,72 5,566 5,442 10,52 10,11 14,52 14,84 18,88 18,24 5,793 6,305 10,74 11,61 14,78 14,32 19,07 19,57 6,291 6,065 11,25 10,20 14,83 14,76 19,16 18,89 6,416 6,799 11,54 10,63 14,87 15,54 19,59 18,57 6,422 5,817 12,13 13,65 14,91 16,33 19,71 17,28 6,468 6,740 12,23 11,90 14,94 14,11 19,88 19,59 6,525 6,658 12,40 11,26 14,94 16,75 19,92 19,88 6,914 6,528 12,55 12,68 14,94 14,80 20,68 20,39 7,307 6,332 12,59 14,38 15,40 16,14 20,90 20,78 7,482 7,861 12,63 11,83 15,45 15,16 21,35 21,82 7,739 7,820 12,95 12,71 15,46 14,62 21,92 23,62 7,888 7,678 13,07 12,61 15,52 14,05 21,93 22,43
Ter controle van de dataset wordt eerst een Grubb’s test uitgevoerd op de
absolute verschillen tussen routine-en referentiemethode. Aangezien deze
geen uitschieter aantoont mag de volledige dataset gebruikt worden voor
verdere berekeningen.
Het gemiddeld verschil, zowel absoluut als relatief, wordt samen met het
95% betrouwbaarheidsinterval (CI) voor dataset berekend (Formule 4.5).
Het CI van het 1,96SD centiel werd berekend met Formule 4.6.
CI(gemiddelde)=±t(0.1,79) × SDverschil/√(80) (Formule 4.5)
CI(1.96SD centiel)=±t(0.1,79)×√[(SD²/80) + (1.96²×SD²/2×80)]
=1.71 × CI(gemiddelde) (Formule 4.6)
- 30/55 -
Tabel 4.9: Samenvatting van alle statistische berekeningen uitgevoerd op
de dataset voor methodevergelijking
GemiddeldeReferentie 12,61 Eenzijdig 95% betrouwbaarheidsinterval
GemiddeldeRoutine 12,64 Plus CI Min CI CI
Gemiddeld verschil (%) 0,35 1,60 -0,90 1,251
1,96*CVverschil 13,17
Gemiddelde+1,96*CVverschil 13,53 15,66 11,39 2,139
Gemiddelde-1,96*CVverschil -12,82 -10,68 -14,96
Tabel 4.9 vat de resultaten samen. De absolute waarden voor het
gemiddeld verschil (%) en bijhorende betrouwbaarheidsinterval, die
representatief zijn voor de SE, vallen binnen diens limiet van 2,2%. De TE
wordt vergeleken met het 1,96CVverschil en zijn betrouwbaarheidsinterval,
er is een 6,9% limiet gesteld. De absolute waarden uit Tabel 4.9 geven
aan dat hieraan niet voldaan wordt, visueel wordt dit bevestigd door
Figuur 4.12.
- 31/55 -
De routinemethode voor de bepaling van glucose wordt niet geschikt
bevonden op basis van de Bland & Altman plot.
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
0 5 10 15 20 25
GC/MS (mg/ml)
Mean Diff. ±1,96 CVdiff. ±95% CL's
SE limit TE limit
Rou
tine
- GC
/TQ
D
Figuur 4.12: Bland & Altman plot, gemiddeld verschil (%) tussen de
routine-en referentiemethode
Bijkomend werden de data geëvalueerd via regressieanalyse. Hierbij
worden de routinedata uitgezet tegenover de referentiedata. Zijn beide
methoden vergelijkbaar dan zal de trendlijn lineair zijn en een helling en
intercept hebben die 1 en 0 benaderen. De minimale en maximale X-
waarde, respectievelijk de voorspelde Y-waarde en
betrouwbaarheidslimieten werden berekend en samengevat in Tabel 4.10
en Tabel 4.11.
