IDENTIFICATIE VAN ANTIGENEN AANWEZIG IN...

Faculteit Farmaceutische Wetenschappen

Vakgroep Geneesmiddelenleer

Laboratorium voor Farmaceutische Biotechnologie

Academiejaar 2008 – 2009

IDENTIFICATIE VAN ANTIGENEN AANWEZIG IN

IMMUUNCOMPLEXEN BIJ

PATIËNTEN MET REUMATOÏDE ARTRITIS

Experimenteel onderzoek

Jolien DE NEVE

Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor

Prof. dr. apr. D. Deforce

Commissarissen

Prof. dr. apr. B. De Spiegeleer

Dr. apr. F. Van Nieuwerburgh

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen

van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”

2 juni 2009

de promotor, de auteur,

Prof. dr. apr. D. Deforce Jolien De Neve

DANKWOORD

Het leven is als een trein, bij elke halte in je leven stappen mensen op en stappen mensen af. Telkens

leer je nieuwe mensen kennen die horen bij die halte van je levensweg. Slechts enkelen zullen je

bijstaan bij alle haltes, slechts die enkelen blijven zitten tot je eindbestemming…

Ik had deze halte in mijn leven nooit kunnen bereiken zonder mijn promotor Prof. dr. apr. D. Deforce, die

zijn laboratorium gedurende het gehele onderzoek ter beschikking heeft gesteld. En zo deze hele

ervaring mogelijk heeft gemaakt!

Ook Katleen Van Steendam wil ik graag, als een van de belangrijkste passagiers, bedanken voor het

vertrouwen dat ze in mij heeft gesteld. Ze gaf me zelfvertrouwen, wat uiteindelijk resulteerde in

voldoening van mijn werk en van mezelf. Wat ik door haar heb bijgeleerd is veel grootser dan woorden

kunnen omschrijven.

Mijn oprechte dank gaat ook uit naar Kin- Jip die me hielp onthouden wat ik durfde vergeten, met wie ik

meningen kon delen en die me algemeen heeft gesteund.

Deze halte was ook voornamelijk sfeervol en dat heb ik te danken aan al mijn medestudenten Hanne,

Elien, Alexandra, Stefanie en Anne- Marie. En zeker ook aan Maarten, Marlies, Kelly, Trees, Mado,

Sandra en Filip. Bedankt allemaal voor de aangename en enthousiaste sfeer die elke dag in het labo

aanwezig was!

Tot slot wil ik graag nog enkele trouwe medereizigers van harte bedanken. Moeke en zus, het is jullie

steun die me recht houdt wanneer ik wankel sta. Bedankt ook va, Stefaan, Bart, grootouders en

vrienden voor jullie onvoorwaardelijke steun een aanmoedigingen!

Inhoudsopgave

Dankwoord

Inhoudsopgave

Lijst met gebruikte afkortingen

1. INLEIDING ..................................................................................................................................................................... 1

1.1. REUMATOÏDE ARTRITIS .................................................................................................................................................. 1 1.2. IMMUUNCOMPLEXEN ...................................................................................................................................................... 2 1.3. DE REUMAFACTOR ........................................................................................................................................................ 5 1.4. AUTOANTILICHAMEN TEGEN GECITRULLINEERDE PROTEÏNEN (ACPA’S) ............................................................................ 6 1.5. GECITRULLINEERDE EIWITTEN ........................................................................................................................................ 8

1.5.1. Gecitrullineerd Fibrinogeen .......................................................................................................................... 10 1.5.2. Gecitrullineerd Fibronectine ......................................................................................................................... 11 1.5.3. Gecitrullineerd Vimentine ............................................................................................................................. 13

2. OBJECTIEVEN ............................................................................................................................................................ 15

3. MATERIALEN EN METHODEN .................................................................................................................................. 17

3.1. IMMUNOPRECIPITATIE VAN SERUM MET PROTEÏNE G ...................................................................................................... 17 3.1.1. Principe .......................................................................................................................................................... 17 3.1.2. Materialen ....................................................................................................................................................... 17 3.1.3. Methode .......................................................................................................................................................... 17

3.2. IMMUNOPRECIPITATIE VAN SYNOVIAAL VOCHT MET PROTEÏNE G ..................................................................................... 18 3.2.1. Principe .......................................................................................................................................................... 18 3.2.2. Materialen ....................................................................................................................................................... 18 3.2.3. Methode .......................................................................................................................................................... 18

3.3. ACETONPRECIPITATIE (AP) .......................................................................................................................................... 18 3.3.1. Principe .......................................................................................................................................................... 18 3.3.2. Materialen ....................................................................................................................................................... 19 3.3.3. Methode .......................................................................................................................................................... 19

3.4. PROTEÏNEBEPALING: COOMASSIE ................................................................................................................................. 19 3.4.1. Principe .......................................................................................................................................................... 19 3.4.2. Materialen ....................................................................................................................................................... 20 3.4.3. Methode .......................................................................................................................................................... 20

3.5. SODIUMDODECYLSULFAAT POLYACRYLAMIDE GELELEKTROFORESE (SDS- PAGE) ......................................................... 21 3.5.1. Principe .......................................................................................................................................................... 21 3.5.2. 1D SDS PAGE ................................................................................................................................................ 21

3.5.2.1. Gieten van de gel ................................................................................................................................... 23 3.5.2.1.1. Materialen ..................................................................................................................................... 23 3.5.2.1.2. Methode ........................................................................................................................................ 23

3.5.2.2. Laden en lopen van de gel ..................................................................................................................... 24 3.5.2.2.1. Materialen ..................................................................................................................................... 24 3.5.2.2.2. Methode ........................................................................................................................................ 24

3.5.3. 2D SDS PAGE ................................................................................................................................................ 25 3.5.3.1. In sample rehydratatie van de IPG strips ............................................................................................... 25

