HEMOFILIA A Giselle Martins Pinto Nelson Gianni de Lima Rafael Domingos Grando Lisiane Machado...

HEMOFILIA A

Giselle Martins Pinto

Nelson Gianni de Lima

Rafael Domingos Grando

Lisiane Machado

Luciana Mendes Johann

Introdução

• Doença de grande interesse médico, científico e público

• Freqüente distúrbio hereditário da coagulação

• Causada por: ausência, deficiência severa ou defeitos na função do fator VIII da coagulação

Dados Históricos

• Relatos antigos presentes no Talmud sugerem seu padrão de herança há aproximadamente 2000 anos

• “perda de sangue” x “retenção de sangue”

• Em 1803, Otto descreveu seu padrão de herança numa família de New Hampshire

Dados Históricos• A Hemofilia ficou conhecida

como “doença Real” por seu aparecimento entre os filhos da Rainha Victoria, da Grã-Bretanha

• Se disseminou às famílias reais européias através dos descendentes da Rainha Victoria

• Hemofilia A ou Hemofilia B?

Definição

• A hemofilia A é uma doença hereditária recessiva ligada ao cromossomo X que ocorre devido à deficiência do fator VIII da coagulação ou a defeitos estruturais em suas moléculas

• Distúrbio clinicamente heterogêneo devido à quantidade de defeitos diferentes no gene do fator VIII

Epidemiologia

• É uma doença que não respeita limites étnicos ou geográficos

• É a principal causa de sangramentos severos e a segunda principal causa de todos os distúrbios congênitos que causam sangramentos, ficando atrás somente da doença de von Willebrand

Epidemiologia• Incidência aproximada:

- 1 em cada 5000 crianças do sexo masculino

- em mulheres, é de 1 para cada 25.000.000

Padrão de Herança

Doença recessiva

ligada ao cromossomo X

Padrão de Herança

• Expressa-se em todos os homens que a recebem, mas apenas nas mulheres homozigóticas para a mutação

• O homem afetado transmite o gene para todas as suas filhas

• Mulheres carreadoras têm aproximadamente 50% de chance de transmitir os genes para seus filhos

• O gene jamais se transmite diretamente do pai para o filho

• Aproximadamente 30% dos casos decorrem de mutações novas

Padrão de Herança

• Mulheres afetadas:- Homozigóticas recessivas- Hemizigóticas para a mutação do fator

VIII, como resultado de inativação desigual do cromossomo X (defeito na Lyonização)

• Alguns casos:- Mulheres com síndrome de Turner- Casos de mosaicismo do cromossomo X

Apresentação Clínica

• Ocorre nas seguintes formas – Leve: 31%*– Moderada: 26%*– Severa: 43%*

*Soucie, J. M.; Evatt, B.; Jackson, D.; Hemophilia Surveillance System Project

Investigators : Occurrence of hemophilia in the United States. Am. J. Hemat. 59: 288-294,

1998.

Apresentação ClínicaClassificação Nível de Fator VIII

(ativo)Achados Clínicos

Severa Até 1% do normal Hemorragias e hemartroses

espontâneas, requerindo reposição de fator VIII.

Moderada 2-5% do normal Hemorragias secundárias a traumas ou cirurgias.

Leve 6-30% do normal Hemorragias secundárias a traumas ou cirurgias,

raras hemorragias espontâneas.

Hemartrose

Hematoma

Hematoma do ílio-psoas

Outros Achados

• Pseudotumores

• Hematúria

• Complicações neurológicas

• Hemorragias em mucosas

• Sangramentos pós-cirúrgicos

Hemorragia Intracraniana

Papel do Fator VIII na Coagulação Sangüínea

Hemostasia

• Espasmo Vascular

• Formação do tampão plaquetário

• Formação do coágulo sangüíneo

• Organização fibrosa

• Dissolução da crase sangüínea

Via Intrínseca

• Inicia com alteração no sangue ou exposição deste ao colágeno do vaso traumatizado