- 32/55 -
Tabel 4.10: Resultaten van de regressieanalyse op basis van de maximale
X-waarde
Minimum
X
Voorspelde
Y
CI
(Trendlijn)
Limiet
SE=2,2%
Voorspelde
Y+CL
Voorspelde
Y-CL
3,365 3,420 0,354 3,774 3,066
Δ(%) SE 12,154 -8,896
Minimum
Y
CI
(Punt)
Limiet
TE=6,9%
Voorspelde
Y+CL
Berekende
Y-CL
3,244 1,564 4,984 1,857
Δ(%) TE 48,091 -44,833
Tabel 4.11: Resultaten van de regressieanalyse op basis van de minimale
X-waarde
Maximum
X
Voorspelde
Y
CI
(Trendlijn)
Limiet
SE=2,2%
Voorspelde
Y+CL
Voorspelde
Y-CL
21,925 21,916 0,356 22,272 21,560
Δ(%) SE 1,584 -1,664
Maximum
Y
CI
(Punt)
Limiet
TE=6.9%
Voorspelde
Y+CL
Voorspelde
Y-CL
23,924 1,564 23,480 20,352
Δ(%) TE 7,093 -7,173
De berekende betrouwbaarheidslimieten voor de minimale X-waarde
overschrijden, zowel voor de SE als de TE, ruim de vooropgestelde
specificaties. De specificaties voor de betrouwbaarheidslimieten bij de
maximale X-waarde worden voor de SE gehaald, echter niet voor de TE.
- 33/55 -
De afwijkingen tegenover de SE en TE zijn groter bij de minimale X-
waarde dan bij de maximale X-waarde. Het uitgebreide interval tussen de
lage en hoge meetwaarden zorgt er mee voor dat de procentuele afwijking
van de minimale X-waarde (=een referentiewaarde) tegenover de
betrouwbaarheidslimieten van de voorspelde Y-waarde (=op basis van de
bekomen regressielijn) groter zal zijn.
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
0 5 10 15 20 25Referentie (mgl/ml)
Res
idua
ls (m
g/m
l)
Figuur 4.13: Residueplot, absoluut verschil tussen de referentie-en
routinemethode
Op Figuur 4.13 is duidelijk een trechtervormige curve te zien. De SD is
niet constant en wordt groter bij een stijgende concentratie, een
concentratieafhankelijke fout.
- 34/55 -
De eindconclusie voor de methodevalidatie zal getrokken worden op basis
van de regressieanalyse aangezien een concentratieafhankelijke fout werd
vastgesteld en de Bland & Altman plot dan best wordt vermeden.
y = 0.9966x + 0.0664R2 = 0.969
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20 25Referentie (mg/ml)
TE Linear (Data)
Rou
tine
(mg/
ml)
Figuur 4.14: Regressieanalyse
De specificaties voor de betrouwbaarheidslimieten bij de maximale X-
waarde worden voor de SE als enige gehaald. We vinden de getestte
routinemethode dus ongeschikt aangezien 3 van de 4 controlepunten de
limiet overschreden.
- 35/55 -
4.1.6 Besluit experimenteel onderzoek
Tabel 4.12: Resultaten methodevalidatie
EXPERIMENT SPECIFICATIE
Lineariteit NIET VOLDAAN
Imprecisie VOLDAAN
Terugvinding VOLDAAN
Aantoonbaarheidsgrens NIET VOLDAAN
Methodevergelijking NIET VOLDAAN
De resultaten van de uitgevoerde experimenten werden samengevat in
Tabel 4.12. Het imprecisie-experiment en het terugvindingsexperiment
voldoen aan hun vooropgestelde specificatie. Bij het lineariteits-
experiment, de aantoonbaarheidsgrens en de methodevergelijking werd
deze niet gehaald. Aangezien 3 van de 5 experimenten de specificatie
overschreden, voldoet de methode hieraan ook niet. Bijgevolg wordt de
methode niet geschikt bevonden voor de bepaling van DNOP.
4.2 Literatuurstudie
Het uitvoeren van een literatuurstudie heeft de bedoeling bekwaamheid
bij te brengen in het zoeken naar specifieke informatie. De gehanteerde
techniek vereist de juiste vraagstelling, het gebruik van de goede
trefwoorden en een kritische houding tegenover de verworven informatie.
De studie heeft als doel het onderwerp van deze masterproef in een
breder perspectief te bekijken. Het opzoeken van alternatieve
analysemethoden voor ftalaten en het gebruik van ftalaten in de
farmaceutische industrie sluiten als thema rechtstreeks aan bij het
onderwerp van de masterproef. Het derde thema handelt over de validatie
van analytische methoden in het domein van het milieu.
