Inductie en herstel van DNA dubbelstrengbreuken (DSB) door ...

Inductie en herstel van DNA

dubbelstrengbreuken (DSB)

door mammografie X-stralen en

γ-stralen in humaan

borstweefsel.

Lynn GHESQUIERE

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. ANNE VRAL

Vakgroep MEDISCHE BASISWETENSCHAPPEN

Academiejaar 2014-2015

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander

gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met

betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van

resultaten uit deze masterproef.”

Datum

(handtekening student) (handtekening promotor)

Lynn Ghesquiere Prof. Dr. Anne Vral

Voorwoord

Zonder de hulp van verschillende mensen zou deze thesis nooit tot stand kunnen gekomen zijn,

daarom wil ik me eerst richten tot deze mensen als bedanking.

Ik wil me in de eerste plaats richten tot mijn promotor Prof. Dr. Anne Vral. In de loop van vorig

schooljaar en dit schooljaar heeft ze me enorm veel vakkennis bijgebracht. Ik wil haar ook

bedanken voor de tijd die ze vrijmaakt om mijn vragen te beantwoorden en het nalezen van

mijn thesis.

Ik wil ook mijn begeleidster Julie Depuydt bedanken voor het beantwoorden van mijn vele

vragen, het nalezen van mijn thesis en voor de hulp bij het maken van de grafieken.

Verder wil ik ook Prof. Dr. Cornelissen bedanken voor het gebruik van het labo.

Een speciaal woordje van dank ook aan Leen die steeds met raad en daad klaarstond in het labo.

Ondanks haar drukke agenda stond ze steeds klaar om een handje te helpen, maar ook voor een

leuk gesprek.

Bedankt aan Annelot voor het gezelschap in het donker kamertje aan de microscoop en voor

het verdragen van de muziek.

Ook een bedankje aan mijn mede-thesis genoten die de soms lange dagen in het labo toch wat

plezanter maakten.

De middagpauzes werden ook steeds opgefleurd door de leuke gesprekken met Heidi, Johanna,

Greet, Toke, Annelies en Jeroen, bedankt hiervoor.

Tot slot ook bedankt aan mijn ouders en vrienden die me enorm gesteund hebben in de loop

van mijn studententijd.

Inhoudstafel

Samenvatting .............................................................................................................................. 1

Abstract ...................................................................................................................................... 2

1. Inleiding ................................................................................................................................. 3

1.1 Borstkankerincidentie en mortaliteit ................................................................................ 3

1.2 Histologische structuur van de borst ................................................................................ 4

1.3 Mammografie screening en alternatieven ........................................................................ 5

1.4 Ioniserende straling (IR) en DNA schade ........................................................................ 7

1.5 De DNA schade respons ................................................................................................ 10

1.5.1 Herstelmechanisme voor DNA-DSB ...................................................................... 10

1.5.2 Herstel pathways ..................................................................................................... 11

1.5.1.1 NHEJ .................................................................................................................... 11

1.5.1.2 HR ........................................................................................................................ 12

1.5.2 De rol van BRCA1 en BRCA2 in DNA-DSB herstel ............................................. 15

1.5.3 γH2AX .................................................................................................................... 16

1.6 Risico-inschatting ........................................................................................................... 18

1.6.1 Lineaire energie transfer (LET) ............................................................................... 18

1.6.2 Relatieve biologische effectiviteit (RBE)................................................................ 19

1.6.3 Detectie/inductie ratio (DIR) ................................................................................... 20

1.7 Doelstelling .................................................................................................................... 20

2. Materialen en methoden ....................................................................................................... 21

2.1 Materiaal ......................................................................................................................... 21

2.2 In vitro bestralingsprotocol ............................................................................................ 22

2.3 Histologisch doorwerken van het borstweefsel .............................................................. 22

2.3.1 Fixatie ...................................................................................................................... 22

2.3.2 Inbedding en weefselcoupes snijden ....................................................................... 23

2.3.3 Haematoxyline-eosine (HE) kleuring ...................................................................... 23

2.4 γH2AX foci test .............................................................................................................. 23

2.4.1 Deparaffineren ......................................................................................................... 24

2.4.2 Antigen retrieval (AR) ............................................................................................ 24

2.4.3 Voorbehandeling met H2O2 en blokkingsserum (BS) ............................................. 24

2.4.4 Immunohistochemische kleuring ............................................................................ 25

2.4.5 Ontwateren en dekglas monteren ............................................................................ 26

2.5 Foci telling ...................................................................................................................... 26

2.6 Statistische bewerkingen ................................................................................................ 26

3. Resultaten ............................................................................................................................. 27

3.1 Materiaal ......................................................................................................................... 27

3.2 HE kleuring .................................................................................................................... 28

3.3 Optimalisatie γH2AX immunohistochemische kleuring ................................................ 28

3.4 Dosis-respons curve ....................................................................................................... 32

3.5 Lage-dosis effecten ........................................................................................................ 35

3.6 Repair van DSB ............................................................................................................. 36

4. Bespreking ............................................................................................................................ 40

4.1 Materiaal ......................................................................................................................... 40

4.2 γH2AX foci test .............................................................................................................. 41

4.3 Dosis-respons curve ....................................................................................................... 42

4.4 Lage dosis-effecten ........................................................................................................ 44

4.5 Repair van DSB ............................................................................................................. 45

5. Conclusie .............................................................................................................................. 47

6. Referenties ............................................................................................................................ 48

7. Bijlage ......................................................................................................................................

Afkortingen

53BP1 p53-Binding Protein 1

AD Gedestilleerd water

AL Antilichaam

AR Antigen Retrieval

ATM Ataxia Telangiectasia Mutated

ATR ATM and Rad3-related

BARD 1 BRCA1 associated RING Domain protein 1

BC Breast Cancer

Bioth RAM Gebiotinyleerd Rabbit Anti-Mouse

BIR Break-Induced Replication

BRCA Breast Cancer Gene

BRCT BRCA1 C-terminal

BS Blokkingsserum

BT Breast Tissue

C Carboxy

CT Computed Tomography

CtBP C-terminal-Binding Protein

CtIP CtBP-Interacting Protein

DAB 3,3'-diaminobenzidine

DDR DNA-damage-response

dHj double Holliday junction

DIR Detection/Induction Ration

DNA Desoxyribonucleïne Acid

DNA-PKcs DNA-Proteïne Kinase catalytische subunit

DSB Double-Strand Break

E Energy

EMS Elektromagnetische Straling

FSH Follikel Stimulerend Hormoon

GC Gene Conversion

HE Haematoxyline-Eosine

HR Homologe Recombinatie

ICRP International Commission on Radioprotection

Ig Immunoglobuline

IR Ionizing Radiation

KCE The Belgian Health Care Knowledge Centre

kV kilo Volt

LET Linear Energy Transfer

LH Luteïniserend Hormoon

LNT Linear No Treshold

MDS Multiply Damaged Sites

MeV Megaelektron Volt

MGD Mean Glandular Dose

µm micrometer

mGy milligray

MN Micronucleus

MRI Magnetic Resonance Imaging

MRN Mre11/RAD50/NBS1

N Amino

NHEJ Non Homologous End Joining

P overschrijdingskans

PALB2 Partner And Localisator of BRCA2

PFA Paraformaldehyde

PI3 Phosphoinositide 3

PMMA Polymethylmethacrylaat

RBE Relatieve Biologische Effectiviteit

RIBR Radiation-Induced Bystander Response

RING Really Interesting New Gene

ROS Reactive Oxygen Species

RPA Replicatie Proteïne A

SDSA Synthesis-Dependent Strand-Annealing

SEM Standard Error of the Mean

SSA Single Strand Annealing

SSB Single-Strand Break

ssDNA single-stranded DNA

Strept-HRP Streptavidine-HorseRadish Peroxidase

TCR T-Cel Receptor

TDLU Terminal Duct Lobular Unit

US FDA United States Food and Drug Administration

XRCC4 X-Ray repair Cross-Complementing protein 4

1

Samenvatting

Borstkanker is met een incidentie van 25,2% de meest gediagnostiseerde kanker in vrouwen.

Mortaliteit door borstkanker komt echter pas op de 5de plaats. Dit is te wijten aan de invoering

van een 2-jaarlijkse mammografie screening voor vrouwen tussen de 50 en 70 jaar, aangeboden

door de Vlaamse overheid.

Mammografie maakt gebruik van 30kV X-stralen waarbij 2 opnames gemaakt worden van elke

borst (± 4mGy). Het laat toe borstkanker in een vroeg stadium te detecteren en samen met de

goede behandelingen die beschikbaar zijn, zorgt het voor een reductie in borstkanker

mortaliteit.

Voor lage LET stralen zoals mammografie X-stralen en 60Co γ-stralen veronderstelt de ICRP

een RBE van 1. Aangezien deze data afkomstig zijn van extrapolaties uit de “life span study”

waarbij overlevenden van Hiroshima en Nagasaki werden blootgesteld aan hoge energie 60Co

γ-stralen (2-5MeV), wordt in twijfel getrokken of de RBE niet onderschat wordt.

Deze studie werd dan ook opgezet om na te gaan welk biologisch effect 30kV X-stralen heeft,

met 60Co γ-stralen als referentie. De studie werd uitgevoerd op borstweefsel, in tegenstelling

tot voorgaande studies waar gefocust werd op celculturen en cellijnen (vnl. lymfocyten en

borstepitheel cellen). Dosissen variërend tussen 0 en 500mGy 30kV X-stralen en 60Co γ-stralen

werden toegediend. Aan de hand van de zeer gevoelige γH2AX foci test werd inductie en repair

van DNA DSB in het klierweefsel nagegaan.

Eerste resultaten tonen aan dat 30kV X-stralen een hoger aantal γH2AX foci induceren dan

60Co γ-stralen met een RBE van 1,1. Deze toename in RBE is echter beperkt. Ook werd een

significant lage-dosis effect geobserveerd bij de dosis van 4mGy. Onderzoek naar het herstel

van DSB toont aan dat bij alle dosissen herstel van DSB is opgetreden na 24h. Voor de dosissen

van 4 en 40mGy worden het aantal geïnduceerde foci gereduceerd tot de achtergrondwaarde.

Enkel voor 500mGy blijft het aantal residuele foci na 24h boven deze achtergrondwaarde.

Verder onderzoek met meer stalen is nodig om significante resultaten te bekomen.

2

Abstract

Background: In this study we wanted to examine the effect of mammography X-rays (30kV)

on healthy human breast tissue and determine the RBE. Not only the induction of DSB was

assessed with the γH2AX foci test but also DSB repair. The repair was compared between

BRCA1/2 mutation carriers and healthy patients. 60Co γ-rays were used as reference radiation.

Methods: Healthy breast tissue of 16 female donors was irradiated in vitro with 30kV X-rays

and 60Co γ-rays, with doses between 0 and 500mGy. Quantification of the DSB after 30’ and

24h was assessed with the γH2AX foci test. Repair of DSB after 24h was only assessed for the

doses 0, 4, 40 and 500mGy with 30kV X-rays and 60Co γ-rays.

Results: First results showed that 30kV X-rays induced more γH2AX foci than 60Co γ-rays.

Also a significant low-dose affect at 4mGy for both 30kV X- as 60Co γ-rays was shown.

Through the dose-response curve (0-500mGy) a RBE of 1,1 was obtained. Repair was observed

after 24h of incubation for all doses. The induced number of foci returned to their background

value after 24h except for 500mGy.

Conclusion: 30kV X-rays induce more DSB than 60Co γ-rays and a RBE of 1,1 was obtained.

A significant low-dose effect was observed at 4mGy and a decrease of γH2AX foci was

observed after 24h but it was inconclusive if DSB repair is less efficient in BRCA1/2 mutation

carriers.

3

1. Inleiding

1.1 Borstkankerincidentie en mortaliteit

Met een incidentie van 11,9% is borstkanker de meest gediagnostiseerde kanker na longkanker.

Als men enkel kijkt naar vrouwen is borstkanker de meest voorkomende kanker met een

incidentie van 25,2% [1]. De meest frequent voorkomende borstkankers zijn invasieve ductale

carcinomen met 80%, gevolgd door invasieve lobulaire carcinomen met 10% [2]. Kijkt men

echter naar de mortaliteit door kanker, dan komt borstkanker slechts op de 5de plaats (6,4%).

Dit is te wijten aan de vroege detectie door mammografie screening bij vrouwen tussen de 50

en 70 jaar en de goede behandeling [1, 3-5]. Sinds de invoer van de mammografie screening is

de borstkanker mortaliteit gedaald met 1-9% per jaar en is er een totale mortaliteit reductie

tussen de 28-36% [3, 6, 7]. De incidentie van borstkanker is echter wel gestegen [3, 4]. Verder

valt ook op dat de borstkanker incidentie vooral hoog is in ontwikkelende landen. In

ontwikkelingslanden is dit lager [1, 8], maar de incidentie stijgt er wel [1].

Incidentie en mortaliteit van verschillende kankers bij vrouwen in zowel ontwikkelings- als

ontwikkelde landen wordt in fig. 1 weergegeven [1].

Fig.1: Incidentie en mortaliteit bij vrouwen in ontwikkelde en ontwikkelingslanden [1].

4

1.2 Histologische structuur van de borst

De borst is een gemodificeerde apocriene zweetklier die in de embryonale ontwikkeling ontstaat

langs de melklijn die loopt van de oksel tot de lies. Vanaf de pubertijd ontwikkelt de borst bij

de vrouw onder invloed van hormonen zoals oestrogeen, prolactine, progesteron en

groeihormoon of somatotropine, die voornamelijk afkomstig zijn van de eierstokken en de

hypofyse. Tot aan de menopauze ondergaat de borst cyclische veranderingen in activiteit die

ook weer gecontroleerd worden door hormonen (follikel stimulerend hormoon (FSH),

oestradiol, luteïniserend hormoon (LH)…), dit zijn de hormonen van de ovariële cyclus. Na de

menopauze ondergaat de borst progressieve atrofie en involutieve veranderingen, zoals afname

van klier- en steunweefsel waardoor de borst voornamelijk nog uit vetweefsel bestaat [9].

Elke borst bestaat uit ongeveer 15-25 onafhankelijke eenheden, borst lobi, die elk een tubulo-

acinaire klier bevatten. Elke klier mondt via de ductus lactiferus uit ter hoogte van het tepel

oppervlak. Net voor de opening aan het oppervlak is er een verbreding van de ductus, de sinus

lactiferus. De borst bestaat naast klierweefsel ook uit vet- en bindweefsel. Onmiddellijk rond

het klierweefsel ligt steeds bindweefsel (fibroglandulair weefsel). Dit wordt dan omgeven door

vetweefsel [9, 10]. Elke ductus lactiferus vertakt zich in steeds kleiner wordende ducti, die

eindigen in een lobule, bestaande uit tubulo-alveolair secretoire delen waarvan de histologische

structuren sterk varieren afhankelijk van de leeftijd en fysiologische activiteit. Een terminale

ductus met lobule wordt ook een terminal duct–lobular unit (TDLU) genaamd. De structuur

van een borst met TDLU en lobule bestaande uit verschillende acini wordt in fig. 2 weergegeven

[9].

De borst ducti en acini zijn afgelijnd door 2 lagen van cellen: een luminale laag van epitheliale

cellen en een basale laag van afgeplatte myo-epitheelcellen. In grotere ducti zijn de luminale

epitheliale cellen cilindrisch van vorm. In kleinere ducti zijn de luminale epitheliale cellen

eerder cuboïdaal. Een discontinue laag van stellate myo-epitheliale cellen omgeeft deze

epitheliale cellen [9].

