T E S I S · 2016-10-27 · MARGARITA ELIZABETH RICO LEMUS DIRECTOR DE TESIS DR. BENJAMÍN...

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN

TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A.C.

Efecto del nitroprusiato de sodio en la

regeneración in vitro de un híbrido del género

Polianthes

T E S I S

PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE

MAESTRO EN CIENCIAS DE LA FLORICULTURA

PRESENTA

MARGARITA ELIZABETH RICO LEMUS

DIRECTOR DE TESIS

DR. BENJAMÍN RODRÍGUEZ GARAY

Guadalajara, Jalisco, Febrero del 2016

DECLARACIÓN DE PROPIEDAD

Declaro que la información contenida en la sección de materiales y métodos

experimentales, los resultados y discusión de este punto proviene de las

actividades de experimentación realizadas durante el periodo que se me asignó

para desarrollar mi trabajo de tesis, en las unidades y laboratorios del Centro de

Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C., y

que a razón de lo anterior y en contraprestación de los servicios educativos o de

apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos de la Ley Federal

del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenecen

patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya

manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o

desarrollados pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación y Asistencia

en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C., y en el mismo tenor,

reconozco que si derivasen de este trabajo productos intelectuales o desarrollos

tecnológicos, en lo especial, estos se regirán, en todo caso por lo dispuesto por la

Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor

de lo expuesto en la presente declaración.

____________________________

MARGARITA ELIZABETH RICO LEMUS

ÍNDICE GENERAL

Pág.

I. INTRODUCCIÓN 1

II. ANTECEDENTES 2

2.1 Origen e Importancia del género Polianthes 2

2.2 Características morfológicas de P. tuberosa, especies silvestres y

sus híbridos

4

2.3 Reproducción de Polianthes tuberosa y especies silvestres 6

2.4 Propagación in vitro del género Polianthes L. 7

2.5 Embriogénesis somática 12

2.5.1 Picloram y 2,4-D en la inducción de embriogénesis 19

2.6 Óxido nítrico 21

2.6.1 Definición y propiedades fisicoquímicas del óxido nítrico 21

2.6.2 Función del óxido nítrico en las células vegetales 22

2.6.2.1 Rol del óxido nítrico en la síntesis de clorofila 23

2.6.3 Biosíntesis de óxido nítrico en las plantas 24

2.6.4 Agentes químicos donadores de óxido nítrico 27

2.6.5 Complejos de transición metal-óxido nítrico 27

2.6.5.1 Nitroprusiato o nitroprusida de sodio (NPS) 28

2.6.5.2 NPS en el cultivo in vitro 28

III. JUSTIFICACIÓN 31

IV. HIPÓTESIS 32

ÍNDICE GENERAL

Pág.

V. OBJETIVOS 33

5.1 Objetivo general 33

5.2 Objetivos específicos 33

VI. METODOLOGÍA 34


6.1.1 Germinación de semillas 36

6.1.2 Desdiferenciación de tejido somático de plántulas del híbrido 37

6.1.3 Doble tinción diferencial de células 39

6.1.4 Subcultivo de callo potencialmente embriogénico 39

6.1.4.1 Subcultivo utilizando medios de inducción 39

6.1.4.2 Subcultivo utilizando medio de inducción enriquecido

con aminoácidos

40

6.1.5 Subcultivo a medio de expresión 41

6.2 Micropropagación 41

6.2.1 Descripción inicial de plántulas 41

6.2.2 Estimulación de la producción de brotes en plántulas 44

6.2.3 Establecimiento de yemas axilares de la inflorescencia del

híbrido 1008157

46

6.2.4 Propagación de clones del híbrido 1008157 47

6.2.5 Estimulación de la producción de brotes en clones del

híbrido 1008157

47

6.2.6 Extracción y cuantificación de clorofila 50

6.3 Preparación de medios de cultivo con NPS 51

ÍNDICE GENERAL

Pág.

6.4 Análisis estadístico 52

6.5 Enraizado y aclimatación de explantes clones del híbrido

1008157 52

VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 54


7.1.2 Desdiferenciación de tejido somático de plántulas del híbrido 54

7.1.3 Doble tinción diferencial de células 60

7.1.4 Subcultivo de callo potencialmente embriogénico 62

7.1.4.1 Subcultivo utilizando medios de inducción 62

7.1.4.2 Subcultivo utilizando medio de inducción enriquecido

con aminoácidos

68

7.1.5 Subcultivo a medio de expresión 68

7.2 Micropropagación 70

7.2.1 Descripción inicial de plántulas 70

7.2.2 Estimulación de la producción de brotes en plántulas 70

7.2.3 Establecimiento de yemas axilares de la inflorescencia del

híbrido 1008157

81

7.2.4 Propagación de clones del híbrido 1008157 82

7.2.5 Estimulación de la producción de brotes en clones del

híbrido 1008157

84

7.2.5.1 Clones del híbrido con al menos un brote antes del

cultivo en NPS

85

ÍNDICE GENERAL

Pág.

7.2.5.1 Clones del híbrido con al menos un brote antes del

cultivo en NPS

87

7.2.6 Extracción y cuantificación de clorofila 90

7.2.5 Enraizado y aclimatación de explantes clones del híbrido

1008157

91

IX. CONCLUSIONES 92

Xl. BIBLIOGRAFÍA 94

ÍNDICE DE FIGURAS

No. Descripción Pág.

1 Distribución del género Polianthes en México 2

2 Morfología de P. tuberosa var. doble 4

3 Morfología de la especie silvestre P. howardii Verh-Will 5

4 Morfología del híbrido 1008157 6

5 Principales técnicas para la propagación in vitro 9

6 Embriogénesis cigótica en angiospermas y gimnospermas 14

7 Eventos característicos de la embriogénesis somática 16

8 Rutas enzimáticas y no enzimáticas para la producción de óxido

nítrico en las plantas

25

9 Diagrama de los principales grupos de compuestos donadores de

óxido nítrico (NO)

27

10 Principales compuestos del grupo complejos de transición metal-

óxido nítrico

28

11 Diagrama general de la metodología experimental 35

12 Proceso de germinación de las semillas 37

13 Siembra de los segmentos de hoja en el medio de cultivo 38

14 Diseño factorial 24 para evaluar el efecto de picloram y el

nitroprusiato de sodio (NPS) sobre la desdiferenciación de tejido

vegetal de plántulas del híbrido 1008157

38

15 Plántulas resembradas en medio con tidiazuron después de 30 d de

cultivo

42

16 Proceso de establecimiento de las yemas axilares de la

inflorescencia del híbrido 1008157

46

17 Diseño experimental unifactorial utilizado en la evaluación de

multiplicación de brotes adicionando NPS (0, 10, 20, 30 y 40 M)

50

18 Proceso de aclimatación de los explantes clones del híbrido 1008157 54

19 Similitud con los embriones somáticos formados a partir de

secciones tallo en Agave fourcroydes

56

ÍNDICE DE FIGURAS

No. Descripción Pág. 20 Comparación de medias para la respuesta en los 16 tratamientos del

diseño factorial entre NPS y picloram

57

21 Desdiferenciación de tejido a partir de segmentos de hoja de

plántulas provenientes de semillas de un híbrido del género

Polianthes después de 30 d de cultivo

61

22 Comparación de medias para la presencia de estructuras globulares

en los 16 tratamientos del diseño factorial entre NPS y picloram

61

23 Tipos de respuesta en la inducción de la embriogénesis somática a

partir de segmentos de hoja de plántulas de un híbrido del género

Polianthes

64

24 Estructuras globulares sometidas a la doble tinción diferencial 66

25 Comparación de la respuesta de dos genotipos diferentes del

tratamiento con 2.07 y 10 M de picloram y NPS respectivamente,

en medios de cultivo para inducción MIA y MIP

69




70

27 Respuesta de tres genotipos diferentes del tratamiento con 2.07 y 30

M de picloram y NPS respectivamente, en medio de cultivo para

inducción MIA

71


tratamiento con 3.1 y 10 M de picloram y NPS respectivamente, en

medios de cultivo para inducción MIA y MIP

71

29 Comparación de la respuesta de tres genotipos diferentes del



72

30 Comparación de la respuesta de los 4 genotipos diferentes del



73

ÍNDICE DE FIGURAS


31 Comparación de la respuesta de los 4 genotipos diferentes del



74

32 Respuesta de los genotipos a la resiembra en medios de inducción

enriquecido con aminoácidos

76

33 Plantas control con diferencias fenotípicas en su morfología después

de 60 d en medio de cultivo sin NPS

79

34 Efecto del NPS sobre el desarrollo de las plantas durante el primer

cultivo

80

35 Porcentaje de plantas estimuladas para la producción de nuevos

brotes durante el primer cultivo

81

36 Efecto del NPS sobre el desarrollo de las plantas durante el segundo

cultivo

82

37 Porcentaje de plantas que fueron estimuladas hasta el segundo

cultivo para la producción de nuevos brotes

83

38 Porcentaje de plantas que fueron estimuladas al final del

experimento para la producción de nuevos brotes

84

39 Plántulas con mayor número de brotes en cada tratamiento 84

40 Plantas cultivadas en medio con 10 M de NPS después de 60 d de

cultivo

85


cultivo

86


cultivo

87


cultivo

88

44 Establecimiento de yemas axilares a partir de la inflorescencia del

hibrido 1008157

90

ÍNDICE DE FIGURAS


45 Propagación de brotes vegetativos utilizando la multiplicación por

yemas axilares

91

46 Explantes clones del híbrido después de incubarlos en oscuridad 92

47 Marchitamiento y muerte del tejido del ápice de las hojas adultas

durante el cultivo con NPS

94

48 Efecto del NPS sobre las características de desarrollo de los

explantes clones del híbrido con al menos un brote

95

49 Efecto del NPS sobre las características morfológicas de los

explantes clones del híbrido sin brotes al inicio del cultivo

97

50 Prueba de rangos múltiples (LSD) para contenido de clorofila 99

51 Comparación del contenido de clorofila entre los tratamientos con

NPS para los clones del híbrido con o sin brotes durante el cultivo

100

52 Plantas del híbrido 1008157 aclimatadas 101

ÍNDICE DE TABLAS


1 Producción de P. tuberosa L. (gruesa) en México 3

2 Propagación in vitro del género Polianthes 10

3 Embriogénesis somática en el género Agave y otros 18

4 El uso de NPS en combinación con reguladores de crecimiento en la

propagación in vitro

30

5 Descripción inicial de las 75 plántulas del híbrido 1008157 42

6 Diseño experimental unifactorial utilizado para evaluar el efecto de la

concentración de NPS sobre la producción de brotes de plántulas del

híbrido 1008157

45

7 Propagación de plantas del híbrido 1008157 47

8 Descripción inicial de los explantes del híbrido con presencia de al

menos un brote

48

9 Descripción inicial de los explantes del híbrido sin brotes 49

10 Ecuaciones para la determinación clorofila 51

11 Efecto del NPS y picloram en la inducción de embriogénesis

somática utilizando tejido somático de plántulas de un híbrido del

género Polianthes

58

12 Comparación de las respuestas de desarrollo de las plantas durante

el cultivo en medio sin NPS

75


el cultivo en medio con 10 M NPS

81



82



83



84

ÍNDICE DE TABLAS


17 Comparación entre las variables de respuesta para los clones del

híbrido con al menos un brote durante el cultivo en medio con NPS

89

18 Promedio y desviación estándar para las variables de respuesta en

clones del híbrido con presencia de brotes durante el cultivo en

medio con NPS

90

19 Comparación entre las variables de respuesta para los clones del

híbrido sin brotes durante el cultivo en medio con NPS

92

20 Promedio y desviación estándar para las variables de respuesta en

clones del híbrido con presencia de brotes durante el cultivo en

medio con NPS

93

21 Promedio para el contenido de clorofila a y b en explantes clones del

híbrido después del cultivo en medio con NPS

95

A G R A D EC I M I E N T O S

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca

otorgada para la posible realización de mis estudios de Maestría a través del

Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco

(CIATEJ) dentro de la Unidad de Biotecnología Vegetal.

A mi Director de tesis, el Dr. Benjamín Rodríguez Garay por todo el apoyo,

los consejos, las enseñanzas, el tiempo brindado y sobre todo, la paciencia que

mostró para el desarrollo del proyecto.

Al Maestro Manuel Rodríguez por el tiempo otorgado para el análisis de

resultados, la revisión de avances de tesis y seminarios, siempre mostrando una

actitud de aprecio y confianza para solucionar cualquier duda.

Al Dr. Ernesto Tapia por sus comentarios y correcciones en los seminarios y

el tiempo brindado para revisión de avances de tesis. Agradeciendo especialmente

su atenta disposición para la donación del material vegetal de trabajo.

Al Maestro Octavio García Depraect por su tiempo brindado para la

revisión y corrección del documento escrito, por su apoyo, sus consejos y el ánimo

de un buen amigo para culminar a tiempo la maestría.

A mis amigos y compañeros de laboratorio Alejandra Flores, Isabel Ibarra,

Daniela Rodríguez y Ángel Barranco por todo su apoyo en las etapas de trabajo

más pesadas, sin su apoyo hubiera sido más difícil lograrlo.

A mis amigos Magdalena, Samuel, Michelle, Felipe, Jaime Silva, Ismael,

Jesús, Diego, Luzmy, Bahena, Fredy, Anahi, Mary, Nelly por su apoyo y amistad

en los buenos momentos que pasamos juntos, momentos que hicieron mi estancia

en Guadalajara inolvidable y muy placentera.

A cada uno de los profesores de la Maestría en Floricultura, en especial a la

Doctora Antonia, directora de la unidad de Biotecnología Vegetal por su apoyo y

estimación.

D E D I C A T O R I A

A Dios

Por permitirme concluir satisfactoriamente una etapa más en mi vida, por

cuidarme y apoyarme en los momentos decisivos durante estos dos años.

A mi Padres

A mi Papá que me apoyó económicamente pero sobre todo dándome su

confianza y consejos para crecer como persona; a mi Mamá que fue la luz y fuerza

en los momentos más difíciles, que a pesar de la distancia siempre tenía una

palabra de aliento y/o consuelo para continuar. Por recibirme con tanto cariño

cuando estaba en casa y despedirme dándome ánimos y fortaleza a mi regreso.

A mis hermanos por su apoyo incondicional, por creer en mí y sentirse

orgullosos de mis logros.

Al Dr. José Luis Cabrera Ponce, por impulsarme en realizar una Maestría y

vincularme con el CIATEJ, sin su apoyo y consejos, esta gran meta no la hubiera

comenzado en cuanto salí de la universidad.

RESUMEN

El género Polianthes L. (Asparagaceae), es endémico de México y posee

gran variedad de especies silvestres distribuidas en gran parte del territorio

nacional. Este género es representado económica y culturalmente por la variedad

comercial P. tuberosa L. la cual en tiempos prehispánicos fue utilizada por los

aztecas como flor de corte y para usos medicinales. Actualmente, está siendo

utilizada en la industria farmacéutica y para uso ornamental. Se han realizado

cruzas entre P. tuberosa L. y especies silvestres para obtener híbridos con

características especiales por ejemplo el color de la flor, el aroma, el tamaño, etc.

que las hagan atractivas para un nicho de mercado. La propagación in vitro del

género Polianthes se ha realizado principalmente por la técnica de yemas axilares

utilizando reguladores de crecimiento como auxinas y citocininas. Escasamente la

regeneración in vitro de esta planta se ha estudiado y realizado por la técnica de

embriogénesis somática. En el presente estudio se realizó la regeneración de un

híbrido producto de la cruza de P. tuberosa L. y P. howardii mediante las técnicas

de yemas axilares y embriogénesis somática. Además de adicionar al medio de

cultivo reguladores de crecimiento, se utilizó diferentes concentraciones de

nitroprusiato de sodio (NPS), un agente químico donador de oxido nítrico, para

estimular la respuesta del tejido vegetal en cada una de las técnicas utilizadas.

Dentro de los resultados, únicamente se logró la regeneración del hibrido por la

técnica de yemas axilares. Sin embargo, la adición de NPS en las diferentes

concentraciones (10, 20, 30 Y 40 M) no aportó diferencia estadística para la

producción de brotes con respecto al control que contenía solo reguladores de

crecimiento (10 mg/L de BA y 0.025 mg/L de 2,4-D). Sin embargo, numéricamente,

la producción de nuevos brotes del híbrido sí fue mayor cuando el medio de cultivo

fue adicionado con 40 M de NPS. Debido a estos resultados se podría

incrementar la concentración de NPS en estudios posteriores del género

Polianthes.

Palabras clave: Polianthes, híbrido, regeneración, in vitro, nitroprusiato de sodio.

ABSTRACT

The genus Polianthes L. (Asparagaceae), is endemic to Mexico. It has a

high number of species distributed over a great part of Mexican territory. This

genus is represented economically and culturally by the commercial variety P.

tuberosa L. which in ancient times was used by the Aztecs as a cut flower and for

medicinal uses. Currently, it is being used in the pharmaceutical industry and for

ornamental uses. Crosses have been made between P. tuberosa L. and wild

species generating hybrids with special characteristics such as flower color, flavor,

size, etc. that make them attractive to a specific niche market. In vitro propagation

of genus Polianthes has been mainly carried out by axillary buds culture technique

using plant growth regulators such as auxins and cytokinins. Rarely in vitro

regeneration of this plant has been studied and applied by somatic embryogenesis

technique. In this study, the regeneration of a hybrid product obtained by cross of

P. tuberosa L. with P. howardii was performed using axillary buds culture and

somatic embryogenesis technique. Besides adding to the culture medium growth

regulators, different concentrations of sodium nitroprusside (SNP), a chemical

agent used as nitric oxide donor, to stimulate a response on plant tissue. Results

showed that only hybrid regeneration was achieved by using axillary buds

technique. On the other hand, the addition of NPS in different concentrations (10,

20, 30 and 40 uM) no provided significant statistical difference for shoot production

over the control, which contained only growth regulators (10 mg BA /L and 0.025

mg 2,4-D /L). However, numerically, the production of new shoots from hybrid was

higher when the culture medium was added with NPS (40 uM). Finally, these

results point out that the effect of NPS concentration on the genus Polianthes must

be studied deeply.

Keywords: Polianthes, hybrid, regeneration, in vitro, sodium nitroprusside.

I. INTRODUCCIÓN

En México los productos ornamentales han ganado terreno en cuanto a

exportaciones y al valor de la producción. En el año 2011 el valor de la floricultura

fue de 5,646 millones de pesos, además, la superficie destinada al cultivo de flores

y plantas en maceta fue de 18,629 ha. Los estados con mayor participación por el

valor de la producción de este cultivo destacaron Estado de México, Puebla,

Morelos, Distrito Federal, Baja California y Jalisco.

P. tuberosa L. se cultiva extensivamente dentro del territorio nacional debido

a sus flores intensamente aromáticas y su uso en la industria del perfume. La

forma más común y fácil de propagación es de manera asexual usando bulbos

tanto para la variedad comercial como para las especies silvestres sin embargo

esto tiene desventajas en tiempo, costo y enfermedades de las plantas. Por lo

tanto, es necesario implementar protocolos de cultivo in vitro debido a las ventajas

que esta técnica ofrece como son el número elevado de plantas en un espacio

reducido, la producción en cualquier época del año, el crecimiento más vigoroso y

rejuvenecimiento de la planta así, como plantas libres de enfermedades. De esta

manera, se podrían propagar especies silvestres o híbridos del género Polianthes

con características especiales para que resulten atractivas para un nuevo

mercado.

Recientemente se está implementado el uso de agentes químicos donadores

de óxido nítrico (NO) como potenciadores del crecimiento de las plantas. Tal es el

caso del nitroprusiato de sodio (NPS) un compuesto que libera NO al medio de

cultivo. El NPS ha sido evaluado en su mayoría en protocolos de propagación y en

estudios para la protección de las células contra daños por patógenos u otro tipo

de estrés. En el presente estudio se realizó una evaluación del efecto de NPS en

la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes. Se evaluó la

respuesta del tejido somático de plántulas a la inducción de embriogénesis y por

otro lado se evaluó el efecto de NPS en la producción de brotes a partir de yemas

axilares.

2

Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración

in vitro de un híbrido del género Polianthes

II. ANTECEDENTES

2.1 Origen e Importancia del género Polianthes

El género Polianthes L. (Asparagaceae), es endémico de México y está

conformado por catorce especies, tres variedades y dos cultivares (Solano, 2000).