3.5.3.1.1. Materialen ..................................................................................................................................... 26 3.5.3.1.2. Methoden ...................................................................................................................................... 26

3.5.3.2. Isoëlektrische focussing (IEF): 1e dimensie ........................................................................................... 27

3.5.3.2.1. Materialen ..................................................................................................................................... 27 3.5.3.2.2. Methode ........................................................................................................................................ 27

3.5.3.3. SDS- PAGE: 2e dimensie ...................................................................................................................... 27 3.5.3.3.1. Materialen ..................................................................................................................................... 28 3.5.3.3.2. Methode ........................................................................................................................................ 29

3.6. SYPRO RUBY KLEURING ............................................................................................................................................... 29 3.6.1. Principe .......................................................................................................................................................... 29 3.6.2. Materialen ....................................................................................................................................................... 30 3.6.3. Methode .......................................................................................................................................................... 30

3.7. WESTERN BLOTTING .................................................................................................................................................... 31 3.7.1. Principe .......................................................................................................................................................... 31 3.7.2. Materialen ....................................................................................................................................................... 31 3.7.3. Methode .......................................................................................................................................................... 32

3.8. PONCEAU ................................................................................................................................................................... 32 3.8.1. Principe .......................................................................................................................................................... 32 3.8.2. Materialen ....................................................................................................................................................... 33 3.8.3. Methode .......................................................................................................................................................... 33

3.9. IMMUNODETECTIE........................................................................................................................................................ 33 3.9.1. Detectie met behulp van antilichamen: anti- fibrinogeen β kleuring, anti- fibrinogeen γ kleuring, anti-

vimentine kleuring, anti- fibronectine kleuring. .......................................................................................... 33 3.9.2. Materialen ....................................................................................................................................................... 34 3.9.3. Methode .......................................................................................................................................................... 35

3.10. AMC- KLEURING ......................................................................................................................................................... 35 3.10.1. Principe .......................................................................................................................................................... 35 3.10.2. Materialen ....................................................................................................................................................... 35 3.10.3. Methode .......................................................................................................................................................... 36

3.11. STRIPPING VAN EEN BLOT ............................................................................................................................................ 36 3.11.1. Principe .......................................................................................................................................................... 36 3.11.2. Materialen ....................................................................................................................................................... 37 3.11.3. Methode .......................................................................................................................................................... 37

4. RESULTATEN ............................................................................................................................................................. 38

4.1. VERGELIJKING VAN IC UIT RA SERUM VERSUS RA SF MET 1D SDS- PAGE ..................................................................... 38 4.2. VERGELIJKING VAN IC UIT SERUM VERSUS SF MET 2D SDS- PAGE: RA SF, RA SERUM EN GEZOND SERUM ..................... 39

4.2.1. SYPRO Ruby kleuring ................................................................................................................................... 40 4.2.2. Immunodetectie met anti- fibrinogeen β ..................................................................................................... 41 4.2.3. Immunodetectie met anti- fibrinogeen γ ..................................................................................................... 43 4.2.4. Immunodetectie met anti- fibronectine ....................................................................................................... 43 4.2.5. Immunodetectie met anti- vimentine ........................................................................................................... 45 4.2.6. AMC- kleuring ................................................................................................................................................ 45

4.3. REPRODUCEERBAARHEID IN SF ................................................................................................................................... 47 4.4. CONTROLE ASPECIFIEKE BINDING ................................................................................................................................. 47 4.5. VERGELIJKING TUSSEN INDIVIDUELE PATIËNTEN CCP - EN CCP + .................................................................................. 48

5. DISCUSSIE .................................................................................................................................................................. 50

6. CONCLUSIE ................................................................................................................................................................ 52

7. LITERATUURLIJST .................................................................................................................................................... 54

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

ACPA anticitrullinated peptide antibody

AFA anti- fillagrine autoantilichamen

AhFibA antihumaan fibrinogeen autoantilichamen

AKA antikeratine antilichamen

AL antilichaam

AMC anti- modified citrulline

Anti- SA antilichaam gericht tegen gecitrullineerd vimentine

AP acetonprecipitatie

APC’s antigenpresenterende cellen

APF anti- perinucleaire factor

APS ammoniumpersulfaat

Arg arginine

BSA bovine serum albumin

BME β- mercaptoethanol

CA carriër amfoliet

cAMP cyclisch adenosine monofosfaat

CAPS 3- (cyclohexylamino)- 1- propaan sulfonzuur

CCP cyclic citrullinated peptide

CD4+ cluster of differentiation 4+

CHAPS [(3- cholamido- propyl) dimethylammonia]- 1- propaansulfaat

Cit citrulline

DTT dithiothreitol

ECCa2+ extracellulaire calciumconcentratie

Fc region fragment crystallizable region

HLA human leukocyte antigen

HRP horseradish peroxidase

IAA iodoacetamide

IC immuuncomplex

ICCa2+ intracellulaire calciumconcentratie

IEF isoëlektrische focussing

IEP isoëlektrisch punt

Ig immunoglobuline

IL interleukine

IFN- γ interferon- γ

IP immunoprecipitatie

IPG immobilized pH gradient

kDa kilodalton

MG moleculair gewicht

MHC major histocompatibility complex

MMP matrix metalloproteïnases

MQ- H2O registered trademark for water purification systems manufactured by Millipore

NKC natural killer cellen

OA osteoartritis

PAD peptidylarginine deïminase

PBS phosphate buffered saline

pI isoëlektrisch punt

pre- mRNA pre- messenger ribonucleic acid

ProtG proteïne G

PVDF polyvinylidene fluoride membraan

RA reumatoïde artritis

RF reumafactor

rpm rounds per minute

SDS sodium dodecyl sulphate

SDS- PAGE sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electroforese

SF synoviaal vocht

Tc cytotoxische T- cellen

TEMED N,N,N’,N’- tetramethylethyleendiamine

Th T- helper cellen

TNF- α tumornecrosisfactor- α

UV ultraviolet

VEGF vasculaire endotheliale groeifactor

1

1. INLEIDING

1.1. REUMATOÏDE ARTRITIS

Reumatoïde artritis (RA) is een chronische, progressieve, inflammatoire systemische auto-

immuunziekte (van Venrooij & Pruijn, 2008). Het is helaas ook een veelvoorkomende ziekte, ongeveer 1%

van de volwassen populatie wordt erdoor getroffen en dit voornamelijk bij de leeftijdscategorie van 50

plussers. Vrouwen worden twee tot drie keer meer getroffen door de ziekte dan mannen (György et al.,

2006).

