Metabolisme van dopeermiddelen - Ghent University · In deze masterproef wordt het fase I en fase...

Metabolisme van

dopeermiddelen

Wouter MORTHIER

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. ir. Peter Van Eenoo

Begeleider: M.Sc. Lore Geldof en

Dr. Leen Lootens

Vakgroep: Klinische biologie,

microbiologie en immunologie

Academiejaar 2014-2015

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar

te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder

de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum

(handtekening student) (handtekening promotor)

Wouter Morthier Prof. Dr. ir. Peter Van Eenoo

Voorwoord

Deze masterproef werd uitgevoerd in het WADA-geaccrediteerde dopingcontrolelaboratorium

(DoCoLab) van de UGent. Ik was zeer enthousiast toen ik dit onderwerp toegewezen kreeg

als masterproef omdat ik mezelf ook als een sportman beschouw en veel interesse heb in alles

wat met sport gerelateerd is. Ik voelde me zeker gedreven toen ik vernam dat mijn promotor

Prof. Peter Van Eenoo een internationaal bekende dopingspecialist is, die zelfs af en toe eens

in het nieuws komt. Ondanks zijn drukke schema vond hij toch de tijd om me raad te geven

bij mijn masterproef en hielp hij bovendien mee om oplossingen te zoeken wanneer het

onderzoek even op een dood spoor belandde. Verder was deze professor altijd wel te vinden

voor een grapje tijdens de pauzes. Via deze weg bedank ik Peter om mij onder zijn hoede te

nemen in het laboratorium.

Tijdens deze masterproef heb ik geleerd dat het uitvoeren van wetenschappelijk onderzoek

niet zo vanzelfsprekend is. Er komen dikwijls hindernissen die je moet trachten te

overwinnen. Je hebt bovendien ook de nodige creativiteit nodig bij het zoeken naar

oplossingen. Ik wil dan ook Lore Geldof enorm bedanken om mij steeds te begeleiden bij

zowel mijn experimenteel werk in het labo als het schrijven van mijn masterproef. Ze had

dikwijls nuttige tips, en zonder haar steun zou het allemaal niet zo vlot verlopen zijn. Ik wil

ook ir. Wim Van Gansbeke specifiek bedanken voor de moeite die hij stak in het analyseren

van mijn component met GC-MS/MS. Ten slotte wil ik nog alle andere medewerkers van het

DoCoLab bedanken voor hun bijdrage in mijn onderzoeksonderwerp en voor het

optimaliseren van de sfeer tijdens en tussen het werken door. Ook Justine (medestudente uit

de opleiding biomedische wetenschappen) en Jochen (student biomedische

laboratoriumtechnologie) hebben bijgedragen tot de realisatie van dit werk.

Inhoudsopgave

Samenvatting ............................................................................................................................ 1

Summary ................................................................................................................................... 2

1. Inleiding ................................................................................................................................. 3

1.1 Doping in sport ............................................................................................................... 3

1.2 Selectieve Androgeen Receptor Modulatoren (SARMs) ............................................... 5

1.2.1 SARMs: anabolica interessant voor klinisch gebruik en dopingmisbruik ............ 5

1.2.2 LGD-4033 .............................................................................................................. 8

1.3 Gebruik van LC-MS en GC-MS voor detectie van metabolieten ................................. 9

1.3.1 Gebruik van chromatografie en massaspectrometrie ............................................ 9

1.3.2 Vloeistofchromatografie in combinatie met massaspectrometrie ....................... 11

1.3.3 Gaschromatografie in combinatie met massaspectrometrie ................................ 15

1.4 Bestuderen van het metabolisme .................................................................................. 17

1.5 Doelstelling ................................................................................................................... 19

2. Materialen en methoden .................................................................................................... 20

2.1 Producten en reagentia ................................................................................................. 20

2.2 Analyse van zuiverheid supplement LGD-4033 .......................................................... 20

2.3 In vitro incubatie met HLM en S9 ................................................................................ 21

2.4 Staalvoorbereiding: extractie en derivatisatie .............................................................. 22

2.5 Opvangen van fracties .................................................................................................. 23

2.6 Instrumentatie ............................................................................................................... 24

3. Resultaten ............................................................................................................................ 26

3.1 Analyse van zuiverheid van LGD-4033 supplement met LC-MS/MS en GC-MS ...... 26

3.2 Incubatiestalen met HLM en S9 fracties voor de studie van het fase I metabolisme ... 27

3.3 Incubatiestalen met HLM voor de studie van het fase II metabolisme ........................ 39

4. Bespreking ........................................................................................................................... 41

4.1 Analyse van zuiverheid van LGD-4033 supplement met LC-MS/MS en GC-MS ...... 41

4.2 Incubatiestalen met HLM en S9 fracties voor de studie van het fase I metabolisme ... 41

4.3 Incubatiestalen met HLM voor de studie van het fase II metabolisme ....................... 47

5. Algemeen besluit ................................................................................................................. 48

6. Referentielijst ...................................................................................................................... 49

Afkortingenlijst

AAS Anabole Androgene Steroïden

AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome

AR androgeenreceptor

CI Chemische Ionisatie

CID Collision-induced dissocation

CYP Cytochroom P450

Da Dalton

DBS dried blood spots

DHT dihydrotestosteron

DoCoLab dopingcontrolelaboratorium

EI Elektron Impact/ Elektron Ionisatie

EIC Extracted Ion Chromatogram

EPO erythropoëtine

GC Gas Chromatography

GST glutathione S-transferase

HCD high collision dissocation

HLM Humane lever microsomen

HPLC High Pressure Liquid Chromatography

HRE Hormone Respons Element

HRMS High Resolution Mass Spectrometry

Hsp90 heat shock protein 90

IAAF International Association of Athletics Federations

IOC Internationaal Olympisch Comité

IS Interne standaard

Ki Inhibitie constante

LC Liquid Chromatography

LGD Ligandrol

LLE Liquid-liquid extraction

m/z massa/lading verhouding

M+

Moleculair ion

M Metaboliet

MESm1G geglucuronideerd Mesterolone metaboliet1

MRM Multiple Reaction Monitoring

MS-MS Tandem Massaspectrometrie

MSTFA N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide

NADPH Nicotinamideadeninedinucleotidefosfaat

NAT N-acetyl transferase

NLS neutral-loss scan

OFN Oxygen-free nitrogen

PC Parent Compound

PSA Prostate Specific Antigen

RPLC Reversed-phase liquid chromatography

RT Retentietijd

SARMs Selectieve Androgeen Receptor Modulatoren

SCID Severe Combined Immunodeficiency

SF steroid free

SIM Selected Ion Monitoring

SPE Solid-phase extraction

SRM Single Reaction Monitoring

ST sulfotransferase

TIC Total Ion Chromatogram

TMS Trimethylsilyl

UGT uridine diphosphoglucuronosyltransferase

uPA urokinase-type plasminogeen activator

VDC Gelijkspanning

VRF Radiofrequente wisselspanning

WADA Wereld Anti-Doping Agentschap

1

Samenvatting

Omwille van hun goede anabole werking in botweefsel en spierweefsel en hun geringe

androgene effecten zijn selectieve androgeen receptor modulatoren (SARMs) een interessante

klasse van dopingsubstanties die misbruikt worden door atleten. Sinds 2008 staan ze bijgevolg

op de lijst van het WADA met verboden middelen en methoden in sport. Het aantal SARMs

die geproduceerd worden als mogelijke therapeutica neemt toe, maar tegelijkertijd worden er

ook producten die deze dopingsubstantie bevatten illegaal aangeboden via het internet. Voor

dopincontrolelaboratoria is het belangrijk om metabolismestudies uit te voeren op deze nieuw

ontwikkelde substanties, zodat hun aanwezigheid in urine in de toekomst kan gedetecteerd

worden, en dus het eventueel misbruik door atleten kan aangetoond worden. Aangezien

humane excretiestudies ethisch niet verantwoord zijn vormen in vitro modellen zoals humane

levermicrosomen (HLM) een waardig alternatief.

In deze masterproef wordt het fase I en fase II (glucuronidatie) metabolisme van de SARM

LGD-4033 bestudeerd door incubatie met HLM, gevolgd door vloeistof-vloeistof extractie

(LLE) en detectie van de gevormde metabolieten door LC-MS(/MS), LC-HRMS en GC-

MS(/MS). De resultaten tonen dat er vijf fase I metabolieten kunnen gedetecteerd worden met

LC-MS/MS en LC-HRMS. Deze metabolieten zijn het duidelijkste zichtbaar bij full-scan in

negatieve modus. Op GC-MS(/MS) konden deze metabolieten echter niet duidelijk

gedetecteerd worden. Enkel de aanwezigheid van M1 kon afgeleid worden. Daarnaast werd

een bijkomende metaboliet (M6) gedetecteerd met GC-MS. Fase II metabolieten werden via

een directe detectie met LC-HRMS geanalyseerd en voor zowel LGD-4033 als M2 werden

glucuronide-conjugaten gedetecteerd.

Op basis van de fragmentionen en de berekening van exacte massa’s werd een hypothese

opgesteld over de structuur van de fase I metabolieten van LGD-4033. M1 wordt

vermoedelijk gevormd door hydroxylatie en vorming van een dubbele binding op de

pyrrolidinering van de molecule, M2 door hydroxylatie en opening van de pyrrolidinering ter

hoogte van het stikstofatoom. M3 en M4 zijn isomeren van elkaar. Uit de resultaten blijkt dat

er geen dihydroxylatie heeft plaatsgevonden bij M3 en M4. Een mogelijke modificatie is een

methoxylatie op de pyrrolidinering, wat een zeldzame modificatie is bij fase I metabolieten.

Om deze resultaten te bevestigen zou het interessant zijn om een in vivo excretiestudie met

bijvoorbeeld een chimeer muismodel uit te voeren.

2

Summary

Background

Selective androgen receptor modulators (SARMs) are an interesting class of doping

substances, due to their promising anabolic/androgenic dissociation. Since 2008 this class of

substances is registrated on the WADA prohibited list. New SARMs are developed as

potential therapeutics, but at the same time more of these substances appear in black market

products. It is necessary to study the metabolism of these new developed SARMs to detect

future misuse by athletes.

Methods

The metabolism of a commercially available supplement containing the SARM LGD-4033

was studied by incubation with human liver microsomes (HLMs). The formed metabolites

were detected and their structure was elucidated by performing LC-MS(/MS), LC-HRMS and

GC-MS(/MS).

Results

Five phase I metabolites could be detected by LC-(HR)MS(/MS). Based on the results of the

product-ion scan there could be assumed that M1 is formed by hydroxylation and the

formation of a double bond in the pyrrolidine ring of the molecule. The proposed structure for

M2 is formed by hydroxylation and opening of the pyrrolidine ring at the nitrogen atom,

M3/M4 are formed by a methoxylation, and M5 is formed by two hydroxylations. Another

metabolite (M6) was detected with GC-MS and is probably formed by the formation of a

double bond on the pyrrolidine ring. Both the parent compound and M2 could also be

detected as glucuronide-conjugates.

Conclusion

LGD-4033 metabolism was studied using HLMs. Five phase I metabolites were detectable by

LC-MS (M1-M5) and two by GC-MS (M1 and M6). The glucuronide-conjugates of the

parent compound and M2 were detected as phase II metabolites.

3

1. Inleiding

1.1 Doping in sport

Het gebruik van dopingmiddelen is geen recent fenomeen. Het bestond al vóór er sprake was

van georganiseerde sporten. Oude Griekse olympiërs in de 3de eeuw v.C. dronken

verschillende wijnbrouwsels, en aten hallucinogene paddenstoelen en sesamzaden in de hoop

hun prestaties te verbeteren. Daarnaast werden allerlei plantensoorten gebruikt om snelheid en

uithouding te verbeteren en om de pijn te verbergen bij geblesseerde atleten. Zelfs in deze tijd

werd doping al beschouwd als iets onethisch. Bij de Oude Grieken werden diegenen die

betrapt werden op het gebruik van deze middelen verkocht als slaven [1].

Het modern dopingtijdperk begon omstreeks 1900, met het illegaal gebruik van

“medicamenten” bij renpaarden. Het eerste misbruik op de olympische spelen werd

vastgesteld in 1904. Tot 1920 werden mengsels van strychnine, heroïne, cocaïne en caffeïne

vaak misbruikt door topatleten. In 1950 begon het olympisch team van de Sovjet-Unie te

experimenteren met testosteron om de kracht te verhogen. Daarna ontstonden steeds meer

dopingsubstanties. De vooruitgang in dopingstrategieën werd deels gedreven door verbeterde

detectiemethoden. Om de detectie te omzeilen worden steeds meer ingewikkelde

dopingtechnieken ontwikkeld. De “International Association of Athletics Federations”

(IAAF) was de eerste sportinstantie die in 1928 het gebruik van doping bij atleten verbood.

Maar deze instantie moest de atleten toen nog op hun woord vertrouwen [1].

De eerste echte dopingtesten bij atleten vonden plaats gedurende de Europese

kampioenschappen in 1966, en twee jaar later voerde het Internationaal Olympisch Comité

(IOC) de eerste dopingtesten in op de olympische winter- en zomerspelen. Het toevoegen van

de anabole steroïden aan de lijst met verboden middelen van het IOC resulteerde in een

verhoging van het aantal dopinggerelateerde diskwalificaties, vooral in krachtsporten zoals

werpen en gewichtheffen. Toen de strijd tegen steroïden en stimulantia resultaat begon op te

leveren, deed bloeddoping zijn intrede in de sport, en nog later erythropoëtine (EPO) [1].