Zoals aangehaald in 1.1 ontstaan de meeste borsttumoren in de ducti van het klierweefsel:

invasief ductaal carcinoom. Op de tweede plaats staan invasieve lobulaire carcinomen die

onstaan in de melkklier acini [2].

5

Fig.2: Structuur van de borst met histologische weergave van een TDLU met acini (haematoxyline-eosine (HE) -

kleuring) [9].

1.3 Mammografie screening en alternatieven

In de jaren ’80-’90 werd in België een niet-georganiseerde mammografie screening ingevoerd,

die later in 2001 uitgewerkt werd tot een georganiseerde screening in Vlaanderen, gevolgd door

Wallonië en Brussel in 2002. Deze gratis screening wordt om de 2 jaar aangeboden voor

vrouwen tussen de 50 en 70 jaar. Het doel is om borstkanker in een vroeg stadium te

diagnosticeren [4, 11]. De screening gebeurt aan de hand van een mammograaf, dit is een toestel

dat gebruik maakt van ioniserende straling (IR), meer bepaald lage energie (E) (30kV) X-

stralen. Bij deze screening worden minstens 2 opnames gemaakt (1 craniocaudale en 1 in

medio-laterale oblique richting [12, 13]) per borst waarbij de mean glandular dose (MGD)

ongeveer 4 milligray (mGy) bedraagt [4, 12]. Gy is de een eenheid van geabsorbeerde dosis.

De MGD kan echter beïnvloed worden door onder andere hoge borstdensiteit, groter

borstvolume, te weinig borstcompressie en variaties in de set-up van de mammograaf. Vroeger

gebeurde deze screening met een screen-film mammograaf (2,37 mGy per opname) maar

tegenwoordig gebruikt men een digitale mammograaf (1,86 mGy per opname) die met een

lagere dosis werkt en een hogere sensitiviteit heeft [13, 14]. Mammografie is op zich een

sensitieve methode om borstkanker en vroege tekenen van borstkanker zoals microcalcificaties

op te sporen [14, 15].

6

De mammograaf maakt gebruik van X-stralen, wat een risico met zich meebrengt voor het

induceren van tumoren. Ondanks de lage dosis die gebruikt wordt, zijn de risico’s, vooral dan

voor mutatiedragers (zie 1.5.2), niet verwaarloosbaar door de herhaaldelijke blootstelling en

het hierbij accumulerende risico. Hierdoor zijn naast mammografie ook alternatieve

screeningsmethoden ter beschikking voor patiënten met een sterk verhoogd risico zoals

patiënten met een familiale belasting of een genetische predispositie (bv. mutatie in Breast

Cancer gene (BRCA) 1 of 2 genen) [11].

Zo heb je magnetic resonance imaging (MRI) die geen gebruik maakt van IR, maar van een

sterk magnetisch veld en radiogolven. De werking berust op het feit dat isotopen met een

oneven aantal kerndeeltjes, bijvoorbeeld waterstof en fosfor, een magnetisch veld hebben [16,

17]. Borst MRI wordt vooral gebruikt voor vrouwen met een verhoogd risico op het krijgen van

borstkanker (zoals vrouwen met een BRCA mutatie, zie 1.5.2). Door een mutatie in

desoxyribonucleïne acid (DNA) herstelgenen of een familiale voorbeschiktheid zijn deze

vrouwen stralingsgevoeliger en wordt een herhaaldelijke mammogram afgeraden [15, 18]. Bij

vrouwen met een BRCA1/2 mutatie wordt om de 6 maanden een klinisch borstonderzoek en

echografie aanbevolen, naast een jaarlijkse mammografie en MRI-scan [19]. MRI is echter niet

aanbevolen als screeningsinstrument op zich door de technische problemen (vals positieven),

langere scantijden en de hoge kostprijs [11, 15, 17].

Verder kan ook een borst echo uitgevoerd worden [16], waarbij gebruik gemaakt wordt van

geluidsgolven die zich door het lichaam verplaatsen en op grensvlakken tussen zachte en

hardere structuren reflecteren. Ook echo kan mammografie niet vervangen doordat deze

techniek een hoog aantal vals positieve resultaten telt en dus vaker gevolgd wordt door een

invasief onderzoek. Het wordt dan ook niet aanbevolen in de Belgian Health Care Knowledge

Centre (KCE) richtlijnen (Federaal Kenniscentrum voor de Gezondheidszorg) [11]. Echo is

minder gevoelig dan MRI maar heeft het voordeel dat het goedkoper en op meer plaatsen

beschikbaar is [15].

Een ductogram kan uitgevoerd worden om de oorzaak van abnormale tepel uitscheiding na te

gaan. Hierbij wordt met contrastvloeistof en X-stralen de ductus gevisualiseerd en kan een

massa in de ductus opgespoord worden.

Een recent alternatief ten slotte is tomosynthese. Deze techniek maakt een 3D-reconstructie van

verschillende beelden die uit verschillende hoeken genomen zijn. Bij elk beeld wordt slechts

een heel lage dosis van X-stralen gegeven aan de patiënt [15, 16, 18, 20]. Momenteel wordt dit

nog samen gebruikt met de gewone mammografie beeldvorming, waardoor de patiënt in

principe een dubbele dosis ontvangt.

7

Deze dosis is echter nog binnen de grenzen die opgezet werden door de United States (US)

Food and Drug Administration (FDA). De voordelen van tomosynthese is de lagere

terugroeping van patiënten en de hogere detectie [15, 20]. Tomosynthese is vooral nuttig voor

vrouwen met dens borstweefsel [15, 18]. In fig. 3 ziet u een flow chart van de aanbevelingen

voor screening per risico groep [11].

Fig. 3: Flow chart van de aanbevelingen van screening bij de verschillende risico groepen [11].

Bij elke techniek is het belangrijk rekening te houden met vals-positieven en overdiagnose van

borstkanker. Dit betekent respectievelijk dat letsels gezien worden op de medische

beeldvorming waar geen kanker aanwezig is en dat tumoren gedetecteerd worden die in het

leven van de patiënt eigenlijk nooit voor een probleem zouden zorgen [3, 14, 15, 21]. Het

gebruik van mammografie screening in oudere vrouwen verhoogt het risico op overdiagnose.

Dit moet in rekening gebracht worden bij de screening opties van een patiënt [21].

1.4 Ioniserende straling (IR) en DNA schade

IR is straling die genoeg energie heeft om een elektron uit de buitenste schil van een atoom te

slaan, ionisatie genaamd. Hierdoor worden onstabiele radicalen gevormd.

8

Je kan onderscheid maken tussen 2 soorten IR: elektromagnetische straling (EMS) en

corpusculaire straling. Onder EMS vallen de X-stralen en γ-stralen die vaak gebruikt worden

voor diagnostische (bv. computed tomography (CT)) en therapeutische doeleinden, maar ook

voor conventionele en interventionele radiografie (bv. kankertherapie) [22]. Wanneer IR

straling invalt op weefsel ontstaan dus eerst fysische reacties, namelijk ionisaties en excitaties,

die op hun beurt aanleiding geven tot fysico-chemische (vorming van radicalen) en chemische

interacties (interactie tussen radicalen en weefselmoleculen). Deze interacties kunnen

resulteren in verschillende biologische effecten waaronder het ontstaan van mutaties en

carcinogenese. De opeenvolgende effecten van IR worden in fig. 4 weergegeven [23].

Fig.4: Opeenvolgende effecten van IR [23].

Het belangrijkste doelwit van IR in een cel is het DNA, dat al onze genetische informatie bevat.

IR kan verschillende types van DNA schade induceren, onder andere base schade (mismatch,

insertie, deletie), enkelstrengbreuken (SSB), dubbelstrengbreuken (DSB) en complexe multiply

damaged sites (MDS) (zie Fig. 5 [24]). Geclusterde DNA schade of MDS bestaat uit 2 of meer

dicht bij elkaar gelokaliseerde geoxideerde basen, abasische sites of SSB verspreidt over beide

strengen [25]. Base schade en SSB worden in de meeste gevallen efficiënt hersteld. DSB

daarentegen zijn de meest genotoxische lesies die door IR worden geïnduceerd, hetzij

rechtstreeks, hetzij onrechtstreeks (door reactive oxygen species (ROS), chemotherapeutische

drugs, mechanische stress op chromosomen of V(D)J recombinatie) [26].

9

Bij een DSB gaat informatie verloren in beide strengen van het DNA waardoor correct herstel

moeilijker is. Foutieve of onherstelde DSB kunnen aanleiding geven tot chromosomale

aberraties en apoptose. Wanneer een DSB geïnduceerd wordt ter hoogte van een tumor

suppressor gen of oncogen kan dit aanleiding geven tot kanker [4, 27].

Fig. 5: Verschillende types van DNA schade geïnduceerd door IR [24].

Naast direct geïnduceerde DNA schade kan straling ook schade veroorzaken in cellen die zelf

niet werden bestraald. Dit fenomeen is voornamelijk belangrijk bij blootstelling aan lage

stralingsdosissen en is het gevolg van intra- en intercellulaire communicatie tussen bestraalde

en niet-bestraalde cellen. Tot deze lage dosis effecten behoren stralingsgeïnduceerde adaptieve

respons, lage dosis hypersensiviteit, genomische instabiliteit en stralingsgeïnduceerde

bystander respons (RIBR). RIBR wordt gedefinieerd als een cellulaire respons die geïnduceerd

wordt in een niet-bestraalde cel die bystander signalen ontvangen heeft van een direct

bestraalde cel in een populatie van bestraalde cellen. RIBR heeft vooral belangrijke biologische

consequenties bij lage dosis bestralingen waar niet bestraalde cellen worden beïnvloed door de

bestraalde populatie. Indien het RIBR niet in rekening wordt gebracht kan dit voor een

onderschatting zorgen van de lage-dosis effecten [28, 29]. Het belang van dit effect in kader

van dit onderzoek wordt verder uitgelegd in 1.5.3.

10

1.5 De DNA schade respons

Aangezien IR een krachtige inducer is van DSB, die zeer schadelijk zijn voor ons genoom,

zullen we in dit onderdeel voornamelijk de cellulaire respons bespreken die wordt geactiveerd

voor het herstellen van de DSB.

1.5.1 Herstelmechanisme voor DNA-DSB

DSB worden niet alleen geïnduceerd door IR maar ook door endogene factoren (zie 1.4) [30].

Deze endogene factoren zorgen voor het continu aanbrengen van schade aan het DNA. Deze

schade wordt door de cel herkend en hersteld door aanwezige herstelmechanismen. Per celcylus

worden naast SSB ongeveer 50 DSB geïnduceerd, die weliswaar minder complex zijn dan

stralingsgeïnduceerde DSB.

De DNA-damage-response (DDR) van DSB gebeurt in 3 stappen. In de eerste plaats moet de

DSB herkend en gesignaleerd worden door eiwitten die besproken worden in 1.5.1.1 en 1.5.1.2.

In de tweede plaats wordt de integriteit van het genoom bewaard door de aanwezigheid van

celcyclus checkpoints. Deze checkpoints zorgen voor een geordend verloop van de

celdelingscyclus en stoppen de celcyclus (G1/S, S, G2/M) wanneer een ongewenste gebeurtenis

zich voordoet zoals DNA schade [31, 32]. De celcyclus en zijn checkpoints worden in fig. 6

weergegeven [33]. Op deze manier krijgt de cel voldoende tijd om de schade te herstellen, wat

de derde stap is van de DDR, vooraleer ze de celcyclus verderzet. Kleine fouten worden

hersteld, maar bij grote fouten gaat de cel in apoptose [31, 32]. Onvermogen om DNA correct

te herstellen leidt tot genomische instabiliteit, wat dan weer de kans op het ontwikkelen van

kanker verhoogt [31, 34]. De belangrijkste herstelmechanismen voor herstel van DNA-DSB

zijn homologe recombinatie (HR) en niet-homologe end joining (NHEJ). Deze mechanismen

verschillen van elkaar in hun accuraatheid en noodzaak voor homologie [30-32, 34]. Andere

DSB herstel mechanismen die nog steeds onderzocht worden zijn single strand annealing

(SSA), gene conversion (GC), double Holliday junction mechanism (dHj), synthesis-dependent

strand-annealing (SDSA) en break-induced replication (BIR) [35].

11

Fig. 6: Fasen van de celcyclus en de checkpoints [33].

1.5.2 Herstel pathways

1.5.1.1 NHEJ

Stralingsgeïnduceerde DNA-DSB worden in eukaryote cellen voornamelijk hersteld door

NHEJ. NHEJ is snel en vereist geen homologie waardoor het in de volledige celcyclus actief is

[27, 30, 32]. Hierdoor is het herstelmechanisme wel eerder error prone. Hiermee bedoelt men

dat fouten kunnen ingebouwd worden die dan kunnen leiden tot chromosoomaberraties [27,

31]. NHEJ is ook betrokken bij V(D)J recombinatie, een mechanisme van genetische

recombinatie in de vroege ontwikkeling van immunoglobulines (Ig) en T-cel receptoren (TCR)

[30, 31].

Wanneer een stralingsgeïnduceerde DNA-DSB ontstaat, zal binnen enkele seconden een

ringvormig heterodimeer eiwitcomplex Ku70/80 aangetrokken worden op de plaats van de

breuk. Het bindt aan de uiteinden van de breuk en verhindert verdere afbraak van het DNA. Dit

eiwitcomplex trekt ook DNA afhankelijke proteïne kinase katalytische subunits (DNA-PKcs)

aan, die binden op het carboxy(C)-terminale uiteinde van Ku80. Dit proteïne kinase zorgt

ervoor dat de 2 uiteinden samen gehouden worden. Verder trekt DNA-PKcs het

Mre11/Rad50/Nbs1 (MRN) eiwitcomplex en Artemis aan die de uiteinden van de DSB

processen (wegknippen van beschadigde zones) zodat herstel mogelijk is. Artemis heeft zowel

een DNA-PKcs-onafhankelijke 5’-3’ exonuclease activiteit als een DNA-PKcs-afhankelijke

endonuclease activiteit in de richting van hairpins en dubbelstreng naar enkelstreng DNA

overgangen [27, 29-31, 34].

12

In afwezigheid van Artemis zijn cellen radiosensitief maar hebben ze geen groot defect bij DSB

herstel, wat suggereert dat niet alle DSB verwerkt moeten worden door Artemis voor herstel

[27, 29, 36, 37]. Artemis wordt net als het H2AX histon vlak na bestraling ter hoogte van de

DSB gefosforyleerd. In tegenstelling tot H2AX staat Artemis-fosforylatie los van DNA herstel

op zich, maar is het gecorreleerd met celcyclus progressie naar of tijdens mitose [37]. Het

verwerken van complexe lesies ter hoogte van de DSB uiteinden kan resulteren in

asymmetrische termini die opnieuw moeten verbonden worden. Deze uiteinden kunnen

onderbrekingen bevatten die ingevuld moeten worden. Hier is de X-familie van DNA

polymerasen ( Pol1, Polk, en tdT) bij betrokken. Ten slotte zal het Ligase IV/ X-ray repair

cross-complementing proteïne 4 (XRCC4) complex zorgen voor het terug verbinden van de

uiteinden van de DNA-strengen [22, 27, 29-31, 34, 36]. De pathway van NHEJ wordt in fig. 7

weergegeven [29].

1.5.1.2 HR

Herstel van DNA-DSB via HR is trager, maakt gebruik van homologe sequenties aanwezig in

een niet-beschadigd zusterchromatide of een intact homoloog chromosoom en is error free.

Door de nood aan homologie speelt dit herstelproces bij dierlijke cellen enkel een rol in de late

S- en G2-fase, wanneer het DNA al verdubbeld is en dus een zusterchromatide aanwezig is [26,

27, 29, 30, 38]. In bacteriën en gisten is HR het belangrijkste herstelmechanisme bij

stralingsschade.

