Validatie van bestaande modellen voor hittebehandelde Listeria monocytogenes in kant-en-

klare maaltijden

Sarah STROOBANTS

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Ir. Frank Devlieghere

Vakgroep Voedselveiligheid en voedselkwaliteit

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Universiteit Gent

Academiejaar 2011-2012

Validatie van bestaande modellen voor hittebehandelde Listeria monocytogenes in kant-en-

klare maaltijden

Sarah STROOBANTS

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Ir. Frank Devlieghere

Vakgroep Voedselveiligheid en voedselkwaliteit

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Universiteit Gent

Academiejaar 2011-2012

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor

consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk

gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht,

in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te

vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.” 14 mei 2012

Sarah Stroobants Prof. Dr. Ir. Frank Devlieghere

Voorwoord

Ziekten veroorzaakt door voedselgerelateerde pathogene micro-organismen of virussen, zijn

een belangrijk gezondheidsprobleem. Het toezien op voedselveiligheid en -kwaliteit is dan

ook van uitermate belang. Het leek mij interessant om uit te zoeken hoe het productieproces

nu precies in elkaar zit en hoe aan de hand van wiskundige modellen de groei van pathogene

micro-organismen kan voorspeld worden.

Allereerst wil ik graag mijn promotor professor dr. ir. Frank Devlieghere bedanken om mijn

masterproef in zijn onderzoeksteam te laten doorgaan. Ik was meteen gemotiveerd om aan

de stage te beginnen. In het laatste jaar heb ik dan ook veel bijgeleerd. Tijdens de stage in

het labo van de Vakgroep Voedselveiligheid en Voedselkwaliteit kreeg ik de kans om een

deel van mijn theoretische bagage in de praktijk om te zetten. Hierbij werd ik bijgestaan

door een enthousiast en ervaren team van laboranten, waarvoor ik hen oprecht wil bedanken.

Een speciaal woordje van dank wil ik richten aan Elien Verguldt: bij haar kon ik steeds

terecht wanneer ik hulp of een tweede opinie nodig had over een praktische zaak in het labo.

Mijn begeleiders ir. Jeff Daelman en dr. ir. An Vermeulen waren steeds bereid om de

geschreven stukken van mijn masterproef na te lezen en te verbeteren. Waarvoor dank!

Ir. Jeff Daelman heeft mij ook wegwijs gemaakt in het labo en mij enkele technieken

aangeleerd. Dr. ir. An Vermeulen heeft mij begeleid bij het analyseren van de resultaten en

toonde mij de werking van de verschillende modellen (softwarepakketten).

Uiteraard wil ik mijn ouders bedanken voor de jarenlange steun in alle betekenissen van het

woord. Ook bedankt aan mijn familie, zus en vrienden voor de nodige steun en ontspanning. Dank u wel, Sarah

Inhoudstafel Inhoudstafel Lijst met afkortingen Samenvatting 1 1. Inleiding 2

1.1 Listeria monocytogenes 4

1.1.1 Eigenschappen van Listeria monocytogenes en insleep 4

in de productieomgeving

1.1.2 Pathogeniteit en listeriosis 5

1.1.3 Listeria monocytogenes in voedingsmiddelen 5

1.1.4 Microbiologische criteria 7

1.2 Verhittingsstap door de producent en consument 8

1.2.1 Pasteurisatie door de producent 8

1.2.2 Nabesmetting 9

1.2.3 Verhittingsstap door de consument en consumentengedrag 10

1.2.3.1 Verhittingsstap door de consument 10

1.2.3.2 De relatie tussen consumentengedrag en voedselveiligheid 10

1.3 Het bepalen van de groeipotentieel voor Listeria monocytogenes 11

1.4 Predictieve microbiologie 13

2. Materialen en methoden 15

2.1 Gebruikte levensmiddelen in challenge testen 15

2.1.1 Lasagne bolognaise 15

2.1.2 Poisson Parmentier (Puree met visblokjes) 15

2.1.3 Puree met rode kool en braadworst 15

2.2 Bepaling van intrinsieke factoren 16

2.3 Uitvoeren van de challenge testen volgens EU CRL for Listeria 16 monocytogenes

2.3.1 Inoculumvoorbereiding 17

2.3.1.1 Opkweek van stammen en bereiden van inoculum 17

2.3.2 Inoculatie, bewaring en uitplating 18

2.4 Inactivatie van Listeria monocytogenes tijdens opwarming 20

2.4.1 Temperatuursregistratie 20

2.5 Modelselectie en validatie 20

3. Resultaten 22

3.1 Fysicochemische parameters 22

3.2 Algemene microbiologische analyse 22

3.3 Groei van L. monocytogenes tijdens bewaring 26

3.3.1 Bepalen en standaardiseren van de opkweekcultuur 26

3.3.2 Bepalen van groeipotentieel en verdubbelingstijd 27

3.3.3 Validatie van groeimodellen 31

3.4 Inactivatie van L. monocytogenes tijdens opwarming van REPFEDs 33

3.4.1 Opwarming volgens voorschriften 33

4. Bespreking 36

4.1 Fysicochemische parameters 36

4.2 Algemene microbiologische analyse 36

4.3 Groei van L. monocytogenes tijdens bewaring 37

4.3.1 Bepalen van groeipotentieel en verdubbelingstijd 37

4.3.2 Validatie van groeimodellen 37

4.4 Inactivatie van L. monocytogenes tijdens opwarming van REPFEDs 39

4.4.1 Opwarming volgens voorschriften 39

4.4.2 Validatie van inactivatiemodellen 41

5. Algemeen besluit 42 6. Referentielijst 43

Lijst met afkortingen

AGES Austrian Agency for Health and Food Safety

ALOA Agar Listeria selon Ottaviani & Agosti

aw Wateractiviteit

BHI Brain Heart Infusion

EH Einde Houdbaarheid

EU CRL European Union Community Reference Laboratory

GfK Growth from Knowledge

GHP Goede Hygiënische Praktijken

GMP Good Manufacturing Practices

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points

IFIC International Food Information Council

kve/g Kolonievormende eenheden/gram

L.monocytogenes Listeria monocytogenes

L.m. Listeria monocytogenes

LFMFP Laboratory of Food Microbiology and Food Preservation

LMG Lab of Microbiology UGent

MAP Modified Atmosphere Packaging

MRS Man Rogosa Sharpe

MZB Melkzuurbacteriën

N0 Initiële celdichtheid

NaCl Zoutgehalte

Nmax Maximale celdichtheid

NVT Niet Van Toepassing

P0 Pasteuristatiewaarde

PCA Plate Count Agar

pH Zuurtegraad

PPS Peptone Physiological Solution

RASFF Rapid Alert System for Food and Feed

RCA Reinforced Clostridial Agar

REPFEDs Refrigerated Processed Foods of Extended Durability

SSSP Seafood Spoilage and Safety Predictor

T Temperatuur

t Tijd

TAK Totaal Aëroob Kiemgetal

TAnK Totaal Anaëroob Kiemgetal

TDT Thermale DodingsTijd

TSA Trypton Soy Agar

W Watt

δ Groeipotentieel

λ Lag

μ Groeisnelheid

μmax Maximale groeisnelheid

1

Samenvatting

Steeds meer wordt een thuisbereide maaltijd ingeruild voor een snelle kant-en-klare maaltijd.

Tegelijkertijd wordt de consument kritischer t.o.v. voedselveiligheid en – kwaliteit.

Voedselgerelateerde ziekten, veroorzaakt door pathogene micro-organismen of virussen,

vormen een belangrijk gezondheidsprobleem.

De voedselveiligheid voor Refrigerated Processed Foods of Extended Durability (REPFEDs)

wordt verzekerd door een combinatie van hittebehandeling en koude bewaring. Door

nabesmetting (= contaminatie na pasteuristatie) tijdens het productieproces (o.a. bij het

versnijden, afvullen en verpakken van het product) kan nog Listeria monocytogenes op het

product terechtkomen aangezien L. monocytogenes een omgevingsbacterie is. Indien het

product gecontamineerd wordt, is de uitgroei van L. monocytogenes tijdens de bewaring in

koeling (tot 0°C) mogelijk omwille van haar psychrotrofe eigenschap. Een infectie met

L. monocytogenes veroorzaakt listeriosis, een zeldzame maar ernstige ziekte met een

mortaliteitspercentage van 20-30%. Het zijn vooral jongeren, ouderen, zwangere vrouwen en

personen met een onderdrukt immuunsysteem die tot de risicogroep behoren.

In deze masterproef zal nagegaan worden wat het effect is van de hittebehandelingen door de

consument (conform de etikettering op het levensmiddel) op het overleven van

L. monocytogenes in kant-en-klare maaltijden en er zal geverifieerd worden of een afwijking

van de huidige tolerantienorm (2 log10 kve/g) kan onderbouwd worden indien rekening

gehouden wordt met hittebehandeling door de consument. Daarvoor zal gebruik gemaakt

worden van challenge testen, waarbij drie producten (met drie batchen per product)

geïnoculeerd worden met een mix van L. monocytogenes en waarbij het proces van verpakken

en bewaren gesimuleerd wordt. Aan de hand van staalnamen en uitplatingen gedurende de

bewaring, kan de groei gevolgd worden. Op einde houdbaarheid worden de producten verhit

met de magnetron en wordt de afdoding van L. monocytogenes nagegaan. De groeipotentieel

is bij alle batchen groter dan 0,5 log10 kve/g en laat dus de groei van L. monocytogenes toe in

alle onderzochte producten. Bij de validatie van verschillende groeimodellen, kan gesteld

worden dat Seafood Spoilage and Safety Predictor (SSSP) het meest geschikt is. De

inactivatie wordt gevalideerd a.d.h.v. de P0-waarden aangezien er geen geschikte

inactivatiemodellen voorhanden zijn. Het verband tussen afdoding en P0 = 2 min. is correct

voor alle onderzochte producten. P0 = 2 min. daarentegen, werd niet altijd bereikt.

2

1. Inleiding

Het aanbod van kant-en-klare maaltijden op de markt groeit. Steeds meer wordt een

thuisbereide maaltijd ingeruild voor een snelle kant-en-klare maaltijd. Mogelijke oorzaken

hiervan zijn onder meer socio-economische evoluties: hoge werkdruk, tijdsgebrek, een grotere

participatie van de vrouw in het werkveld, … [1] Tegelijkertijd wordt de consument ook

steeds kritischer t.o.v. voedselveiligheid en – kwaliteit en wordt verwacht dat de maaltijd

voldoende nutriënten bevat en veilig is voor consumptie [2,3].

Ziekten veroorzaakt door voedselgerelateerde pathogene micro-organismen of virussen, zijn

een belangrijk gezondheidsprobleem. Het toezien op voedselveiligheid en -kwaliteit is dan

ook van uitermate belang. Het Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF van de EU)

wordt gestuurd door de Europese commissie en rapporteert voortdurend recalls en incidenten,

gerelateerd aan voedselveiligheid. Wanneer een lidstaat informatie heeft over een

voedselgerelateerde ziekte met een ernstig gezondheidsrisico of bij een recall, moet dit

gemeld worden aan de RASFF. Het rapport van 2010 toont aan dat Salmonella het meest

frequent gerapporteerde pathogene micro-organisme is (345 meldingen in 2010). Daarnaast

zijn Listeria monocytogenes (100-tal) en Escherichia coli (50-tal) de meest belangrijke, zoals

weergegeven in Figuur 1. Uit deze figuur kan ook worden afgeleid dat, naast vis en vlees, ook

bereide maaltijden en snacks gecontamineerd kunnen zijn met L. monocytogenes [4].

Slechts een deel van de gerapporteerde incidenten en recalls werden opgenomen in

wetenschappelijke publicaties. Zo werd in 2007 L. monocytogenes aangetroffen in een bereide

maaltijd in Frankrijk, bestaande uit kaas en zalm [5]. Ook in Frankrijk was in 2010

L. monocytogenes aanwezig in een zuurkool-maaltijd [6]. De Public Health Agency of

Canada and the Canadian Food Inspection Agency kreeg in 2008 een melding van een

uitbraak van listeriosis, gelinkt aan een vleesproduct [7]. Ook in 2008 meldt de Austrian

Agency for Health and Food Safety (AGES) een uitbraak van diarree, waarbij de stam

afkomstig was van kopvlees bestaande uit varkensvlees [8]. Het jaarlijks rapport van RASFF

(2010) signaleert twee belangrijke uitbraken: in Oostenrijk werden 24 personen getroffen met

listeriosis door het consumeren van kwark. In Tsjechië werden twee personen ziek doordat

vleesworst besmet was met meer dan 3 log10 kve/g L. monocytogenes [4].

3

Bovendien zijn reeds lethale uitbraken van listeriosis gerelateerd aan de aanwezigheid ervan

in voedingsmiddelen [9]. Een zeer recente uitbraak (september 2011) in de VS in cantaloupe-

meloenen zorgde voor een dodental van 14 personen [10].

Figuur 1: Pathogene micro-organismen in voedingsmiddelen, gerapporteerd aan RASPF (jaarlijks rapport 2010) [4].

De voedselveiligheid voor Refrigerated Processed Foods of Extended Durability (REPFEDs)

wordt verzekerd door een combinatie van hittebehandeling en koude bewaring. Door

nabesmetting (= contaminatie na pasteurisatie) tijdens het productieproces (o.a. bij het

versnijden, afvullen en verpakken van het product) kan nog L. monocytogenes op het product

terechtkomen. Indien het product gecontamineerd wordt, is de uitgroei van L. monocytogenes

tijdens de bewaring in koeling mogelijk. In deze masterproef zal nagegaan worden wat het

effect is van de hittebehandelingen door de consument (conform de etikettering op het

levensmiddel) op het overleven van L. monocytogenes in kant-en-klare maaltijden en er zal

geverifieerd worden of een afwijking van de huidige tolerantienorm (2 log10 kve/g) kan

4

onderbouwd worden indien rekening gehouden wordt met hittebehandeling door de

consument (zie 1.1.4).