• Fator VIII: cofator na via intrínseca da cascata de coagulação

Complexos Enzimáticos

• Complexo X-ase: fator VIIIa + fator IXa– Ativação do fator X

• Complexo protrombinase ou ativador da protrombina: fator Xa + fator Va

Fator VIII

• Mesmo quando presente em concentrações relativamente baixas no plasma, a função de coagulação é mantida

• Somente uma redução substancial (maior que 70%) leva aos distúrbios sangüíneos característicos da hemofilia A

Fator de von Willebrand

• Circula no plasma com o fator VIII

• Funções:– acentuar a síntese de fator VIII– proteger o fator VIII contra a proteólise– aumentar a concentração do fator VIII no sítio

da lesão vascular

Estrutura do Gene do Fator VIII


• O gene está localizado no topo do braço longo do cromossomo X (Xq28)

• 186 kb

• 0,1% da constituição total do X

• 26 éxons

• RNAm de 9kb


• 24 éxons variam em comprimento (69 - 263 pares de bases)

• Os maiores éxons são:– éxon 14: 3106 pb– éxon 26: 1958 pb


• Íntron 22– separa os éxons 22 e 23– Contém a ilha CpG– Tem 2 transcrições: F8A e F8B– F8B: transcrito na mesma direção que o gene

do fator VIII, usando um éxon próprio mais os éxons 23 a 26 do fator VIII

– F8A: não contém íntrons e é transcrito na direção oposta do gene do fator VIII


• Íntron 22– Há duas cópias de F8A adicionas, não

localizadas também no cromossomo X implicadas em quase metade dos casos de hemofilia A severa, via mecanismo de inversão parcial.

The Molecular Pathology of Haemophilia A. Review Article. http://europium.cfc.mrc.ac.uk.


• RNAm– codifica um polipeptídeo de 2351 aa, sendo que

19 aa são removidos durante sua secreção.

Hoyer LW. Hemophilia A. N Engl J Med 1994;330:38-47.

Estrutura do Fator VIII

• Contém 3 domínios– domínio A: A1, A2, A3

– domínio B: único e central

– domínio C: C1, C2

Domínio B

• Codificado pelo éxon 14

• Parece exercer a função de conexão

• “Fatores VIII recombinantes, cujo domínio B estava ausente, mantinham sua função relativamente normal, mostrando, portanto, que pode ser dispensável.”

Hoyer LW. Hemophilia A. N Engl J Med 1994;330:38-47.

Domínio B

• O domínio B é clivado, resultando em :– cadeia leve: A3, C1, C2, de 80 kDa– cadeia pesada: A1, A2, de 200 kDa, contém

também parte do domínio B

Ativação do Fator VIII

• Sintetizado como um polipeptídeo de cadeia simples

• Após a síntese é clivado, por protease ainda indefinida

• Torna-se um heterodímero


• Pela ação da trombina ou fator Xa, o fator VIII é clivado nos sítios 372 e 1689 da arginina

• Essa clivagem é essencial para a liberação do fator VIII ligado ao FvW, permitindo que se ligue à superfície fosfolipídica e interaja com o fator IXa


• A clivagem no sítio 372 converte a cadeia pesada em 2 fragmentos: um de 54 kDa e outro de 44 kDa

• A clivagem no sítio 1689, libera um pequeno fragmento da cadeia leve, separando o fator VIII do FvW. Assim o fator VIII fator VIIIa

Fator VIIIa

• É composto pelos seguintes fragmentos:– 54 kDa da cadeia pesada– 44 kDa da cadeia pesada– 72 kDa da cadeia leve

• A etapa limitante na ativação do fator VIII é a clivagem no sítio 372

Fator VIIIa

• Clivagens não essenciais:– sítio 740 da arginina, pela trombina ou fator

Xa– a cadeia pesada torna-se um fragmento de 92

kDa– retira parte do domínio B da cadeia pesada

Desativação do Fator VIII

• A função de cofator do fator VIII é rapidamente perdida:– Pela proteólise molecular que ocorre por

dissociação de suas subunidades.– Pela proteína C ativada

Genética Molecular

Genética Molecular

• Pontos de mutação:– 1/3 dos pontos de mutações que ocorre no gene

do fator VIII estão localizadas no dinucleotídeo CpG (“ponto quente”)

– Sítio da endonuclease de restrição Taq1, que reconhece a seqüência TCGA. Essas mutações são detectadas pela perda deste sítio de clivagem.


