133117-MicroLabBlad 01-03-2005 11:29 Pagina 79 …...FIGURE 260–1.Proposed Pneumocystis...

MICROLLAABBBLADI N F O R M AT I E B U L L E T I N VA N H E T L A B O R AT O R I U M M I C R O B I O L O G I E T W E N T E A C H T E R H O E K

Derde jaargang • Nummer 3 • September 2003

Het zal u ongetwijfeld niet ontgaan zijn dat wij overgegaan zijn of

een nieuwe afname- en detectiemethode voor parasieten en wormeie-

ren. De meest wilde namen komt u nu tegen op de uitslagformulie-

ren: Blastocystes homines, Dientameuba fragilis, Endolimax nana.

In het december nummer van 2002 heeft Bert Mulder al geschreven

over (bijna) niet pathogene darmprotozoa. Nu starten we een reeks

artikelen over minder bekende protozoën. De spits wordt afgebeten

door Truus Derks, die ons uitleg geeft over Cyclospora cayetanensis.

Met dezelfde detectiemethoden als voor de cyclospora kunnen ook

schimmels aangekleurd worden. Saskia Kuipers schrijft hierover.

In de rij van exoten past ook het verhaal van Bert Mulder over

pneumocystis carinii, een micro-organisme dat genetisch meer lijkt

op een schimmel dan op een protozoa.

25 september a.s. promoveert Saskia Kuipers. In het volgende

MicroLabBlad besteden wij daar uitgebreid aandacht aan.

INHOUDSOPGAVEReeks: minder bekende darmparasieten 80

Optische witmiddelen, suikers en schimmels 82

PCP 83

Vraag-en-antwoord rubriek 86

COLOFON

Micro Lab Blad is een uitgave van:

Redactie:S.D. MeijerE. Roelofsen

Laboratorium Microbiologie Twente AchterhoekBurgemeester Edo Bergsmalaan 17512 AD EnschedeTelefoon: (053) 4313263, Telefax: (053) 4341631E-mail: [email protected]

Openingstijden:ma.t/m vr. 08:00 - 18:00 uur, za. en zo. 10:00 - 11:00 uur

133117-MicroLabBlad 01-03-2005 11:29 Pagina 79

8800

MINDER BEKENDE DARMPARASIETENCyclospora cayetanensisTR U U S DE R K S

Na terugkeer uit de (sub-) tropen melden zich regelmatig reizigers met klachten over diarree bij de

huisarts. Naast bacteriële verwekkers moet, zeker bij langer aanhoudende diarree, gedacht worden

aan parasieten als veroorzakers van de problemen. Aan het rijtje bekende pathogene protozoa, zoals

Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Cryptosporidium en de wat minder bekende Isospora belli,

kan de laatste jaren een derde – tot de groep van de coccidia behorend – ééncellige micro-organisme

worden toegevoegd: Cyclospora cayetanensis.

Casus

Op 9 juni meldt zich een 24-jarige vrouw bij haar huisarts met klachten over aanhoudende water-

dunne diarree. Van 28 april tot 21 mei maakte zij een rondreis door Guatemala. De klachten ontston-

den in de eerste week van mei en ze heeft géén koorts.

Er wordt een TFT-set voor parasitologisch onderzoek naar het lab gestuurd.

Bij parasitologisch onderzoek worden in alle drie fecesmonsters oöcysten van C. cayetanensis aange-

troffen. In het monster van de eerste afnamedag aanzienlijk méér dan in de twee daaropvolgende

dagen, wat zou kunnen wijzen op een onregelmatige uitscheiding van deze parasieten in de feces. Er

worden géén andere darmparasieten gevonden. De patiënte wordt behandeld met co-trimoxazol 2dd

960mg gedurende 7 dagen. Enkele dagen na aanvang van de kuur zijn de diarreeklachten verdwenen.

Cyclospora cayetanensis is een ééncellige parasiet en behoort, evenals Cryptosporidium en Isospora

belli tot de Coccidiae. Rijpe gesporuleerde oöcysten bevatten 2 sporocysten met elk 2 sporozoieten.

Cyclosporidiasis wordt sinds het midden van de jaren ‘80 gemeld uit de gehele wereld maar blijkt

aanzienlijk meer voor te komen in tropische en subtropische gebieden.

Hoewel feco-orale transmissie het meest waarschijnlijk is, is in tegenstelling tot bij Cryptosporidium

de directe overdracht van persoon naar persoon niet voor de hand liggend. De in de feces uitgeschei-

den onrijpe oöcysten van Cyclospora hebben namelijk dagen tot weken buiten de gastheer nodig om

infectieus te worden. Als bron van infectie wordt vooral besmet drinkwater genoemd, maar ook groen-

te, fruit en kruiden zijn mogelijke besmettingsbronnen. Tot nu toe zijn geen besmettingen bij wilde of

huisdieren gevonden.

