MICROLLAABBBLADI N F O R M AT I E B U L L E T I N VA N H E T L A B O R AT O R I U M M I C R O B I O L O G I E T W E N T E A C H T E R H O E K
Derde jaargang • Nummer 3 • September 2003
Het zal u ongetwijfeld niet ontgaan zijn dat wij overgegaan zijn of
een nieuwe afname- en detectiemethode voor parasieten en wormeie-
ren. De meest wilde namen komt u nu tegen op de uitslagformulie-
ren: Blastocystes homines, Dientameuba fragilis, Endolimax nana.
In het december nummer van 2002 heeft Bert Mulder al geschreven
over (bijna) niet pathogene darmprotozoa. Nu starten we een reeks
artikelen over minder bekende protozoën. De spits wordt afgebeten
door Truus Derks, die ons uitleg geeft over Cyclospora cayetanensis.
Met dezelfde detectiemethoden als voor de cyclospora kunnen ook
schimmels aangekleurd worden. Saskia Kuipers schrijft hierover.
In de rij van exoten past ook het verhaal van Bert Mulder over
pneumocystis carinii, een micro-organisme dat genetisch meer lijkt
op een schimmel dan op een protozoa.
25 september a.s. promoveert Saskia Kuipers. In het volgende
MicroLabBlad besteden wij daar uitgebreid aandacht aan.
INHOUDSOPGAVEReeks: minder bekende darmparasieten 80
Optische witmiddelen, suikers en schimmels 82
PCP 83
Vraag-en-antwoord rubriek 86
COLOFON
Micro Lab Blad is een uitgave van:
Redactie:S.D. MeijerE. Roelofsen
Laboratorium Microbiologie Twente AchterhoekBurgemeester Edo Bergsmalaan 17512 AD EnschedeTelefoon: (053) 4313263, Telefax: (053) 4341631E-mail: [email protected]
Openingstijden:ma.t/m vr. 08:00 - 18:00 uur, za. en zo. 10:00 - 11:00 uur
133117-MicroLabBlad 01-03-2005 11:29 Pagina 79
8800
MINDER BEKENDE DARMPARASIETENCyclospora cayetanensisTR U U S DE R K S
Na terugkeer uit de (sub-) tropen melden zich regelmatig reizigers met klachten over diarree bij de
huisarts. Naast bacteriële verwekkers moet, zeker bij langer aanhoudende diarree, gedacht worden
aan parasieten als veroorzakers van de problemen. Aan het rijtje bekende pathogene protozoa, zoals
Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Cryptosporidium en de wat minder bekende Isospora belli,
kan de laatste jaren een derde – tot de groep van de coccidia behorend – ééncellige micro-organisme
worden toegevoegd: Cyclospora cayetanensis.
Casus
Op 9 juni meldt zich een 24-jarige vrouw bij haar huisarts met klachten over aanhoudende water-
dunne diarree. Van 28 april tot 21 mei maakte zij een rondreis door Guatemala. De klachten ontston-
den in de eerste week van mei en ze heeft géén koorts.
Er wordt een TFT-set voor parasitologisch onderzoek naar het lab gestuurd.
Bij parasitologisch onderzoek worden in alle drie fecesmonsters oöcysten van C. cayetanensis aange-
troffen. In het monster van de eerste afnamedag aanzienlijk méér dan in de twee daaropvolgende
dagen, wat zou kunnen wijzen op een onregelmatige uitscheiding van deze parasieten in de feces. Er
worden géén andere darmparasieten gevonden. De patiënte wordt behandeld met co-trimoxazol 2dd
960mg gedurende 7 dagen. Enkele dagen na aanvang van de kuur zijn de diarreeklachten verdwenen.
Cyclospora cayetanensis is een ééncellige parasiet en behoort, evenals Cryptosporidium en Isospora
belli tot de Coccidiae. Rijpe gesporuleerde oöcysten bevatten 2 sporocysten met elk 2 sporozoieten.
Cyclosporidiasis wordt sinds het midden van de jaren ‘80 gemeld uit de gehele wereld maar blijkt
aanzienlijk meer voor te komen in tropische en subtropische gebieden.
Hoewel feco-orale transmissie het meest waarschijnlijk is, is in tegenstelling tot bij Cryptosporidium
de directe overdracht van persoon naar persoon niet voor de hand liggend. De in de feces uitgeschei-
den onrijpe oöcysten van Cyclospora hebben namelijk dagen tot weken buiten de gastheer nodig om
infectieus te worden. Als bron van infectie wordt vooral besmet drinkwater genoemd, maar ook groen-
te, fruit en kruiden zijn mogelijke besmettingsbronnen. Tot nu toe zijn geen besmettingen bij wilde of
huisdieren gevonden.
