HEMOFILIA A
Giselle Martins Pinto
Nelson Gianni de Lima
Rafael Domingos Grando
Lisiane Machado
Luciana Mendes Johann
Introdução
• Doença de grande interesse médico, científico e público
• Freqüente distúrbio hereditário da coagulação
• Causada por: ausência, deficiência severa ou defeitos na função do fator VIII da coagulação
Dados Históricos
• Relatos antigos presentes no Talmud sugerem seu padrão de herança há aproximadamente 2000 anos
• “perda de sangue” x “retenção de sangue”
• Em 1803, Otto descreveu seu padrão de herança numa família de New Hampshire
Dados Históricos• A Hemofilia ficou conhecida
como “doença Real” por seu aparecimento entre os filhos da Rainha Victoria, da Grã-Bretanha
• Se disseminou às famílias reais européias através dos descendentes da Rainha Victoria
• Hemofilia A ou Hemofilia B?
Definição
• A hemofilia A é uma doença hereditária recessiva ligada ao cromossomo X que ocorre devido à deficiência do fator VIII da coagulação ou a defeitos estruturais em suas moléculas
• Distúrbio clinicamente heterogêneo devido à quantidade de defeitos diferentes no gene do fator VIII
Epidemiologia
• É uma doença que não respeita limites étnicos ou geográficos
• É a principal causa de sangramentos severos e a segunda principal causa de todos os distúrbios congênitos que causam sangramentos, ficando atrás somente da doença de von Willebrand
Epidemiologia• Incidência aproximada:
- 1 em cada 5000 crianças do sexo masculino
- em mulheres, é de 1 para cada 25.000.000
Padrão de Herança
Doença recessiva
ligada ao cromossomo X
Padrão de Herança
• Expressa-se em todos os homens que a recebem, mas apenas nas mulheres homozigóticas para a mutação
• O homem afetado transmite o gene para todas as suas filhas
• Mulheres carreadoras têm aproximadamente 50% de chance de transmitir os genes para seus filhos
• O gene jamais se transmite diretamente do pai para o filho
• Aproximadamente 30% dos casos decorrem de mutações novas
Padrão de Herança
• Mulheres afetadas:- Homozigóticas recessivas- Hemizigóticas para a mutação do fator
VIII, como resultado de inativação desigual do cromossomo X (defeito na Lyonização)
• Alguns casos:- Mulheres com síndrome de Turner- Casos de mosaicismo do cromossomo X
Apresentação Clínica
• Ocorre nas seguintes formas – Leve: 31%*– Moderada: 26%*– Severa: 43%*
*Soucie, J. M.; Evatt, B.; Jackson, D.; Hemophilia Surveillance System Project
Investigators : Occurrence of hemophilia in the United States. Am. J. Hemat. 59: 288-294,
1998.
Apresentação ClínicaClassificação Nível de Fator VIII
(ativo)Achados Clínicos
Severa Até 1% do normal Hemorragias e hemartroses
espontâneas, requerindo reposição de fator VIII.
Moderada 2-5% do normal Hemorragias secundárias a traumas ou cirurgias.
Leve 6-30% do normal Hemorragias secundárias a traumas ou cirurgias,
raras hemorragias espontâneas.