Dit zal onder meer gebeuren a.d.h.v. de validatie van verscheidene groei- en

inactivatiemodellen die in de literatuur beschikbaar zijn en het gedrag van L. monocytogenes

voorspellen (zie 2.5). In geen enkele van deze modellen wordt echter rekening gehouden met

de combinatie van groei en inactivatie. De meeste wetenschappelijke studies beschrijven

immers het gedrag van L. monocytogenes in kant-en-klare maaltijden die geen verhittingsstap

bij de consument vereisen, bv. gerookte zalm (Vermeulen et al. (2010) [11]) of mayonaise-

gebaseerde salades (Vermeulen et al. (2007) [12]). Anderzijds werd in een studie over

frankfurters van Huang et al. [13] enkel een verhitting uitgevoerd, dit onmiddellijk na

inoculatie met L. monocytogenes en zonder bewaring tussen beide stappen.

De groei en inactivatie die worden voorspeld door de beschikbare predictieve modellen,

moeten echter gevalideerd worden in levensmiddelen aangezien deze vaak ontwikkeld

worden op basis van metingen uitgevoerd in homogene laboratoriamedia, waarbij

groeifactoren optimaal zijn [14,15]. Tevens moet ook rekening gehouden worden met de

achtergrondflora, die de uitgroei van L. monocytogenes ook sterk zou beïnvloeden. Bij het

Jameson effect [16] wordt een verlaging van Nmax (maximale concentratie) vastgesteld van

bacteriële populaties door een dominante stam. Zo werd aangetoond dat de concentratie

L. monocytogenes afneemt door een groei van achtergrondflora zoals melkzuurbacteriën [17].

Verder kan het micro-organisme zich aanpassen aan de omgeving: bv. pH – en

temperatuursadaptatie.

In deze masterproef zullen verschillende groeimodellen (bv. Combase [18]), en

inactivatiemodellen (bv. het model van Fernandez et al.(2007) [19]) voor L. monocytogenes

gevalideerd worden op hun toepasbaarheid in kant-en-klare levensmiddelen.

1.1 Listeria monocytogenes

1.1.1 Eigenschappen van Listeria monocytogenes en insleep in de

productieomgeving

L. monocytogenes is een niet-sporenvormende Gram-positieve, facultatief anaërobe

omgevingsbacterie, die pathogeen is voor mens en dier [20]. Het is een psychrotrofe bacterie

die kan overleven en uitgroeien bij lage temperaturen (tot 0°C). Ze komt voornamelijk voor in

vuil, grond, water, feces, maar ook in onbehandelde plantaardige en dierlijke grondstoffen.

Deze bacterie kan op verschillende wijzen een productieomgeving binnenkomen: via grond

5

onder schoenen, kleding, transportmiddelen, dieren en mensen die drager zijn, machines etc.

[20]. Eenmaal in de productieomgeving, blijven ze als omgevingsbacterie aanwezig.

De L. monocytogenes cellen hechten zich vast aan werkoppervlakken, transportbuizen of

afvoerbuizen en kunnen vervolgens aggregeren. Vooral in koele, vochtige omgevingen

vermenigvuldigen ze zich snel. Dit zijn ideale omstandigheden voor biofilmvorming. Een

biofilm is een driedimensionale structuur van micro-organismen, omgeven door een

organische polymere matrix. Eens tot stand gekomen, vormt deze een hoge resistentie tegen

desinfectantia [21].

De groeiparameters van L. monocytogenes worden weergegeven in Tabel 1. Tabel 1: Groeiparameters van Listeria monocytogenes [19,22]

Minimum Optimum Maximum Temperatuur (T) 0°C 37°C 45°C pH 4,3 7 9,4 Wateractiviteit (aw) 0,92 1 1 NaCl (%) 0 0-2 12

1.1.2 Pathogeniteit en listeriosis

Een infectie met L. monocytogenes veroorzaakt listeriosis, met meningo-encephalitis, sepsis

en meningitis als de voornaamste klinische manifestaties [23]. Het is een zeldzame maar

ernstige ziekte met een mortaliteitspercentage van 20-30% [21].

Tot de risicogroepen behoren jongeren, ouderen, zwangere vrouwen en personen met een

onderdrukt immuunsysteem (bv. AIDS – en kankerpatiënten) [24]. Listeriosis gedurende de

zwangerschap kan aanleiding geven tot een miskraam, premature geboorte, neonatale infectie

of neonatale dood [25].

1.1.3 Listeria monocytogenes in voedingsmiddelen

Verschillende soorten levensmiddelen kunnen gecontamineerd zijn met L. monocytogenes:

(i) rauwe levensmiddelen, (ii) verwerkte, niet-verhitte levensmiddelen en (iii) verhitte

producten onderhevig aan post-contaminatie. Niet-gepasteuriseerde zachte kaas (bv:

Camembert) is een voorbeeld van verwerkte producten die geen verhittingsstap hebben

ondergaan. Deze kant-en-klare levensmiddelen, die langere tijd in de koeling worden

bewaard, zijn risico-producten omwille van de psychrotrofe eigenschap van de bacterie [26].

De pathogene bacterie kan ook aangetroffen worden in verwerkte producten die wel een

verhittingsstap hebben ondergaan, maar welke onderhevig zijn aan nabesmetting tijdens

bijvoorbeeld het verpakken (aangezien L. monocytogenes een omgevingsbacterie is).

6

Deze groepen van levensmiddelen werden dan ook specifiek in de wetgeving opgenomen (zie

1.1.4).

Alle producten die een volledige maaltijd vormen en klaar zijn voor consumptie of door de

consument met een eenvoudige behandeling (meestal een verhittingsstap) geschikt kunnen

worden gemaakt voor consumptie, vallen onder de koepel ‘kant-en-klare maaltijden’ of

‘REPFEDs’ [27]. Meestal gaat het om een samengesteld product van verschillende

maaltijdcomponenten (vb. vlees, puree en groenten), gemengd of in afzonderlijke eenheden

verpakt (meervaksverpakking of gescheiden verpakkingscompartimenten). Deze REPFEDs

worden ook wel “cooked chilled foods” genoemd. Voedselveiligheid wordt verzekerd door

een milde hittebehandeling in combinatie met een gekoelde bewaring. Vaak worden ook

andere conserveringsfactoren zoals een gemodificeerde atmosfeer verpakking (MAP) gebruikt

om microbiële veiligheid en kwaliteit te waarborgen. Bij MAP wordt de lucht uit de

verpakking gezogen en vervangen door het gewenste mengsel van N2, CO2 en O2.

De indeling van de verschillende REPFEDs gebeurt op basis van het al dan niet vereist zijn

van een verhittingsstap door de consument en het al dan niet bereiken van P0=2 min.

(P0 = pasteurisatiewaarde). Bij een P0=2 min. wordt gedurende 2 minuten op 70°C verwarmd

(of evenwaardig), wat een 6 log reductie geeft van L. monocytogenes [28, 29] (zie 1.2.1).

In Figuur 2 wordt een overzicht gegeven van de verschillende soorten REPFEDs. De

opsplitsing tussen ready-to-reheat en ready-to-heat maaltijden wordt gemaakt op basis van de

pasteurisatiewaarde. Wanneer P0 < 2 min., spreken we van een ready-to-reheat maaltijd; bij

een ready-to-heat maaltijd is P0 > 2 min. Deze indeling wordt dus bepaald door de

verhittingsprocedure die vereist is voor het product (weergegeven op het etiket).

7

Figuur 2: Indeling van de REPFEDs

Naast de REPFEDs, bestaan ook ready-to-cook levensmiddelen. Hierbij worden geen tijd-

temperatuurcombinaties toegepast bij de producent en wordt opwarming door de consument

noodzakelijk geacht om het product te bereiden en om micro-organismen te elimineren of te

reduceren tot een aanvaardbaar niveau. Voorbeelden zijn diepvriespizza en loempia [26, 30].

1.1.4 Microbiologische criteria

Een microbiologisch criterium wordt in de EU verordening nr. 2073/2005 [31] als volgt

gedefinieerd: “een criterium ter bepaling van de aanvaardbaarheid van een product, een partij

levensmiddelen of een proces, dat berust op de af- of aanwezigheid van micro-organismen of

het aantal daarvan, en/of de hoeveelheid toxinen/metabolieten ervan, per eenheid van massa,

volume of oppervlakte dan wel per partij.” Eén van de belangrijkste punten is het volgende:

“Levensmiddelen mogen geen micro-organismen of toxinen of metabolieten daarvan bevatten

in dusdanige hoeveelheden dat er een onaanvaardbaar risico voor de menselijke gezondheid

ontstaat.”

De Europese regelgeving geeft op de dag van de productie voor alle kant – en – klare

levensmiddelen als doelwaarde een afwezigheid van L. monocytogenes in 25 g van het

product. Wanneer dit niet bereikt wordt, geldt de tolerantiewaarde van maximum

2 log10 kve/g L. monocytogenes cellen gedurende bewaring tot einde houdbaarheid

(Verordening (EG) nr. 2073/2005) [11,31]. De producent kan eventueel opteren voor een

kortere houdbaarheidsdatum, waarbij de hoeveelheid L. monocytogenes gedurende de shelf

life onder de limiet blijft van 2 log10 kve/g, zoals aangetoond door Carrasco et al. [32,33].

gerookte zalm,

sandwiches en pastasalades

° onmiddellijke consumptie zonder een verhittingsstap door de consument Ready-to-eat

REPFEDs Ready-to-reheat

° consumptie na verhittingsstap door de consument ° P0<2 min

lasagne, drievaks-maaltijden

° consumptie na verhittingsstap door de consument ° P0>2 min

Ready-to-heat

pizza (bewaard in de koeling)

8

1.2 Verhittingsstap door de producent en consument

1.2.1 Pasteurisatie door de producent

REPFEDs worden soms thermisch behandeld bij de producent om de microbiële veiligheid en

de gewenste houdbaarheid te garanderen. De D-waarde (in minuten) is de tijd die nodig is

voor 1 log reductie van een bepaald micro-organisme bij een bepaalde temperatuur. De

temperatuurstijging die vereist is om de D-waarde met 1 log te reduceren, wordt de Z-waarde

(in °C) genoemd. Deze log-lineaire relatie tussen de D-waarde en de temperatuur wordt

weergegeven in een thermale dodingstijd (TDT) – curve, zoals in Figuur 3 [34].

Voor L. monocytogenes wordt meestal het volgende pasteuristatiebarema toegepast: twee

minuten bij 70°C (P0 = 2 min.) om een 6 log reductie van L. monocytogenes te bereiken [25].

Weliswaar kan voor elke tijd-temperatuur combinatie een P-waarde berekend worden (zie

materialen en methoden). Bij een hogere temperatuur is een kortere tijd nodig om een 6 log

reductie te bekomen (zie Figuur 4).

Z

Figuur 3: Thermale dodingstijd-curve

Figuur 4: Tijd-temperatuur-curve (P-waarde): ______ P0 = 2 min., ______ P0 = 2 min. met een snellere 6 log reductie door een hogere temperatuur

9

Door de evolutie in consumentengedrag, komen de klassieke pasteurisatiebarema’s echter

meer en meer op de helling te staan. Enerzijds is er een stijging van de productie en de

consumptie van kant-en-klare maaltijden, anderzijds komen er ook meer levensmiddelen op

de markt die slechts minimaal hittebehandeld zijn omwille van het optimaal bewaren van

smaak, vitaminen en textuur. Bij deze laatste producten is de controle van overlevende micro-

organismen een belangrijk veiligheidsaspect. De drie belangrijkste factoren die de

microbiologische veiligheid bepalen, zijn: 1) intensiteit van de warmtebehandeling en duur, 2)

de snelheid waarmee de afkoeling gebeurt, en 3) de controle van tijd en temperatuur van de

gekoelde opslag [35].

Om kruiscontaminatie bij napasteurisatieprocessen (zoals het verpakken van het product) te

beletten, wordt momenteel ook gebruik gemaakt van niet-thermische conserveringsmethoden

zoals hoge hydrostatische druk, irradiatie en het gebruik van natuurlijke bio-conservaties,

welke efficiënt zijn bij inactivatie van micro-organismen (met uitzondering van

sporenvorming) [36]. De klassieke technieken zijn microgolven, stoompasteurisatie en sous

vide koken waarbij de ingrediënten vacuüm verpakt en vervolgens verhit worden [35].

Hoewel deze technieken een bewezen effectiviteit hebben, hebben ze daarnaast ook een aantal

nadelen: bij vacuüm verpakken verliezen zachte producten hun structuur door druk van de

buitenlucht. Hierdoor is het uitzicht van het levensmiddel niet meer optimaal. Stoom

pasteurisatie kan de kleur beïnvloeden en kan effect hebben op de structuur van het

levensmiddel, zoals beschreven in een studie van Sommers et al. [37].

1.2.2 Nabesmetting

De productie van veilig voedsel is gebaseerd op de uitvoering en toepassing van algemene

preventieve maatregelen zoals Goede Hygiënische Praktijken (GHP) en Good Manufacturing

Practices (GMP) [38]. Het is belangrijk om te zorgen voor een volledige scheiding van rauwe

en kant-en-klare levensmiddelen op gebied van ontvangst, opslag, bereiding, display, en

service [39]. Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP) is een risico-inschatting

voor de productie van voedingsmiddelen. Bedrijven die levensmiddelen bereiden, verwerken,

behandelen, verpakken, vervoeren en distribueren, dienen hierdoor alle aspecten van het

productieproces te identificeren en op gevaren te analyseren. Dit controleproces, verplicht

door de Europese Unie, zorgt ervoor dat het productieproces van alle voedingsmiddelen

gepaard gaat met zo weinig mogelijk risico op besmetting om zo de veiligheid van het product

te verhogen [27].

