STICHTING TOEGEPAST ONDERZOEK …...de onzichtbare onderwaterwereld in kaart te brengen en te...

STICHTINGTOEGEPAST ONDERZOEK WATERBEHEER


[email protected] www.stowa.nlTEL 033 460 32 00 FAX 033 460 32 01

Stationsplein 89POSTBUS 2180 3800 CD AMERSFOORT

[email protected] www.stowa.nlTEL 033 460 32 00

Stationsplein 89 3818 LE Amersfoort POSTBUS 2180 3800 CD AMERSFOORT

2018

14

VERKENNING VAN DE POTENTIE VAN METAGENOMICS VOOR MONITORING VAN WATERKWALITEIT

omslagmetagenomics.indd 1 04-04-18 14:13

Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit

2018

14

2 stowa 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit

copyright | teksten uit dit rapport mogen worden overgenomen, mits met bronvermelding. de in

het rapport ontwikkelde, dan wel verzamelde kennis is om niet verkrijgbaar. de eventuele kosten

die stowa voor rapporten in rekening brengt, zijn uitsluitend kosten voor het vormgeven, verme-

nigvuldigen en verzenden.

disclaimer | dit rapport is gebaseerd op de meest recente inzichten in het vakgebied. desalniet-

temin moeten bij toepassing ervan de resultaten te allen tijde kritisch worden beschouwd.

de auteurs en stowa kunnen niet aansprakelijk worden gesteld voor eventuele schade die ontstaat

door toepassing van het gedachtegoed uit dit rapport.

UitgaVe

stichting toegepast onderzoek waterbeheer

postbus 2180

3800 cd amersfoort

aUteUrs | a.a. (aleida) de Vos van steenwijk, orvion (projectleider)

programmacoördinator | Bas van der wal, stowa

website | www.stowa.nl

VormgeVing | Vormgeving studio B, nieuwkoop

fotografie | Bastiaan schuit Fotografie, istock

drUk | dpp, Houten

stowa | 2018-14 | isbn | 978.90.5773.786.2

amersFoort, april 2018

colofon

3Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit | STOWA 2018-14

ten geleide

Inaansluitingopeeneerderonderzoeknaarhetvoorkomenvandegrotemodderkruiperen

de rode Amerikaans rivierkreeft in de Krimpenerwaard (Zuid-Holland) is een oriënterend

onderzoekgedaannaardemogelijkhedendieeenbredeeDNA-screeningbiedtomopsnelle

eneenvoudigewijzeeenbeeldtekrijgenvandebiodiversiteitendewaterkwaliteitindeze

polder.HetonderzoekwerduitgevoerddoorOrvioninsamenwerkingmetRAVON,hetHoog-

heemraadschapvanSchielandendeKrimpenerwaard,deNatuur-enVogelwerkgroepKrimpe-

nerwaard(NVWK),HetZuid-HollandsLandschap(ZHL)enOasenN.V.

Het onderzoek heeft bijgedragen aan de verdere ontwikkeling van de techniek en inzicht

gegevenindemogelijkhedendiedetechniekbiedtbijhetinbeeldbrengenvanorganismen

inoppervlaktewater.

Hetrapportistechnischvanaard.Hetrapportistoeleverendaanvervolgonderzoek.

bas Van der wal

Programmacoördinator

4 STOWA 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit


inhoUdsopgaVe

colofon

ten geleide

h1 introdUctie

h2 achtergrondinformatie dna analysetechnieken en edna methoden

2.1 dna-analysetechnieken

2.2 environmental dna (edna) methoden

h3 bemonstering

h4 ngs analyseresUltaten

4.1 Biodiversiteit

4.2 Vergelijking van monsters

4.3 Vergelijking filter monster met twn lijst

4.4 genetische eigenschappen

h5 discUssie

h6 conclUsies en aanbeVelingen

stowa in het kort

2

3

6

7

7

8

11

12

12

17

18

19

23

26

27


DNAanalysetechniekenmakeneenbijnaonvoorstelbareontwikkelingdoorwelkenog lang

nietisafgelopen.Deeffectenhiervanzijnvoelbaarinveelsectoren,vandemedischeindustrie

totbiologischebodemsaneringen.Warenditenkelejarengeledennogdureencomplexetech-

nieken,inmiddelszijnzeinveelverschillendesectorengangbaarwaardoordeanalyseduuris

verkortendeprijssterkgereduceerd.DNAanalyseskomendaaromookvoorwaterkwaliteits-

monitoringinbeeld.

Hetdoelvanditprojectisomeeneersteverkenningtemakenvanhettypeinformatieover

waterkwaliteitdatmetbehulpvaneenbredeDNA-screeningwordtverkregen.eDNAwordtnu

vooralgebruiktvoormonitoringvanspecifiekesoorten(bijvoorbeelddeGroteModderkruiper)

ofspecifiekegroepen(bijvoorbeeldvissen).VoordezeeDNAbarcodingenmetabarcodingana-

lyseswordteenkleinstukjevanhetDNAvandesoortofgroepwaarmennaaropzoekiseerst

geamplificeerd(vermenigvuldigd)endangeanalyseerd.AlhetoverigeDNAdatinhetwater-

monsteraanwezigiswordtmetdezeanalysesalshetwareweggegooid.Datisjammeraange-

zienhierheelveelinformatieinschuiltoverdewaterkwaliteitendetoestandvanhetecosys-

teem.Inditprojectwordteendoorkijkgegevenvandekansendiedemetagenomicsmethode

biedtvoorhetmonitorenvanwaterkwaliteit.Ditzouenerzijdsmoetenleidentothetverkrij-

gen van meer hoogwaardige informatie over waterkwaliteit en anderzijds een efficiëntere

monitoringintijdenkosten.

Ditprojectistotstandgekomendoordatin2016voorheteerstindeKrimpenerwaardeDNA

onderzoekwerduitgevoerdnaarhetvoorkomenvandegrotemodderkruiper (GMK)enver-

spreidingvanderodeAmerikaanserivierkreeft (RARK)indeuitgestrekteslotenstelsels.Het

onderzoekwerduitgevoerddoorOrvioninsamenwerkingmetRAVON,Hoogheemraadschap

Schieland en Krimpenerwaard (HHSK), de Natuur- en Vogelwerkgroep Krimpenerwaard

(NVWK),HetZuid-HollandsLandschap(ZHL)enOasenN.V.Hetonderzoekisalskansaangegre-

penom,methulpvanSTOWA,teonderzoekenwelkekansenerliggenommeteenbredere

DNA-screeningmeerinformatieteverkrijgenoverdebiodiversiteitenwaterkwaliteit.Hiertoe

iseenKRWmeetpuntindeKrimpenerwaardbemonsterdengeanalyseerd.

Ditrapportisopgebouwduitdevolgendehoofdstukken:

•Inhoofdstuk2wordtachtergrondinformatiegegevenoverDNAanalysetechniekeneneDNA

methoden.

•Inhoofdstuk3staatomschrevenhoedebemonsteringisverlopenenhetwatermonsterin

hetlabisbehandeld.

•Inhoofdstuk4wordendeanalyseresultatengepresenteerdenverderuitgewerktbinnenver-

schillendethema’s.