Tijdens een rit in de Tour de France in 1998 vond de politie een groot aantal verboden

substanties, waaronder EPO. Dit dopingschandaal leidde tot een belangrijke herbeoordeling

van de rol van de overheid bij antidopingzaken. Het schandaal in de Tour de France belichtte

de nood aan een onafhankelijk en onbevooroordeeld internationaal agentschap die uniforme

standaarden voor de dopingstrijd kon invoeren en tevens het werk van sportorganisaties en

4

overheden kon coördineren. Het IOC nam het initiatief met het organiseren van de eerste

wereldconferentie over doping in sport in februari 1999 te Lausanne. Naar aanleiding van

deze conferentie werd later in hetzelfde jaar het Wereld Anti-Doping Agentschap (WADA)

opgericht [1].

WADA is een onafhankelijk, internationaal agentschap dat de wereld anti-doping code

publiceert. Dit laatste is het document dat de anti-doping richtlijnen in alle sporten en alle

landen harmoniseert. Daarnaast publiceert het WADA jaarlijks een lijst met middelen en

methoden die te allen tijde verboden zijn in sport. Hierbij wordt een onderscheid gemaakt

tussen middelen en methoden waarvan het gebruik zowel binnen als buiten competitie

verboden is, of enkel binnen competitie. Ten slotte was het WADA ook verantwoordelijk

voor de invoering van het “biologisch paspoort” bij atleten. Het principe hiervan is dat

bepaalde parameters van atleten opgevolgd worden in functie van de tijd om op deze manier

indirect dopingmisbruik bij atleten op te sporen. In het geval een atleet noodzakelijk een

verboden substantie moet nemen omwille van medische redenen, kan het WADA een

“uitzondering voor therapeutisch gebruik” toewijzen [1].

In de lijst van verboden middelen en methoden staan volgende categorieën:

- Verboden substanties (binnen en buiten competitie): 1) niet-goedgekeurde substanties

2) anabole middelen 3) peptidehormonen, groeifactoren, mimetica 4) β-2 agonisten 5)

hormonen en metabolische regulatoren 6) diuretica en maskerende middelen

- Verboden methoden (binnen en buiten competitie): 1) manipulatie van bloed en

bloedcomponenten 2) chemische en fysische manipulatie 3) gendoping

- Verboden binnen competitie: stimulantia, narcotica, cannabinoïden en

glucocorticoïden [2]

Laboratoria moeten erkend worden door het WADA om dopingcontroles uit te voeren. Dit

gebeurt door het verlenen van een accreditatie, dit is een formeel bewijs van de competentie

van het labo voor het uitvoeren van specifieke analyses. Wereldwijd zijn er ondertussen 32

WADA-geaccrediteerde laboratoria. Het dopingcontrolelaboratorium (DoCoLab) van de

UGent waar deze masterproef uitgevoerd werd, maakt hier deel van uit [3].

5

1.2 Selectieve Androgeen Receptor Modulatoren (SARMs)

1.2.1 SARMs: anabolica interessant voor klinisch gebruik en dopingmisbruik

In de endocrinologie tracht men vaak hormoondeficiëntieziekten te corrigeren door een

synthetisch analoog van het deficiënte hormoon toe te dienen aan de patiënt. De vervanging

van het deficiënte natuurlijke hormoon door een synthetisch hormoon is echter niet altijd de

beste optie. De redenen hiervoor zijn bijvoorbeeld een nadelig farmacokinetisch profiel, een

verminderde orale biobeschikbaarheid, of ongewenste biologische activiteiten van het

aangeboden hormoon. Steroïd vervangingstherapie aan de hand van synthetische anabole

androgene steroïden (AAS) werd gebruikt sinds de opheldering van de structuur van

testosteron in 1935. Er werd steeds meer gezocht naar beter geschikte en meer

weefselspecifieke anabole analogen, waardoor er duizenden steroïden ontwikkeld werden de

laatste 80 jaar. Deze werden voornamelijk ontwikkeld voor de behandeling van chronische

ziekten zoals AIDS en osteoporose. Daarnaast hadden deze substanties hun rol bij de

behandeling van hypogonadisme en de controle van de fertiliteit [4]. De nadelen van

testosteron zijn de lage orale biobeschikbaarheid van deze component (omwille van een

intensief first-pass metabolisme in de lever), en de conversie van testosteron naar

dihydrotestosteron (DHT) door het enzym 5α-reductase (in prostaat en huid), en naar

oestrogenen door aromatase (in vetweefsel, botweefsel en centraal zenuwstelsel) (figuur 1).

Figuur 1: Omzetting van testosteron naar DHT [5]

6

DHT is een bioactief steroïde dat zorgt voor een amplificatie van de androgene activiteit van

testosteron in verschillende weefsels. Uit het voorgaande volgt dat er nood was aan

synthetische analogen die enerzijds oraal actief zijn, en anderzijds geen substraten waren voor

5α-reductase en aromatase enzymen [4,6].

Er kwam een grote doorbraak in alternatieve medicatie met het ontwikkelen van de eerste

niet-steroïdale androgeenreceptor (AR) agonist in 1998, een analoog van bicalutamide. In de

daaropvolgende jaren werden verschillende SARMs gesynthetiseerd, waardoor er een grote

variëteit aan farmacoforen aanwezig is in de momenteel bestudeerde SARMs waaronder

arylpropionamides, quinolinones, tropanolol, tetrahydroquinoline, hydantoïne, thiophene,

phenyl-oxadiazol en steroïdderivaten. Meerdere van deze componenten zitten ondertussen in

fase II klinische trials [7].

De SARMs hebben uitgesproken anabole effecten ter hoogte van spier- en botweefsel, terwijl

er nauwelijks bijwerkingen, zoals androgene effecten in de prostaat, waar te nemen zijn. De

weefselspecificiteit is te wijten aan het feit dat SARMs binden met een hoge affiniteit aan de

AR, maar geen substraten zijn voor 5α-reductases en aromatases. Bijgevolg kan er geen

amplificatie van androgene effecten plaatsvinden in weefsels zoals de prostaat [4]. Hun

functionele groepen (bijvoorbeeld nitro- en hydroxylgroepen) bootsen de belangrijkste

ankermoleculen van testosteron en DHT voor de AR na, namelijk de 3-ketofunctie en de 17-

hydroxylfunctie. Bovendien worden ook de hydrofobe interacties van steroïden nagebootst.

Hieruit volgt dat de volledige signaalcascade net zoals bij AAS getriggerd wordt, wat leidt tot

een verhoogde biosynthese van proteïnen (figuur 2) [4,7].

Figuur 2: Triggering signaalcascade door SARM:

1) De ligand (het SARM) gaat door de celmembraan en bindt aan de steroïdhormoon receptor die een complex

vormt met het “heat shock protein 90 (hsp90)” 2) Na vrijlating van hsp90 homodimeriseert het ligand-

receptorcomplex dat zich zal vasthechten op het “Hormone Respons Element (HRE)” van het DNA. 3) Er treedt

genexpressie op waardoor uiteindelijk anabole effecten bekomen worden [7].

7

Ten slotte is gebleken uit receptorbinding studies dat binding van het ligand aan de AR

conformationele veranderingen veroorzaakt in het ligandbindingsdomein van de receptor.

Deze vormveranderingen in de receptor laten interactie toe met verscheidene cofactoren, wat

bijdraagt tot een weefselspecifieke genregulatie.

Omwille van hun goede weefselspecificiteit en hun minimale androgene effecten, maar

uitgesproken anabole effecten, vertonen deze anabole middelen een enorm therapeutisch

potentieel. Maar tegelijkertijd maken deze kenmerken SARMs interessant voor misbruik door

atleten die hun prestaties willen verbeteren [7]. Sinds januari 2008 staan SARMs op de

WADA lijst van verboden middelen en methoden in sport [8]. In de WADA lijst van 2015

vallen ze onder de categorie “S1: Anabolic agents”, waartoe ook de subcategorie “anabole

androgene steroïden (AAS)” behoort [2]. Ondanks het feit dat ze nog niet gebruikt worden in

de klinische praktijk, zijn sommige SARMs een bestanddeel van producten die illegaal

aangeboden worden via het internet [8].

Aangezien er steeds meer nieuwe soorten SARMs (zowel steroïdale als niet-steroïdale)

geproduceerd worden als mogelijke therapeutica, neemt hun aantal die door atleten kunnen

misbruikt worden eveneens toe. In 2010 verschenen de eerste afwijkende analytische

resultaten voor SARMs bij atleten. Daaruit bleek de noodzaak om voldoende adequate

detectiemethoden te ontwikkelen om het misbruik van nieuwe SARMs eveneens te kunnen

bewijzen. Er zijn voor een aantal componenten uit deze groep analytische testen ter

beschikking voor zowel plasma, opgedroogde bloedvlekken (dried blood spots “DBS”), als

urine. Hierbij wordt de intacte component gedetecteerd (plasma en DBS), ofwel de

belangrijkste metabolieten van de “parent compound” (urine) die geïdentificeerd werden in in

vitro en in vivo studies. Gezien de grote variëteit aan farmacoforen aanwezig in de momenteel

bestudeerde SARMs is het belangrijk om metabolisme studies uit te voeren en de

massaspectrometrische eigenschappen te bestuderen, zodat dopingcontrolelaboratoria deze

substanties vlot kunnen detecteren [9].

8

1.2.2 LGD-4033

In deze masterproef zal het metabolisme van één van de meest recent ontwikkelde SARMs

bestudeerd worden, namelijk LGD-4033 (Ligandrol). LGD-4033 werd ontwikkeld door

Ligand Pharmaceuticals. Het is een niet-steroïdaal, oraal SARM dat bindt aan de AR met een

hoge affiniteit (Ki van ongeveer 1nM) en selectiviteit. In dierenmodellen is aangetoond dat

LGD-4033 anabole activiteiten heeft in spierweefel, en anabole en antiresorptieve activiteiten

in botweefsel. Daarnaast toonde deze component een goede selectiviteit voor spier- tegenover

prostaatweefsel. Uit een klinische trial werd het groot anabool effect, met toename van de

vetvrije massa, van deze SARM al duidelijk. Bovendien wordt LGD-4033 relatief traag

afgebroken (halfwaardetijd: 24-36u). Daarnaast was er geen stijging van de merker voor

prostaatkanker, PSA, waar te nemen. Er waren echter ook enkele bijwerkingen van dit SARM

waar te nemen: een significante, dosisafhankelijke daling van het endogeen testosterongehalte

in het bloed en van HDL-cholesterol. Omwille van deze potentieel schadelijke effecten op

lange termijn, is het gebruik van SARMs in de kliniek nog niet goedgekeurd [10,11]. De

structuur van LGD-4033 is nog niet officieel bevestigd door Ligand Pharmaceuticals.

Verdelers op internet geven 4-(2-((S)-2,2,2-trifluoro-1-hydroxyethyl)pyrrolidin-1-yl)-2-

(trifluoromethyl)-benzonitrile als chemische naam op voor LGD-4033 (figuur 3), aangezien

deze structuur vermeld wordt in een patent met SARMs van Ligand Pharmaceuticals [9].

Figuur 3: Structuur van LGD-4033: 4-(2-((S) -2,2,2-trifluoro-1-hydroxyethyl)pyrrolidin-1-yl)-2-

(trifluoromethyl)-benzonitrile [9]

9

1.3 Gebruik van LC-MS en GC-MS voor detectie van metabolieten

1.3.1 Gebruik van chromatografie en massaspectrometrie

Chromatografie is een techniek die gebruikt wordt voor het scheiden van componenten in een

mengsel. Deze scheiding is het gevolg van een specifieke interactie van elke aanwezige

component met de stationaire en de mobiele fase die onderdeel zijn van een chromatograaf.

Elke component zal bijgevolg een bepaalde retentie vertonen bij het elueren uit de kolom van

de chromatograaf. Uit de verkregen resultaten (het chromatogram) kan afgeleid worden uit

welke componenten een mengsel is opgebouwd (mits enige voorkennis over de component)

en in welke hoeveelheiden (relatieve abundantie) de componenten aanwezig zijn. Bij een

kwalitatieve analyse gaat het enkel om de identificatie van de componenten aanwezig in het

monster. De parameter in het chromatogram die hierbij informatie verschaft is de retentietijd

of het retentievolume. Als men de hoeveelheid component wil weten, spreekt men van een

kwantitatieve analyse. Een maat hiervoor is de piekhoogte of de piekoppervlakte in het

chromatogram. In DoCoLab worden twee types chromatografen gebruikt:

vloeistofchromatografen (HPLC) en gaschromatografen (GC). Bij HPLC bestaat de mobiele

fase uit een vloeistof, bij GC uit een gas. De keuze tussen beiden hangt af van één of

meerdere eigenschappen waaraan monstercomponenten moeten voldoen. Zo zullen

componenten met een lage vluchtigheid, met aanwezigheid van neutrale, zeer polaire of

geladen ionogene groepen, en thermisch labiele componenten eerder geanalyseerd worden

met HPLC dan met GC.

Om een identificatie van onbekende componenten uit te voeren is het mogelijk om een

chromatograaf te combineren met een massaspectrometer. De koppeling van chromatografie

aan massaspectrometrie levert een krachtige methode voor kwalitatieve analyse op.

Met massaspectrometrie (MS) kan er informatie over de structuur van een molecule verkregen

worden. Massaspectrometrie is gebaseerd op het genereren van ionen in de gasfase

(ioniseren), de scheiding van de gevormde ionen op basis van hun massa-ladingsverhouding

(m/z) en de detectie van deze ionen. Een massaspectrum is een grafische weergave van de

intensiteiten van de gescheiden ionen in functie van hun m/z. Er bestaan verschillende

methoden om ionen te produceren voor MS, waarbij men vier klassen onderscheidt (tabel 1).