10

Niettegenstaande dat deze normen zo goed mogelijk worden opgevolgd, kan er in sommige

producten toch L. monocytogenes worden aangetroffen ten gevolge van nabesmetting tijdens

het versnijden, afvullen en verpakken [4, 31, 33]. Deze postcontaminatie is voornamelijk te

wijten aan afwijkingen van de standaard hygiënische praktijken door het personeel (vb.

vervuilde handschoenen), vervuilde uitrusting of gereedschap. Maar ook door druppels vocht

of stofdeeltjes kan L. monocytogenes terechtkomen aan het oppervlak van het product, daar

L. monocytogenes een omgevingsbacterie is [39]. Indien er na het verpakken geen

hittebehandeling meer wordt toegepast, is er een risico dat de aanwezige L. monocytogenes

uitgroeit tijdens de bewaring.

1.2.3 Verhittingsstap door de consument en consumentengedrag

1.2.3.1 Verhittingsstap door de consument

De finale verhittingsstap wordt op de verpakking omschreven. In de veronderstelling dat de

consument het protocol nauwkeurig volgt, kan de vraag gesteld worden of er voldoende

inactivatie plaatsvindt. Coote et al [40] bestudeerde de afdoding van L. monocytogenes in

laboratoriummedium en in kip: wanneer de voorschriften omtrent opwarming in de

microgolfoven correct werden opgevolgd, werd een reductie van meer dan 6 log kve/g

waargenomen. In de studie van Mejia et al [41] werd daarentegen P0=2 min. niet behaald,

waardoor er onvoldoende afdoding was in een Kip Tandoori maaltijd (bestaande uit rijst,

tandoorisaus, groenten en kip). Het effect van verhitten met de microgolfoven op

L. monocytogenes en het al dan niet behalen van P0=2 min. moet nog verder onderzocht

worden om dergelijke tegenstrijdigheden op te helderen.

1.2.3.2 De relatie tussen consumentengedrag en voedselveiligheid

Het correct handelen van de consument voor wat betreft voedselveiligheid, kan in twijfel

getrokken worden: Jevsnik et al [42] tonen aan dat, door een gebrek aan kennis, de

voedselveiligheid in het gedrang komt. Bij ernstige afwijkingen kan dit voedselinfecties of

- intoxicaties tot gevolg hebben.

Zo gebruikte 50% van de respondenten uit de studie nooit een koeltas voor het vervoer van

ingevroren of gekoelde levensmiddelen en lieten ze het vlees ontdooien op werkoppervlakken

bij kamertemperatuur. Daarnaast was ongeveer de helft (44%) van de respondenten niet op de

hoogte van de juiste koelkasttemperatuur voor de opslag van bederfelijke producten.

Verder is er ook een verschuiving in het consumentengedrag. Volgens de studie van Costa et

al [43] wordt, naast de thuisbereide maaltijden, ook vaak gekozen voor een kant-en-klare

11

maaltijd. De voornaamste argumenten bij het thuis bereiden van een maaltijd zijn versheid en

de lage kost. Daarentegen vormt gemakzucht de doorslaggevende factor bij kant-en-klare

maaltijden. Over de minder goede smaak van de REPFEDs zijn beide groepen het wel met

elkaar eens. In de studie van Geeroms et al [1] worden een aantal psychologische factoren

onderzocht die de variatie in consumentengedrag kunnen verklaren zoals kennis, attitudes en

sociale normen. Het verschillend gedrag van consumenten gaat gepaard met de verschillende

betekenissen die zij geven aan een goede gezondheid De studie resulteerde in een

onderverdeling van vijf groepen: (i) energetische experimenteerders (gezondheid is gelinkt

aan energie), (ii) genieters (genieten van het leven), (iii) verzorgers (sociaal welzijn), (iiii)

experts (presteren, slim en ambitieus zijn), (iiiii) rationalisten (autonomie: goede balans

tussen werk en familie). Uit dit onderzoek blijkt dat de experimenteerders en de experts een

positievere ingesteldheid hebben t.o.v. kant-en-klare maaltijden.

De GfK consumer scan, uitgevoerd door GfK Panel Services Benelux, een

marktonderzoeksbureau, geeft aan dat het gebruik van kant-en-klare maaltijden significant

hoger is bij consumenten jonger dan 30 jaar; terwijl het bij consumenten ouder dan 50 jaar

een kleiner deel uitmaakt van de dagelijkse inname van voedsel [44].

1.3 Het bepalen van de groeipotentieel voor Listeria monocytogenes

De groei van L. monocytogenes wordt geëvalueerd aan de hand van een challenge test, een

test vastgelegd door de EU guideline, met een protocol beschreven in het ‘Technical

Guidance Document on shelf life studies for Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods’

dat door EU CRL (EU Community Reference Laboratory) werd opgesteld [45].

Bij deze test wordt de volledige procedure van inoculeren, verpakken, bewaren en uitplaten

beschreven, met als doel de groei van L. monocytogenes te evalueren. Hierbij is het belangrijk

dat er rekening gehouden wordt met de variabiliteit in biologische factoren,

voedselkarakteristieken en opslagcondities [46]. Een challenge test kwantificeert de

groeipotentieel (δ) van L. monocytogenes: dit is het maximale verschil (van drie batchen)

tussen de mediaan van de L. monocytogenes concentratie (in log kve/g) op einde

houdbaarheid en de mediaan van de beginconcentratie [47]. Wanneer de groeipotentieel

groter is dan 0,5 log10 kve/g, is er een significant verschil en wordt verondersteld dat het

voedsel in staat is om de groei van L. monocytogenes toe te laten. Wanneer de groeipotentieel

kleiner is dan 0,5 log10 kve/g, dan is er geen significant verschil. Om de mediaan te kunnen

bepalen, worden de producten elk in drievoud getest.

12

In het huidige protocol wordt een startinoculum van 50 kve/g vooropgesteld en moet een

overschrijding van 100 kve/g vermeden worden om een zo realistisch mogelijke besmetting

na te bootsen [45].

De challenge test heeft als voordeel dat het vrij eenvoudig is om te implementeren en dat de

resultaten onmiddellijk kunnen gebruikt worden. Het voornaamste nadeel is het gebrek aan

flexibiliteit bij de interpretatie: de resultaten zijn alleen geldig voor de onderzochte

levensmiddelen bij de onderzochte voorwaarden, zodat er telkens nieuwe experimenten

moeten worden uitgevoerd bij elke verandering, zoals verandering van productsamenstelling,

ingrediëntenmix, verpakkingscondities of tijd-temperatuurprofielen.

De informatie die bekomen wordt uit een challenge test, wordt in Figuur 5 [45] weergegeven.

Deze informatie kan verder ondersteund worden door predictieve microbiologie (zie 1.4).

L.m.: Listeria monocytogenes

Figuur 5: Data bekomen uit een challenge test [45]

Challenge test

Kant-en-klare maaltijden ondersteunen de groei van L.m

Kant-en-klare maaltijden ondersteunen de groei van L.m niet

Groeipotentieel (δ) vb. δ = 0,3

Beginconcentratie L. m vb. beginconcentratie = 1,6 log kve/g

Beginconcentratie L.m zodat de limiet van 2 log10 kve/g op einde houdbaarheid

gerespecteerd wordt Eindconcentratie L. m vb. eindconcentratie = 1,9 log

kve/g

13

1.4 Predictieve microbiologie

Predictieve microbiologie is het gebruik van wiskundige vergelijkingen om microbieel gedrag

te beschrijven. Het is een domein binnen de levensmiddelenmicrobiologie waarbij microbiële

responsen op omgevingsfactoren gemeten worden onder gecontroleerde condities.

In de EU-verordening nr. 2073/2005 wordt de predictieve microbiologie vermeld als

ondersteuning ter preventie van de uitgroei van L. monocytogenes [31].

Toch geven voorspellende modellen slechts een schatting van de groeiparameters van een

micro-organisme. Enige afwijking van de realiteit is dus mogelijk aangezien het onmogelijk is

om alle productspecifieke karakteristieken in rekening te brengen [16].

In de literatuur zijn verschillende predictieve modellen beschikbaar die het gedrag van micro-

organismen in levensmiddelen beschrijven en hun toepassing vinden in het wetenschappelijk

onderzoek en de voedingsindustrie [33].

Primaire modellen [34] beschrijven de evolutie van de celdensiteit in functie van de tijd en

omvatten groei-, inactivatie - en overlevingscurves. De groeifunctie is klassiek een sigmoïdale

functie, bestaande uit drie fasen zoals beschreven in Figuur 6: 1) lagfase, 2) exponentiële

groeifase en 3) stationaire fase. Hierbij zijn er vier belangrijke parameters: lag (λ),

groeisnelheid (μ), maximum celdichtheid (Nmax) en initiële celdichtheid (N0) [48].

Inactivatiecurves kunnen verschillende vormen aannemen, zoals weergegeven in Figuur 7

[49].

Concentratie (Log (kve/g)

Nmax

μmax N0

λ Tijd (dagen) Figuur 6: Een voorbeeld groeicurve

3

2

1

14

Concentratie Concentratie (log kve/g) (log kve/g) tijd tijd Figuur 7: Inactivatiecurves: Links: ∆ lineair, x lineair met een staart, □ sigmoïdaal, o lineair voorafgegaan door een schouder. Rechts: ∆ bifasisch, x concaaf, □ bifasisch met schouder, o convex [49]

Secundaire modellen beschrijven het effect van de omgevingscondities op de parameters van

de primaire modellen – dit kunnen zowel intrinsieke (vb. pH en wateractiviteit (aw)) als

extrinsieke (vb. temperatuur (T) en MAP) factoren zijn. Tertiaire modellen zijn

gebruiksvriendelijke softwarepakketten die de modellen onmiddellijk toepasbaar maken (vb.

ComBase [18] en Seafood Spoilage and Safety Predictor (SSSP) [50]).

In deze studie wordt gebruik gemaakt van SSSP en Combase voor het voorspellen van de

groeicurven, rekening houdend met de waarden van de parameters (aw, temperatuur, NaCl %,

pH, droge stof, …). Er zijn niet veel inactivatiemodellen beschikbaar en er is geen bruikbare

software voor deze studie (zie discussie).

15

2. Materialen en methoden

2.1 Gebruikte levensmiddelen in challenge testen

De keuze van de drie producten werd gebaseerd op de interesse van de industrie. Er werden

drie soorten maaltijden onderzocht: (i) een pastamaaltijd (lasagne bolognaise), (ii) een

vismaaltijd (poisson parmentier) en een vleesmaaltijd (braadworst met puree en rode kool).

2.1.1 Lasagne bolognaise

Voor de eerste drie challenge testen werd gebruik gemaakt van

drie batchen lasagne bolognaise. Het product is 28 dagen

houdbaar en volgende instructies moeten uitgevoerd worden door

de consument: “de inhoud op een bord leggen, afdekken en 4

minuten opwarmen in een microgolfoven bij 900 Watt”. Figuur 8 : Lasagne bolognaise

2.1.2 Poisson parmentier (Puree met visblokjes)

Voor de volgende drie challenge testen werd gebruik gemaakt van

drie batchen puree met visblokjes. Het product is 45 dagen

houdbaar en moet opgewarmd worden gedurende 3 minuten op 650

Watt (folie doorprikken).

Figuur 9 : Poisson Parmentier (Puree met visblokjes)

2.1.3 Puree met rode kool en braadworst

Het derde product is 10 dagen houdbaar en moet worden

opgewarmd in de microgolfoven gedurende 5 minuten op 850

Watt.

Figuur 10 : Puree met rode kool en braadworst

16

2.2 Bepaling van intrinsieke factoren

Op dag 0 en einde houdbaarheid werden verschillende intrinsieke parameters bepaald:

zuurtegraad (pH), zoutgehalte, aw, gassamenstelling, droge stof en redoxpotentiaal. Deze

werden gebruikt om de variabiliteit tussen de batchen te kennen en als input voor de

predictieve modellen. Om de zuurtegraad te bepalen, werd het staal gemixt in een blender

(Turbo 600W, Braun, Spain) en werd de pH gemeten met een steekelektrode (SevenEasy

Mettler Toledo, Schwerzenbach, Switserland). Het zoutgehalte werd bepaald aan de hand van

de Mohr methode: een titrimetrische bepaling van chloriden. Deze methode is gebaseerd op

volgend principe: het zout wordt geëxtraheerd met warm water. De chloride-ionen worden

bepaald met behulp van een neerslagtitratie uit zilvernitraat.

De wateractiviteit is een maat voor de hoeveelheid beschikbaar water of de verhouding van

waterdampspanning boven het medium tot deze boven zuiver water. Dit wordt gemeten aan

de hand van een cryometer (NAGY Mabsysteme, GmbH Gäufelden, Germany) [11, 51].

De gassamenstelling (CO2, O2 en N2) werd gemeten aan de hand van een Gullimex

(Checkmate 9900, PBI Dansensor, Ringsted, Denemarken), dit door te prikken door een

septum.

De droge stof bepaling heeft als doel de hoeveelheid water te kunnen bepalen. Dit gebeurt aan

de hand van het drogen van een schaaltje zeezand (Merck KGaA, Darmstadt, Germany),

toevoegen van het gemixte staal en meting van de massa na drogen in de droogstoof.

De redoxpotentiaal werd gemeten met behulp van een redox-meter (PBI Dansensor, Ringsted,

Denemarken).