•Inhoofdstuk5wordenderesultatensamengevatenwordteendoorkijkgegevennaarde

toepassingsmogelijkheden(enonmogelijkheden).

•Inhoofdstuk6wordeneenaantalaanbevelingengedaan.

h1 introdUctie


2.1 dna-analysetechnieken

Hieronderwordteenkorteomschrijvinggegevenvandetechniekenzoalsdezezijngebruikt

binnenditproject.Hetvaltbuitendescopevanditprojectomaldebeschikbaretechniekenen

toepassingenteomschrijvenenvergelijken.

next generation sequencing (ngs)

Omdesamenstellingvanorganismenineenwatermonstermeetbaarenzichtbaartemakenis

binnenditprojectgebruikgemaaktvaneentechniekdieNextGenerationSequencing(NGS)

heet.Hiermeewordenorganismenineenmonstergekarakteriseerdopbasisvanhungene-

tischmateriaal(DNA-code).AangezienallelevendeorganismenuniekDNAbevatten,kanhun

DNA-codewordengebruiktomzevanelkaarteonderscheidenenteidentificeren.

Het DNA dat in de organismen van een watermonster aanwezig is wordt allereerst hieruit

geïsoleerdenopgezuiverd.VervolgenswordendeindividuelestukkenDNA(DNA-fragmenten)

middelsNGSafgelezen,waardoordeDNA-codevanelkfragmentdigitaalbeschikbaarkomt.

VanelkvandezeDNA-codeswordtbepaaldofhetovereenkomtmeteenorganismewaarvande

DNA-codereedsstaatgeregistreerdinpubliekedatabases.Wanneerdithetgevalis,endeze

goedovereenkomen,ishetgeïdentificeerd.

SomskomtdeverkregenDNA-codeovereenmetmeerderesoortenvandezelfdegroep,indat

gevalwordthetDNA-fragmenttoteenlagertaxonomischniveaugeïdentificeerd(bv.genus,

familie,orde,etc.).InditgevalishetDNAnietonderscheidendgenoegomtoteenhogerniveau

teidentificeren.

VanveelorganismenishetDNA(ofgenoom)nognietbekendofgeregistreerdindeonlinedata-

basesenishetdaarommogelijkdateenorganisme(nog)nietkanwordengeïdentificeerdop

basisvanhetDNA.Dedatabasewordtechtersteedssnellergevuldaangeziendekostenentech-

niekendieditmogelijkmakensteedsgoedkoperengangbaarderworden(ziefiguur2.1).

h2 achtergrondinformatie dna analysetechnieken en edna methoden

Tweegrafiekenwaarinwordtweergegeven(links)deafnameinkostenvoorsequencingen(rechts)detoenameinaantal

genomendatisgesequenced.

fig 2.1


VerschillendeNGS-techniekenzijnbeschikbaaren

worden nog doorontwikkeld, elk met hun eigen

voor- en nadelen. Binnen dit project is gebruik

gemaaktvannanoporesequencingmetdeMinION

vanOxfordNanoporeTechnologies(ONT).Dereden

voordezekeuzeisdatdetechnologietoegankelijk

is (geengrote investeringnodig inapparatuuren

laboratoriumruimte), dat de resultaten snel wor-

denverkregen(binnen2dagenishaalbaar)endat

de technologie mobiel is en daarmee niet meer

perségebondenaanspecialistischelaboratoria.

2.2 enVironmental dna (edna) methoden

EnvironmentalDNA(eDNA)iseenmethodeomdeaanwezigheidvansoortenaantetonen.

Nietdoorhetindividuzelfoptezoeken,maardesporenvanDNAteanalyserendieinhet

milieudoordesoortwordenachtergelaten.Waterorganismenendierendievaakinhetwater

zijntevinden,latencontinuDNAinhetwaterachterviabijvoorbeeldfeces,slijmenhuidcel-

len. Door watermonsters te analyseren op DNA specifiek van deze organismen wordt het

mogelijkomhunaanwezigheidaantetonen.EeneDNAaanpakiseenbewezenmethodeom

deonzichtbareonderwaterwereldinkaarttebrengenentemonitoren,hetgeeneenwaarde-

volletoevoegingisaandehuidigemethoden.

VerschillendemethodesbestaanomheteDNAvanorganismenteanalyseren,dezeworden

hieronderkortomschrevenenschematischweergegeveninfiguur2.3.

barcoding middels qpcr

eDNA wordt nu vooral gebruikt voor monitoring van specifieke soorten. Bijvoorbeeld van

zeldzamesoortenalsdegrotemodderkruiperofknoflookpad,ofvanexotenalsderodeAme-

rikaanserivierkreeftofmuskusrat.VooreDNAbarcodingwordteenonderscheidendstukje

vanhetDNA(barcode)vandesoortwaarmennaaropzoekisgeamplificeerd(vermenigvul-

digd)engeanalyseerd.HiervoorwordteentechniekgebruiktdieqPCR(quantitativePolyme-

raseChainReaction)heet.Dezetechniekiszeergevoeligendaarmeeuitermategeschiktom

diersoortenaantetonenwaarvanweinigeDNAaanwezigisinhetwater.EenqPCRreactieis

bovendiensnelengoedkoopuittevoeren.Hetnadeelisdatvoorelkesoorteenaparteanalyse

moetwordenuitgevoerd,daarmeeisdezetechnieknietgeschiktomeenbredescreeninguit

tevoerenenmoetvantevorenwordenbepaaldwelkesoortenmenwilmonitoren.

metabarcoding middels ngs amplicon sequencing

eDNAwordtookgebruiktomsoortenlijstentegenererenbinneneenspecifiekegroep,zoals

bijvoorbeeld van vissen of amfibieën. Voor deze eDNA metabarcoding analyses wordt een

onderscheidendstukjeDNA(barcode)vandegroepeerstgeamplificeerd(vermenigvuldigd).

Aldevermenigvuldigde stukjeswordenvervolgensafgelezenmeteenNGS-techniekomte

identificerenvanwelkesoortbinnendegroepheteDNAafkomstigis.Deuitdagingisomeen

stukDNAtevindendatzowelonderscheidendisvoordegroep(bv.datvissenonderscheidt

DeMinIONsequencer(ziegroenepijl)ingebruik

ophetkantoorvanOrvion.

fig 2.2


vanalleanderesoorten),als(naamplificatie)voldoendeonderscheidendDNAoplevertzodat

deindividuelesoortenbinnendiegroepkunnenwordengeïdentificeerd.Dezeaanpakisook

bruikbaarvoorsoortenwaarweinigDNAvanaanwezigisomdatheteerstwordtvermenigvul-

digd.Metéénanalyseishetmogelijkomeensoortenlijsttegenereren.Dekostenpermonster

liggenhogerdanvoordeqPCR,echterwordtookmeerinformatieverkregen.Indepraktijk

blijktdatnietallesoortenindeanalyseswordenmeegenomenofvanelkaarzijnteonder-

scheiden.Voorelkegroep(bv.bacteriën,algen,vertebraten,vissen,amfibieën,etc.)wordteen

aparteanalyseuitgevoerd.Vooreencompleteanalysevanallesoortenbinnenallegroepenis

dezeaanpakkostbaarenomslachtig.