10

Tabel 1: Overzicht van de belangrijkste MS ionisatietechnieken [12]

Monstertoestand Klasse Ionisatiemethode

Gas/Damp Elektron ionisatie

(hard)

Elektron ionisatie

Gas/Damp Chemische ionisatie

(zacht)

Chemische ionisatie

Atmosferische –druk

chemische ionisatie

Vloeistof

of vaste stof

Desorptie ionisatie

(zacht)

Fast-atom bombardment

Liquid-SIMS

Veld desorptie

Plasma desorptie

Matrix-assisted laser

desorptie/ionisatie

Vloeistof/

oplossing

Vernevelingsionisatie

(zacht)

Thermospray ionisatie

Electrospray ionisatie

We onderscheiden zachte en harde ionisatiemethoden, en binnen de zachte ionisatietechnieken

zijn er verschillende mogelijkheden van ionisatie, namelijk langs chemische-, desorptie-, of

vernevelingsweg. Samengevat worden in een massaspectrum volgende pieken teruggevonden:

- Een piek afkomstig van de intacte molecule, dit kan een moleculair ion M+, een

gekationiseerde of geanioniseerde molecule ([M+H]+ of [M-H]

-), of een

meerwaardig geladen molecule zijn, afhankelijk van de gebruikte ionisatietechniek.

- Fragmentionen, dit zijn pieken te wijten aan de fragmentatie van de moleule.

- Isotooppieken

- Pieken ten gevolge van in het monster aanwezige verontreinigingen of ten gevolge

van gasfase-reacties in de ionenbron (bijvoorbeeld oplosmiddel-cluster ionen) [12].

11

1.3.2 Vloeistofchromatografie in combinatie met massaspectrometrie (LC-MS)

Reversed-phase vloeistofchromatografie (RPLC) is een belangrijk onderdeel van de hoge

druk vloeistofchromatografie (HPLC). Het principe is dat men gebruik maakt van een apolaire

(of minder polaire) stationaire fase en een polaire mobiele fase. Dit is het omgekeerde van

normale vloeistofchromatografie. De vloeistoffen worden gepompt vanuit één of meerdere

reservoirs, die gemengd de mobiele fase vormen. De pomp zorgt voor de voortstuwing van de

mobiele fase. Tussen de pomp en de kolom zit het injectiesysteem (een hogedrukkraan). Hier

wordt het monster in het chromatografische systeem gebracht. De kolom bestaat meestal uit

een rechte, roestvrij stalen buis waarin het stationaire fasemateriaal zich bevindt. De detector

reageert op de aanwezigheid van een component en geeft een elektrisch signaal, dat

geregistreerd wordt door een recorder of datasysteem (figuur 4).

Figuur 4: De onderdelen van een vloeistofchromatograaf (LC) [12].

De samenstelling van de mobiele fase is van belang bij LC-MS. De keuze hiervan wordt

voornamelijk bepaald door de aard van de te analyseren verbindingen. Daarom wordt bij LC-

MS geopteerd voor RPLC met als mobiele fase een mengsel van water en een organische

modifier (methanol of acetonitril). De organische modifier adsorbeert aan de stationaire fase,

en dient voor het conditioneren van de kolom (figuur 5).

12

Figuur 5: De C-18 keten als voorbeeld van een ligand voor de stationaire fase van RPLC [12].

Door een gradiëntelutie toe te passen waarbij de verhouding water/methanol steeds kleiner

wordt zullen de meer apolaire componenten van de apolaire stationaire fase naar de mobiele

fase overgaan en uiteindelijk ook elueren. Belangrijke voordelen van gradiëntelutie zijn de

relatief korte analysetijd en optimale omstandigheden voor de elutie en detectie van alle

stoffen aanwezig in het monster. Een nadeel is dat na beëindiging van een gradiënt de kolom

weer in de startconditie (samenstelling van de mobiele fase aan het begin van de gradiënt)

moet worden gebracht. Dit kost tijd en heeft een invloed op de levensduur van de kolom.

Nadat de gescheiden componenten uit de kolom elueren worden deze geïoniseerd in de

gasfase en de gevormde ionen worden nadien gedetecteerd door een massaspectrometer. Deze

overgang van LC naar MS gebeurt in deze masterproef door een elektrospray interface.

Elektrospray is zowel een vernevelings- als een ionisatietechniek. De meest voorkomende

ionen die hierbij gevormd worden zijn de geprotoneerde of gedeprotoneerde molecule,

natrium-, kalium-, ammonium- en acetaatadducten van de te analyseren verbinding.

De massa analysatoren die in DoCoLab gecombineerd worden met LC zijn triple-quadrupool

MS en HRMS (hoge resolutie MS). Dit zijn beiden tandem massaspectrometers. Een

quadrupool analysator bestaat uit vier hyperbolische of ronde staven, die parallel in de vorm

van een vierkant zijn geplaatst. Op de tegenover elkaar liggende staven wordt een positieve of

negatieve gelijkspanning (VDC) aangebracht, waarop een radiofrequente wisselspanning (VRF)

wordt gesuperponeerd (figuur 6).

13

Figuur 6: De quadrupool massa analysator [12].

De ionen worden in het quadrupool veld gebracht, waarna ze gaan oscilleren in een veld

loodrecht op de staven. Enkel ionen met een welbepaalde m/z zijn stabiel genoeg om de

quadrupool te passeren en de detector te bereiken. De andere ionen hebben een onstabiel

traject en worden ontladen op de staven. Bij een triple-quadrupool MS worden twee

quadrupolen achter elkaar geplaatst met tussenin een botsingscel (figuur 7).

Figuur 7: Schema van een triple-quadrupool MS [12].

Omdat er twee massaspectrometers gecombineerd worden, spreekt men van een MS/MS of

tandem MS systeem. In beide quadrupolen wordt een massagebied afgescand of kunnen ionen

met een welbepaalde m/z geselecteerd worden. Dit betekent dat men een single-quadrupool

MS kan gebruiken in de “full-scan” of “Selected Ion Monitoring (SIM)” modus. Het verschil

bij triple-quadrupool MS is dat er in de botsingscel via botsingen met neutrale gasatomen of

-moleculen een botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) van de ionen kan plaatsvinden. De

collisie-energie kan door de gebruiker zelf ingesteld worden. Als gevolg van deze

fragmentatie zijn een aantal bijkomende scan modi mogelijk bij MS/MS: precursor-ion scan,

product-ion scan, neutral-loss scan (NLS), selected reaction monitoring (SRM) en multiple

reaction monitoring (MRM) (tabel 2).

14

Tabel 2: Overzicht van de verschillende scan-modi en hun toepassingen [12].

Modus MS1 MS2 Applicatie

Product-ionen Selecterend Scannend Verkrijgen van structuurinformatie van

ionen met behulp van CID

Precursor ionen Scannend Selecterend Zoeken naar verbindingen die in CID alle

eenzelfde product-ion hebben

Neutral-loss Scannend Scannend Zoeken naar verbindingen die in CID

eenzelfde groep verliezen

Selective reaction Selecterend Selecterend Volgen van een monitoring (SRM)

specifieke reactie in CID

Bij een product-ion scan zal in de eerste quadrupool een ion met een welbepaalde m/z

geselecteerd worden, en worden na fragmentatie alle gevormde product-ionen gescand. Deze

modus laat toe om structuurinformatie af te leiden. In de precursor-ion scan modus wordt

uitgegaan van een gemeenschappelijk product-ion. Het product-ion wordt in quadrupool 2

geselecteerd, terwijl alle precursor-ionen afkomstig van dit product-ion gescand worden in

quadrupool 1. Het principe van SRM en MRM is dat respectievelijk één of meerdere transities

van precursor-ion naar product-ion gescand worden. Ten slotte is er de neutral-loss scan

modus, waarbij uitgegaan wordt van het gemeenschappelijk verlies van een bepaald neutraal

deel van het molecuul. In beide quadrupolen wordt gescand, maar met een vast verschil in

m/z. Er zal enkel een signaal waargenomen worden indien in quadrupool 1 een ion wordt

doorgelaten dat het ingestelde massaverschil verliest bij de fragmentatie.

Het principe van de ion trap is dat er door het aanbrengen van een wisselspanning op een

ringelektrode ionen in de ion trap worden opgeslagen. Door deze wisselspanning langzaam

aan te verhogen worden de trajecten van ionen met opeenvolgende m/z instabiel. Hierdoor

worden deze ionen uit de ion trap gestoten en kunnen ze gedetecteerd worden door een

electron multiplier (figuur 8). In tegenstelling tot een quadrupool filter worden hier juist de

ionen met een instabiel traject gedetecteerd. Bij een ion trap is het mogelijk om na de eerste

CID stap één van de product-ionen te selecteren en te gebruiken voor een tweede CID stap. Er

is bijgevolg (MS/MS)n mogelijk. Een nadeel t.o.v. een triple-quadrupool is dat geen

precursor-ion scan en neutral-loss scan kunnen toegepast worden.

15

Figuur 8: Schema van een ion trap analysator [12].

Voor de detectie van de ionen worden in alle massaspectrometers electron multipliers

gebruikt. De werking hiervan steunt op secundaire elektronen-emissie. De energierijke ionen

worden gebombardeerd op een bepaald metaaloppervlak, waardoor elektronen vrijkomen uit

dit oppervlak. Deze elektronen vallen op hun beurt weer in op een tweede oppervlak, waarbij

nog meer elektronen vrijkomen. Door het herhalen van dit proces kan het signaal versterkt

worden [12].

1.3.3 Gaschromatografie in combinatie met massaspectrometrie.

Gaschromatografie (GC) is specifiek voorbehouden aan vluchtige verbindingen of

verbindingen die vluchtig te maken zijn d.m.v. temperatuurverhoging. Een gaschromatograaf

bestaat uit een gascilinder of gasgenerator die beiden voorzien zijn van druk- of

flowregelaars, om voor een constante aanvoer van mobiele fase te zorgen. Een

injectiesysteem spuit het monster vervolgens op de kolom. De kolom hangt in een oven om de

monstercomponenten gasvormig te maken en te houden. Een capillaire kolom is gemaakt van

metaal of fused silica (puur kwartsglas). De stationaire fase is gecoat als een laagje (film) op

de binnenwand. Als mobiele fase wordt een draaggas zoals Helium gebruikt. Helium is het op

één na snelste draaggas en is tevens onbrandbaar en dus relatief veilig. De elutiesnelheid kan

geregeld worden via een temperatuurprogramma of door het debiet aan te passen. Hoe hoger

de temperatuur of het debiet, hoe sneller de componenten zullen elueren, maar hoe minder de

componenten van elkaar gescheiden worden (figuur 9).

16

Figuur 9: Schema van de onderdelen van een gaschromatograaf [13].

Bij GC-MS zorgt een interface tussen de gaschromatograaf en de ionenbron ervoor dat zoveel

mogelijk dampmoleculen de ionenbron bereiken, zonder dat het vacuüm in de

massaspectrometer wordt verstoord. Capillaire kolommen kunnen meestal direct aan de

ionenbron worden gekoppeld. Een interface is dus niet nodig.

Als ionisatietechnieken bij GC wordt in DoCoLab gewerkt met elektron-impact/elektron

ionisatie (EI) en chemische ionisatie (CI). Beide technieken gaan uit van ioniseren van

moleculen in de dampfase. Bij EI worden door een gloeidraad elektronen geëmitteerd die

monsterdamp bombarderen in de ionisatiekamer waardoor één of meerdere valentie-

elektronen van de monstermolecule worden verwijderd. Door het verlies van een elektron

wordt een molecuul met massa M omgezet in een positief geladen moleculair ion M+. De

vorming van negatieve ionen is bij EI verwaarloosbaar. Naast de vorming van positief

geladen ionen treedt bij veel verbindingen onder EI ook fragmentatie van de gevormde ionen

in kleinere deeltjes op. Daarom is deze harde ionisatiemethode geschikt voor het krijgen van

structuurinformatie van de te analyseren verbinding. Bij CI wordt in de ionenbron naast de

monsterdamp ook een reactiegas ingelaten. Het reactiegas wordt geïoniseerd door het te

beschieten met elektronen afkomstig van een filament. Door reacties van de gevormde

radicaal kationen met de overmaat reactiegas vormt zich het geprotoneerde reactiegas, dat op

zijn beurt weer reageert door een proton over te dragen aan de te analyseren verbinding. CI is

een zachte ionisatiemethode, er vindt bij CI veel minder fragmentatie plaats. CI geeft vooral

goede informatie over de moleculaire massa.

17

GC wordt in DoCoLab ook gecombineerd met single- en triple-quadrupool MS. Bij GC zijn

dezelfde scan modi met de MS mogelijk als bij LC [13].

Als men het fase II metabolisme wil bestuderen, kan dit indirect gebeuren met behulp van

GC-MS(/MS) door het vergelijken van de vrije of ongeconjugeerde fractie metabolieten (fase

I) met de totale fractie metabolieten (fase I en II). Bij voorkeur wordt echter gewerkt met LC-

MS/MS, aangezien men hierbij de geconjugeerde metabolieten rechtstreeks kan analyseren.

Bovendien heeft de analyse met LC-MS/MS het voordeel dat er geen derivatiestap nodig is,

wat wel het geval is bij GC-MS(/MS). Enerzijds zorgt deze derivatisatie ervoor dat de

componenten meer apolair worden. Anderzijds maakt dit de stoffen vluchtiger en thermisch

stabieler, waardoor hun gaschromatografische eigenschappen verbeteren. In het DoCoLab

gebruikt men een TMS (trimethylsilyl)-derivatisatiemengsel. Dit is een mengsel van N-

methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA), NH4I en ethaanthiol. Hierdoor worden

de hydroxyl- en ketogroepen van de component omgezet in respectievelijk TMS-ether en

TMS-enol derivaten [14, 15].