Na herkenning van de DSB door het MRN complex wordt samen met C-terminal-binding

protein (CtBP)-interacting protein (CtIP) 3’-overhangende single-stranded DNA (ssDNA)

uiteinden gegenereerd [30]. MRN houdt de DNA uiteinden dicht bij elkaar en rekruteert en

activeert Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM). Verder bewerkt het de DNA uiteinden tot 3’-

ssDNA uiteinden die nodig zijn voor HR. De endonuclease activiteit van Mre11 die zorgt voor

de vorming van de 3’-ssDNA uiteinden wordt gereguleerd door het CtBP proteïne, dat in

normale omstandigheden afhankelijk is van BRCA1 en ATM. ATM is een proteïne kinase die

de celcyclus stillegt zodat HR kan doorgaan. Enkele proteïnen gelinkt aan HR zoals replicatie

proteïne A (RPA) en BRCA1 worden direct gefosforyleerd door ATM na bestraling. Kort na

het vormen van de 3’-ssDNA uiteinden bindt RPA op deze uiteinden. Vervolgens wordt met

behulp van BRCA1, BRCA2 en partner and localizer of BRCA2 (PALB2) het

RAD52/BRCA2/RAD51/RAD54 eiwitcomplex gerekruteerd dat het RPA vervangt en een

RAD51 nucleoproteïne filament vormt.

13

RAD52 heeft hier een protectieve rol en bindt direct aan de ssDNA uiteinden om exonuclease

tegen te gaan. Error free HR wordt bekrachtigd door de invasie van het RAD51 nucleoproteïne

filament in de intacte zusterchromatide. Na invasie van de streng wordt gezocht naar een

homologe sequentie en zal het invaderende ssDNA dienst doen als primer voor DNA synthese,

dit met behulp van polymerase δ. Streng invasie zorgt voor verplaatsing van de 2e streng van

het zusterchromatide waardoor een D-lus structuur gevormd wordt. Meer specifiek zal de

verplaatste zusterchromatide streng binden aan de 3’- overhangende uiteinden van het ander

uiteinde van het DNA. De verplaatste streng kan nu dienst doen als template voor DNA

synthese geprimed door het 2e uiteinde van het DNA. DNA replicatie wordt beëindigd door het

vormen van een verbinding tussen beide zusterchromatiden via een dHj. De dHj moet dan nog

worden ontbonden met behulp van resolvasen en de DNA uiteinden worden aan elkaar gezet

door ligasen zodat een intact herstelde DNA molecule kan ontstaan [23, 27, 29-31, 34, 36]. De

pathway van HR wordt in fig. 7 weergegeven [29].

14

Fig. 7: DSB herstel pathways. DNA-DSB worden voornamelijk hersteld door 1 van deze 2 pathways. HR heeft

nood aan een homologe zusterchromatide als template om de stukken DNA die verloren zijn gegaan door de breuk

terug in te bouwen. NHEJ kan doorgaan in aan- of afwezigheid van een zusterchromatide. In dit herstel proces

worden complexe lesies ter hoogte van de DSB die resulteren in assymetrische termini opnieuw met elkaar

verbonden waarna ze geprocessed worden en onderbrekingen opgevuld worden vooraleer de uiteinden terug

geligeerd worden [29].

15

1.5.2 De rol van BRCA1 en BRCA2 in DNA-DSB herstel

BRCA1 en BRCA2 zijn tumor suppressor genen. Beide zijn betrokken in het behoud van

genoom integriteit door hun rol in DNA herstel (vooral bij HR), celcyclus checkpoint controle

(vooral BRCA1) en regulatie van belangrijke stappen in mitose en celdeling. Bijgevolg kan

verlies van functie bij 1 van de 2 BRCA genproducten zorgen voor een enorme toename in

genoom instabiliteit en verhoogde radiosensitiviteit [31, 36, 38]. Ongeveer 5% van alle

borstkankers ontstaan door mutaties in de BRCA1 en/of BRCA2 genen. Vrouwen met een

BRCA1 of BRCA2 mutatie maken respectievelijk 60-80% en 50-70% kans om borstkanker te

ontwikkelen voor de leeftijd van 70 [22, 36]. Bij mannen is dit respectievelijk 1-5% en 5-10%

[22]. Vrouwen die drager zijn van zo een mutatie lopen eveneens een groter risico op

ovariumkanker, respectievelijk 20-45% en 10-20% [36, 39]. Vanaf de leeftijd van 50 hebben

vrouwen met een BRCA1 mutatie ook een verhoogd risico op colonkanker [39]. Mannen met

een BRCA2 mutatie hebben verder ook nog 25% meer kans op het ontwikkelen van

prostaatkanker. Tot slot hebben zowel vrouwen en mannen een licht verhoogde kans op het

ontwikkelen van pancreaskanker als ze drager zijn van een BRCA1 of BRCA2 mutatie,

respectievelijk 2-3% en 3-5% [22].

Het BRCA1 gen bevindt zich op de lange arm van chromosoom 17 (17q) en maakt voornamelijk

een proteïne aan die 1863 aminozuren lang is. Het BRCA1 proteïne bevat een really interesting

new gene (RING) domein in zijn amino(N)-terminale regio en een coiled-coil domein samen

met tandem BRCA1 C-terminal (BRCT) domeinen in zijn C-terminale regio [31]. Deze

domeinen zijn belangrijk voor DNA herstel en de DNA schade respons signaleringsfunctie van

BRCA1. BRCA1 maakt deel uit van verschillende supercomplexen die allemaal een rol spelen

in DNA schade respons- en checkpoint-activatie en DSB herstel. BRCA1 bestaat normaal als

een heterodimeer met BRCA1 geassocieerd RING domein proteïne 1 (BARD1), die ook een

RING/BRCT domein bevat [40]. In de afwezigheid van BARD1 is BRCA1 onstabiel en wordt

het zeer snel gedegradeerd. Zoals reeds vermeld speelt BRCA1 een belangrijke rol in het herstel

van DSB door HR. Na inductie van de stralingsgeïnduceerde DSB vormt het BRCA1/BARD1

heterodimeer verschillende supercomplexen met vele verschillende bindingspartners. Eén van

die complexen bestaat uit BRCA1, CtIP en het MRN complex. Dit complex, zoals eerder

besproken, zorgt voor generatie van de ssDNA uiteinden. De BRCA1 interactie met CtIP

gebeurt enkel na fosforylatie van CtIP in de S- of G2-fase wanneer HR voornamelijk actief is

voor DSB herstel.

16

BRCA1 is ook betrokken in een later stadium van HR waarbij BRCA1 interageert met BRCA2

via een mediator proteïne PALB2 en zo RAD51 rekruteert [36, 40].

Het BRCA2 gen bevindt zich op de lange arm van chromosoom 13 (13q) en codeert voor een

proteïne van 3418 aminozuren lang. De primaire functie van BRCA2 is in HR door zijn binding

aan RAD51 met behulp van 1 van zijn 8 tandem BRCT domeinen. Zoals eerder vermeld

interageert BRCA2 ook met PALB2 en kan het zo samen met BRCA1 RAD51 rekruteren naar

de DSB. Eens RAD51 zich op de plaats van de DSB bevindt, kan BRCA2 het op de 3’-ssDNA

uiteinden laden waarmee het RPA vervangt. Hierna doet BRCA2 nog dienst om het resulterende

nucleoproteïne filament te stabiliseren [36] (zie fig. 6. [29]).

1.5.3 γH2AX

Om de enorme lengte van het eukaryotisch genoom in de nucleus van een cel te passen, is een

zeer goede opvouwing nodig van het DNA. Deze opvouwing moet flexibel zijn zodat replicatie,

transcriptie en translatie kan plaatsvinden. Het DNA windt zich rond 8 histoneiwitten

(nucleosoom), dat dan verder condenseert tot chromatine. Een nucleosoom bestaat uit 8

histoneiwitten, afkomstig uit 4 histoneiwit families (2 van elk: H4, H3, H2B en H2A) [41].

Een DNA-DSB wordt gekenmerkt door de fosforylatie van een H2AX histoneiwit op serine

139 van zijn C-terminale staart, γH2AX genaamd [16, 26, 30, 41] (fig. 8). Deze fosforylatie

breidt uit tot enkele megabasen aan beide zijden van de breuk wat leidt tot een focus van γH2AX

[26, 41, 42]. Een kinase van de fosfoinositide 3-kinase (PI3)-familie (ATM, ataxia

telangiectasia and Rad3 related (ATR) en DNA-PK) is verantwoordelijk voor deze fosforylatie

[26, 27, 41]. De fosforylatie kan gebeuren na de replicatievork collapse of als reactie op IR,

maar ook tijdens gecontroleerde fysiologische processen zoals V(D)J recombinatie. De cel legt

ter hoogte van 1 van zijn celcylcus checkpoints de celcyclus stil zodat er tijd is om de schade te

herstellen. Na herstel van de DSB moet de cel terug uit het celcyclus checkpoint geraken, dit

gebeurt door het chromatine-geassocieerde fosfatase Wip1. Wip1 defosforyleert γH2AX op zijn

serine 139 waardoor de cel naar zijn volgende celdeling cyclus kan overgaan [41].

De rol van het gefosforyleerde histoneiwit in DNA herstel is nog steeds onder discussie maar

er is reeds geweten dat door de modificatie het DNA minder gecondenseerd wordt. Hierdoor

kunnen eiwitten die nodig zijn voor het herstel van de DSB gemakkelijker aan de breuk geraken.

http://en.wikipedia.org/wiki/Ataxia_telangiectasia_and_Rad3_related

http://en.wikipedia.org/wiki/Ataxia_telangiectasia_and_Rad3_related

17

Dit leidt tot de suggestie dat deze foci een rol spelen in signaal amplificatie, accumulatie van

DNA herstel factoren die chromatine remodulering vergemakkelijken, cel cyclus checkpoint

functionering, zusterchromatide-afhankelijk recombinatie-herstel en chromatine vasthechting

om dissociatie van gebroken uiteinden te voorkomen [42]. Mutagene experimenten hebben

aangetoond dat de modificatie noodzakelijk is voor de vorming van stralingsgeïnduceerde foci

in respons tot DSB, maar dat het niet noodzakelijk is voor de rekrutering van eiwitten naar de

plaats van de breuk.

Onderzoek toonde aan dat H2AX-deficiënte cellen nog functionele NHEJ hadden, maar geen

functionele HR [41].

Fig. 8: Boven: Humaan H2AX histoneiwit waarop alle serine-, threonine-, tyrosine- en histidine-residuen worden

op weergegeven. Residuen waarvan reeds gerapporteerd is dat ze gefosforyleerd kunnen worden, worden met een

rode “P” aangeduid. Onder: Schematische weergave van de processen die zich kunnen voordoen op S139 in

zoogdier cellen [41].

γH2AX wordt gebruikt voor het onderzoek naar DSB in cellen [4, 16, 27, 42]. De γH2AX foci

test, gebaseerd op de fosforylatie van H2AX, wordt reeds gebruikt als biomerker voor

veroudering en kanker, en als een biodosimeter voor drug ontwikkeling, blootstelling aan IR en

klinische trials voor chemo- en radiotherapie [27, 42]. Deze test is zeer gevoelig en detecteert

zelf DSB gecreëerd door lage dosissen in de orde van enkele mGy [13, 16, 43]. In de γH2AX

foci test worden aan de hand van een immunohistochemische kleuring de γH2AX foci

gevisualiseerd [4, 16]. Per DSB wordt juist 1 foci gevormd, waardoor deze test een perfecte

kwantitatieve indicator is voor het aantal DSB.

18

Aan de hand van het aantal foci per dosis kan dan een dosis-respons curve opgesteld worden

[4, 16]. De best passende dosis-respons curve bij mammografie X-stralen is een lineaire curve

met een over-respons in het zeer lage dosis gebied van enkele mGy en een lineaire respons bij

hogere dosissen [4, 16, 44-46] en kan verklaard worden door het RIBR (zie 1.4). De

international commission on radiological protection (ICRP) raadt nog steeds het linear-non-

treshold (LNT) model aan [12, 28, 46]. De curven worden voorgesteld in fig. 9 [47].

Naarmate de DSB hersteld worden zullen ook de foci verdwijnen. Hierdoor kan dus ook

gekeken worden naar de repair van DSB. Residuele DSB die overblijven na 24h geven een idee

over het aantal resterende of niet-herstelde DSB [16, 27, 40].

Fig. 9: Schematische voorstelling van verschillende mogelijke extrapolaties van gemeten stralingsrisico’s in het

lage dosis gebied. Curve a: LNT model. Curve b: hoger risico dan geschat bij het LNT model. Curve c en d,

lager risico dan geschat bij het LNT model. Curve e: lager risico in het zeer lage-dosis gebied gevolgd door een

licht hoger risico dan geschat bij het LNT model (hormese) [47].

1.6 Risico-inschatting

1.6.1 Lineaire energie transfer (LET)

X-stralen en γ-stralen geven hun energie af aan weefsel onder de vorm van indirecte ionisaties

(zie 1.4). Voor energieën onder de 50keV overheerst het foto-elektrisch effect, bij hogere

energieën wordt het Compton effect belangrijker [44]. De ionisatiedichtheid van deze stralen is

laag waardoor ze diep in weefsel kunnen penetreren.

19

Straling met deze eigenschappen wordt ook wel lage LET straling genoemd. LET wordt

gedefinieerd als de hoeveelheid energie die wordt neergezet onder de vorm van excitaties en/of

ionisaties per eenheid van afgelegde weg (keV/µm) [23]. DNA breuken geïnduceerd door lage

LET stralen zijn niet complex en worden efficiënt hersteld. Op het einde van een track kunnen

wel geclusterde ionisaties ontstaan [4, 23].

Hoge LET stralen daarentegen zijn onder andere snelle neutronen en α-deeltje. Deze stralen

hebben een hoge ionisatiedichtheid waardoor ze minder diep in het weefsel penetreren. Door

deze hoge ionisatiedichtheid creëren ze complexere DNA schade die moeilijker te herstellen is

en dus vaker leidt tot foutief of niet-herstelde DNA breuken [4, 23].

Mammografie X-stralen hebben een lage LET en een lage energie met een piek rond de 28-

30kV [12] en een energie rond de 15-20keV. 60Co γ-stralen vallen ook onder de lage LET stralen

maar hebben een hogere energie van rond de 1,25MeV. Deze 60Co γ-stralen geven hun energie

af over een langere afstand waardoor hun ionisatiedichtheid kleiner is en ze bijgevolg ook een

lagere LET hebben dan mammografie X-stralen [4, 44]. De impact van deze hogere LET 30 kV

X-stralen in vergelijking met de 60Co γ-stralen op biologische effecten wordt nog steeds

onderzocht. De huidige stralingsrisico’s van lage LET stralen zijn namelijk gebaseerd op

studies die gebruik maken van veel hogere dosissen en energieën (bv. Overlevenden van

Hiroshima en Nagasaki blootgesteld aan 2-5MeV 60Co γ-stralen) dan gebruikt bij

mammografie. Deze resultaten worden dan geëxtrapoleerd naar lagere dosissen en lagere

energieën, wat een verkeerd beeld kan geven [4, 12, 28, 44-46].

1.6.2 Relatieve biologische effectiviteit (RBE)

De RBE wordt gedefinieerd als de verhouding van de dosis van de referentiestraling (60Co γ-

stralen) tot de dosis van de te onderzoeken straling (mammografie X-stralen) die hetzelfde

biologisch effect in een bepaald type weefsel zal teweeg brengen [23]. De ICRP neemt

standaard voor alle lage LET X-stralen een relatieve biologische effectiviteit (RBE) van 1 aan.