Desde tiempos prehispánicos, este género ha tenido importancia en aspectos

económicos, científicos y culturales, siendo utilizado comúnmente para propósitos

ornamentales y ceremoniales. Polianthes L. se distribuye principalmente desde el

sur de Chihuahua y Tamaulipas hasta el centro-sur de Oaxaca. La Figura 1

muestra las áreas con mayor variedad de especies que se localizan a lo largo de

la Sierra Madre Occidental y la Faja Volcánica Transmexicana (Solano y Feria,

2007). Por otra parte, en base a estudios citogenéticos del género Polianthes, este

comparte una cercana relación a la familia Agavaceae, presentando un número

cromosómico haploide x=30, de los cuales, 25 cromosomas son pequeños y 5 son

grandes con forma de L (Barba-Gonzalez y col., 2012).

Figura 1. Distribución del género Polianthes en México (tomado de Barba-González y col., 2012).

La principal especie conocida del género Polianthes es P. tuberosa L.,

conocida comúnmente como nardo. En México, los aztecas la cultivaban desde

antes de la conquista como planta ornamental y medicinal. Ellos nombraron a sus

flores "omixochitl" o flor de hueso por poseer un color blanco-crema y ser

intensamente fragantes. La planta ornamental P. tuberosa L. se cultiva

extensivamente dentro del territorio nacional principalmente en el estado de

3



Jalisco (Trueblood, 1973). Además de México; en India, Nueva Zelanda y Japón el

nardo se cultiva comercialmente debido a sus flores intensamente aromáticas y es

usado en la industria del perfume en India y Francia (Barba-González y col.,

2012).

De acuerdo a la Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural,

Pesca y Alimentación (SAGARPA), México reportó en el año 2014 una producción

de P. tuberosa L. de aproximadamente 328 mil toneladas representando un valor

de producción cercano a 47 millones de pesos (Tabla 1).

Tabla 1. Producción de P. tuberosa L. (gruesa) en México

(SAGARPA, 2014)

En México, cinco especies de Polianthes (P. densiflora, P. howardii, P.

longiflora, P. palustris y P. platyphylla) se encuentran incluidas en la categoría de

protección especial en la Norma Oficial Mexicana (NOM-059-ECOL-2001)

(SEMARNAT, 2002), anteriormente estas especies estaban catalogadas como

raras ante la IUCN (por sus siglas inglés, International Union for Conservation of

Nature) (Oldfield, 1997). Actualmente, el término "raro" ya no es utilizado, sin

embargo, cabe resaltar que la rareza es una categoría natural de distribución o

abundancia del taxón y no necesariamente indica riesgo de extinción.

Parámetro Valor

Superficie sembrada (ha) 282.50

Superficie cosechada (ha) 282.50

Producción (t) 327,467.15

Rendimiento (t/ha) 1,159.18

Precio medio rural (pesos (MXN)/t) 143.74

Valor de producción (miles de pesos (MXN)) 47,069.96

4



No obstante, tal concepto, puede considerarse un factor importante en la

evaluación del estatus de conservación de las especies (Solano y Feria, 2007).

Siendo importante efectuar una revisión continua de dicho estatus sobre todo

cuando existe una transformación de los hábitats naturales (Oldfield, 1997).

2.2 Características morfológicas de P. tuberosa, especies silvestres y

sus híbridos

La morfología de P. tuberosa (Figura 2) se describe como una planta

herbácea, perenne, de hojas verdes lineares a lanceoladas (Figura 2c). Sus flores

intensamente fragantes son blancas, cerosas y se agrupan por parejas. Cada flor

posee un sépalo, seis estambres y un solo pistilo (Figura 2a). La planta completa

(desde la base del bulbo) suele medir entre 60 cm y 1 m de altura. El órgano de

reproducción asexual de P. tuberosa es el bulbo, este tiene una forma ovoide y, su

longitud y diámetro es de 3 a 3.5 cm y 2 cm respectivamente; presenta de 6 a 10

hojas por roseta y de la parte central del bulbo emerge el tallo floral o

inflorescencia, siendo esta, de tipo espiga con flores tubulares, alcanzando una

altura promedio de 40 cm (desde donde aparecen las primeras flores hasta el

ápice floral, Figura 2b) (Solano, 2000).

Figura 2. Morfología de P. tuberosa var. doble. a) Estructura de las flores b)Inflorescencia floral c) Morfología de las hojas

5



Respecto a la morfología de las especies silvestres de Polianthes, la especie

P. howardii Verh-Will (distribuida principalmente en los estados de Colima y

Jalisco) (Figura 3) se caracteriza por presentar una longitud de planta completa

entre 62 a 108 cm; su bulbo, al igual que P. tuberosa, es de forma ovoide y

generalmente tanto su longitud como su diámetro mide 8 mm; este bulbo posee de

5 a 6 hojas por roseta (con manchas purpuras en la base) con una longitud y

ancho promedio de 22 a 27 cm y 1.5 a 2.5 cm respectivamente. Por otra parte, su

inflorescencia con forma de racimo tiene de 15 a 41 nudos fértiles y, la distancia

que existe entre dos nudos es mayor en el caso de los nudos estériles que en los

fértiles. Con relación a la sección donde se encuentran las flores en la

inflorescencia, esta sección presenta un color morado o rojizo; sus flores sin

fragancia aparecen solitarias con pedicelos rojizos con una longitud de 2 a 4.7 cm

y un tubo floral de 1.2 a 2.1 cm de largo y 3.2 a 5 mm de ancho (Solano, 2000).

Figura 3. Morfologia de la especie silvestre P. howardii Verh-Will. (a) tomada de Barba-González y col., 2012; (b) tomada de Feria-Arroyo y col., 2010).

Se han realizado cruzas entre Polianthes tuberosa L. y especies silvestres

para obtener híbridos que conserven o no características de ambos progenitores y

puedan ser de interés comercial y/o designadas para el registro de nuevas

6



variedades. En este sentido, en el presente trabajo se utilizó un híbrido (No. de

registro interno 1008157 proporcionado por el Centro de Investigación y Asistencia

en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco A.C., CIATEJ) producto de la cruza

realizada entre P. tuberosa L. (madre) y P. howardii Verh-Will. (padre). La Figura 4

muestra las principales carecteristicas morfológicas del híbrido.

Figura 4. Morfología del híbrido 1008157.

2.3 Reproducción de Polianthes tuberosa y especies silvestres.

La reproducción comercial de P. tuberosa L. se realiza comúnmente

utilizando el bulbo, que se siembra al comienzo de la estación templada, en un

terreno rico en materia orgánica y con un porcentaje elevado de arcilla y de arena.

Cuando es tiempo de floración, la inflorescencia suele durar más de 40 d en

disposición de ser cortada, ya que éstas deben mantenerse para completar el ciclo

de multiplicación de los nuevos bulbos, que por regla general se extraen de la

tierra a la llegada de la estación fría. La reproducción de Polianthes tiene un ciclo

7



de tres años. Durante el primer año los bulbillos nacen junto al bulbo madre, en el

segundo se engrosan y finalmente durante el tercer año, los bulbillos son

separados del bulbo madre, estando listos para la etapa de floración (SIAP, 2014).

Por otra parte, las especies silvestres de Polianthes pueden ser reproducidas

tanto vegetativamente mediante bulbos (al igual que P. tuberosa) como

sexualmente a partir de la semilla. La técnica de propagación por semilla es

utilizada en programas de mejoramiento, siendo importante en el mantenimiento

de la diversidad genética y la propagación de las especies de Polianthes en

peligro de extinción. Sin embargo, desde un punto de vista comercial, la

propagación por semilla presenta una gran desventaja; y es que para alcanzar la

madurez en la planta es necesario un tiempo demasiado prolongado. Aunado a

esta desventaja, muchas especies silvestres de Polianthes presentan una

producción deficiente en el número y la viabilidad de las semillas (Barba-González

y col., 2012).

2.4 Propagación in vitro del género Polianthes L.

Como se mencionó previamente, dentro de las características de

reproducción para el género Polianthes (tanto comercial como silvestre), la forma

más común y fácil de propagación es de manera asexual usando bulbos. Sin

embargo, debido a sus ventajas, la propagación in vitro también conocida como

micropropagación es la principal técnica utilizada para la generación de millones

de plántulas de diferentes especies cada año, ya que teóricamente, para

micropropagar un cultivo, cualquier órgano y tejido de las plantas pueden ser

potencialmente utilizados como punto de inicio (Mendoza, 2013).

Las ventajas de la propagación in vitro abarcan dos vertientes, la primera, es

la cantidad de material vegetal utilizado para poder realizar la técnica, es decir,

para iniciar la micropropagación se puede partir de una parte muy pequeña de la

planta y así generar nuevos brotes. La segunda, es el desarrollo del cultivo masivo

de una especie, esto permite producir un número elevado de plantas en un

8



espacio reducido, lo que conlleva a producir plantas no solo en una temporada

sino durante cualquier época del año y, disminuir los insumos y el personal

destinado para el cuidado de las plantas. Además, el crecimiento de las plantas

propagadas in vitro con frecuencia es más vigoroso que el de las plantas

propagadas in vivo, debido al rejuvenecimiento de la planta y a la obtención de

plantas libres de enfermedades (George, 1993; George y col., 2008).

Las técnicas para la micropropagación que son teóricamente disponibles

para la regeneración de plantas in vitro se ilustran en la Figura 5. Resumiendo, las

técnicas se pueden realizar a partir de la multiplicación de brotes partiendo de (1)

yemas axilares o apicales y (2) por la formación de brotes adventicios y/o

embriones somáticos adventicios (George, 1993).

Dentro de las técnicas para realizar la propagación, en el presente estudio se

utilizó la multiplicación por medio de yemas axilares y la embriogénesis somática

(mostrada en sección 2.5). Respecto a la primera, es importante mencionar que el

fundamento de esta técnica se basa en promover el desarrollo de puntos de

crecimiento ya existentes en las plantas conocidos como meristemos. Por otra

parte, teóricamente la multiplicación por medio de yemas axilares mantiene la

fidelidad genética de la descendencia con respecto a la planta madre, ya que la

variación somaclonal está prácticamente ausente cuando se cultivan estructuras

organizadas como lo son meristemos y yemas. Por lo que puede considerarse que

este es el sistema ideal para la propagación clonal de cultivares (Molphe y col.,

1999).

Debido a que no existe un método general para la micropropagación, es

necesario realizar estudios específicos con el fin de efectuar y mejorar esta técnica

consiguiendo de esta forma la regeneración y multiplicación de una especie o

variedad en particular. En la actualidad los estudios que conllevan a la

regeneración de plantas in vitro son enfocados principalmente a estimular una

respuesta positiva en el crecimiento de la planta. Esto se consigue básicamente a

9



través de la evaluación de (1) diferentes tipos de tejido como explante inicial y (2)

diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento (RC) y agentes químicos,

por ejemplo, la adición de nitroprusiato de sodio como donador de óxido nítrico al

medio de cultivo para favorecer los eventos fisiológicos y bioquímicos de las

plantas (Rico-Lemus y Rodríguez-Garay, 2014).

Figura 5. Principales técnicas para la propagación in vitro. Adaptado de George y col., 2008.

Aunque la propagación in vitro de especies silvestres o híbridos de

Polianthes es nula, existe información escasa para la micropropagación de P.

tuberosa L. En la siguiente tabla se muestra en orden cronológico y de forma

resumida información de diversos trabajos realizados para la micropropagación de

este género. Cabe mencionar que hasta la fecha, no se reporta el desarrollo de

protocolos de micropropagación para el género Polianthes utilizando agentes

químicos donadores de óxido nítrico.

10



Tabla 2. Propagación in vitro del género Polianthes.

Explante Respuesta Medio + RC óptimo

(mg/L)

Referencia

Segmentos de

bulbo

Yemas

axilares

MS + 3.0 KIN (IB)

MS + 2.0 AIB (IR)

(Rajasekaran,

y col., 2000)

Segmentos de

tallo terminales

y axilares

Yemas

axilares

MS + 2.0 BAP + 0.1 AIA (IB)

MS + 0.2 AIA + 0.25 AIB (IR)

(Krishnamurthy

y col., 2001)

Segmentos de

tallo

Yemas

axilares

MS + 1.0 BAP + 15.0 AG3

(IB)

MS + 0.5 ANA (IR)

(Datta y col.,

2002)

Segmentos de

bulbo

Organogénesis MS + 0.5 BAP + 0.5 2,4-D

(IC)

MS + 1.0 BAP + 1.0 2,4-D

(IC)

MS + 1.0 BAP (RB)

(Nazneen y

col., 2003)

Segmentos de

bulbo con o sin

yemas axilares

Organogénesis MS modificado + 1.9 ANA

(IC)

MS modificado + 3.4 BAP +

0.9 ANA (IB)

MS modificado + 0.9 2,4-D

(CC)

MS modificado + 0.9 2,4-D +

174.2 L-arginina (RB)

MS modificado + 4.5 BAP +

0.9 2,4-D (PB)

(Ahmad y col.,

2006)

Rizomas Organogénesis MS + 1.5 BAP + 0.5 AIA (IB)

MS + 0.2 AIA + 0.25 AIB (IR)

(Sangavai y

Chellapandi,

2008)

Segmentos de

bulbo

Yemas

axilares

MS + 1.0 BA + 0.2 ANA (IB) (Estrada-

Basaldua y

col., 2011)

Discos de tallo Organogénesis WH + 0.3 TDZ + 0.5 ANA (IB)

WH + 2.0 AIB (IR)

(Gajbhiye y

col., 2011)

11



Continuación…

Explante Respuesta Medio + RC óptimo

(mg/L)

Referencia

Segmentos

externos e

internos del

bulbo

Yemas

axilares

MS + 2.5 BAP + 0.5 ANA +

0.1 KIN (IB)

MS + 1.0 ANA (IR)

(Naz y col.,

2012)

Botón floral,

yema floral,

segmentos de

bulbo y hoja

Yemas

axilares y

Organogénesis

GC + 4.5 BAP + 0.1 ANA (IB)

GC + 4.5 BAP + 0.1

ANA (Desarrollo-

proembriones)

(Hernández,

2013)

Segmentos de

bulbo:

Híbrido var

Prajwal

Híbrido var

Shringar

Yemas

axilares

Yemas

axilares

MS + 2.0 BAP + 2.0 KIN (IB)

MS + 0.5 AIB + 2.0 AIA (IR)

MS + 0.2 BAP + 0.2 KIN (IB)

MS + 0.5 AIB + 2.5 AIA (IR)

(Panigrahi y

col., 2013)

Segmentos de

bulbo:

Cultivar Phule

Rajni

Cultivar

Calcutta Doble

Yemas

axilares

Yemas

axilares

MS + 1.0 BAP + 1.0 KIN (IB)

MS + 0.5 ANA + 0.5 AIA (IR)

MS + 2.5 BAP + 2.5 KIN (IB)

MS + 3.5 ANA + 0.5 AIA (IR)

(Panigrahi y

col., 2013)

Discos de tallo Organogénesis WH + 4.0 2,4-D (IC)

WH + 1.0 TDZ + 0.5 ANA (IB)

(Raghuvanshi

y col., 2013)

Segmentos de

bulbo con

yemas axilares

Yemas

axilares

MS + 6.0 BAP (IB)

MS + 1.0 ANA (PB)

(Dehdezi y

col., 2014)

IB=inducción de brotes; IR= inducción de raíces; IC= inducción de callo; CC= producción o aumento de callo; RB= regeneración de brotes; PB= proliferación de brotes; GC= MS + 50 mL agua de coco + 20 g sacarosa; WH= Medio White KIN= kinetina; AIB= ácido indolbutírico; AIA= ácido indolacético; BAP = bencilaminopurina; BAP = 6-N-bencil aminopurina; AG3= ácido giberélico; ANA = ácido 1-naftalenacético; 2,4-D= ácido 2,4- diclorofenoxiacético

A partir de la información presentada en la Tabla 2, en los trabajos realizados

para la propagación in vitro del género Polianthes se usó mayormente P. tuberosa,

exceptuando los trabajos realizados por Panigrahi et al., (2013a; 2013b) donde

utilizó tejido de híbridos o cultivares como explante. Por otra parte, se puede

12



resaltar el éxito que se ha tenido en la regeneración de plantas utilizando la

técnica de propagación por yemas axilares.

Además, las concentraciones óptimas de RC para una mejor respuesta en la

micropropagación encontradas empíricamente durante los diferentes estudios,

representan un amplio espectro de opciones que sirven de guía para el desarrollo

de nuevos protocolos. Es importante subrayar que el efecto de los RC es diferente

para cada planta, y está en función de la especie, el explante que se utilice, el

estado de desarrollo en que se encuentre la planta de donde se toma el explante

inicial, la concentración e interacción hormonal, y los factores ambientales a la

cual sea expuesta.

2.5 Embriogénesis sómatica

Antes de la descripción de las etapas y eventos celulares que ocurren

durante el proceso de embriogénesis somática, es importante tomar en cuenta

algunos conceptos básicos del proceso de embriogénesis cigótica, el cual se lleva

a cabo durante la reproducción sexual de las plantas.

Hace aproximadamente 300 millones de años las plantas se dividieron en

angiospermas y gimnospermas. Actualmente, en ambos grupos las etapas básicas

del desarrollo del embrión se encuentran bien definidas (von Arnold y col., 2002).

En plantas angiospermas, se genera simultáneamente el embrión y el endospermo

durante el proceso llamado doble fertilización, este propicia el desarrollo de una

semilla viable (Dodeman y col., 1997). En contraste, en plantas gimnospermas,

generalmente no ocurre el proceso de la doble fertilización.

En ambos tipos de plantas, la formación del embrión requiere la secuencia

de etapas características, para las angiospermas comienza con la aparición del

cigoto (célula que resulta de la unión de las células sexuales masculina y

femenina), y continúa con su desarrollo a través de divisiones celulares y cambios

13



morfológicos hasta llegar a un estado cotiledonar. A todo este proceso, se le

conoce como embriogénesis cigótica (Figura 6a) (von Arnold y col., 2002).

De acuerdo con Dodeman y colaboradores (1997) el desarrollo embrionario

puede ser dividido en dos eventos principales:

1. Embriogénesis sensu stricto: Como se mencionó anteriormente, en el caso

de plantas angiospermas, el desarrollo comienza con la formación del cigoto, el

cual sufre una serie de divisiones de manera ordenada. Estas divisiones fueron

descritas y agrupadas en tres eventos por (Goldberg y col.,1994): (1) División

asimétrica del cigoto, la cual da origen a una célula pequeña apical y una célula

grande basal; (2) Formación de un patrón específico, la cual da lugar al estadio de

un embrión globular y (3) Transición a la etapa cotiledonar, en la cual se presenta

la aparición de cotiledones primarios.

Por otro lado, en plantas gimnospermas, la secuencia para el desarrollo

embrionario está dividida en tres eventos descritos por Singh (1978) y que se

esquematizan en la Figura 6b: (1) Proembriogénesis, la cual representa a todas

las etapas antes de la elongación del suspensor; (2) Embriogénesis temprana, la

cual engloba a todas las etapas después de la elongación del suspensor y antes

del establecimiento del meristemo radicular y (3) Embriogénesis tardía,

histogénesis intensiva que incluye la formación de la raíz y los meristemos

apicales.

2. Maduración del embrión seguido por su germinación: A partir de esta

etapa, tanto en angiospermas como en gimnospermas la actividad meristemática

se dispara dando lugar a cambios fisiológicos donde inician los procesos de

crecimiento, almacenamiento de sustancias de reserva y maduración. Los

cambios fisiológicos, tales como la desecación, y en la mayoría de los casos la

dormancia, completan el proceso de la formación de semillas (Dodeman y col.,

1997).

14



Figura 6. Embriogénesis cigótica. (a) en angiospermas, ejemplo Arabidopsis, dibujos basados en Goldberg y col., 1994. (b) en gimnospermas, ejemplo de la familia Pinacea, dibujos basados en Gifford y Foster, 1989). Abreviaturas traducidas del inglés: EP = parte embrionaria, pU = suspensor primario, pE = parte embrionaria primaria, E = sección de embrión, S = sección suspensor, U= tejido somático, EM = tejido embrionario, sS = suspensor secundario. La ilustración no está a escala.