metagenomics middels ngs

HetisookmogelijkomalhetDNAinuiteenwatermonsterinéénkeer(direct)aftelezen,

zonderdatheteerstwordtvermenigvuldigd.Hiermeewordteenbredescreeninggemaakt

vanalhetlevenineenwatersysteem.NietalleenhetDNAvanhogeresoortenwordtmeegeno-

men, maar ook van organismen die onzichtbaar zijn zonder een microscoop (bacteriën,

macrofauna,algen,etc.).

schematische weergaVe Van de Verschillende technieken

Dezetechniekenwordeningezetvoormonitoringvanwaterorganismen.BarcodingmiddelsqPCRgeeftinzichtinéén

soort.Metmetabarcodingwordteensoortenlijstvaneenspecifieke(genetischverwante)groepgegenereerd.Metmeta-

genomicswordtinzichtverkregeninallesoortenineenmonster,achterafkunnenverschillendesoortenlijsten(ofande-

reeigenschappen)wordengegenereerd.

fig 2.3

stowa 2018-14 | Verkenning Van de potentie Van metagenomics Voor monitoring Van waterkwaliteit10

Hetvoordeelvandezeaanpakisdatvantevorengeenselectiegemaakthoefttewordenvande

organismendiemenwilmeten.Eenbredescreeningwordtgemaaktmetslechtséénanalyse.

Eenmogelijkeeffect(bias)alsgevolgvanvermenigvuldigingvanhetDNAwordthiermeevoor-

komen.Bovendiengaandegenetischeeigenschappen(zoalsantibioticaresistentie,metabolis-

me,etc.)dieookophetDNAgecodeerdzijnnietverlorenmetdezeaanpak,ietsdatdoorver-

menigvuldigingwelgebeurd.

EennadeelvandezeaanpakisdatDNAdatinzeerlageconcentratiesvoorkomtmogelijkniet

meerterugwordtgevonden.Degrotehoeveelhedendatadiewordengegenereerdbevatten

zeerveelnuttigeinformatie,echtervormthetverwerkenhiervaneenIT-uitdaging.

Binnenditprojectisvoordezemethodegekozenomeenverkenningtemakenvanhettype

informatiedathiermeewordtgegenereerdenwelkekansenerliggenvoorwaterkwaliteits-

monitoring.


NaoverlegmetHHSKiseenKRWmonsternamelocatiegeselecteerdombinnenditproject

mee tenemen.Hetmonsternamepunt ligtdichtbijeengemaalwatalsmogelijkvoordeel

heeftdatheteDNAvanuiteengrotergebiedvandepolderdaarsamenkomt(ziefiguur3.1).

Bovendienblijkthet(opbasisvaneerdereKRW-metingen)eensoortenrijkelocatietezijn(zie

tabel3.1).

Delocatieisop1november2016bemonsterddoorOrvion,hierbijzijnnietdeofficiëleKRW

richtlijnengevolgd.Deelmonsterszijnvanhettrajectgenomenomde100mopverschillende

plekken(middenindeslootentussenhetriet)enverschillendedieptes.Vandezemonstersis

éénmengmonstergemaaktdatdirectinbehandelingisgenomeninhetlaboratoriumvan

Orvion.

Hetbemonsterdewaterisvervolgensophetlaboptweemanierenvoorbehandeld:

1200mlvanhetwaterisgefiltreerdovereen0,2μmmembraanfilteromdeaanwezigeorga-

nismenuithetwateropteconcentreren.Uitdeorganismendieophetfilterzijnachterge-

blevenisvervolgenshetDNAgeëxtraheerd(monstercodeS534D01 - filter).

2200mlvanhetwaterisafgedraaidineencentrifugeomdeaanwezigeorganismentecon-

centreren.Degevormdepelletmetcellen/organismenisgebruiktomeenDNA-extractieuit

tevoeren(monstercodeS534D03 - pellet).

h3 bemonstering

39_25DN3

39_25DN1

39_22BA3

39_25DN2

39_22BA1

39_22BA2

39_23DHS2

39_23DHS1

39_23DHS3

39_20KGZ539_20KGZ6

39_20KGZ4

KRWlocatiedieisbemonsterddoorOrvionop1november2016.fig 3.1

monsternamepunt X-coörd Y-coörd # macroFauna- soorten #macroFauna indiViduen

39_20kgZ4 105120 436908 101 1866

gegeVens Van de bemonsterde krw-locatie Zoals aangeleVerd door hhsk.tabel 3.1


h4 ngs analyseresUltaten

DeDNA-extractenvandetweedeelmonsterszijngeanalyseerdmiddelsNGS(MinIONvanONT),

hiervoorisgeenamplificatiestapuitgevoerd,maarishettotaleDNAgeanalyseerd(ziepara-

graaf2.2).Indeoffertestaatgenoemddatdriemonsterszoudenwordengeanalyseerd,echteris

inafstemmingmetBasvanderWalbeslotendathetvanmeerwaardewasomextraeffortte

stoppenindeBio-ITenrapportagevandedata.Vandaardattweemonsterszijngeanalyseerd.

DeverkregendigitaleDNA-codesvanaldefragmentenzijnmetdoorOrvionontwikkeldeBio-

ITsoftwarevergelekenmetonlinepubliekedatabasesomtebepalenmetwelkedezehetbeste

overeenkomtof-komen.Deinstellingenindesoftwarebepalenaanwelkecriteriaeenmatch

moetvoldoenomtewordengeaccepteerd.

Vervolgenswordtdedataopgeschoond,dithoudtindatsoortendieminderdanvijfkeerzijn

geïdentificeerduitdedatawordengefilterdaangeziendezealsruiszijntebeschouwen.De

zoogdieren(Mammalia)zijninditgevalookuitdedatagefilterdaangeziendeidentificatieop

basisvanhettotaleDNAnognietbetrouwbaaris.Eenaantalvirussenenfagenzijnaangetoond

indedata,alzijndezenietmeerdanvierkeerteruggevondenendaaromuitdedatasetsgefil-

terd.Dealgemeneanalyseparameterswordenintabel4.1weergegeven.

Deverkregendatazijnopeenaantalmanierengeanalyseerdengeïnterpreteerd.Hetdoelisom

telatenzienopwelkemanierendezelfdedatasetkanwordenbenaderdengeanalyseerden

welkedatainhetDNAzitopgesloten

4.1 biodiVersiteit

Degeïdentificeerdesoorten(biodiversiteit)zijnzichtbaargemaaktineeninteractiefdiagram

(Krona)enineenExcelbestand.MetdeinteractieveKronadiagrammeniseenvisueeloverzicht

gegevenvandebiodiversiteit.Hiermeeisheteenvoudigomnaarspecifiekesoortentezoeken

ofdoordebiodiversiteitheente‘browsen’.Dooropeengroeptedubbelklikkenwordthierop

ingezoomd(meerdetail).Doorinhetmiddenteklikkenophetgewensteniveauwordterweer

uitgezoomd.

monster omscHrijVing (i) dna (ii) # dna- (iii) # Fragmenten (iV) # taXonomiscHe

concentratie Fragmenten geïdentiFiceerd eenHeden

(μg/ml) (reads) (reads) geïdentiFiceerd

s534d01 gefiltreerd 13,5 150.011 Voor: 5.929 155

na: 4.317

s534d03 gecentrifugeerd 32,8 248.717 Voor: 8.997 287

na: 6.924

algemene analysegegeVens Van de twee monsters.