Hemartrose
Hematoma
Hematoma do ílio-psoas
Outros Achados
• Pseudotumores
• Hematúria
• Complicações neurológicas
• Hemorragias em mucosas
• Sangramentos pós-cirúrgicos
Hemorragia Intracraniana
Papel do Fator VIII na Coagulação Sangüínea
Hemostasia
• Espasmo Vascular
• Formação do tampão plaquetário
• Formação do coágulo sangüíneo
• Organização fibrosa
• Dissolução da crase sangüínea
Via Intrínseca
• Inicia com alteração no sangue ou exposição deste ao colágeno do vaso traumatizado
• Fator VIII: cofator na via intrínseca da cascata de coagulação
Complexos Enzimáticos
• Complexo X-ase: fator VIIIa + fator IXa– Ativação do fator X
• Complexo protrombinase ou ativador da protrombina: fator Xa + fator Va
Fator VIII
• Mesmo quando presente em concentrações relativamente baixas no plasma, a função de coagulação é mantida
• Somente uma redução substancial (maior que 70%) leva aos distúrbios sangüíneos característicos da hemofilia A
Fator de von Willebrand
• Circula no plasma com o fator VIII
• Funções:– acentuar a síntese de fator VIII– proteger o fator VIII contra a proteólise– aumentar a concentração do fator VIII no sítio
da lesão vascular
Estrutura do Gene do Fator VIII
Estrutura do Gene do Fator VIII
• O gene está localizado no topo do braço longo do cromossomo X (Xq28)
• 186 kb
• 0,1% da constituição total do X
• 26 éxons
• RNAm de 9kb
Estrutura do Gene do Fator VIII
• 24 éxons variam em comprimento (69 - 263 pares de bases)
• Os maiores éxons são:– éxon 14: 3106 pb– éxon 26: 1958 pb
Estrutura do Gene do Fator VIII
• Íntron 22– separa os éxons 22 e 23– Contém a ilha CpG– Tem 2 transcrições: F8A e F8B– F8B: transcrito na mesma direção que o gene
do fator VIII, usando um éxon próprio mais os éxons 23 a 26 do fator VIII
– F8A: não contém íntrons e é transcrito na direção oposta do gene do fator VIII
Estrutura do Gene do Fator VIII
• Íntron 22– Há duas cópias de F8A adicionas, não
localizadas também no cromossomo X implicadas em quase metade dos casos de hemofilia A severa, via mecanismo de inversão parcial.
The Molecular Pathology of Haemophilia A. Review Article. http://europium.cfc.mrc.ac.uk.
Estrutura do Gene do Fator VIII
• RNAm– codifica um polipeptídeo de 2351 aa, sendo que
19 aa são removidos durante sua secreção.
Hoyer LW. Hemophilia A. N Engl J Med 1994;330:38-47.
Estrutura do Fator VIII
• Contém 3 domínios– domínio A: A1, A2, A3
– domínio B: único e central
– domínio C: C1, C2
Domínio B
• Codificado pelo éxon 14
• Parece exercer a função de conexão
• “Fatores VIII recombinantes, cujo domínio B estava ausente, mantinham sua função relativamente normal, mostrando, portanto, que pode ser dispensável.”
Hoyer LW. Hemophilia A. N Engl J Med 1994;330:38-47.
Domínio B
• O domínio B é clivado, resultando em :– cadeia leve: A3, C1, C2, de 80 kDa– cadeia pesada: A1, A2, de 200 kDa, contém
também parte do domínio B
Ativação do Fator VIII
• Sintetizado como um polipeptídeo de cadeia simples
• Após a síntese é clivado, por protease ainda indefinida
• Torna-se um heterodímero
Ativação do Fator VIII
• Pela ação da trombina ou fator Xa, o fator VIII é clivado nos sítios 372 e 1689 da arginina
• Essa clivagem é essencial para a liberação do fator VIII ligado ao FvW, permitindo que se ligue à superfície fosfolipídica e interaja com o fator IXa
Ativação do Fator VIII
• A clivagem no sítio 372 converte a cadeia pesada em 2 fragmentos: um de 54 kDa e outro de 44 kDa
• A clivagem no sítio 1689, libera um pequeno fragmento da cadeia leve, separando o fator VIII do FvW. Assim o fator VIII fator VIIIa
Fator VIIIa
• É composto pelos seguintes fragmentos:– 54 kDa da cadeia pesada– 44 kDa da cadeia pesada– 72 kDa da cadeia leve
• A etapa limitante na ativação do fator VIII é a clivagem no sítio 372
Fator VIIIa
• Clivagens não essenciais:– sítio 740 da arginina, pela trombina ou fator
Xa– a cadeia pesada torna-se um fragmento de 92
kDa– retira parte do domínio B da cadeia pesada
Desativação do Fator VIII
• A função de cofator do fator VIII é rapidamente perdida:– Pela proteólise molecular que ocorre por
dissociação de suas subunidades.– Pela proteína C ativada
Genética Molecular
Genética Molecular
• Pontos de mutação:– 1/3 dos pontos de mutações que ocorre no gene
do fator VIII estão localizadas no dinucleotídeo CpG (“ponto quente”)
– Sítio da endonuclease de restrição Taq1, que reconhece a seqüência TCGA. Essas mutações são detectadas pela perda deste sítio de clivagem.