Por otra parte y, retomando el enfoque del presente estudio, la

embriogénesis somática se define como un proceso de desarrollo en el cual

células somáticas son sometidas a un serie de reestructuraciones para generar

células embriogénicas. Las células somáticas experimentan cambios morfológicos

y bioquímicos que resultan en la formación de un embrión somático (también

llamado no-cigótico) con la capacidad de regenerarse y formar una nueva planta

(Yang y Zhang, 2010).

Los primeros reportes de embriogénesis somática fueron publicados en 1958

por Reinert; Stewards y colaboradores, utilizando un cultivo de células en

suspensión de Daucus carota L. Desde entonces, el potencial de la embriogénesis

somática ha sido probado exitosamente en una amplia gama de sistemas de

15



de tejidos tanto para plantas dicotiledóneas como monocotiledóneas (Mathieu y

col., 2006; Quiroz-Figueroa y col., 2006).

La embriogénesis somática es una técnica muy útil para la conservación de

germoplasma in vitro y para el mejoramiento genético. Como método para la

micropropagación, esta aumenta la eficiencia del sistema de multiplicación,

disminuye los costos de producción, y permite la automatización parcial del

proceso mediante el uso de biorreactores. Es decir, esta técnica ha permitido

desarrollar la micropropagación eficiente de varias especies económicamente

importantes. En el proceso se modulan factores biológicos, físicos y químicos los

cuales deben ser optimizados para cada especie, variedad, o incluso línea

genética con el fin de generar el éxito de un protocolo y/o hacerlo comercialmente

viable (Monja-Mio y Robert, 2013).

La embriogénesis somática puede derivar de una célula somática individual o

de un grupo de células. Además, es posible clasificarla en dos tipos de

embriogénesis: (1) Directa, cuando los embriones somáticos se diferencian desde

el explante inicial sin pasar por una fase de callo y (2) Indirecta, donde el explante

inicial forma un callo que posteriormente se diferencia para formar embriones

somáticos (Williams y Maheswaran, 1986).

En resumen, para realizar la embriogénesis somática se requiere de una

serie de etapas que siguen una única ruta de desarrollo que involucra un número

de eventos celulares complejos (Figura 7). Dichas etapas se explican en base a

von Arnold y col., (2002)

1. Iniciación de cultivos embriogénicos, para ello se cultiva el explante inicial

en un medio suplementado con reguladores de crecimiento, principalmente

auxinas, pero comúnmente dicho medio también es adicionado con citocininas.

16



2. Proliferación de cultivos embriogénicos, se realiza en medio sólido o

líquido suplementado con reguladores de crecimiento a concentraciones similares

o menores a las utilizadas en el medio de iniciación.

3. Premaduración de embriones somáticos, esto se lleva a cabo en medio sin

RC, para inhibir la proliferación de células no embriogénicas y, estimular la

formación y el desarrollo temprano de embriones.

4. Maduración de embriones somáticos, se realiza un cultivo utilizando un

medio suplementado con ABA y/o con un potencial osmótico reducido.

5. Desarrollo de plantas, para ello se utiliza un medio que carece de RC, lo

cual propicia la aparición y el fortalecimiento de raíces.

Figura 7. Eventos característicos de la embriogénesis somática.

Nomura y Komamine (1985) y Quiroz-Figueroa y colaboradores (2002)

coinciden en llamar a la primera fase de la embriogénesis somática, iniciación

embriogénica, donde células somáticas diferenciadas pasan por un proceso de

desdiferenciación para adquirir competencia embriogénica y proliferar como

células embriogénicas. Esta fase de iniciación de la vía embriogénica se limita a

ciertas células sensibles que tienen el potencial para activar los genes que

participan en la generación de células embriogénicas. Una vez que estos genes se

1. Desdiferenciación celular

2. Activación de la división celular

3. Reprogramación celular (fisiología, metabolismo, patrones de expresión de

genes)

17



activan, la expresión programada de genes embriogénicos reemplaza el patrón de

genes establecido en el tejido del explante (Quiroz-Figueroa y col., 2002).

Una vez que las células embriogénicas se han formado, estas continúan

proliferando y forman masas proembriogénicas (PEMs). Las auxinas son

requeridas para la etapa de proliferación pero son inhibidoras para el desarrollo

posterior de embriones somáticos (Filonova y col., 2000; Nomura y Komamine,

1995). El grado de diferenciación de embriones que tiene lugar en presencia de

concentraciones de auxina varía en diferentes especies. En la mayoría de los

cultivos, el potencial embriogénico disminuye con el cultivo prolongado en un

medio que contiene reguladores de crecimiento y eventualmente llega a perderse

esa capacidad embriogénica (von Arnold y col., 2002).

Dentro del acervo bibliográfico de la técnica de embriogénesis somática en el

género Polianthes la información es casi nula, sin embargo, existe información de

géneros cercanamente emparentados como es el caso del género Agave, donde

se ha logrado exitosamente la regeneración de embriones somáticos. También, la

embriogénesis somática se ha realizado satisfactoriamente en otras plantas

ornanmentales bulbosas como es el caso de Tulipa gesneriana L. y Lilium

longiflorum Thunb. Basado en esta revisión (Tabla 3), en el presente trabajo de

investigación fueron seleccionados aquellos reguladores de crecimiento que

pudieran resultar más efectivos para el desarrolo de esta técnica.

18



Tabla 3. Embriogénesis somática en el género Agave y otros

Especie Medio + RC

óptimos (M)

Tipo de

embriogénesis

Referencias

Agave

fourcroydes

Lem.

MS + 2.26

dicamba

MS + 2.07

picloram

Embriogénesis

somática directa a partir

de discos de tallo

(Monja-Mio y

Robert, 2013)

Polianthes

tuberosa L.

11.31 2,4-D +

0.44 BAP medio

MS líquido o

sólido

Embriogénesis

somática indirecta a

partir de hoja, tallo y

yema floral

(Abdullah, 2012)

Agave tequilana

Weber cultivar

azul

MS + 9.0 2,4-D +

1.3 BAP

Embriogénesis


partir de segmentos de

hoja

(Santacruz-

Ruvalcaba y

Portillo, 2009)

Agave salmiana MS + 2.7 ANA +

5.0 BAP +

Cocktail 20

Embriogénesis


partir de segmentos

hoja

(Flores-Benítez

y col., 2007)

Agave tequilana

Weber cultivar

azul

66.6 BA + 4.5

2,4-D

9.0 2,4-D + 1.3

BAP

Embriogénesis



hoja

(Portillo y col.,

2007)

Tulipa

gesneriana L.

25 picloram + 0.5

BAP

Embriogénesis



tallo floral

(Ptak y Bach,

2007)

Lilium

longiflorum

MS reducido +

1.0 ANA + 1.1

BAP + 4.5%

sacarosa en

presencia de luz

Embriogénesis



bulbo

(Bakhshaie, y

col., 2010)

Agave tequilana

Weber cultivar

azul

MS + 13.6 2,4-D

+ 1.3 BAP

Embriogénesis



hoja y raíz

(Portillo y

Santacruz-

Ruvalcaba,

2006)

Continuación...

19



Especie Medio + RC

óptimos (M)

Tipo de

embriogénesis

Referencias

Agave victoria

reginae

MS + 2.26 2,4-D Embriogénesis

somática indirecta

(Martínez-

Palacios y col.,

2003)

Agave victoria

reginae Moore

MS + 1.4 2,4-D Embriogénesis

somática directa a partir

de hoja

(Rodríguez-

Garay y col.,

1996)

2.5.1 Picloram y 2,4-D en la inducción de embriogénesis.

Se ha propuesto que los reguladores de crecimiento vegetal y el estrés

celular desempeñan un papel central en la mediación de la cascada de

transducción de señales. Esto conduce a la reprogramación de la expresión

génica, seguido por una serie de divisiones celulares que inducen el crecimiento

del callo ya sea de manera desorganizada o mostrando un crecimiento polarizado

que conduce a la embriogénesis somática (de Jong y col., 1993; Dudits y col.,

1991).

La iniciación o activación en función de una respuesta auxínica puede ser un

evento clave en la adaptación celular y la reprogramación genética, metabólica, y

fisiológica, conduciendo a que células vegetales somáticas sean potencialmente

embriogénicas (Yang y Zhang, 2010). Además de las auxinas como un inductor

principal para la embriogénesis somática, también hay estudios en respuesta

aotros RC como citocininas o el ácido abscísico (ABA). Recientemente la

aplicación de una nueva generación de RC como los oligosacáridos, jasmonatos,

poliaminas y brasinoesteriodes han demostrado ser útiles para la iniciación de la

embriogénesis en muchas especies vegetales (Jiménez, 2005).

Las auxinas comúnmente utilizadas en el cultivo de tejidos son el ácido 2,4-

diclorofenoxiacético (2,4-D) y el ácido 1-naftalenacético (ANA). El 2,4-D es usado

para la inducción de callo y en la técnica de suspensiones celulares. Otras auxinas

como dicamba (ácido 3,6-dicloro-O-anísico) y picloram (ácido 4-amino-3,5,6

20



trichloropyridine-2-carboxilico) son empleadas comercialmente como herbicidas

selectivos, en contraste, estos mismos son comúnmente efectivos en la inducción

de formación de tejido embriogénico y en el mantenimiento de la viabilidad de

suspensiones celulares (Gaspar y col., 1996).

La eficiencia del picloram en la inducción de callo es comparable a la

eficiencia del 2,4-D en terminos de la inducción de crecimiento, y es superior a

éste en cuanto a lograr la friabilidad de los callos (Gaspar y col., 1996). Sin

embargo, como se ha mencionando anteriormente, el nivel de respuesta de los

grupos de RC es muy variable. Especificamente la acción de las auxinas se

diferencia no sólo de planta a planta, sino también de órgano a órgano, tejido a

tejido, célula a célula y, por otra parte, también con la edad y el estado fisiológico

de la planta (Davies, 2010). Algunos ejemplos comparativos en el uso de picloram

y 2,4-D son mostrados en la Tabla 3. La auxina inductora de la embriogénesis

somática indirecta que ha presentado mayor éxito sobre las especies Agave

tequilana y Agave victoria reginae es 2,4-D. Sin embargo, dentro del mismo

genero pero diferente especie (Agave fourcroydes) resultó ser mejor el uso de

picloram para la inducción de embriogénesis somática y coincide con trabajos

realizados en otras especies de plantas hornamentales y bulbosas.

Respecto a otras especies, donde se ha empleado el picloram como el

principal regulador de crecimiento para el desarrollo de embriogénesis somatica,

se encuentra el estudio realizado en Fragaria ananassa L. que utilizó hojas como

explante inicial y el medio óptimo para la inducción de embriones somáticos

contenía 2 mg/L de picloram (Kordestani y Karami, 2008). Otros ejemplos de éxito

para la inducción de embriogénesis somática utilizando picloram son en: Triticum

aestivum L. donde el uso del picloram aumentó la producción de callo (Mendoza y

Kaeppler, 2002); cultivares de Hordeum vulgare (Castillo y col., 1998); Paspalum

scrobiculatum L. donde la formación directa de embriones somáticos tuvo lugar

utilizando un medio de cultivo que contenía una combinación de picloram y

21



cinetina (Kaur y Kothari, 2004) y Lilium longiflorum donde se adicionó picloram en

una concentración de 2 M para obtener un callo friable (Tribulato y col., 1997).

2.6 Óxido nítrico

2.6.1 Definición y propiedades fisicoquímicas del óxido nítrico

El óxido nítrico (NO) es un gas incoloro, inorgánico, lábil, de bajo peso

molecular (30.01 g/mol), que tiene un electrón no apareado en su capa exterior y

debido a ello posee las características de un radical que puede ganar o perder un

electrón, intercambiándose en tres especies diferentes: el radical (NO•), el catión

nitrosonio (NO+) y el anión nitroxilo (NO-) lo que explica su elevada reactividad y

su tendencia a unirse con hemoproteínas reducidas (Thomas y col., 2001). Estas

tres formas moleculares en las que se puede encontrar el NO, son intercambiables

dentro de la célula y dependen fuertemente del potencial redox de la misma. El

radical (NO•) se difunde libremente en soluciones acuosas y es capaz de atravesar

membranas lipídicas; moverse dentro de compartimentos celulares y de célula a

célula (Subczynski y col, 1996).

El NO es inestable y ligeramente soluble en medio acuoso, un poco más

soluble en solventes orgánicos y, en presencia de oxígeno se oxida a nitrito y

nitrato los cuales son moléculas más estables. Por otra parte, el NO tiene una vida

media de menos de seis segundos, siendo el nitrito el producto más abundante de

su catabolismo (Airaki y col., 2012).

El óxido nítrico fue descubierto en 1772 por Joseph Priestley como “aire

nitroso” y anteriormente se creía que era solo un gas venenoso que causaba la

lluvia ácida (Khan y col., 2013). La primera función biológica del NO fue reportada

por Ignarro y colaboradores en 1987 (Hou y col., 1999). La importancia biológica

del óxido nítrico ganó considerable atención en todo el mundo cuando en el año

1992 fue nominada como la “molécula del año” por las revistas de ciencia (Khan y

col., 2013). En 1998 tres científicos americanos Robert F. Furchgott, Ferid Murad y

22



Louis J. Ignarro identificaron el NO como una molecula señalizadora en el sistema

cardiovascular ganando el premio nobel de Medicina y Fisiología en ese mismo

año. Debido a este aporte en el campo de la medicina humana, actualmente, el

NO ha sido blanco de estudios para evaluar su efecto en los procesos fisiológicos

y patológicos en plantas (Delledonne, 2005; Hou y col., 1999).

2.6.2 Función del óxido nítrico en las células vegetales

Inicialmente, los estudios para dilucidar la funcionalidad del NO se

desarrollaron utilizando células animales, donde el NO funciona como un factor de

relajación endotelial (EDRF, endothelium-derived relaxing factor) que se genera a

partir de la conversión de L-arginina, por la enzima óxido nítrico sintasa (NOS) y

sus 3 isoformas (nNOS, eNOS, iNOS), algunas de ellas dependientes de la

concentración de calcio libre intracelular (Lamattina y col., 2003; Wendehenne y

col., 2001).

En plantas, el NO juega el rol de mensajero químico, ya que este participa

tanto en procesos fisiológicos, patológicos y en el desarrollo de las células

vegetales. Muchos estímulos hormonales y medioambientales son transmitidos

tanto directa o indirectamente por cascadas de señalización donde participa el NO.

La capacidad del NO para actuar simultáneamente en diferentes rutas bioquímicas

sin relación y sus propiedades homeostáticas redox sugieren que podría ser una

molécula de sincronización en las plantas las cuales pueden generar NO por

sistemas tanto enzimáticos como no enzimáticos (Lamattina y col., 2003).

Los procesos donde participa el NO son diversos pudiendo enumerarlos de

la siguiente manera: (1) resistencia a enfermedades causadas por patógenos; (2)

respuesta al estrés abiótico; (3) dormancia y germinación de semillas; (4)

estimulación del crecimiento de plántulas; (5) etapa de floración; (6) cierre de los

estomas; (7) regulación del crecimiento y orientación del tubo polínico; (8)

maduración de frutos; (9) retardo de la senescencia de las hojas; (10) actividades

enzimáticas; (11) rutas de señalización MAP quinasas; (12) expresión de genes

23



del ciclo celular; (13) desarrollo de nódulos funcionales y (14) crecimiento de

raíces primarias y laterales (del Rio y col., 2014; Khan y col., 2013). Además, otros

estudios indicaron que el NO puede participar en la división celular y por lo tanto

afectar la regeneración y multiplicación de brotes adventicios (Han y col., 2009).

2.6.2.1 Rol del óxido nítrico en la síntesis de clorofila

Los cloroplastos son el principal sitio de la célula donde se produce NO, es

por ello que el funcionamiento correcto de estos es esencial para mantener los

niveles adecuados de NO en las hojas. El óxido nítrico estimula la biosíntesis de

clorofila, la diferenciación de los cloroplastos (Tewari y col., 2013) y preserva los

niveles de clorofila durante la senescencia de las hojas. Sin embargo, el

mecanismo por el cual el NO regula el proceso de degradación de clorofila

permanece aún desconocido (Liu y Guo, 2013).

Dependiendo de factores como la concentración, tipo de tejido, edad de la

planta y el tipo de estrés, el NO puede ser un agente inductor de estrés, ó bien, el

NO puede desempeñar un rol en la protección de las células ante el daño

oxidativo (Lipton y col., 1993). Lazalt y colaboradores (1997) han reportado que el

óxido nítrico fue capaz de prevenir parcialmente la degradación de clorofila

producida por Phytophtora infestans en hojas de papa, postulando la capacidad de

NO como una molécula protectora, tanto para preservar la membrana de los

cloroplastos en contra de los efectos tóxicos de las especies reactivas de oxígeno

en secciones de hoja infectadas o como una molécula directamente involucrada

en cualquiera de los pasos de la vía metabólica de la clorofila. Por otro lado,

(Beligni y Lamattina, 1999) y (Hung y col., 2002) han reportado que el NO es

capaz de contrarrestar la toxicidad de herbicidas como el paraquat y diquat en

hojas de papa y arroz, respectivamente.

En otros términos, respecto al conocimiento en el área de cuidados post-

cosecha de frutas y hortalizas existen estudios donde se ha evaluado la actividad

protectora de NO (Eum y col., 2009; Manjunatha y col., 2010). Por ejemplo, la

24



aplicación externa de NO en flores de brócoli retrasa el proceso de amarillamiento

y el inicio de la degradación de clorofila durante el almacenamiento a 20°C (Eum y

col., 2009). Otro estudio realizado en plantas de plátano sugiere que el NO puede

mejorar el sistema antioxidante de las plantas de manera enzimática y no

enzimática retardando la degradación de clorofila. Debido a su efecto inhibitorio

sobre la actividad de las enzimas que degradan la clorofila y la promoción del

sistema de defensa antioxidante, se sugiere que el NO tiene potencial para

preservar el contenido de clorofila y mantener la calidad de los frutos después de

almacenamiento en frío (Wang y col., 2015).

2.6.3 Biosíntesis de óxido nítrico en las plantas

Las plantas pueden generar NO por procesos tanto enzimáticos como no

enzimáticos. Hasta la fecha, se han reconocido y estudiado ocho diferentes rutas

(Figura 8) para la producción de NO en plantas. Los principales sitios en la célula

donde se realiza la biosíntesis de NO son los cloroplastos, mitocondrias y

peroxisomas (Rőszer, 2014). El citoplasma, la membrana celular, el retículo

endoplasmático y el apoplasto también pueden generar NO en plantas vasculares

(Fröhlich y Durner, 2011).

La síntesis enzimática de NO en plantas se divide básicamente en dos vías

una reductiva y otra oxidativa. En la primera, la generación de NO se realiza

utilizando la enzima nitrato reductasa (NR). Esta reacción ocurre en el citoplasma

de la célula donde NR cataliza la reacción de reducción de nitrato a nitrito usando

NADH como donador de electrones. Esta misma enzima NR también cataliza la

reacción de reducción de nitrito a NO (Airaki y col., 2012). La síntesis de NO

mediante la NR requiere concentraciones relativamente bajas de nitrato y altas de

nitrito porque la afinidad por el nitrito (KM = 100 µM) es mayor comparada con la

constante de inhibición del nitrato (Ki = 50 µM) (Rockel y col., 2002) y, por lo tanto,

la producción de NO depende de la acumulación de nitrito. Además, las

modificaciones post-traduccionales de la enzima NR afectan la producción de NO

in vitro e in vivo (Airaki y col., 2012).

25



Figura 8. Rutas enzimáticas y no enzimáticas para la producción de NO en las plantas: (1) Producción de NO por reducción de nitrito que puede ser catalizado por a= nitrato reductasa, b= cadena de trasporte de electrones en la mitocondria y c= hemoproteínas desoxigenadas; (2) bajo condiciones de acidez, el ácido nitroso es protonado y forma nitrito que puede producir NO en un proceso no enzimático; (3) síntesis oxidativa de NO a partir de L-arginina catalizada por la enzima óxido nítrico sintasa; (4, 5 y 6) poliaminas e hidroxilamina pueden incrementar la síntesis de NO aun por mecanismos desconocidos; (7) liberación no enzimática del NO cuando el mismo NO reacciona con el glutatión para formar S-nitrosoglutation (Adaptado de Rőszer 2014).