(I)deconcentratievanhetgeëxtraheerdeDNA,(II)HetaantalDNA-fragmentendatdoordeMinIONisgedecodeerd(III)

HetaantalDNA-fragmentendatovereenkomtmetDNAindereferentiedatabases(voorennahetopschonenvande

data)(IV)aantaltaxonomischeeenhedendiezijngeïdentificeerdnahetopschonenvandedata.

tabel 4.1


DeExceldocumentenbevattendesoortenlijstwaaropdeKrona’szijngebaseerd.Hierinisper

soort/groepaangegevenhoeveelDNA-fragmentenzijngeïdentificeerdenwelkpercentagevan

hetgeheelditbetreft.InExcelisheteenvoudigomdedatatebewerken(sorteren,filterenen

kopiëren).

Devolgendezesfileszijndigitaalbeschikbaargesteldmetditrapportofzijnoptevragenvia

Orvion:

•Exceldocumentmetdatavanhetgefiltreerdemonster:

20171219_M14-S534D01-filter_P0180.xlsx

•Kronadiagramvandebacteriëninhetgefiltreerdemonster:

20171219_M14-S0534D01-bacterien-filter_P0180.html

•Kronadiagramvandeeukaryoten(zonderzoogdieren)inhetgefiltreerdemonster:

20171219_M14-S0534D01-eukaryoten-filter_P0180.html

•Exceldocumentmetdatavanhetgecentrifugeerde monster:

20171219_M15-S537D03-pellet_P0180.xlsx

•Kronadiagramvandebacteriëninhetgefiltreerdemonster:

20171219_M15-S0534D03-bacterien-pellet_P0180.html

•Kronadiagramvandeeukaryoten(zonderzoogdieren)inhetgefiltreerdemonster:

20171219_M15-S0534D03-eukaryoten-pellet_P0180.html

Debiodiversiteitresultatenzijnhierondervoordetweemonstersnaderuitgewerkt.

gefilterde watermonster (filter)

DeverkregendatazijnopgesplitstinBacteriënenEukaryoten.Intabel4.2iseenoverzichtgege-

venvandetop3aangetoondegeneravanbeidegroepen.Infiguur4.1iseenscreenshotweerge-

gevenvandebiodiversiteitKronafilesvandebeidegroepen.

# dna- %-age Van omscHrijVing

Fragmenten totaal

prokaryoten

Limnohabitans sp. 448 7,56 Veel aangetroffen bacterieel genus in

zoetwater (meren, sloten, etc.), zeer

diverse ecofysiologie. Facultatief aeroob.

Flavobacterium sp. 235 3,96 Breed aangetroffen in milieu (water en

bodem). aeroob, chemoheterotroof.

Polynucleobacter sp. 129 2,18 Veel aangetroffen bacterieel genus in

zoetwater (meren, sloten, etc.),

eukaryoten

Thalassiosira sp. 40 0,67 diatomeeën/kiezelwieren

Sterkiella sp. 12 0,20 ciliaten

Spirogyra sp. 11 0,19 groene algen

top 3 Van aangetroffen bacteriën en eUkaryoten in het gefiltreerde watermonster

(filter) die tot genUsniVeaU Zijn geïdentificeerd.

tabel 4.2


screenshots Van de krona’s Voor het gefiltreerde watermonster (filter).

AfbeeldingAvandebacteriënenafbeeldingBvandeEukaryoten.DeinteractieveKrona’szijnmetditrapport

meegestuurd.

fig 4.1

gecentrifugeerde watermonster (pellet)

DeverkregendatasetvandepelletisgefilterdomonderscheidtemakentussenProkaryoten

(ArchaeaenBacteriën)enEukaryoten.Intabel4.3iseenoverzichtgegevenvandetop3aange-

toondegeneravanbeidegroepen.

a

b


discussie van de biodiversiteitresultaten

CentrifugerenresulteertineenhogereconcentratieDNA,aantalDNA-fragmentenenaantal

taxonomischeeenhedenen lijktdaarmeeeenbetereprocedurevoordit typeanalyses.Dit

heeftechternauwelijksverschilgemaaktindedominantaangetroffensoortentussendetwee

monsters.Welblijktdateenaantalsoortensignificantmeerzijnaangetroffeninhetgecentri-

fugeerdemonsterdaninhetgefiltreerdemonster,ditwordtnadertoegelichtinparagraaf4.2.

OpvallendisdatveelvanheteukaryootDNAnietkanwordengeïdentificeerd(meerdan30%).

Ditkomtwaarschijnlijkdoordatnogmaarweiniggenomenvanhogereorganismeninderefe-

rentiedatabaseszijnopgenomenendoordathogereorganismenveelmeerDNAmetzichmee-

dragendanprokaryoten.VeelvanditDNAisnietuniekenonderscheidendvooreensoort

waardoor identificatie niet mogelijk is. Zo zijn bijvoorbeeld een aantal soorten geïdentifi-

ceerdwaarvanwezekerkunnenzijndatdezenietinhetwateraanwezigzijn,zoalsDNAvan

deorang-oetangofvandeTibetaanseantilope.

Ookzijneenaantalvissoortengeïdentificeerd(bijvoorbeelddekarperendriedoornigestekel-

baars),maarsteedsmetslechtséénDNA-fragmentwaardoordeidentificatienietbetrouw-

baargenoegisommeetenemeninderesultaten.OokisbijvoorbeeldéénDNA-fragmentvan

eenkikkersoortteruggevonden-Nanoranaparkeri-ditiséénvandeeersteamfibieënwaarvan

hetgenoomisgesequenced.HetstukjeDNAdatinonzedatasetisgevondeniswaarschijnlijk

generiekvooramfibieën/kikkers,wantdezespecifiekekikkersoortkomtnietinWest-Europa

voor.

Vooralkleinemicro-organismenwordenindedatasetsteruggevonden,dithoudtindesoor-

tendieinhetgeheelwordenbemonsterd(bacteriën,macrofauna,etc.)ennietlossecellenin

lageconcentratiesvanhogereorganismen(eDNA).Vandemicro-organismenisdeidentifica-

tieookbeteraangezienmeerDNAinhetmonsteraanwezigisendereferentiedatabasesbeter

zijngevuld.

# dna- %-age Van omscHrijVing

Fragmenten totaal

bacteriën

Flavobacterium sp. 744 8,29 Veel aangetroffen bacterieel genus in

zoetwater (meren, sloten, etc.), zeer

diverse ecofysiologie. Facultatief aeroob.

Limnohabitans sp. 519 5,78 Breed aangetroffen in milieu (water en

bodem). aeroob, chemoheterotroof.