2.3 Uitvoeren van de challenge testen volgens EU CRL for Listeria monocytogenes

Binnen deze masterproef werd nagegaan welke van de bestaande groei- en

inactivatiemodellen kunnen toegepast worden op kant-en-klare maaltijden. Daarvoor werd de

door de modellen voorspelde groei en/of reductie van L. monocytogenes vergeleken met

resultaten van de challenge testen om zo de accuraatheid en de nauwkeurigheid van het model

te valideren [45]. Het volledige proces van bewaring en hittebehandeling wordt weergegeven

in Figuur 11.

17

Figuur 11: Overzicht: volledige proces van bewaring en hittebehandeling.

Omdat een challenge test arbeidsintensief is, worden per batch van producten slechts drie

herhalingen uitgevoerd. Eén challenge test bestaat dus uit één batch per product, elk staal

wordt in een batch in drievoud getest. In de studie werden drie batches en drie producten

opgenomen, wat overeenkomt met negen challenge testen [45]. Er werd gekozen voor drie

producten om de variabiliteit in groeipotentieel te testen.

Per batch werden 30 producten getest:

Figuur 12: Overzicht van het aantal producten

2.3.1 Inoculumvoorbereiding

2.3.1.1. Opkweek van stammen en bereiden van inoculum

Voor de start van deze masterproef, werden drie verschillende stammen L. monocytogenes

geselecteerd, nl. LMG 23194, LFMFP 392 en LFMFP 491. Deze drie stammen werden

gekozen op basis van eerdere ervaringen met deze stammen in het labo, waardoor ze goed

gekarakteriseerd zijn. Bij de opkweek van het inoculum werd gestart vanaf een cultuur

bewaard bij -75°C. Hiervoor werd de cultuur geënt op glasparels in een glyceroloplossing.

Einde houdbaarheid Bewaring Dag nul

° koude product: staalname en

uitplaten ° verhitte product:

staalname en uitplaten

° parameters bepalen

Dag x: staalname en

uitplaten

Dag y: ° staalname en

uitplaten

Dag z: ° staalname en

uitplaten

° inoculatie ° staalname en

uitplaten ° parameters

bepalen

Einde houdbaarheid

Reserves Parameters Dag x, y, z Dag nul

° uitplaten koude

product: 3 ° uitplaten

verhitte product: 3

° blanco’s: 2

3 x (3 voor inoculatie + een blanco)

= 12

Bepalen parameters:

3

4

inoculatie + een blanco:

3

18

Van elke stam werd een glasparel in een broth Brain Heart Infusion (BHI) gebracht en

geïncubeerd bij 30°C gedurende 24 uur [11]. Vervolgens werd van elke stam 0,1 ml overgeënt

in een nieuwe proefbuis met BHI broth, die 24 uur geïncubeerd werd bij 37°C. Nadien werd

een subcultuur van 0,1 ml in BHI gebracht en gedurende 4 dagen bij 7°C geplaatst. Deze

bewaring bij lage temperatuur geeft de stam de tijd om zich aan te passen aan de

bewaartemperatuur tijdens de challenge test. Stammen werden ook voor maximum een maand

bewaard op slantcultuur bij 4°C.

Een mix van de drie stammen werd aangemaakt en verdund in Peptone Physiological Solution

(PPS, Oxoid) om het celaantal te bepalen voor inoculatie, rekening houdend met het gewenste

inoculatieniveau van 50 kve/g. De drie stammen afzonderlijk werden eveneens verdund, dit

om het celaantal in de mix te checken. Er werd telkens serieel met een factor 10 verdund: 1ml

van een stam of van de mix werd aangelengd met 9 ml PPS. Dit werd herhaald tot de

gewenste verdunning bereikt werd [52].

PPS wordt gemaakt door 0,1% neutralized bacteriological peptone (Oxoid) en 0,85% NaCl op

te lossen in gedemineraliseerd water.

Om de zuiverheid van de stammen na te gaan, werd een 4x4 uitplating uitgevoerd op Trypton

Soy Agar (TSA, Oxoid, Basingstoke, GB) (24 uur bij 37°C incuberen) [11,47].

Voor het bepalen en standaardiseren van de opkweekcultuur werd de procedure voor elke

stam zes keer herhaald (één dag bij 37°C en vier dagen bij 7°C) en uitgeplaat op TSA-platen.

Op die manier kon de start van de stationaire fase bepaald worden [11]. Op basis van de

bepaling werd de verdunning berekend aan 50 kve/g [45].

2.3.2 Inoculatie, bewaring en uitplating

De stalen werden geïnoculeerd met de L. monocytogenes mix [41]. Dit gebeurde aan de hand

van een druppelsgewijze verspreiding over de producten. Voor de blanco’s werd gebruik

gemaakt van PPS om na te gaan of de hoeveelheid zout, aanwezig in PPS, geen invloed had

op de groei. De stalen werden MAP verpakt d.m.v. een schalensluiter (MECA 900,

Decatechnic, België), een verpakkingstoestel dat gebruikt werd in combinatie met een

gasmenger (Airproducts, Witt-gasetechnik, Witten, Duitsland). In de verpakking werd de

gassamenstelling (bestaande uit N2, CO2 en O2) gebracht zoals aangegeven door de industrie.

Het initieel CO2 in de kopruimte zal oplossen in het product en na een 2-tal uren ontstaat een

evenwicht in het product.

19

De hoeveelheid opgeloste CO2 wordt bepaald door drie factoren: de temperatuur, het initiële

CO2-gehalte en de gas-product verhouding. Hoe lager de temperatuur, hoe meer CO2 oplost in

het product en bijgevolg hoe lager het CO2-gehalte (bij constante gas-product verhouding) dat

gemeten wordt in de kopruimte [53]. Vervolgens werden de producten opnieuw verpakt en

bewaard bij de koeltemperatuur [17].

Figuur 13: Tray sealer (MECA 900, Decatechnic, België)

De producten werden bewaard in de koelcel bij 7°C, de maximaal wettelijke temperatuur voor

retail in België [34] aangezien de groeisnelheid of verdubbelingstijd moest bepaald worden.

Bij het uitplaten werd 10-20 g van elk staal in een stomacherzak gebracht en tienmaal verdund

door aan te lengen met PPS. Na het stomacheren, waarbij een optimale overdracht van de

micro-organismen op het staal naar de verdunningsvloeistof werd verkregen, werd 1 ml

mengsel overgebracht in een proefbuis met 9 ml PPS [54]. Hieruit werd verder verdund. Deze

laatsten werden dan uitgeplaat. Dit gebeurde aan de hand van strijkplaten (100μl), nl. ALOA

en gietplaten (1ml), nl. PCA, RCA en MRS.

Agar Listeria selon Ottaviani & Agosti (ALOA, Biolife, Milano, Italy) + supplement (ALOA

Enrichment Supplement en ALOA Selective Supplement) is een selectief medium voor de

isolatie van L. monocytogenes [41]. Na inoculatie werden de platen 24 uur vochtig

geïncubeerd bij 37°C. Om uitdroging te voorkomen, werden de platen samen met een prop nat

papier in een afgesloten plastic zak geplaatst.

Plate Count Agar (PCA, Oxoid) werd gebruikt voor het totaal aëroob kiemgetal (5 dagen bij

22°C incuberen) [54]. Met Reinforced Clostridial Agar (RCA, Oxoid) kon het anaëroob

20

kiemgetal bepaald worden. Deze platen vereisten een extra toplaag en werden na inoculatie

gedurende vijf dagen bij 30°C geplaatst. De petriplaten werden in een extra recipiënt

geplaatst, waaraan een zuurstofscavenger (anaerogen, Oxiod) werd toegevoegd. Man Rogosa

Sharpe (MRS, Oxoid) [41] is een groeimedium dat gebruikt werd voor de bepaling van

melkzuurbacteriën (5 dagen bij 22°C incuberen). Ook deze platen vereisen een deklaag.

Na incubatie konden de platen geteld worden, om vervolgens de concentratie

L. monocytogenes cellen te bepalen [34].

De groeipotentieel (δ) is het verschil tussen de mediaan van log10 kve/g op einde

houdbaarheid en de mediaan van log10 kve/g van de beginconcentratie [41]. Wanneer

δ > 0,5 log10 kve/g, dan is er een significant verschil en wordt verondersteld dat het product

groei van L. monocytogenes toelaat, wanneer δ ≤ 0,5 log10 kve/g dan is er geen significant

verschil.

2.4 Inactivatie van Listeria monocytogenes tijdens opwarming

2.4.1. Temperatuursregistratie

Op einde houdbaarheid werd het product opgewarmd in de microgolfoven. De temperatuur

werd gedurende deze verhitting geregistreerd door middel van een temperatuursonde

(DataTrace, Senze Instruments, Battice, België). Bij deze opwarming werd telkens in het

midden en aan de rand van de maaltijd gemeten. Hierbij is het belangrijk dat de voorschriften

omtrent de opwarmingsprocedure correct gevolgd worden.

Uit het temperatuur-tijd-profiel konden de P0-waarden bepaald worden met behulp van

formule (1). Vervolgens kon nagegaan worden of P0 = 2 min. bereikt werd (zie Figuur 4 in

1.2.1).

P0 = ∑푡 ∗ 10°

, (1)

2.5 Modelselectie en validatie

Aan de hand van groeidata, temperaturen, modelparameters en celaantallen werd getracht om

de vraagstelling te beantwoorden. Om een beeld te krijgen over de overeenkomsten tussen de

door de modellen voorspelde groeiresponsen en deze geobserveerd in de desbetreffende

voedingsmiddelen, werd gebruik gemaakt van softwarepaketten zoals ComBase [18] en

21

Seafood Spoilage & Safety Predictor (SSSP), waarbij een onderscheid gemaakt werd tussen

enerzijds groeimodellen en anderzijds thermische inactivatiemodellen.

De modellen werden geselecteerd op basis van de waarden van de intrinsieke en extrinsieke

parameters (aw, temperatuur, % NaCl, pH, droge stof, …).

In deze studie werden verschillende groei- en inactivatiemodellen voor L. monocytogenes

gevalideerd op hun toepasbaarheid in kant-en-klare levensmiddelen. Dit gebeurde aan de hand

van verschillende tools.

Eerst werd de verdubbelingstijd berekend voor de experimentele waarden en nadien voorspeld

met Combase en SSSP. Dit is enkel mogelijk bij constante temperatuur.

Verder werd, naast een visuele vergelijking van de experimentele en de voorspelde groei – en

afdodingscurves, eveneens de bias – en accuraatheidsfactor bepaald, weergegeven in formule

(2) en (3) [55].

De accuraatheidsfactor is een maat voor het vertrouwen dat kan gesteld worden in de

voorspellingen van het model en geeft de over- of onderschatting van het model weer. De

biasfactor geeft de afwijking van de werkelijke waarden t.o.v. de voorspellingen [54].

푎푐푐푢푟푎푎푡ℎ푒푖푑푠푓푎푐푡표푟 = exp[∑ ∑ ( ( , ) )²

∑ ] (2)

푏푖푎푠푓푎푐푡표푟 = exp∑ ∑ ( ( , ) )

∑ (3)

22

3. Resultaten 3.1 Fysicochemische parameters

Voor elk product werden de intrinsieke parameters (zie materialen en methoden) gemeten op

dag 0 en einde houdbaarheid zoals weergegeven in tabel 2, 3, 4. Er werd gebruik gemaakt van

drie producten: (i) een pastamaaltijd (lasagne bolognaise), (ii) een vismaaltijd (poisson

parmentier) en een vleesmaaltijd (braadworst met puree en rode kool).

In de drie producten blijven zowel pH en aw vrij stabiel met een kleine standaarddeviatie op

de analyse. Een lichte daling van de pH naar einde houdbaarheid toe kan verklaard worden

door de toename van bederfflora. Voor de gebruikte REPFEDs liggen deze pH- en aw-

waarden binnen de groeigrenzen van L. monocytogenes. Het percentage droge stof, het

zoutgehalte en het percentage O2 dalen licht (respectievelijk tussen 5-10%, 0,01-0,5% en 0,5-

1%). Het CO2-gehalte vertoont een grote variabiliteit waardoor het moeilijk is om enkel op

basis van de intrinsieke parameters conclusies te trekken. Bij de pasta – en vismaaltijd daalt

het CO2-gehalte, bij de vleesmaaltijd daarentegen is er een stijging. De pastamaaltijd heeft een

vrij hoge redoxpotentiaal in vergelijking met de andere twee producten.

3.2 Algemene microbiologische analyse

Figuren 14, 15 en 16 tonen het totaal aëroob kiemgetal (TAK) (Figuur 14a, 15a, 16a), het

totaal anaëroob kiemgetal (TAnK) (Figuur 14b, 15b, 16b) en het aantal melkzuurbacteriën

(MZB) (Figuur 16c) voor de geïnoculeerde producten, bewaard bij een constante temperatuur

van 7°C. De curven voor de niet-geïnoculeerde producten lopen vrij gelijkaardig. De

stationaire fase wordt in de pastamaaltijd bereikt na ongeveer 17 dagen, in de vismaaltijd na

ongeveer 15 dagen. In de vleesmaaltijd is er echter een blijvende stijging. Het totaal aëroob en

anaëroob kiemgetal bij de geïnoculeerde stalen loopt vrij gelijk op met de groei van L.

monocytogenes, daar deze pathogene bacterie facultatief anaëroob is (zie Figuur 17). In de

vleesmaaltijd ligt het TAK, TAnK en het aantal melkzuurbacteriën echter een stuk hoger.

De interbatch-variabiliteit is vrij laag, waaruit geconcludeerd kan worden dat de producten

zeer homogeen geproduceerd werden.

23

De resultaten tonen aan dat op dag nul het TAK en TAnK in de pasta- en vismaaltijd binnen

de aanvaardbare limieten ligt [56]. Het aantal melkzuurbacteriën in deze twee producten is

lager dan 1 log10 kve/g.