Por otro lado, dentro de la generación oxidativa de NO en células vegetales,

se encuentra la síntesis de NO mediante la actividad de la enzima putativa óxido

nítrico sintasa (NOS). Así como en células animales, en tejido vegetal fue

reportada la actividad de NOS dependiente del aminoácido L-arginina, donde

también se muestra que la actividad enzimática de NOS puede ser inhibida por la

presencia de derivados estructurales de dicho aminoácido (Khan y col., 2013). En

cuanto a la estructura proteica o al gen que participa en la expresión de esta, de

acuerdo a Fröhlich y Durner (2011), no se ha tenido éxito en la identificación de

dichos genes o enzimas en plantas superiores. Además, Lamattina y

colaboradores (2003) establecieron que no se han encontrado ni el gen o cDNA de

ninguna proteína con alta similitud de secuencia conocida a NOS de animales.

En la actualidad ha sido posible la detección de la actividad de NOS

dependiente del metabolismo de L-arginina en al menos 11 especies diferentes de

plantas, esto mediante métodos bioquímicos, fisicoquímicos y moleculares

26



(Corpas y col., 2009; Del Río, 2011). La actividad de NOS fue reportada en

peroxisomas, en células de tejido de raíces, tallos y hojas de plántulas de chícharo

(Barroso y col., 1999; Corpas y col., 2006; del Rio y col., 2002). Así mismo,

Valderrama y colaboradores (2007) reportaron que la salinidad en arboles de olivo

incrementa la actividad de NOS.

Por otra parte, Guo y colaboradores (2003) identificaron en Arabidopsis una

proteína (AtNOS1) que produce NO en respuesta a señales hormonales. Dicha

proteína exhibió en sus genes una secuencia homologa del 16% con respecto a la

posible NOS encontrada en una especie de caracol (Helix pomatia). Sin embargo,

ni la proteína de caracol ni la proteína de Arabidopsis fueron similares a ningún

tipo de NOS de animales, sin embargo, sí fue evidente su actividad enzimática

debido a que existió un incremento de NO mediante la síntesis dependiente de L-

arginina.

Profundizando en el estudio antes mencionado, se utilizó un mutante de

Arabidopsis (Atnos1) para la producción de NO, donde la proteína purificada

(AtNOS1) al igual que en células animales empleaba L-arginina y NADPH como

sustratos y necesitó Ca+2 y calmodulina para su activación. De tal forma que

ninguna secuencia mostró similitud con cualquier isoforma de NOS en mamíferos.

AtNOS1 se propuso como una enzima distinta y se sugirió cambiar el nombre a

AtNOA1 (óxido nítrico asociada 1). En conclusión, la actividad de la posible NOS

en plantas superiores es importante para la generación de NO en la célula, así

como en el crecimiento y la señalización hormonal de esta (Guo, Okamoto, &

Crawford, 2003). Sin embargo, en la actualidad siguen siendo desconocidas las

secuencias homólogas de los genes que codifican para la expresión de NOS en

mamíferos (Mur y col., 2013).

2.6.4 Agentes químicos donadores de óxido nítrico

Existen agentes químicos donadores de óxido nítrico (NO) los cuales han

sido estudiados principalmente en medicina cardiovascular desde hace más de

27



dos décadas. Por definición, un agente donador de NO se refiere a cualquier

compuesto que pueda generar NO en alguna de sus formas (radical, anión o

catión) a través de rutas enzimáticas, químicas, electroquímicas o fotoquímicas. La

mayoría de estos agentes son compuestos orgánicos, pero hay un pequeño grupo

de compuestos que forman un complejo de transición metal-NO al que pertenece

el nitroprusiato de sodio. Los donadores de NO pueden ser clasificados en 6

categorías (Figura 9) basados en el átomo al que está unido el resto de la

molécula liberadora de NO (Hou y col., 1999).

Figura 9. Diagrama de los principales grupos de compuestos donadores de óxido nítrico.

2.6.5 Complejos de transición metal-óxido nítrico

Representan una clase importante de donadores de óxido nítrico. En este

tipo de compuestos el NO actúa como un poderoso ligando, en el cual, el

nitrógeno, se une al metal. Los principales compuestos de este tipo usados en

investigación se mencionan en la figura 9.

DONADORES DE ÓXIDO NÍTRICO

C-NO N-NO O-NO S-NO DONADORES HETEROCÍCLICOS

COMPLEJOS DE TRANSICIÓN

METAL-ÓXIDO NÍTRICO

28



Figura 10. Principales compuestos del grupo complejos de transición metal-óxido nítrico, tomado de Hou y col., 1999.

2.6.5.1 Nitroprusiato o nitroprusida de sodio (NPS)

Es el compuesto más ampliamente estudiado de la familia de los nitrosilos de

hierro, su nombre sistemático según la IUPAC (Unión Internacional de Química

Pura y Aplicada, por sus siglas en inglés) es pentacianidonitrosilferrato de sodio II,

un complejo inorgánico donde el hierro está en estado ferroso (Fe2-) y el óxido

nítrico se une formalmente como NO+. A pesar de estudios intensivos de su

reactividad química, en particular, con tioles, el mecanismo de liberación de NO

sigue siendo claramente no entendido. Es claro, sin embargo, que el NPS requiere

tanto la irradiación con luz o la reducción de un electrón para liberar NO (Feelisch,

1998). El NPS en solución acuosa, se degrada cuando se expone a la luz blanca o

azul, pero no a la luz roja, aun cuando se degrada los subproductos siguen siendo

biológicamente activos (Arnold y col., 1984).

2.6.5.2 NPS en el cultivo in vitro

La adición de NPS en el cultivo in vitro es actualmente un tema de interés.

Ötvös y colaboradores (2005) utilizaron NPS como donador de óxido nítrico en

combinación con auxinas como promotor de la activación de la división celular y la

formación de células embriogénicas en Medicago sativa. Dentro de sus resultados

29



ellos postulan que en ausencia de una auxina endógena y con una concentración

de 10 M de NPS no hay influencia para la división celular. Sin embargo en

presencia tanto de 0.22 y 1 M de 2,4-D y la misma cantidad de NPS incrementa

significativamente la frecuencia de células en división y viables.

Un estudio más reciente sin relación con el género anterior pero

perteneciente al mismo orden que Polianthes fue realizado por Tan y

colaboradores en el 2013, donde evaluaron el efecto del NPS en la multiplicación

de brotes y regeneración de Vanilla planifolia Andrews. En ambos estudios se

utilizó una concentración de 10 µM de NPS adicionado al medio MS y las

concentraciones de auxinas y citocininas fueron muy diferentes. En el caso de la

producción de brotes en Vanilla ellos reportaron que el NO estimuló el desarrollo

de los brotes y fue un intermediario en la regeneracion de brotes adventicios y

raíces como se ha sugerido para otras especies como Cucumis sativus donde

adicionó la misma concentración y en Solanum lycopersicum donde la

concentración óptima fue de 200 µM (Correa-Aragunde y col., 2006; Pagnussat y

col., 2002).

En relación con las concetraciones de NPS usadas hay un rango amplio en

la bibliografía reportada pues en el caso de He y colaboradores (2004) los cuales

evaluaron la respuesta del NO en la trancisión a la etapa de floración donde sus

tratamientos de semillas germinadas en medio con NPS elevaron su crecimiento

vegetativo y retrasaron su floración. NPS incrementó el crecimiento de brotes en

concentraciones menores o iguales a 100 µM de NPS y lo inhibió en

concentraciones por encima de la mencionada. La concentración óptima de NPS

para promover el crecimiento de brotes fue aproximadamente de 100 µM.

En la tabla 4 se agrupan otros trabajos realizados. En conclusión la

respuesta de la planta al efecto por el nitroprusiato de sodio no es característica

de un solo género en particular, lo que permite sugerir que el uso de NPS pudiera

tener un efecto sobre el cultivo in vitro de Polianthes.

30



Tabla 4. El uso de NPS en combinación con reguladores de crecimiento en la propagación in vitro.

Especie [NPS] Descripción Referencias

Agave

angustifolia

40 M Propagación por yemas

Axilares

No publicado, CIATEJ

Vanilla

planifolia

Andrews

10 M Organogénesis directa a

partir de segmentos nodales.

Más del 93% de explantes

formaron brotes.

(Tan y col., 2013)

Dioscorea

opposita

Thunb

40 M Inducción de callo y

regeneración de brotes a

partir de explantes de

tubérculo.

(Xu y col., 2009)

Malus

hupehensis

20 M

20 – 30

M

75 M

Multiplicación plántulas

Diferenciación y

regeneración de brotes

adventicios a partir de hoja o

cotiledones

Inducción de raíz

(Han y col., 2009)

Solanum

lycopersicum

Mill

200 M Inducción para la formación

de raíces laterales

(Correa-Aragunde y

col., 2006)

Medicago

sativa

10 M Cultivo de células en

suspensión

(Ötvös y col., 2005)

Cucumis

sativus

10 M Inducción para la formación

de raíces

(Pagnussat y col.,

2002)

31



II. JUSTIFICACIÓN

El género Polianthes es endémico de México, su uso comercial principal es

como planta ornamental (como flor de corte), además se utiliza en la industria del

perfume y farmacéutica. En el país, el cultivo de Polianthes representa una

importante fuente de generación de ingresos, en el año 2014 se reportó un valor

de producción de 47 millones de pesos (SAGARPA, 2014). Sin embargo, para

producir la variedad comercial de Polianthes (P. tuberosa) se utiliza la

reproducción asexual mediante bulbos, disminuyendo la variabilidad genética y

produciendo plantas con inflorescencias de color blanco. Por lo tanto, es necesario

implementar protocolos de cultivo in vitro que permitan propagar nuevas especies

silvestres o híbridos del género Polianthes con características especiales (por ej.

modificación de color de flor, aroma, tamaño, etc.) que las hagan atractivas para

un nicho de mercado, además, de propagar especies en peligro de extinción y

conservar la diversidad genética nativa.

Actualmente, existe un número limitado de trabajos de investigación

utilizados para propagar Polianthes, en su mayoría protocolos de

micropropagación a partir de segmentos de bulbo y en menor medida protocolos

de embriogénesis somática. Estos protocolos han sido probados

satisfactoriamente utilizando medio MS y diferentes reguladores de crecimiento.

Por otro lado, en otras especies vegetales se ha utilizado exitosamente el NPS

para promover la iniciación de células embriogénicas y/o la generación de brotes.

Sin embargo, su uso no ha sido investigado en el cultivo in vitro del género

Polianthes. Debido a esto, en el presente trabajo se estableció un protocolo de

embriogénesis somática y micropropagación para reproducir un híbrido de

Polianthes evaluando el efecto de la adición de NPS. Esto permitirá obtener un

mayor número de plantas en un menor tiempo y contribuirá a la obtención de

registros de nuevas variedades.

32



IV. HIPÓTESIS

La adición de nitroprusiato de sodio al medio de cultivo in vitro, sólo o en

combinación con reguladores de crecimiento favorece la iniciación de células

embriogénicas y/o estimula la producción de brotes en el cultivo in vitro de un

híbrido del género Polianthes.

33



V. OBJETIVOS

5.1 Objetivo general

Evaluar el efecto de la adición de nitroprusiato de sodio sobre la

regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes mediante la

embriogénesis somática y proliferación de yemas axilares.

5.2 Objetivos específicos

1. Obtener tejido juvenil a través de la germinación de semillas del híbrido.

2. Evaluar el efecto de la adición de NPS sobre la desdiferenciación de tejido de

hoja para la inducción de embriogénesis somática.

3. Inducir el proceso de embriogénesis somática utilizando medios cultivo

específicos para la etapa de inducción y de expresión.

4. Establecer y propagar el híbrido mediante la técnica de yemas axilares

utilizando la inflorescencia.

5. Evaluar el efecto de la adición de NPS sobre la producción de brotes

utilizando plántulas del híbrido o explantes generados por la técnica de

yemas axilares de la inflorescencia del hibrido, así como su efecto sobre la

síntesis de clorofila.

34



VI. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

Para cumplir con los objetivos planteados en el presente proyecto de

investigación, la metodología experimental fue dividida en dos etapas (Figura 11).

Durante la primera etapa se realizaron estudios de embriogénesis para evaluar el

efecto de NPS sobre la inducción de embriones somáticos a partir del tejido de

hoja. Al inicio se efectuó la germinación de semillas del híbrido 1008157 P.

howardii x P. tuberosa (proporcionado el Dr. Ernesto Tapia Campos-CIATEJ) para

obtener tejido juvenil. Este tejido fue utilizado para evaluar el efecto de la

combinación entre NPS y un regulador de crecimiento perteneciente al grupo de

las auxinas (picloram) sobre la desdiferenciación del tejido vegetal. Debido a que

después del proceso de desdiferenciación se observó la formación de estructuras

relacionadas con la formación de embriones, como lo son las estructuras

globulares y callos friables se procedió a realizar la comprobación a través de una

técnica de doble tinción diferencial con el fin de detectar estructuras

embriogénicas y polarización celular. Una vez corroborada la presencia de células

potencialmente embriogénicas se realizaron resiembras a medios de inducción

para seguir estimulando el proceso de diferenciación. Primero, se resembró el

tejido utilizando medios de cultivo que contenían reguladores de crecimiento (2,4-

D y BA) en diferentes concentraciones. Después, el tejido que presentó viabilidad

embriogénica vinculada a la morfología estructural (estructuras globulares) fue

resembrado en un medio que contenía (ANA y BA) como reguladores de

crecimiento y enriquecido con aminoácidos para favorecer selectivamente la

formación de estructuras embriogénicas. Debido a que las estructuras que se

formaron una vez concluido el proceso de desdiferenciación de tejido e inducción

de embriogénesis sólo presentaron un estadio globular se procedió a realizar una

resiembra utilizando un medio de expresión sin reguladores de crecimiento y

reduciendo la concentración de nutrientes, esto con el fin de coadyuvar el avance

en los estadios que componen el proceso de desarrollo de un embrión somático a

través del estrés inducido por limitación de nutrientes.

35



Figura 11. Diagrama general de la metodología experimental.

36



Con el objetivo de incrementar el número de clones del híbrido 1008157 P.

howardii x P. tuberosa durante la segunda etapa, se realizaron estudios de

micropropagación. En estos estudios se evaluó el efecto de la concentración de

NPS sobre la estimulación de la producción de brotes utilizando plántulas y yemas

axilares florales. Respecto a las plántulas, éstas primeramente fueron

seleccionadas y caracterizadas morfológicamente. Por otra parte, se colectaron

yemas axilares de la inflorescencia del híbrido, para obtener brotes vegetativos a

partir de estas yemas, estas fueron desinfectadas y cultivadas utilizando un medio

de propagación con reguladores de crecimiento (BA y 2,4-D). Los brotes

vegetativos resultantes se propagaron con la finalidad de incrementar el número

de explantes, y así disponer de material suficiente para evaluar el efecto de la

adición de NPS sobre la multiplicación de brotes y la síntesis de clorofila.

Finalmente, la evaluación del efecto de NPS sobre la estimulación de la

producción de brotes se realizó de manera independiente tanto en plántulas como

en yemas axilares.

6.1 Embriogénesis somática

6.1.1 Germinación de semillas

200 semillas del híbrido 1008157 provenientes de polinización abierta fueron

utilizadas para la germinación (Figura 12). Las semillas se desinfectaron con

hipoclorito de sodio comercial (Cloralex) diluido al 3% v/v, para ello se agregó 10

mL de NaClO más dos gotas de detergente líquido a un tubo tipo Falcon (50 mL)

estéril, el cual fue agitado vigorosamente durante 15 min. Después, se aplicó

lavado por triplicado con agua destilada estéril en periodos de 5 min.

Posteriormente, para prevenir contaminación microbiana, las semillas se lavaron

con una solución de PPM (2 mL/L) (Plant Preservative Mixture, Plant Cell

Technology, USA) durante 10 min. Transcurrido el tiempo, se retiró la solución de

PPM y se adicionó una solución de cefotaxima (300 mg/L) durante 1 h.

37



Finalmente, se retiró completamente el exceso de esta solución y las semillas

fueron vertidas sobre una caja Petri estéril.

Una vez desinfectadas las semillas, estas fueron cultivadas en frascos de

vidrio con medio GE sin reguladores de crecimiento. Cada frasco contenía 4

semillas y 25 mL de medio GE que contenía 10 mL/L de medio MS (Murashige y

Skoog, 1962) (concentrado 10 veces), 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar. Se

ajustó el pH a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N). El medio fue esterilizado

utilizando un autoclave a 121 °C durante 20 min. Aunque la germinación de las

plántulas ocurrió durante los primeros 5 d, el tiempo de desarrollo del cultivo duró

60 d, tiempo necesario para observar una altura de las plántulas mayor a 7 cm.

Los frascos se incubaron a una temperatura de 27 °C y con un fotoperiodo de 16

h luz y 8 h oscuridad.

Figura 12. Proceso de germinación de las semillas: (a) desinfección; (b); vertido en placa estéril; (c) cultivo en medio GE y (d) plántulas germinadas con 30 d de cultivo.

6.1.2 Desdiferenciación de tejido somático de plántulas del híbrido

Después de la germinación, las plántulas fueron retiradas del medio GE. A

cada plántula se le cortaron las hojas en segmentos pequeños de

aproximadamente 0.5 cm. Es importante mencionar que únicamente se utilizó

tejido de hojas excluyéndose la raíz. Los segmentos se sembraron verticalmente

cuidando de no hundirlos completamente en el medio de cultivo (Figura 13). Este

38



medio de cultivo contenía medio MS, picloram como regulador de crecimiento y

NPS. La composición del medio de cultivo con respecto al picloram y NPS varió de

acuerdo al diseño factorial que se muestra en la Figura 14.

Figura 13. Siembra de los segmentos de hoja en el medio de cultivo: (a) segmentos individuales vistos en microscopio (barra = 5 mm); (b) hojas completas segmentada cultivadas en el medio.

Los cultivos se incubaron durante 60 d a una temperatura de 27°C ± 2 bajo

un fotoperiodo de 16 h luz y 8 h oscuridad con una densidad de flujo de fotones

fotosintéticos (PPF, por sus siglas en inglés) de 16.5 mol/m2s proporcionada por

lámparas fluorescentes blancas frías. Se utilizó luz roja provista mediante papel

celofán rojo cuando el medio de cultivo contenía NPS. Con la finalidad de

descartar un error en el efecto de picloram debido a las condiciones de cultivo,

específicamente el color de luz, se realizó un experimento donde se cultivó de la

misma manera segmentos de hoja y se incubaron bajo luz blanca. Cada

tratamiento constó de 4 repeticiones con 1 plántula diferente originada por una

semilla (genotipo) diferente para cada repetición.

Figura 14. Diseño factorial 2

4 para evaluar el efecto de picloram y el NPS sobre la

desdiferenciación de tejido vegetal de plántulas del híbrido 1008157.

39



6.1.3 Doble tinción diferencial de células

Para conocer si el callo y/o las estructuras globulares formadas a partir de la

hoja en los tratamientos del diseño factorial poseen células potencialmente

embriogénicas se realizó la técnica de doble tinción diferencial de acuerdo a

Portillo y colaboradores (2007). Se colocó una muestra de callo de

aproximadamente 8 mm3 en un tubo Eppendorf (1.5 mL), cuando la concistencia

del callo era dura fue necesario disgregar el tejido cuidando no aplicar una fuerza

excesiva. La muestra se suspendió en 0.5 mL de agua destilada y se agregaron 3

gotas de acetocarmin al 0.5%, luego, se llevó a baño María a 50°C durante 30 s.

Posteriormente, las células fueron lavadas tres veces con agua destilada para

remover el exceso de colorante. Después, a la muestra ya teñida se le agregaron

dos gotas de azul de Evans al 0.5% y se dejó reposar durante 30 s.

Inmediatamente, se lavó tres veces con agua destilada para remover el exceso de

colorante. La muestra doblemente teñida se resuspendió en 0.5 mL de agua

destilada y fue observada en el microscopio Olympus BH-2 RFCA acoplado a una

cámara Leica® DFC 450C.