De incubatieperiode varieert van 1 tot 10-12 dagen. De besmetting kan zowel symptomatisch als a-
symptomatisch verlopen. Cyclospora cayetanensis infecteert de dunne darm en kan waterige diarree
(zonder bloed- of slijmbijmenging), bovenbuikklachten, anorexie met gewichtsverlies en extreme
vermoeidheid veroorzaken. Soms ook misselijkheid en braken.
De diarree ontstaat acuut en kan lang aanhouden (> 2 weken); soms wisselen perioden met waterige
diarree zich af met constipatie. De ziekte is op den duur self-limiting.
133117-MicroLabBlad 01-03-2005 11:29 Pagina 80
MICROLLAABBBLAD8811
Laboratoriumdiagnostiek
Cyclospora cayetanensis kan gemakkelijk
gemist worden: de oöcysten worden vaak in
kleine hoeveelheden uitgescheiden en zijn
soms moeilijk te concentreren. De in de feces
uitgescheiden oöcysten zijn bolvormig; 8 – 10
µm in doorsnede en hebben een duidelijke
wand. In het directe ongekleurde preparaat
zijn binnen de oöcyste kleine ongekleurde bol-
vormige structuren te zien (afbeelding 1).
Waarschijnlijk is de verbeterde diagnostiek voor Cryptosporidium - de invoering van de gemodifi-
ceerde Ziehl-Neelsen- en de invoering van de ijzerhaematoxyline-Kinyounkleuring – debet aan het
frequenter melden van Cyclospora cayetanensis door parasitologische laboratoria (afbeelding 2). De
sensitiviteit van deze zuurvaste kleuringen ligt in onze ervaring rond de 80% ten opzichte van de
autofluorescentie (zie onder). Dit is te wijten aan het feit dat veel oöcysten de kleurstof slecht vast-
houden. De ongekleurde parasieten blijven daardoor onopgemerkt. De bij de detectie van
Cryptosporidium gebruikte Auraminekleuring is ongeschikt voor het opsporen van oöcysten van
Cyclospora. De beste resultaten worden gezien bij het gebruik van autofluorescentie: een direct of
geconcentreerd nat preparaat wordt onder de fluorescentiemicroscoop gescreend. Deze microscoop is
daartoe uitgerust met een 330 – 380 nm filter. De oöcysten van Cyclospora cayetanensis lichten
neon-blauw op tegen een donkere achtergrond (afbeelding 3). Ook infecties met weinig oöcysten
kunnen hierdoor gemakkelijk worden opgespoord. Sinds enkele maanden beschikt het Laboratorium
Microbiologie Twente Achterhoek over een met dit filter uitgeruste fluorescentiemicroscoop.
Afbeelding 1: Onrijpe oöcyste van Cyclospora cayetanensis in direct preparaat
Afbeelding 2: Oöcyste van Cyclospora cayetanensis inZN-preparaat
Afbeelding 3: Autofluorescentie van Cyclospora cayetanensis
133117-MicroLabBlad 01-03-2005 11:29 Pagina 81
8822
Schimmels kweken is een tijdrovend werkje. Het duurt dagen tot weken voor een schimmel groeit.
De sensitiviteit van kweken is daarbij slechts 70 tot 80 procent. Snellere detectiemethoden zijn dus
welkom. Bijvoorbeeld in de vorm van fluorescerende kleurmethoden.
Bepaalde fluorescerende kleurstoffen worden als optische witmakers
gebruikt in de wasmiddelenindustrie en bij de fabricage van wit papier.
Doordat deze witmakers een hoge affiniteit hebben voor specifieke suikers
– bijvoorbeeld glucaan en chitine – zijn ze ook zeer geschikt om schim-
mels mee aan te kleuren.
Er zijn verschillende witmiddelen in de handel, maar voor de detectie van schimmels in vers materi-
aal is Blankophor-P (Bayer, Leverkusen, Duitsland) de beste. Het Laboratorium Microbiologie ver-
richt met dit middel de directe kleuring voor gisten en schimmels. Met behulp van de fluorescentie-
microscoop wordt de gebonden kleurstof in de preparaten zichtbaar gemaakt, waardoor morfologi-
sche herkenning van gisten en schimmeldraden mogelijk wordt. Schimmels in verse materialen heb-
ben weinig tijd nodig om Blankophor te binden, maar om het middel in stukjes kalknagel te laten
doordringen is meer tijd nodig, tot 24 uur.
Positieve Blankophor preparaten worden niet altijd gevolgd door een positieve kweek. Dit is wel
vaker bij nagels het geval. Een van de redenen kan zijn dat het stuk nagel dat toegestuurd is voor
schimmelonderzoek ook een gezond stukje nagel kan zijn; een andere reden is dat dermatofyten niet
altijd even makkelijk in kweek kunnen worden gebracht.