Dit wordt nu in twijfel getrokken omdat verwacht wordt dat lage energie X-stralen een groter

biologisch effect teweeg brengen per eenheid van geabsorbeerde dosis dan hogere energie X-

stralen of γ-stralen door hun hogere LET [4, 44, 45]. Deze hogere RBE voor mammografie X-

stralen komt niet enkel doordat ze meer DSB induceren, maar ook doordat de DSB complexer

en dus moeilijker te herstellen zijn [4]. De RBE van mammografie X-stralen wordt in recente

onderzoeken geschat op 3-4 [4, 12, 44-46].

20

1.6.3 Detectie/inductie ratio (DIR)

Bij mammografie screeningprogramma’s is het belangrijk dat de voordelen van een vroege

detectie gewogen worden tegen de nadelen van mogelijke stralingsgeïnduceerde borstkanker.

Uit de RBE kan je dan de borstkanker detectie/inductie ratio (DIR) berekenen, de verhouding

van hoeveel borstkankers gedetecteerd worden op het aantal dat geïnduceerd worden bij de

screening met mammografie. De DIR is dan weer een maat voor de benefit/risk verhouding.

Epidemiologisch onderzoek toont dat de benefit/risk verhouding van het huidig doorgevoerd

mammografie screeningsprogramma voldoende groot is voor vrouwen tussen 50 en 70 jaar.

Voor een RBE van 1 is de DIR voor vrouwen boven de 50 met een 2 jaar screening interval

boven de 100 [4]. Maar recente onderzoeken tonen dat als we de verhoogde RBE van

mammografie X-stralen in rekening brengen, het risico onderschat wordt met een factor 3-4 [4,

12, 44-46]. Deze risico inschatting is vooral van belang voor patiënten met een mutatie zoals

een BRCA1 of BRCA2 mutatie, waar screening reeds start op jonge leeftijd.

Deze studies werden echter uitgevoerd op bloed (lymfocyten) [4] of cellijnen (epitheelcellen

van borst) [5, 13] en niet op borstweefsel. Onderzoek uitgevoerd op borstweefsel is

representatiever voor wat in vivo gebeurt als een borst bestraald wordt.

1.7 Doelstelling

Het doel van dit onderzoek is om aan de hand van een γH2AX foci test inductie en herstel van

DNA-DSB ten gevolge van lage dosis mammografie X-stralen (30kV X-stralen) en 60Co γ-

stralen na te gaan in humaan borstweefsel. Dit zal toelaten om een RBE te bepalen voor

mammografie X-stralen wat dan zal leiden tot een betere risico-inschatting bij het gebruik van

mammografie X-stralen. Ook zal worden nagegaan of een lage dosis van 4mGy, zoals

toegediend bij mammografie, kan worden waargenomen via de foci test. Er wordt gewerkt met

borstweefsel afkomstig van vrouwen met of zonder een BRCA1/2 mutatie. Zo kan ook nagegaan

worden of er een verschil is in DNA-DSB herstel bij personen met en zonder een BRCA1 of 2

mutatie.

21

2. Materialen en methoden

2.1 Materiaal

Deze studie werd uitgevoerd op gezond borstweefsel en werd goedgekeurd door het ethisch

comité van UZ Gent. Het borstweefsel werd verkregen in samenwerking met de dienst

plastische heelkunde (Prof. Dr. P. Blondeel, Dr. N. Roche en Dr. F. Stillaert). Dit borstweefsel

is afkomstig van gezond restweefsel van een borstreductie of mastectomie bij vrouwen.

Mastectomie gebeurt preventief bij asymptotische dragers van een BRCA1 of BRCA2 mutatie

of bij familiale belasting, maar ook bij vrouwen waar borstkanker vastgesteld werd. Het weefsel

kon enkel gebruikt worden indien een informed consent verkregen werd van de patiënt die

vooraf de volledige opzet van het onderzoek uitgelegd kreeg.

Uit het verkregen borstweefsel werd fibroglandulair weefsel geïsoleerd uit het vetweefsel en

versneden in stukjes van maximum 2mm laagdikte. Dit gebeurde met behulp van een pincet en

een schaar in een petrischaal (Greiner bio-one, Wemmel, België) gevuld met ringer oplossing

(kamertemperatuur) om het borstweefsel vochtig te houden. De samenstelling van ringer wordt

in tabel 1 weergegeven. Na het snijden werd het fibroglandulair weefsel in 6 well-platen

(Greiner bio-one) gelegd waarna ze gevuld werden met voorverwarmd cultuurmedium (37°C).

Dit medium wordt gebruikt voor culturen van humane borstepitheel cellijnen (MCF10A). De

samenstelling van het cultuurmedium voor de MCF10A cellijn wordt in tabel 2 weergegeven.

Tabel 1: Samenstelling ringer.

Producten Firma Catalogusnummer Hoeveelheid

Natriumchloride (NaCl) Sigma-Aldrich® (Bornem, België) S-9888 9,00g

Calciumchloride (CaCl) VWR® (Leuven, België) 766948 0,42g

Kaliumchloride (KCl) VWR® 1.04936 0,24g

Tabel 2: Samenstelling cultuurmedium MCF10A.


DMEM/Glutamax Gibco® (Thermo

Scientific)

61965 250ml

F12/Glutamax Gibco® 31765 250ml

FCS Gibco® 10270-106 25,0ml

EGF (recombinant

humaan)*

PeproTec (Halle-Zoersel,

België)

AF-100-15 100µl

Hydrocortison** Sigma-Aldrich® H0888 250µl

Insuline*** Sigma-Aldrich® I1882 500µl

Penicilline/Streptavidine Gibco® 15140-122 2,50ml

* EFG: oplossen in 100µg/ml in steriel water, aliquoteren en bij -20°C bewaren.

** Hydrocortison: oplossen in 1mg/ml absolute ethanol, aliquoteren en bij -20°C bewaren (eerst 10X aliquoteren

en pas indien nodig verder verdunnen naar 1X)

*** Insuline: oplossen in 10mg/ml in steriel water met 1% ijsazijn. Laat staan gedurende ongeveer 10-15min,

aliquoteren en bewaren bij 4°C.

22

2.2 In vitro bestralingsprotocol

Bestraling van de borstweefselstukjes gebeurde in vitro in het Instituut voor Nucleaire

Wetenschappen (INW, Prof. Dr. H. Thierens). De gebruikte dosissen waren 0, 4, 10, 40, 100-

en 500mGy, toegediend met een Siemens Mammomat3 mammograaf (Siemens, Brussel,

België) en een 60Co γ-bron als referentie. De bestraling met de mammograaf gebeurde in een

voorverwarmde polymethylmethacrylaat bak (PMMA, 37°C). Het toestel produceert een 30kV

Mo/Mo X-straal spectrum aan een dosistempo van 0,125 Gy/min. De dosis werd toegediend in

verschillende pulsen. De samenstelling van deze pulsen en de ingestelde parameters worden in

tabel 3 weergegeven.

60Co γ-bestraling gebeurde in een warmwaterbad (37°C) met een dosistempo van 0,00484

Gy/min bij dosissen tot en met 40mGy. Bestraling van 100 en 500mGy gebeurde aan een

dosistempo van 6Gy/min om de bestralingstijden in te korten.

De bestraalde weefselstukjes werden nog 30min geïncubeerd in een CO2 incubator (Thermo

Scientific, 5% CO2, 37°C), waarna het DNA herstel proces gestopt werd door het weefsel op

ijs te plaatsen. Dit gebeurde in een 6-well-plaat (Greiner bio-one) gevuld met koude ringer.

Controle stalen (0mGy) en weefselstukjes die bestraald werden met 4- en 40mGy werden naast

30’ ook 24h geïncubeerd. Op die manier hadden de cellen de tijd om de opgelopen

stralingsschade te herstellen en kon de repair van DSB bekeken worden.

Tabel 3: Parameters Siemens Mammomat3 mammograaf.

Dosis (mGy) kV mAs Samenstelling

0 0 0 /

4 30 14 10+4

10 30 35 25+10

40 30 138 110+28

100 30 346 250+80+16

500 30 1729 6*250+220+9

2.3 Histologisch doorwerken van het borstweefsel

2.3.1 Fixatie

Na incubatie van 30’ of 24h werd het weefsel gefixeerd door het bij 4°C in 4%

paraformaldehyde (PFA) te brengen gedurende 24h. De samenstelling van 4% PFA wordt in

tabel 4 weergegeven. Fixeren was nodig om de dynamische processen in de cel stil te leggen

en de oorspronkelijke morfologie zo goed mogelijk te bewaren.

23

Tabel 4: Samenstelling 4% PFA.

Producten Firma CatalogusnummerHoeveelheid

Formaldehyde 40% VWR® UN.2209 100ml

Dinatriumhydrogenfosfaat

(Na2HPO4)

VWR® 1.06580 1,78g

Kaliumdihydrogenfosfaat

(KH2PO4)*

VWR® 1.04873 0,42g

*KH2PO4 toevoegen tot pH 6,9

**gedestilleerd water (aqua dest., AD) toevoegen tot 1000ml

2.3.2 Inbedding en weefselcoupes snijden

Aan de hand van een stijgende alcoholreeks werd het weefsel eerst ontwaterd. Aangezien

alcohol niet oplosbaar is in de paraffine, waar het weefsel in ingebed werd, is de incubatie als

volgt: isopropyl alcohol, isopropyl alcohol/toluol en als laatste toluol. Het protocol van de

manuele inbedding wordt in bijlage 1 weergegeven. De weefselstukjes werden daarna in cupjes

met paraffine (Thermo Scientific) geplaatst. De cupjes met ingebed weefsel verbleven dan

overnacht in een oven van 60°C. Vervolgens werden de weefselstukjes centraal georiënteerd in

het cupje en 2h in de koelkast (4°C) geplaatst om de paraffine voldoende te laten uitharden.

Hierna werd het in paraffine ingebed weefsel uit de cupjes gehaald, op blokjes geplaatst en

nogmaal 2h in de koelkast geplaatst. Vervolgens werden coupes van 5µm gesneden met de

microtoom en overgebracht op draagglaasjes. Er werden 3 preparaten gemaakt per

weefselstukje met elk 2 coupes per draagglaasje.

2.3.3 Haematoxyline-eosine (HE) kleuring

Voordat een immunohistochemische kleuring uitgevoerd wordt, moet men zeker zijn dat er

effectief klierbuizen aanwezig zijn in de weefselcoupes. Dit werd nagegaan aan de hand van

een haematoxyline- (1/4 mayer, VWR®) eosine-pfloxine (Thermo Scientific) kleuring. Deze

kleuring gebeurde geautomatiseerd met de Robot Stainer Microm HMS 740. Het protocol van

de HE kleuring wordt in bijlage 2 weergegeven.

2.4 γH2AX foci test

In een vorige masterproef werd de γH2AX foci test reeds op punt gesteld op borstweefsel.

Aangezien de γH2AX immunohistochemische kleuring nog niet optimaal was, werd in deze

studie nog verder geoptimaliseerd. Er werd getest met verschillende protocols, AR, 2

verschillende 1e AL’en, verschillende verdunningen van het 1e AL, verschillende wasbuffers

en chromogene substraten. De resultaten van deze optimalisatie stappen worden besproken in

de resultaten en de bespreking.

24

Hieronder volgt de beschrijving van het geoptimaliseerd protocol dat werd gebruikt in deze

studie.

2.4.1 Deparaffineren

Deparaffinering gebeurde geautomatiseerd met het kleurtoestel Microm HMS 740 (Robot-

Stainer, Walldorf, Duitsland). Het protocol van de deparaffinering wordt in bijlage 3

weergegeven.

2.4.2 Antigen retrieval (AR)

AR gebeurde in een citraatbuffer (0,1g citroenzuur (E. Merck, Darmstadt, Duitsland) in 500ml

AD) met pH 6. De pH werd aangepast door toevoeging van natriumhydroxide (NaOH). De

buffer werd aan de kook gebracht door het ongeveer 5’ in de microgolf te plaatsen met deksel.

Vervolgens werden de preparaten in de citraatbuffer gebracht en 2 x 5’ in de microgolf

geplaatst, terug met deksel. Tussen de 2 x 5’ koken moest de buffer kort afkoelen zodat deze

niet meer kookt. Daarna werd de buffer met preparaten 30’ afgekoeld tot kamertemperatuur en

nog 2 x 5’ in PBS geplaatst. Vervolgens werden de weefselcoupes afgegrensd met een Dako

pen (Dako, Heverlee, België) zodat de vloeistoffen op de weefsels zouden blijven.

2.4.3 Voorbehandeling met H2O2 en blokkingsserum (BS)

Aangezien er gewerkt werd met een immuno-enzymatische kleurreactie, moest de endogene

peroxidase activiteit uitgeschakeld worden zodat deze niet interfereert met de kleuring.

Voorbehandeling van de coupes gebeurde in 3%H2O2 (1.06172, VWR®), dit gedurende 10’.

H2O2 schakelt in afwezigheid van 3,3'-diaminobenzidine (DAB) de endogene peroxidase

activiteit uit. Dit gebeurde in het donker omdat H2O2 reageert met licht. 3%H2O2 werd

vervolgens vervangen door het BS en 30’ geïncubeerd op kamertemperatuur. Het BS gaat niet-

specifieke bindingen tegen. Tween®20, een bestanddeel van het BS is een detergent en maakt

de membranen van de cel en de kern permeabel. De samenstelling van het BS wordt in tabel 5

weergegeven.

25

Tabel 5: Samenstelling BS


BS

PBS (PH:7,2) UGent Zie boven 0,005 l

BSA Roche diagnostics

(Vilvoorde, België)

10 735 086 001 0,050 g

NRS DAKO X0902 250,0 x10^-6 l

Tween 20 (10%) VWR® 161-0781 100,0 x10^-6 l

2.4.4 Immunohistochemische kleuring

De immunohistochemische kleuring gebeurde via een driestapsreactie, waarbij

achtereenvolgens met volgende antilichamen (AL’en) werd geïncubeerd:

1. anti-γH2AX (613401, BioLegend, Trembodegem, België)(1/1000 in PBS + 10% BS;

2h bij kamertemperatuur).

2. gebiotinyleerd rabbit anti-mouse (Bioth RAM, E0413, Dako)(1/200 in PBS + 10% BS;

30’).

3. streptavidine-horseradish peroxidase (Strept-HRP, P0397, Dako)(1/200 in PBS; 30’).

Per coupe werd ongeveer 100µl AL-oplossing voorzien. Na de eerste 2 AL stappen werd telkens

2 x 5’ gewassen met PBS + Tween® 20 0,3%. Na incubatie met Strept-HRP werd 3 x 5’

gewassen met PBS. De kleuring werd zichtbaar gemaakt door de reactie met DAB-NiCl2. Deze

incubatie duurde 10’ en gebeurde in het donker aangezien DAB reageert met licht. De

samenstelling van PBS en DAB-NiCl2 wordt in tabel 6 weergegeven. De preparaten werden

nog 10’ gespoeld met stromend leidingwater.