1.4 Bestuderen van het metabolisme

Biotransformatie van medicamenten is een belangrijke factor die de therapeutische en

toxische effecten van een medicament bepaalt. Zo kan het leiden tot detoxificatie en excretie

van geneesmiddelen, maar ook tot activatie. Biotransformatie of metabolisatie gebeurt in veel

verschillende weefsels zoals de longen, huid, nieren en de darmen. De lever is echter het

belangrijkste orgaan [16].

Er worden twee stappen in het metabolisatieproces onderscheiden: fase I en fase II reacties.

Fase I reacties zijn reducties en oxidaties (oa. hydroxylaties) die zorgen voor een verhoogde

polariteit en excretie van de drug. Fase I metabolieten zijn niet noodzakelijk inactief. Fase II

reacties worden daarentegen als echte “detoxificatiereacties” beschouwd, omdat de conjugatie

van polaire groepen leidt tot inactivatie van de drug en de eliminatie vereenvoudigt.

Glucuronidatie is de belangrijkste conjugatiereactie bij zoogdieren. Andere conjugatiereacties

die voorkomen zijn sulfatatie, methylatie, acetylatie, en conjugatie met aminozuren of

glutathion [17]. De biotransformatie van een bepaalde drug zal één van deze twee fasen of

beide fasen doorlopen. De cytochroom P450 (CYP) superfamilie van enzymen speelt een

belangrijke rol bij fase I reacties en is voornamelijk aanwezig in de lever. De belangrijkste

fase II enzymen zijn uridine diphosphoglucuronosyltransferase (UGT), N-acetyl transferase

(NAT), glutathione S-transferase (GST), en sulfotransferase (ST) [16].

18

Om het hepatisch metabolisme van anabole substanties zoals SARMs te bestuderen kunnen

verschillende in vitro systemen gebruikt worden, zoals geïsoleerde hepatocyten, levercoupes,

getransfecteerde cellijnen of subcellulaire fracties waaronder microsomen [17]. Het doel

hierbij is om een modelsysteem te gebruiken met een sterke voorspellingsgraad voor in vivo

humane biotransformatie [16]. Humane excretiestudies met designer drugs zijn immers

ethisch niet verantwoord, omwille van de ongekende bijwerkingen. Het gebruik van in vivo

diermodellen biedt het voordeel dat alle mogelijke transformaties van een drug kunnen

bestudeerd worden en dat ze op deze manier representatief zijn voor de humane in vivo

situatie. Er zijn echter een aantal nadelen aan verbonden ook. Dierexperimenten vereisen

voldoende middelen. De identificatie van urinaire metabolieten is vaak onderhevig aan

interferentie en kost bovendien veel tijd. Ten slotte is het niet evident om de mechanismen

van het metabolisme te bestuderen zoals de betrokken enzymen. Als alternatief voor

dierexperimenten kunnen in vitro modellen gebruikt worden. Enkele nadelen van in vitro

modellen zijn de ethische kwesties omtrent de weefselvoorziening, het gebrek aan een intact

biologisch systeem en het gebrek aan een voldoende hoge in vitro - in vivo correlatie [18].

Deze modellen laten vooral een kwalitatieve analyse toe van de bestudeerde processen, en

vormen een voorbereiding op het gebruik van een in vivo diermodel. Een complete

vervanging van diermodellen door in vitro modellen blijkt niet realistisch te zijn [16]. De in

vivo resultaten moeten bovendien altijd voorrang krijgen op de in vitro resultaten, indien er

verschillende resultaten vastgesteld worden tussen beide systemen. Toch blijken in vitro

modellen nuttig te zijn, omdat ze het aantal dierexperimenten reduceren en

metabolismestudies doorgaans eenvoudiger maken.

Humane lever microsomen (HLMs) zijn het meest populaire in vitro model voor

metabolisatiestudies. Ze zijn in grote mate beschikbaar, goedkoop, eenvoudig te gebruiken, en

geven een goede indicatie van de in vivo metabolische CYP enzym en Uridine 5'-diphospho-

glucuronosyltransferase (UGT) enzym activiteiten. Lever microsomen bestaan uit vesikels

afkomstig van het endoplasmatisch reticulum van hepatocyten, bekomen door verschillende

opeenvolgende centrifugaties. Een nadeel van microsomen is dat ze niet kunnen gebruikt

worden voor kwantitatieve predicties. De reden hiervoor is dat ze een overvloed aan CYP en

UGT enzymen bevatten en deze enzymen hier niet in competitie gaan met andere enzymen,

zoals in vivo wel het geval is. Dit leidt tot een grote overschatting van de biotransformatie.

Anderzijds blijven, door afwezigheid van de meeste fase II enzymen zoals NAT, GST en ST

en door afwezigheid van cytosolische cofactoren, bepaalde metabolieten die in een intacte

lever gevormd worden onopgemerkt. Daarom zijn microsomen vooral nuttig om fase I

19

reacties te bestuderen en om eventuele glucuronidatiereacties (fase II) te bestuderen. Ten

slotte moet vermeld worden dat de biotransformatie in microsomen niet beïnvloed wordt door

‘drug transporters’, wat wel het geval is in de intacte lever [16, 17]. Door gebruik te maken

van HLMs kunnen metabolieten van SARMs gegenereerd worden, die nadien bruikbaar zijn

als referentiematerialen bij de opsporing van deze SARMs in het kader van dopingcontrole

[9].

Om een meer compleet metabolisch profiel te bekomen, zou men gebruik kunnen maken van

humane S9 leverfracties. Deze bezitten zowel fase I als fase II activiteit. Daarentegen hebben

deze S9 fracties een veel lagere enzymactiviteit dan microsomen, aangezien deze minder

opgezuiverd zijn. Rekening houdend met deze specifieke kenmerken worden de microsomen

en S9 fracties best aanvullend gebruikt [16]. Uit humane in vitro metabolismestudies met

HLMs en S9 fracties is reeds gebleken dat deze klasse van dopingsubstanties fase I en fase II

metabolisatiereacties ondergaan. De meest voorkomende fase I modificaties waren

hydroxylatie, defenylatie, demethylatie en deacetylatie, terwijl glucuronidatie en sulfatatie de

voornaamste fase II modificaties inhielden [8].

1.5 Doelstelling

In deze masterproef zal het metabolisme bestudeerd worden van “LGD-4033”. Omwille van

de prestatiebevorderende effecten van dit nieuw type SARM en doordat het reeds verkocht

wordt op de zwarte markt, is het ook beschikbaar voor atleten voor eventueel misbruik. Om

deze evoluties op te kunnen volgen is het belangrijk dat dopingcontrolelaboratoria deze

component kunnen detecteren. Omdat er meestal één of meerdere metabolieten van een

dopingsubstantie in urine gedetecteerd worden en omdat de metabolieten over het algemeen

langer opspoorbaar zijn is het belangrijk om het metabolisme van LGD-4033 te bestuderen.

Aan de hand van in vitro incubaties met HLM en detectie door GC-MS(/MS), LC-MS/MS en

LC-HRMS zal een predictie gemaakt worden van de voornaamste metabolieten gevormd uit

LGD-4033.

20

2. Materialen en methoden

2.1 Producten en reagentia

Het supplement van LGD-4033 werd aangekocht via het internet. Triamterene en

triamcinolone (controle van verschuiving retentietijd) kwamen respectievelijk van Smith

Kline en Cyanamid. Methandiënone (positieve controle) werd verkregen via het NMI. Als

interne standaarden (IS) werden 17α-methyltestosteron (Organon, Oss, Nederland) en

sibutramine (TRC) gebruikt. MSTFA en ethaanthiol (derivatisatiemengsel) komen

respectievelijk van Karl Bucher (Waldstetten, Duitsland) en Acros (Geel, België).

Ammoniumiodide (NH4I) voor het derivatisatiemengsel en natriumsulfaat (Na2SO4) voor de

droging werden aangekocht bij Merck (Darmstadt, Duitsland). Methanol (stopzetten

enzymreactie) en diëthylether (extractie) komen van Fisher Scientific (Loughborough, UK).

De ethanol voor het oplossen van LGD-4033 komt van Biosolve (Valkenswaard, Nederland).

De mobiele fases die gebruikt werden voor LC bestonden uit methanol en water (J.T. Baker,

Deventer Nederland), azijnzuur (Merck) en ammoniumacetaat (Biosolve). Air Liquide

(Bornem, België) is de leverancier van de gassen gebruikt voor de GC-MS analyse. Voor de

incubatiestudie werd gebruik gemaakt van HLM afkomstig van 20 à 30 gepoolde donoren en

gepoolde humane S9 leverfracties. De microsomen, S9, cofactoren (NADPH regenererend

systeem en de UGT reactie mix (UDPGA en alamethicine), en de fosfaatbuffer (pH 7,4) voor

de in vitro studies werden aangekocht bij Corning (Amsterdam, Nederland). De

carbonaatbuffer (pH 9,5) voor de LLE bestaat uit NaHCO3/K2CO3 (beide van Merck) in

verhouding 2/1.

2.2 Analyse van zuiverheid supplement LGD-4033

Vooraleer het metabolisme van LGD-4033 te bestuderen, werd eerst de zuiverheid van het

supplement LGD-4033 getest met zowel LC-MS/MS als GC- MS. Hiervoor werd 20 µl van

het supplement LGD-4033 (100 µg/ml) opgelost in 180 µl mobiele fase (H2O/methanol

50/50) voor analyse met LC. Voor de GC-MS analyse werd 20 µl LGD-4033 ingedampt

onder zuurstofvrije stikstofstroom (OFN) en werd nadien 100 µl derivatisatiemengsel

toegevoegd (zie sectie 2.4: staalvoorbereiding).

21

2.3 In vitro incubatie met HLM en S9

Na het controleren van de zuiverheid van LGD-4033, werd het fase I metabolisme bestudeerd.

Er werden verschillende epjes voorbereid (positieve controle, negatieve controle, blanco staal,

incubatiestaal) bij verschillende incubatietijden (2, 4, 6 en 18 uur). Bij de positieve controle

wordt een component (methandiënone) waarvan het in vitro metabolisme gekend is

geïncubeerd met HLM of S9 leverfracties. Dit dient om na te gaan of de in vitro

metabolisatiereactie correct is doorgegaan. De negatieve controle is een staal met HLM of S9

leverfracties waarin geen LGD-4033 aanwezig is, en het blanco staal bevat enkel LGD-4033

zonder microsomen/ S9 leverfracties. De microsomen en S9 leverfracties die bij -80°C

bewaard worden, werden eerst ontdooid op ijs. Aan alle epjes werd 226 µl fosfaatbuffer (0,1

M, pH 7,4) toegevoegd. Dit komt overeen met de fysiologische pH in het lichaam.

Vervolgens werd 15 µl van een NADPH regenererend systeem (10 mM) toegevoegd.

NADPH dient als cofactor voor de energievoorziening van de CYP enzymen die grotendeels

verantwoordelijk zijn voor het fase I metabolisme. Dit systeem wordt bekomen door het

samenvoegen van 12,5 µl van een oplossing A en 2,5 µl van een oplossing B. Oplossing A

bevat NADP+ en glucose-6-fosfaat, oplossing B bevat glucose-6-fosfaat dehydrogenase. Dit

enzym zal in aanwezigheid van zijn substraat glucose-6-fosfaat NADP+ omzetten naar

NADPH, dat hierdoor steeds opnieuw kan gebruikt worden door de CYP enzymen. Aan de

epjes met de positieve controle werd 2,5 µl methandiënone (4 mg/ml) toegevoegd als

referentiestandaard. Bij de negatieve controle epjes werd 2,5 µl ethanol in plaats van substraat

toegevoegd. Aan alle andere epjes werd 100 µl LGD-4033 (100 µg/ml) toegevoegd en na

indampen heropgelost in 2,5 µl ethanol. Dit mengsel van NADPH, fosfaatbuffer en substraat

werd gedurende 5 minuten bij 37°C geïncubeerd (Eppendorf Thermomixer). Nadien werd de

CYP reactie geïnitieerd door aan alle epjes behalve de blanco stalen 6,5 µl HLM of S9 fractie

(20 mg/ml proteïne) toe te voegen en na vortexen te incuberen gedurende 2, 4, 6 en 18 uur.

Aan de blanco stalen werd 6,5 µl fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,4) toegevoegd in plaats van

HLM. De incubatiestalen werden bij elke incubatietijd telkens in drievoud opgenomen. De

incubatiestalen met S9 fractie werden enkel gedurende 4 en 18 uur geïncubeerd.

Voor de studie van het fase II metabolisme (glucuronidatie) door middel van HLM werd dit

protocol wat aangepast. Om glucuronidatie door HLM te initiëren is het immers nodig om

uridine diphosphate glucuronic acid (UDPGA) als cofactor samen met de poriënvormende

component alamethicine toe te voegen. UDPGA zorgt ervoor dat de glucuronidegroep voor

het uitvoeren van de glucuronidatie aanwezig is. Hiervoor dient 70 µl UGT reactie mix

22

toegevoegd te worden (20 µl oplossing A met UDPGA (25 mM) en 50 µl oplossing B met

Tris-HCl (250 mM), MgCl2 (40 mM), alamethicine (0.125 mg/ml)). Er werd ook 171 µl

gedestilleerd water (in plaats van fosfaatbuffer) toegevoegd. LGD-4033 werd op dezelfde

manier en aan dezelfde concentratie toegevoegd als hierboven beschreven voor de fase I

experimenten.

De fase II reacties werden eveneens geïnitieerd door het toevoegen van 6.5 µL HLM (20

mg/ml proteïne) en werden vervolgens gedurende 2u geïncubeerd bij 37°C.