RA is een vorm van ontstekingsreuma, waarbij een aantal gewrichten vaak langdurig ontstoken zijn.

Actieve perioden worden afgewisseld met rustigere waarin weinig tot geen inflammatie optreedt. Het

ontstekingsproces bestaat voornamelijk uit celbeschadiging, vaatverwijding, vochtophoping en afzetting

van witte bloedcellen in het synovium. Deze witte bloedcellen veroorzaken ontsteking en zwelling in het

synovium (synovitis) doordat ze, om een tot nog toe ongekende reden, de lichaamseigen weefsels

aanvallen.

Deze gewrichtsaandoening wordt mogelijks geïnitieerd door immuuncomplexen en complement,

onderhouden door cytokines en uiteindelijk wordt het bot aangetast door metalloproteïnasen

(Weissmann, 2006).

Waarneembare symptomen zijn roodheid, warmte, zwelling, pijn, een gestoorde functie en zelfs

immobiliteit door gewrichtsstijfheid. Wanneer onbehandeld, leidt RA op termijn tot beschadiging van

zowel bot- als kraakbeen en mogelijks zelfs tot vergroeiingen met invaliditeit tot gevolg (http://www.rpv-

gorinchem.nl/wat_is_reuma.htm). Vaak ziet men een symmetrisch verloop in RA, dit wil zeggen dat zowel

het linker als het rechter gewricht aangetast is. Getroffen gewrichten zijn voornamelijk polsen, handen,

ellebogen, knieën en enkels.

Meestal worden eerst de kleine diartrodiale gewrichten van handen en voeten aangetast, maar al snel

breidt dit uit naar de grotere gewrichten.

RA is ook een systemische ziekte, welke zich dus niet enkel beperkt tot de gewrichten, maar ook

algemene schade veroorzaakt. Symptomen als vermoeidheid, koorts en algemeen onbehagen zullen

dan optreden (FIG. 1.1) (http://www.niams.nih.gov/Health_Info/Rheumatic_Disease).

2

FIG. 1.1: AANTASTING VAN HET GEWRICHT IN RA (LINKS). RA IS EEN SYMMETRISCHE ZIEKTE (MIDDEN). X- STRAAL FOTO VAN EEN GEZONDE HAND [figuur 1] EN EEN VAN EEN RA PATIËNT [figuur 2]. MEN ZIET BOTEROSIE EN ZELFS BOTVERPLAATSING BIJ DE RA PATIËNT (http://www.bio.davidson.edu/courses/immunology/Students/spring2006/Dresser/RA.html)(http://z.about.com/f/p/440/graphic

s/images/en/17128.jpg)(http://64.143.176.9/library/healthguide/en- us/images/media/medical/hw/h9991226.jpg).

Het is nog niet bekend wat auto- immuniteit triggert, maar zowel de omgeving als de genetische

voorbestemdheid, voornamelijk het MHC genotype, spelen een duidelijke rol. Bepaalde MHC klasse 2

genen worden gezien als de belangrijkste risicofactoren voor RA. Studies omtrent de overeenkomst

tussen HLA klasse 2 genen en RA wezen sterk in de richting van MHC- ΙΙ- dependente T- cel activatie.

Deze behoort tot de adaptieve immuunrespons en zou pathogeen zijn voor RA (Klareskog et al., 2008).

Ook roken blijkt een van de grote risicofactoren te zijn voor RA. Deze risicofactor werd eerst als een

algemeen, niet- specifiek risico onderzocht onder het mom “algemeen welzijn”. Maar nu blijkt dat roken

en een bepaald HLA- allel (DR4) de grootste risicofactoren zijn voor de RF- positieve ziekte, meer zelfs

voor de ACPA- positieve RA patiënten (zie 1.3, 1.4). In een vergelijkende studie van Klareskog et al.

(2008) werd vastgesteld dat zware rokers tot 50 keer meer risico lopen op ACPA- positieve RA dan niet-

rokers. Er kan dus geconcludeerd worden dat roken met citrullinatie en zelfs met chronische inflammatie

in verband kan worden gebracht (zie 2.) (Klareskog et al., 2008).

Deze mogelijke associatie tussen citrullinatie in longen en roken – en de daarbij horende mogelijke

trigger van anticitrulline immuniteit – is een uitdagend concept, maar mag niet worden beperkt tot roken

alleen (Klareskog et al., 2008)!

1.2. IMMUUNCOMPLEXEN

Ons afweersysteem wordt ingedeeld in twee functioneel verschillende delen, namelijk de eerste

lijnsverdediging of het aangeboren immuunsysteem en de tweede lijnsverdediging of het adaptief

3

immuunsysteem. Het aangeboren immuunsysteem geeft een snelle en niet- antigenspecifieke reactie.