The Molecular Pathology of Haemophilia A. Review Article. http://europium.cfc.mrc.ac.uk.
Defeitos Genéticos
1. Rearranjos gênicos2. Substituição de Base Única
– missense: substituição de um único aminoácido– nonsense ou mutação em parada: término prematuro
na cadeia peptídica
3. Deleções– Grandes deleções– Pequenas deleções
4. Inserção
Rearranjos Gênicos
• Consistem basicamente em uma única inversão responsável por mais de 40% de todos os casos de hemofilia A severa.
• Grande inversão e translocação dos éxons 1 a 22, juntamente com os íntrons, com os éxons 23 a 26
• Mecanismo: recombinação homóloga entre F8A e uma cópia extragênica de F8A
Rearranjos Gênicos
• Conseqüência: remoção da terminação C da proteína codificada pelos éxons 23-26, ocasionando uma perda completa na função deste fator
• Detecção: Southern blotting (enzima de restrição BclI e gene A como probe)
Rearranjos Gênicos
• 35% dos casos de hemofilia A severa é pela inversão com a cópia distal de F8A
• 7% dos casos de hemofilia A severa é pela inversão com a cópia proximal de F8A
The Molecular Pathology of Haemophilia A. Review Article. http://europium.cfc.mrc.ac.uk.
Rearranjos Gênicos
• Origem: quase exclusivamente é proveniente de um único erro no crossing-over durante a meiose espermatogênica de um homem normal
• Conclusão:– Gera mulheres carreadoras desta mutação, mas
sem história familiar de hemofilia A– mais de 40% dos casos de hemofilia A severa
não têm história familiar
Substituição de Base Única
• Há aproximadamente 309 tipos– 85% são mutações missense– 14% são mutações nonsense– 1% o splicing do RNAm está alterado ou
ausente
• Nos “pontos quentes” o códon do aa arginina (CGA, CGC, CGG) é freqüentemente afetado por mutações
Substituição de única base
• Missense: fenótipos variados
• Nonsense: levam a hemofilia A severa, por formar uma molécula de fator VIII truncado
Deleções
• 5% dos casos de hemofilia
• Frequëntemente associado à hemofilia A severa
• Ocorre tanto nas células germinativas femininas quanto nas masculinas
Grandes Deleções
• Deleções desde 1kb até mais de 210 kb
• Mecanismo mais provável: recombinação não-homóloga dos cromossomos na meiose I
• 5% dos casos de hemofilia A severa
• Doença moderada: resultado do splicing do RNAm que deleta o éxon 22 e os éxons 23-24
• Alto risco para desenvolvimento de inibidores.
Pequenas Deleções
• Variam desde 1 a 86 pares de bases distribuídos pelos éxons.
• Associadas a doença severa e moderada
• A maioria são mutações do tipo frameshift
Inserções
• Variam em tamanho de 1 par de bases a 2,1 kb
• Todas associadas a doença severa
• Inserção L1 (LINE 1) similaridade ao DNA da transcriptase reversa retroviral
Diagnóstico Clínico
• Sangramentos– Articulações– Músculos– TGI
• Hemorragias espontâneas
Diagnóstico Laboratorial
TTPA
• Plaquetas, TP, tempo de sangramento normais
• FvW normal
Diagnóstico Genético
• Mutações de base única PCR + seqüenciamento• Inversões Southern blotting (probe F8A)• Deleções
– Grandes deleções Southern blotting
– Pequenas deleções PCR + seqüenciamento
• Inserções Southern blotting
Diagnóstico Diferencial
• Hemofilia B – Deficiência de fator IX
• Doença de von Willebrand– FvW deficiente ou anormal– Tempo de sangramento prolongado– Padrão autossômico dominante
Aconselhamento Genético
• História familiar
• Exames laboratoriais:– PCR– Southern blotting
• Predisposição à formação de inibidores
Aconselhamento Genético• PCR + Seqüenciamento
– Mutações de base única• Dificuldades