Polynucleobacter sp. 132 1,47 Veel aangetroffen bacterieel genus in

zoetwater (meren, sloten, etc.),

eukaryoten

Thalassiosira sp. 40 0,67 diatomeeën/kiezelwieren

Sterkiella sp. 12 0,20 ciliaten

Spirogyra sp. 11 0,19 groene algen

top 3 Van aangetroffen bacteriën en eUkaryoten in het gecentrifUgeerde watermonster (pellet)

die tot genUsniVeaU Zijn geïdentificeerd.

tabel 4.3


screenshots Van de krona’s Voor het gecentrifUgeerde watermonster (pellet).

AfbeeldingAvandebacteriënenafbeeldingBvandeEukaryoten.DeinteractieveKrona’szijnmetditrapport

meegestuurd.

fig 4.2

a

b


screenshot Van een krona waarin de genera worden afgebeeld die alleen in het filtermonster

Zijn aangetroffen (a) en die genera die alleen in het pelletmonster Zijn aangetroffen (b).

fig 4.3

4.2 Vergelijking Van monsters

Doordatalledatadigitaalwordengegenereerdishetmogelijkommetalgoritmesdemon-

stersmetelkaartevergelijken.Bijvoorbeeld,welkesoorten/genera/familieszijninbeidemon-

stersaangetoondenwelkezijnenkelindeéén,maarnietindeanderaangetoond?Terillustra-

tiestaatinfiguur4.3weergegevenwelkegeneraalleeninhetfilterofjuistalleenindepellet

zijnaangetoond.

a

b


Zoalsverwachtzijnmeersoortenalleenindepelletaangetoonddandiealleeninhetfilter

zijnaangetoond.Aangezienuitdepelletongeveer2,5keermeerDNAisgeëxtraheerddanuit

hetfilterisdeverwachtingdatsoortendieindepelletmetweinigDNA-fragmentenzijnaan-

getoondnietinhetfilterzijnteruggevondendoordatdezeonderdedetectielimietblijven.Dit

isvoordemeestegeneraookhetgeval,zezijnopbasisvangemiddeld11,8DNA-fragmenten

(0,13%vantotaal)geïdentificeerdendaarmeenietdominantaanwezig.Erzijntweegroepen

dieechteropvallen,Rhodobacterspp.(106DNA-fragmentenoftewel1,18%)endegroepvande

Sphingomonadaceae (118 DNA-fragmenten oftewel 1,31%) bestaande uit Sphingopyxis spp.,

Novosphingobiumspp.enSphingomonasspp.

VanShingopyxisalaskensis isbekenddatheteenultramicrobacteriumismeteenzeerklein

volumevan0,1μm3welkedooreen0,2μmfilterheenkangaanendusnietindeanalysevan

het filterwordtmeegenomen.Door te centrifugerenwordtdezeechterwelmeegenomen.

Mogelijkisditookhetgevalvoordeoverigesoorten,alzijndeze(voorzoverbekend)nietaan-

gemerktalsultramicrobacteria.

Dezevergelijkinglaatziendatheteenvoudigisomsignificanteverschillentussenmonsters

inzichtelijktemakenmetdezemethode.Ditgeldtookvoorhetvergelijkenvanvelemonsters

omopdezemaniersignificanteverschillenenovereenkomstenaantetonen,bijvoorbeeldin

detijd,inlocatiesofwatercondities.

4.3 Vergelijking filter monster met twn lijst

DeTaxaWaterbeheerNederlandbestaatuiteenaantallijsten(TWN-lijst),waarinalleorganis-

menzijnopgenomendievoorhetwaterbeheerrelevant(kunnen)zijn.Ditkunnenduszowel

aquatischealssemi-aquatischealsookniet-aquatischeorganismenzijn.

DedatadiezijnverkregenvoorhetfiltermonsterzijnmetdeTWNlijstvergelekenomtebepa-

lenwelkesoortendieindeTWN-lijstzijnopgenomeninhetwatermiddelsNGSterugzijn

gevonden.DeTWN-lijstisbegin2017gedownloadviahttp://sofus.ecosys.nl/Taxus/Downloads/Taxa-

lists/TWNList.XLS.VoordevergelijkingisgebruikgemaaktvandeEukaryotendieinhetwater

zijnaangetroffen,deBacteriënzijnbuitenbeschouwinggelaten.Erisnietgecontroleerdop

eventueleverschilleninnaamgevingofandereafwijkingentussendetweedatasets,hetkan

daaromzijndatbepaaldeovereenkomstennietzijnmeegenomen.DetaxadiemetdeMinION

zijngeïdentificeerddieookindeTWN-lijstvoorkomenstaanweergegevenintabel4.4.

MindersoortenopindeTWN-lijstzijnopbasisvanhetDNAgeïdentificeerddande101soor-

tendiemetdereguliereKRW-monitoringzijnbepaald(zietabel1).Zoalseerderalomschre-

venheeftditvooraltemakenmethetfeitdatnogmaarweiniggenomenvanEukaryoteninde

referentiedatabaseszijnopgenomen.Bovendienisnietbekendhoegrootheteffectvande

bemonsteringisgeweest(dezeisnietvolgensKRW-richtlijnenuitgevoerd)ofhetfeitdatdeze

opeenandermoment(jaarenseizoen)isgenomen.

ZoalsverwachtzijnopbasisvanhetDNAwelveelbacteriëngeïdentificeerd,dezestaanechter

nauwelijks(oftotzeerlagetaxonomischeeenheid)indeTWN-lijstopgenomen.


MindersoortenopindeTWN-lijstzijnopbasisvanhetDNAgeïdentificeerddande101soor-

tendiemetdereguliereKRW-monitoringzijnbepaald(zietabel3.1).Zoalseerderalomschre-

venheeftditvooraltemakenmethetfeitdatnogmaarweiniggenomenvanEukaryoteninde

referentiedatabaseszijnopgenomen.Bovendienisnietbekendhoegrootheteffectvande

bemonsteringisgeweest(dezeisnietvolgensKRW-richtlijnenuitgevoerd)ofhetfeitdatdeze

opeenandermoment(jaarenseizoen)isgenomen.

ZoalsverwachtzijnopbasisvanhetDNAwelveelbacteriëngeïdentificeerd,dezestaanechter

nauwelijks(oftotzeerlagetaxonomischeeenheid)indeTWN-lijstopgenomen.

4.4 genetische eigenschappen

DoordathettotaleDNAvandealleorganismenindeanalysewordtmeegenomen,engeen

gebruikwordtgemaaktvanamplificatiestappen,wordthetmogelijkomnietalleendebiodi-

versiteittemeten,maarookdeaanwezigegenetischeeigenschappen.Ditwilzeggendatniet

alleenwordtbepaaldwieerzijn,maarookwatzekunnendoen.

Dedatasetvandepelletis,terillustratie,gescreendopdeaanwezigheidvanantibioticaresis-

tentiegenen(ARG).Dedatazijnnietverdergevalideerdenkandaaromnietalsdiagnosewor-

denbeschouwd,hetisbedoeldomteillustrerenwelketypeinformatieindedatazitopgeslo-

ten.OmspecifiekdedatasettescreenenopdeaanwezigheidvanARGisgebruikgemaaktvan

deCARDreferentiedatabase(TheComprehensiveAntibioticResistanceDatabase-https://card.

mcmaster.ca/).Deaangetroffengenendiemeerdantweekeerzijnaangetroffenstaanomschre-

venintabel3.1.