6.1.4 Subcultivos de callo y/o estructuras potencialmente

embriogénicas

6.1.4.1 Subcultivo utilizando medios de inducción

Después del tiempo de desdiferenciación del tejido (60 d) se resembró el

material vegetal que presentó formación de callo y/o estructuras globulares para

continuar con la inducción del proceso de embriogénesis. Las muestras fueron

cultivadas utilizando medios de inducción: medio MIA para Agave y medio MIP

para Polianthes. El tejido desdiferenciado se incubó durante 60 d utilizando luz

blanca bajo las mismas condiciones descritas en la sección 5.1.2. El medio MIA

contenía 100 mL/L de medio MS (Murashige y Skoog, 1962) (concentrado 10

veces), 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, 1.3 M de BA y 9.0 M de 2,4-D.

40



Además, el pH fue ajustado a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N). El

medio fue esterilizado utilizando un autoclave a 121 °C durante 20 min. Por otra

parte, el medio MIP contenía 100 mL/L de medio MS (Murashige y Skoog, 1962)

(concentrado 10 veces), 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, 0.1 mg/L de BA y 2.5

mg/L de 2,4-D. Se ajustó el pH a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N). Este

medio también fue esterilizado en autoclave a 121 °C durante 20 min.

6.1.4.2 Subcultivo utilizando medio de inducción enriquecido con

aminoácidos

Una vez transcurrido el tiempo de incubación descrito en la sección anterior,

algunos tratamientos presentaron estructuras potencialmente embriogénicas,

particularmente estructuras asociadas a los estadios embrionarios. Estas

estructuras permanecieron en forma globular y no continuaron su proceso de

desarrollo, debido a esto, el tejido fue resembrado en un medio de cultivo de

inducción (MIc20) enriquecido con aminoácidos e incubado en oscuridad durante

30 d a una temperatura de 27°C ± 2. El medio MIc20 contenía medio MS sin

vitaminas, 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, en mg/L: L-asparagina 10, L-arginina

10, L-ác. aspártico 7.5, glicina 23, glutamina 60, ác. glutámico 7.5, biotina (B12) 1,

ác. fólico 1, ác. nicotínico 1.5, piridoxina 1.5, riboflavina 0.1, tiamina 3, myo-

inositol 145, urea 45, BA 1 y ANA 0.5. Se ajustó el pH a 5.8 utilizando HCl o NaOH

(ambos 1N). Para preparar medio Mic20, una parte del medio la cual contenía

medio MS sin vitaminas, sacarosa, agar y RC y fue esterilizado en autoclave (121

°C durante 20 min). Otra parte que contenía la solución de aminoácidos se

esterilizó en frio (microfiltración, 0.22 m), a continuación se mezclaron ambas

soluciones.

6.1.5 Subcultivo a medio de expresión

Para corroborar la viabilidad celular embrionaria, pseudoembriones en

estado globular y callo friable fueron transferidos a un medio de expresión (ME)

durante 30 d utilizando luz blanca y condiciones idénticas de temperatura y

41



fotoperiodo descritas en la sección de germinación. El medio ME únicamente

contenía 100 mL/L de medio MS (Murashige y Skoog, 1962) (concentrado 10

veces), 30 g/L de sacarosa, 6 g/L de Phytagel, 250 mg/L hidrolizado de caseína y

500 mg/L glutamina, posteriormente, el pH fue ajustado a 5.8 utilizando HCl o

NaOH (ambos 1N) y fue esterilizado utilizando un autoclave a 121 °C durante 20

min.

6.2 Micropropagación

6.2.1 Descripción inicial de plántulas

En la etapa de embriogénesis se germinaron 200 semillas del híbrido

1008157, las plántulas derivadas de la germinación se utilizarón para la realización

de estudios de micropropagación. En esta segunda etapa el objetivo fue evaluar el

efecto de la concentración de NPS sobre la inducción de nuevos brotes en

plántulas. Las plántulas sin hojas obtenidas después del proceso de diferenciación

de tejido fueron resembradas en medio TDZ durante 30 d (Figura 15). El medio

TDZ contenía 100 mL/L de medio MS concentrado, 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de

agar y 0.25 mg/L de tidiazuron (TDZ). Se ajustó el pH a 5.8 utilizando HCl o NaOH

(ambos 1N) y, fue esterilizado utilizando un autoclave a 121 °C durante 20 min,

excepto el TDZ que fue esterilizado a través de microfiltración utilizando una

membrana de 0.22 m. La resiembra se realizó con el propósito de fortalecer y

acelerar el crecimiento de las plántulas. Cuando se observó la recuperación

(crecimiento) de las plántulas, 75 de ellas fueron seleccionadas para realizar la

evaluación del efecto de NPS sobre la producción de brotes. Estas plántulas

seleccionadas se describieron morfológicamente (Tabla 5) cuantificando el número

de hojas, número de brotes y altura de la planta (tomando como referencia la hoja

de mayor longitud del meristemo central).

42



Figura 15. Plántulas resembradas en medio TDZ después de 30 d de cultivo.

Tabla 5. Descripción inicial de las 75 plántulas del híbrido 1008157.

No. Código de identificación Altura (cm) No. Hojas No. Brotes

1 1 2.2 3 0

2 2 2.5 14 3

3 3 2.4 5 1

4 4 5.8 4 0

5 5 4.7 19 3

6 6 3.3 5 0

7 7 5.8 17 2

8 8 5.5 4 0

9 9 3.0 5 0

10 10 4.4 7 1

11 11 1.3 8 2

12 12 2.4 4 0

13 14 2.1 4 0

14 15 2.0 5 1

15 21 3.2 4 0

16 22 2.5 5 0

17 23 4.1 4 0

18 24 1.1 2 1

19 25 3.2 6 1

20 26 1.9 3 0

21 27 1.9 7 1

22 28 1.0 4 0

23 30 1.8 5 1

24 31 0.6 2 0

Continuación…

43




25 32 1.5 2 0

26 33 1.4 3 0

27 34 1.2 7 1

28 35 2.2 4 0

29 36 2.3 4 0

30 37 1.3 1 0

31 40 2.0 2 0

32 41 7.0 7 1

33 42 3.2 4 0

34 43 1.8 4 0

35 44 4.0 8 2

36 45 4.3 10 1

37 46 1.7 2 0

38 47 4.8 10 2

39 48 1.4 3 0

40 49 8.1 7 1

41 50 1.3 3 0

42 51 2.5 5 1

43 52 1.3 8 1

44 53 1.9 13 3

45 54 5.0 6 1

46 61 9.5 8 1

47 62 6.2 4 0

48 63 5.0 12 1

49 64 0.8 5 0

50 65 1.6 4 0

51 66 1.5 5 3

52 70 2.8 4 0

53 71 1.7 7 1

54 72 2.7 6 1

55 73 2.2 7 1

56 74 3.4 4 0

57 75 0.7 3 0

58 76 7.5 9 1

59 77 2.5 4 0

60 84 3.9 10 2

Continuación…

44




61 85 4.2 6 1

62 95 5.5 7 3

63 96 2.0 5 0

64 97 2.5 5 0

65 100 3.9 5 0

66 101 1.1 2 0

67 102 1.0 1 0

68 103 5.2 11 2

69 104 1.8 2 0

70 105 3.5 5 0

71 106 1.0 1 0

72 107 4.1 5 0

73 108 1.0 9 2

74 109 0.9 3 1

75 110 2.0 3 0

6.2.2 Estimulación de la producción de brotes en plántulas

El efecto en la estimulación de la producción de brotes fue evaluado

probando diferentes concentraciones de NPS (0, 10, 20, 30 y 40 M), para ello se

seleccionaron 15 plántulas de manera aleatoria para cada tratamiento, las cuales

fueron cultivadas en condiciones estériles sembrando 3 plántulas dentro de un

frasco de vidrio (500 mL) que contenía 50 mL de medio de cultivo utilizado para

propagar Agave (PA) al cual le fue agregado NPS, la concentración de NPS varío

de acuerdo al diseño experimental que se muestra en la Tabla 6.

El medio PA que se utilizó contiene 100 mL/L de medio MS concentrado, 30

g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, 10 mg/L de BA y 0.025 mg/L de 2,4-D. Se ajustó el

pH a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N). El medio fue esterilizado en

autoclave a 121 °C durante 20 min.

45



Tabla 6. Diseño experimental unifactorial utilizado para evaluar el efecto de la concentración de

NPS sobre la producción de brotes de plántulas del híbrido 1008157.

NPS

(M)

Plántula del híbrido1008157*

0

103 9 109 32 40

85 23 15 22 43

51 72 71 100 27

10

2 107 4 97 28

77 48 6 64 26

10 12 76 110 42

20

14 5 53 96 63

105 70 62 46 66

54 21 73 101 35

30

65 84 31 3 47

95 8 11 30 49

33 36 41 37 74

40

102 7 75 34 25

52 45 106 61 50

24 44 1 104 108

* Código de identificación

Las plántulas ya cultivadas fueron incubadas a una temperatura de 27°C ± 2

con un fotoperiodo de 16 h luz y 8 h oscuridad utilizando lámparas fluorescentes

blancas frías. Para evitar la rápida degradación de NPS disuelto en el medio, los

frascos fueron cubiertos con un polímero que al ser incidido por una fuente de luz,

este proporciona una longitud de onda predominante entre 618 y 780 nm (espectro

correspondiente a un color de luz roja).

Para evaluar la persistencia del efecto inducido por NPS en futuras

resiembras, las plántulas obtenidas de la primera siembra se resembraron e

incubaron por segunda ocasión utilizando las mismas condiciones del primer

cultivo durante 30 d.

Finalmente, se realizó la comparación del estado morfológico de las plántulas

al inicio y después del primer y segundo cultivo, midiendo la longitud máxima

46



(tomando como referencia la hoja de mayor longitud del meristemo central) así

como el número de hojas y brotes.

6.2.3 Establecimiento de yemas axilares de la inflorescencia del híbrido

1008157

Para el establecimiento de yemas axilares (Figura 16) se realizó una colecta

de tallos de la inflorescencia del híbrido 1008157. Los tallos se cortaron en 50

segmentos internodales de 2 a 3 cm de longitud los cuales presentaban yemas

axilares florales. Los segmentos fueron desinfectados, para ello se lavaron con

hipoclorito de sodio comercial (10% v/v) durante 15 min, después se les retiró la

solución de hipoclorito de sodio, se enjuagaron con agua destilada y se colocaron

dentro de un frasco de vidrio (1 L) estéril con una solución de cefotaxima (600

mg/L) con PPM (2 mL/L) agitándose durante 24 h. Posteriormente, se enjuagaron

con agua destilada estéril tres veces, después, las yemas fueron cultivadas

durante 120 d en frascos de vidrio con medio estéril PA, manteniendo las

siguientes condiciones de incubación: temperatura 27°C ± 2, fotoperiodo de 16 h

luz y 8 h oscuridad y PPF de 16.5 mol/m2s. Posterior al último cultivo, los

segmentos se subcultivaron en medio TDZ y se incubaron bajo las condiciones

mencionadas por 90 d hasta cuando presentaron respuesta.

Figura 16. Proceso de establecimiento de las yemas axilares de la inflorescencia del híbrido 1008157: (a) colecta; (b) adición de cefotaxima y PPM; (c) yemas axilares desinfectadas.

47



6.2.4 Propagación de clones del híbrido 1008157

Para incrementar el número de clones del híbrido se utilizaron los brotes

vegetativos resultantes del establecimiento de yemas axilares florales. Estos

brotes fueron separados del tallo madre, luego, se dividieron en varios segmentos

y se cultivaron durante 202 d utilizando un medio diferente como se muestra en la

Tabla 7. Los explantes cultivados en medio MSC fueron incubados en oscuridad

durante 12 d.

Tabla 7. Propagación de plantas del híbrido.

Medio de cultivo Fecha

PA 16/Abril/15

PA 16/Mayo/15

TDZ 03/Julio/15

PA 07/Agosto/15

10 NPS 17/Septiembre/15

MSC 23/Octubre/15

*El medio 10 NPS contenía 100 mL/L de medio MS concentrado, 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de

agar, 10 mg/L de BA y 0.025 mg/L de 2,4-D y 10M de NPS. Se ajustó el pH a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N). El medio fue esterilizado utilizando una autoclave a 121 °C durante 20 minutos excepto el NPS que fue esterilizado en frio. **El medio MSC contenía 100 mL/L de medio MS concentrado, 30 g/L de sacarosa y 8 g/L de agar. Se ajustó el pH a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N). El medio fue esterilizado utilizando una autoclave a 121 °C durante 20 min.

6.2.5 Estimulación de la producción de brotes en clones del híbrido

1008157

Una vez propagados los brotes se obtuvo un número suficiente de explantes,

los cuales fueron cultivados para evaluar el efecto de la combinación de NPS y

reguladores de crecimiento sobre la producción de brotes a partir de clones del

híbrido. Dicha evaluación se llevó a cabo en dos experimentos, en la primera se

utilizaron explantes que presentaban al menos un brote (Tabla 8) y en la segunda

se utilizaron explantes individuales, los cuales carecían de brotes (Tabla 9). Se

realizaron 4 y 6 repeticiones por concentración de NPS para el primer y segundo

experimento respectivamente (Figura 17). Los cultivos fueron incubados durante

48



30 d utilizando las condiciones descritas en la sección 5.2.2. Por otra parte, con el

objetivo de comparar el estado morfológico, se efectuó una descripción de los

explantes al inicio y después del periodo de incubación.

Finalmente, los explantes se resembraron en medio PA sin NPS y se

incubaron bajo las mismas condiciones utilizando luz blanca durante 30 d para

después realizar la etapa de enraizamiento.

Tabla 8. Descripción inicial de los explantes del híbrido con presencia de al menos un brote.

No. Altura (cm) No. Hojas No. Brotes

1 5.8 14 1

2 6.5 8 2

3 6.7 12 1

4 7.1 15 2

5 7.2 15 3

6 7.4 10 1

7 7.5 12 2

8 8.0 19 1

9 8.0 14 3

10 8.6 12 1

11 9.0 12 1

12 9.0 11 1

13 9.0 17 2

14 10.5 18 3

15 10.5 20 3

16 10.5 12 1

17 11.3 13 1

18 11.8 13 2

19 12.8 14 1

20 13.3 15 1

49



Tabla 9. Descripción inicial de los explantes del híbrido sin brotes.

No. Altura (cm) No. Hojas

1 4.1 3

2 4.4 5

3 5.1 5

4 5.3 4

5 6.1 5

6 6.7 5

7 7.0 6

8 7.3 6

9 7.5 5

10 7.7 7

11 7.9 5

12 8.1 6

13 8.4 8

14 8.6 7

15 8.8 12

16 9.0 11

17 9.0 10

18 9.0 8

19 9.1 7

20 9.2 8

21 9.7 8

22 10.4 10

23 10.5 9

24 10.5 10

25 11.0 8

26 11.5 9

27 12.0 12

28 12.6 8

29 13.5 15

30 16.5 10

50



Figura 17. Diseño experimental unifactorial utilizado en la evaluación de multiplicación de brotes

adicionando NPS en diferentes concentraciones (0, 10, 20, 30 y 40 M); (a) explantes con al menos un brote; (b) explantes individuales.

6.2.6 Extracción y cuantificación de clorofila

Después de haber realizado la propagación de clones del híbrido 1008157,

se realizó una cuantificación de clorofila (a y b). La determinación de clorofila

permitió conocer el estado fisiológico de los explantes después de haber sido

sometidos a estrés ocasionado por la incubación en oscuridad durante 12 d. La

concentración de clorofila fue determinada siguiendo la metodología propuesta por

Bojovic y Stojanovic (2005). 500 mg de tejido fresco fueron cortados

(aproximadamente 0.5 cm) y molidos en un mortero, en seguida, se colocaron en

un tubo Falcon (50mL) y se agregó 10 mL de acetona al 80% (v/v).

Posteriormente, la mezcla se dejó macerar durante 30 min y fue centrifugada a

2500 rpm durante 5 min. Entonces, se tomó 1 mL del sobrenadante y se diluyó en

9 mL de acetona al 80% (v/v). La muestra diluida se analizó en un

espectrofotómetro UV-Vis (DR 5000, HACH) utilizando una longitud de onda de

664 y 647 para clorofila a y b respectivamente. Para calcular el contenido de

clorofila (a y b) se utilizó un conjunto de ecuaciones propuestas por Wellburn

(1994) (Tabla 10).

51



Después de la estimulación de la producción de brotes en clones del híbrido,

se evaluó el efecto de la concentración de NPS sobre la síntesis clorofila. Para

extraer la clorofila se utilizó metanol, se tomaron tres discos (0.5 cm de diámetro)

de diferentes hojas del explante y se colocaron en tres tubos de ensayo de vidrio

de 10 mL. Se agregó 1 mL de metanol a cada tubo y se cubrió con Parafilm,

enseguida, los tubos fueron refrigerados a 4C durante 24 h. Pasado el tiempo, se

tomó una alícuota y se analizó por espectrofotometría utilizando un

espectrofotómetro para microplacas (Multiskan™ GO). De igual manera, el

contenido de clorofila (a y b) fue calculado utilizando el conjunto de ecuaciones

propuestas por Wellburn (1994).

Tabla 10. Ecuaciones para la determinación clorofila.

Solvente Ecuación (g/mL)

Acetona 80%

Metanol

6.3 Preparación de medios de cultivo con nitroprusiato de sodio.

Para la preparación de los medios de cultivo que contenían NPS (10, 20, 30,

40 M) se realizó el siguiente procedimiento. Primeramente, el medio de cultivo

MS con sacarosa, agar y RC fue esterilizado. Mientras el medio esterilizado

disminuía su temperatura, se preparó una solución stock de NPS (1x105M) la

cual se esterilizó en frio usando un filtro de membrana (0.22 m) y se mantuvo

protegida de la luz. En función de la concentración de NPS utilizada en cada

tratamiento, se tomó el volumen específico de la solución stock al medio de

52



cultivo. Dependiendo del objetivo, se vacío el medio sobre cajas Petri o en frascos

de vidrio estériles. Inmediatamente, para evitar la degradación del compuesto por

la luz (solar o blanca) se cubrieron con plástico de color rojo o se mantuvieron en

oscuridad hasta su uso. Los medios que contienen NPS se utilizaron el mismo día

o máximo un día después de su elaboración.

6.4 Análisis Estadístico

Para la etapa de embriogénesis somática se analizó estadísticamente el

efecto del NPS y el picloram sobre la desdiferenciación del tejido de plántulas

utilizando una estadística no paramétrica mediante la prueba para muestras

independientes Kruskal Wallis (α = 0.05), donde 1 representaba la presencia de

respuesta, y 0 representaba la ausencia de respuesta. Para la etapa de

micropropagación las variables de respuesta se analizaron mediante un análisis

de varianza a través de la comparación de muestras múltiples (α = 0.05). Para

ambos análisis se utilizó el software Statgraphics Centurion versión 16.1

(Statistical Graphics, Rockville, MD).

6.5 Enraizado y aclimatación de explantes clones del híbrido 1008157

Una vez finalizados los experimentos con el NPS, los explantes que

presentaron brotes se cultivaron en medio PA para continuar la propagación. Los

explantes que no presentaban brotes se colocaron en un medio MSC que se

preparó igual que la en la sección 6.2.4 pero con la diferencia que se incrementó

la cantidad de sacarosa a 45 g/L esto con el fin de estimular la producción de

raíces en el explante. Una vez que los explantes se cultivaron en el medio, se

incubaron por 40 d bajo las condiciones mencionadas en la sección 6.2.3.

Después de los 40 d, las plantas fueron retiradas del medio de cultivo para

colocarlas en el sustrato. El sustrato fue una mezcla de tres tipos diferentes de

suelo comúnmente utilizados en el cultivo del género Polianthes: turba, arena y

agrolita en un proporción 3:2:1 respectivamente. Esta mezcla de sustratos fue

53



humedecida y esterilizada en autoclave a 121 °C durante 20 min. Una vez que él

sustrato se encontraba a temperatura ambiente se colocó dentro de macetas de

plástico limpias (Figura 18a).