Het bezit hiervoor enkele belangrijke cellulaire componenten zoals: monocyten (macrofagen,

dendritische cellen), neutrofielen, eosinofielen, basofielen, mastcellen, NKC en γδ T- cellen. Het

adaptief immuunsysteem is daarentegen trager en antigen- specifiek, maar bouwt wel een (belangrijk)

immunologisch geheugen op. Deze tweede lijnsverdediging wordt vertegenwoordigd door B- en T-

cellen.

De adaptieve immuunrespons is een kritische component in de verdediging tegen infecties en is dus

essentieel voor de gezondheid van elk individu. Echter deze adaptieve immuunrespons kan ook

optreden tegen antigenen, die niet geassocieerd zijn met infectieuze componenten. Deze respons is in

essentie identiek aan deze tegen infectieuze componenten, maar de antigenen zijn verschillend.

Indien de antigenen lichaamseigen weefselantigenen zijn, spreekt men over auto- immuniteit. Dit kan

leiden tot auto- immuunziekten, gekenmerkt door weefselschade. De mechanismen achter deze schade

zijn ongeveer dezelfde als deze van de protectieve immuniteit. De adaptieve immuunrespons wordt

geïnitieerd door de activatie van antigenspecifieke T- cellen. Men neemt aan dat auto- immuniteit op

dezelfde manier wordt geïnitieerd. Een cytotoxische T- cel respons en een ongewenste activatie van

macrofagen door Th1- cellen kunnen op zich ernstige weefselschade veroorzaken. Ook ongewenste T-

cel hulp aan zelfreactieve B- cellen kan schadelijke autoantilichaam responsen veroorzaken (Janeway,

2001).

Macrofagen, dendritische cellen en B- cellen zijn antigenpresenterende cellen (APC’s). Wanneer het

lichaam een lichaamsvreemde of een vervormde lichaamseigen stof (antigenen) herkent, kan het

hiertegen een immuunreactie opwekken. Bij auto- immuunziekten, zoals RA, treedt een immuunreactie

op tegen autoantigenen in het synoviaal weefsel. Gecitrullineerd fibrinogeen en andere gecitrullineerde

eiwitten zijn zo kandidaat autoantigenen, die om een nog onbekende reden als lichaamsvreemd worden

beschouwd. Deze antigenen worden specifiek herkend en gebonden aan de APC’s . Daar worden ze

intracellulair opgenomen in vesikels en met behulp van proteolytische enzymen verknipt tot peptiden.

De vesikels met peptiden kunnen dan fusioneren met andere vesikels, welke MHC- ΙΙ’s bevatten.

Binden de peptide aan deze MHC- ΙΙ’s, dan worden ze getransporteerd naar de celmembraan van de

APC voor presentatie. Naïeve T- cellen in de lymfeknoop kunnen met behulp van hun T- celreceptor de

gepresenteerde peptiden herkennen en met hun CD4+ het bijhorende MHC- ΙΙ. Dit resulteert in een

binding en wanneer de B7.1 en de B7.2 eiwitten op de celmembraan van de APC binden aan de CD 28

4

ligand van de T- cel, worden de T- cellen geactiveerd. Deze kunnen nu prolifereren en differentiëren tot

effector T- cellen (voornamelijk Th1, Th2 en Tc cellen) (FIG. 1.2.a)

FIG. 1.2.a: (A) POLYPEPTIDE ANTIGEN ONDERGAAT PINOCYTOSE IN EEN APC EN WORDT ENZYMATISCH VERTEERD. DE KLEINERE PEPTIDEN WORDEN GEPRESENTEERD DOOR MHC KLASSE 2. (B) DE APC INTERAGEERT MET EEN TCEL DIE VOORBIJ KOMT. DE APC EN DE TCEL WORDEN SAMENGEHOUDEN DOOR CELINTERACTIE MOLECULEN LFA- I/ICAM- I EN COSTIMULATOIRE MOLECULEN B7/CD28. TCEL EN APC WORDEN GEACTIVEERD EN PRODUCEREN CYTOKINES. (C) GEACTIVEERDE TCEL EN APC BLIJVEN CYTOKINES EN ANDERE INFLAMMATOIRE MEDIATOREN PRODUCEREN. [FAS = FATTY- ACID SYNTHESIS; LFA = LYMPHOCYTE FUNCTION ANTIGEN; ICAM = INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE; NO = NITRIC OXIDE] (Smith & Haynes, 2002)

Een lokale inflammatie vindt plaats in het gewricht en een invasie van cellulaire componenten van het

immuunsysteem (vnl. B- cellen, T- cellen en macrofagen) treedt op. De effector T- cellen zijn in staat te

interageren met de targetcellen die het specifiek antigen op hun oppervlak dragen. Zo kunnen ze met

hun T- celreceptor de door de B- cel gepresenteerde peptiden herkennen. Met hun CD4+ herkennen ze

tevens MHC- ΙΙ. Hierdoor ontstaat terug een binding en wanneer nu ook CD 40, aanwezig op de B- cel,

bindt aan een CD 40- ligand op de T- cel, zal de T- cel cytokines produceren. Deze cytokines, zoals

interleukines, helpen de B- cel prolifereren en differentiëren tot plasmacellen en geheugen- B- cellen

(zie FIG 1.2.b). De plasmacellen zullen antilichamen/autoantilichamen produceren specifiek tegen deze

antigenen/autoantigenen. In een eerste fase zullen dit voornamelijk IgM antilichamen zijn, later gevolgd

door IgG antilichamen. Bij een tweede contact, waar geheugen- B- cellen worden gestimuleerd, zullen

voornamelijk specifiekere IgG antilichamen worden gevormd. Deze autoantilichamen binden dan de

lichaamseigen proteïnen binnenin het synoviaal vocht. Op deze manier ontstaan antilichaam- antigen-

bindingen of immuuncomplexen (IC).