- 36/55 -
Tabel 4.13: Voorbeelden van gehanteerde zoektermen, werkwijzen,
gebruikte limieten en het aantal resultaten.
Database Title And Title AND Topic Refine Results
Phthalate Validation 5
Phthalate Method 48
Phthalate Review 45
Phthalate Analysis 98
Phthalate Solid Phase Extraction
66
Phthalate Determination 148
Phthalate Method Validation 9
Phthalate GC 9
Phthalate MS 16
Phthalate LC 9
Phthalate Packaging 18
Phthalate Pharmaceutical 20
Phthalate Excipiënt 8
Phthalate Use 30
Phthalate Environment 101
Phthalate Environment Review 5
Phthalate Detector 27
Plasticizer Biodegradation 16
Plasticizer Phthalate 186
Di-n-octyl phthalate 73
Di-n-octyl phthalate Review 4
"Method Validation" 304
"Method Validation" Review 10
"Method Validation" Guidelines 32
Protocol "Method Validation" 17
Method Validation Environmental 44
Web Of Science
Validation Guidelines Analytical Methods 19
"Method Validation" Environment 6 IUPAC
"Method Validation" Procedures 13
Phthalate Guidelines 4 Google Scholar
Phthalate Method OR Validation 89
http://europa.eu/index_nl.htm Ftalaten 58
- 37/55 -
4.2.1 Analysemethoden voor ftalaten
4.2.1.1 Staalvoorbereiding
“Een groot probleem in de analyse van milieustalen is de vermindering
van achtergrond contaminatie tot op een lager niveau dan meestal
aanwezig in de stalen (parts per billion). Dit probleem stelt zich meer bij
ftalaten dan bij andere verontreinigende stoffen aangezien ftalaten
aanwezig zijn in bijna alle materiaal en reagentia die gebruikt worden in
een laboratorium” (Fatoki & Noma, 2000).
Er moet veel aandacht besteed worden aan de preventie van contaminatie
van stalen, wat het grootste probleem is bij ftalaatanalyse (Aries et al.,
2004).
LLE (vloeistof-vloeistof extractie) en SPE (vaste-fase extractie) worden
algemeen toegepast voor de bepaling van ftalaten in waterige stalen. Het
USEPA heeft reeds verschillende technieken gepubliceerd voor de bepaling
van ftalaten in afvalwater gebaseerd op deze technieken. Doch zijn deze
methoden duur, tijdrovend en bevorderen ze contaminatierisico’s. De
laatste jaren echter heeft SPME (vaste-fase microextractie) aan belang
gewonnen voor de analyse van semivluchtige componenten, alsook
ftalaten. Deze techniek is een goed alternatief voor de bepaling van
ftalaten in waterige stalen aangezien het risico op contaminatie significant
kan beperkt worden tijdens de staal bewerking (Polo et al., 2005).
SPME is een eenvoudige, snelle en efficiënte staalvoorbereidingstechniek,
die bovendien zonder solvent werkt en toelaat om ftalaatesters te bepalen
bij lage concentraties. Recent gaat ook meer aandacht naar LPME
(vloeistof-fase microextractie) dankzij de goedkope apparatuur, praktisch
elimineren van solventen en combinatie van extractie, aanconcentreren en
staalintroductie in één stap (Pei Liang et al., 2008).
- 38/55 -
4.2.1.2 Chromatografie en detectoren
Uit de gevonden literatuur kunnen we afleiden dat staalvoorbereiding de
belangrijkste stap is bij de bepaling van ftalaten, voor de scheiding en
detectie ervan komen steeds dezelfde technieken terug. Op de site van
het USEPA worden 2 werkingswijzen voorgesteld: methode 8061A, die
beschrijft de bepaling van ftalaten via gaschromatografie gekoppeld aan
een electron capture detector en methode 606 die ook met
gaschromatografie werkt echter met een massaspectrometer als detector.
Tijdens mijn literatuuronderzoek heb ik geen documentatie teruggevonden
over dewelke nu de ideale techniek is voor de bepaling van ftalaten. De
verschillende artikels overlopend, kwamen dezelfde methoden echter
constant terug. Scheiding gebeurt via gas-of vloeistofchromatografie,
hieronder staan voor elke techniek de meest voorkomende detectoren.