– Grande tamanho da região codificadora – Não detecta rearranjos onde a seqüência de éxons esteja inalterada
– Pequenas deleções
• Southern blotting– Grandes deleções– Inserções– Inversões
Diagnóstico Pré-Natal
• Por quê?– Assistência psicológica– Assistência hospitalar– Complicações
• Determinação do sexo– análise citogenética– 1979: fetoscopia assistida por ECO = sangue
fetal
Diagnóstico Pré-Natal
• Amniocentese– 12-14ª semana de gestação
• Vilosidades Coriônicas– 9-11ª semana de gestação– transcervical x transabdominal
Tratamento
• Restituição da atividade deficiente
• Manejo clínico– centros especializados– equipes multidisciplinares– avaliações periódicas– programas de exercícios– boa higiene oral
Tratamento
Derivados plasmáticos
X
Fator VIII recombinante
Tratamento
• Derivados Plasmáticos– Anos 70– Crioprecipitado / Plasma fresco– Transmissão de agentes infecciosos– Processos de inativação viral– Formação de inibidores– Profilaxia: 3 vezes/semana
Tratamento
• Fator VIII Recombinante– Início da década de 90– Excelente eficácia– Alta correlação entre dose X níveis fator VII– Meia-vida: 8-12 horas– Profilaxia: 3 vezes/semana
Tratamento
Derivados Plasmáticos Fator VIII Recombinante
• segurança? (inativação viral)
• + seguros
• + baratos • + caros (2-3 vezes)
• disponibilidade maior • baixa disponibilidade
• inibidores: 10-15% • inibidores: 10-15%
• + utilizados
Tratamento
• Anticorpos contra o fator VIII– 10-20% dos pacientes hemofílicos– Distúrbios severos da crase– TTPA prolongado– Ac inativam plasma normal
Tratamento
4%7%
34%36%
38%
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
MutaçõesMissense
PequenasDeleções
Inversões(íntron 22)
GrandesDeleções
MutaçõesNonsense
Formação de Inibidores X Tipo de Mutação
Schwaab R, Brackmann HH, Meyer C, et al. Haemophilia A: mutation type determines risk of inhibitor formation. Thromb Haemost 1995;74:1402-6.
Tratamento
Tratamento
• Lewis et al. (1985) Tx Hepático– Pcte hemofílico + cirrose por hepatite viral– Pós-operatório: níveis quase normais de fator
VIII
Tratamento
• Sangramentos– Menores: atingir 25% dos valores normais de fator VIII
– Moderados (hematomas musculares): atingir 50%
– Grandes sgtos / cirurgias: atingir 100%
• Dose– 1U fator VIII = 1 ml plasma
– Volume plasmático = 40 ml/Kg
– Volume de distribuição do fator VIII = 1,5 vez o volume do plasma
– 100% 60 unidades/Kg
Tratamento
• Desmopressina– Análogo da vasopressina liberação e níveis de fator VIII e FvW Hemofilia A leve a moderada
Doenças Secundárias
• Fatores plasmáticos (agentes infecciosos)• Cirrose Hepática
– Vírus da hepatite B, C– Ca hepatocelular
• SIDA– HIV– Inibidores da protease– Trombocitopenia imune– Metade da década de 80: 60-70% dos hemofílicos
contaminados (EUA e Europa Ocidental)
Terapia Gênica
• Candidatas ideais
• Produção endógena contínua
• Vetores virais
• Introdução do gene em fibroblastos da pele ex vivo
Terapia Gênica
• Roth et al.: Nonviral transfer of the gene encoding coagulation factor VIII in patients with severe hemophilia A. N Engl J Med 2001;344:1735-42.
– 4/6 pactes: níveis detectáveis de fator VIII (2 pactes: > 1,0%)
– Nenhum pcte desenvolveu inibidores
– ¾ pctes dose de fator VIII recombinante sgtos
– 10 meses após: indetectáveis
Terapia Gênica
• Introdução do gene em fibroblastos (eletroforese)
• Implantação dos fibroblastos no peritôneo
Terapia Gênica
Hemofilia A – Realidade
• 80% dos pacientes não recebem qualquer tipo de tto
• Produção e purificação do fator VIII extraído do leite de animais transgênicos
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