5

FIG. 1.2.b: INTERACTIE TH2 CEL EN BCEL. WANNEER OOK CD 40 OP DE B- CEL BINDT AAN DE CD 40- LIGAND OP DE T- CEL, ZAL DE T- CEL CYTOKINES PRODUCEREN. DEZE CYTOKINES, ZOALS INTERLEUKINES , HELPEN DE B- CEL PROLIFEREREN EN DIFFERENTIËREN TOT PLASMACELLEN EN GEHEUGEN- B- CELLEN. (http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/26/T- cell_dependent_b- cell_act.jpg)

Immuuncomplexen activeren het complement, voornamelijk C3a en C5a anafylatoxinen, welke

chemotaxis induceren, wat uiteindelijk tot inflammatie kan leiden. Het

complement is tevens in staat om cellen te lyseren met behulp van het membrane attack

complex. Het anafylatoxine C5a zorgt voor een upregulatie van het aantal activerende receptoren en

een downregulatie van de inhiberende Fc- receptoren (Weissmann, 2006). Dit anafylatoxine lokt

inflammatie en intra- articulaire weefselschade uit (Weissmann, 2004).

De geactiveerde T- cel maakt ook groeifactor IL- 2 aan, welke T- cel proliferatie induceert, waarbij

oppervlaktemolecules zoals tumor necrosis factor- α (TNF- α) tot expressie komen. TNF- α is betrokken

bij de activatie van de synoviale fibroblasten. T- cel activatie leidt ook tot de vrijstelling van cytokines

zoals IFN γ, welke verantwoordelijk zijn voor de stimulatie van de macrofagen en de vrijstelling van de

pro- inflammatoire cytokines zoals IL- 1, IL- 6 en TNF- α. Deze cytokines stimuleren de proliferatie van

de synoviale fibroblasten en de synthese van weefselafbrekende matrix metalloproteïnasen (MMP),

welke schade kunnen berokkenen aan het gewricht.

1.3. DE REUMAFACTOR

Van alle autoantilichamen gevonden in RA patiënten, zijn enkel de reumafactor (RF) en de anti-

gecitrullineerde proteïne/peptide antilichamen (ACPA’s) de klinisch meest bruikbare determinanten (van

Venrooij & Pruijn, 2008). Het immuuncomplex met RF is tot nog toe het meest gekende bij RA. Hierbij

wordt het complex gevormd door een autoantilichaam, namelijk een IgG of een IgM reumatoïde factor,

dat multipele epitopen op het Fc- deel van een humaan IgG antilichaam kan binden. Het gevormd IgG-

IgM immuuncomplex activeert dan het complement, voornamelijk C3a en C5a anafylatoxinen. Dit

veroorzaakt inflammatie.

6

FIG. 1.3: DE REUMAFACTOR: IC GEVORMD DOOR CENTRAAL EEN PENTAMEER IgM DAT HET Fc- DEEL VAN EEN IgG KAN BINDEN. (http://www.bio.davidson.edu/courses/immunology)

Ongeveer 70% van de RA- patiënten zijn seropositief voor de reumafactor, waardoor deze dus als een

diagnostische merker in aanmerking komt. De mate waarin deze factor aanwezig is, is ook gecorreleerd

met de ernst en agressiviteit van de aandoening. Algemeen houdt de aanwezigheid van de reumafactor

verband met een verhoogde morbiditeit en zelfs mortaliteit (Dörner et al., 2004).

Hoewel de RF een goede indicatie geeft over het ziekteverloop van RA, is deze merker niet specifiek

genoeg. Zo komt hij ook in andere reumatische en auto- immuun ziekten voor. Daarenboven bedraagt

de sensitiviteit van de RF in de diagnose van RA zo’n 75%, wat neerkomt op 25% van de patiënten met

een klinische aanwezigheid van RA waar geen RF in het serum wordt gedetecteerd (Klareskog et al.,

2008).

Men ging dus op zoek naar een specifiekere merker, die wel even gevoelig is als RF, namelijk de anti-

gecitrullineerde proteïne antilichamen (ACPA’s). De detectie van deze ACPA’s blijkt de beste

diagnostische merker te zijn voor RA met een gevoeligheid van 65.2% ( ~ RF) en een specificiteit van

98,5%.

Een nog hogere predictieve waarde voor RA bekomt men uiteraard door beide diagnostische merkers,

RF en ACPA, te combineren.

1.4. AUTOANTILICHAMEN TEGEN GECITRULLINEERDE PROTEÏNEN (ACPA’S)

Gezien de ernst van de ziekte zou het dus zeer voordelig zijn om de diagnose van RA reeds te kunnen

stellen nog voor de eerste klinische symptomen zich manifesteren. Op deze manier kunnen

reumatologen de behandeling sneller starten en zo de progressie ervan sterk vertragen. Uit voorgaande

7

studies blijkt namelijk dat een “agressieve” behandeling in de meest vroege stadia irreversibele

botdestructie zou vertragen tot zelfs vermijden (Vincent et al., 2004).

ACPA’s worden bij zowat 60% van de RA- patiënten gevonden en worden als zeer specifiek beschouwd

in deze ziekte. Dit omdat ze slechts in 1,5% van de normale populatie en zelden bij andere

inflammatoire aandoeningen worden gezien (Klareskog et al., 2008). Aangezien ACPA’s zo specifiek zijn

voor RA en vooral gezien ze reeds enkele jaren voor de eerste symptomen van de ziekte aanwezig zijn,

is onderzoek naar deze nieuwe diagnostische merker van groot belang (Klareskog et al., 2008).