Gaschromatografie met als detector:
- Massaspectrometer: Peñalver et al. (2000), Del Carlo et al. (2008),
Farahani et al. (2007), Ballesteros et al. (2006), Cortazar et al.
(2002), Mohamed & Amar( 2008), USEPA methode 606
- Electron capture detector: Prokupkovád et al. (2002), USEPA
methode 8061A
- Vlamionisatiedetector: Jing Xu et al. (2007)
(Hoge druk) vloeistofchromatografie met als detector:
- UV detector: Pei Liang et al. (2008), Cai et al. (2003)
- Tandem massaspectrometer: Mortensen et al.(2005), Silva et al.
(2007)
- 39/55 -
4.2.2 Betekenis van ftalaten in de farmaceutische context?
Ftalaten worden vooral als weekmakers gebruikt, dus ook in medische
materialen zoals verpakkingen, buisjes en apparaten. Daarnaast werd
opgezocht waar ftalaten dienen als excipiënt of zelfs als actief ingrediënt
(Remon, 2001).
Enterische omhulling werd als enige toepassing in farmaceutische
bereidingen teruggevonden, als bescherming van sommige
geneesmiddelen tegen de zure pH in de maag of de afbraak ervan door
maagenzymen. Anderzijds kan het irriterende geneesmiddelen ook
verhinderen de maagwand aan te tasten. Een filmcoating maakt dat de
capsulewand maagsapresistent is, waardoor deze pas oplost in de dunne
darm en daar kan geresorbeerd worden.
De filmomhullingsmiddelen bestaan voornamelijk uit polymeren naast
pigmenten, weekmakers en viscositeitsverhogers. In de practicumcursus
(Remon, 2001) worden twee componenten vermeld die ftalaten bevatten.
- Cellulose-acetoftalaat (CAP): een cellulosepolymeer waarvan de
hydroxylfuncties veresterd zijn met ftalaatzuur waardoor het
onoplosbaar is in zuur milieu. Bij overgang van maag naar dunne
darm stijgt de pH en worden de ester-en zuurfuncties geïoniseerd
waardoor ook de oplosbaarheid stijgt.
- Diëthylftalaat: zorgt als weekmaker voor een elastische film die niet
barst of broos wordt.
Therapeutisch zijn er onderzoeken die microbicide activiteit van CAP
rapporteren tegen sexueel overdraagbare pathogen zoals het HIV-1
retrovirus. Deze resultaten ondersteunen het mogelijke gebruik van CAP
als topische behandeling van sexueel overdraagbare aandoeningen
(SOA’s) (Fengl et al., 2002).
“CAP is een veelbelovende microbicide agens voor de preventie van
infectia met SOA pathogenen, alsook voor HIV-1 (Neurath et al., 2002).”
- 40/55 -
DEHP is het potenste ftalaat, dit is gebleken uit verscheidene
toxicologische studies, alsook het meest gebruikt in medische materialen
zoals buisjes en infuuszakken. Logischerwijze is de blootstelling bij
patiënten die langdurig medische behandelingen zoals dialyse ondergaan
of een infuus krijgen veel groter. (Kamrin, 2009)
“Doch is er geen bewijs voorhanden dat er reeds effecten zijn opgetreden
of dit aannemelijk is voor te komen bij volwassenen en kinderen als
resultaat van een intensieve medische bedandeling (Kamrin, 2009).”
Ftalaten vinden ook toepassingen in cosmetica zoals nagellak en
verschillende shampoo’s, hier werd niet verder op ingegaan.
4.2.3 Validatie van analytische methoden in het domein van het milieu
Eerst werd in de databank Web of Science gezocht naar een review over
methodevalidatie. De review “Method validation across the disciplines—
Critical investigation of major validation criteria and associated
experimental protocols” (Stöckl et al., 2009) werd gebruikt als leidraad
om verdere informatie op te zoeken. De literatuurlijst werd gecontroleerd
op regelgevende instanties en bruikbare referenties. We vonden het US
Environmental Protection Agency (USEPA) samen met de documenten
“Guidance for methods validation for the Resource Conservation and
Recovery Act (RSCA) program” (USEPA, 1995) en “Method 8000C”
(USEPA, 2003, derde revisie), die opgezocht werden op de site van het
USEPA (www.epa.gov).