Los explantes una vez retirados del frasco (Figura 18b) fueron lavados con

agua corriente hasta eliminar completamente el agar (Figura 18c) y a continuación

se pasaron brevemente por una solución fungicida Captan 50 PH (ingrediente

activo: N-triclorometiltio-4-ciclohexeno-1,2-dicarboximida) en una dosis de 1 g/L

(Figura 18d). Inmediatamente se les colocó en la base enraizador en polvo Radix

1500 (ingrediente activo ácido indolbutírico 1500 ppm) (Figura 18e) y se plantaron

dentro de la maceta con sustrato (Figura 18f). En cada maceta se colocó uno o

dos explantes dependiendo el tamaño de los mismos. Después de plantar los

explantes se le agregó agua a cada maceta evitando que el sustrato quedara

demasiado húmedo. Finalmente fueron dispuestos en bolsas de plástico cubriendo

totalmente el (Figura 18g). Las macetas fueron incubadas durante 15 d con riegos

de una vez por semana. Transcurridos los 15 d, se realizaron dos perforaciones a

los extremos de la bolsa de plástico que cubría la maceta (Figura 18h) y el riego

se modificó una vez cada tercer día. Después de 15 d, se les retiró la cubierta de

plástico y el riego continúo siendo el mismo.

54



Figura 18. Proceso de aclimatación de los explantes clones del híbrido 1008157. (a) Sustrato estéril colocado en macetas limpias y previamente humedecido. (b) Planta retirada del frasco, aún presenta agar en la parte de la raíz. (c) Planta lavada para retirar el agar. (d) Plantas en solución de Captan. (e) Enraizador en polvo. (f) Planta cultivada en el sustrato. (g) Plantas con cubierta plástica para la aclimatación y colocadas en el incubador. (h) Planta a los 15 d de cultivada indicando las perforaciones que se le hicieron a la cubierta plástica para apoyar a la aclimatación.

55



VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.1 Embriogénesis somática

7.1.1 Desdiferenciación de tejido somático de plántulas del híbrido

El tejido somático que se utilizó como explante inicial fue obtenido de la

germinación de semillas del híbrido 1008157. Las hojas de las plántulas fueron

segmentadas y distribuidas en 16 tratamientos (TR) variando las concentraciones

de NPS y picloram. En cada tratamiento, cuatro plántulas diferentes fueron

sometidas de manera independiente a desdiferenciación. Diferentes respuestas

fueron inducidas por efecto de la desdiferenciación resaltando la formación de

raíces, formación de callo (con o sin potencial embriogénico) y estructuras

globulares. El tipo de respuesta estuvo determinada en función de la

concentración de NPS, solo ó en combinación con picloram. Fehér y

colaboradores (2003) mencionan que el proceso de embriogénesis somática es

modulado por varios factores como el tipo de explante, el nivel endógeno y

exógeno de auxinas, las condiciones in vitro y el genotipo. El picloram fue

seleccionado como auxina inductora debido a que ha sido reportado por otros

autores (Gaspar y col., 1996; Ptak y Bach, 2007; Monja-Mio y Robert, 2013) en

relación a la inducción de embriogénesis en otras monocotiledóneas cercanas al

género Polianthes. Tal es el caso de Monja-Mio y Robert (2013) que realizaron

embriogénesis somática a partir de discos de tallo de Agave obteniendo 82.7

embriones por explante, las estructuras que se formaron en el proceso de

desdiferenciación del tejido son similares a las estructuras globulares identificadas

en TR13 y TR15, teniendo un diámetro y tiempo de expresión aproximado (Figura

19).

56



Otro factor que está involucrado en la expresión de respuestas asociadas a

la desdiferenciación de tejido para la inducción de embriogénesis somática es el

genotipo. El genotipo es uno de los factores más importantes que determinan la

capacidad de embriogénesis somática debido a la variación en los niveles

endógenos de las fitohormonas y es una de las principales razones por las que

carecen de reproducibilidad muchos protocolos de embriogénesis (Fehér y col.,

2003; Jiménez 2005). En el presente estudio se utilizó genotipos diferentes lo cual

pudo influenciar la variabilidad de respuestas incluso en un mismo tratamiento.

Figura 19. Similitud con los embriones somáticos formados a partir de secciones tallo en Agave fourcroydes. (a) Híbrido 1008157; (b) Agave fourcroydes tomada de Monja-Mio y Robert (2013).

Con respecto al NPS se utilizó como un donador de NO, el cual es una

novedosa molécula que participa en procesos fisiológicos, patológicos y en el

desarrollo de las células vegetales. El efecto reportado del NO es dependiendo de

factores como la concentración, tipo de tejido, edad de la planta y el tipo de estrés

al que se somete la planta (Lipton y col., 1993). En la tabla 11 se describe

detalladamente la respuesta de los 64 genotipos diferentes después de 30 d de

cultivo. Esta tabla contiene la concentración de cada uno de los 16 tratamientos

con NPS y picloram. Estadísticamente existe diferencia significativa para la

presencia o ausencia de respuesta en cada tratamiento (p = 0.00000492915, α =

0.05) que fue evaluada a través de la prueba de Kruskal Wallis. Esta diferencia se

aprecia gráficamente mediante la prueba (LSD) para la comparación de medias

(Figura 20) en donde los tratamientos iguales o cercanos a 0 tienden a la ausencia

57



de respuesta y, los cercanos o iguales a 1 presentaron respuesta a la adición de

NPS y picloram en el medio de cultivo.

Figura 20. Comparación de medias para la respuesta en los 16 tratamientos del diseño factorial entre NPS y picloram. Los tratamientos con círculos de color azul presentaron callo potencialmente embriogénico y con rojo los tratamientos con presencia de estructuras perfectamente globulares.

La figura 21 muestra el tejido desdiferenciado de las plántulas después de 30

d de cultivo. Algunos genotipos de los tratamientos TR6, TR7, TR8, TR10, TR12,

TR13 y TR15 (señalados en color gris en la tabla 11) presentaron respuesta

potencialmente embriogénica, por lo que fueron resembrados para continuar el

proceso de inducción.

La presencia de estructuras globulares fue el principal criterio para elegir si el

tejido era o no potencialmente embriogénico. Estadísticamente los 16 tratamientos

mostraron diferencia significativa para este criterio (p = 0.00396679, α = 0.05). De

manera gráfica, en la figura 22, se muestra la comparación de medias entre los

tratamientos con presencia de estructuras globulares.

58

Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes

Tabla 11. Efecto del NPS y picloram en la inducción de embriogénesis somática utilizando tejido somático de plántulas de un híbrido del género Polianthes

Genotipo

TR

Concentraciones

(M)

Respuesta

Tipo de respuesta

Raíz

Callogénesis

Estructuras globulares

bien definidas

Picloram NPS Sin vellosidades

Puntas con vellosidades

Potencialmente embriogénico

No embriogénico

S18 1

0

0

No - - - - - S19 No - - - - - S20 No - - - - - S21 No - - - - -

S13 2

0

10

No - - - - - S14 No - - - - - S17 No - - - - -

S100 No - - - - -

S1 3

0

20

Si Si - - - - S2 No - - - - - S3 No - - - - - S4 No - - - - -

S9 4

0

30

Si Si - - - - S10 No - - - - - S11 Si Si - - - - S12 No - - - - -

S65 5

2.07

0

Si - Si Si Si - S66 Si - Si - - -

S102 Si - Si Si Si - S107 Si - Si - Si -

S58 6 2.07 10 Si - Si - Si -

59


continuación...

Genotipo

TR

Concentraciones

(M)

Respuesta

Tipo de respuesta

Raíz

Callogénesis


bien definidas

Picloram NPS Sin vellosidades



No embriogénico

S59 6

2.07

10

Si - - Si - - S103 Si - Si - Si - S104 Si - - Si Si -

S45 7

2.07

20

Si - Si - Si - S46 Si - Si Si - - S47 Si - - Si - Si S74 Si - Si - Si -

S60 8

2.07

30

Si - Si - Si Si S61 Si - Si - Si - S62 Si - - Si - Si S63 Si - Si - Si -

S34 9

3.1

0

Si - Si - Si -

S35 Si - Si - Si -

S36 Si - Si - - -

S37 Si - Si - - -

S5 10

3.1

10

Si - Si - - -

S6 Si - Si - Si -

S7 Si - - - Si Si

S106 Si - - - Si -

S30 11 3.1 20 Si - Si - Si Si

S31 Si Si - - - -

60


continuación ...

Genotipo

TR

Concentraciones

(M)

Respuesta

Tipo de respuesta

Raíz

Callogénesis


bien definidas Picloram NPS Sin vellosidades



No embriogénico

S32 11

3.1 20 Si - Si - - - S33 Si - Si - Si -

S40 12

3.1

20

Si - - Si - - S41 Si - Si - Si Si S42 Si - - - Si - S43 Si - Si Si - Si

S25 13

4.54

0

Si - - - - Si S27 Si - - - - Si S28 Si - - - - Si

S105 Si - - - - Si

S47 14

4.54

10

Si - - - - Si S48 Si - Si - - Si S49 Si - - - Si - S50 Si - Si - Si -

S22 15

4.54

20

Si - - - - Si S23 Si - - - - Si S24 Si - - - - Si S26 Si - - - - Si

S51 16

4.54

30

Si - Si - - - S52 Si - Si - - Si S53 Si - Si - - Si

S101 Si - Si - - -

61



Figura 21. Desdiferenciación de tejido a partir de segmentos de hoja de plántulas provenientes de semillas de un híbrido del género Polianthes después de 30 d de cultivo (barra = 5 mm).

Figura 22. Comparación de medias para la presencia de estructuras globulares en los 16

tratamientos del diseño factorial entre NPS y picloram.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Medias y 95.0% de Fisher LSD

TRATAMIENTO

-0.3

0.1

0.5

0.9

1.3

ES

TR

UC

TU

RA

S G

LO

BU

LA

RE

S

62



Las estructuras globulares fueron claramente identificadas en los cuatro

genotipos en los tratamientos 13 y 15 presentando algunas características

diferentes entre ellos. En el TR13, los genotipos con mayor formación de

estructuras globulares (tipo 1) fueron S27 y S28, siendo perfectamente globulares,

compactas, de una tenue coloración amarilla, fácil de separar y con un diámetro

menor a 1 mm (Figura 23e). En el TR15 fueron tres los genotipos con una mejor

respuesta para la formación de estructuras globulares (tipo 2). La diferencia con el

TR13 fue el tamaño y la coloración, siendo más traslúcidas y con un diámetro

menor (figura 23f).

En base al objetivo del presente estudio que es inducir embriogénesis

somática, todos aquellos tratamientos en los cuales el tipo de respuesta después

de 30 d de cultivo estuvo relacionada con la formación de raíces o estructuras tipo

raíces y callo no embriogénico fueron descartados (TR1, TR2, TR3, TR4, TR5,

TR9, TR11, TR14, TR16). En TR1 y TR2 el tejido somático no presentó respuesta,

y permaneció vivo hasta que los nutrientes en el medio de cultivo se agotaron

(Figura 23a). En TR3 y TR4, sólo algunos segmentos del tejido presentaron

respuesta para la formación de raíces gruesas sin vellosidades. Es decir, los

tratamientos con 0 M de picloram, donde el NPS no tuvo efecto de inducción y

requiere una concentración mayor al nivel endógeno de auxina para que el tejido

se desdiferencie. Ötvös y colaboradores (2005) utilizaron NPS en combinación con

2,4-D como promotor de la activación de la división celular y la formación de

células embriogénicas en Medicago sativa, postulando que en ausencia de una

auxina endógena y con una concentración de 10 M de NPS no hay influencia

para la división celular. Sin embargo en presencia de 2,4-D (0.22 y 1 M) y NPS

(10 M) se incrementa significativamente la frecuencia de células en división y

viables.

63



Por otra parte, TR9 fue el primero en mostrar una respuesta de

desdiferenciación del tejido a los 10 d de cultivo (figura 23b), sin embargo, el

escaso callo que se formó en los bordes de algunos segmentos de hoja pronto se

convirtió en un callo no friable (figura 23h) y más tarde aumentó de tamaño

formando estructuras tipo raíces deformes (figura 23d). Además, en este mismo

tratamiento un genotipo presentó estructuras tipo raíces con abundantes

vellosidades. Para TR11, TR14 y TR16 la respuesta en dos genotipos fue la

formación de estructuras globulares bien definidas de color amarillo pálido. Al paso

de los días dichas estructuras globulares adquirieron coloraciones verdes. Para los

otros genotipos de estos mismos tratamientos, las estructuras globulares

aumentaron de tamaño y se deformaron en estructuras tipo raíces donde apareció

abundante vello (Figura 23g).

El efecto en la formación de raíces primarias y laterales fue reportado por

Khan y colaboradores (2013); Del Río y colaboradores (2014). Con relación a este

tipo de respuesta retomemos que en los tratamientos donde solo había NPS, se

presentó la formación de raíces, y cuando se adicionaba en conjunto con picloram

principalmente para los tratamientos con 2.07 y 3.1 M producía raíces con

vellosidades.

64



Figura 23. Tipos de respuesta en la inducción de la embriogénesis somática a partir de segmentos de hoja de plántulas de un híbrido del género Polianthes:(a) Raíz sin vellocidades, (b) Desdiferenciación del tejido somático después de 9 d, (c) Dos respuesta en un mismo genotipo, formación de estructuras globulares y tipo puntas, (d y g) Estructuras tipo raíz con abundantes vellocidades, (e) Estructuras globulares de color amarillo pálido, (f) Estructuras globulares translúcidas, (h) Callo no friable. Barra = 5.0 mm

65



7.1.2 Doble tinción diferencial de células

Posterior a los 30 d de cultivo y después de observar cuidadosamente cada

unos de los 7 tratamientos seleccionados como potencialmente embriogénicos se

tomó una muestra para realizar la prueba de la doble tinción diferencial de células

como se describe en la sección 6.1.3. Con respecto a la muestra, se tomaron

varias estructuras globulares con el diámetro menor en cada uno de los genotipos

de cada tratamiento. La manipulación del tejido fue meticulosa para evitar la

contaminación y debido a esto sólo se realizó la tinción una vez. Se tomó

suficiente muestra para poder realizar más de una observación en el microscopio.

Sin embargo, la forma globular y compacta de las estructuras impidió una visión

clara de las mismas en el microscopio. En varias ocasiones la muestra se presionó

con una fuerza excesiva y aún así no se logró observar claramente la polaridad en

las células. Por lo tanto estos resultados, no comprobaron la presencia de células

polarizadas, característica fundamental en la inducción de embriogénesis

somática. Sin embargo, estos resultados fueron comparados con análisis

histológicos de estructuras globulares embriogénicas (Monja-Mio y Robert, 2013;

Portillo y col., 2007; Sáenz y col., 2006). En estos estudios, las estructuras

embriogénicas que se analizaron histológicamente son similares a las encontradas

durante la doble tinción diferencial.

En la mayoría de las estructuras las células del contorno se tiñeron con azul

de Evans y por dentro con acetocarmin, aunque existió la presencia de células

azules, estas eran menores. De acuerdo al estudio de embriogénesis somática de

coco realizado por Sáenz y colaboradores (2006), el conjunto de células teñidas

de azul formaron algo similar a la cubierta de células que denominan protodermo,

y debajo están las posibles células meristemáticas que se activan para dar inicio al

desarrollo de estructuras embriogénicas.

66



En la figura 24 se puede observar una imagen representativa de la doble

tinción diferencial celular. Las estructuras Tipo 1 (Figura 24a) que se formaron

principalmente en el TR13 presenta una mayor organización en las células del

contorno de las estructuras teñidas (Figura 24 b y c). Para el caso de las

estructuras Tipo 2 (Figura 24d) que se formaron en el TR15 presentan también

células del contorno teñidas mayormente con azul de Evans y tienen una

apariencia menos compacta que las del tratamiento 13 (Figura 24e).

Como se menciono previamente otros tratamientos presentaron estructuras

globulares pero con otras características (Figura 24g) como delgadas

vellosidades, apariencia translucida, apariencia porosa y otras compactas pero de

color amarillo. Este tipo de estructuras también se tiñeron y lo que se observo en

el microscopio también presentaba células del contorno teñidas (Figura 24f) pero

desorganizadas. En el TR8 se encontraron otro tipo de estructuras semejante a lo

que los autores denominan embrión ovalado con el mismo patrón de tinción en las

células del contorno y del interior (Figura 24h-i).

Figura 24. Estructuras globulares sometidas a la doble tinción diferencial.

67



7.1.3 Subcultivos de callo y/o estructuras potencialmente embriogénicas

7.1.3.1 Subcultivo utilizando medios de inducción.

Con los resultados de la doble tinción diferencial no fue posible concluir la

inducción de embriogénesis somática en algunos de los 7 tratamientos

seleccionados. Transcurridos 60 d de cultivo bajo observaciones periódicas los

tratamientos no mostraban cambios aparentes, las estructuras globulares no

parecían continuar el desarrollo normalmente embrionario por lo que fue necesario

realizar una resiembra. Se utilizaron dos medios de cultivo que han sido utilizados

para inducción a embriogénesis somática. Se utilizó medio MIA reportado por

varios autores para inducir embriogénesis somática en Agave el cuál contiene 2

mg/L de 2,4-D y 0.3 mg/L de BA (Portillo y col., 2007). El otro medio de inducción

que se utilizó fue el medio MIP reportado recientemente (Abdullah, 2012) que

contiene 2.5 mg/L de 2,4-D y 0.1 mg/L de BA. La posibilidad de una respuesta

positiva para continuar el proceso de inducción a la embriogénesis somática

estuvo en base de que estos medios han sido utilizados exitosamente en el

género Agave (cercano al género Polianthes), y el mismo género para Polianthes

tuberosa. Además la activación de las celulas en respuesta a auxinas puede ser

un evento clave en la adaptación celular genética, metabólica y de reprogramación

fisiológica, dando lugar a la competencia embriogénica de las células vegetales

somáticas. los RC en ambos medios son los mismos y las concentraciones muy

cercanas. De esta manera el efecto de ambos RC pudo verse aun cuando se

trabajo con genotipos diferentes.

Portillo y col., 2007 mencionan que el efecto de aumenar la concentración de

citoquininas es benefico para la formación de embriones somaticos en Agave; el

medio MIA tenia mayor concentración de BA en comparación con el MIP, sin

embargo, esta diferencia de BA no es tan elevada como la reportada por esos

mismos autores (44.4 y 66.6 M BA) por lo tanto se pensó en una respuesta muy

parecida en ambos medios. Abdullah (2012) estudio la embiogénesis somática en

68



Polianthes tuberosa y utilizó el medio MIP para promover efectivamente la

embriogénesis somática. Obtuvo apartir de callo, embriones somáticos en sus

diferentes estadios (globular, torpedo y cotiledonar) despúes de tres meses de

cultivo. Utilizando medio MIP líquido o sólido obtuvo un promedio de embriones de

26.67±0.42 and 20.53±0.50 respectivamente a partir de 0.5 cm de callo.

El proceso de resiembra fue seleccionar muestra en cada genotipo donde

hubiera posibilidad de inducción embriogénica y cultivarla tanto en medio MIA

como en medio MIP. Los resultados después de 30 d de cultivo se observan para

cada tratamiento (figura 25 - 31). No se puede generalizar una respuesta, debido

principalmente al origen del tejido genotipicamente diferente. Sin embargo si se

distingue un efecto más positivo en el medio MIA con respecto a la inducción pero

sin llegar a obtener embriones en ningun tratamiento.

El genotipo S59 del tratamiento 6 formó en ambos medios de cultivo cúmulos

celulares que sobresalían al tejido los cuales no estaban presentes antes de la

resiembra. Sin embargo la coloración era muy amarilla y no parecían ser

estructuras embrionarias sino más bien el inicio de masas pro embriogénicas. En

el genotipo S104 la respuesta en los dos medios fue diferente. En el medio MIA

fue similar a la antes descrita añadiendo que parte del tejido se necroso y murió.

Para el medio MIP se formaron las mismas estructuras ya identificadas como

puntas con abundantes vellosidades y también se presento tejido necrótico y seco.

69



Figura 25. Comparación de la respuesta de dos genotipos diferentes del tratamiento con 2.07 y 10

M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP. El genotipo S59 en ambos medios de cultivo formó cúmulos celulares que sobresalían al tejido. El genotipo S104 presentó la formación de cúmulos celulares en el medio MIA y en el medio MIP la presencia de tejido necrótico y estructuras con abundante vello. Barra = 5.0 mm

Los dos genotipos del TR7 que se resembraron a medios de inducción

presentaron una respuesta totalmente diferente. En el tejido del genotipo S47 en el

medio MIP formaron más estructuras globulares como las que ya presentaba el

tejido pero ahora con una coloración beige. También aparecieron delgadas y

escasas vellosidades. El tejido en este mismo genotipo en el medio MIA se

deformo. Para el genotipo S46 en el medio MIP hubo formación de abundantes

vellosidades y el tejido se convirtió en un callo verde amorfo a diferencia del medio

MIA donde a pesar de mostrar una avanzada necrosis había ciertos cúmulos de

células que resaltaban iguales a los del genotipo S59 para el mismo medio MIA.