De ontdekking van deze familie antilichamen verliep over verschillende jaren. Vooreerst ontdekte men

dat de immunoglobulines in de sera van RA- patiënten reageerden met het epitheel van de rat-

oesofagus. Daarom werden ze beschreven als antikeratine antilichamen (AKA). Men dacht ook dat ze

cytokeratines zouden kunnen herkennen. Wanneer men vond dat deze AKA’s niet enkel reageerden

met het rat- oesofagus- epitheel, maar ook met menselijke buccale mucosale cellen, werd deze

cytokeratine- hypothese bevestigd. Twaalf jaar later werd duidelijk dat het AKA antigen niet cytokeratine

was, maar een geassocieerde molecule (pro)fillagrine. De antilichamen werden nu anti- fillagrine

autoantilichamen (AFA) genoemd. Verdere studies wezen uit dat de AFA/AKA moleculen identiek waren

aan de anti- perinucleaire factor (APF), die reeds veel eerder werd ontdekt. Echter ook deze AFA

gedachte bleek niet geheel correct, aangezien bij gebruik van recombinant of synthetisch aangemaakte

peptide fragmenten van (pro)fillagrine geen reactiviteit werd gezien. Dit leverde het bewijs dat de

immunogeniciteit van het (pro)fillagrine verband hield met zijn posttranslationele modificaties.

Zo vond men dat het antigen, herkend door de AKA/AFA/APF antilichamen, gecitrullineerd (pro)fillagrine

was, dat lokaal werd geproduceerd door autoreactieve B- cellen. Toch bleek dat er in vivo geen

(pro)fillagrine productie plaatsvond. Dit weerlegde de hypothese dat het antigen (pro)fillagrine kon zijn,

gezien de inflammatie enkel optreedt in het gewricht en niet in de epidermis, waar (pro)fillagrine talrijk

aanwezig is. Uiteindelijk identificeerde men het antigen in het gewricht als gedeïmineerde α- en β-

ketens van fibrine.

De ACPA familie wordt dus voorlopig nog opgedeeld in verschillende families onder andere

anticyclische gecitrullineerde peptide antilichamen (anti- CCP), anti- perinucleaire factor (APF),

antikeratine antilichamen (AKA), antihumaan fillagrine autoantilichamen (AhFA), antihumaan fibrinogeen

autoantilichamen (AhFibA), anti- Sa (gericht tegen gecitrullineerd vimentine), … (György et al., 2006)

8

RA patiënten worden ook best opgedeeld in 2 subgroepen, namelijk de ACPA negatieven en de ACPA

positieven. Dit omdat ACPA- positieve RA- patiënten een meer ernstig verloop van de ziekte kennen,

andere risicofactoren hebben en zelfs het effect van medicatie blijkt anders te zijn dan bij APCA

negatieve RA. Voor een gezond persoon, welke ACPA positief blijkt uit een anti- CCP test, is het risico

tot ontwikkeling van RA in de toekomst zelfs 100 keer groter dan bij de algemene populatie (Klareskog et

al., 2008).

1.5. GECITRULLINEERDE EIWITTEN

Eiwitten worden in ons lichaam gecodeerd door een zeer beperkt aantal genen in het genoom. Maar

met behulp van posttranslationele modificaties, bijvoorbeeld fosforylaties en glycosylaties, kan zowel de

structurele als de functionele diversiteit van het proteoom worden verhoogd (György et al., 2006).

Gecitrullineerde eiwitten zijn proteïnen die een citrullinatie als posttranslationele modificatie hebben

ondergaan.

Citrullinatie is een enzymatisch gekatalyseerde reactie door het enzym peptidylarginine deïminase

(PAD). Hiervan werden reeds vijf belangrijke iso- types geïdentificeerd (PAD 1 [epidermis, uterus], PAD

2 [skeletale spieren,hersenen,…], PAD 3 [haarfollikels], PAD 4 [in neutrofielen, eosinofielen], PAD 6

[eieren, embryo’s]) (György et al., 2006). Waarvan PAD 2 en PAD 4 de meest relevante zijn in RA

(Vossenaar & van Venrooij, 2004). Naast deze enzymatische katalysator PAD is calcium, als regulator,

onmisbaar voor de reactie (György et al., 2006). Dit wil zeggen dat gezien de calciumconcentratie

intracellulair ( ICCa2+: 10- 7 mol/l) vrij laag is, de reactie voornamelijk voorkomt na extreme

omstandigheden als apoptose of terminale differentiatie van de epidermis, waarbij een influx van

extracellulair calcium (ECCa2+: 10- 3 mol/l) optreedt (10- 5 mol/l is nodig voor PAD activatie) (Vossenaar &

van Venrooij, 2004).

Bij het citrullinatie proces wordt het natuurlijk gevormd aminozuur arginine (Arg), met behulp van zowel

een katalysator als regulator, omgezet in een citrulline (Cit). De actieve plaats van het PAD enzym

bevat een cysteïne residu, dat de guanidine groep van het arginine aanvalt. Na een nucleofiele aanval

van een watermolecule, wordt het stikstofatoom in deze guanidine groep omgezet in een zuurstofatoom

waarbij ammoniak ontstaat als bijproduct. Hierbij wordt het cysteïne residu terug geregenereerd (György

et al., 2006). Dit proces noemt men ook wel deïminatie, aangezien een gedeïmineerd aminozuur wordt

gevormd (zie FIG. 1.5).

9

FIG. 1.5: CITRULLINATIE: DEIMINATIE VAN EEN PEPTIDYLARGININE NAAR EEN PEPTIDYLCITRULLINE IS EEN POSTTRANSLATIONELE MODIFICATIE, GEDREVEN DOOR HET CACIUM- DEPENDENT ENZYM PAD (György et al., 2006).