Tabel 6: Samenstelling PBS en DAB-NiCl2


PBS (pH: 7,2)

Natriumwaterstoffosfaat

(Na2HPO4)

VWR® 1.06580 1,780 g

Kaliumwaterstoffosfaat (KH2PO4) VWR® 1.04873 0,420 g

Natriumchloride (NaCl) Sigma-Aldrich® S-9888 7,200 g

Gedestilleerd water / / 1,000 l

DAB (stockoplossing)

DAB Sigma-Aldrich® D5637 0,025 g

AD / / 0,001 l

NiCl2 (stockoplossing)

NiCl2 VWR® 1.06717 4,000 g

Gedestilleerd H2O / / 0,050 l

DAB- NiCl2 (werkoplossing)

DAB Sigma-Aldrich® D5637 200,0 x10^-6 l

PBS (PH:7,2) Zie boven Zie boven 0,010 l

NiCl2 VWR® 1.06717 50,00 x10^-6 l

H2O2 (30%) VWR® 1.06172 4,170 x10^-6 l

26

2.4.5 Ontwateren en dekglas monteren

De coupes werden automatisch ontwaterd in de Microm HMS 740 (Robot-Stainer, Walldorf,

Duitsland) met een stijgende alcoholreeks. Het protocol van ontwateren wordt in bijlage 4

weergegeven. Bijlage 1 geeft de firma en het catalogusnummer van deze producten weer. Na

het ontwateren werd op de coupes mounting media (Thermo Scientific) gebracht en een dekglas

(knittel glass, Duitsland) gemonteerd.

2.5 Foci telling

De foci werden geteld met behulp van een lichtmicroscoop (Leica LEITZ-DMRB, Diegem,

Belgïe) bij een objectief vergroting van 63X. Het gemiddeld aantal foci per cel is een

belangrijke maat om stralingsschade te meten.

Enkel preparaten met een goede kleuring werden geteld. Indien twijfel bestaat over de

immunohistochemische kleuring werd deze opnieuw uitgevoerd. Bij deze controle

behoort ook het nakijken van de negatieve controle op aspecifieke bindingen.

De preparaten werden gecodeerd voor een objectieve telling.

Enkel de luminale epitheelcellen van een klierbuis werden geteld.

Op elk preparaat werden minstens 400 cellen geteld, verdeeld over 4 verschillende

klierbuizen of klierbuisgroepen.

2.6 Statistische bewerkingen

Statistische analyse werd uitgevoerd in SigmaPlot. De Mann-Whitney U test is een test om na

te gaan of twee onafhankelijke steekproeven uit dezelfde populatie of verdeling komen. Met

deze test werd nagegaan of er een significant verschil is tussen de waarden in het 95%

betrouwbaarheidsinterval.

27

3. Resultaten

3.1 Materiaal

In totaal werden tijdens deze masterproef 6 borstweefsel stalen verkregen (breast tissue (BT)11-

16). In deze studie werd nooit met tumorweefsel gewerkt. 3 stalen waren afkomstig van een

borstreductie (2 bilateraal, en 1 na borstkanker in de andere borst), 2 stalen waren afkomstig

van een mammectomie bij vrouwen die asymptotische drager zijn van een BRCA1 of BRCA2

mutatie (geen verdere info over de specifieke mutatie gekend) en 1 staal werd niet bestraald en

niet gebruikt in deze studie. BT12 bevatte klierweefsel maar toonde geen mooie resultaten bij

de γH2AX foci test en werd hierdoor uit de studie gelaten. Daarnaast werden in een vorige

masterproef al 10 stalen verkregen (BT1-BT10). Over staal 10 was geen achtergrond informatie

beschikbaar. Hierbij waren 4 stalen afkomstig van een borstreductie, 2 stalen afkomstig van

vrouwen die asymptotische drager zijn van een BRCA1 of BRCA2 mutatie, 1 staal afkomstig

van een vrouw met familiale belasting en 2 stalen afkomstig van vrouwen met borstkanker. In

staal 1 en 7 werd geen klierweefsel aangetroffen na uitvoeren van een HE kleuring. Er werd

een γH2AX foci test met AR uitgevoerd op BT2-6, BT9, BT11 en BT14-BT16 zodat voor elke

dosis minstens 1 γH2AX foci kleuring uitgevoerd werd. Een overzicht van de stalen wordt in

tabel 7 weergegeven.

Tabel 7: Overzicht van borstweefsel stalen.

Staal Type γH2AX met AR

BT1 (18/11/2013) BRCA1 of 2 mutatie

BT2 (19/11/2013) familiale belasting X

BT3 (26/11/2013) Borstkanker X

BT4 (06/12/2013) Borstreductie X


BT6 (24/02/2014) BRCA1 of 2 mutatie X

BT7 (27/03/2014) Borstkanker

BT8 (10/04/2014) Borstreductie


BT10 (16/05/2014) /


BT12 (04/11/2014) Borstkanker/borstreductie

BT13 (06/11/2014) Controlestaal




28

3.2 HE kleuring

De HE kleuring werd uitgevoerd om na te gaan of de weefselcoupes effectief klierweefsel

bevatten en om na te gaan of de kwaliteit van het klierweefsel goed was. Haematoxyline is een

basische kleurstof die basofiele structuren zoals degene die nucleïnezuren bevatten (ribosomen,

chromatinerijke celkern, RNA-rijke cytoplasmatische gebieden,...) blauwpaars kleurt. Eosine

kleurt de eosinofiele structuren zoals intracellulaire of extracellulaire proteïnen en matrix helder

roze. Haematoxyline kleurt dus voornamelijk de kern en eosine het cytoplasma en de

bindweefsel matrix. Hierdoor zie je duidelijk het klierweefsel liggen, omringd door

voornamelijk bindweefsel en een beetje vetweefsel. Een doorsnede doorheen een klierbuis met

omgevend bindweefsel gekleurd met HE wordt in fig. 10 weergegeven.

Fig. 10: HE kleuring van een doorsnede doorheen een klierbuis met omgevend bindweefsel: vergroting 20X,

schaal-50µm.

3.3 Optimalisatie γH2AX immunohistochemische kleuring

In een vorige masterproef werd reeds een optimalisatie van de immunohistochemische kleuring

uitgevoerd, maar deze stond nog niet helemaal op punt. Sommige klierbuisgroepen in een

bepaalde coupe werden aangekleurd terwijl anderen niet. Verder was er ook heel wat

achtergrondkleuring waardoor de tellingen bemoeilijkt werden. Het was dan ook de bedoeling

om in deze studie de immunohistochemische kleuring eerst verder te optimaliseren vooraleer

foci tellingen uit te voeren.

29

Antigen retrieval

Een eerste optimalisatie was gericht op het beter beschikbaar maken van de epitopen, dit door

AR.

In fig. 11 wordt een aangekleurde en een niet-aangekleurde zone in eenzelfde coupe

weergegeven wanneer geen AR toegepast werd. Met AR is het de bedoeling om de cross-links

tussen de eiwitten in het weefsel gecreëerd door het fixatief deels te verbreken waardoor meer

antigenen (γH2AX) beschikbaar worden voor binding met het 1e AL. Hierdoor werd gezorgd

dat een coupe meer egaal aankleurde. Bij AR werden de coupes gekookt in een citraatbuffer.

Er werd getest met een steamer en met een microgolf. De microgolf gaf een beter resultaat

aangezien met de steamer het weefsel sterk beschadigd werd.

A. B.

Fig. 11: γH2AX immunohistochemische kleuring: vergroting 60X, schaal-10µm. A. Niet aangekleurde zone bij

een immunohistochemische kleuring zonder AR, B. Aangekleurde zone bij een immunohistochemische kleuring

zonder AR.

Antilichamen

In de vorige studie werd enkel gewerkt met één primair AL, nu werd ook geëxperimenteerd

met een 2e AL. Voor beide AL’en werden verschillende verdunningen en verschillende

incubatie tijden getest.

Het 1e anti-γH2AX AL dat ook gebruikt werd in een vorige masterproef is een monoklonaal

AL opgewekt in muis (Millipore 05-636). Als 2e AL werd gebiotinyleerd rabbit anti-mouse

gebruikt. De verdunningen getest bij overnacht incubatie en 2h incubatie voor het 1e AL waren

1/500 en 1/1000.

Het 2e anti-γH2AX AL dat in deze studie ook werd getest is een polyklonaal AL opgewekt in

konijn (bethyl IHC-00059). Als 2e AL werd gebiotinyleerd goat anti-rabbit gebruikt.

30

Bij een overnacht kleuring werden de verdunningen 1/2500 en 1/5000 voor het 1e AL uitgetest.

Daarnaast werd ook een 2h incubatie uitgetest met de verdunningen 1/1000 en 1/2000.

Chromogeen substraat

Voor de visualisatie van het signaal werd gewerkt met een peroxidase-DAB reactie. Voor beide

AL’en werd ook het verschil nagegaan tussen het gebruik van DAB en DAB-NiCl2. DAB is

een chromogeen die door het enzym HRP kan omgezet worden in een gekleurde verbinding

volgens volgende immuno-enzymatische reactie:

Kleurloos chromogeen (DAB) + substraat (H2O2) + enzym (HRP) HRP + 2H2O + bruine

neerslag (geoxideerd DAB)

NiCl2 bindt aan DAB en zorgt dat de foci zwart zijn in plaats van bruin. Hierdoor is er meer

contrast en zijn de foci duidelijker zichtbaar.

In bijlage 5 worden de testkleuringen weergegeven. De overnacht kleuringen met het

monoklonaal AL opgewekt in muis met NiCl2 hadden zeer donkere kernen en er waren geen

foci zichtbaar. Zonder NiCl2 waren ook geen foci zichtbaar, waarschijnlijk door te weinig

contrast. Bij de overnacht kleuringen met het polyklonaal AL opgewekt in konijn met NiCl2

waren de kernen terug zeer donker en zijn geen foci zichtbaar. Zonder NiCl2 waren ook geen

foci zichtbaar, waarschijnlijk door te weinig contrast.

De kleuringen met 2h incubatie waren over het algemeen beter. Het monoklonaal AL opgewekt

in muis met NiCl2 gaf de meest optimale kleuring. Bij de 1/500 verdunning waren de kernen

redelijk donker maar waren grote duidelijke foci zichtbaar. Er was minder achtergrond

aanwezig bij de 1/1000 doordat bij een grotere verdunning minder aspecifieke bindingen

plaatsvinden. Zonder NiCl2 waren ook duidelijke foci zichtbaar maar was het contrast minder.

Bij het polyklonaal AL opgewekt in konijn waren de kleuringen met NiCl2 redelijk donker maar

waren wel zeer kleine foci te zien. Zonder NiCl2 zag je duidelijke foci maar was het contrast

laag.

Wasbuffer

Om de achtergrond kleuring ten gevolge van aspecifieke bindingen te verminderen, werd aan

de PBS buffer Tween®20 (0,3%) toegevoegd. Deze buffer werd gebruikt bij de wasstappen

volgend op de incubatiestappen van de AL’en.

31

Bij specifieke bindingen zullen naast ionische en van der Waals interacties ook zeer sterke

hydrofobe interacties zijn tussen het eiwit en het AL. Tween®20 is een lichte detergent die de

zwakkere hydrofobe interacties die bestaan tussen het weefsel en het AL bij aspecifieke

bindingen verbreekt. Hierdoor kunnen de minder sterk gebonden AL worden weggespoeld

waardoor er minder achtergrondkleuring is. In fig. 12 wordt het verschil weergegeven tussen

een γH2AX immunohistochemiche kleuring met en zonder Tween®20.

A. B.

Fig. 12 γH2AX Immunohistochemische kleuring: A. zonder Tween®20, B. met Tween®20.

Tegenkleuring

In een voorgaande masterproef gebeurde de tegenkleuring met toluïdine blauw, maar ten

gevolge van de AR werd de kleurstof niet meer opgenomen in de kern. De kernen waren echter

al duidelijk zichtbaar zonder tegenkleuring. Een tegenkleuring werd dan ook uit het protocol

gelaten.

Geoptimaliseerd protocol

De beste resultaten werden verkregen bij de immunohistochemische kleuring met AR, het

monoklonaal AL opgewekt in muis, verdunning 1/1000 van het 1e AL, PBS met Tween®20 als

wasbuffer en met DAB-NiCl2. Gebruik makend van het geoptimaliseerd protocol, zoals

beschreven in materialen en methoden, werden foci geteld in de verschillende stalen. In

sommige gevallen was er nog te veel achtergrond. Enkel in de coupes waar de

immunohistochemische kleuring optimaal gelukt was en de foci duidelijk zichtbaar waren,

werden de foci geteld. In fig. 13 wordt een negatieve controle, een optimale kleuring en een

kleuring met te veel achtergrond weergegeven.

32

A. B.

C. D.

Fig.13 γH2AX immunohistochemische kleuring: vergroting 60X, schaal-10µm A. negatieve controle, B. kleuring

met te veel achtergrond, C. optimale kleuring 100mGy, D. optimale kleuring 500mGy.

3.4 Dosis-respons curve

10 borstweefsel stalen werden gebruikt voor het opstellen van een dosis-respons curve voor

30kV X-stralen en 60Co γ-stralen.

In tabel 8A en B worden het aantal γH2AX foci/cel na 30’ incubatie weergegeven voor

respectievelijk 60Co γ-stralen en 30kV X-stralen. Zowel individuele waarden als het gemiddelde

worden getoond. De waarden voor de niet bestraalde weefselstukjes zijn hetzelfde voor 30kV

X-stralen als 60Co γ-stralen. Er werden steeds ongeveer 400 cellen per preparaat geteld,

verdeeld over 4 klierbuizen of klierbuisgroepen. Niet elk stukje borstweefsel bevatte effectief

klierweefsel, daarom zijn bij sommige stalen niet alle dosissen ingevuld.

33

Tabel 8: Aantal geïnduceerde foci/cel na 30’ incubatie. A. 60Co γ-stralen, B. 30kV X-stralen.

A. 60Co γ (mGy) BT2 BT3 BT4 BT5 BT6 BT9 BT11 BT14 BT15 BT16 mean

0 0,24 0,13 0,11 0,14 0,073 0,14 0,090 0,13

4 0,30 0,22 0,13 0,19 0,21

10 0,34 0,23 0,29

40 0,38 0,30 0,34

100 0,74 0,79 0,77

500 4,70 4,048 2,77 3,84

B. 30kV X (mGy) BT2 BT3 BT4 BT5 BT6 BT9 BT11 BT14 BT15 BT16 mean

0 0,24 0,13 0,11 0,14 0,073 0,14 0,090 0,13

4 0,21 0,18 0,21 0,31 0,16 0,21

10 0,27 0,24 0,22 0,24

40 0,43 0,35 0,41 0,40

100 0,66 0,88 0,77 0,98 0,82

500 4,39 3,80 4,073 4,54 4,20

*BC = Borstkanker

In Fig. 14 worden de dosis-respons curven (0-500mGy) met standard error of the mean (SEM)

weergegeven voor het gemiddeld aantal γH2AX foci/cel na 30’ incubatie voor 60Co γ-stralen

en 30kV X-stralen. Data van mutatiedragers en niet-mutatiedragers werden samengenomen

aangezien 30’ na bestraling geen verschil wordt verwacht. (Vergelijking 60Co γ-stralen:

Yγ=0,007372 D + 0,13; Vergelijking 30kV X-stralen: Yx= 0,008086 D + 0,13)

In Fig. 15 wordt de dosis-respons curve uitvergroot weergegeven voor het lage dosis gebied (0-

40mGy).

34

Fig. 14: De lineair gefitte dosis-responscurve (0-500mGy) met SEM van het gemiddeld aantal foci/cel na 30’

incubatie voor 60Co γ-stralen en 30kV X-stralen. (opgesteld in graphpad)

Fig.15: Dosis-respons curve met SEM van het gemiddeld aantal foci/cel na 30’ incubatie voor 60Co γ-stralen en

30kV X-stralen, in het lage dosis gebied (0-40mGy). Hierop werden de dosis-respons curven uit fig. 14 geplot.