Op dag nul liggen TAK en TAnK in de drie-componenten-maaltijd (rode kool met puree en

braadworst) veel hoger dan de doelwaarden (3 log10 kve/g) maar wel onder de

tolerantiegrenzen (4 log10 kve/g).

Deze maaltijd bevat op dag nul, in tegenstelling tot de eerste twee producten, een aanzienlijke

hoeveelheid melkzuurbacteriën, welke gemiddeld de tolerantiewaarde (3 log10 kve/g)

overtreft. Het aantal melkzuurbacteriën is dus microbiologisch minder aanvaardbaar in dit

product. Tabel 2 : Intrinsieke factoren op dag 0 en einde houdbaarheid in de pastamaaltijd, geïncubeerd bij 7°C.

(*) enkel gemeten voor batch 3

Parameter Batch Dag 0 Dag 28 pH 1 5,6 ± 0,1 5,7 ± 0,2

2 5,5 ± 0,1 5,6 ± 0,1

3 5,8 ± 0,2 5,7 ± 0,4 Gassamenstelling (O2) 1 0,85% ± 0,09% 0% ± 0% (initieel) 2 0,32% ± 0,12% 0% ± 0% 3 1,20% ± 0,34% 0,33% ± 0,08% Gassamenstelling (CO2) 1 25,60% ± 1,57% 12,20% ± 1,12% (initieel) 2 17,30% ± 0,99% 12,20% ± 0,89% 3 16,50% ± 2,23% 12,30% ± 1,89% aw 1 0,9913 ± 0,0002 0,9909 ± 0,0001

2 0,9913 ± 0,0003 0,9903 ± 0,0003

3 0,9910 ± 0,0002 0,9908 ± 0,0004 Droge stof 1 26,33% ± 0,75% 26,99% ± 0,67%

2 27,83% ± 0,87% 27,18% ± 0,59%

3 27,13% ± 1,02% 20,19% ± 1,03% NaCl % 1 1,15% ± 0,08% 0,95% ± 0,13%

2 1,12% ± 0,14% 0,98% ± 0,23%

3 0,83% ± 0,21% 0,83% ± 0,13% Redoxpotentiaal (*) 1

2 3 190 mV ± 3,54 mV 212 mV ± 4,12 mV

24

Tabel 3 : Intrinsieke factoren op dag 0 en einde houdbaarheid in de vismaaltijd, geïncubeerd bij 7°C. Parameter Batch Dag 0 Dag 45 pH 1 6,0 ± 0,1 6,1 ± 0,2

2 5,9 ± 0,3 5,5 ± 0,3

3 5,9 ± 0,2 5,5 ± 0,1 Gassamenstelling (O2) 1 1,11% ± 0,38% 1,70% ± 0,21% (initieel) 2 1,87% ± 0,32% 0,71% ± 0,34%

3 1,50% ± 0,41% 0,30% ± 0,09%

Gassamenstelling (CO2) 1 20,40% ± 2,02% 16,50% ± 1,78% (initieel) 2 16,80% ± 1,98% 10,80% ± 1,34% 3 17,00% ± 2,30% 11,31% ± 1,88% aw 1 0,9937 ± 0,0003 0,9926 ± 0,0003

2 0,9917 ± 0,0001 0,9912 ± 0,0002

3 0,9916 ± 0,0004 0,9910 ± 0,0001 Droge stof 1 20,76% ± 2,41% 20,31% ± 2,02%

2 21,08% ± 2,33% 27,59% ± 1,77%

3 29,11% ± 1,89% 22,97% ± 1,98% NaCl % 1 0,95% ± 0,0045% 0,73% ± 0,0034% 2 0,93% ± 0,0030% 0,77% ± 0,0041% 3 0,81% ± 0,1000% 0,82% ± 0,0100% Redoxpotentiaal (**) 1

2 155 mV ± 4,24 mV 190 mV ± 5,10 mV

3 163 mV ± 2,78 mV 184 mV ± 3,80mV (**) enkel gemeten voor batch 2 en 3

Tabel 4a : Intrinsieke factoren op dag 0 en einde houdbaarheid in de vleesmaaltijd, geïncubeerd bij 7°C.

braadworst puree rode kool Parameter Batch Dag 0 Dag 10 Dag 0 Dag 10 Dag 0 Dag 10 pH 1 6,1 ± 0,1 5,9 ± 0,5 6,0 ± 0,3 4,9 ± 0,1 4,6 ± 0,5 4,2 ± 0,3

2 6,1 ± 0,4 5,8 ± 0,3 6,1 ± 0,2 4,9 ± 0,2 4,2 ± 0,2 3,8 ± 0,2 3 6,0 ± 0,2 5,7 ± 0,1 5,9 ± 0,4 4,7 ± 0,4 4,7 ± 0,3 4,1 ± 0,1 aw 1 0,9932 ± 0,0002 0,9899 ± 0,0004 0,9934 ± 0,0012 0,9928 ± 0,0007 0,9981 ± 0,0005 0,9973 ± 0,0004

2 0,9900 ± 0,0010 0,9887 ± 0,0005 0,9936 ± 0,0011 0,9931 ± 0,0004 0,9970 ± 0,0003 0,9965 ± 0,0002 3 0,9934 ± 0,0005 0,9887 ± 0,0005 0,9931 ± 0,0008 0,9931 ± 0,0001 0,9983 ± 0,0002 0,9965 ± 0,0003 Droge stof 1 37,18% ±1,49% 34,54% ±2,57% 21,90% ± 2,78% 15,90% ± 0,88% 14,75% ± 0,78% 16,78% ± 1,09%

2 38,24% ±1,28% 36,14% ±0,98% 22,52% ± 1,55% 15,70% ± 0,77% 13,46% ± 0,98% 17,86% ± 0,97% 3 36,30% ±1,55% 28,56% ±1,44% 18,54% ± 0,78% 17,99% ± 1,04% 15,87% ± 0,55% 16,03% ± 2,52% NaCl % 1 1,10% ± 0,11% 0,98% ± 0,23% 0,83% ± 0,24% 0,97% ± 0,21% 0,85% ± 0,15% 0,81% ± 0,08%

2 1,21% ± 0,05% 0,96% ± 0,12% 0,85% ± 0,12% 1,01% ± 0,34% 0,85% ± 0,18% 0,83% ± 0,09% 3 1,06% ± 0,25% 0,94% ± 0,14% 0,82% ± 0,32% 0,89% ± 0,15% 0,82% ± 0,19% 0,79% ± 0,15% Redoxpotentiaal 1 135mV±3,74mV 122mV±5,4mV 131m ±1,78mV 123mV±3,54mV 179mV±2,75mV 143mV±3,54mV

2 142mV±5,78mV 121m ±3,55mV 137m ±2,54mV 125mV±1,45mV 173mV±3,88mV 151 mV±1,98mV 3 137mV±3,43mV 125m ±2,54mV 140mV±1,75mV 128m ±3,33mV 169mV±1,09mV 157mV ±3,75mV

25

Tabel 4b : Gassamenstelling op dag 0 en einde houdbaarheid in de vleesmaaltijd, geïncubeerd bij 7°C.

a. b.

Figuur 14: (a)TAK, (b) TAnK op de geïnoculeerde lasagne bolognaise (■ batch 1, ♦ batch 2, ▲ batch 3).

a. b.

Figuur 15: (a)TAK, (b) TAnK op de geïnoculeerde vismaaltijd (■ batch 1, ♦ batch 2, ▲ batch 3).

Parameter Batch Dag 0 Dag 10 Gassamenstelling (CO2) 1 20,70% ±0,12% 29,90% ± 0,34% (initieel) 2 21,00% ±0,34% 30,70% ± 0,41% 3 20,90% ±0,98% 30,70% ± 1,3%

0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,0

10,0

0 10 20 30

conc

entr

atie

(log

kve

/g)

tijd (dagen)

0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,0

10,0

0 5 10 15 20 25 30

conc

entr

atie

(log

kve

/g)

tijd (dagen)

0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,0

10,0

0 10 20 30 40 50

conc

entr

atie

(log

kve

/g)

tijd (dagen)

0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,0

10,0

0 10 20 30 40 50

conc

entr

atie

(log

kve

/g)

tijd (dagen)

26

a. b.

c.

Figuur 16: (a)TAK, (b) TAnK en (c) MZB op de geïnoculeerde vleesmaaltijd (■ batch 1, ♦ batch 2, ▲ batch 3).

3.3 Groei van L. monocytogenes tijdens bewaring

3.3.1 Bepalen en standaardiseren van de opkweekcultuur

De procedure voor de opkweek werd voor elke stam zes keer herhaald (één dag bij 37°C en

vier dagen bij 7°C) en werd uitgeplaat op TSA-platen. Tabel 5 toont aan dat de stationaire

fase start op dag 4. Het valt op dat de stam LMG 23194 iets sterker uitgroeit dan de andere

twee. Voor de drie stammen zijn er kleine standaardafwijkingen. Dit wijst op een goede

herhaalbaarheid en een goede uitplatingstechniek.

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

0 5 10 15

conc

entr

atie

(log

kve

/g)

tijd (dagen)

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

0 5 10 15

conc

entr

atie

(log

kve

/g)

tijd (dagen)

27

Tabel 5: Gemiddelde concentraties van L. monocytogenes bij standaardisatie van de opkweekcultuur op dag 3, 4 en 5.

concentratie L. monocytogenes (log kve/g) stam dag 3 dag 4 dag 5 LFMFP 392 8,3 ± 0,09 8,7 ± 0,09 9,5 ± 0,08 LFMFP 491 8,0 ± 0,08 8,6 ± 0,00 9,3 ± 0,15 LMG 23194 8,3 ± 0,04 9,1 ± 0,09 10,1 ± 0,44

3.3.2 Bepalen van groeipotentieel en verdubbelingstijd

Figuur 17 geeft de groeicurven van L. monocytogenes weer voor de drie producten (a, b, c).

Deze resultaten tonen dat de interbatch-variabiliteit vrij klein is.

De groei van L. monocytogenes in lasagne bolognaise (gedurende 28 dagen) (Figuur 17a) en

de visblokjes (gedurende 45 dagen) (Figuur 17b) is een sigmoïdale functie. De lagfase is

minimaal of zelfs volledig afwezig. In beide producten wordt vanaf dag 16 de stationaire fase

bereikt bij een maximale concentratie (Nmax) van respectievelijk 8,8 log kve/g en

8,3 log kve/g.

In de drie-componenten-maaltijd, bestaande uit rode kool, puree en braadworst, groeit

L. monocytogenes minder sterk uit: er is enkel een exponentiële fase waar te nemen binnen de

voorgestelde houdbaarheid (Figuur 17c). De houdbaarheid van dit product is echter korter dan

de andere twee producten en de concentratie melkzuurbacteriën hoger, waardoor de groei van

L. monocytogenes geremd kan zijn (het Jameson effect).

In alle producten is op einde houdbaarheid de concentratie L. monocytogenes hoger dan de

Europese norm van 2 log10 kve/g (Figuur 17). Wanneer het product koud zou geconsumeerd

worden, is het een onveilig product want de minimaal infectieuze dosis (3 log10 kve/g) wordt

sterk overschreden. In eerste instantie moet nabesmetting dus vermeden worden. Wanneer

zich dit toch voordoet, kan de vereiste opwarming van deze REPFEDs een oplossing bieden

en zorgen voor afdoding van L. monocytogenes (zie 3.4.1).

28

a.

a.

b.

c.

d.

e.

f.

g.

b.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 5 10 15 20 25 30

conc

entr

atie

(log

kve

/g)

tijd (dagen)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

conc

entr

atie

(log

kve

/g)

tijd (dagen)

29

c.

Figuur 17: Listeria monocytogenes groeicurven in (a) de pastamaaltijd, (b) vismaaltijd en (c) vleesmaaltijd (♦ batch 1, ■ batch 2, ▲ batch 3); voorspellingen door: ______ SSSP, ______ SSSP in combinatie met melkzuurbacteriën, ______ Combase

Voor elk product kan uit de challenge test de groeipotentieel en verdubbelingstijd berekend

worden (tabel 6, 7).

Voor alle geteste producten is de groeipotentieel groter dan 0,5 log10 kve/g. Hierdoor wordt er

verondersteld dat deze REPFEDs in staat zijn om de groei van L. monocytogenes toe te laten.

Het valt op dat de groeipotentieel en verdubbelingstijd in het derde product een stuk lager

liggen dan bij de andere twee producten. In het eerste en tweede product is de

verdubbelingstijd vergelijkbaar.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 2 4 6 8 10 12

conc

entr

atie

(log

kve

/g)

tijd (dagen)

30

Tabel 6 : Groeipotentieel van L. monocytogenes van de drie producten: (a) pastamaaltijd, (b) vismaaltijd en (c)

vleesmaaltijd.

Batch Dag Concentratie (log kve/g)

Verschil tussen de mediaan van de concentratie op einde

houdbaarheid (EH) en de mediaan van de

beginconcentratie

Groeipotentieel δ

1 0 3,60 3,40 3,20 5,42

EH 8,82 9,26 8,78

2 0 3,33 3,34 3,34 5,63 5,63

EH 9,00 8,95 8,98

3 0 3,29 3,29 3,29 5,31

EH 8,00 8,90 8,60

Batch Dag Concentratie (log kve/g)

Verschil tussen de mediaan van de concentratie op einde

houdbaarheid (EH) en de mediaan van de

beginconcentratie

Groeipotentieel δ

1 0 2,89 3,63 3,20 5,62

EH 9,25 9,43 8,98

2 0 3,1 2,1 2,0 6,32 6,41

EH 8,39 8,99 8,42

3 0 3,29 2,61 2,65 6,41

EH 8,34 9,1 9,06

a.

b.