Richtlijnen voor validatie van analytische methoden in het domein van het
milieu staan beschreven in het “Guidance for methods validation for the
RSCA-program”. De prestatiekenmerken, protocollen en specificaties
beschreven in het “RSCA-program” en “Method 8000C” staan samengevat
in Tabel 4.14.
- 41/55 -
Tabel 4.14: Prestatiekenmerken, protocollen en specificaties beschreven
in het RSCA-program en *Method 8000C
PRESTATIEKENMERKEN PROTOCOL SPECIFICATIES
Lineariteit Geen N gegeven r≥0,99*
Precisie
5 en 50 keer LoQ in 3
matrices
N=7
≤15% op lange termijn
≤20% terugvinding
duplicaten
Juistheid
5 en 50 keer LoQ in 3
matrices
N=7
≤20%
Aantoonbaarheidsgrens
(LoD)
Stalen met lage
concentratie
N=7
Bepaalbaarheidsgrens
(LoQ)
Stalen met lage
concentratie
N=7
4×LoD
Op Google (www.google.com) werd verder gezocht naar Belgische
instanties aangezien er geen vermeld staan in de literatuurlijst van de
review. We vonden de Vlaamse Instelling voor Technologisch Onderzoek
(VITO) met op hun site (www.vito.be) het document “Compendium voor
Monstername en Analyse” (CMA) dat de validatie van analytische
methoden in het domein van het milieu beschrijft. De prestatiekenmerken,
protocollen en specificaties beschreven in CMA/6/A (Validatie,
Prestatiekenmerken, 2008) staan samengevat in Tabel 4.15.
- 42/55 -
Tabel 4.15: Prestatiekenmerken, protocollen en specificaties beschreven
in CMA/6/A
PRESTATIEKENMERKEN PROTOCOL SPECIFICATIES
Precisie
Meervoudige analyse van
hetzelfde monsterb:
N=1, 5 analysen
Duplo-analyse van
verschillende monstersb:
N≥5, analysen in duplo
met voorkeur voor
verschillende dagen
Duplo-analyse van
verschillende monstersa:
N≥5, analysen in duplo
Juistheid
Meervoudige analyse van
een referentiemateriaala:
N=1, 5 analysen
Terugvindingsexperimenten
op een geselecteerd
monstera: N≥10
deelmonsters, 5 paren
analysen
Selectiviteit en
robuustheid
Verschillende deelmonsters
met toenemende
concentratieb
Verhouding tussen
reproduceerbaarheid
en herhaalbaarheid:
maat voor de
robuustheid
(ideaal=1)
Lineariteit en
modelafwijking
N≥6 (concentraties
gespreid over ganse
werkgebied), analysen in
drievoud
- 43/55 -
Tabel 4.15 (vervolg):Prestatiekenmerken, protocollen en specificaties
beschreven in CMA/6/A
PRESTATIEKENMERKEN PROTOCOL SPECIFICATIES
Werkgebied
Ondergrens ≥
bepalingsgrens en
binnen het
lineariteitsgebied
Rapportagegrens:
waarde beneden welke
een component als niet
kwantificeerbaar wordt
gerapporteerd, is
hoogstens een vijfde
van de toetsingswaarde
voor de gemeten
monsters
LoD en LoQ
Meervoudige analyse
van praktijkmonster
met laag gehaltea,b:
N≥5
Duploanalyse van
verschillende praktijk-
monsters met laag
gehalte:
N≥5 (verschillend),
analysen in duplo (niet
op dezelfde dag),
geheel gespreid over
evenveel dagen als het
aantal monsterparen
S/R voor verschillende
praktijkmonsters met
laag gehaltea:
N≥5
Aantoonbaarheidsgrens:
3×standaardafwijking
Bepalingsgrens:
6×standaardafwijking
aReproduceerbaarheidsvoorwaarden: uitvoering van de metingen onder
variabele omstandigheden, dit wil zeggen in verschillende
- 44/55 -
laboratoriumruimten, door verschillende analisten, met verschillende
apparaten en batches reagentia/standaarden, op verschillende tijdstippen
met grotere tussenpozen (ISO 3534-1) bHerhaalbaarheidsvoorwaarden: uitvoering van alle betreffende metingen
door dezelfde analist, met dezelfde meetapparatuur, op zo dicht mogelijke
bij elkaar gelegen tijdstippen (ISO 3534 -1)
- 45/55 -
5. LITERATUURLIJST
- Aries, E.; Anderson, D. R.; Ordsmith, N.; Hall, K.; Fisher, R. (2004).