Fig. 14 toont dat na bestraling met 30 kV X-stralen een licht hogere lineaire dosis-respons curve

(0-500mGy) werd verkregen in vergelijking met 60Co γ-stralen. Uit deze dosis-respons curven

werd een RBE van 1,1 berekend. In het lage dosis-gebied (0-10mGy, fig. 15) lagen de

gemiddelde foci voor zowel 30kV X-stralen als 60Co γ-stralen boven de gefitte dosis-respons

curven uit fig. 14. Dit wijst op een sterkere stijging van het aantal foci in het lage dosis gebied

gaande van 0-10mGy wat zou kunnen wijzen op lage dosis hypersensitiviteit (supra-lineariteit).

In het lage dosis gebied van 0-10mGy werden geen duidelijke verschillen gezien tussen 30kV

X-stralen en 60Co γ-stralen.

35

3.5 Lage-dosis effecten

Een patiënt ontvangt bij een mammografie screening een MGD van ongeveer 4mGy. Of een

dosis van 4mGy resulteert in een duidelijk genotoxisch effect is daarom van groot belang. In

fig. 16 wordt een histogram met SEM van het gemiddeld aantal foci/cel voor 0, 4 en 10mGy na

30’ weergegeven, dit enkel voor 30kV X-stralen zoals gebruikt bij mammografie. De resultaten

van 0 en 4mGy voor 60Co γ-stralen waren in deze studie dezelfde als die voor 30kV X-stralen.

Data van mutatiedragers en niet-mutatiedragers werden terug samengenomen.

Fig. 16: Histogram met SEM van het gemiddeld aantal foci/cel voor 0 (n=7), 4 (n=5) en 10mGy (n=3) na 30’

incubatie voor 30kV X-stralen.

Het histogram toonde een duidelijke stijging in gemiddeld aantal foci/cel tussen 0 en 4mGy

(fig. 16). Er werd een Mann-Whitney U test uitgevoerd om na te gaan of het verschil in

gemiddeld aantal foci/cel tussen 0 en 4mGy significant was. De test toonde een significant

verschil in het 95% betrouwbaarheidsinterval (overschrijdingskans (P)=0,03). Hieruit kon

besloten worden dat het verschil in de gemiddelde waarden tussen de 2 groepen groot genoeg

was om de mogelijkheid uit te sluiten dat het verschil het resultaat is van random variabiliteit.

Tussen 4 en 10mGy was er een niet significante stijging.

36

3.6 Repair van DSB

In tabel 9A en B wordt het gemiddeld aantal foci/cel na 24h incubatie weergegeven voor

respectievelijk 60Co γ-stralen en 30kV X-stralen. Op deze manier kon het aantal geïnduceerde

foci vergeleken worden met het aantal residuele foci/cel na herstel. Het verschil in DSB repair

werd bekeken tussen mutatiedragers en niet-mutatiedragers. Er werden steeds ongeveer 400

cellen per preparaat geteld, verdeeld over 4 klierbuizen of klierbuisgroepen. Niet elk stukje

borstweefsel bevat effectief klierweefsel, daarom zijn bij sommige stalen niet alle dosissen

ingevuld. Er werd enkel naar de repair gekeken bij de dosissen 0, 4, 40 en 500mGy.

Tabel 9: Gemiddeld aantal foci/cel na 24h incubatie. A. 60Co γ-stralen, B. 30kV X-stralen.

A Zonder mutatie BRCA1/2 mutatie 60Co γ (mGy) BT2 BT3 BT4 BT11 BT16 BT5 BT6 BT9 BT14 BT15

0 0,12 0,20 0,19 0,24

4 0,16 0,20

40 0,18 0,14

500 0,37

B Zonder mutatie BRCA1/2 mutatie 30kV X (mGy) BT2 BT3 BT4 BT11 BT16 BT5 BT6 BT9 BT14 BT15

0 0,12 0,20 0,19 0,24

4 0,21 0,16 0,11 0,17 0,16 0,15

40 0,21 0,18 0,19 0,18

500 0,37 0,26 0,27 0,22

*BC = Borstkanker

In fig 17-19 worden deze data grafisch weergegeven.

Fig. 17A toont het gemiddeld aantal foci/cel bij mutatiedragers en niet-mutatiedragers voor

60Co γ-stralen, na een postbestralingstijd van 30’ en 24h bij bestraling met 0, 4 en 40mGy. Dit

geeft respectievelijk het initieel aantal DSB en het residueel aantal DSB weer. Fig. 17B toont

dezelfde data maar voor 30kV X-stralen.

Fig. 18 toont het gemiddeld aantal foci/cel bij mutatiedragers en niet-mutatiedragers voor 60Co

γ-stralen en 30kV X-stralen, na een postbestralingstijd van 30’ en 24h bij bestraling met

500mGy.

In Fig. 19A en 19B worden enkel de gemiddelde residuele foci voor respectievelijk 60Co γ-

stralen en 30kV X-stralen weergegeven voor de verschillende dosissen (0, 4, 40 en 500mGy)

bij mutatiedragers en niet-mutatiedragers.

37

A.

B.

Fig. 17: Gemiddeld aantal foci/cel voor 60Co γ-stralen en 30kV X-stralen, 30’ en 24h na bestraling met 0, 4 en

40mGy. A. 60Co γ-stralen (0mGy: 30’ (n=7), 24h gezond (n=3), 24h mutatie (n=1); 4mGy: 30’ (n=4), 24h gezond

(n=1), 24h mutatie (n=1); 40mGy: 30’ (n=2), 24h gezond (n=1), 24h mutatie (n=1)). B. 30kV X-stralen (0mGy:

30’ (n=7), 24h gezond (n=3), 24h mutatie (n=1); 4mGy: 30’ (n=5), 24h gezond (n=4), 24h mutatie (n=2); 40mGy:

30’ (n=3), 24h gezond (n=3), 24h mutatie (n=1)).

Fig. 18: Gemiddeld aantal foci/ cel voor 60Co γ-stralen (30’ (n=3), 24h gezond (n=1)) en 30kV X-stralen (30’

(n=4), 24h gezond (n=2), 24h mutatie (n=2)) na bestraling met 500mGy.

38

A.

B.

Fig. 19: Gemiddeld aantal foci/cel voor 60Co γ-stralen en 30kV X-stralen, 30’ en 24h na bestraling met 0, 4, 40

en 500mGy. A. 60Co γ-stralen (0mGy: 24h gezond (n=3), 24h mutatie (n=1); 4mGy: 24h gezond (n=1), 24h

mutatie (n=1); 40mGy: 24h gezond (n=1), 24h mutatie (n=1); 500mGy: 24h gezond (n=1)). B. 30kV X-stralen

(0mGy: 24h gezond (n=3), 24h mutatie (n=1); 4mGy: 24h gezond (n=4), 24h mutatie (n=2); 40mGy: 24h gezond

(n=3), 24h mutatie (n=1); 500mGy: 24h gezond (n=2), 24h mutatie (n=2)).

Na bestraling met zowel 30kV X-stralen als 60Co γ-stralen werd een daling van het gemiddeld

aantal foci/cel geobserveerd na 24h. Voor 4 en 40mGy daalde het aantal foci tot de waarde

bekomen in de niet bestraalde stalen (achtergrondwaarde). Voor 500mGy bleef het aantal foci

na 24h duidelijk boven deze waarde. In de niet bestraalde stalen is het aantal foci laag maar

werd een stijging in aantal foci vastgesteld in de stalen geïncubeerd voor 24h in vergelijking

met de stalen geïncubeerd gedurende 30’. Door de beperkte data kon niet nagegaan worden of

deze veranderingen significant zijn. Ook voor het verschil in herstel tussen mutatiedragers en

niet-mutatiedragers kon geen significantie berekend worden omwille van diezelfde reden.

39

Wanneer men de data van mutatiedragers en niet-mutatiedragers samen neemt, kon voor 30kV

X-stralen nagegaan worden of het verschil in gemiddeld aantal residuele foci significant is

tussen 0, 4, 40 en 500mGy. Dit werd nagegaan met de Mann-Whitney U test. De test toont een

significant verschil tussen 40 en 500mGy (P=0,029). Het verschil tussen 0 en 4mGy na 24h en

0 en 40mGy was niet significant. de P-waarden waren respectievelijk 0,352 en 0,686.

40

4. Bespreking

Het doel van dit onderzoek is om aan de hand van een γH2AX foci test inductie en herstel van

DNA-DSB ten gevolge van lage dosis mammografie X-stralen (30kV X-stralen) en 60Co γ-

stralen na te gaan in humaan borstweefsel. Hiertoe diende de γH2AX foci test voor borstweefsel

eerst verder geoptimaliseerd te worden. Een optimalisatie was nodig aangezien de γH2AX foci

test gebruikt werd om verschillen na te gaan in het lage dosis gebied. Uit literatuur blijkt dat

detectie van zeer lage dosissen (0-10mGy) mogelijk is via deze test [13, 16, 43]. Een goede

immunohistochemische aankleuring is dan ook belangrijk aangezien aspecifieke binding en

achtergrondkleuring kan zorgen voor een overschatting van de effecten.

In dit onderzoek werd via de geoptimaliseerde foci test in de eerste plaats de RBE nagegaan

van 30kV X-stralen ten opzichte van 60Co γ-stralen. In de tweede plaats was een optimale

γH2AX kleuring belangrijk om het effect van 4mGy na te gaan. Ten derde werd het verschil in

repair van DSB tussen mutatiedragers en niet-mutatiedragers nagegaan.

4.1 Materiaal

Voor het uitvoeren van deze studie werd gebruik gemaakt van gezond restweefsel afkomstig

van vrouwen zonder mutatie (borstreducties), met een BRCA1/2 mutatie, met een genetische

predispositie of vrouwelijke borstkankerpatiënten (mastectomiëen). Weefsel bekomen van een

mastectomie bij vrouwen met borstkanker bevatte geen tumorweefsel maar enkel gezond

klierweefsel.

Uit het verkregen borstweefsel werd fibroglandulair weefsel geïsoleerd uit het omgevend

vetweefsel en versneden in stukjes van 2mm laagdikte. Deze 2mm weefselstukjes werden

gebruikt voor in vitro bestraling. Of deze weefselstukjes klierweefsel bevatten is op voorhand

niet geweten. Elk weefselstukje werd bestraald met een verschillende dosis. Bij een volledige

setup bij een gezonde donor werd voor inductie van de DSB met 6 dosispunten (0, 4, 10, 40,

100 en 500mGy) gewerkt en voor repair met 4 dosispunten (0, 4, 40 en 500mGy). Dit werd

uitgevoerd voor zowel 60Co γ-stralen als 30kV X-stralen waardoor in totaal minstens 20 2mm

dikke weefselstukjes nodig waren van 1 staal. Om te beperken dat te veel dosispunten zouden

wegvallen ten gevolge van afwezigheid van klierweefsel in de 2mm weefselstukjes werd voor

elke dosis en/of stralingskwaliteit indien mogelijk een A en een B stukje bestraald (dus in totaal

40 weefselstukjes).

41

Voor een patiënt met familiale belasting werd gewerkt met 4 dosispunten (0, 4, 40 en 500mGy)

zowel voor inductie als repair van de DSB en waren dus 16 dosispunten nodig voor een

volledige set up.

Vooraleer vervolgens de foci test uit te voeren, werd eerst een HE kleuring uitgevoerd om na

te gaan of de coupes voldoende klierweefsel bevatten (fig. 9). In de literatuur zijn nog geen

methoden beschreven om op voorhand na te gaan of klierweefsel aanwezig is in het

bindweefsel. Het op voorhand weten of klierweefsel aanwezig is, zou een belangrijke

vooruitgang betekenen in dit onderzoek. In eerder gelijkaardig onderzoek deed dit probleem

zich niet voor omdat deze onderzoeken uitgevoerd werden op lymfocyten [4] of borstepitheel

cellijnen [5, 13].

Een belangrijke reden waarom heel wat weefselstukjes in ons onderzoek geen klierbuizen

bevatten, was omdat veel borstweefsel verkregen werd van oudere patiënten. Stalen van oudere

patiënten bevatten minder klierweefsel en meer vetweefsel, dit ten gevolge van de gedaalde

oestrogeen- en progesteronproductie waardoor de TDLU’s atrofiëren en involueren [9]. Tevens

gingen sommige stalen verloren omdat, ondanks de aanwezigheid van klierweefsel, geen mooie

γH2AX immunohistochemische kleuring kon uitgevoerd worden. De reden hiervoor is

onduidelijk maar lijkt weefselafhankelijk te zijn.

4.2 γH2AX foci test

De γH2AX foci test werd in deze studie gebruikt om stralingsgeïnduceerde DSB te detecteren

in borstweefsel. Een optimalisatie van deze test op borstweefsel was dan ook belangrijk. Er

werd gekeken naar zeer lage dosissen en aldus zeer kleine verschillen in aantal foci/cel. Met

het voorheen gebruikte γH2AX immunohistochemische kleuringsprotocol werd nog te veel

achtergrondkleuring waargenomen en bepaalde delen in de coupes kleurden vaak niet aan. Er

werden verschillende protocols getest. 1 van de belangrijkste verschillen met het vorige

protocol is het toepassen van AR.

Fixatie in PFA en inbedding in paraffine zorgt voor het behoud van een goede morfologie van

het weefsel maar resulteert in het maskeren van de antigen epitopen [48]. In literatuur is

beschreven dat het antigen verval afhankelijk is van de tijdsduur waarmee weefsel ingebed is

en de temperatuur en lichtintensiteit waarbij het weefsel bewaard wordt. Weefsel dat gedurende

beperkte tijd ingebed en koud (4°C) en donker bewaard werd, vertoont het minst antigen verval.

Antigenen die reductie vertonen zijn voornamelijk nucleair of membranair en het verval is ook

antigen-afhankelijk [49, 50].

42

Een methode om de epitopen terug beschikbaar te maken voor binding met een AL is AR. AR

is een voorbehandeling met warmte waardoor de cross-links tussen de eiwitten in het weefsel

gevormd door het fixatief deels verbroken worden waardoor meer epitopen terug beschikbaar

worden. Op deze manier kon in dit onderzoek vermeden worden dat bepaalde klierbuizen niet

aankleurden en konden de γH2AX foci optimaal worden gedetecteerd [48-50].

De meeste studies die gebruik maken van een γH2AX foci test maken gebruik van celpreparaten

en kleuren de foci aan met een fluorescente immunohistochemische kleuring [4, 5, 13]. Deze

fluorescente immunohistochemische kleuring wordt echter minder gebruikt op weefselcoupes

aangezien het resulteert in een minder goede visualisatie van de weefselstructuren en er ook

vaak autofluorescentie van het weefsel kan optreden. Verder heeft de immuno-enzymatische

kleuring die werd toegepast in deze studie het voordeel dat er zich geen fading voordoet. Bij

fluorescente kleuringen vervaagt het signaal met tijd. Zo is er met de immuno-enzymatische

kleuring de mogelijkheid de preparaten te bewaren voor verder onderzoek en ze eventueel te

laten tellen door een 2e persoon [48].

Zoals eerder vermeld was een optimale kleuring cruciaal omdat gewerkt wordt met zeer lage

dosissen en er dus een zeer klein verschil in aantal foci moet worden gedetecteerd. Daarnaast

was een uniforme telling ook van groot belang. Het probleem bleef echter dat bepaalde stalen,

ondanks een goed uitgevoerde immunohistochemische kleuring, geen mooi resultaat gaven, dit

ten gevolge van een slechte morfologie of te veel achtergrondkleuring. De variatie in kwaliteit

tussen stalen kan het gevolg zijn van zowel patiënt gerelateerde factoren (bv. ouderdom,

hormooninname, menstruele cyclus… [9]) als onderzoek gerelateerde factoren (bv. te lang

zonder medium staan bij het doorwerken van stalen).