Defeitos Genéticos

1. Rearranjos gênicos2. Substituição de Base Única

– missense: substituição de um único aminoácido– nonsense ou mutação em parada: término prematuro

na cadeia peptídica

3. Deleções– Grandes deleções– Pequenas deleções

4. Inserção

Rearranjos Gênicos

• Consistem basicamente em uma única inversão responsável por mais de 40% de todos os casos de hemofilia A severa.

• Grande inversão e translocação dos éxons 1 a 22, juntamente com os íntrons, com os éxons 23 a 26

• Mecanismo: recombinação homóloga entre F8A e uma cópia extragênica de F8A

Rearranjos Gênicos

• Conseqüência: remoção da terminação C da proteína codificada pelos éxons 23-26, ocasionando uma perda completa na função deste fator

• Detecção: Southern blotting (enzima de restrição BclI e gene A como probe)

Rearranjos Gênicos

• 35% dos casos de hemofilia A severa é pela inversão com a cópia distal de F8A

• 7% dos casos de hemofilia A severa é pela inversão com a cópia proximal de F8A


Rearranjos Gênicos

• Origem: quase exclusivamente é proveniente de um único erro no crossing-over durante a meiose espermatogênica de um homem normal

• Conclusão:– Gera mulheres carreadoras desta mutação, mas

sem história familiar de hemofilia A– mais de 40% dos casos de hemofilia A severa

não têm história familiar

Substituição de Base Única

• Há aproximadamente 309 tipos– 85% são mutações missense– 14% são mutações nonsense– 1% o splicing do RNAm está alterado ou

ausente

• Nos “pontos quentes” o códon do aa arginina (CGA, CGC, CGG) é freqüentemente afetado por mutações

Substituição de única base

• Missense: fenótipos variados

• Nonsense: levam a hemofilia A severa, por formar uma molécula de fator VIII truncado

Deleções

• 5% dos casos de hemofilia

• Frequëntemente associado à hemofilia A severa

• Ocorre tanto nas células germinativas femininas quanto nas masculinas

Grandes Deleções

• Deleções desde 1kb até mais de 210 kb

• Mecanismo mais provável: recombinação não-homóloga dos cromossomos na meiose I

• 5% dos casos de hemofilia A severa

• Doença moderada: resultado do splicing do RNAm que deleta o éxon 22 e os éxons 23-24

• Alto risco para desenvolvimento de inibidores.

Pequenas Deleções

• Variam desde 1 a 86 pares de bases distribuídos pelos éxons.

• Associadas a doença severa e moderada

• A maioria são mutações do tipo frameshift

Inserções

• Variam em tamanho de 1 par de bases a 2,1 kb

• Todas associadas a doença severa

• Inserção L1 (LINE 1) similaridade ao DNA da transcriptase reversa retroviral

Diagnóstico Clínico

• Sangramentos– Articulações– Músculos– TGI

• Hemorragias espontâneas

Diagnóstico Laboratorial

TTPA

• Plaquetas, TP, tempo de sangramento normais

• FvW normal

Diagnóstico Genético

• Mutações de base única PCR + seqüenciamento• Inversões Southern blotting (probe F8A)• Deleções

– Grandes deleções Southern blotting

– Pequenas deleções PCR + seqüenciamento

• Inserções Southern blotting

Diagnóstico Diferencial

• Hemofilia B – Deficiência de fator IX

• Doença de von Willebrand– FvW deficiente ou anormal– Tempo de sangramento prolongado– Padrão autossômico dominante

Aconselhamento Genético

• História familiar

• Exames laboratoriais:– PCR– Southern blotting

• Predisposição à formação de inibidores

Aconselhamento Genético• PCR + Seqüenciamento

– Mutações de base única• Dificuldades

– Grande tamanho da região codificadora – Não detecta rearranjos onde a seqüência de éxons esteja inalterada