Om zowel het fase I als het fase II metabolisme te bestuderen werden naast de UGT

cofactoren ook de NADPH cofactoren toegevoegd. Hiervoor werden eerst de fase I reacties

geïnitieerd door de NADPH cofactoren, enkel oplossing B van de UGT reactie mix, 156 µL

gedestilleerd water en de HLM gedurende 2u te incuberen bij 37°C. Vervolgens werden de

fase II reacties geïnitieerd door het toevoegen van oplossing A van de UGT reactie mix. De

epjes werden vervolgens nog 2 bijkomende uren geïncubeerd (totale incubatietijd van 4u). Bij

deze fase II experimenten werden naast het incubatiestaal met LGD-4033 eveneens

controlestalen (negatief, blanco en positief) geïncubeerd.

Om de enzymreacties, zowel fase I als fase II, stop te zetten werd 250 µl ijskoude methanol

toegevoegd aan de epjes en na 15 minuten afkoelen in een ijsbad werden ze gecentrifugeerd

gedurende 5 minuten bij 4°C (12000 g, Universal 32R - Hettich Zentrifugen).

2.4 Staalvoorbereiding: extractie en derivatisatie

Na de in vitro fase I incubatiereacties door middel van HLM of S9 fracties werd een vloeistof-

vloeistof (LLE) extractie uitgevoerd. Deze extractie had als doel om de testcomponent en zijn

eventueel gevormde metabolieten uit hun matrix te extraheren. Bij de fase II incubatiestalen

werd deze extractie niet uitgevoerd te worden, aangezien een directe analyse van

geglucuronideerde metabolieten met LC-MS mogelijk is.

Na het centrifugeren werd 400 µl van de bovenste fase afgenomen en overgebracht in een

klein sovirelbuisje voor LLE of rechtstreeks in een vial voor de directe analyse met LC-MS.

Er werd nadien 50 µl 17α-methyltestosteron als interne standaard (IS) toegevoegd. Deze IS

dient toegevoegd te worden om te corrigeren voor mogelijke meetfouten of

onnauwkeurigheden bij het pipetteren tijdens de staalvoorbereiding, of om relatieve

retentietijden te bepalen. De stalen, waarop een LLE uitgevoerd moest worden, werden

23

vervolgens ingedampt onder een OFN. Hierdoor wordt de nog aanwezige methanol

(stopzetten enzymreactie) verwijderd. Methanol zou immers kunnen interfereren bij de

extractie. De eigenlijke extractie bestond uit het toevoegen van 1 ml vloeibare carbonaatbuffer

(pH 9,5) en 5 ml diëthylether. De buizen werden dan 20 minuten gerold en vervolgens 5

minuten gecentrifugeerd bij 2500 toeren (1500 g, Eppendorf centrifuge 5810). De bovenste

(organische) fase werd nadien overgebracht in een nieuwe sovirelbuis, waarna ze gedroogd

werd door 100 mg Na2SO4 toe te voegen en over te gieten in een andere sovirelbuis.

Uiteindelijk werden de geëxtraheerde stalen terug ingedampt onder OFN.

Voor stalen die met GC-MS dienden geanalyseerd te worden, werd na het droogdampen

onder OFN 100 µl van een trimethylsilyl(TMS)-derivatiseringsmengsel toegevoegd. Dit is

een mengsel van N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (MSTFA), NH4I en

ethaanthiol (500/4/2). Bij deze derivatisatie werden de stalen gedurende 1 uur in een oven

geplaatst bij 80±5°C. Het doel van dit proces is om de vluchtigheid, de thermische stabiliteit

van de componenten, en eveneens de chromatografische scheiding te verbeteren. Tijdens deze

fase worden hydroxyl- en ketofuncties omgezet naar respectievelijk TMS-ether en TMS-enol

derivaten. Nadien werd 50 µl overgebracht in vials met insert voor GC-MS analyse. Voor

analyse met LC-MS is geen derivatiseringsstap nodig en werden de stalen opgelost in 200 µl

mobiele fase (methanol/H2O 50/50) en vervolgens overgebracht in vials.

2.5 Opvangen van fracties

Met als doel meer informatie over de structuur van de gedetecteerde metabolieten met LC-

MS/MS te bekomen, werden verschillende fracties van het eluens afkomstig van zowel de

negatieve, blanco, als 4 uur incubatiestalen gecollecteerd. Om eventuele verschuivingen van

de retentietijden van de voordien gevonden metabolieten in de incubatiestalen na te gaan werd

triamcinolone/triamterene aan de stalen toegevoegd. Aan de hand van de retentietijden van de

gevonden metabolieten in deze 4 uur incubatiestalen, werden de tijdstippen vastgelegd

waarop de fracties verzameld werden. In totaal werden er 8 fracties verzameld uit zowel het

negatief, blanco als 4 uur incubatiestaal. Deze fractiecollectie werd telkens in drievoud

uitgevoerd. In alle 3 epjes (negatief, blank, 4 uur incubatiestaal) werd eerst 20 µl

triamcinolone toegevoegd als referentie en 200 µl mobiele fase. Het eerste deel van het eluens

ging van de kolom naar de detector. Vanaf fractie 1 tot en met 8 werd op de vastgelegde

24

tijdstippen het eluens uit de kolom naar de “waste” (in plaats van naar de detector) geleid en

daar opgevangen in opeenvolgende proefbuisjes voor de opeenvolgende fracties.

2.6 Instrumentatie

Na de in vitro incubaties en de extractie werden de stalen geanalyseerd met LC-MS/MS.

Hiervoor werd gebruik gemaakt van de TSQ Quantum Discovery MAX triple quadrupool

massaspectrometer. Dit toestel werd aangekocht bij Thermo Scientific. Er werd een mobiele

fase op basis van methanol (mobiele fase A) en water (mobiele fase B) gebruikt. Beide

oplossingen bevatten 1 mM ammoniumacetaat en 0,1% azijnzuur aangevuld met

respectievelijk methanol en water. Bij de start van de analyse bestond de mobiele fase voor

30% uit methanol en voor 70% uit water. Na acht minuten werd overgeschakeld op 55%

methanol en 45% water. Deze verhouding werd aangehouden tot 29,5 minuten. Op dit tijdstip

steeg het percentage methanol tot 95%. Na 31 minuten werd opnieuw de oorspronkelijke

verhouding ingesteld (30% methanol en 70% water). Met deze verhouding werd de analyse

van het staal dan afgewerkt. Het debiet bedroeg 250 µl/minuten, het injectievolume 20 µl, en

de injectiemodus werd ingesteld op “no waste”. De analyse van één staal duurde 35 minuten.

De massaspectrometer werd enerzijds gebruikt in de full-scan modus, waarbij gescand werd

van m/z 30-1500. Anderzijds werd ook een NLS (verlies van HF, m/z 20 en verlies van

acetaat, m/z 60) toegepast. Hierbij werd het massagebied m/z 200-600 afgescand. De full-scan

werd uitgevoerd in zowel negatieve als positieve modus, de NLS enkel in negatieve modus.

Verder werd ook een product-ion scan uitgevoerd van M1 tot en met M5 in zowel negatieve

modus (m/z 351, 355, 367 en 369) als positieve modus (m/z 353, 357, 369 en 371). Bij elk

van deze precursor-ionen werd een collisie-energie van 10, 20, 30, 40 en 50 eV toegepast en

werd het massagebied m/z 30-600 afgescand. Daarnaast werd ook gebruik gemaakt van een

LC-MS toestel met een hoge resolutie massaspectrometer (HRMS), meer bepaald een

Exactive benchtop Orbitrap-based MS en een Q-Exactive MS (Thermo Scientific) bij een

resolutie van respectievelijk 50 000 en 70 000. De LC kolom voor zowel LC-MS/MS als LC-

HRMS was een SunFire™ C18 kolom (50 × 2,1 mm, interne diameter: 3,5 μm) van Waters

(AH Etten-Leur, Nederland). Er werd opnieuw 20 µl staal geïnjecteerd. De LC condities

(mobiele fase en gradiënt) waren hetzelfde als bij LC-MS/MS. Op het Exactive toestel werd

een full-scan uitgevoerd in het gebied m/z 100-2000 in positieve en negatieve modus.

Bovendien werd ook een ‘high collission dissocation (HCD)’ met een collisie-energie van 20

25

eV binnen het gebied m/z 50-500 (positieve en negatieve modus) uitgevoerd. De tijd nodig

voor de analyse van één staal bedroeg 30,5 minuten. Op het Q-Exactive toestel werd ook een

product-ion scan uitgevoerd in positieve en negatieve modus waarbij dezelfde collisie-

energieën en precursor-ionen geselecteerd werden als op het LC-MS/MS toestel.

Ten slotte werden ook analyses uitgevoerd met GC-MS en GC-MS/MS. Hiervoor werd

gebruik gemaakt van een Agilent 6890 gaschromatograaf en een Agilent 5973

massaspectrometer (GC-MS) of een Agilent 7890 gaschromatograaf met een Agilent 7000

massaspectrometer (GC-MS/MS). Er werd telkens 1 µl van het staal geïnjecteerd door een

autosampler met een split/splitless-injector. De gaschromatograaf was uitgerust met een JW

Ultra-1 capillaire kolom (afmetingen: 17m x 200 µm, interne diameter: 0,11 µm). Dit is een

fused silica kolom met als stationaire fase dimethylpolysiloxaan. Als mobiele fase werd

Helium gebruikt. Bij GC-MS/MS werd gewerkt met CI, waarbij ammoniak als ionisatiegas

fungeerde. Het gasdebiet bedroeg 1,0 ml/minuut en de gasdruk 16,24 psi en 0,89402 psi bij

GC-MS en GC-MS/MS respectievelijk. De scheiding werd geregeld door een

temperatuurprogramma. De initiële temperatuur was 120 °C bij GC-MS en 90 °C bij GC-

MS/MS. Het ingestelde temperatuurprogramma verschilde tussen GC-MS en GC-MS/MS. Bij

GC-MS steeg de temperatuur tot 180 °C aan een snelheid van 70 °C/minuut. Dan nam de

temperatuur toe aan een snelheid van 4 °C/minuut tot 234 °C, en uiteindelijk werd de

temperatuur verhoogd met 30 °C/minuut tot 300 °C. Deze finale temperatuur werd 2 minuten

aangehouden. Bij GC-MS/MS werd de temperatuur eerst verhoogd tot 125 °C aan 70

°C/minuut, daarna tot 194 °C aan 35°C/minuut, tot 215 °C aan 10 °C/minuut, tot 250 °C aan

20 °C/minuut, tot 275 °C aan 30 °C/minuut en ten slotte tot 320 °C aan 75 °C/minuut. Hierbij

werd de finale temperatuur 1,3 minuten aangehouden. De totale analysetijd van één staal was

18,76 minuten voor GC-MS en 9,35 minuten voor GC-MS/MS. De GC single-quadrupool

massaspectrometer scande het gebied m/z 50-800.

26

3. Resultaten

3.1 Analyse van zuiverheid van LGD-4033 supplement met LC-MS/MS en GC-MS

Alvorens het metabolisme van LGD-4033 te bestuderen, werd de zuiverheid van zijn

supplement nagegaan door het te analyseren in full-scan modus op LC-MS/MS en GC-MS.

Hieruit blijkt dat LGD-4033 elueert na een RT van 17,4 min op LC-MS/MS en een RT van

5,1 min bij GC-MS (figuur 10 en 11). Bovendien bedroeg het massaverschil tussen de

theoretische massa en de experimentele massa van LGD-4033 bij de full-scan analyse op LC-

HRMS respectievelijk 3,81 en 2,77 ppm in geprotoneerde en gedeprotoneerde vorm, wat

aanvaardbaar is (tabel 3). Het massaverschil is hier weergegeven in ‘parts per million (ppm)’

Figuur 10: Chromatogrammen (TIC) en massaspectrum (full-scan in negatieve modus) op LC-MS/MS van LGD-

4033.

TIC

(negatieve modus) Full-scan MS in negatieve modus

TIC

(positieve modus)

27

Figuur 11: Chromatogram (TIC) en massaspectrum (full-scan) van LGD-4033 (na TMS-derivatisatie) op GC-

MS

3.2 Incubatiestalen met HLM en S9 fracties voor de studie van het fase I metabolisme

Bij de in vitro studie van het fase I metabolisme van LGD-4033 werden zowel 2u, 4u, 6u en

18u incubatiestalen met HLM geanalyseerd, bovendien werden ook een 4u en een 18u

incubatiestaal met humane S9 leverfracties geanalyseerd. Er werd zowel een full-scan (in

positieve en negatieve modus) als een NLS uitgevoerd op LC-MS/MS. Om de pieken in het

chromatogram op te sporen die specifiek zijn voor metabolieten, werden de incubatiestalen

vergeleken met blanco stalen en met negatieve stalen. Bij de incubatie van de positieve

controle werd er naast methandiënone zelf bovendien een piek gedetecteerd van zijn

gehydroxyleerde metaboliet (6β-hydroxymethandienone) bij full-scan in positieve modus

(m/z 317). Dit is een indicatie dat de metabolisatiereactie met HLM correct is verlopen. De IS

(17α-methyltestosteron) had een RT van 15,6 min, zoals te verwachten is op basis van zijn

gekende chromatografische eigenschappen. Het “Total Ion Chromatogram (TIC)” met de

gedetecteerde metabolieten staat weergegeven in figuur 12 en 13.

1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 0 3 8 0 4 0 0

0

2 0 0 0

4 0 0 0

6 0 0 0

8 0 0 0

1 0 0 0 0

1 2 0 0 0

1 4 0 0 0

1 6 0 0 0

1 8 0 0 0

2 0 0 0 0

2 2 0 0 0

2 4 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

S c a n 2 4 8 ( 5 . 0 5 6 m in ) : R E F - L G D . D

2 3 9

3 1 3

1 9 7

1 7 0

2 2 01 8 5 3 9 52 8 51 5 5 3 2 8 4 1 02 5 1 2 6 9 2 9 9 3 4 33 5 53 6 72 0 9 3 8 0

TIC

Full-scan MS

28

Figuur 12: Chromatogram (TIC) met LC-MS van een 6u incubatiestaal met HLM (rechts) en vergelijking met

een blanco staal (links). De vier gedetecteerde metabolieten en de parent compound zijn aangeduid op het

bovenste chromatogram (full-scan in negatieve modus), de IS op het onderste chromatogram (full-scan in

positieve modus).