De incubatieperiode varieert van 1 tot 10-12 dagen. De besmetting kan zowel symptomatisch als a-

symptomatisch verlopen. Cyclospora cayetanensis infecteert de dunne darm en kan waterige diarree

(zonder bloed- of slijmbijmenging), bovenbuikklachten, anorexie met gewichtsverlies en extreme

vermoeidheid veroorzaken. Soms ook misselijkheid en braken.

De diarree ontstaat acuut en kan lang aanhouden (> 2 weken); soms wisselen perioden met waterige

diarree zich af met constipatie. De ziekte is op den duur self-limiting.


MICROLLAABBBLAD8811

Laboratoriumdiagnostiek

Cyclospora cayetanensis kan gemakkelijk

gemist worden: de oöcysten worden vaak in

kleine hoeveelheden uitgescheiden en zijn

soms moeilijk te concentreren. De in de feces

uitgescheiden oöcysten zijn bolvormig; 8 – 10

µm in doorsnede en hebben een duidelijke

wand. In het directe ongekleurde preparaat

zijn binnen de oöcyste kleine ongekleurde bol-

vormige structuren te zien (afbeelding 1).

Waarschijnlijk is de verbeterde diagnostiek voor Cryptosporidium - de invoering van de gemodifi-

ceerde Ziehl-Neelsen- en de invoering van de ijzerhaematoxyline-Kinyounkleuring – debet aan het

frequenter melden van Cyclospora cayetanensis door parasitologische laboratoria (afbeelding 2). De

sensitiviteit van deze zuurvaste kleuringen ligt in onze ervaring rond de 80% ten opzichte van de

autofluorescentie (zie onder). Dit is te wijten aan het feit dat veel oöcysten de kleurstof slecht vast-

houden. De ongekleurde parasieten blijven daardoor onopgemerkt. De bij de detectie van

Cryptosporidium gebruikte Auraminekleuring is ongeschikt voor het opsporen van oöcysten van

Cyclospora. De beste resultaten worden gezien bij het gebruik van autofluorescentie: een direct of

geconcentreerd nat preparaat wordt onder de fluorescentiemicroscoop gescreend. Deze microscoop is

daartoe uitgerust met een 330 – 380 nm filter. De oöcysten van Cyclospora cayetanensis lichten

neon-blauw op tegen een donkere achtergrond (afbeelding 3). Ook infecties met weinig oöcysten

kunnen hierdoor gemakkelijk worden opgespoord. Sinds enkele maanden beschikt het Laboratorium

Microbiologie Twente Achterhoek over een met dit filter uitgeruste fluorescentiemicroscoop.

Afbeelding 1: Onrijpe oöcyste van Cyclospora cayetanensis in direct preparaat

Afbeelding 2: Oöcyste van Cyclospora cayetanensis inZN-preparaat

Afbeelding 3: Autofluorescentie van Cyclospora cayetanensis


8822

Schimmels kweken is een tijdrovend werkje. Het duurt dagen tot weken voor een schimmel groeit.

De sensitiviteit van kweken is daarbij slechts 70 tot 80 procent. Snellere detectiemethoden zijn dus

welkom. Bijvoorbeeld in de vorm van fluorescerende kleurmethoden.

Bepaalde fluorescerende kleurstoffen worden als optische witmakers

gebruikt in de wasmiddelenindustrie en bij de fabricage van wit papier.

Doordat deze witmakers een hoge affiniteit hebben voor specifieke suikers

– bijvoorbeeld glucaan en chitine – zijn ze ook zeer geschikt om schim-

mels mee aan te kleuren.

Er zijn verschillende witmiddelen in de handel, maar voor de detectie van schimmels in vers materi-

aal is Blankophor-P (Bayer, Leverkusen, Duitsland) de beste. Het Laboratorium Microbiologie ver-

richt met dit middel de directe kleuring voor gisten en schimmels. Met behulp van de fluorescentie-

microscoop wordt de gebonden kleurstof in de preparaten zichtbaar gemaakt, waardoor morfologi-

sche herkenning van gisten en schimmeldraden mogelijk wordt. Schimmels in verse materialen heb-

ben weinig tijd nodig om Blankophor te binden, maar om het middel in stukjes kalknagel te laten

doordringen is meer tijd nodig, tot 24 uur.

Positieve Blankophor preparaten worden niet altijd gevolgd door een positieve kweek. Dit is wel

vaker bij nagels het geval. Een van de redenen kan zijn dat het stuk nagel dat toegestuurd is voor

schimmelonderzoek ook een gezond stukje nagel kan zijn; een andere reden is dat dermatofyten niet

altijd even makkelijk in kweek kunnen worden gebracht.