70




M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP. El genotipo S47 en medio MIA presentó deformación y en medio MIP formación de estructuras globulares de coloración beige. El genotipo S46 en medio MIA presentó tejido necrótico y áreas donde hubo formación de estructuras globulares y en medio MIP deformación de callo con abundantes vellosidades. Barra = 5.0 mm

El efecto de la resiembra de tres genotipos para el TR8 fue muy heterogéneo

entre los mismos. El genotipo que tuvo una respuesta más relacionada con la

inducción fue el S60 en ambos medios ya que aparecieron algunas estructuras

globulares y en forma de arroz de apariencia translúcidas rodeadas de tejido

necrótico. Los otros dos genotipos no mostraron este mismo efecto para el medio

MIA. En el S61, las estructuras globulares existentes adquirieron una coloración

verde y abundantes vellosidades. En el S62 el tejido se necrosó o se formó un

callo blanco de aspecto poroso.

71



Figura 27. Respuesta de tres genotipos diferentes del tratamiento con 2.07 y 30 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA. Las placas del medio MIP se contaminaron durante el tiempo de cultivo. El genotipo S60 presentó formación de estructuras globulares translúcidas. En el genotipo S61 hubo formación de estructuras globulares de coloración verde y rodeadas de vellosidades. El genotipo S62 mostró necrosis y callo en forma de espuma. Barra = 5.0 mm

Para los tratamientos siguientes la respuesta fue muy similar con alguno de

los genotipo antes descritos.


M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP. El genotipo S7 en medio MIA evidenció la formación de estructuras globulares de coloración beige y en medio MIP formación de callo no friable esponjoso. En el genotipo S6 en ambos medios hubo necrosis o formación de callo esponjoso no friable. Barra = 5.0 mm

72



Figura 29. Comparación de la respuesta de tres genotipos diferentes del tratamiento con 3.1 y 30

M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP. El genotipo S40 en medio MIA presentó estructuras globulares sólidas de color amarillo y el tejido en medio MIP fue escaso y sin forma. El tejido en el genotipo S41 en medio MIA presentó necrosis acompañado de la formación de estructuras globulares friables de coloración amarilla. La respuesta del mismo genotipo en medio MIP fueron estructuras tipo raíces con abundantes vellos. El genotipo S43 presentó en ambos medios la formación de callo no friable, esponjoso y blanco. Barra = 5.0 mm

73



Figura 30. Comparación de la respuesta de los 4 genotipos diferentes del tratamiento con 4.54 y 0

M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP. Visualmente los 4 genotipos presentaron una respuesta similar independientemente del medio de inducción en el que se subcultivaron. El genotipo S28 permaneció en ambos medios de inducción MIA y MIP con una respuesta potencialmente embriogénica donde las estructuras globulares ya existentes adquirieron una coloración beige y un ligero aumento de tamaño. Los otros genotipos S25, S105 y S27 perdieron las estructuras potencialmente embriogénicas para formar estructuras globulares solidas, de coloración amarilla a verde y en el genotipo S105 presentaron abundantes vellosidades. Además dicho genotipos también presentaron tejido necrótico. Barra = 5.0 mm

74



Figura 31. Comparación de la respuesta de los 4 genotipos diferentes del tratamiento con 4.54 y

20 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP. El genotipo S24 permaneció en ambos medios de inducción con una respuesta potencialmente embriogénica donde las estructuras globulares ya existentes adquirieron una coloración amarillo claro y un aspecto rugoso. Los otros genotipos S22, S23 y S26 presentaron deformación de las estructuras potencialmente embriogénicas formando callo esponjoso, presencia de tejido necrótico y vellosidades. Sin embargo, algunos segmentos de tejido de esos mismos genotipos cultivados en medio MIA permanecieron globulares y viables. Barra = 5.0 mm

75



7.1.3.2 Subcultivo utilizando medio de inducción enriquecido con

aminoácidos.

Al finalizar la resiembra utilizando los medios de inducción MIA y MIP solo se

logró mantener con viabilidad el tejido. Después de 90 d aún existían en algunos

tratamientos la presencia de estructuras globulares potencialmente viables. Mere y

Vázquez (2003) utilizaron una solución enriquecida con factores de crecimiento,

específicamente, vitaminas y aminoácidos, además de compuestos orgánicos

como la urea para producir callos embriogénicos en Daucus carota L. Flores-

Benítez y colaboradores (2007) indujeron embriones somáticos en Agave a partir

de callo mediante la adición de una mezcla de aminoácidos y vitaminas que

denominaron coctel 20, estos fueron inducidos después de seis a ocho semanas

resultando friables. Por lo tanto, en el presente trabajo se realizó un último

subcultivo adicionando al medio de cultivo MS la misma solución de aminoácidos y

vitaminas reportada por Benítez y colaboradores (2007) cuya compocición es rica

en nitrógeno orgánico.

Nitrógeno reducido fue identificado como otro factor importante en la

inducción y desarrollo del embrión. Trigiano y colaboradores (1992), confirmaron

que una fuente adicional de nitrógeno reducido indujo la desdiferenciación y

proliferación de células en la epidermis para iniciar embriones secundarios en

Dactylis glomerata. Además, Stuart y Strickland (1984), incrementaron el número

de embriones producidos por cultivos de alfalfa al adicionar nitrógeno reducido al

medio de cultivo. Sin embargo, en el presente estudio el efecto de la adición del

coctel 20 al medio de cultivo MIc20 (en conjunto con los RC) sobre el tejido de

todos los genotipos resembrados no influyó en la desdiferenciación y proliferación

de células en epidermis de las estructuras globulares resembradas. Al contrario,

exceptuando el genotipo S24 del TR15 en donde las estructuras globulares

persistieron sin mostrar ningún cambio aparente en la resiembra, en todos los

demás genotipos la adición del coctel 20 y RC causó una desorganización del

tejido, producción de callo no embriogénico, aparición de vellosidades y la

76



deformación de las estructuras globulares que se habían formado y mantenido

(Figura 32). Es posible que este comportamiento sea influenciado por el largo

periodo de resiembra. van Arnold y colaboradores (2002) sugieren que aunque los

cultivos embriogénicos de algunas especies y algunos genotipos pueden ser

subcultivados durante un período prolongado en un medio con RC conservando su

potencial embriogénico, en la mayoría de los cultivos el potencial embriogénico de

células somáticas disminuye con el cultivo prolongado, pudiendo llegar a perderse

eventualmente.

Figura 32. Respuesta de los genotipos a la resiembra en medios de inducción enriquecido con

aminoácidos. Barra= 5 mm.

77



7.2 Micropropagación

7.2.1 Descripción inicial de plántulas

Para evaluar el efecto del NPS sobre la micropropagación de plántulas del

híbrido 1008157 se utilizaron 75 plantas provenientes de la germinación de

semillas, debido a esto, las plantas fueron genotípicamente diferentes entre sí. La

Tabla 5 (mostrada en la sección 6.2.1) muestra la descripción inicial de las 75

plántulas obteniendo en promedio una longitud de la planta de 2.94 cm ± 1.89, un

número de hojas igual a 5.61 ± 3.44 y 0.68 ± 0.90 brotes. Además, respecto al

número de brotes, el 45.3 % del total de las plantas presentaron brotes, de los

cuales, el 64.7 % presentó un solo brote, el 20.6 % dos brotes y el 14.7 % tres

brotes.

7.2.2 Estimulación de la producción de brotes en plántulas

El efecto del NPS en la estimulación de la producción de brotes fue evaluado

en un primer cultivo, donde las 75 plantas fueron distribuidas aleatoriamente en

cinco tratamientos variando la concentración de NPS (0, 10, 20, 30 y 40 M).

Además, para evaluar la posible persistencia o disminución del efecto inducido por

el NPS en cultivos subsecuentes, las plantas obtenidas del primer cultivo se

resembraron por segunda vez utilizando la misma concentración de NPS para

cada tratamiento. Al finalizar cada cultivo, se realizó una descripción del desarrollo

de la planta donde las variables de respuesta fueron la altura, el número de hojas

y brotes.

La adición de NPS en el cultivo in vitro de células vegetales es actualmente

un tema de interés. Han y colaboradores (2009) indicaron que el NO puede

participar en la división celular y por lo tanto afectar la regeneración y

multiplicación de brotes adventicios. Tan y colaboradores (2013), evaluaron el

efecto de la NPS en la multiplicación de brotes y regeneración de Vanilla planifolia

78



Andrews. Sus resultados indicaron que el NPS a un concentración 10 µM

estimulaba el desarrollo de organogénesis directa produciendo brotes a partir de

segmentos nodales con un éxito del 93% de los explantes producían brotes.

Pagnussat y colaboradores (2002) adicionaron la misma concentración de

NPS en Cucumis sativus y sugieren su efecto como un intermediario de

regeneración de brotes adventicios y raíces. Esto también se ha sugerido por

Correa-Aragunde y colaboradores (2006) en otras especies como Solanum

lycopersicum donde la concentración óptima fue menor (200 µM). Los resultados

en este estudio no pudieron demostrar el efecto potenciador del NPS en la

producción de brotes debido principalmente al número reducido de repeticiones

por tratamiento. Sin embargo si se observó una influencia numéricamente positiva

al producir brotes.

En el tratamiento 0 M NPS (Tabla 12), al finalizar el primer cultivo presentó

un promedio para la altura de las plantas igual a 1.52 cm ± 1.13, este mismo

tratamiento en el segundo cultivo tuvo una disminución en la altura de las plantas,

las cuales presentaron un promedio igual a 0.59 cm ± 1.62. Para las variables de

respuesta, estadísticamente no hay diferencia significativa entre el primer y

segundo cultivo p = 0.0846, 0.0595, 0.8150, α = 0.05 para altura, número de hojas

y número de brotes respectivamente. Respecto al número de hojas, al finalizar el

primer cultivo el promedio de las plantas fue igual a 5.53 hojas ± 3.34. Esta misma

variable de respuesta al finalizar el segundo cultivo mostró un incremento

obteniendo un promedio de 6.46 hojas ± 5.72. Respecto al número de brotes, el

promedio del primer y segundo cultivo fue igual a 0.93 ± 0.88 y 0.85 ± 1.03 brotes

respectivamente. Debido a los fines de la técnica de micropropagación, el número

de brotes es la variable de respuesta de mayor interés en este estudio (Figura 39)

entonces, es importante resaltar que al finalizar el segundo cultivo 11 plantas

diferentes (73.3%) mostraron una estimulación en la producción de nuevos brotes.

Sin embargo, el número de plantas estimuladas fue mayor durante el primer

79



cultivo (nueve), a diferencia del segundo cultivo en el que únicamente dos plantas

fueron estimuladas para la producción de nuevos brotes (Figura 33).

Tabla 12. Comparación de las respuestas de desarrollo de las plantas durante el cultivo en medio sin NPS.

(0 M)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 PROM

ALTURA

(cm)

1ER C 0.0 2.0 1.2 2.0 3.0 0.9 2.8 3.0 2.3 0.0 0.0 0.1 1.5 2.7 1.3 1.52

2DO C -2.2 -0.7 -0.5 1.5 -1.6 1.6 2.0 - - 0.2 3.4 -0.4 2.2 1.0 1.1 0.59

HOJAS

1ER C 7 4 3 3 2 6 8 13 10 3 5 2 9 6 2 5.53

2DO C 17 12 -2 15 5 10 2 - - 2 6 2 9 4 2 6.46

BROTES

1ER C 2 0 0 1 0 0 1 2 2 1 1 0 2 2 0 0.93

2DO C 3 1 0 2 0 2 0 - - 0 1 0 2 0 0 0.85

*Los espacios vacíos en la tabla corresponden a plantas contaminadas durante la manipulación en el subcultivo. Por lo tanto, estas plantas no fueron tomadas en cuenta para la determinación de los promedios, C: cultivo.

Al finalizar el primer cultivo, ninguno de los tratamientos presentó diferencia

significativa en la altura (0, 10, 20, 30 y 40 M) (p = 0.6971, α = 0.05). Además, la

altura promedio mayor fue la del control (1.52 cm ± 1.13), mientras que el

tratamiento con menor altura promedio fue 20 M (0.73 cm ± 1.77) (Tabla 14)

seguido de 30 M (0.86 cm ± 1.90) (Tabla 15), 40 M (1.37 cm ± 1.40) (Tabla 16)

y 10 M (1.44 cm ± 2.66) (Tabla 13).

Figura 33. Plantas control con diferencias fenotípicas en su morfología después de 60 d en medio de cultivo sin NPS.

80



Para el número de hojas, comparando las plantas control y las plantas con

NPS no existió diferencia significativa (p = 0.1668, α = 0.05). Sin embargo, los

tratamientos con NPS mostraron un incremento al finalizar el primer cultivo,

excepto el tratamiento con 20 M (4.0 ± 3.6). Los tratamientos utilizando 10 M

(7.33 ± 5.92), 30 M (7.1 ± 5.1) y 40 M (7.9 ± 5.24) incrementaron en promedio 2

hojas respecto al control (5.53 ± 3.34).

El efecto de la concentración de NPS sobre el número de brotes promedio en

las plantas no tuvo efecto significativo (p = 0.5609, α = 0.05). La concentración 10

M (1.27 ± 1.71) (Figura 40) fue la mayor superando el efecto del medio de cultivo

que contiene únicamente reguladores de crecimiento en las plantas control con un

número de brotes promedio de 0.93 ± 0.88. Además, el tratamiento 20 M mostró

el promedio más bajo en el número de brotes (0.6 ± 0.74) (Figura 41) seguido de

los tratamientos 30 M (0.8 ± 0.77) (Figura 42) y 40 M (1.13 ± 1.46) (Figura 43).

De forma gráfica todos los resultados de las variables de respuesta se ilustran en

la figura 34.

Figura 34. Efecto del NPS sobre el desarrollo de las plantas durante el primer cultivo. Las barras de bigotes dentro de las barras de colores indican la desviación estándar para cada tratamiento.

81



Respecto al porcentaje de plantas estimuladas (Figura 35), el control mostró

un 60 % de plantas que produjeron nuevos brotes. Los demás tratamientos

presentaron un número de plantas igual o menor al control, obteniendo un

porcentaje de plantas con nuevos brotes de 53.3, 46.7, 60, y 53.3 % para 10, 20,

30 y 40 M respectivamente.

Figura 35. Porcentaje de plantas estimuladas para la producción de nuevos brotes durante el primer cultivo.

Por otro lado, los resultados de las variables de respuesta al finalizar el

segundo cultivo con NPS (Figura 36) fueron altamente heterogéneas. Una vez

más no existió diferencia significativa entre los tratamientos presentando un valor

p de 0.9701, 0.7064 y 0.1189 para altura, número de hojas y número de brotes

respectivamente (α = 0.05). Los tratamientos 10, 30 y 40 M presentaron altura y

número de hojas menor con respecto al control. Sin embargo, el tratamiento 20 M

mostró un incremento respecto al primer cultivo en la altura (0.62 ± 1.33) y número

de hojas (6.46 ± 5.72). Para el número de brotes existió un incremento en los

tratamientos con 10 M (1.85 ± 2.57) y 30 M (1.33 ± 1.35) comparado con el

control (0.85 ± 1.03).

82



Figura 36. Efecto del NPS sobre el desarrollo de las plantas durante el segundo cultivo. Las barras

de bigotes dentro de las barras de colores indican la desviación estándar para cada tratamiento.

Respecto al porcentaje de plantas que se estimularon después del segundo

cultivo con NPS (Figura 37) y tomando como referencia un total de 67 plantas (sin

las contaminadas), el control mostró solo un 15.4 % de plantas que produjeron

nuevos brotes. Los tratamientos 20 y 30 M presentaron un número de plantas

estimuladas mayor al control, obteniendo un porcentaje de 23.1 y 33.3

respectivamente. El tratamiento 10 M tuvo sólo un 7.7% de plantas estimuladas,

por debajo del control y el tratamiento 40 M presentó las mismas plantas que el

control.

83



Figura 37. Porcentaje de plantas que fueron estimuladas hasta el segundo cultivo para la producción de nuevos brotes.

El porcentaje de plantas estimuladas al final del experimento con diferentes

concentraciones de NPS fue mayor que el control (73.3%) en el tratamiento 30

M, el cual obtuvo un total de 14 plantas diferentes (93.3%) con brotes nuevos

seguido por los tratamientos 40 M y 20 M ambos con 10 plantas (66.6%) y

finalmente el tratamiento 10 M con 9 plantas (60%). Es importante en este punto,

volver a mencionar que las 15 plantas en cada tratamiento provenían de semillas

diferentes, por lo que a pesar de ser genéticamente diferentes mostraron un efecto

por la adición del NPS al medio de cultivo (Figura 38).

84



Figura 38. Porcentaje de plantas que fueron estimuladas al final del experimento para la

producción de nuevos brotes.

Figura 39. Plántulas con mayor número de brotes en cada tratamiento.

85



Tabla 13. Comparación de las respuestas de desarrollo de las plantas durante el cultivo en medio

con 10 M NPS.

(10 M)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 PROM.

TRAT

ALTURA

(cm)

1ER C -1.3 0.8 -1.0 6.4 4.1 1.1 -1.4 0.8 -0.2 1.4 -3.0 3.2 6.5 2.5 1.8 1.4

2DO C 0.7 0.2 -1.2 -4.1 2.5 -0.5 1.3 2.4 -1.8 -0.6 0.3 - 2.2 1.6 - 0.23

HOJAS

1ER C 10 5 20 10 3 1 11 17 12 0 6 2 4 7 2 7.3

2DO C 8 2 6 7 -2 1 1 1 3 4 3 - 28 2 - 4.92

BROTES

1ER C 1 0 3 3 0 0 2 6 2 0 1 0 0 1 0 1.27

2DO C 5 0 5 0 0 0 2 0 2 0 1 - 8 1 - 1.85

Figura 40. Plantas cultivadas en medio con 10 M de NPS después de 60 d de cultivo.

86




con 20 M NPS.

(20 M)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 PROM.

TRAT

ALTURA

(cm)

1ER C 2.8 0.2 0.5 1.8 3.6 0.1 0.4 -1.1 0.6 1.0 -1.5 2.3 2.8 0.2 0.5 0.73

2DO C 0.3 1.5 -0.5 -0.9 1.6 0 0 -1.8 1.3 1.6 0 2.1 - 2.9 - 0.62

HOJAS

1ER C 1 4 6 8 3 4 2 6 1 3 1 4 -2 13 6 4.0

2DO C 1 7 7 19 1 4 7 6 5 5 5 3 - 17 - 6.69

BROTES

1ER C 0 0 0 2 0 1 1 2 0 1 0 0 1 0 1 0.6

2DO C 0 1 0 2 0 0 0 0 1 0 1 0 - 0 - 0.39


87




con 30 M NPS.

(30 M)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 PROM.

TRAT

ALTURA

(cm)

1ER C 4.7 -2.5 1.1 1.6 0.5 3.0 1.7 0.3 0.9 0.4 2.3 1.8 -1.3 -2.4 0.9 0.86

2DO C -3.5 -0.4 -0.4 0.8 1.5 0.3 3.0 2.2 5.6 0.8 -1.4 -0.7 -0.5 1.0 -0.8 0.5

HOJAS

1ER C 8 18 12 14 2 4 3 8 7 4 12 1 3 8 2 7.1

2DO C 7 9 7 3 2 7 1 -2 3 6 4 7 5 8 4 4.73

BROTES

1ER C 2 1 1 1 0 1 0 1 1 0 2 0 0 2 0 0.8

2DO C 1 5 3 0 0 2 0 1 1 2 1 2 1 0 1 1.3


88




con 40 M NPS.

(40 M)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 PROM.