# Fragmenten %-age Van totaal naam taXontYpe (uit twn) taXon niVeau

109 1,8 Thalassiosirales diatomeeën ordo

137 2,3 Bacillariophyta diatomeeën divisio

14 0,24 Thalassiosira pseudonana diatomeeën species

11 0,19 Spirogyra maxima Fytoplankton species

40 0,67 Thalassiosira diatomeeën genus

9 0,15 Daphniidae Zoöplankton Familia

55 0,93 Thalassiosiraceae diatomeeën Familia

8 0,13 Thalassiosira weissflogii diatomeeën species

7 0,12 Cryptophyta Fytoplankton phylum

14 0,24 Anomopoda Zoöplankton cladocera

6 0,10 Tintinnida Zoöplankton ordo

5 0,08 Brachionus calyciflorus Zoöplankton species

taxa die Zowel in het filter als in de twn-lijst Voorkomen.

Hetaantalfragmentenenpercentagevanhettotaalstaanookgenoemd.Hettaxontypeentaxonniveauisuitde

TWN-lijstovergenomen.

tabel 4.4


gen naam Biedt resistentie tegen omscHrijVing (engels) # Fragmente

mexk tetracycline, erythromycine, inner membrane resistance-nodulation-cell 6

triclosan division (rnd) transporter in the mexjk

multidrug efflux protein

ceoB aminoglycoside, ceoaB is an rnd efflux system that 3

fluoroquinolone confers multidrug

resistance in Burkholderia cenocepacia

nova novobiocin a type iii aBc transporter, identified 3

on the novobiocin biosynthetic gene

cluster, involved in the transport and

resistance of novobiocin.

mexn thiamphenicol, mexn is the inner membrane transporter of 3

chloramphenicol the mexmn-oprm multidrug efflux complex

antibiotica resistentiegenen die meer dan twee keer in de dataset Zijn aangetroffen

op basis Van een screening met de card referentiedatabase.

tabel 4.5

BinneneenanderprojectvanOrvionisvaneenRWZIhetinfluent(ruwrioolwater)enhet

effluent(nazuivering)gescreendopdeaanwezigheidvanARG.Dezetweemonstersbevatten

significantmeerARGdanditslootwatermonster(ziefiguur4.4).Inhetinfluentzijntoen63

verschillendeARGaangetoondeninheteffluentnog30ARG.Inditslootwatermonsterzijn

vierARGaangetoond,inhoeverredezeARGvannaturevoorkomen(ARGisdeelseennatuur-

lijkafweermechanismeinbacteriën)ofdoorexternefactorenaanwezigzijnzounaderonder-

zochtmoetenwordenomtebepaleninhoeverreantibioticaresistentieviahetoppervlaktewa-

terwordtverspreid.

Enkeleanderevoorbeeldenvangenetischeeigenschappenvanhetecosysteemdiemetdeze

datakunnenwordenverkregenzijn:

•pathogeniciteits- en/of toxiciteitsgenen (bijvoorbeeld van blauwalgen, ziektemakers voor

mens,dieren/ofplant),

•specifieke metaboleprocessen (bijvoorbeeldnitrificatie (omzettingvanammoniumnaar

nitraat),denitrificatie(omzettingvannitraatnaarstikstofgas),methaanproductie,afbraak

vanspecifiekestoffen),

•matevanaerobie/anaerobie(aeroob,microaerofiel,nitraatreducerend,sulfaatreducerend,

etc.).

TotnutoewordtvooralhetDNAvanwatermonstersgeanalyseerd.Hetisechterookmogelijk

omhetRNAopdezelfdewijzemetNGSteanalyseren.RNAiseenvormvanDNAdatalleen

wordtgeproduceerdwanneereengenactiefis,hetRNAvormthetsjabloonvoorhetcorres-

ponderendeeiwit/enzym.RNAisdaaromeenmaatvooractiviteitaangezieneencelinprinci-

pealleenRNAzalproducerenwanneerhetcorresponderendeenzymnodigis.DoorRNAte

metenwordtdaarominformatieverkregenoverwieineenmonsteractiefzijnenwatzeaan

hetdoenzijn.Ditbiedtextramogelijkhedenomvaneenwatersysteemtebepalenwatdeactu-

elestatusis.


referentiedatabase naturalis

MethetprojectDNAWaterscanontwikkelenNaturalisenKWReengenetischemethodevoor

dedetectieenmonitoringvanaquatischemacrofaunaindicatorsoorten,die(mede-)bepalend

zijnvoordeecologischewaterkwaliteit,volksgezondheid(muggen)ofschade(exoten).

Naturalisenpartnershebbendegenetischecodevanverscheidenesoortengesequenceden

eenreferentiedatabaseopgesteld.Aangeziendedatabase (nog)nietpubliekbeschikbaaris,

heeftNaturalisdedatasetvanhetfiltermonstervanOrviontegenhuneigendatabaseaange-

houdenmethuneigenBio-ITsoftware.Hetdoelwasomtebepalenofdoorgebruiktemaken

vaneenanderereferentiedatabasemeerdataoverhetwatermonsterbeschikbaarkomt,met

namevandemacrofauna.

1 de Vos van steenwijk, a., godschalk, F.d., van Bemmel, m., van loosdrecht, m. next-generation dna-monitoringstechnieken voor het nieuwe zuiveren H2o-online. H2o-online / 9 januari 2017

antibiotica resistentiegenen (arg).

Dieinhetinfluent(blauw)eninheteffluent(groen)zijnaangetoond.ZiehetbijbehorendeartikelinH2Ovoormeer

informatie1.

fig 4.4


Hetblijktechterdat,omwillevaneenaantalfactoren,dedatanietdirectbruikbaarisbinnen

ditproject.Ditonderanderedoordatniethethelegenoomvandemacrofaunasoorten is

gesequencd,maareenbarcode(hetCOI-gen)vandesoorten.BovendienmaaktOrviongebruikt

vaneenanderesequencingtechnologie(MinIONvanONT)danNaturalis(Illumina)watande-

redataverwerkingenBio-ITtoolsvereist.Kortom,deinformatieverkregendoortevergelijken

metdereferentiedatabasevanNaturaliskon(nog)nietbinnenditprojectwordenmeegeno-

men.


Devolgendepuntenwordenindithoofdstuknadertoegelichtenbediscussieerd:

•Monitoringprokaryoten

•Monitoringhogereorganismen

•Behoudenbeheervandata

•Monsterconserveringen-opslag

•Ontwikkelingenintechnologieendatabases

•Onmogelijkhedenvandemethode

kansen voor monitoring prokaryoten

BacteriënenArchaea(deProkaryoten)zijnzeerdiversenaangepastaanhunomgeving.Deze

groeporganismenreageertsnelopveranderendecondities,veelalsnellerdanmeercomplexe

organismen.Desamenstellingvanprokaryotengeeftdaarominformatieoverdetoestandvan

hetwater,alsgevolgvanbijvoorbeeldorganischestofgehalte,zuurstofconcentratie,stikstof

(ammonium,nitriet,nitraat)enmogelijkookvanspecifiekeverontreinigingen.