OPTISCHE WITMIDDELEN, SUIKERS EN SCHIMMELSSA S K I A KU I P E R S
CandidiasisFoto: Jrn of Clin Microbiol, aug 1999, vol. 37, no. 8, p. 2694.
ZygomycosisFoto: Jrn of Clin Microbiol, aug1999, vol. 37, no. 8, p. 2694.
133117-MicroLabBlad 01-03-2005 11:29 Pagina 82
MICROLLAABBBLAD8833
Pneumocystis carinii kwam in de vorige eeuw aanvankelijk epidemisch voor als verwekker van een
interstitiële longontsteking bij ondervoede kinderen in weeshuizen. P. carinii wordt nu wereldwijd
gezien als verwekker van pneumonie bij een gestoorde afweer. Onduidelijk is of deze opportunisti-
sche infectie optreedt door reactivering van de latente infectie of doordat frequente blootstelling
plaatsvindt. De gestoorde cellulaire afweer die predisponeert voor een P. carinii pneumonie (PCP)
wordt met name gezien bij AIDS-patiënten met een CD4 getal lager dan 200/mm3 en patiënten onder
immunosuppressieve en radiologische therapie tijdens de behandeling van tumoren of na orgaan-
transplantatie. De meest beschreven immunosuppressieve middelen zijn corticosteroïden in hoge
dosering, maar ook tijdens chemotherapie zonder corticosteroïden kan de infectie voorkomen. De
taxonomische plaats van P. carinii is controversieel, nadat uit moleculair genetische analyse bleek dat
het organisme meer verwantschap vertoont met schimmels dan met protozoa.
Klinische verschijnselen
De belangrijkste klinische verschijnselen van PCP zijn kortademigheid, koorts en niet-productieve
hoest als regel sinds 1 à 2 weken bestaand, bij HIV-patiënten vaak langer. Bij lichamelijk onderzoek
staan tachypnoe en tachycardie en evt. cyanose op de voorgrond. Het klassieke beeld op de thoraxfo-
to is een diffuus bilateraal infiltraat. Het laboratoriumonderzoek (pO2, pCO2) toont de verslechterde
oxygenatie.
Diagnose
Aan PCP dient bij immuun gecompromitteerde patiënten met respiratoire klachten, koorts en afwij-
kingen op de thoraxfoto te worden gedacht. Omdat in deze groep dit klinisch beeld een lange diffe-
rentiaal diagnose heeft, van zowel infectieuze (bacteriën, tuberculose, schimmels, viraal, nocardia,
toxoplasma, strongyloides), als niet-infectieuze aard, berust de diagnose PCP op het aantonen van
P. carinii door middel van laboratorium diagnostiek. Immuunfluorescentie voor het aantonen van
P. carinii blijkt gevoeliger dan histologische kleuringen. Preparaten zijn na voorbewerking door
middel van een cytospincentrifugatie beter te beoordelen omdat te dikke preparaten niet betrouwbaar
te beoordelen zijn (zie figuur 1). De ontwikkeling van een PCR heeft de sensitiviteit nog verder doen
toenemen. Van groot belang voor de diagnose is het verkrijgen van representatief longmateriaal. In
het algemeen neemt de diagnostische opbrengst toe met een meer invasieve procedure. P. carinii
wordt slechts zelden aangetoond in sputum, tenzij dit sputum is geïnduceerd met zoutnevel inhalatie.
De diagnostische opbrengst van geïnduceerd sputum ligt tussen 50 en 90%. Bij een broncho-alveolai-
re lavage (BAL) ligt deze opbrengst hoger, zeker als meerdere longkwabben worden gespoeld, met
name de meest aangedane gedeelten. Cytomegalovirus wordt nogal eens als co-infectie aangetroffen
maar dit beïnvloedt de prognose niet.
Diagnostische dillema’s
Hoewel verbeterde diagnostiek (en behandeling) hebben geleid tot een reductie in mortaliteit, blijkt
PNEUMOCYSTIS CARINII BE RT MU L D E R
133117-MicroLabBlad 01-03-2005 11:30 Pagina 83
8844
het moeilijk de diagnostische kennis van Pneumocystis carinii op peil te houden. Dit wordt mede
veroorzaakt door de dalende incidentie van PCP diagnoses gedurende het laatste decennium door de
toepassing van zowel PCP profylaxe als HAART bij AIDS-patiënten. Daarnaast is de toepassing van
immuunfluorescentie voor de detectie van P. carinii een gespecialiseerde technische vaardigheid, die
in de praktijk alleen met een beperkt aantal analisten in stand te houden is. Derhalve is binnen het
Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek gekozen voor het middels continue scholing in stand
houden van de vaardigheid met een beperkte analistengroep. Dit betekent dat de bepaling elke werk-
dag nog dezelfde dag (cito) kan worden uitgevoerd indien het klinisch (BAL-)materiaal voor 15:00
uur op het laboratorium aanwezig is. Uiteraard wordt dit beleid met de longartsen overlegd. Voor de
toekomst wordt aan de ontwikkeling van PCP diagnostiek door toepassing van real-time PCR tech-
niek gewerkt. De eerste ervaringen met deze techniek zien er hoopgevend uit (zie figuur 2) met een
goede specificiteit en hogere sensitiviteit dan conventionele diagnostische methoden.