OPTISCHE WITMIDDELEN, SUIKERS EN SCHIMMELSSA S K I A KU I P E R S

CandidiasisFoto: Jrn of Clin Microbiol, aug 1999, vol. 37, no. 8, p. 2694.

ZygomycosisFoto: Jrn of Clin Microbiol, aug1999, vol. 37, no. 8, p. 2694.


MICROLLAABBBLAD8833

Pneumocystis carinii kwam in de vorige eeuw aanvankelijk epidemisch voor als verwekker van een

interstitiële longontsteking bij ondervoede kinderen in weeshuizen. P. carinii wordt nu wereldwijd

gezien als verwekker van pneumonie bij een gestoorde afweer. Onduidelijk is of deze opportunisti-

sche infectie optreedt door reactivering van de latente infectie of doordat frequente blootstelling

plaatsvindt. De gestoorde cellulaire afweer die predisponeert voor een P. carinii pneumonie (PCP)

wordt met name gezien bij AIDS-patiënten met een CD4 getal lager dan 200/mm3 en patiënten onder

immunosuppressieve en radiologische therapie tijdens de behandeling van tumoren of na orgaan-

transplantatie. De meest beschreven immunosuppressieve middelen zijn corticosteroïden in hoge

dosering, maar ook tijdens chemotherapie zonder corticosteroïden kan de infectie voorkomen. De

taxonomische plaats van P. carinii is controversieel, nadat uit moleculair genetische analyse bleek dat

het organisme meer verwantschap vertoont met schimmels dan met protozoa.

Klinische verschijnselen

De belangrijkste klinische verschijnselen van PCP zijn kortademigheid, koorts en niet-productieve

hoest als regel sinds 1 à 2 weken bestaand, bij HIV-patiënten vaak langer. Bij lichamelijk onderzoek

staan tachypnoe en tachycardie en evt. cyanose op de voorgrond. Het klassieke beeld op de thoraxfo-

to is een diffuus bilateraal infiltraat. Het laboratoriumonderzoek (pO2, pCO2) toont de verslechterde

oxygenatie.

Diagnose

Aan PCP dient bij immuun gecompromitteerde patiënten met respiratoire klachten, koorts en afwij-

kingen op de thoraxfoto te worden gedacht. Omdat in deze groep dit klinisch beeld een lange diffe-

rentiaal diagnose heeft, van zowel infectieuze (bacteriën, tuberculose, schimmels, viraal, nocardia,

toxoplasma, strongyloides), als niet-infectieuze aard, berust de diagnose PCP op het aantonen van

P. carinii door middel van laboratorium diagnostiek. Immuunfluorescentie voor het aantonen van

P. carinii blijkt gevoeliger dan histologische kleuringen. Preparaten zijn na voorbewerking door

middel van een cytospincentrifugatie beter te beoordelen omdat te dikke preparaten niet betrouwbaar

te beoordelen zijn (zie figuur 1). De ontwikkeling van een PCR heeft de sensitiviteit nog verder doen

toenemen. Van groot belang voor de diagnose is het verkrijgen van representatief longmateriaal. In

het algemeen neemt de diagnostische opbrengst toe met een meer invasieve procedure. P. carinii

wordt slechts zelden aangetoond in sputum, tenzij dit sputum is geïnduceerd met zoutnevel inhalatie.

De diagnostische opbrengst van geïnduceerd sputum ligt tussen 50 en 90%. Bij een broncho-alveolai-

re lavage (BAL) ligt deze opbrengst hoger, zeker als meerdere longkwabben worden gespoeld, met

name de meest aangedane gedeelten. Cytomegalovirus wordt nogal eens als co-infectie aangetroffen

maar dit beïnvloedt de prognose niet.

Diagnostische dillema’s

Hoewel verbeterde diagnostiek (en behandeling) hebben geleid tot een reductie in mortaliteit, blijkt

PNEUMOCYSTIS CARINII BE RT MU L D E R


8844

het moeilijk de diagnostische kennis van Pneumocystis carinii op peil te houden. Dit wordt mede

veroorzaakt door de dalende incidentie van PCP diagnoses gedurende het laatste decennium door de

toepassing van zowel PCP profylaxe als HAART bij AIDS-patiënten. Daarnaast is de toepassing van

immuunfluorescentie voor de detectie van P. carinii een gespecialiseerde technische vaardigheid, die

in de praktijk alleen met een beperkt aantal analisten in stand te houden is. Derhalve is binnen het

Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek gekozen voor het middels continue scholing in stand

houden van de vaardigheid met een beperkte analistengroep. Dit betekent dat de bepaling elke werk-

dag nog dezelfde dag (cito) kan worden uitgevoerd indien het klinisch (BAL-)materiaal voor 15:00

uur op het laboratorium aanwezig is. Uiteraard wordt dit beleid met de longartsen overlegd. Voor de

toekomst wordt aan de ontwikkeling van PCP diagnostiek door toepassing van real-time PCR tech-

niek gewerkt. De eerste ervaringen met deze techniek zien er hoopgevend uit (zie figuur 2) met een

goede specificiteit en hogere sensitiviteit dan conventionele diagnostische methoden.