Het chromatogram van de incubatiestalen toonde aan dat er vier pieken terug te vinden zijn,

die specifiek zijn voor metabolieten van LGD-4033. Zoals uit figuur 12 kan afgeleid worden,

zijn deze metabolieten het duidelijkst te zien bij een full-scan in negatieve modus. De

retentietijden van de metabolieten zijn weergegeven in tabel 3.

29

Ook in het chromatogram dat opgenomen werd in NLS modus met verlies van acetaat konden

dezelfde vier metabolieten gedetecteerd worden als in full-scan modus (figuur 13).

Figuur 13: Chromatogram (TIC) op LC-MS/MS van een 4u incubatiestaal met HLM, opgenomen in NLS met

verlies van acetaat (negatieve modus). De vier metabolieten zijn aangeduid.

De overeenkomstige massa’s van de vier metabolieten en de parent compound (PC) zijn

weergegeven in tabel 3. Hieruit kan afgeleid worden dat de fase I metabolisatiereactie een

toename in massa van respectievelijk 14, 18 en 30 Da teweegbrengt. Dit in combinatie met de

meest voorkomende fase I reacties beschreven in de literatuur leidt tot de hypothese dat M1

gevormd wordt door hydroxylatie en vorming van een dubbele binding, M2 door hydroxylatie

en reductie met opening van de pyrrolidinering, en M3/M4 door twee hydroxylaties en

vorming van een dubbele binding.

Vervolgens werden op basis van deze brutoformules de exacte massa’s van de vier

metabolieten berekend met behulp van de Xcalibur software (LC-MS) en werd het

massaverschil (in ppm) bepaald tussen deze theoretische massa’s en de experimentele massa’s

30

in het LC-HRMS (Exactive) massaspectrum van de incubatiestalen. Dit massaverschil werd

berekend voor enkele adductionen van de metabolieten. Ook voor de parent compound en de

IS werd dit gedaan. De resultaten staan weergegeven in tabel 3. Een massaverschil tot 10 ppm

wordt aanvaard.

Naar aanleiding van de poster van Sobolevsky T et al. waarin het metabolisme van LGD-4033

via in vitro en in vivo studies onderzocht werd, werd eveneens een herevalutatie van de data

uitgevoerd. Hierbij werd naast het vergelijken van de TIC van de HLM incubatiestalen met

deze van de controlestalen, eveneens “Extracted Ion Chromatograms” (EIC) vergeleken

(figuur 14). De ionen die in deze EIC opgevraagd werden zijn gebaseerd op

metabolisatiereacties die reeds beschreven zijn in de literatuur: oxidaties (bijvoorbeeld

hydroxylatie), reductie, combinaties van deze, ...[19, 20]

Figuur 14: EIC van M1, M2, M3/M4 en M5 in een blanco staal (links) en een 4u incubatiestaal met HLM

(rechts) op LC-HRMS in gedeprotoneerde modus.

M1

M2

M3/M4

M5

31

Tabel 3: Vergelijking tussen theoretische en experimentele massa's van de vijf metabolieten en de parent

compound van LGD-4033. De IS is 17α-methyltestosteron.

Component Chemische

formule

Adduct ion Theoretische

m/z

Experimentele

m/z

Massa

deviatie

(ppm)

RT

(min)

IS C20H30O2

[M+H]+ 303.2318567 303.23178 0.25

17.95 [M+K]

+ 341.1877386 341.18768 0.17

[M+Na]+ 325.2138014 325.21387 0.21

[M+NH4]+ 320.2584058 /

LGD-4033 C14H12F6N2O

[M-H]- 337.0781055 337.07712 2.77

19.26

[M+CH3COO]- 397.0992349 397.09988 1.88

[M+H]+ 339.0926588 339.09174 3.81

[M+K]+

377.0485407 377.04755 2.63

[M+Na]+ 361.0746035 361.07370 2.50

[M+NH4]+ 356.1192079 356.11859 1.74

M1 C14H10F6N2O2

[M+CH3COO]- 411.0784994 411.07834 0.39

9.55 [M-H]- 351.0573701 351.05734 0.09

[M+H]+ 353.0719233 353.07184 0.24

M2 C14H14F6N2O2

[M+CH3COO]- 415.1097995 415.11005 0.60

10.44 [M-H]- 355.0886702 355.08868 0.03

[M+H]+ 357.1032234 357.10309 0.37

M3/M4

C14H10F6N2O3

[M+CH3COO]- 427.0734140 / /

17.22/

17.77

[M-H]- 367.0522847 367.08841 98

(>10ppm)

[M+H]+ 369.0668379 / /

C15H14F6N2O2

[M+CH3COO]- 427.1097995 427.10910 1.41

[M-H]- 367.0886702 367.08840 0.74

[M+H]+ 369.1032234 369.10300 0.60

M5 [19] C14H12F6N2O3

[M-H]- 369.0679347 369.06769 0.66

10.67 [M+CH3COO]-

429.0890640 / /

[M+H]+ 371.0824880 371.08197 1.40

Uit tabel 3 blijkt dat het massaverschil tussen de theoretische en experimentele massa voor

M3 en M4 te groot is, zodat de vooropgestelde fase I reactie (2 hydroxylaties en vorming van

een dubbele binding) voor deze metabolieten niet aanvaard kan worden. Daarom werd een

nieuwe verklaring voor metabolieten 3 en 4 gezocht. Met behulp van de Xcalibur software op

de Exactive werd een nieuwe brutoformule gegenereerd met een massa die de experimentele

massa zo dicht mogelijk benadert, rekening houdend met de hoeveelheid fluor- en

stikstofatomen die LGD-4033 bevat. De brutoformule C15H14F6N2O2 (afwijking: -0,709 ppm)

was het meest waarschijnlijk. Dit betekent dat er aan de brutoformule van LGD-4033 CH2O

wordt toegevoegd.

Vervolgens werd een product-ion scan in negatieve en positieve modus uitgevoerd op LC-

MS/MS en Q-Exactive, om na te gaan welke fragmenten van LGD-4033 gevormd worden,

om zo fragmentatiepatronen bij de metabolieten te kunnen verklaren. De belangrijkste

fragmentionen van LGD-4033 in negatieve modus hadden een massa van 170, 239 en 267 Da.

32

In positieve modus hadden de belangrijkste fragmentionen een massa van 199, 213, 220 en

240 Da. Er werd getracht om de gevonden fragmentionen te verklaren op basis van de

veronderstelde structuur van LGD-4033 zoals die weergegeven staat in figuur 3. Met behulp

van het programma “ChemBioDraw (Athena UGent) werd deze structuur op verschillende

manieren gesplitst tot fragmenten, waarvan de massa’s overeenkomen met deze van de

gevonden fragmentionen in het massaspectrum (figuur 15, A en B).

Nadien werd het referentiestaal van LGD-4033 ook geanalyseerd met LC-HRMS (Exactive en

Q-Exactive) om meer informatie af te leiden uit de massa’s van de fragmentionen. Hierbij

werd een fragmentatie uitgevoerd bij verschillende collisie-energieën (10, 20, 30, 40 en 50

eV). Aan de hand van de brutoformule van de vooropgestelde fragmenten (figuur 15, A en B)

werden de exacte massa’s bepaald van deze theoretische fragmenten. Vervolgens werd het

massaverschil berekend tussen de theoretische fragmenten en de experimenteel gedetecteerde

fragmenten in het HCD massaspectrum (tabel 4). Een massaverschil tot 10 ppm wordt

aanvaard.

Met als doel meer structuurinformatie over de metabolieten te bekomen, werd het

fragmentatiepatroon van de vijf metabolieten bestudeerd. Dit gebeurde in eerste instantie door

een product-ion scan uit te voeren op LC-MS/MS en LC-HRMS, waarbij zowel de

gedeprotoneerde metabolieten (m/z 351, 355, 367 en 369) als de geprotoneerde metabolieten

(m/z 353, 357, 369 en 371) als precursor-ion geselecteerd werden (figuur 15, A en B) . Elk

precursor-ion werd gefragmenteerd bij verschillende collisie-energieën: 10, 20, 30, 40 en 50

eV.

33

Figuur 15 A: Product-ion scan massaspectra in negatieve modus (LC-MS/MS) van de parent compound en

metabolieten M1, M2, M3/M4 en M5. De MS van de parent compound, M1 en M3/M4 zijn opgenomen bij een

collisie-energie van 20 eV, die van M2 en M5 bij een collisie-energie van 30 eV. De overeenkomstige

fragmenten zijn aangeduid in de structuur van LGD-4033.

Product-ion MS van LGD-4033

Product-ion MS van M1


Product-ion MS

van M3/M4


34

Figuur 15 B: Product-ion scan massaspectra in positieve modus van de vijf metabolieten en de parent compound

op Q-Exactive. De MS van parent compound, M1 en M3/M4 zijn opgenomen bij een collisie-energie van 40 eV,

die van M2 en M5 bij een collisie-energie van 30 eV. De fragmenten zijn aangeduid in de structuur van LGD-

4033.

Product-ion MS van

LGD-4033



Product-ion MS van M3/M4 Product-ion MS van M5

35

Om meer te weten te komen over het soort modificatie van de verschillende metabolieten

werden ook product-ion scans van de 4u en 18u incubatiestalen uitgevoerd met LC-HRMS

(zowel op Exactive als Q-Exactive). Op basis van de brutoformule die gekoppeld is aan

fragment 1, 2, 3 en 7 van LGD-4033 met inclusie van de verschillende hypothetische

metabolisatiereacties werden exacte massa’s berekend. Vervolgens werden deze theoretische

massa’s opnieuw vergeleken met de experimentele massa’s uit het massaspectrum. Hetzelfde

werd gedaan voor fragment 1, 2, 3, 4, 5, 6 en 7 van de parent compound (tabel 4).

Tabel 4: Fragmenten van LGD-4033 met en zonder modificatie gedetecteerd in het HRMS massaspectrum (Q-

exactive in negatieve en positieve modus) van de vijf metabolieten

Component Chemische formule Adduct

ion

Theoretische

m/z

Experimentele

m/z

Massa

deviatie

(ppm)

LGD-4033

A) Fragment 1

B) Fragment 2

C) Fragment 3

D) Fragment 4

E) Fragment 5

F) Fragment 6

G) Fragment 7

[M-H]-

170.0223071

267.0750709

239.0801563

239.0790595

199.0477594

213.0634094

240.0868845

220.0806563

170.02274

267.07590

239.04446

239.07875

199.04760

213.06316

240.08658

220.08050

2.55

3.10

149.37

1.29

0.80

1.17

1.27

0.71

[M+H]+

M1

A) C13H10F3N2O2

B) C8H1F3NO

C) C12H8F3N2O

D) Fragment 1

E) Fragment 2

F) Fragment 3

G) Fragment 7

H) C12H8F2N2O

[M-H]-

281.0543354

184.0004748

253.0583240

170.0223071

267.0750709

239.0790595

220.0806563

234.0599208

281.05438

/

253.02316

170.02219

/

239.08023

/

234.05969

0.16

/

139.13

0.69

/

4.90

/

0.99 [M+H]+

M2

A) C13H14F3N2O2

B) C8H5F3NO

C) C12H12F3N2O

D) Fragment 1

E) Fragment 2

F) Fragment 3

[M-H]-

285.0856356

188.0317750

257.0896242

170.0223071

267.0750709

239.0790595

285.08581

/

257.09091

170.02237

/

239.07893

0.61

/

5.00

0.37

/

0.54

36

G) Fragment 7

H) C12H12F2N2O [M+H]

+

220.0806563

238.0912210

/

/

/

/

M3/M4

A) C13H9F3N2O3

C14H14F3N2O2

B) C9H5F3NO

C) C13H12F3N2O

D) Fragment 1

E) Fragment 2

F) Fragment 3

G) Fragment 7

H) C13H12F2N2O

[M-H]-

297.0492500

297.0856356

200.0317750

269.0896242

170.0223071

267.0750709

239.0790595

220.0806563

250.0912210

297.08557

297.08557

/

/

170.02213

/

/

/

/

122

0.22

/

/

1.04

/

/

/

/ [M+H]

+

M5

A) C13H11F3N2O3

B) C8H4F3NO2

C) C12H11F3N2O2

D) Fragment 1

E) Fragment 2

F) Fragment 3

G) Fragment 7

H) C12H10F2N2O2

[M-H]-

299.0649001

202.0121363

271.0699855

170.0223071

267.0750709

239.0790595

220.0806563

252.0704855

299.06445

/

/

/

/

/

/

/

1.51

/

/

/

/

/

/

/ [M+H]

+

De fragmentionen met m/z 281, 285 en 297 en 299 van respectievelijk M1, M2, M3/M4 en

M5 zoals in tabel 4 weergegeven wordt, blijken allemaal uit fragment 2 van LGD-4033 (m/z

267) te bestaan. Het massaverschil tussen enerzijds de theoretische massa die berekend werd

uit de brutoformule van fragment 2 met zijn specifieke metabolisatiereactie, en anderzijds de

experimentele massa’s van hun product-ionen is immers aanvaardbaar. Daarnaast werd dit

fragment niet als aparte massa teruggevonden in hun product-ion scan massaspectrum. De

massa van fragment 1 van LGD-4033 (m/z 170) is wel terug te vinden in het massaspectrum

van de product-ionen, behalve voor M5. Bovendien kon fragment 3 (m/z 239) van LGD-4033

gedetecteerd worden bij de product-ion scan van M1 en M2. In positieve modus konden

dezelfde fragmenten echter niet gedetecteerd worden met LC-HRMS. Naar aanleiding van de

poster van Sobolevsky et al. [19] werd het fragment met m/z 220 met en zonder inclusie van

de metabolische modificatie in positieve modus opgevraagd met Q-Exactive (figuur 15 B).