Het komt voor in diverse fysiologische processen zoals apoptose, terminale epitheliale differentiatie en

genexpressie. Gecitrullineerde eiwitten komen voornamelijk voor in haar, huid en nagels. Maar

citrullinatie komt ook voor in verschillende pathologiën zoals psoriasis, de ziekte van Alzheimer,

multipele sclerosis, RA,... (György et al., 2006)

Verschillende belangrijke gevolgen, met betrekking tot de structuur en de functie van het eiwit waarvan

het deel uitmaakt, treden op. Zo is de guanidine-groep in Arg verantwoordelijk voor de basiciteit van het

aminozuur en bijgevolg ook voor zijn positieve lading bij fysiologische pH. Dit in tegenstelling tot het

gevormde Cit, dat neutraal geladen is (György et al., 2006). Deze verandering in lading geeft aanleiding

tot een andere opvouwing en maakt het eiwit gevoeliger voor degradatie (Klareskog et al., 2008). Het

eiwit wordt meer hydrofoob en kan zijn tertiaire, secundaire en zelfs primaire structuur verliezen.

In vitro werd reeds aangetoond dat een hoge graad van citrullinatie proteïnen kan denatureren. Maar in

vivo mag men niet veronderstellen dat citrullinatie een denaturatieproces is. Algemeen kan worden

gesteld dat een lossere, minder georganiseerde en minder open configuratie wordt gevormd. De

omzetting kan ook de interacties met andere proteïnen beïnvloeden. Tevens wordt een klein verschil in

moleculair gewicht opgemerkt, zijnde 1 Da per gemodificeerd arginine. Gezien het gevormde citrulline

geen natuurlijk voorkomend aminozuur is in proteïnen, kan dit dus een immuunrespons opwekken

(György et al., 2006).

Deze verschillende primaire veranderingen ten gevolge van citrullinatie kunnen verregaande

fysiologische, maar ook pathologische gevolgen hebben. Dit bewijst nogmaals dat onderzoek hier

omtrent sterk aangewezen is. Uit verscheidene voorgaande studies blijken drie gecitrullineerde eiwitten,

gecitrullineerd fibrinogeen, fibronectine en vimentine, teruggevonden in RA SF (Tabushi et al., 2008).

10

1.5.1. Gecitrullineerd Fibrinogeen

Fibrinogeen is de natuurlijke precursor van fibrine, dat wordt gevormd met behulp van het enzym

trombine, dat op zijn beurt ontstaat uit protrombine. Fibrine is een bloedstollingseiwit in het bloedplasma

dat een belangrijke rol speelt bij de normale wondgenezing en bloedstolling (Tabushi et al., 2008). Het

mechanisme hierachter berust op de vorming van een soort netwerk van “draden” op de plek van

beschadiging van het bloedvat. Bloedplaatjes komen vervolgens in dit netwerk vast te zitten en zorgen

samen met de fibrinedraden voor het dichten van de wonde stolselvorming. Dit blijft zo tot de wonde

hersteld is.

Citrullinatie van het fibrine maakt de molecule ook antigenisch, wat wil zeggen dat het kan worden

herkend door de ACPA’s en aldus een immuunrespons uitlokken. Deze afweerreactie leidt tot

verhoogde plasma- exsudatie en endotheliale celcontractie. Dit geeft aanleiding tot een verhoogd

gehalte fibrinogeen en andere procoagulatoire proteïnen in het interstitium (György et al., 2006).

Naast citrullinatie van fibrine blijkt citrullinatie van fibrinogeen nog belangrijker.

PAD 2 en PAD 4 zijn de enzymen die arginines in fibrinogeen modificeren tot citrullines. Sommige van

deze gemodificeerde residu’s waren herkenningsplaatsen voor trombine. Gecitrullineerd fibrinogeen is

dus een niet- competitieve inhibitor en inhibeert op deze manier de trombinereactie. Gecitrullineerd

fibrinogeen gaat met andere woorden de trombine- gekatalyseerde polymerisatie tot fibrine tegen.

Gezien geen fibrine meer gevormd kan worden, beïnvloedt dit de hemostase. Fibrinogeen staat ook in

voor chemokineproductie onder normale fysiologische omstandigheden. Wanneer de balans tussen

coagulatie en fibrinolyse dus uit evenwicht geraakt, ten gevolge van de citrullinatie van fibrinogeen, kan

de chemokineproductie worden geïnduceerd en de ontwikkeling van RA versnellen (Nakayama – Hamada

et al., 2008).

11

FIG. 1.5.1: HUMAAN FIBRINOGEEN: EEN HETEROHEXAMEER; VIA DISULFIDEBRUGGEN GEBONDEN. BEVAT 2 SETS VAN 3 NIET IDENTIEKE KETENS (ALPHA, BETA AND GAMMA). DE 2 HETEROTRIMEREN ZITTEN IN EEN KOP AAN KOP CONFORMATIE MET DE N- TERMINI IN EEN SMAL CENTRAAL DOMEIN (http://www.bmsc.washington.edu/people/teller/fig1.gif).

Een verhoogde concentratie van gecitrullineerd fibrinogeen kan ook antigeniciteit opwekken. Maar

ACPA’s, specifiek tegen gecitrullineerd fibrinogeen, zouden op zich geen artritis kunnen veroorzaken

(Klareskog et al., 2008).

1.5.2. Gecitrullineerd Fibronectine

Fibronectine is een hoogmoleculair glycoproteïne aanwezig in het bloed, bindweefsel en op

celoppervlakken. Het wordt voornamelijk in vitro geproduceerd door een brede waaier epitheliale en

mesenchymale cellen, waaronder fibroblasten, myoblasten, macrofagen, hepatocyten en intestinale

cellen.

Bij de analyse van fibronectine- moleculen heeft men ontdekt dat het proteïne verschillende functionele

en structurele regio’s bevat waarmee het kan binden aan celoppervlakken, collageen, fibrinogeen of

fibrine, complement, glycosaminoglycanen, proteoglycanen en heparine

(http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/datasheet2/f3648dat.Par.0001.File.tmp/f3648dat.pdf).