Figuur 1a: Immunofluorescentie opname (Pneumo-cel) van P. carinii(foto: UMC St Radboud Nijmegen)

Figuur 1b: Immunofluorescentie opname (Pneumo-cel)

van P. carinii bij een te dik preparaat (foto: UMC St Radboud Nijmegen)


MICROLLAABBBLAD8855

FIGURE 260–1. Proposed Pneumocystis carinii life cycle involving asexual and sexual stages.

The photographs show living trophic and cyst forms of the organism by Nomarski interference

microscopy. (From Cushion M. Pneumocystis carinii. In: Collier L, Balows A, Sussman M, eds.

Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections, v. 4. New York: Oxford University

Press; 1998:645–683.)

FIGURE 260–2. A, Cluster of Pneumocystis carinii trophozoites and cysts (Diff-Quik, ?2500). B,

Cluster of P. carinii cysts (methenamine silver stain, ?1250).

FIGURE 260–3. Pneumocystis carinii pneumonia illustrating frothy honeycombed material filling the

alveolar space (H&E, ?165).

FIGURE 260–4. Chest radiograph showing bilateral infiltrates of Pneumocystis carinii pneumonia.

thoraxfoto bij patiënt met pneumocystis carinii


DE VRAAG-EN-ANTWOORD RUBRIEK

De laatste maanden wordt de arts-microbioloog vaker geconsulteerd over gevallen van (bulleus)

impetigo. Uit heel Nederland wordt een toename van impetigo gemeld, vooral in de categorie van

kinderen onder de 12 jaar. Voor ons was dit aanleiding om een aantal vragen hier te beantwoorden.

Hoe ontstaan de blaren bij bulleus impetigo?

De verwekker van impetigo met blaarvorming is de Staphylococcus aureus. Bepaalde toxinen

– exfoliatieve toxinen A en B – zijn in staat om een belangrijk structureel eiwit van de mense-

lijke huid, het zogeheten desmogleïne, af te breken. Hierdoor ontstaan blaren onder de stratum

corneum van de huid.

Welke antibiotica zijn geschikt om bulleus impetigo mee te behandelen?

Uit Nederlands onderzoek blijkt dat het overgrote deel van de S. aureus stammen die impetigo

veroorzaken gevoelig zijn voor fucidinezuur en mupirocine. Echter lokale behandeling met

deze middelen is bij bulleus impetigo minder effectief dan systemische behandeling. Omdat de

meeste stafylokokken stammen ongevoelig zijn voor penicilline en amoxicilline, zijn ook deze

middelen minder geschikt. Flucloxacilline (50 mg/kg verdeeld over 3-4 doses) gedurende 7

dagen is de beste therapie. Van flucloxacilline is echter geen suspensie in de handel, alhoewel

via de kinderarts op recept in bepaalde gevallen wel suspensie te verkrijgen is. Het enige alter-

natief blijft dan amoxicilline/clavulaanzuur (50/12.5 mg/kg te verdelen over 4 doses) of

clindamycine (25 mg/kg verdeeld over 4 doses). De in Twente circulerende, impetigo-

veroorzakende S. aureus stam is ongevoelig voor erthromycine, azithromycine en

clarithromycine, wat deze middelen onbruikbaar maakt als therapeuticum.

Collega Bos konden wij onlangs verblijden met een positieve uitslag (>10 E/ml) voor kinkhoest sero-

logie bij een man van middelbare leeftijd die gedurende langere tijd hoestbuien had. Waarop natuur-

lijk onmiddellijk de vraag rees hoe lang blijft zo'n titer aanwezig en hoe hoog is die dan.

Een artikel van H.E. de Melker et al. in the Journal of Clinical Microbiology van februari 2000 leert

ons dat de hoogte van de antistoftiter in 1 jaar afneemt tot onder de grens waarboven de uitslag posi-

tief wordt genoemd. Negatieve sera bij zowel kinderen als volwassenen komen zelden boven de 10

VE/ml. Een hoge titer (volwassenen > 18) in combinatie met klachten die verdacht zijn voor kink-

hoest zijn dus een sterke aanwijzing voor een (recent doorgemaakte) infectie.


133117-MicroLabBlad 01-03-2005 11:29 Pagina 79 …...FIGURE 260–1.Proposed Pneumocystis...

Documents

Transcript of 133117-MicroLabBlad 01-03-2005 11:29 Pagina 79 …...FIGURE 260–1.Proposed Pneumocystis...