Development and validation of a method for analysis of ‘‘dioxin-like’’ PCBs
in environmental samples from the steel industry. Chemosphere. 54, 23-
31
- Ballesteros, O.; Zafra A.; Navalon, A.; Vilchez, J. L. (2006). Sensitive
gas chromatographic–mass spectrometric method for the determination of
phthalate esters, alkylphenols, bisphenol A and their chlorinated
derivatives in wastewater samples. J. Chromatogr. A. 1121, 154–162
- Cai, Y.; Jiang, G.; Liu, J. (2003) Solid-Phase Microextraction Coupled
with High Performance Liquid Chromatography–UV Detection for the
Determination of Di-n-Propyl-phthalate, Di-iso-Butyl-phthalate and Di-
Cyclohexyl-phthalate in Environmental Water Samples. Anal. Lett. 36:2,
389–404
- Chandran, S.; Singh, R. S. P. (2007). Comparison of various
international guidelines for analytical method validation. Pharmazie. 62,
4–14
- Compendium voor Monstername en Analyse, Deel 6 Validatie,
Prestatiekenmerken (CMA/6/A), VITO, België, 2008
- Cortazar, E.; Zuloaga, O.; Sanz, J.; Raposo, J. C.; Etxebarria, N.;
Fernàndez L. A. (2002). MultiSimplex optimisation of the solid-phase
microextraction–gas chromatographic–mass spectrometric determination
of polycyclic aromatic hydrocarbons, polychlorinated biphenyls and
phthalates from water samples. J. Chromatogr. A. 978, 165–175
- Del Carlo, M; Pepe, A.; Sacchetti, G.; Compagnone, D.; Mastrocola, D.;
Cichelli, A. (2008). Determination of phthalate esters in wine using solid-
phase extraction and gas chromatography–mass spectrometry. Food.
Chem. 111, 771–777
- EPA Method 606, Methods For Organic Chemical Analysis Of Municipal
And Industrial Wastewater. EPA, Washington, DC, 1996.
- 46/55 -
- EPA Method 8061A, Phthalate Esters By Chromatography With Electron
Capture Detection (GC/ECD). EPA, Washington, DC, 1996.
EPA Method 8000C, Determinative Chromatographic Separations (Revision
3). EPA, Washington, DC, 2003.
- Farahani, H.; Norouzi, P.; Dinarvand, R.; Ganjali, M. R. (2007).
Development of dispersive liquid–liquid microextraction combined with
gas chromatography–mass spectrometry as a simple, rapid and highly
sensitive method for the determination of phthalate esters in water
samples. J. Chromatogr. A. 1172, 105–112
- Fatoki, O. S.; Noma, A. (2000). Solid phase extraction method for
selective determination of phthalate esters in the aquatic environment.
Kluwer Academic Publ. 140, 85-98
- Guidance for Methods Development and Methods Validation for the
Resource Conservation and Recovery Act (RCRA) Program (SW-846
methods), EPA, Washington, DC, 1995.