Per coupe werden γH2AX foci manueel geteld in 400 luminale cellen met behulp van een

lichtmicroscoop. Deze cellen waren verspreid over minstens 4 verschillende klierbuizen of

klierbuisgroepen en verdeeld over 2 coupes op eenzelfde preparaat. De stalen werden door 1 of

2 scorers geteld. Andere onderzoeken zoals van Depuydt et al. en Colin et al. scoorden

respectievelijk 100 lymfocyten per slide en 60 borstepitheel cellen per slide [4, 13]. In beide

studies verliepen de tellingen manueel met een fluorescentiemicroscoop. Hernandez et al.

maakte gebruik van een automatische scoring via flowcytometrie [5].

4.3 Dosis-respons curve

Aan de hand van de dosis-respons curve (0-500mGy) konden we nagaan wat de biologische

effecten zijn in dit dosisgebied van 30kV X-stralen ten opzichte van 60Co γ-stralen op het

humaan borstweefsel.

43

Aangezien DNA een cruciaal doelwit is voor IR, werd het biologisch effect op dit niveau

onderzocht. DSB zijn hierbij de meest toxische schade geïnduceerd door IR. Het aantal DSB

werd nagegaan door kwantificering van de γH2AX foci na 30’. Eerder onderzoek toonde aan

dat de γH2AX foci test een gevoelige methode is voor het detecteren van DSB bij lage dosissen

[13, 42].

Gezien het aantal verkregen stalen met voldoende klierweefsel in dit onderzoek beperkt was,

werden de data van mutatiedragers en niet-mutatiedragers samen genomen om de dosis-respons

curve op te stellen. Er wordt immers geen verschil in aantal geïnduceerde foci verwacht tussen

mutatiedragers en niet-mutatiedragers na 30’. Er werd gekozen voor een post-bestralingstijd

van 30’ aangezien in vitro studies aantoonden dat een maximaal aantal γH2AX foci aanwezig

zijn tussen de 15-30’ na bestraling. Deze foci bereiken dan ook hun maximale grootte [51, 52].

De data uit dit onderzoek toonden aan dat de γH2AX dosis-respons curve voor 30kV X-stralen

iets hoger ligt dan die voor 60Co γ-stralen. Een hogere dosis-respons voor 30kV X-stralen komt

overeen met het feit dat 30kV X-stralen een lagere energie hebben dan 60Co γ-stralen en dus

een hogere LET hebben dan deze laatste. Door deze hogere LET kunnen 30kV X-stralen meer

en complexere DNA schade induceren [4, 44].

Uit de dosis-respons curve (0-500mGy) van dit onderzoek werd een RBE van 1,1 bepaald. De

RBE geeft de relatieve effectiviteit weer in het induceren van DNA-DSB van 30kV X-stralen

ten opzichte van 60Co γ-stralen. De bekomen RBE is hoger dan de RBE van 1 die wordt

aangenomen door de ICRP voor alle lage LET X-stralen in het kader van risico inschatting,

maar lager dan andere recente onderzoeken rond risico inschatting van mammografie X-stralen

[4, 44, 45]. Het onderzoek van Depuydt et al. gebeurde op lymfocyten en beschreef een RBE

van 1,4 voor de dose range 0-500mGy met de γH2AX foci test en een RBE tussen de 3 en 4

voor de dose range 0-2000mGy met de micronucleus (MN) test [4].

De reviews van Heyes et al. en Hill et al. beschreven een onderschatting van een RBE met een

factor 4 [12, 44]. Een review van Hunter et al. sprak over een onderschatting van een factor 3-

4 [45]. Deze RBE’s werden bepaald aan de hand van MN testen en dicentrische chromosoom

aberratie testen in humane lymfocyten. De MN test en dicentrische chromosoom aberratie test

zijn cytogenetische testen waarbij gekeken wordt naar residuele schade na herstel en niet naar

de inductie van DSB zoals bij de γH2AX foci test.

Een vorige masterproef zag geen verschil in RBE in het dosis gebied 0-100mGy. In het dosis

gebied 0-10mGy werd een RBE van 2,34 bekomen maar deze RBE is gebaseerd op een klein

aantal stalen. Bij een toename van de RBE van 1 naar 4 liggen de risico’s voor mammografie

screening voor gezonde vrouwen tussen 50 en 70 jaar nog binnen aanvaardbare grenzen.

44

Dit is echter niet meer het geval voor screening onder de leeftijd van 40 en voor vrouwen met

een genetische susceptibiliteit door de aanwezigheid van een BRCA mutatie [12].

In het lage dosis gebied (0-40mGy, fig. 15) was te zien dat de gemiddelde foci waarden voor 4

en 10 mGy boven de lineaire dosis-respons curven (0-500mGy) van 60Co γ-stralen en 30kV X-

stralen lagen. Na de verhoogde respons bij 4mGy zag je een afvlakking van de respons bij

hogere dosissen van 30kV X-stralen, bij 60Co γ-stralen kwam de afvlakking na 10mGy (fig.

15).

In vele onderzoeken wordt dit verklaard door het bystander effect (zie 1.4 en fig. 9). Ojima et

al. (2008) testte de hypothese of DSB geïnduceerd door lage dosissen vooral het gevolg zijn

van het bystander effect. De studie gebeurde op humane fibroblastcellen die bestraald werden

met een dosis tussen de 1,2 en 200mGy. De inductie van DSB vertoonde een supra-lineaire

dosis respons maar door het toevoegen van lindaan (inhibitor voor intracellulaire gap juncties)

verdween de supra-lineariteit wat impliceerde dat het bystander effect de oorzaak was voor deze

supra-lineariteit [53]. In een recentere studie beschrijft Ojima et al. (2011) dat bystander

geïnduceerde DSB persistenter bleven bestaan dan DSB geïnduceerd door directe

stralingseffecten [54]. Nuta et al. spreekt deze studie tegen. Dit onderzoek gebeurde op huid

fibroblastcellen en verklaarde dat de bystander geïnduceerde DSB niet geprononceerd genoeg

waren om de relatie tussen het bystander effect en de lage-dosis hypersensitiviteit te verklaren.

Dit experiment stelde dat de lage-dosis hypersensitiviteit gerelateerd is aan bystander factor

geïnduceerde cel inactivatie [55].

4.4 Lage dosis-effecten

Bij mammografie screening wordt een patiënt blootgesteld aan een MGD van 4mGy. In het

kader van de risico-inschatting van deze screening werd in deze studie gekeken of een

significant lage dosis effect kan vastgesteld worden bij 4mGy. Er werd gekeken naar het

verschil in inductie van γH2AX foci tussen 0 en 4mGy 30kV X-stralen.

De resultaten toonden een significant verschil aan (P=0,03) van het gemiddeld aantal

geïnduceerde γH2AX foci tussen 0 en 4mGy 30kV X-stralen (fig. 16). Tussen 4 en 10mGy was

dit verschil niet meer significant. Deze verhoogde respons kan mogelijks verklaard worden door

het bystander effect, beschreven in 4.3.

In de studie van Colin et al. werd inductie van DSB bij 28kV X-stralen in de exacte condities

van mammografie bestralingsprocedures onderzocht in primaire borstepitheel cellen. Met

45

behulp van de γH2AX foci test kon een significant dosis effect geobserveerd worden bij een

single dose van 4mGy en bij een repeated dose van 2+2mGy zoals gebruikt bij een two-view

mammografie [13]. In de studie van Depuydt et al. op lymfocyten zijn deze lage dosis effecten

slechts waarneembaar vanaf 10mGy [4]. De lagere dosis detectie threshold van 4mGy

gevonden in deze studie en in de studie van Colin et al. in vergelijking met de studie van

Depuydt et al. kan het gevolg zijn van verschillen in het γH2AX foci protocol of het gevolg

zijn van een hogere gevoeligheid van borstklierweefsel en borstepitheel cellen in vergelijking

met lymfocyten.

4.5 Repair van DSB

De γH2AX foci test werd ook gebruikt om het herstel van DSB na te gaan en om het verschil

in repair tussen gezonde patiënten en BRCA1/2 mutatiedragers na te gaan. Eens de DSB

hersteld is, wordt het γH2AX histoneiwit gedefosforyleerd en verdwijnt de focus.

In dit onderzoek werd de repair bekeken voor de dosissen 0, 4, 40 en 500mGy. Hiervoor werden

de stalen na bestraling 30’ of 24h geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2.

Voor elke dosis behalve voor 0mGy werd herstel geobserveerd na 24h incubatie, zowel voor

30kV X-stralen als 60Co γ-stralen (fig. 17 en 18). Het feit dat er meer foci aanwezig zijn na 24h

in het niet bestraalde staal kan te maken hebben met de langere in vitro incubatie van de

weefselstalen. In literatuur wordt beschreven dat de aanwezigheid van spontane γH2AX foci

beïnvloed wordt door oxidatieve stress en omgeving/occupationele stress [13].

In deze studie werd het aantal geïnduceerde γH2AX foci voor 4 en 40mGy na 24h gereduceerd

tot de achtergrondwaarde, zowel voor 60Co γ-stralen als 30kV X-stralen. Dit was niet het geval

voor 500mGy 60Co γ-stralen en 30 kV X-stralen, waar het aantal γH2AX foci na 24h hoger

blijft dan de achtergrondwaarde. Voor 30kV X-stralen werd een significant verschil

geobserveerd voor het aantal residuele γH2AX foci na 24h tussen 40mGy en 500mGy. Hierbij

werden data van mutatiedragers en niet-mutatiedragers samengenomen zodat statistische

analyse kon uitgevoerd worden. Het verschil in residuele aantal γH2AX foci tussen 0 en 4mGy

en tussen 0 en 40mGy is niet significant.

Preliminaire resultaten uit deze studie komen niet overeen met Depuydt et al. en Beels et al.

Depuydt et al. beschrijft dat 30kV X-stralen zorgen voor meer geclusterde DNA schade dan

60Co γ-stralen en dus moeilijker hersteld wordt. Dit heeft tot gevolg dat er meer residuele foci

verwacht worden bij 30kV X-stralen dan bij 60Co γ-stralen na 24h [4]. Dit fenomeen werd niet

geobserveerd in deze studie waar het aantal residuele foci vergelijkbaar is voor 60Co γ-stralen

46

en 30kV X-stralen. Beels et al. onderzocht repair kinetiek in bloedstalen en T-lymfocyten tot

24h na bestraling bij de dosissen 5 en 200 mGy 100kV X-stralen en 60Co γ-stralen. In deze

studie werd vertraagd herstel geobserveerd na bestraling van bloedstalen met 100kV X-stralen

(5 en 200mGy) met 40% van de geïnduceerde foci die nog steeds aanwezig waren 24h na

bestraling. Voor geïsoleerde T-lymfocyten bestraald met 200mGy 100kV X-stralen was het

aantal geïnduceerde foci gereduceerd tot 10% 24h na bestraling. In tegenstelling hiermee

werden geïnduceerde foci volledig gereduceerd naar de achtergrondwaarde 24h na bestraling

met 200mGy 60Co γ-stralen. Beels et al. concludeerde hieruit dat er 2 types DSB bestaan. Het

1e type heeft een gereduceerde herstel capaciteit afhankelijk van de stralingskwaliteit en is

mogelijks gerelateerd aan het bystander effect. Het 2e type DSB vertoont herstel met een

halfleven van 3-4h [43].

Resultaten uit deze studie komen ook niet overeen met de resultaten van Löbrich et al. en

Rothkamm et al. waarin beschreven wordt dat DSB herstel minder efficiënt verloopt bij lage

dosissen dan bij hoge [56, 57]. Löbrich et al. nam een verschil in herstel waar wanneer

lymfocyten in vitro werden bestraald met dosissen van 5 en 500mGy 90kV X-stralen. Hieruit

bleek dat het aantal stralingsgeïnduceerde γH2AX foci na 24h voor respectievelijk 50% en 90%

waren hersteld. Dit was echter niet het geval voor de in vivo situatie waar 24h na bestraling het

aantal γH2AX foci gereduceerd waren naar hun achtergrondwaarde voor zowel 5 als 500mGy

X-stralen [56]. Rothkamm et al. onderzochten in vitro het effect van 1-2000 mGy 90kV X-

stralen op onder andere de MRC-5 cellijn. In deze studie werd vastgesteld dat het herstel van

DSB minder efficiënt verliep bij lage dosissen (1,2-5mGy) of zelfs uitbleef bij dosissen lager

dan 1,2mGy na 24h, in tegenstelling tot de efficiënte repair bij hogere dosissen (20-2000mGy),

waarbij het aantal stralingsgeïnduceerde foci naar de achtergrondwaarden reduceerden [57].

Naast herstel in het algemeen werd in deze studie ook onderzocht of er een verschil was in

herstel tussen BRCA1/2 mutatiedragers en niet-mutatiedragers. BRCA1 en 2 zijn genen die

betrokken zijn bij DNA herstel en signaleringsprocessen [58]. Er werd dus verwacht dat

patiënten met een BRCA1/2 mutatie minder efficiënt DSB zouden herstellen en dus een hoger

aantal residueel γH2AX foci zouden hebben na 24h. Uit de data werd geen eenzijdige trend

geobserveerd en er kon ook geen statistische analyse uitgevoerd worden wegens de beperkte

data.

Fig. 17 toont dat voor 0mGy 60Co γ-stralen en 30kV X-stralen bij mutatiedragers een hoger

aantal γH2AX foci aanwezig zijn na 24h dan bij niet-mutatiedragers. Deze data komen overeen

met de studie van Colin et al.

47

Deze studie beschrijft dat de aanwezigheid van spontane γH2AX foci het gevolg zijn van

genoom instabiliteit en/of residuele DSB ten gevolge van individuele gevoeligheid aan

oxidatieve stress, omgeving en/of occupationele stress en/of radiologische geschiedenis. Colin

et al. toonde aan dat het aantal spontane γH2AX foci/cel significant hoger was in high risk

patiënten dan in low risk patiënten [13].

Beucher et al. voerde een γH2AX foci test uit op G0, G1 en G2 wild type en heterozygote

BRCA1 of BRCA2 gemuteerde fibroblasten. De γH2AX foci testen in G0, G1 en G2 cellen

vertoonden geen herstel defecten in heterozygote BRCA1 gemuteerde cellen. Hieruit kan

geconcludeerd worden dat de overgebleven hoeveelheid normale BRCA1 voldoende is voor

herstel in deze fasen. Hetzelfde geldt voor heterozygote BRCA2 gemuteerde cellen behalve in

G2 cellen waar een gereduceerde herstel capaciteit werd geobserveerd. Dit kan verklaard

worden door het gen dosage effect in de G2 fase [59].

Het verschil in resultaten tussen deze studie en andere studies kan te wijten zijn aan het gebruik

van andere dosissen, stralingskwaliteiten, celtypes, cellijnen en methoden. Een grotere studie

met meer stalen is nodig om significante data te bekomen.

In de toekomst kan de γH2AX immunohistochemische kleuring verder geoptimaliseerd worden

door gebruik te maken van een dubbelkleuring waarbij zowel p53-binding protein 1 (53BP1)

als γH2AX aangekleurd worden. 53BP1 is een eiwit die ook zeer snel gerekruteerd wordt naar

een DSB bij herstel [60]. Hierbij mogen enkel de foci gescoord worden die positief zijn voor

beide AL’en.