– Pequenas deleções

• Southern blotting– Grandes deleções– Inserções– Inversões

Diagnóstico Pré-Natal

• Por quê?– Assistência psicológica– Assistência hospitalar– Complicações

• Determinação do sexo– análise citogenética– 1979: fetoscopia assistida por ECO = sangue

fetal

Diagnóstico Pré-Natal

• Amniocentese– 12-14ª semana de gestação

• Vilosidades Coriônicas– 9-11ª semana de gestação– transcervical x transabdominal

Tratamento

• Restituição da atividade deficiente

• Manejo clínico– centros especializados– equipes multidisciplinares– avaliações periódicas– programas de exercícios– boa higiene oral

Tratamento

Derivados plasmáticos

X

Fator VIII recombinante

Tratamento

• Derivados Plasmáticos– Anos 70– Crioprecipitado / Plasma fresco– Transmissão de agentes infecciosos– Processos de inativação viral– Formação de inibidores– Profilaxia: 3 vezes/semana

Tratamento

• Fator VIII Recombinante– Início da década de 90– Excelente eficácia– Alta correlação entre dose X níveis fator VII– Meia-vida: 8-12 horas– Profilaxia: 3 vezes/semana

Tratamento

Derivados Plasmáticos Fator VIII Recombinante

• segurança? (inativação viral)

• + seguros

• + baratos • + caros (2-3 vezes)

• disponibilidade maior • baixa disponibilidade

• inibidores: 10-15% • inibidores: 10-15%

• + utilizados

Tratamento

• Anticorpos contra o fator VIII– 10-20% dos pacientes hemofílicos– Distúrbios severos da crase– TTPA prolongado– Ac inativam plasma normal

Tratamento

4%7%

34%36%

38%

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

MutaçõesMissense

PequenasDeleções

Inversões(íntron 22)

GrandesDeleções

MutaçõesNonsense

Formação de Inibidores X Tipo de Mutação

Schwaab R, Brackmann HH, Meyer C, et al. Haemophilia A: mutation type determines risk of inhibitor formation. Thromb Haemost 1995;74:1402-6.

Tratamento

Tratamento

• Lewis et al. (1985) Tx Hepático– Pcte hemofílico + cirrose por hepatite viral– Pós-operatório: níveis quase normais de fator

VIII

Tratamento

• Sangramentos– Menores: atingir 25% dos valores normais de fator VIII

– Moderados (hematomas musculares): atingir 50%

– Grandes sgtos / cirurgias: atingir 100%

• Dose– 1U fator VIII = 1 ml plasma

– Volume plasmático = 40 ml/Kg

– Volume de distribuição do fator VIII = 1,5 vez o volume do plasma

– 100% 60 unidades/Kg

Tratamento

• Desmopressina– Análogo da vasopressina liberação e níveis de fator VIII e FvW Hemofilia A leve a moderada

Doenças Secundárias

• Fatores plasmáticos (agentes infecciosos)• Cirrose Hepática

– Vírus da hepatite B, C– Ca hepatocelular

• SIDA– HIV– Inibidores da protease– Trombocitopenia imune– Metade da década de 80: 60-70% dos hemofílicos

contaminados (EUA e Europa Ocidental)

Terapia Gênica

• Candidatas ideais

• Produção endógena contínua

• Vetores virais

• Introdução do gene em fibroblastos da pele ex vivo

Terapia Gênica

• Roth et al.: Nonviral transfer of the gene encoding coagulation factor VIII in patients with severe hemophilia A. N Engl J Med 2001;344:1735-42.

– 4/6 pactes: níveis detectáveis de fator VIII (2 pactes: > 1,0%)

– Nenhum pcte desenvolveu inibidores

– ¾ pctes dose de fator VIII recombinante sgtos

– 10 meses após: indetectáveis

Terapia Gênica

• Introdução do gene em fibroblastos (eletroforese)

• Implantação dos fibroblastos no peritôneo

Terapia Gênica

Hemofilia A – Realidade

• 80% dos pacientes não recebem qualquer tipo de tto

• Produção e purificação do fator VIII extraído do leite de animais transgênicos

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