31

Batch Dag Concentratie (log kve/g)

Verschil tussen de mediaan van de concentratie op einde

houdbaarheid (EH) en de mediaan van de

beginconcentratie

Groeipotentieel δ

1 0 2,98 3,15 3,31 1,15

EH 4,30 3,98 4,44

2 0 3,10 2,80 2,50 3,85 3,85

EH 5,99 6,87 6,65

3 0 3,21 2,61 2,90 3,84

EH 5,89 6,98 6,74

Tabel 7 : Verdubbelingstijd van L. monocytogenes van de drie producten.

Verdubbelingstijd (u.)

Pastamaaltijd 22,87 ± 1,89 Vismaaltijd 23,81 ± 15,69 Vleesmaaltijd 14,75 ± 7,23

3.3.3 Validatie van groeimodellen

De groeisnelheid en lagfase (ook al is deze zo goed als afwezig), geobserveerd in de geteste

voedingsmiddelen, werden vergeleken met deze voorspeld door de modellen. Hiervoor werd

gebruik gemaakt van de softwarepaketten ComBase [18] en SSSP [50].

Het aantal melkzuurbacteriën in de pasta- en vismaaltijd is lager dan 1 log10 kve/g

(detectielimiet). Hierdoor werden de melkzuurbacteriën niet mee in rekening gebracht bij de

groeivoorspellingen van L. monocytogenes voor deze twee producten.

Voor de experimenten in deze masterproef was het noodzakelijk de stalen bij een constante

temperatuur van 7°C te bewaren. Bij Combase [18] werd dan ook gekozen voor het ingeven

van een statische temperatuur (7°C). De andere inputfactoren zijn de initiële concentratie

L. monocytogenes, het NaCl-gehalte op de waterfase, de pH, het CO2-gehalte in de kopruimte

c.

32

na evenwicht en de mate waarin de stam zich heeft aangepast aan de omgeving. Combase

geeft een grafische weergave van de voorspelde groei (log kve/g) van L. monocytogenes in

functie van de tijd en berekent ook de verdubbelingstijd. De validatie kan zowel visueel als

aan de hand van de bias- en accuraatheidsfactor (tabel 8) gebeuren. Deze factoren werden

berekend op de datapunten a.d.h.v. reeds vermelde formules (zie 2.5). In lasagne bolognaise

(Figuur 17a) wordt een lichte overschatting van de groeisnelheid door het model

waargenomen. Toch is er een vrij goede beschrijving van de data: voornamelijk de schatting

van de stationaire fase toont een goede overeenstemming, de exponentiële fase daarentegen,

wordt licht overschat. Ook in de vis- en vleesmaaltijd komen de voorspellingen goed overeen

met de experimenteel bepaalde waarden (Figuur 17b en c). Alleen in de vleesmaaltijd

vertoont de voorspelling van Combase een overschatting ten opzichte van de eerste batch.

In SSSP [48] wordt ook een statische temperatuur (7°C) ingegeven. In het programma kan het

NaCl-gehalte in het volledige product en de droge stof ingegeven worden. Door middel van

een ingebouwde formule kan het NaCl-gehalte in de waterfase bepaald worden. De andere

inputfactoren zijn de volgende: de initiële concentratie L. monocytogenes en het CO2-gehalte

in de kopruimte na evenwicht. Dit laatste wordt eveneens met een ingebouwde formule,

bestaande uit temperatuur, initiële CO2-gehalte en initiële gas-product verhouding, berekend

door het programma. Ook in dit programma wordt de lagfase als afwezig beschouwd. De

voorspelling wordt ook grafisch uitgezet en de verdubbelingstijd wordt berekend. De

modelvoorspelling door SSSP toont een goede overeenkomst met de experimenteel bepaalde

waarden.

De biasfactoren van de voorspelling van SSSP liggen dichter bij 1 dan deze van de

voorspelling door Combase: de afwijking van de werkelijke waarden t.o.v. de voorspellingen

is dus minimaal. De accuraatheidsfactoren liggen voor beide modellen vrij hoog.

Tabel 8: Accuraatheidsfactor en biasfactor (validatie modellen)

Combase SSSP SSSP met MZB Accuraatheidsfactor Biasfactor Accuraatheidsfactor Biasfactor Accuraatheidsfactor Biasfactor

Pasta 1,50 ± 0,34 0,88 ± 0,19 1,30 ± 0,05 1,07 ± 0,14 NVT Vis 1,82 ± 0,50 1,20 ± 0,44 1,91 ± 0,19 1,50 ± 0,45 NVT

Vlees 1,56 ± 0,24 1,17 ± 0,43 1,82 ± 0,44 1,11 ± 0,46 1,87 ± 0,39 1,14 ± 0,48

33

Algemeen kan gezegd worden dat de verdubbelingstijden (tabel 9), voorspeld door SSSP,

hoger zijn (mits enkele uitzonderingen) dan deze verkregen door lineaire regressie door vijf

punten, terwijl deze van Combase lager zijn. Batch 1 van de vleesmaaltijd vormt hierop een

uitzondering. Wanneer de fitting van Combase voor deze batch vergeleken wordt met de

experimentele punten in Figuur 18, is er nauwelijks een overeenstemming. De voorspelling

loopt loglineair, terwijl de experimentele data een snellere groei vertonen.

Tabel 9:Verdubbelingstijden (uur) verkregen door lineaire regressie, Combase en SSSP

Lineaire regressie Combase SSSP Pasta batch 1 24,67 16,74 21,20

batch 2 20,89 17,52 20,63

batch 3 23,05 14,17 18,84

Vis batch 1 17,12 13,42 18,48

batch 2 12,57 13,30 18,24

batch 3 41,74 13,68 18,53

Vlees batch 1 22,97 60,69 20,82

batch 2 9,39 13,79 18,43

batch 3 11,90 15,60 20,27

Figuur 18: Listeria monocytogenes groeicurve van batch 1 van de vleesmaaltijd: ______ voorspeld door Combase , ♦ experimentele punten

3.4 Inactivatie van L. monocytogenes tijdens opwarming van REPFEDs

3.4.1 Opwarming volgens voorschriften

De REPFEDs werden hittebehandeld conform de etikettering. Deze opwarmingsprocedure

werd geregistreerd met een temperatuursonde. De tijd-temperatuurcurven (Figuur 19) tonen

aan dat de temperatuur aan de rand veel hogere waarden geeft dan in de kern. De verhitting in

de kern verloopt vrij lineair, terwijl de temperatuur aan de rand sneller stijgt.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

0 2 4 6 8 10 12

conc

entr

atie

(log

kve

/g)

tijd (dagen)

34

In de drie-componenten-maaltijd (Figuur 19c) valt op dat de temperatuur in de braadworst het

hoogst oploopt, maar wel een enorme schommeling vertoont. De verhitting van de puree

daarentegen verloopt vrij lineair.

a. b.

c.

Figuur 19: Tijd-temperatuurprofiel (a) pastamaaltijd en (b) vismaaltijd: _______ centraal, _______ rand; tijd-temperatuurprofiel (c) vleesmaaltijd: _______ rode kool, _______ puree, _______ braadworst

Bijna alle producten behaalden het pasteurisatiebarema van P0 = 2 min., met een afdoding van

L. monocytogenes van meer dan 6 log tot gevolg (tabel 10). Batchen 1 en 3 van de

pastamaaltijd en batchen 1 en 2 van de vismaaltijd vormden hierop een uitzondering. Toch

werd vastgesteld dat, na staalname van de verhitte producten, uitplating en telling van de

kolonies, in de eerste en tweede batch van de vismaaltijd de L. monocytogenes cellen meer

dan 6 log reductie vertoonden. Een mogelijke verklaring is dat er geen rekening werd

gehouden met de afkoeltijden (want enkel de verhittingsstap werd gemeten), waardoor het

zeer waarschijnlijk is dat P0 = 2 min. toch werd bereikt. Batchen 1 en 3 van de pastamaaltijd

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300

tem

pera

tuur

(°C

)

tijd (s)

0102030405060708090

100

0 50 100 150 200te

mpe

ratu

ur (°

C)

tijd (s)

0

20

40

60

80

100

120

140

0 50 100 150 200 250 300 350

tem

pera

tuur

(°C

)

tijd (s)

35

toonden respectievelijk slechts een 0,7 en 2,2 log reductie. Dit kan als volgt verklaard worden:

bij batch 1 werd gewerkt met een steeksonde om de temperatuur te meten. Hierbij werd

telkens het opwarmingsproces onderbroken, waardoor Tmax lager ligt. Met een P0 = 0,18 min.

(wat ongeveer 1/10 is van 2) wordt in theorie slechts 0,54 log afgedood, wat goed

overeenkomt met de 0,7 log afdoding, waargenomen in het experiment. Bij de derde batch

klimt de P0 slechts op tot 0,77 min. (wat ongeveer 1/3 is van 2). In theorie komt dit neer op

een afdoding van 2,31 log10 kve/g, wat goed overeenstemt met de 2,2 log reductie in de

praktijk. Ook de puree van de eerste batch uit de vleesmaaltijd behaalde de P0 = 2 min. niet.

Deze is namelijk zo klein (0,00103) dat er geen enkele afdoding heeft plaatsgevonden.

Tabel 10 : Tmax, P0-waarden en log reductie van L. monocytogenes na microgolfopwarming van producten 1, 2 en 3

Verhittingstijd

(min.) Vermogen

(Watt)

Tmax (°C) P0

Afdoding L. monocytogenes

(log kve/g) Pasta 4 900 batch 1 kern 66,60 0,18 0,7

rand 72,90 2,20 > 6

batch 2 kern 84,94 4,13 > 6

rand 99,20 >1000 > 6

batch 3 kern 72,61 0,77 2,2

rand 97,37 >1000 > 6 Vis 3 650 batch 1 kern 75,07 1,6968 > 6

rand 92,44 246,95 > 6

batch 2 kern 75,69 1,17 > 6

rand 84,21 7,80 > 6

batch 3 kern 84,83 49,42 > 6

rand 94,03 469,35 > 6

Vlees 5

850

batch 1 worst

103,92

>1000

> 4

rode kool 101,06 >1000 > 4

puree 54,15 0,00 0

batch 2 worst 131,13 >1000 > 4

rode kool 102,92 >1000 > 4

puree 82,39 8,35 > 4

batch 3 worst 131,13 >1000 > 4

rode kool 102,92 >1000 > 4

puree 82,39 8,35 > 4

36

4. Bespreking 4.1 Fysicochemische parameters

De pH- en de aw-waarden van de onderzochte REPFEDs liggen binnen de groeigrenzen van

L. monocytogenes en laten effectief de groei ervan toe. De redoxpotentiaal van de lasagne

bolognaise is hoger in vergelijking met de andere twee producten. Dit kan verklaard worden

door de sterke gelaagdheid van de lasagne waardoor er een grotere hoeveelheid lucht in het

product zit. Hoe lager de redoxpotentiaal, hoe meer de voedingsmiddelen rijk zijn aan

reducerende stoffen, welke de aanwezige zuurstof reduceren. Bij een lage redoxpotentiaal

groeien anaërobe micro-organismen goed, bij een hoge redoxpotentiaal groeien de aërobe

micro-organismen. Bij de lasagne bolognaise is op einde houdbaarheid het totaal aëroob

kiemgetal dan ook iets hoger dan het totaal anaëroob kiemgetal.

Het CO2-gehalte varieert naargelang het product. Het CO2-gehalte in de kopruimte na

evenwicht is afhankelijk van de temperatuur, de gas-product verhouding en de initiële

hoeveelheid CO2 [53]. Tijdens de bewaring in koeling gaat de CO2 oplossen in het product tot

een evenwicht bereikt is. De stijging van de hoeveelheid CO2 in de kopruimte van de

verpakking op einde houdbaarheid bij een aantal producten, kan verklaard worden door het

feit dat CO2 geproduceerd wordt door de micro-organismen. Aangezien de aanwezige

bacteriën eerst het O2 opgebruiken, is dit O2-gehalte sterk gedaald tot een minimale waarde.

4.2 Algemene microbiologische analyse

De lage aanwezigheid van melkzuurbacteriën wordt in de hand gewerkt door de MAP

verpakking. De gassamenstelling bevat een minimale hoeveelheid O2 (< 2%), wat suboptimaal

is voor melkzuurbacteriën. Aangezien melkzuurbacteriën aërotolerant zijn, kunnen ze het best

ontwikkelen in een milieu van 5-6% O2 [54].

In de drie-componenten-maaltijd overschrijdt het aantal melkzuurbacteriën de toegelaten

tolerantiewaarde. Dit is te verklaren door de handmatige afvulling van de maaltijden, terwijl

dit bij de andere producten machinaal gebeurt [55].

37

4.3 Groei van L. monocytogenes tijdens bewaring

4.3.1 Bepalen van groeipotentieel en verdubbelingstijd

Het is duidelijk dat de vleesmaaltijd microbiologisch het minst risicovol is van de drie

onderzochte producten. L. monocytogenes groeit tijdens de bewaring uit tot

5,9 ± 1,4 log10 kve/g. Niettegenstaande dat deze waarde ook het microbiologische criterium

overschrijdt en voldoende hoog is om ziek te worden, is dit gemiddeld toch 2,9 log10 kve/g

lager dan in de lasagne bolognaise en de vismaaltijd. Dit is enerzijds te verklaren door de

korte bewaartijd van het derde product (10 dagen) en anderzijds door de hogere concentratie

melkzuurbacteriën. Deze laatsten onderdrukken L. monocytogenes (Jameson-effect). In de

groeicurve wordt helemaal geen sigmoïdale curve waargenomen: er is enkel een korte lagfase

en een exponentiële fase te onderscheiden.