TRAT

ALTURA

(cm)

1ER C 3.0 2.4 1.8 -3.1 2.4 2.0 2.0 0.8 2.4 1.3 1.5 1.3 0.8 1.1 0.9 1.37

2DO C 0.0 1.3 0.6 0.0 -3.1 -2.0 0.2 1.2 0.4 1.0 0.0 -0.3 2.2 - 2.4 0.26

HOJAS

1ER C 5 5 7 19 4 6 1 4 5 14 11 2 10 9 16 7.9

2DO C 2 8 2 0 -1 6 0 2 24 11 2 2 -2 - -6 3.85

BROTES

1ER C 0 1 0 5 0 0 0 0 1 3 2 0 1 2 2 1.13

2DO C 0 2 0 0 0 1 0 1 4 1 0 0 0 - 0 0.64

Figura 43. Plantas cultivadas en medio con 40 M de NPS después de 60 días de cultivo.

89



7.2.3 Establecimiento de yemas axilares de la inflorescencia del hibrido

Para la fase del establecimiento de las yemas axilares a partir de la

inflorescencia del híbrido 1008157 se colectaron dos tipos de tallo. El primero

pertenecía a una inflorescencia muy desarrollada (Figura 44a) de tejido rígido,

leñoso y con botones florales abiertos. El segundo tipo de tallo que se colectó era

de una inflorescencia juvenil (Figura 44c), su tejido presentaba mayor plasticidad,

botones florales cerrados y todos agrupados en el ápice formando espiga. Ambos

tallos fueron colectados en diferente fecha. Se cortaron, desinfectaron y

establecieron como se mencionó en la sección 6.2.3. Se realizaron más de dos

colectas sin tener éxito en la respuesta de los explantes. Los segmentos de tallo

se necrosaban y el tejido moría. Solo dos establecimientos de tallos realizados por

separado tuvieron respuesta.

Sólo tres explantes en el primer establecimiento tuvieron respuesta. Fueron

segmentos de tallo tipo leñoso. Estos segmentos contenían yemas axilares

florales las cuales no terminaron de diferenciarse para formar un botón floral y

formaron un botón vegetativo como respuesta al medio de cultivo u otro factor

(Figura 44b). El tejido somático que se obtuvo en este establecimiento se utilizó

para desdiferenciarlo en la estandarización de la sección 6.1.2 y no fue

propagado. En el segundo establecimiento solo dos segmentos de tallo tuvieron

respuesta (Figura 44d). Los segmentos presentaban yemas axilares destinadas a

formar un botón floral. Sin embargo, siete meses después de que se establecieron

los segmentos de tallo, estos formaron brotes vegetativos estimulados por el

medio de cultivo, la plasticidad de las células del explante, entre otros factores.

Debido al prolongado tiempo de respuesta de las yemas axilares de la

inflorescencia, se optó por propagar los dos brotes obtenidos en lugar de realizar

un tercer establecimiento.

90



Figura 44. Establecimiento de yemas axilares a partir de la inflorescencia del hibrido 1008157.

7.2.4 Propagación de clones del híbrido 1008157

La propagación de los brotes vegetativos obtenidos a partir de yemas

axilares de la inflorescencia se realizó con la finalidad de incrementar el material

vegetal disponible para realizar los experimentos posteriores es este estudio. La

propagación se realizó por más de ocho meses utilizando diferentes medios de

cultivo (sección 6.2.2). Debido a que el híbrido 1007157 es una planta con

crecimiento vigoroso y sano (Figura 45a), los dos brotes iniciales se multiplicaron

hasta formar más de 50 explantes (Figura 45c). Algunos de esos explantes

presentaban brotes axilares pequeños (Figura 45b) los cuales permanecieron

unidos al brote central para propiciar un crecimiento más rápido de ambos. En la

91



última fase de la propagación, los explantes se cultivaron en medio MSC sin

reguladores de crecimiento y se colocaron en oscuridad con la finalidad de inducir

un decremento en la síntesis de clorofila.

Figura 45. Propagación de brotes vegetativos utilizando la multiplicación por yemas axilares.

Los explantes después de 12 días en oscuridad presentaron una disminución

del color verde intenso que habían presentado durante toda la etapa de

propagación (Figura 46a). Además las hojas de mayor longitud perdieron la

dureza, el vigor, mostraron un aspecto de marchitez y un color amarillo en

contraste con las hojas del explante cultivado en el mismo medio MSC pero en

presencia de luz (Figura 46b) el cual no mostró ninguno de los síntomas

mencionados.

92



Figura 46. Explantes clones del híbrido después de incubarlos en oscuridad. a) Algunos de los explantes clones del híbrido después de incubarlos durante 12 días en oscuridad. b) Comparación de explantes incubados en presencia de luz (centro) y oscuridad (laterales).

7.2.5 Estimulación de la producción de brotes en clones del híbrido

1008157

Después de cultivar los explantes en medio MSC durante 12 días en

oscuridad, los explantes fueron divididos en dos experimentos diferentes para

evaluar el efecto del NPS en la producción de brotes. En el primer experimento se

utilizó explantes que presentaban brotes (al menos uno) y en el segundo

experimento se utilizó explantes que no presentaron brotes. En ambos

experimentos los explantes se cultivaron en un medio con diferentes

concentraciones de NPS (0, 10, 20, 30 y 40 M) y se incubaron durante 30 d.

93



Transcurridos los 30 d, en cada uno de los experimentos se realizó una

descripción de características de desarrollo donde los valores de cada variable de

respuesta reflejan la diferencia entre el estado final e inicial. Las variables de

respuesta consideradas fueron la altura de la planta; el número de hojas y brotes.

7.2.5.1 Clones del híbrido con al menos un brote antes del cultivo en

NPS

Cuatro repeticiones por tratamiento fueron realizadas por experimento. Se

evaluó la respuesta de los explantes clones del hibrido que tenían brotes antes del

cultivo con diferentes concentraciones de NPS. De acuerdo a los valores

obtenidos (Tabla 17), para la altura, independientemente del tratamiento, el 50%

del total de las plantas, no mostraron crecimiento o en su defecto presentaron una

disminución. Esto se traduce, en que, la mayoría de las hojas que presentaron

síntomas de marchitez después del periodo de incubación en oscuridad, no

lograron recuperarse durante el cultivo con NPS. Dicho tejido se secó (Figura 47)

dando como resultado una disminución en la longitud de la hoja que se tomó como

referencia para medir la altura de la planta. Respecto al número de explantes que

fueron estimulados para producir brotes nuevos, en el control, el 100% de los

explantes produjo brotes, en contraste con los tratamientos con NPS donde solo el

tratamiento 40 M mostró un 100% de explantes con producción de brotes. Sin

embargo, un 75% del total de explantes presentó un estímulo para la producción

de brotes nuevos.

Tabla 17. Comparación entre las variables de respuesta para los clones del híbrido con al menos un brote durante el cultivo en medio con NPS.

NPS (M)

0 0 0 0 10 10 10 10 20 20 20 20 30 30 30 30 40 40 40 40

ALTURA

(cm) 0.0 2.1 2.1 -0.6 -0.6 1.4 4.6 1.1 -3.3 -2.8 5.4 6.0 -0.5 -4.2 1.0 -1.7 1.5 1.8 0.0 -1.8

HOJAS -1 14 5 11 7 2 14 8 12 12 21 2 5 0 4 11 8 33 10 6

BROTES 1 3 1 1 0 0 1 2 2 2 2 0 1 0 0 4 3 3 1 2

94



Figura 47. Marchitamiento y muerte del tejido del ápice de las hojas adultas durante el cultivo con NPS.

En términos del valor promedio, para la altura, los tratamientos 10 y 20 M

fueron numéricamente superiores que el control, mientras que los tratamientos con

mayor concentración de NPS (30 y 40 M) estuvieron por debajo del crecimiento

en el control (Tabla 18). Para la variable número de hojas, todos los tratamientos

con NPS superaron al control con excepción del tratamiento 30 M que fue menor.

Para la producción de nuevos brotes, y retomando que esta variable es la de

mayor interés, el control mostró un promedio mayor o igual que los tratamientos

10, 20 y 30 M. Únicamente el tratamiento con 40 M numéricamente superó el

número de brotes, sin embargo, no existió diferencia significativa de acuerdo al

ANOVA (p= 0.5996, 0.4880 y 0.3662, α= 0.05, para altura, número de hojas y

número de brotes respectivamente, Figura 48).

Tabla 18. Promedio y desviación estándar para las variables de respuesta en clones del híbrido con presencia de brotes durante el cultivo en medio con NPS.

NPS (M)

0 10 20 30 40

PROM DS PROM DS PROM DS PROM DS PROM DS

ALTURA

(cm) 0.9 1.41 1.63 2.8 1.33 5.1 -1.35 2.2 0.63 1.23

HOJAS 7.5 4.58 7.75 4.92 11.75 7.76 6.67 4.55 14.25 12.6

BROTES 1.5 1.0 0.75 0.96 1.5 1.0 1.25 1.89 2.25 0.96

95



Figura 48. Efecto del NPS sobre las características de desarrollo de los explantes clones del híbrido con al menos un brote. Las barras de bigotes dentro de las barras de colores indican la desviación estándar para cada tratamiento.

7.2.5.1 Clones del híbrido sin brotes antes del cultivo en NPS

Se realizó un segundo experimento utilizando los clones del híbrido que no

presentaban brotes antes del cultivo en NPS. La finalidad de este experimento fue

complementar los resultados del experimento anterior y evaluar el efecto del NPS

en la producción de nuevos brotes considerando la homogeneidad en el explante

inicial (sin brotes) en todos los tratamientos.

Este experimento se realizó con 6 repeticiones en cada tratamiento 0, 10, 20,

30 y 40 M NPS. Los valores para las variables de respuesta mostradas en la

tabla 19 son el resultado de la diferencia entre el estado final e inicial del cada

explante. Con respecto a la altura, ocurrió el mismo fenómeno que se ha

presentado en los experimentos anteriores, donde el tejido del ápice de las hojas

de los explantes se seca. Sin embargo, dicho efecto disminuyó obteniendo solo

96



un 33.3% del total de explantes que disminuyeron su altura en comparación con el

50% en el experimento de clones con brotes. Es importante considerar que la

mitad del número de explantes del 33.3% pertenecen únicamente al tratamiento

40 M. Para el número de brotes (la variable de mayor interés), se observó una

disminución con respecto al experimento anterior (clones con al menos un brote)

ya que solo el 56.6% del total de explantes fueron estimuladas para la producción

de brotes. Con referencia a esto, el tratamiento 40 M tuvo un 83.3% de plantas

estimuladas superando al control (66.6%) y a los otros tratamientos con NPS.

Tabla 19. Comparación de las variables de respuesta (altura, hojas y brotes) para los clones del híbrido sin brotes durante el cultivo en medio con NPS. (6 repeticiones por tratamiento)

NPS (M)

0 10 20 30 40

ALTURA

(cm)

-2.9 0.5 1.8 3.7 1.7 0.7 4.5 1.5 -3.4 1.8 2.1 1.3 7.8 -2.7 -0.8

-0.3 1.3 1.2 -1.2 0.3 0.0 2.3 2.5 1.2 2.1 1.1 -0.2 -0.2 -1.7 -0.3

HOJAS

6 3 2 4 5 13 1 4 8 4 4 4 3 3 10

4 8 3 5 -2 4 5 2 3 4 2 7 6 2 1

BROTES

2 0 0 0 0 5 0 1 3 1 1 0 2 1 2

1 3 1 1 0 0 2 0 0 0 0 4 2 1 0

En términos de promedio (Tabla 20) para la altura, todos los tratamientos con

NPS fueron superiores que el control, sin embargo, esté valor no tiene el suficiente

respaldo debido a que sólo uno de los 6 explantes aporto este valor. Por lo tanto,

sería más razonable considerar el tratamiento 30 M como el mejor debido a que

5 de 6 plantas incrementaron su longitud. Para la variable número de hojas, el

tratamiento 10 M superó al control y los tratamientos 20, 30 y 40 M fueron

menores al control. El efecto en el número brotes, y retomando que esta variable

es la de mayor interés, los tratamientos 10, 20 y 30 M tuvieron el mismo

97



promedio pero menor al control, únicamente el tratamiento 40 M superó el

número de brotes promedio obtenido en el control (Figura 49). Estadísticamente

no existió diferencia significativa entre los tratamientos (p= 0.8160, 0.1674 y

0.9914, α = 0.05, para altura, número de hojas y número de brotes

respectivamente).

Tabla 20. Promedio y desviación estándar para las variables de respuesta en clones del híbrido con presencia de brotes durante el cultivo en medio con NPS.

NPS (M)

0 10 20 30 40

PROM DS PROM DS PROM DS PROM DS PROM DS

ALTURA

(cm) 0.1 1.65 0.87 1.68 1.43 2.64 1.37 0.87 0.35 3.77

HOJAS 4.33 2.25 4.83 4.79 3.83 2.48 4.17 1.60 4.16 3.31

BROTES 1.17 1.17 1.0 2.0 1.0 1.26 1.0 1.55 1.33 0.82

Figura 49. Efecto del NPS sobre las características morfológicas de los explantes clones del híbrido sin brotes al inicio del cultivo. Las barras de bigotes dentro de las barras de colores indican la desviación estándar para cada tratamiento.

98



7.2.6 Extracción y cuantificación de clorofila

Los explantes clones del híbrido (con y sin brotes) se cultivaron en un medio

con diferentes concentraciones de NPS. Después de hacer la evaluación para las

variables de respuesta se tomó una muestra de material vegetal de cada explante

para extraer la clorofila utilizando etanol por 24 hrs. Posteriormente se cuantificó

clorofila a y b por medio de espectrofotometría. Las absorbancias obtenidas para

los dos tipos de clorofila en cada explante fueron convertidas a g/mL mediante

las fórmulas de Wellburn (1994).

Se obtuvo el promedio de clorofila a y b para cada tratamiento con NPS (0,

10, 20, 30 y 40 M) de acuerdo a los dos experimentos con o sin brotes antes del

cultivo. Este promedio representa la cantidad de clorofila en g/mL en los

explantes de cada tratamiento. El promedio para la clorofila a y b en el tratamiento

0 M NPS fue menor en los explantes con al menos un brote respecto a los

explantes sin brotes. Sin embargo, estadísticamente no existió diferencia

significativa para el contenido de clorofila tanto a como b entre ambos

experimentos (clorofila a p = 0.2893; clorofila b: p = 0.2802, α = 0.05).

Para los explantes con brotes, el contenido de clorofila a fue menor en el

control, seguido de 20, 10, 40 y 30 M NPS. Estadísticamente dicha disminución

en el control no tuvo efecto significativo con respecto a todos los tratamientos (p =

0.2062, α = 0.05). Para la clorofila b, en este mismo experimento, los tratamientos

10, 30 y 40 M superaron al control, excepto el tratamiento 20 M siendo una vez

más numéricamente el tratamiento 30 M NPS el de mayor contenido y

presentando diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos (p =

0.0255, α = 0.05). La diferencia que existió fue para los tratamientos 10 y 30 M

con el tratamiento 20 M, lo que sólo confirmó que los niveles más bajos de

clorofila se dieron en el tratamiento 20 M (Figura 50).

99



Figura 50. Prueba de rangos múltiples (LSD) para comparar las medias de los tratamientos y saber cuáles son diferentes entre sí.

Respecto a los explantes sin brotes los niveles clorofila a y b fueron mayores

únicamente en el tratamiento 20 M donde no existió un efecto estadísticamente

significativo entre los tratamientos. Los otros tratamientos tienen niveles menores

al control de clorofila a y b pero aún sin presentar una diferencia estadísticamente

significativa (clorofila a p = 0.3512, clorofila b p= 0.1379 α = 0.05)

Tabla 21. Promedio para el contenido de clorofila a y b en explantes clones del híbrido después del

cultivo en medio con NPS.

Clorofila a (mg/mL) Clorofila b (mg/mL)

NPS

(M)

Clones con al

menos un brote clones sin brotes

Clones con al

menos un brote clones sin brotes

0 1.979 ± 0.662 2.101 ± 0.299 1.063 ± 0.193 1.091 ± 0.095

10 2.318 ± 0.093 1.881 ± 0.521 1.189 ± 0.007 1.019 ± 0.138

20 2.046 ± 0.345 2.259 ± 0.351 1.097 ± 0.094 1.124 ± 0.087

30 2.445 ± 0.523 1.943 ± 0.335 1.214 ± 0.124 1.039 ± 0.109

40 2.240 ± 0.191 1.581 ± 0.436 1.167 ± 0.036 0.954 ± 0.142

100



Figura 51. Comparación del contenido de clorofila entre los tratamientos con NPS para los clones del híbrido con o sin brotes durante el cultivo.

7.2.6 Enraizado y aclimatación de explantes clones del híbrido 1008157

Cuando se desarrolla un protocolo de micropropagación la etapa de

enraizado y aclimatación de explantes es muy importante debido a que muchas

especies propagadas in vitro no toleran el cambio de condiciones que existen al

pasar de un cultivo in vitro a in situ. En el presente estudio la aclimatación de

plantas del híbrido 1008157 del género Polianthes fue satisfactoria. Estas plantas

se cultivaron, previamente a la aclimatación, en un medio MSC para enraizar, con

la finalidad de estimular la producción de raíz el medio contenía una mayor

cantidad de sacarosa de la que normalmente se utiliza. 18 plantas sin brotes y de

tamaños diferentes fueron utilizadas para el enraizado. Uno de esos explantes,

previamente sirvió de control para comparar la pérdida de coloración cuando los

explantes se incubaron en oscuridad por 12 d. Por lo tanto este explante no

participó en el último experimento con NPS. Permaneció en medio MSC durante

casi tres meses donde formo raíces abundantes, delgadas y largas (Figura 52b).

101



Las otras 17 plantas que se pusieron en medio MSC para enraizar, después

de los 40 d al retirarlos del medio de cultivo presentaron apenas la punta de una

raíz en la base. Un mes después de que las 18 plantas se cultivaron en suelo, 16

explantes lograron aclimatarse (Figura 52c) y solo dos murieron por contaminación

por hongos. Las plantas aclimatadas presentaron un crecimiento vigoroso, poseen

hojas muy verdes, gruesas y sanas (Figura 52d). Además, las plantas fueron

retiradas del suelo para ver el desarrollo de sus raíces. Comparando las raíces

antes y después de la aclimatación en la Figura 52a, se logra observar que las

raíces son más gruesas independientemente del tamaño del explante. Se

comprobó la característica del vigor en el crecimiento que posee este híbrido tanto

radicular como apical.

Figura 52. Plantas del híbrido 1008157 aclimatadas a) Plantas con presencia de raíces después

de un mes de aclimatación barra= 5 cm; b) Planta recién retirada del medio de cultivo; c) 16 plantas aclimatadas; d) Las plantas aclimatadas presentaron un crecimiento vigoroso, poseen hojas muy verdes, gruesas y sanas.

102



IX. CONCLUSIONES

La regeneración del híbrido 1008157 del género Polianthes fue satisfactoria

únicamente por la técnica de propagación por yemas axilares de la inflorescencia.

No fue posible comprobar que la adición de nitroprusiato de sodio al medio

de cultivo favorece la inducción de embriogénesis somática o estimula la

producción de brotes en el cultivo in vitro del híbrido. Sin embargo, se reporta la

descripción detallada del proceso de desdiferenciación del tejido somático de

plántulas utilizando NPS y picloram en 16 concentraciones diferentes. Por otro

lado, en la producción de brotes, el NPS si tiene un efecto numéricamente mayor

en comparación con el medio sin NPS para una concentración de 40 M.

Debido al crecimiento vigoroso y capacidad de multiplicación del híbrido

1008157 fue posible establecer exitosamente un protocolo de micropropagación

desde el inicio hasta la etapa de aclimatación contribuyendo así en incrementar el

número de plantas existentes del híbrido 1008157.

Este estudio puede servir de referencia para trabajos posteriores en la

propagación de otros híbridos o especies cercanas al género.

103



XI. BIBLIOGRAFIA

Abdullah, S. (2012). Somatic embryogenesis and regeneration of Polianthes

tuberosa L. Universidad de Malaya. Tesis de Maestria. 191 pp

Ahmad, M. S., Ahmad, T., Zaidi, N., y Ahmad, N. I. (2006). High frequency in vitro

propagation of Polianthes tuberosa. Pakistan Journal of Scientific and

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T E S I S · 2016-10-27 · MARGARITA ELIZABETH RICO LEMUS DIRECTOR DE TESIS DR. BENJAMÍN...

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