De stalen werden eveneens geanalyseerd door middel van directe injectie op LC-MS om

eventuele zure metabolieten te kunnen detecteren. Dezelfde metabolieten werden echter

gedetecteerd bij analyse van de incubatiestalen zonder een extractiestap.

37

Nadien werd besloten om verschillende fracties van de in vitro stalen te collecteren met LC en

deze fracties vervolgens te analyseren met zowel LC-MS als GC-MS, met als doel meer

structuurinformatie van de vijf metabolieten te bekomen. Vooraf werd een controle

uitgevoerd van de retentietijden van metabolieten, parent compound, en twee

referentiecomponenten (triamterene en triamcinolone). Aan het 4u incubatiestaal, blanco staal

en negatief staal werd uiteindelijk triamcinolone toegevoegd om een mogelijke verschuiving

van de retentietijden na te gaan. Er werden 8 verschillende fracties gecollecteerd van zowel

het 4u incubatiestaal, negatief staal en het blanco staal. De fractiecollectie gebeurde in

drievoud per staal. De tijdstippen waarop de verschillende fracties gecollecteerd werden en de

aanwezige componenten zijn weergegeven in tabel 5. De vier metabolieten en de parent

compound werden in hun respectievelijke fracties gedetecteerd bij full-scan analyse op LC-

MS/MS.

Tabel 5: Resultaten fractiecollectie

Fractie Tijdstip collectie (min) Aanwezige component GC-MS analyse

RT (min) m/z na

TMS-derivatisatie

1 7-8,5 4,55 463, 389, 347, 147, 73

2 8,5-10,1 M1 / /

3 9,6-11 M2 / /

4 11-14 / /

5 14-15,3 M3 / /

6 15,3-17,2 M4 5,114

15,617 (IS)

503, 350, 335, 239, 197

446, 301, 73

7 17,2-19,5 PC 5,106 410, 239, 197, 170, 77

8 19,5-25 / /

Ten slotte werden de gecollecteerde fracties ook geanalyseerd via GC-MS(/MS), alsook de 4u

en 18u incubatiestalen. De massa’s van M1, M2, M3/M4 na derivatisatie met TMS

(respectievelijk m/z 496, 500, 440 (methoxylatie) en 584 (twee hydroxylaties en reductie

dubbele binding)) werden niet gedetecteerd in het massaspectrum van hun overeenkomstige

fracties. De massa van de parent compound (m/z 410) werd daarentegen wel gedetecteerd

(tabel 5). De incubatiestalen (4u en 18u) en de controlestalen werden eveneens geanalyseerd

met GC-MS zonder voorgaande fractiecollectie. Hierbij kon wel de aanwezigheid van M1

38

afgeleid worden en in het 4u incubatiestaal werd bovendien een bijkomende metaboliet M6

gedetecteerd (tabel 6).

Tabel 6: Resultaten analyse incubatiestalen met GC-MS

Retentietijd Massa’s Staal Metaboliet

5,34 253,197, 170 4u en 18u incubatiestaal M1

6,891 170, 237, 341, 408 4u incubatiestaal M6

Bij de analyse met GC-MS/MS werden geen bijkomende metabolieten gedetecteerd.

39

3.3 Incubatiestalen met HLM voor de studie van het fase II metabolisme

Na het vergelijken van een fase I+II incubatiestaal met HLM met een fase I+II blanco staal en

een fase II incubatiestaal kon de glucuronidatie van enkele van de voorheen gedetecteerde

fase I metabolieten waargenomen worden (figuur 16). Enkel voor de parent compound en M2

konden alle opgevraagde adductionen van het geglucuronideerde metaboliet gedetecteerd

worden met een voldoende grote abundantie. Voor M1 konden geen adductionen

teruggevonden worden. Voor M3/M4 en M5 konden enkel het gedeprotoneerde en het

geprotoneerde geglucuronideerd metaboliet respectievelijk gedetecteerd worden met een lage

abundantie (tabel 7).

Figuur 16: Chromatogrammen (EIC) in full-scan modus van de geglucuronideerde fase I metabolieten

gedetecteerd in een fase I+II incubatiestaal van LGD-4033 met HLM (rechts) en vergelijking met een fase I+II

blanco staal (links). De geglucuronideerde parent compound en M1, M2 en M3/M4 zijn weergegeven in

gedeprotoneerde vorm, M5 in geprotoneerde vorm.

40

Tabel 7: Vergelijking tussen theoretische en experimentele massa's van enkele adductionen van potentieel

geglucuronideerde metabolieten

Component Chemische

formule

Adduct ion Theoretische

m/z

Experimentele

m/z

Massa

deviatie

(ppm)

RT

(min)

LGD-4033G C20H20F6N2O7

[M+H]+ 515.1247466 515.12512 0.72

4.65 [M-H]

- 513.1101934 513.11011 0.16

[M+Na]+

537.1066913 537.10693 0.45

[M+NH4]+

532.1512957 532.15155 0.47

M1G

C20H18F6N2O8

[M+H]+ 529.1040112 / /

/ [M-H]

- 527.0894579 /

[M+Na]+ 551.0859558 /

[M+NH4]+ 546.1305603 /

M2G

C20H22F6N2O8

[M+H]+ 533.1353113 533.13507 0.45

3.48 [M-H]

- 531.1207580 531.12067 0.17

[M+Na]+ 555.1172560 555.11682 0.79

[M+NH4]+ 550.1618604 550.16162 0.44

M3/M4G

C21H22F6N2O8

[M+H]+ 545.1353113 /

4.12

[M-H]- 543.1207580 543.12091 0.28

[M+Na]+ 567.1172560 /

[M+NH4]+ 562.1618604 /

[M+CH3COO]- 603.1418873 /

M5G

C20H20F6N2O9

[M+H]+ 547.1145758 547.11664 3.77

3.88 [M-H]

- 545.1000226 /

[M+Na]+ 569.0965205 /

[M+NH4]+ 564.1411249 /

41

4. Bespreking

4.1 Analyse van zuiverheid van LGD-4033 supplement met LC-MS/MS en GC-MS

De analyse van het supplement diende om na te gaan of LGD-4033 hierin aanwezig is, en om

mogelijke contaminaties vast te stellen. Zowel op LC-MS(/MS), LC-HRMS en GC-MS(/MS)

kon LGD-4033 gedetecteerd worden en werden er geen contaminaties vastgesteld. Wat de

analyse met LC-MS/MS betreft, werd LGD-4033 zowel in full-scan modus als in NLS modus

gedetecteerd. Er werd zowel een NLS met verlies van fluor als met verlies van acetaat

uitgetest. Enkel de laatste liet echter een goede detectie van de parent compound toe. Bij de

full-scan analyses met LC-MS/MS was deze component het duidelijkst zichtbaar in de

negatieve modus. In het full-scan MS in negatieve modus kon een kleine piek gedetecteerd

worden van de gedeprotoneerde molecule (m/z 337) en een grotere piek van het acetaatadduct

van de molecule (m/z 397). Het massaverschil tussen de theoretische massa’s van de

verschillende adductionen van LGD-4033 en de experimentele massa’s in het LC-HRMS

massaspectrum was steeds kleiner dan 5 ppm. Aangezien een massadeviatie tot 10 ppm

aanvaardbaar is, toont deze analyse aan dat deze SARM vrij accuraat kan gedetecteerd

worden. In het GC-MS massaspectrum was er naast de massa (m/z 410) van de

gederivatiseerde parent compound (door TMS: toename in massa van 72 Da) ook een piek bij

m/z 395 waarneembaar, afkomstig van het verlies van een methylgroep van TMS.

4.2 Incubatiestalen met HLM en S9 fracties voor de studie van het fase I metabolisme

Bij de in vitro incubatie van LGD-4033 met humane levermicrosomen waarbij NADPH als

cofactor werd gebruikt, werden er vijf fase I metabolieten gedetecteerd op LC-MS/MS en LC-

HRMS. In figuur 13 zijn de resultaten weergegeven van een 6u incubatiestaal met HLM.

Dezelfde fase I metabolieten konden ook gedetecteerd worden bij de 2u, 4u en 18u HLM en

4u en 18u S9 leverfractie incubatiestalen. De metabolieten M1, M2, M3 en M4 vertoonden

net zoals de parent compound de hoogste gevoeligheid bij full-scan in negatieve modus en

NLS. Zowel de gedeprotoneerde molecule als het acetaatadduct werden gedetecteerd, maar

het acetaatadduct ion vertoonde in overeenstemming met LGD-4033 zelf de hoogste

abundantie. De toename in massa ten gevolge van de fase I metabolisatie bedraagt

respectievelijk 14 Da (M1), 18 Da (M2) en 30 Da (M3/M4). Op basis van deze toename in

massa en de meest voorkomende fase I modificaties die beschreven zijn in de literatuur, werd

een hypothese opgesteld over de fase I modificatie van de vier metabolieten. M1 zou gevormd

42

worden door hydroxylatie en vorming van een dubbele binding, M2 door hydroxylatie en

reductie van een dubbele binding, en M3/M4 door twee hydroxylaties en vorming van een

dubbele binding. Aangezien M3 en M4 dezelfde massa maar een verschillende retentietijd

vertonen, zijn dit vermoedelijk isomeren van elkaar. Dit betekent dat ze dezelfde

brutoformule hebben, maar een licht verschillende structuur.

Bij de product-ion scan in negatieve modus van de LGD-4033 molecule waren er drie

specifieke fragmenten waarneembaar met een m/z waarde van respectievelijk 170 (fragment

1), 267 (fragment 2) en 239 (fragment 3). Deze product-ionen werden door Thevis en

Schänzer reeds beschreven, bovendien werden de klievingsplaatsen voor fragment 1 en 2

bepaald [9]. De aanwezigheid van deze drie fragmenten werd bovendien bevestigd met LC-

HRMS. Het massaverschil tussen de experimentele massa en de theoretische massa van

fragment 3 in negatieve modus met HCD (149 ppm) was echter hoger dan de aanvaardbare

limiet van 10 ppm. Het massaverschil van dit fragment in positieve modus met HCD (1,29

ppm) bleek echter binnen de aanvaardbare grens te liggen. Bovendien was het massaverschil

voor fragmenten 4, 5, 6 en 7 uit de poster van Sobolevsky et al. [19] ook telkens lager dan 5

ppm. Volgens deze onderzoekers kan er na in vitro incubatie van LGD-4033 met HLM en na

orale inname van LGD-4033 door een mannelijke proefpersoon een dihydroxy metaboliet

gedetecteerd worden met LC-HRMS. Deze metaboliet blijkt dus belangrijk te zijn voor

humane excretiestudies. De aanwezigheid van deze metaboliet, M5, werd in deze masterproef

bevestigd. Wanneer de adductionen van M5 opgevraagd werden aan de hand van hun exacte

massa bleek er immers een piek voor te komen bij RT 10,7 minuten. Bovendien was het

massaverschil tussen de theoretische en experimentele massa’s aanvaardbaar. Het humaan

belang van de andere gedetecteerde metabolieten in deze masterproef is moeilijk te

achterhalen, aangezien in de studie van Sobolevsky et al. LC-MS enkel in positieve modus

werd toegepast.

Het moleculair ion van de vijf metabolieten kon niet gedetecteerd worden met GC-MS in de

incubatiestalen en in de fracties. Enkel de detectie van M1 in de incubatiestalen kan afgeleid

worden door de aanwezigheid van een fragmention met m/z 253. Dit kan wijzen op fragment

3 van LGD-4033 met de modificatie van M1. Misschien zijn de metabolieten niet vluchtig

genoeg of zijn ze thermisch niet stabiel genoeg, zelfs niet na derivatisatie met TMS. Een

andere mogelijke verklaring is dat ze zodanig sterk gefragmenteerd worden bij EI, dat enkel

nog fragmenten zichtbaar zijn in het massaspectrum. Er werd echter wel een bijkomende

metaboliet M6 gedetecteerd. M6 vertoonde een fragment ion met m/z 237, wat doet

43

vermoeden dat er een dubbele binding in fragment 3 van LGD-4033 gevormd wordt, en een

piek bij m/z 408, wat kan wijzen op het verlies van 2 H-atomen van de gederivatiseerde

parent compound. Op basis van deze assumptie zou M6 de voorloper kunnen zijn van M1,

aangezien er aangenomen wordt dat M1 ontstaat door hydroxylatie en vorming van een

dubbele binding. De fase I metabolieten van LGD-4033 die gevormd worden door incubatie

met HLMs, blijken alleszins beter opspoorbaar te zijn met LC-MS(/MS) dan met GC-

MS(/MS).

Het verschil in exacte massa op LC-HRMS tussen de theoretische en experimentele massa

geeft bijkomende evidentie voor de bewering dat M1 gevormd wordt door hydroxylatie en

vorming van een dubbele binding, of door vorming van een ketogroep. Fragment 1 (massa

170) wordt steeds teruggevonden bij de product-ionen en fragment 2 (massa 267) komt niet

afzonderlijk voor in het massaspectrum. Fragmenten 2 en 3 met hydroxylatie en vorming van

een dubbele binding worden daarentegen wel teruggevonden (m/z 281 en 253). Daarnaast is

er eveneens een product-ion met m/z 237 terug te vinden. Dit verschil in massa van 16 Da ten

opzichte van m/z 253 kan wijzen op het verlies van een hydroxylgroep. De massa 237 kan

afkomstig zijn van fragment 3 (massa 239) waarop een dubbele binding is gevormd. Hieruit

volgt dat de hierboven beschreven modificatie moet gebeuren op het pyrrolidinegedeelte van

de LGD-4033 molecule (figuur 17). Uit de resultaten van de product-ion scan van M1 in

positieve modus kan de positie van de modificatie nog nauwkeuriger vastgelegd worden.