De verdubbelingstijd van L. monocytogenes in de vleesmaaltijd ligt veel lager dan in de pasta-

en vismaaltijd. Dit is eveneens te verklaren door de hogere concentratie melkzuurbacteriën.

De vleesmaaltijd illustreert dat het beperken van de houdbaarheid een mogelijke oplossing is

voor het veiliger maken van een product. Hierdoor kan L. monocytogenes minder sterk

uitgroeien en heeft de hittebehandeling met de microgolfoven, relatief gezien, meer effect.

De concentratie L. monocytogenes op einde houdbaarheid overschrijdt duidelijk de norm die

bepaald werd door de Europese regelgeving (2 log10 kve/g). Wanneer de onderzochte

REPFEDs niet zouden opgewarmd worden, zouden ze op einde houdbaarheid dus

onaanvaardbaar zijn.

4.3.2 Validatie van groeimodellen

In Combase werd gekozen voor een fysieke status van 0,9. De fysieke status (waarde tussen

0-1) is de mate waarin de stam zich heeft aangepast aan de omgeving. Aangezien bij de

opkweek van L. monocytogenes de stammen vier dagen bij 7°C bewaard werden, hebben ze

zich reeds goed kunnen aanpassen aan deze bewaartemperatuur. Dit is ook af te leiden uit de

groeicurven: er is namelijk nauwelijks een lagfase waar te nemen.

De voorspellingen van de groeimodellen fitten zeer goed met de data uit de eigen

experimenten. Voor de lasagne bolognaise is de beste match waar te nemen bij SSSP. Ook

hierbij wordt er amper een lagfase weergegeven. Voor de vismaaltijd wordt er eveneens het

38

best geopteerd voor SSSP. Bij deze tweede waarneming werd voldaan aan de verwachtingen,

daar SSSP een specifieke predictor is voor de groei van bederf en pathogenen in vis en

zeevruchten. Voor de rode kool met puree en braadworst zijn de voorspellingen van Combase

en SSSP vrij gelijkaardig en vertonen een goede match met de experimentele datapunten.

Over het algemeen kan dus gesteld worden dat SSSP een beter model is: er zijn betere

voorspellingen waar te nemen. Een voordeel van dit model is het feit dat de groei van

L. monocytogenes in combinatie met melkzuurbacteriën kan voorspeld worden. In het derde

product was initieel een vrij grote hoeveelheid melkzuurbacteriën aanwezig. Door deze in

rekening te brengen in het model, is er een betere voorspelling. Toch is er slechts een

minimaal verschil waar te nemen in Figuur 17c met de afwezigheid van melkzuurbacteriën.

Bij aanwezigheid van melkzuurbacteriën gaat de voorspelde groeicurve van L. monocytogenes

iets sneller in stationaire fase.

Ook de bias- en accuraatheidsfactoren bevestigen dat SSSP een beter predictief model is. De

afwijking van de werkelijke waarden t.o.v. de voorspellingen is minimaal. De

accuraatheidsfactoren daarentegen, zijn minder goed. Bij de eerste batch van de pastamaaltijd

bijvoorbeeld betekent een accuraatheidsfactor van 1,50 dat de voorspelling voor 50%

overschat is. De mogelijkheid om de achtergrondflora (nl. melkzuurbacteriën) in rekening te

brengen in SSSP, komt in de biasfactor echter niet tot uiting.

Ook in vroegere studies probeerde men de toepassing van kwantitatieve modellen reeds te

illustreren. Zo maakte Carrasco et al [33] gebruik van gekookte ham; dit om na te gaan of er

aan de microbiologische criteria werd voldaan. Hierbij overschreden de drie batchen de limiet

van 2 log10 kve/g. Een kortere bewaartermijn bood wel een aanvaardbare hoeveelheid kve/g.

In een studie van Vermeulen et al [11] werd de EU-technical guidance van overlevingsstudies

van L. monocytogenes in kant-en-klare maaltijden geëvalueerd in gerookte zalm. Ook hierbij

werd de limiet van 2 log10 kve/g overschreden. De groei van L. monocytogenes in de gerookte

zalm stemde goed overeen met deze voorspeld door SSSP. De grote hoeveelheden

melkzuurbacteriën onderdrukten duidelijk de groei van L. monocytogenes, wat goed

voorspeld werd door SSSP, daar SSSP de achtergrondflora in rekening kan brengen.

39

4.4 Inactivatie van L. monocytogenes tijdens opwarming van REPFEDs

4.4.1 Opwarming volgens voorschriften

Bij de opwarming van de REPFED werd telkens in het midden en aan de rand van de maaltijd

de temperatuur gemeten. De drie onderzochte producten werden elk conform de etikettering

opgewarmd, elk bij hun eigen opgegeven wattages. Uit tabel 10 kan afgeleid worden dat bij

de pasta- en vleesmaaltijd (opgewarmd bij een vermogen van respectievelijk 900W en 850W)

de P0-waarden zeer hoog kunnen zijn. Dit in tegenstelling tot de opwarming van de

vismaaltijd bij 650 W, waarbij de P0-waarden aanzienlijk lager liggen. Mejia et al [41] ging,

naast het aangegeven vermogen op het etiket, ook het effect na van verschillende wattages

van de microgolfoven op de afdoding van L. monocytogenes. Dit gaf een aanzienlijk verschil:

een stijging van het vermogen van de magnetron met 200 Watt resulteerde in een extra

afdoding van L. monocytogenes in een Tandoori Kip maaltijd van meer dan 2 log. De

combinatie van een twee minuten langere opwarmingstijd en een vermogen van 200 Watt

hoger, had zelfs een 3 log reductie tot gevolg. Toch werd in geen enkel geval P0 = 2 min.

behaald, waardoor ook de 6 log reductie niet werd bereikt.

Het valt op dat de tijd-temperatuurprofielen bij elke individuele verhittingsprocedure enorm

variëren. Niettegenstaande dat bij eenzelfde product steeds dezelfde opwarmingsvariabelen

(tijd en vermogen van de microgolf) werden toegepast en dat er steeds op dezelfde plaatsen

werd gemeten in het product, is er een sterke variatie in de maximale temperatuur. Dit wijst

erop dat de microgolven geen homogene verspreiding vertonen: omdat de golven binnen de

ruimte van de oven blijven, ontstaan er staande golven. Hierdoor is de opwarming op

sommige plekken heviger dan op andere [40]. Een staande golf (Figuur 20) wordt veroorzaakt

door interferentie van twee golven met gelijke frequentie en amplitude maar tegengestelde

voortplantingsrichting. Er ontstaat een regelmatig patroon van punten die stilstaan (knopen)

en punten die maximale uitslag vertonen (buiken). De afstand tussen de buiken bedraagt de

halve golflengte van de interfererende golven. Alle punten in een staande golf gaan

tegelijkertijd door de evenwichtspositie, dit in tegenstelling tot een lopende golf [57].

Om deze reden is de magnetron meestal voorzien van een draaiplateau, zodat de energie

gelijkmatiger over alle delen van het op te warmen voedsel verdeeld wordt. Niettegenstaande

dat er voor de opwarming van de onderzochte REPFEDs gebruik gemaakt werd van een

40

magnetron met een draaischijf, is er toch een blijvende variabiliteit in de tijd-

temperatuurprofielen.

Figuur 20 : Staande golven (door interferentie van twee golven met gelijke frequentie en amplitude maar tegengestelde voortplantingsrichting) [58]

Deze hoge variabiliteit vertaalt zich in een variabiliteit in het al dan niet behalen van

P0=2 min. Coote et al [40] bestudeerde de afdoding van L. monocytogenes in

laboratoriummedium en kip. In deze studie werd de pasteurisatiewaarde P0=2 min. bereikt en

was er meer dan 6 log reductie in zowel het medium als het levensmiddel. In een studie van

Mejia et al [41] werd daarentegen slechts 2,9 log kve afgedood in een Kip Tandoori maaltijd

(bestaande uit rijst, tandoorisaus, groenten en kip) en werd P0=2 min. niet bereikt.

Uit de resultaten blijkt dat, wanneer de voorschriften omtrent de opwarmingsprocedure goed

gevolgd werden, alle L. monocytogenes cellen werden afgedood (> 6 log kve/g reductie bij de

pasta- en de vismaaltijd, en > 4 log reductie bij de vleesmaaltijd), op drie batchen na. In

functie van de voedselveiligheid is het dus zeer belangrijk dat de consument het product

correct behandelt, dit zowel met betrekking tot de bewaartemperatuur als het opwarmen van

de maaltijd. Uit de Food and Health Survey (2008) van de International Food Information

Council (IFIC) Foundation [59] blijkt dat 79% van de 1000 deelnemers de

opwarmingsinstructies volgt. Slechts 15% checkt de wattage van de microgolfoven, 72%

gebruikt een magnetron met een ronddraaiende schijf of roert zelf in de maaltijd. Hieruit blijkt

dat het consumentengedrag niet altijd optimaal is. Maar zelfs bij correct gebruik, wordt

P0 = 2 min. niet altijd bereikt. In deze masterproef faalden drie batchen van de negen, wat

neer komt op één derde. Dit vormt toch een aanzienlijke hoeveelheid. Na hittebehandeling

door de magnetron kunnen de REPFEDs dus niet altijd als veilig beschouwd worden en zit de

concentratie L. monocytogenes niet altijd onder het maximaal toegelaten microbiologisch

criterium.

41

4.4.2 Validatie van inactivatiemodellen

Er zijn momenteel geen modellen voorhanden die de inactivatie van L. monocytogenes in een

product, waarbij de opwarming volgens een dynamisch tijd-temperatuurprofiel verloopt,

kunnen voorspellen. Ofwel is er enkel de mogelijkheid om een welbepaalde constante

verhittingstemperatuur in te geven ofwel kan er een dynamisch tijd-temperatuurverloop

ingegeven worden, maar dan binnen bepaalde grenzen (bij Combase: 60-68°C). In tabel 11

wordt een overzicht gegeven van de inactivatiemodellen die wel ter beschikking zijn, maar

niet kunnen gebruikt worden voor deze masterproef.

Tabel 11: Inactivatiemodellen met de range van de groeiparameters (wateractiviteit (aw), temperatuur (T), zoutgehalte (NaCl%)) n° Product/medium Variabelen Range Referentie

1 Sucrose oplossing aw 0,90-0,99 Fernandez et al. [19]

T 58-64°C

2 Macerated potato aw 0,71-0,99 Valdramidis et al. [60]

T 55-65°C

3 Varkensvlees T 57,5-62,5°C Lihono et al. [61]

NaCl % 0-6 %

4 Rundsvlees jus T 55-65°C Juneja et al. [62]

pH 4-8

NaCl % 0-6 %

Bovenstaande modellen werden dus niet gebruikt aangezien de tijd-temperatuurprofielen

grotendeels buiten de range van de modellen vallen en slechts gedurende enkele seconden

binnen het interval liggen.

Mejia et al [41] valideerde het Bigelow model door een welbepaalde constante temperatuur in

te geven. Hierbij werd de gemiddelde temperatuur tijdens de opwarming ingegeven, wat geen

correct beeld geeft van het opwarmingsprofiel en de P0-waarden.

Wanneer de P0-waarden en hun overeenkomstige afdodingswaarden vergeleken worden met

elkaar (zoals berekend in 3.4.1), wordt vastgesteld dat de theoretische waarden overeenkomen

met deze in de praktijk. Het verband tussen afdoding en P0 = 2 min. is correct voor alle

onderzochte producten.

42

5. Algemeen besluit

De pH- en de aw-waarden van de onderzochte REPFEDs liggen binnen de groeigrenzen van

L. monocytogenes en laten effectief de groei ervan toe.

De pasta-, vis- en vleesmaaltijd zijn microbiologisch veilig: het totaal aëroob kiemgetal en het

totaal anaëroob kiemgetal liggen binnen de aanvaardbare limieten. Het aantal

melkzuurbacteriën daarentegen ligt bij de vleesmaaltijd boven de tolerantiegrenzen.

De groeicurven van L. monocytogenes vertonen een goede overeenkomst met de voorspelde

groeicurven door Combase en SSSP. De groeipotentieel is voor de drie onderzochte producten

groter dan 0,5 log10 kve/g. Dit betekent dat de groei van L. monocytogenes hierin kan

plaatsvinden. Wanneer de accuraatheids- en biasfactor bekeken worden, kan gesteld worden

dat SSSP een beter predictief model is. De interbatch-variabiliteit is vrij laag: de

verdubbelingstijden kennen weinig variatie.

De vleesmaaltijd bevat initieel veel melkzuurbacteriën waardoor de groei van

L. monocytogenes geremd wordt (Jameson effect). De korte houdbaarheid van het product

(10 dagen) draagt eveneens bij tot een minder sterke uitgroei van L. monocytogenes.

Wanneer de producten met de microgolfoven worden opgewarmd conform de etikettering,

valt het op dat de temperatuur aan de rand van het product veel hoger oploopt dan in de kern.

In de meeste gevallen wordt P0= 2 min. bereikt. Hierbij is er meer dan 6 log reductie,

waardoor de limiet van 2 log10 kve/g niet meer overschreden wordt en het product dus veilig

is. Toch is waakzaamheid geboden aangezien er een vrij grote variabiliteit bestaat in de tijd-

temperatuurprofielen, bekomen door de verhitting met de magnetron en dat zelfs bij correct

gebruik, P0 = 2 min. niet altijd bereikt wordt. De inactivatiemodellen die momenteel

voorhanden zijn, zijn niet bruikbaar. Ofwel is er enkel de mogelijkheid om een welbepaalde

constante verhittingstemperatuur in te geven ofwel kan er een dynamisch tijd-

temperatuurverloop ingegeven worden, maar dan binnen bepaalde grenzen (bij Combase:

60-68°C). Wel kan de afdoding van L. monocytogenes nagegaan worden aan de hand van de

P0-waarden. Hieruit kan besloten worden dat het verband tussen afdoding en P0 = 2 min.

correct is voor alle onderzochte producten.