Voorheenwashetnietmogelijkomdeprokaryotenindetailincomplexeecosystementeana-

lyseren aangezien de technieken hiervoor niet beschikbaar waren of te kostbaar waren.

Ondertussen is dit wel mogelijk en kan deze groep organismen een belangrijke bron van

informatievormen.Dereferentiekadersontbrekenechternogomopbasisvandebacteriële

biodiversiteitenaanwezigeeigenschappeneenuitspraaktedoenoverdewaterkwaliteit.

Eenaantalthema’swaarvoorditwelmogelijkiswordenhieronderkortomschreven.

Fecale indicatoren:Specifiekebacteriënkomenalleenvoorindefecesvanwarmbloedigedie-

ren.Dezewordendaaromgebruiktalsindicatorvoorfecalebesmettingvanwater.Denormis

nogaltijdomEscherichiacolientotaalcoliformenoptekweken.Anderefecaleindicatororga-

nismenzijnechterbekenddiemeerwaardevolleinformatiekunnengevendoordatzespeci-

fiekzijnvoorbepaaldediersoorten.Doordezeaantetonenwordtdaaromnietalleeninfor-

matieverkregenoverhetoptredenvanfecalebesmettingen,maarookwaardebesmetting

vandaankomt.Isdebesmettingbijvoorbeeldafkomstigvandemens(RWZIofriooloverstort),

vankoeien,varkensofvogels?Dithelptinhetnemenvanpreventievemaatregelenomtoe-

komstigebesmettingentevoorkomenendewaterkwaliteitteverbeteren.DeDNA-datasetvan

eenmonsterkanopaldezefecalesoortenwordengescreend.Overigensisinditprojectver-

kregendatasetsgeenDNAvanfecaleindicatororganismenbovendedetectielimietterugge-

vonden.

Blauwalgen (cyanobacteriën) en pathogenen:Dedatakunnenwordengescreendopsoorten

waarvan bekend is dat ze gezondheidsrisico’s met zich meebrengen. Te denken valt aan

blauwalgenenziektemakers(voormens,planten/ofdier).Doordatdegenetischeeigenschap-

penmeewordengenomenzouspecifiekgescreendkunnenwordenopdeaanwezigheidvan

toxiciteitsgenenofpathogeniciteitsgenen.Cyanobacteriëndieindedatasetszijnaangetrof-

fenzijn:

•Calothrixsp.

•Nostocsp.

•Cyanobiumsp.

h5 discUssie


Antibioticaresistentiegenen: Zoals beschreven (zie paragraaf 4.4) kan het DNA ook worden

gescreendopdeaanwezigheidvanantibioticaresistentiegenen(ARG).Dedatakunnenwor-

dengebruiktomhetontstaanendeverspreidingvanantibioticaresistentieinhetmilieute

monitoren.

Virussen: HetismogelijkommetDNA-techniekenookvirussenenfagen(virussenspecifiek

voorbacteriën) tekarakteriseren.Bijbemonsteringenanalysevanditmonster ishierniet

specifiekrekeningmeegehouden,tochzijneenaantalvirussenenfageninlageaantallen

(1of2fragmenten)aangetoond.HetbetreffenDNA-virussenaangeziendeanalyseisuitge-

voerdopDNAennietopRNA.Eenaantalvoorbeeldenvanaangetroffenvirussen/fagenstaan

hierondergenoemd:

•ParameciumbursariaChlorellavirus:infecteertgroenealgen

•Chrysochromulinaericinavirus:infecteertgroenealgen

•MycobacteriumphageTonenili:infecteertMycobacteriën

monitoring van hogere organismen

Zoalsreedseerdergenoemdisgeblekendatdezeaanpaknietdirectbruikbaarisvoorhetana-

lyserenenmonitorenvanhogereorganismen.Vandesoortendiekleingenoegzijnominzijn

geheelindebemonsteringmeetewordengenomeniswelvoldoendeDNAbeschikbaar,echter

zijndereferentiedatabasesnognietvoldoendegevuldomdezenauwkeurigteidentificeren.

Nadrukmoetliggenophetvullenvandedatabasesmetcompletegenomenvan,voorwater-

kwaliteit,significanteorganismen.

VandesoortenwaarvanenkelheteDNAwordenbemonsterd(zoalsvissen,amfibieën,zoog-

dieren)isgeblekendatmetdezemethodeonvoldoendedatawordtgeproduceerd.Bovendien

geldtookvoordezesoortendatdereferentiedatabasesnogonvoldoendecompleetzijn.Een

combinatievantechniekenzouhierinuitkomstbieden,zokanvaneenmonsterzowelhet

totaleDNA(dezemethode)alshetgeamplificeerdeDNAvoorspecifiekehogereorganismen

(ampliconsequencing,zieparagraaf2.2)wordengeanalyseerdindienaanvullendeinformatie

nodig/wenselijkis.

behoud en beheer van data

ZoalsinhetvoorgaandehoofdstukisgedemonstreerdkunnendeDNA-datadiepermonster

worden gegenereerd op verschillende manieren worden geanalyseerd en geïnterpreteerd

afhankelijkvanhetdoelendevraagstellingen.Dedigitaledatablijvenbehoudenenkunnen

ookjarenlateropnieuwwordengeanalyseerdopbasisvandenieuwsteinzichten.Zoishet

dusmogelijkom‘terugindetijd’,opbasisvannieuweinzichten,monstersteanalyseren.

HetDNAdatpermonsterwordtverkregenblijftvelejarenstabielwanneerhetbij-80°Cwordt

opgeslagen.Indienbijvoorbeeldeennieuwe,verbeterdetechnologiewordtontwikkeldishet

mogelijkomookhetDNAterugindetijdteanalyseren.

Het opslaan en beheren van de data vormt een belangrijk aandachtspunt. Ook is het van

belangdatdedatavooreindgebruikers,maarookvoorhetpubliekenanderebelanghebben-

den,wordenontslotenenvisueelwordengemaakt.


monsterconservering en -opslag

OmdatDNA-analysesnietafhankelijkzijnvanlevende,ofzelfsintacte,organismenworden

deteanalyserenwatermonstersinhetvelddirectgeconserveerd.Opdezemanierblijvende

monstersrepresentatiefvoorhetbemonsterdesysteemzonderdatergegevensverlorengaan.

Demonstershoevennaconserveringniettewordengekoeldofdirectinbehandelinggeno-

menteworden,maarkunneneenaantalweken/maandenwordenopgeslagen.Ditbetekent

datdelogistiekeenvoudigisenmonsterskunnenwordenopgespaardindiendatwenselijk/

nodigis.

ontwikkelingen in technologie

Sequencing-techniekenzijnalvergaandgeautomatiseerd(bijvoorbeelddoorrobotisering)en

deverwachtingisdatditalleenmaarverderzalwordengeautomatiseerd.Ditbetekentdat

hetmogelijkisomveelmonstersinparallelinbehandelingtenemen(high-throughput)ende

doorlooptijdsterkwordtverkort.Bovendienwordtdeafhankelijkheidvanbeschikbareen/of

gespecialiseerde manuren veel kleiner. Voor relatief eenvoudige analyses en interpretaties

zijndoorlooptijdenvanminderdaneenweekhaalbaar.