Figuur 1a: Immunofluorescentie opname (Pneumo-cel) van P. carinii(foto: UMC St Radboud Nijmegen)
Figuur 1b: Immunofluorescentie opname (Pneumo-cel)
van P. carinii bij een te dik preparaat (foto: UMC St Radboud Nijmegen)
133117-MicroLabBlad 01-03-2005 11:30 Pagina 84
MICROLLAABBBLAD8855
FIGURE 260–1. Proposed Pneumocystis carinii life cycle involving asexual and sexual stages.
The photographs show living trophic and cyst forms of the organism by Nomarski interference
microscopy. (From Cushion M. Pneumocystis carinii. In: Collier L, Balows A, Sussman M, eds.
Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections, v. 4. New York: Oxford University
Press; 1998:645–683.)
FIGURE 260–2. A, Cluster of Pneumocystis carinii trophozoites and cysts (Diff-Quik, ?2500). B,
Cluster of P. carinii cysts (methenamine silver stain, ?1250).
FIGURE 260–3. Pneumocystis carinii pneumonia illustrating frothy honeycombed material filling the
alveolar space (H&E, ?165).
FIGURE 260–4. Chest radiograph showing bilateral infiltrates of Pneumocystis carinii pneumonia.
thoraxfoto bij patiënt met pneumocystis carinii
133117-MicroLabBlad 01-03-2005 11:30 Pagina 85
DE VRAAG-EN-ANTWOORD RUBRIEK
De laatste maanden wordt de arts-microbioloog vaker geconsulteerd over gevallen van (bulleus)
impetigo. Uit heel Nederland wordt een toename van impetigo gemeld, vooral in de categorie van
kinderen onder de 12 jaar. Voor ons was dit aanleiding om een aantal vragen hier te beantwoorden.
Hoe ontstaan de blaren bij bulleus impetigo?
De verwekker van impetigo met blaarvorming is de Staphylococcus aureus. Bepaalde toxinen
– exfoliatieve toxinen A en B – zijn in staat om een belangrijk structureel eiwit van de mense-
lijke huid, het zogeheten desmogleïne, af te breken. Hierdoor ontstaan blaren onder de stratum
corneum van de huid.
Welke antibiotica zijn geschikt om bulleus impetigo mee te behandelen?
Uit Nederlands onderzoek blijkt dat het overgrote deel van de S. aureus stammen die impetigo
veroorzaken gevoelig zijn voor fucidinezuur en mupirocine. Echter lokale behandeling met
deze middelen is bij bulleus impetigo minder effectief dan systemische behandeling. Omdat de
meeste stafylokokken stammen ongevoelig zijn voor penicilline en amoxicilline, zijn ook deze
middelen minder geschikt. Flucloxacilline (50 mg/kg verdeeld over 3-4 doses) gedurende 7
dagen is de beste therapie. Van flucloxacilline is echter geen suspensie in de handel, alhoewel
via de kinderarts op recept in bepaalde gevallen wel suspensie te verkrijgen is. Het enige alter-
natief blijft dan amoxicilline/clavulaanzuur (50/12.5 mg/kg te verdelen over 4 doses) of
clindamycine (25 mg/kg verdeeld over 4 doses). De in Twente circulerende, impetigo-
veroorzakende S. aureus stam is ongevoelig voor erthromycine, azithromycine en
clarithromycine, wat deze middelen onbruikbaar maakt als therapeuticum.
Collega Bos konden wij onlangs verblijden met een positieve uitslag (>10 E/ml) voor kinkhoest sero-
logie bij een man van middelbare leeftijd die gedurende langere tijd hoestbuien had. Waarop natuur-
lijk onmiddellijk de vraag rees hoe lang blijft zo'n titer aanwezig en hoe hoog is die dan.
Een artikel van H.E. de Melker et al. in the Journal of Clinical Microbiology van februari 2000 leert
ons dat de hoogte van de antistoftiter in 1 jaar afneemt tot onder de grens waarboven de uitslag posi-
tief wordt genoemd. Negatieve sera bij zowel kinderen als volwassenen komen zelden boven de 10
VE/ml. Een hoge titer (volwassenen > 18) in combinatie met klachten die verdacht zijn voor kink-
hoest zijn dus een sterke aanwijzing voor een (recent doorgemaakte) infectie.
133117-MicroLabBlad 01-03-2005 11:30 Pagina 86
Top Related