43

6. Referentielijst

1. Geeroms N, Verbeke W, Van Kenhove P (2008). Consumers’ health-related motive orientations and

ready meal consumption behaviour. Appetite. 51: 704–712. 2. Peck MW, Goodburn KE, Bett RP and Stringer SC (2008). Assessment of the potential for growth and

neurotoxin formation by non-proteolytic Clostridium botulinum in short shelf-life commercial foods designed to be stored chilled. Trends in Food Science & Technology. 19: 207-216

3. Raspor P (2008). Total food chain safety: how good practices can contribute? Trends in Food Science & Technology. 19: 405-412.

4. The Rapid Alert System for Food and Feed (2010). Annual report. 1-64. 5. RASFF. Geraadpleegd op 8 september 2011 via https://webgate.ec.europa.eu/rasff-

window/portal/index.cfm?event=notificationDetail&NOTIF_REFERENCE=2007.0504 6. RASFF. Geraadpleegd op 8 september 2011 via https://webgate.ec.europa.eu/rasff-

window/portal/index.cfm?event=notificationDetail&NOTIF_REFERENCE=2010.1169 7. Conly JM, Johnston BL (2008). Listeria: A persistent food-borne pathogen. The Canadian Journal of

Incetious Diseases & Medical Microbiology. 19: 327-328. 8. Pichler J, Much P, Kasper S, Fretz R, Auer B, Kathan J, Mann M, Huhulescu S, Ruppitsch W, Pietzka

A, Silberbauer K, Neumann C, Gschiel E, de Martin A, Schuetz A, Gindl J, Neugschwandtner E, Allerberger F (2009). An outbreak of febrile gastroenteritis associated with jellied pork contaminated with Listeria monocytogenes. Wiener klinische Wochenschrift. 121: 149-156.

9. Sofos JN, Geornaras I (2010). Overview of current meat hygiene and safety risks and summary of recent studies on biofilms, and control of Escherichia coli O157:H7 in nonintact, and Listeria monocytogenes in ready-to-eat, meat products. Meat science. 86: 2-14.

10. Anoniem (2011). Multistate outbreak of listeriosis associated with jensen farms cantaloupe --- United States, august--september 2011. Morbidity and mortality weekly report. 7 (60) :1357-1358.

11. Vermeulen A, Devlieghere F, De Loy-Hendrickx A, Uyttendaele M (2010). Critical evaluation of the EU-tszechnical guidance on shelf-life studies for L. monocytogenes on RTE-foods: A case study for smoked salmon. International Journal of Food Microbiology. 145 (1): 176-185.

12. Vermeulen A, Smigic N, Rajkovic A, Gysemans K, Bernaerts K, Geeraerd A, van Impe J, Debevere J, Devlieghere F (2007). Performance of a growth-No growth model for Listeria monocytogenes developed for mayonnaise-based salads: Influence of strain variability, food matrix, inoculation level, and presence of sorbic and benzoic acid. Journal of food protection. 70 (9): 2118-2126.

13. Huang L, Sites J (2006). Automatic control of a microwave heating process for in-package pasteurization of beef frankfurters. Journal of Food Engineering. 80: 226–233.

14. Vermeulen, A. (2008). Microbial stability and safety of acid sauces and mayonnaise-based salads assessed through probabilistic growth/no growth models. Thesis submitted in fulfillment of the requirements for the degree of doctor (Ph.D.) in Applied Biological Sciences. Faculty of Bioscience Engineering, University of Ghent. 1-310.

15. te Giffel MC, Zwietering MH (1999). Validation of predictive models describing the growth of Listeria monocytogenes. International journal of food microbiology. 46: 135-149.

16. Cornua M, Billoirb E, Bergisa H (2010). Modeling microbial competition in food: Application to the behavior of Listeria monocytogenes and lactic acid flora in pork meat products. Food Microbiology. 28 (4): 639-647.

17. Mejlholm O, Dalgaard P (2007). Modeling and Predicting the Growth of Lactic Acid Bacteria in Lightly Preserved Seafood and Their Inhibiting Effect on Listeria monocytogenes. Journal of Food Protection. 70(11): 2485–2497.

18. Baranyi J, Tamplin ML (2004). ComBase: a common database on microbial responses to food environments. Journal of Food Protection. 67(9):1967-1971.

19. Fernandez A, Lopez M, Bernardo A, Condon S, Raso J (2007). Modelling thermal inactivation of Listeria monocytogenes in sucrose solutions of various water activities. Food Microbiology. 24: 372–379.

20. Anoniem (2008).VWA: nieuwe Voedsel-en WarenAutoriteit. Kennisbank voedselveiligheid VWA: 1-4. 21. Chaturongkasumrita Y, Takahashia H, Keeratipibulb S, Kudaa T, Kimuraa B (2011). The effect of

polyesterurethane belt surface roughness on Listeria monocytogenes biofilm formation and its cleaning efficiency. Food Control. 22 (12): 1893–1899.

22. FSA (Food Standards Agency) (2004). Guidance on the safety and shelf-life of vacuum and modified atmosphere packed chilled foods. Geraadpleegd op 10 augustus 2011 via http://www.food.gov.uk/multimedia/pdfs/acm714.pdf#page=2.

44

23. Loncarevic S, Danielsson-Tham ML, Martensson L, Ringnér A, Runehagen A, Tham W (1997). A case of foodborne listeriosis in Sweden. Letters in applied microbiology. 24: 65-68.

24. Little CL, Pires SM, Gillespie IA, Grant K, Nichols GL (2010). Attribution of Human Listeria monocytogenes Infections in England and Wales to Ready-to-Eat Food Sources Placed on the Market: Adaptation of the Hald Salmonella Source Attribution Model. Foodborne pathogens and disease. 7 (7): 749-756.

25. Jackson KA, Iwamoto M, Swerdlow D (2010). Pregnancy-associated listeriosis. Epidemiological Infection. 138: 1503–1509.

26. Uyttendaele M, Busschaert P, Valero A, Geeraerd AH, Vermeulen A, Jacxsens L, Goh KK, De Loy A, Van Impe JF, Devlieghere F (2009). Prevalence and challenge tests of Listeria monocytogenes in Belgian produced and retailed mayonnaise-based deli-salads, cooked meat products and smoked fish between 2005 and 2007. International journal of food microbiology. 133(1-2):94-104.

27. Brema. Geraadpleegd op 2 november 2011 via http://www.brema.be/main/default.asp?lang=. 28. ICMSF (2002). Microorganisms in Foods 7. Microbiological testing in food safety management -

Kluwer Academic / Plenum Publishers - New York, USA 29. ACMSF (2007). Report on Safe Cooking of Burgers. 30. CFA, Chilled Food Association (2006). Best practice guidelines for the production of chilled food. 4th

edition. 31. Commission of the European Communities (2005). Commission regulation (EC) 2073/2005 of 15

November 2005 on microbiological criteria for foodstuffs. Official Journal of the European Union. 338:1–26.

32. Uyttendaele M (2011). Microbiologische veiligheid en analyse van levensmiddelen. 1ste Master Biomedische Wetenschappen, UGent.

33. Carrasco E, Valero A, Pérez-Rodríguez F, García-Gimeno RM, Zurera G (2007). Management of microbiological safety of ready-to-eat meat products by mathematical modelling: Listeria monocytogenes as an example. International Journal of Food Microbiology. 114 (2): 221-226.

34. Devlieghere F, Debevere J, Jacxsens L, Uyttendaele M, Vermeulen A (2011). Levensmiddelenmicrobiologie en conservering. 1-260.

35. Garcia-Linares MC, Gonzalez-Fandos, Garcia-Fernandez MC, Garcia-Aris MT (2004). Microbiological and nutritional quality of sous vide or traditionally processed fish: influence of fat content. Journal of Food Quality. 27: 371–387.

36. Aymerich T, Picouet PA, Monfort JM (2008). Decontamination technologies for meat products. Meat Science. 78 (1-2): 114-129.

37. Sommers CH, Geveke DJ, Pulsfus S, Lemmenes B (2009). Inactivation of Listeria innocua on Frankfurters by Ultraviolet Light and Flash Pasteurization. Journal of food science. 74(3):138-141.

38. Reij MW, Den Aantrekker ED (2004). Recontamination as a source of pathogens in processed Foods. International Journal of Food Microbiology. 91: 1– 11.

39. Voluntary guidelines of sanitation practices standard operating procedures and good retail practices to minimize contamination and growth of Listeria monocytogenes within food establishments (2004-2006). Conference for Food Protection Listeria monocytogenes Intervention Committee. 1-17.

40. Coote PJ, Holyoak CD, Cole MB (1991). Thermal inactivation of Listeria monocytogenes during a process simulating temperatures achieved during microwave heating. J Appl Bacteriol. 70 (6):489-494.

41. Sosa Mejia Z, Beumer RR, Zwietering MH (2011). Risk evaluation and management to reaching a suggested FSO in a steam meal. Food Microbiology. 28: 631-638.

42. Jevšnik M, Hlebec V, Raspor P (2008). Consumers’ awareness of food safety from shopping to eating. Food Control. 19 (8): 737-745.

43. Costa AI, Schoolmeester D, Dekker M, Jongen WMF (2007). To cook or not to cook: A means-end study of motives for choice of meal solutions. Food Quality and Preference. 18: 77–88.

44. GfK Consumer Scan (2007). Household consumer panel. Brussels: GfK Consumer Scan Benelux. 45. EU CRL for Listeria monocytogenes (2008). Technical guidance document on shelf-life studies for

Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods. 1-31. 46. Augustin JC, Bergis H, Midelet-Bourdin G, Cornu M, Couvert O, Denis C, Huchet V, Lemonnier S,

Pinon A, Vialette M, Zuliani V, Stahl V (2010). Design of challenge testing experiments to assess the variability of Listeria monocytogenes growth in foods. Food Microbiology 28 (2011) 746 – 754.

47. Skalina L, Nikolajeva V (2010). Growth potential of Listeria monocytogenes strains in mixed ready-to-eat salads. International Journal of Food Microbiology. 144: 317–321.

48. Francois K, Valero A, Geeraerd AH, Van Impe JF, Debevere J, Garcia-Gimeno RM, Zurera G, Devlieghere F (2007). Effect of preincubation temperature and pH on the individual cell lag phase of Listeria monocytogenes, cultured at refrigeration temperatures. Food Microbiology. 24: 32–43.

45

49. Geeraerd AH, Valdramidis VP, Van Impe JF (2005). GInaFiT, a freeware tool to assess non-log-linear microbial survivor curves. International Journal of Food Microbiology 102: 95– 105.

50. SSSP. Geraadpleegd op 18 april 2012 via http://sssp.dtuaqua.dk/HTML_Pages/Help/English/Listeria/Lm-LAB/lm-lab.htm.

51. Stekelenburg FK (2005). Het meten van de wateractiviteit. Anoniem. 1-7. 52. Uyttendaele M, Rajkovic A, Benos G, François K, Devlieghere F, Debevere J (2003). Evaluation of a

challenge testing protocol to assess the stability of ready-to-eat cooked meat products against growth of Listeria monocytogenes. International Journal of Food Microbiology. 90: 219– 236.

53. Devlieghere F, Debevere J en Van Impeb J (1998). Concentration of carbon dioxide in the water-phase as a parameter to model the effect of a modified atmosphere on microorganisms. International Journal of Food Microbiology. 43 (1–2): 105–113.

54. Hannah JF, Cason JA, Richardson JR, Cox NA, Hinton A Jr., Buhr RJ, Smith DP (2011). Effect of stomaching on numbers of bacteria recovered from chicken skin. Poultry Science. 90(2):491-493.

55. Geysen S, Escalona VH, Verlinden BE, Aertsen A, Geeraerd AH, Michiels CW, Van Impe JF, Nicolaï BM (2006). Validation of predictive growth models describing superatmospheric oxygen effects on Pseudomonas fluorescens and Listeria innocua on fresh-cut lettuce. International Journal of Food Microbiology. 111: 48–58.

56. Uyttendaele M, Jacxsens L, De Loy-Hendrickx A, Devlieghere F, Debevere J (2010). Microbiologische richtwaarden en wettelijke microbiologische criteria. 1-123.

57. Online encyclopedie. Geraadpleegd op 16 april 2012 via http://www.encyclo.nl/begrip/staande%20golf 58. KULeuven. Geraadpleegd op 25 april 2012 via http://fys.kuleuven.be/pradem/golven/gol_c_01.htm 59. Food & Health Survey, Consumer Attitudes toward Food, Nutrition & Health (2008). International

Food Information Council Foundation. 41-42. 60. Valdramidis VP, Geeraerd AH, Gaze JE, Kondjoyan A, Boyd AR, Shaw HL,Van Impe JF (2006).

Quantitative description of Listeria monocytogenes inactivation kinetics with temperature and water activity as the influencing factors; model prediction and methodological validation on dynamic data. Journal of Food Engineering. 76: 79–88.

61. Lihono MA, Mendonca AF, Dickson JS, Dixon PM (2003). A predictive model to determine the effects of temperature, sodium pyrophosphate and sodium chloride on thermal inactivation of starved Listeria monocytogenes in pork slurry. Journal of food protection. 66 (7): 1216-1221.

62. Juneja VK, Eblen BS (1999). Predictive thermal inactivation model for Listeria monocytogenes with temperature, pH, NaCl, and sodium pyrophosphate as controlling factors. Journal of food protection. 62 (9): 986-993.