Eenandereontwikkelingisdatdetechnologieindetoekomstookinhetveldkanworden

toegepast.Voorspecifieketoepassingenbiedtditkansenaangezienergeenafhankelijkheid

meer isvangespecialiseerde laboratoriaen/ofspecialistischewerknemers.Dedataworden

digitaal verkregen en kunnen eenvoudig via internet worden verstuurd naar een centraal

puntvoorverdereverwerkingenanalyse.Deverwachtingisdatditbinnenvijfjaargangbaar

wordtvoorNGSenqPCRtechnieken.

Detechnologieontwikkeltzichsnel.Ditheeftalsnadeeldathetvoorschrijvenvanstandaard-

proceduresmoeilijkis,echterhetvoordeelisdatdekostenafnemenendekwaliteittoeneemt.

wat zijn de openstaande uitdagingen?

Opditmomentishetnognietmogelijkommetdezetechniekeninformatietegenererenover

bijvoorbeeldhetstadiumvanontwikkelingvandeaanwezigehogereorganismen.Zijnditbij-

voorbeeldadulten,juvenielenoflarven?Ookaspectenalsgezondheidengeslachtzijnnog

nietuitdedatatedestilleren(ditisoverigensonmogelijkindienalleennaarbarcodeswordt

gekeken).

Metdezetechnologieisnoggeenabsolutekwantificatie (aantallen/ml)mogelijk,maarwel

eenrelatievekwantificatie(%-agevantotaalDNAsequenties).Ditisveelalvoldoendevoorhet

vergelijkenvanmonstersengeeftinzichtinverschuivingenindetijd.Indienabsolutekwanti-

ficatievanbepaaldesoorten/eigenschappennodigiszijnanderetechniekenbeschikbaar(bij-

voorbeeldqPCR,zieparagraaf2.2)waarmeedezekunnenwordengekwantificeerd.Voorsoor-

tenwaarvanenkelheteDNAwordtgeanalyseerd(endusniethetorganismeinhetgeheel)is

absolutekwantificatienognietmogelijk


MetdezeverkenningisaangetoonddatmeteenbredeDNA-screening(metagenomics)van

eenwatermonsterveeldatawordtverkregenoverhetwatersysteem.155(filter)en287(pellet)

taxonomischeeenhedenzijngeïdentificeerd.Dezezijnzichtbaargemaaktindebijgevoegde

digitalebestandeninExceleninKronadiagrammen.Maarookdeeigenschappenvandesoor-

tenkomenmetdezemethodebeschikbaarhetgeenmeerinformatiegenereertoverhetwater-

systeem.

Opbasisvanderesultatenwordendevolgendeaanbevelingengedaan:

•Hetiswaardevolommiddelsmetagenomicswaterkwaliteittemonitoren.Opkortetermijn

kanditalvoormicro-organismenenhuneigenschappen.

•Oplangeretermijniseenbredescreeningvoorhogereorganismen(m.nmacrofauna)ook

haalbaar. Voorwaarde daarvoor is dat complete genomen worden gesequenced van deze

organismenenopenbaarwordengemaakt.

•Indienmogelijkpre-amplificatie vanhetDNAvermijdenaangezienopdezemanierveel

dataverlorengaat.Pre-amplificatieismetnamevalidewanneerhetDNAnietinvoldoende

concentratiesvoorkomt,bijvoorbeeldvooreDNAwaarbijalleensporen(enniethetorganis-

mezelf)wordenbemonsterd.

•Hetisnumetnamevanbelangomdatategenereren,referentiekadersoptebouwenen

ervaringoptedoenmetdezemethodieken

h6 conclUsies en aanbeVelingen


STOWAishetkenniscentrumvanderegionalewaterbeheerders(veelaldewaterschappen)in

Nederland.STOWAontwikkelt,vergaart,verspreidtenimplementeerttoegepastekennisdie

dewaterbeheerdersnodighebbenomdeopgavenwaarzijinhunwerkvoorstaan,goeduitte

voeren.Dezekenniskanliggenoptoegepasttechnisch,natuurwetenschappelijk,bestuurlijk-

juridischofsociaalwetenschappelijkgebied.

STOWAwerktinhogematevraaggestuurd.Weinventariserennauwgezetwelkekennisvragen

waterschappenhebbenenzettendievragenuitbijdejuistekennisleveranciers.Hetinitiatief

daarvoorligtveelalbijdekennisvragendewaterbeheerders,maarsomsookbijdekennisinstel-

lingenenhetbedrijfsleven.Dittweerichtingsverkeerstimuleertvernieuwingeninnovatie.

Vraaggestuurdwerkenbetekentookdatwezelfvoortdurendopzoekzijnnaarde‘kennisvra-

genvanmorgen’-devragendiewegraagopdeagendazettennogvoordatiemandzegesteld

heeft-omoptimaalvoorbereidtezijnopdetoekomst.

STOWAontzorgtdewaterbeheerders.Wijnemendeaanbestedingenbegeleidingvandegeza-

menlijkekennisprojectenopons.Wijzorgenervoordatwaterbeheerdersverbondenblijven

metdezeprojectenenerook‘eigenaar’vanzijn.Ditomtewaarborgendatdejuistekennis-

vragenwordenbeantwoord.Deprojectenwordenbegeleiddoorcommissieswaarregionale

waterbeheerderszelfdeelvanuitmaken.Degroteonderzoekslijnenwordenperwerkvelduit-

gezetenverantwoorddoorspecialeprogrammacommissies.Ookhierinhebbenderegionale

waterbeheerderszitting.

STOWA verbindt niet alleen kennisvragen en kennisleveranciers, maar ook de regionale

waterbeheerdersonderling.DoordesamenwerkingvandewaterbeheerdersbinnenSTOWA

zijnzijsamenverantwoordelijkvoordeprogrammering,zettenzijgezamenlijkdekoersuit,

wordenmeerderewaterschappenbijéénenhetzelfdeonderzoekbetrokkenenkomende

resultatensnellertengoedevanallewaterschappen.

de grondbeginselen Van stowa Zijn Verwoord in onZe missie:

Het samenmet regionalewaterbeheerdersdefiniëren vanhunkennisbehoeften ophetgebied vanhet

waterbeheerenhetvoorenmetdezebeheerders(laten)ontwikkelen,bijeenbrengen,beschikbaarmaken,

delen,verankerenenimplementerenvandebenodigdekennis.

stowa in het kort



[email protected] www.stowa.nlTEL 033 460 32 00 FAX 033 460 32 01

Stationsplein 89POSTBUS 2180 3800 CD AMERSFOORT

[email protected] www.stowa.nlTEL 033 460 32 00

Stationsplein 89 3818 LE Amersfoort POSTBUS 2180 3800 CD AMERSFOORT

2018

14

VERKENNING VAN DE POTENTIE VAN METAGENOMICS VOOR MONITORING VAN WATERKWALITEIT

omslagmetagenomics.indd 1 04-04-18 14:13

STICHTING TOEGEPAST ONDERZOEK …...de onzichtbare onderwaterwereld in kaart te brengen en te...

Documents

Transcript of STICHTING TOEGEPAST ONDERZOEK …...de onzichtbare onderwaterwereld in kaart te brengen en te...