Fragmenten 4 ( m/z 199) en 5 (m/z 213) van LGD-4033 komen immers apart voor in het

product-ion scan massaspectrum van M1, terwijl de massa van fragment 7 (m/z 220) niet

apart voorkomt. De massa van fragment 7 met inclusie van de fase I modificatie (m/z 234)

kon wel gedetecteerd worden.

44

Figuur 17: Tentatieve structuren van M1 met aanduiding van de belangrijkste fragmenten, in A vorming van een

ketofunctie, in B een hydroxylatie en vorming van een dubbele binding op de pyrrolidinering van LGD-4033

Ook voor M2 geeft de berekening van de exacte massa en vergelijking met de experimentele

massa bijkomend bewijs voor de hypothese dat M2 gevormd wordt door hydroxylatie en

reductie van een dubbele binding. Aangezien ook bij deze metaboliet steeds fragment 1 van

LGD-4033 wordt gedetecteerd, laat dit vermoeden dat de modificatie ook hier in het

pyrrolidinegedeelte van de molecule moet plaatsvinden. Dit vermoeden wordt nog versterkt

door het voorkomen van m/z waarden 257 en 285, wat overeenkomt met de massa’s van

fragmenten 3 en 2 met inclusie van de modificatie. In het massaspectrum van de product-

ionen van M2 wordt eveneens een ion met m/z 267 teruggevonden. Dit verschil in massa van

18 Da, in vergelijking met het ion met m/z 285, zou kunnen wijzen op het verlies van water.

Aangezien de modificatie waarschijnlijk plaatsvindt op het pyrrolidinegedeelte van de

molecule is de reductie van een dubbele binding niet mogelijk. Een mogelijke verklaring voor

deze metaboliet kwam er naar aanleiding van een conferentie waarop Sobolevsky et al. een

structuurvoorstel deden voor M2. De reductie zou namelijk kunnen wijzen op de opening van

de pyrrolidinering ter hoogte van het stikstofatoom (figuur 18). Voor deze metaboliet konden

fragmenten 4 (m/z 199) en 5 (m/z 213) ook gedetecteerd worden in positieve modus.

Fragment 7 werd zowel met inclusie van de modificatie (m/z 238) als zonder inclusie ervan

(m/z 220) niet gedetecteerd, waardoor geen nauwkeuriger informatie over de positie van de

modificatie kon afgeleid worden uit deze resultaten.

45

Figuur 18: Tentatieve structuur van M2 met aanduiding van de belangrijkste fragmenten, opening van de

pyrrolidinering en een hydroxylatie op het pyrrolidinegedeelte

M3 en M4 zijn moeilijk te verklaren op basis van de meest voorkomende fase I reacties die

reeds beschreven zijn in de wetenschappelijke literatuur. De resultaten van de fragmentatie

tonen ook hier aan dat er geen modificatie gebeurt op fragment 1 van LGD-4033. Het

product-ion met m/z 237 laat vermoeden dat er een dubbele binding gevormd wordt op

fragment 3 (m/z 239). Anderzijds wijst het product-ion met m/z 335 op het verlies van twee

hydroxylgroepen van de gedeprotoneerde molecule van M3/M4. Uitgaande van deze

informatie zou er verondersteld kunnen worden dat M3/M4 gevormd wordt door twee

hydroxylaties en de vorming van een dubbele binding, wat overeenkomt met een toename in

massa van 30 Da. Wanneer de exacte massa van de brutoformule horende bij deze modificatie

(C14H10F6N2O3) vergeleken wordt met de experimentele massa blijkt het massaverschil (98

ppm) te groot om aanvaardbaar te zijn. Daarom werd gezocht naar een nieuwe verklaring voor

M3/M4. In de sectie resultaten werd al aangegeven dat de brutoformule C15H14F6N2O2

gegenereerd werd uit de experimentele massa van M3/M4 op LC-HRMS. Dit betekent dat er

ten opzichte van de brutoformule van LGD-4033 CH2O wordt toegevoegd. Uit het

artikelsupplement van Domínguez-Romero J et al. [20] bleek een modificatie van de

brutoformule met CH2O overeen te komen met een methoxylatie. Een methoxylatie werd

bovendien al beschreven bij het metabolisme van Estradiol, waarbij de aromatische ring eerst

gehydroxyleerd wordt, en nadien een methylatie ondergaat [21]. Hoewel dit type fase I

modificatie uitermate zeldzaam is en normaal enkel op de aromatische ring plaatsvindt, lijkt

dit toch de meest aannemelijke verklaring te zijn voor M3/M4 (figuur 19). Bij de product-ion

scan in positieve modus van M3/M4 konden opnieuw fragmenten 4 (m/z 199) en 5 (m/z 213)

van LGD-4033 gedetecteerd worden. Fragment 7 met en zonder inclusie van de modificatie

(m/z 250 en m/z 220 respectievelijk) werd hier echter niet gedetecteerd. Deze resultaten

kunnen de positie van de methoxylatie bijgevolg niet bevestigen.

46

Figuur 19: Tentatieve structuur van M3/M4, een methoxylatie op pyrrolidinering

Voor M5 werden bij product-ion scan in positieve modus op Q-Exactive de fragmenten met

m/z 167, 187 en 234 uit de poster van Sobolevsky et al. [19] gedetecteerd. Dit bevestigt de

door deze onderzoekers voorgestelde modificatie voor M5, namelijk een dihydroxylatie op de

pyrrolidinering. Daarbovenop werd bij product-ion scan in negatieve modus op Q-Exactive

een fragment met m/z 299 gedetecteerd. Dit zou fragment 2 (m/z 267) van LGD-4033 met

inclusie van twee hydroxylgroepen kunnen zijn. Fragment 1 van LGD-4033 met (m/z 202) en

zonder inclusie van de modificatie (m/z 170) werden echter niet gedetecteerd.

47

4.3 Incubatiestalen met HLM voor de studie van het fase II metabolisme

Zoals in figuur 16 is weergegeven werd het gedeprotoneerde (PC, M2, M3/M4) of

geprotoneerde (M5) geglucuronideerde fase I metaboliet gedetecteerd in de incubatiestalen

met HLM waaraan de fase I en II cofactoren werden toegevoegd. Enkel voor M1 werd geen

enkel adduction van het geglucuronideerde metaboliet gedetecteerd. Deze geglucuronideerde

metabolieten werden niet gedetecteerd in het blanco staal. Het is echter weinig waarschijnlijk

dat M3/M4 en M5 geglucuronideerd worden, aangezien slechts één adduction te detecteren is,

in tegenstelling tot M2 waarbij zowel het geprotoneerde, gedeprotoneerde geglucuronideerde

metaboliet als zijn natrium- en kaliumadducten duidelijk waar te nemen zijn (tabel 7).

Bovendien werd door Sobolevsky et al. [19] na de in vivo humane excretiestudie de

geglucuronideerde PC van LGD-4033 en de ongeconjugeerde metaboliet M5 in urine

gedetecteerd.

48

5. Algemeen besluit

Bij het metabolisme van de SARM LGD-4033 door middel van een in vitro model op basis

van humane lever microsomen werden er zes verschillende fase I metabolieten gedetecteerd.

De fase I metabolieten zijn het duidelijkst te detecteren met LC-MS. Vijf metabolieten

werden immers gedetecteerd door analyse van de incubatiestalen met deze techniek (M1-M5).

Enkel M1 werd zowel met LC-MS als GC-MS gedetecteerd. Door de analyse met GC-MS

werd de aanwezigheid van een extra metaboliet M6 vastgesteld. Een overzicht van alle

metabolieten gedetecteerd met beide technieken en hun tentatieve fase I modificatie is

weergegeven in tabel 8. M1, M3/M4 en M5 werden ook gedetecteerd op de EIC in de blanco

stalen met LC-HRMS maar niet in het referentiestaal met LGD-4033. Hierdoor kan er

besloten worden dat ze niet te wijten zijn aan contaminatie van het LGD-4033 supplement,

maar kan er ook niet uitgesloten worden dat ze uitsluitend enzymatisch gevormd worden. Hun

abundantie was echter meer dan 10 keer lager in de blanco stalen dan in de HLM

incubatiestalen (figuur 14). M2 werd uitsluitend gedetecteerd op het EIC in het HLM

incubatiestaal, en is dus zeker een fase I metaboliet. Bovendien werden M2 en M5 ook reeds

na een in vivo humane excretiestudie in urine gedetecteerd [19]. Uit de in vitro studie van het

fase II metabolisme van LGD-4033 kan besloten worden dat de parent compound en M2

geglucuronideerd worden. Om de resultaten van de fase I en fase II metabolieten te kunnen

bevestigen zou het interessant zijn om in vivo excretiestudies van deze SARM bij muizen uit

te voeren.

Tabel 8: Overzicht van het metabolisme van LGD-4033 na incubatie met HLMs en detectie door LC-MS of GC-

MS. De aanduiding ‘ν’ betekent dat het metaboliet kon gedetecteerd worden.

Component Massadeviatie

t.o.v. PC

Fase I modificatie Glucuronidatie LC-

MS

GC-

MS

LGD-4033 / / (parent compound) ν ν ν

M1 +14 hydroxylatie en vorming

dubbele binding

OF

hydroxylatie en vorming van

een ketofunctie

ν ν

M2 +18 hydroxylatie en opening

pyrrolidinering

ν ν

M3 +30 methoxylatie ν

M4 +30 methoxylatie ν

M5 +32 twee hydroxylaties ν

M6 -2 vorming dubbele binding ν

49

6. Referenties

[1] Reardon C, Creado S (2014). Drug Abuse in Athletes. Substance Abuse and Rehabilitation 5: 95-105.

[2] https://www.wada-ama.org/en/media/news/2014-09/wada-publishes-2015-prohibited-list#.VE-

dD_cVH4g

[3] https://www.wada-ama.org/en/who-we-are/anti-doping-community/accredited-approved-laboratories

[4] Thevis M, Schänzer W (2010). Synthetic anabolic agents: steroids and nonsteroidal selective androgen

receptor modulators. Handbook of Experimental Pharmacology (Thieme D, Hemmersbach P)

Uitgeverij Springer 195: 99–126.

[5] http://www.chemischefeitelijkheden.nl/uploads/magazines/h058.pdf

[6] Gao W, Dalton JT (2007). Ockham’s razor and selective androgen receptor modulators (SARMs): are we

overlooking the role of 5α-reductase? Molecular Interventions 7(1): 10-13.

[7] Thevis M, Thomas A et al. (2009). Emerging drugs: mechanism of action, mass spectrometry and doping

control analysis. Journal of Mass Spectrometry : 44: 442–460.

[8] De Rijke E, Essers ML et al. (2013). Selective androgen receptor modulators: in vitro and in vivo

metabolism and analysis. Food additives & contaminants: Part A 30(9): 1517–1526.

[9] Thevis M, Schänzer W (2014). Analytical approaches for the detection of emerging therapeutics and non-

approved drugs in human doping controls. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 101: 66-

83.

[10] http://www.ergogenics.org/anderhalve-kilo-vetvrije-massa-erbij-na-drie-weken-kuren-met-lgd-4033.html

[11] Basaria S, Collins L et al. (2013). The safety, pharmacokinetics, and effects of LGD-4033, a novel

nonsteroidal oral, selective androgen receptor modulator, in healthy young men. The Journals of

Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences 68(1): 87–95.

[12] Lipschitz C, Baars B et al.(1997). Chromatografie in de praktijk:gaschromatografie. Uitgeverij Ten

Hagen en Stam.

[13] Chromatografie in de praktijk: gaschromatografie (1995). Uitgeverij Ten Hagen en Stam.

[14] Kicman A, Gower D (2003). Anabolic steroids in sport: biochemical, clinical and analytical perspectives.

Annals of Clinical Biochemistry 40: 321-356.

[15] Gomes R, Meredith W et al. (2009). Analysis of conjugated steroid androgens: deconjugation,

derivatisation and associated issues. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 49(5) : 1133–

1140.

[16] Brandon E, Raap C et al. (2003). An update on in vitro test methods in human hepatic drug

biotransformation research: pros and cons. Toxicology and Applied Pharmacology 189 (3): 233–246.

[17] Jia L, Liu X (2007). The conduct of drug metabolism studies considered good practice (II): in vitro

experiments. Current Drug Metabolism 8 (8): 822-829.

[18] Scarth J, Spencer H et al. (2010). The use of in vitro technologies coupled with high resolution accurate

mass LC-MS for studying drug metabolism in equine drug surveillance. Drug Testing and Analysis 2: 1–

10.

[19] Sobolevsky T, Dikunets M, Dudko G, Rodchenkov G (2015). Metabolism study of selective androgen

receptor modulator LGD-4033. Poster (14) van Manfred Donike Workshop, 33rd Cologne workshop on

dope analysis (01/03/2015-06/03/2015).

[20] Domínguez-Romero J, García-Reyes J et al. (2013). Combined data mining strategy for the systematic

identification of sport drug metabolites in urine by liquid chromatography time-of-flight mass

spectrometry (Supplementary Data). Analytica chimica acta 761: 1–10.

[21] Martucci C, Fishman J (1993). P450 ENZYMES OF ESTROGEN METABOLISM. Pharmacology &

Therapeutics 57: 237–257.

Metabolisme van dopeermiddelen - Ghent University · In deze masterproef wordt het fase I en fase...

Documents

Transcript of Metabolisme van dopeermiddelen - Ghent University · In deze masterproef wordt het fase I en fase...