5. Conclusie

De γH2AX foci test is een goede test voor het inschatten van het aantal geïnduceerde DSB door

IR en dus voor het inschatten van het kanker risico voor mammografie X-stralen. Aan de hand

van een dosis-respons curve (0-500mGy) werd een RBE van 1,1 bekomen. Verder kon een

significant lage dosis effect geobserveerd worden bij 4mGy. Deze resultaten bevestigen recente

literatuur die spreken over een onderschatting van de risico’s van mammografie X-stralen die

gebaseerd zijn op een RBE van 1 (ICRP). Er werd herstel van DSB geobserveerd 24h na

bestraling maar er kon geen duidelijk verschil worden waargenomen tussen 60Co γ-stralen en

30kV X-stralen. Gezien het beperkt aantal stalen kon geen significantie berekend worden. Na

24h werd het aantal geïnduceerde foci gereduceerd tot hun achtergrondwaarde behalve voor

500mGy. Verdere studies met meer stalen zijn nodig om significante resultaten te bekomen.

48

6. Referenties

1. Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, et al. Cancer incidence and mortality

worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer.

2015; 136: E359-86.

2. Lim ST, Yu JH, Park HK, Moon BI, Ko BK, Suh YJ. A comparison of the clinical outcomes of patients

with invasive lobular carcinoma and invasive ductal carcinoma of the breast according to molecular

subtype in a Korean population. World Journal of Surgical Oncology. 2014; 12: 56.

3. Broeders M, Moss S, Nystrom L, Njor S, Jonsson H, Paap E, et al. The impact of mammographic

screening on breast cancer mortality in Europe: a review of observational studies. Journal of Medical

Screening. 2012; 19 Suppl 1: 14-25.

4. Depuydt J, Baert A, Vandersickel V, Thierens H, Vral A. Relative biological effectiveness of

mammography X-rays at the level of DNA and chromosomes in lymphocytes. International journal of

radiation biology. 2013; 89: 532-8.

5. Hernandez L, Terradas M, Martin M, Feijoo P, Soler D, Tusell L, et al. Increased mammogram-induced

DNA damage in mammary epithelial cells aged in vitro. PLoS One. 2013; 8: e63052.

6. Moss SM, Nystrom L, Jonsson H, Paci E, Lynge E, Njor S, et al. The impact of mammographic screening

on breast cancer mortality in Europe: a review of trend studies. Journal of Medical Screening. 2012; 19

Suppl 1: 26-32.

7. Njor S, Nystrom L, Moss S, Paci E, Broeders M, Segnan N, et al. Breast cancer mortality in

mammographic screening in Europe: a review of incidence-based mortality studies. Journal of Medical

Screening. 2012; 19 Suppl 1: 33-41.

8. Corbex M, Bouzbid S, Boffetta P. Features of breast cancer in developing countries, examples from

North-Africa. European Journal of Cancer. 2014; 50: 1808-18.

9. Young B LJ SA, Heath JW. Wheater's Functional Histology: A Text and Colour Atlas. Elsevier Health

Sciences. 2006.

10. http://www.webmd.com/women/picture-of-the-breasts.

11. Verleye L, Desomer A, Gailly J, Robays J. Borstkankerscreening: hoe vrouwen met een verhoogd risico

identificeren - welke beeldvorming gebruiken? Good Clinical Practice (GCP). Brussel: Federaal

Kenniscentrum voor de Gezondheidszorg (KCE). 2011. KCE Reports 172A. D/2011/10.273/90.

12. Heyes GJ, Mill AJ, Charles MW. Mammography-oncogenecity at low doses. Journal of radiological

protection. 2009; 29: A123-A32.

13. Colin C, Devic C, Noel A, Rabilloud M, Zabot MT, Pinet-Isaac S, et al. DNA double-strand breaks

induced by mammographic screening procedures in human mammary epithelial cells. International

journal of radiation biology. 2011; 87: 1103-12.

14. Bluekens AM, Holland R, Karssemeijer N, Broeders MJ, den Heeten GJ. Comparison of digital screening

mammography and screen-film mammography in the early detection of clinically relevant cancers: a

multicenter study. Radiology. 2012; 265: 707-14.

15. Freimanis RI, Yacobozzi M. Breast cancer screening. North Carolina Medical Journal. 2014; 75: 117-20.

16. Schwab SA, Brand M, Schlude IK, Wuest W, Meier-Meitinger M, Distel L, et al. X-Ray Induced

Formation of gamma-H2AX Foci after Full-Field Digital Mammography and Digital Breast-

Tomosynthesis. Plos One. 2013; 8.

17. Health Quality O. Cancer screening with digital mammography for women at average risk for breast

cancer, magnetic resonance imaging (MRI) for women at high risk: an evidence-based analysis. Ontario

Health Technology Assessment Series. 2010; 10: 1-55.

18. Wang AT, Vachon CM, Brandt KR, Ghosh K. Breast density and breast cancer risk: a practical review.

Mayo Clinic Proceedings. 2014; 89: 548-57.

19. http://www.gezondheid.be/index.cfm?fuseaction=art&art_id=15603.

20. Houssami N, Macaskill P, Bernardi D, Caumo F, Pellegrini M, Brunelli S, et al. Breast screening using

2D-mammography or integrating digital breast tomosynthesis (3D-mammography) for single-reading or

double-reading - Evidence to guide future screening strategies. European Journal of Cancer. 2014; 50:

1799-807.

21. Coldman A, Phillips N. Incidence of breast cancer and estimates of overdiagnosis after the initiation of a

population-based mammography screening program. Canadian Medical Association Journal. 2013; 185:

E492-8.

22. Bracke M LF VP, Vanderkerken K. Kanker, biomedisch bekeken. Standaard uitgeverij professional.

2013.

23. Tubiana M, Dutreix J, Wambersie A. Introduction to radiobiology. Taylor & Francis: London ; New

York; 1990. p. 371 p.

24. http://www.radiation-scott.org/radsource/3-0.htm.

http://www.webmd.com/women/picture-of-the-breasts

http://www.gezondheid.be/index.cfm?fuseaction=art&art_id=15603

http://www.radiation-scott.org/radsource/3-0.htm

49

25. Eot-Houllier G, Eon-Marchais S, Gasparutto D, Sage E. Processing of a complex multiply damaged DNA

site by human cell extracts and purified repair proteins. Nucleic Acids Research. 2005; 33: 260-71.

26. Scully R, Xie A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutation research. 2013; 750:

5-14.

27. Belov OV, Krasavin EA, Lyashko MS, Batmunkh M, Sweilam NH. A quantitative model of the major

pathways for radiation-induced DNA double-strand break repair. Journal of Theoretical Biology. 2015;

366: 115-30.

28. Tomita M, Maeda M. Mechanisms and biological importance of photon-induced bystander responses: do

they have an impact on low-dose radiation responses. Journal of Radiation Research. 2014; 56: 205-19.

29. Kavanagh JN, Redmond KM, Schettino G, Prise KM. DNA double strand break repair: a radiation

perspective. Antioxidants & Redox Signaling. 2013; 18: 2458-72.

30. Brandsma I, Gent DC. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing

act. Genome Integrity. 2012; 3: 9.

31. Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nature

genetics. 2001; 27: 247-54.

32. Giglia-Mari G, Zotter A, Vermeulen W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in

Biology. 2011; 3: a000745.

33. http://members.home.nl/larsbosboom/celcyclus.htm.

34. Zhiyong M, Ying J, Xiang L, Andrei S, Vera G. DNA repair by homologous recombination, but not by

nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 2009; 11: 683-91.

35. Mehta A, Haber JE. Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair.

Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2014; 6: a016428.

36. O'Donovan PJ, Livingston DM. BRCA1 and BRCA2: breast/ovarian cancer susceptibility gene products

and participants in DNA double-strand break repair. Carcinogenesis. 2010; 31: 961-7.

37. Wang J, Pluth JM, Cooper PK, Cowan MJ, Chen DJ, Yannone SM. Artemis deficiency confers a DNA

double-strand break repair defect and Artemis phosphorylation status is altered by DNA damage and cell

cycle progression. DNA Repair (Amst). 2005; 4: 556-70.

38. Baeyens A, Thierens H, Claes K, Poppe B, Messiaen L, De Ridder L, et al. Chromosomal radiosensitivity

in breast cancer patients with a known or putative genetic predisposition. British journal of cancer. 2002;

87: 1379-85.

39. www.nature.com.

40. Brandsma I, Gent DC. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing

act. Genome Integr. 2012; 3: 9.

41. Banerjee T, Chakravarti D. A peek into the complex realm of histone phosphorylation. Molecular and

Cell Biology. 2011; 31: 4858-73.

42. Redon CE, Nakamura AJ, Martin OA, Parekh PR, Weyemi US, Bonner WM. Recent developments in

the use of gamma-H2AX as a quantitative DNA double-strand break biomarker. Aging (Albany NY).

2011; 3: 168-74.

43. Beels L, Werbrouck J, Thierens H. Dose response and repair kinetics of gamma-H2AX foci induced by

in vitro irradiation of whole blood and T-lymphocytes with X- and gamma-radiation. International Journal

of Radiation Biology. 2010; 86: 760-8.

44. Hill MA. The variation in biological effectiveness of X-rays and gamma rays with energy. Radiation

Protection Dosimetry. 2004; 112: 471-81.

45. Hunter N, Muirhead CR. Review of relative biological effectiveness dependence on linear energy transfer

for low-LET radiations. Journal of Radiological Protection. 2009; 29: 5-21.

46. Leenhouts HP, Chadwick KH. Dose-effect relationships, epidemiological analysis and the derivation of

low dose risk. Journal of Radiological Protection. 2011; 31: 95-105.

47. Brenner DJ, Doll R, Goodhead DT, Hall EJ, Land CE, Little JB, et al. Cancer risks attributable to low

doses of ionizing radiation: assessing what we really know. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America. 2003; 100: 13761-6.

48. Kumar LG ZME. Immunohistochemical (IHC) Staining Methods. Dako North America, California. 2009:

172.

49. Grillo F, Pigozzi S, Ceriolo P, Calamaro P, Fiocca R, Mastracci L. Factors affecting immunoreactivity in

long-term storage of formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Histochemistry and Cell Biology.

2015.

50. Ramos-Vara JA, Webster JD, DuSold D, Miller MA. Immunohistochemical evaluation of the effects of

paraffin section storage on biomarker stability. Vet Pathol. 2014; 51: 102-9.

51. Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Ivanova VS, Bonner WM. DNA double-stranded breaks induce histone

H2AX phosphorylation on serine 139. The Journal of Biological Chemistry. 1998; 273: 5858-68.

52. Sedelnikova OA, Pilch DR, Redon C, Bonner WM. Histone H2AX in DNA damage and repair. Cancer

Biology & Therapy. 2003; 2: 233-5.

http://members.home.nl/larsbosboom/celcyclus.htm

http://www.nature.com/

50

53. Ojima M, Ban N, Kai M. DNA double-strand breaks induced by very low X-ray doses are largely due to

bystander effects. Radiation Research. 2008; 170: 365-71.

54. Ojima M, Furutani A, Ban N, Kai M. Persistence of DNA double-strand breaks in normal human cells

induced by radiation-induced bystander effect. Radiation Research. 2011; 175: 90-6.

55. Nuta O, Darroudi F. The impact of the bystander effect on the low-dose hypersensitivity phenomenon.

Radiation and Environmental Biophysics. 2008; 47: 265-74.

56. Lobrich M, Rief N, Kuhne M, Heckmann M, Fleckenstein J, Rube C, et al. In vivo formation and repair

of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;

102: 8984-9.

57. Rothkamm K, Lobrich M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed

to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100: 5057-62.

58. Baeyens A, Thierens H, Claes K, Poppe B, de Ridder L, Vral A. Chromosomal radiosensitivity in BRCA1

and BRCA2 mutation carriers. International journal of radiation biology. 2004; 80: 745-56.

59. Beucher A, Deckbar D, Schumann E, Krempler A, Frankenberg-Schwager M, Lobrich M. Elevated

radiation-induced gammaH2AX foci in G2 phase heterozygous BRCA2 fibroblasts. Radiother Oncol.

2011; 101: 46-50.

60. Panier S, Boulton SJ. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;

15: 7-18.

7. Bijlage

Bijlage 1: Protocol manuele inbedding in paraffine.

Producten Firma Catalogusnummer Tijd

Disolol® 30% Chem-lab

(Zedelgem, België)

CL00.1807.2500 1h

Disolol® 50% Chem-lab CL00.1807.2500 1h

Disolol® 70% Chem-lab CL00.1807.2500 1h

Gedenatureerde alcohol (alcohol 96%) Chem-lab CL00.1807.2500 1h

Isopropyl alcohol Chem-lab CL00.0901.5000 1h

Isopropyl alcohol/toluol (1/1) Chem-lab CL00.0901.5000/CL00.2001.50

00

1h

Toluol Chem-lab CL00.2001.5000 30’

Bijlage 2: Protocol HE kleuring van het kleurtoestel Microm HMS 740.

Bad nummer Producten Tijd

Bad 1 tolueen 5’

Bad2 tolueen 5’

Bad3 tolueen 5’

Bad4 Isopropanol 2’

Bad5 Isopropanol 2’

Bad6 alcohol 96% 2’


Bad29 Leidingwater 2’

Bad19 AD 1’

Bad15 haematox. 15”

Bad29 Leidingwater 2’

Bad16 clarifier I 1’

Bad29 leidingwater 1’

Bad17 bluing reagent 1’


Bad19 AD 1’

Bad18 eosine+phloxine 30”




Bad22 isopropanol 2’


Bad9 Tolueen 2’

Bad23 Tolueen 2’

Bad38 Tolueen 1’

Bijlage 3: Protocol deparaffinering van het kleurtoestel Microm HMS 740. Bad nummer Producten Tijd

Bad 1 tolueen 5’

Bad2 tolueen 5’

Bad3 tolueen 5’






Bad19 AD 1’

Bad40 AD 1’

Bijlage 4: Protocol ontwateren van het kleurtoestel Microm HMS 740.

Bad nummer Producten Tijd

Bad 20 Alcohol 96% 2’

Bad 21 Alcohol 96% 2’

Bad 22 Isoprpanol 2’

Bad 8 Isopropanol 2’

Bad 9 Tolueen 2’

Bad 23 Tolueen 2’

Bad 38 Tolueen 1’

Bijlage 5: verschillende γH2AX immuno-enzymatische testkleuringen. Vergroting 60X, schaal-10µm. 1:

testkleuringen met AL opgewekt in konijn; 1A.: overnacht incubatie, verdunning 1/2500 met NiCl2; 1B.: overnacht

incubatie, verdunning 1/5000 met NiCl2; 1C.: overnacht incubatie, verdunning 1/2500 zonder NiCl2; 1D.:

overnacht incubatie, verdunning 1/5000 zonder NiCl2; 1E.: 2h incubatie, verdunning 1/1000 met NiCl2; 1F.: 2h

incubatie, verdunning 1/2000 met NiCl2; 1G.: 2h incubatie, verdunning 1/1000 zonder NiCl2; 1H.: 2h incubatie,

verdunning 1/2000 zonder NiCl2.

2: testkleuringen met AL opgewekt in muis; 2A.: overnacht incubatie, verdunning 1/500 met NiCl2; 2B.: overnacht

incubatie, verdunning 1/1000 met NiCl2; 2C.: overnacht incubatie, verdunning 1/500 zonder NiCl2; 2D.: overnacht

incubatie, verdunning 1/1000 zonder NiCl2; 2E.: 2h incubatie, verdunning 1/500 met NiCl2; 2F.: 2h incubatie,

verdunning 1/1000 met NiCl2; 2G.: 2h incubatie, verdunning 1/500 zonder NiCl2; 2H.: 2h incubatie, verdunning

1/1000 zonder NiCl2.

1A. 1B.

1C. 1D.

1E. 1F.

1G. 1H.

2A. 2B.

2C. 2D.

2E. 2F.

2G. 2H.

Inductie en herstel van DNA dubbelstrengbreuken (DSB) door ...

Documents

Transcript of Inductie en herstel van DNA dubbelstrengbreuken (DSB) door ...