- Kamrin, M. A. (2009). Phthalate Risks, Phthalate Regulation, and Public
Health: A Review. J. Toxicol. Env. Heal. B. 12:2, 157 — 174
- Kavlock, R.; Boekelheide, K.; Chapin, R.; Cunningham, M.; Faustman,
E.; Foster, P.; Golub, M.; Henderson, R.; Hinberg, I.; Little, R.; Seed, J.;
Shea, K.; Tabacova, S.; Tyl, R.; Williams, P.; Zacharewski, T. (2002). NTP
Center for the Evaluation of Risks to Human Reproduction: phthalates
expert panel report on the reproductive and developmental toxicity of di-
n-octyl phthalate. Reprod. Toxicol. 16, 721–734
- Koninklijk besluit tot wijziging van het koninklijk besluit van 25
februari 1996 tot beperking van het op de markt brengen en van het
gebruik van bepaalde gevaarlijke stoffen en preparaten, omzetting van de
- Europese Richtlijn 2005/84/EG en 76/769/EEG, België, 2006
- Liang, P.; Xu, J.; Li, Q. (2008). Application of dispersive liquid–liquid
microextraction and high-performance liquid chromatography for the
determination of three phthalate esters in water samples. Analyst. 609,
53–58
- 47/55 -
- Lorz, P. M.; Towae, F. K.; Enke, W.; Jäckh, R.; Bhargava, N.; Hillesheim,
W. (2002). “Phthalic Acid and Derivatives" in Ullmann's Encyclopedia of
Industrial Chemistry. Wiley-VCH, Weinheim, Germany
- Merck Index 11th Edition (1989). Merck & Co., Inc., Whitehouse Station,
NJ, USA
- Mohamed, M. A.; Ammar A. S. (2008). Quantitative Analysis of
Phthalates Plasticizers in Traditional Egyption Foods (Koushary and Foul
Medams), Black Tea, Instant Coffee and Bottled Waters by Solid Phase
Extraction-Capillary Gas Chromatography-Mass Spectroscopy. American
Journal of Food Technology, 3(5), 341-346
- Mortensen, G. K.; Main, K. M. ; Andersson, A.; Leffers, H.; Skakkebæk,
N. E. (2005). Determination of phthalate monoesters in human milk,
consumer milk and infant formula by tandem mass spectrometry (LC–MS–
MS). Anal. Bioanal. Chem. 382, 1084–1092
- Neurath, R. A.; Strick, N.; Jiang, S.; Li Y.;Debnath, A. K. (2002). Anti-
HIV-1 activity of cellulose acetate phthalate: Synergy with soluble CD4
and induction of "dead-end" gp41 six-helix bundles. BMC Infectious
Diseases. 2:6, 1-13
- Peñalver, A.; Pocurull, E.; Borrull, F.; Marcé, R. M. (2000).
Determination of phthalate esters in water samples by solid-phase
microextraction and gas chromatography with mass spectrometric
detection. J. Chromatogr. A. 872, 191–201
- Prokupková, G.; Holadová, K.; Poustka, J.; Hajšlová, J. (2002)
Development of a solid-phase microextraction method for the
determination of phthalic acid esters in water. Analyst. 457, 211–223
- Polo, M.; Llompart, M.; Garcia-Jares, C.; Cela, R. (2005). Multivariate
optimization of a solid-phase microextraction method for the analysis of
phthalate esters in environmental waters. J. Chromatogr. A. 1072, 63–72
- Remon, J. P. (2001). Handleiding bij het uitvoeren van magistrale
bereidingen. Academia Press, Ghent, Belgium
-Schettler, T. (2005). Human exposure to phthalates via consumer
products. Int. J. Androl. 29, 134-139
- 48/55 -
- Silva, M. J.; Samandar, E.; Preau, J. L. J.; Reidy, J. A.; Needham, L. L.;
Calafat, A. M. (2007). Quantification of 22 phthalate metabolites in
human urine. J. Chromatogr. B. 860, 106–112
- Silva, M. J.; Preau, J. L. Jr.; Needham, L. L.; Calafat, A. M. (2008) Cross
validation and ruggedness testing of analytical methods used for the
quantification of urinary phthalate metabolites. J. Chromatogr. B, 873,
180–186
- Stöckl, D. (2007). Laboratory Statistics & Grapics with Excel®, STT
Consulting, Horebeke, Belgium
- Stöckl, D. (2007). Method validation With Confidence. STT Consulting,
Horebeke, Belgium
- Stöckl, D.; D’Hondt, H.; Thienpont, L.M. (2009). Method validation
across the disciplines—Critical investigation of major validation criteria
and associated experimental protocols. J. Chromatogr. B.
doi:10.1016/j.jchromb.2008.12.056
- Xu, J.; Liang, P.; Zhang, T. (2007). Dynamic liquid-phase
microextraction of three phthalate esters from water samples and
determination by gas chromatography. Analyst. 597, 1–5
- 49/55 -
Top Related