Circulerend fibronectine staat in voor de vorming van de extracellulaire matrix in weefsels, maar

functioneert eveneens als een niet- specifiek opsonine dat de opname van afgebroken weefsel door

fagocyterende cellen vergemakkelijkt. Gezien een alternatieve splitsing van het pre- mRNA van

fibronectine kan optreden, komen ook vele iso- vormen voor. Deze iso- vormen vervullen op hun beurt

een belangrijke rol in fysiologische processen (zoals celadhesie, migratie, proliferatie en differentiatie)

(Chang et al., 2005). Fibronectine blijkt ook betrokken bij o.a. cellulaire morfologie, cytoskeletale

organisatie, fagocytose, hemostase en wondheling


12

Fibronectine komt in hoge concentraties voor in artritische gewrichten en speelt een heel belangrijke rol

in de pro- inflammatie, pannus invasie en andere processen betrokken bij de ziekteprogressie van

bijvoorbeeld RA (Tabushi et al., 2008).

Niet gecitrullineerd induceert fibronectine dus apoptose, maar eens deze gecitrullineerd raakt, verliest

het zijn effect op de geprogrammeerde celdood (Chang et al., 2005).

Wijelath et al. (2002) toonden twee bindingsplaatsen voor de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF)

aan op de N- en C- terminus van fibronectine. Zij ontdekten dat de associatie tussen fibronectine en

VEGF noodzakelijk was voor het effect van VEGF- geïnduceerde celmigratie en proliferatie. Gebruik

makend van een gelijkaardig protocol kon men in een volgende studie (Chang et al., 2005) bewijzen dat

de binding van gecitrullineerd fibronectine aan VEGF sterk verhoogd was. Dit kon zich voordoen

doordat de switch van arginine- residu’s in citrulline- residu’s een conformationele verandering van het

fibronectine gaf en op deze manier de affiniteit voor VEGF beïnvloedde. Op deze manier heeft

citrullinatie van fibronectine dus een effect op de biologische werking van VEGF. Op deze manier drijft

het sterk de neovascularisatie en de progressieve gewrichtsdestructie bij RA.

Naast een verhoogde affiniteit van gecitrullineerd fibronectine voor VEGF, werd een verlaagde affiniteit

voor integrin β1 vastgesteld. De interactie tussen fibronectine en integrin β1 medieert in normale

omstandigheden celadhesie, migratie en signaal transductie. Deze reactie speelt dus een cruciale rol in

onder andere wondherstel, hemostase, immuunrespons en geprogrammeerde celdood. Hoe

gecitrullineerd fibronectine en zijn dissociatie van integrin β1 de RA- pathogenese beïnvloeden, is nog

niet bekend. Men vermoedt wel dat deze verminderde interactie bijdraagt tot de destructie, de

inflammatie en de abnormale celproliferatie die kan worden vastgesteld bij deze ziekte (Chang et al.,

2005).

Yasuda et al. (2003- 2004) vonden dat de COOH- terminus van een fibronectine molecule in reumatisch

kraakbeen stikstof- oxide produceerde, net als MMP. Beide, stikstof- oxide en MMP, spelen een rol bij

de inflammatie en weefseldestructie van geïnflammeerde gewrichten.

13

FIG. 1.5.2: FIBRONECTINE: FIBRONECTINE BESTAAT ALS EEN DIMEER UIT TWEE BIJNA IDENTIEKE POLYPEPTIDEKETENS AAN ELKAAR GELINKT DOOR DISULFIDE BINDINGEN (http://en.wikipedia.org/wiki/File:PBB_Protein_FN1_image.jpg).

1.5.3. Gecitrullineerd Vimentine

Vimentine is een cytoskeletaal proteïne, een intermediair filament dat wordt geproduceerd door

verschillende cellen en voorkomt in mesenchymale cellen, macrofagen en synoviale fibroblasten. Het

wordt voornamelijk geacht een zeer belangrijke rol te spelen in de stabiliteit van het cytoplasmatisch

netwerk en dus van het cytoskelet. De intermediaire filamenten vormen een zeer dynamisch moleculair

netwerk. Het uit elkaar gaan en weer samenkomen van deze filamenten wordt geregeld door fosforylatie

(Tilleman et al., 2008).

Men veronderstelt dat de regulatie van polymerisatie en depolymerisatie gebeurt door fosforylatie/

defosforylatie en citrullinatie. cAMP dependent proteïne kinase en proteïne kinase C enzymen kunnen

vimentine fosforyleren. Het hoofddomein van vimentine bevat verschillende β- ketens die makkelijk

kunnen worden gedeïmineerd. Zowel deze fosforylatie als deze deïminatie dragen bij tot de reductie van

het isoëlektrisch punt (IEP) van vimentine. Als gevolg hiervan wordt het eiwit gedepolymeriseerd. Dit

betekent dat arginine residu’s bijdragen tot de vorming van filamenten. Wanneer dus bij apoptose de

intracellulair verhoogde calciumconcentratie zorgt voor geactiveerde PAD’s en bijgevolg voor citrullinatie

van onder andere vimentine, verliest dit laatste zijn volledig intermediair filament netwerk. Er treedt dus

een morfologische verandering op ten gevolge van apoptose, meer bepaald ten gevolge van de

deïminatie die ermee gepaard gaat (György et al., 2006).

Vimentine is detecteerbaar in het synovium en fibroblast- achtige synoviocyten. Het zou een rol spelen

in inflammatie, gezien fragmenten gesecreteerd worden door geactiveerde macrofagen gedurende

inflammatie. Gecitrullineerd vimentine is geïndentificeerd als het Sa- antigen in RA (Tilleman et al.,2008).

14

Anti- gecitrullineerde vimentine antilichamen bezitten een hoge specificiteit (92%- 98%) en vertonen een

positieve predictieve waarde (84%- 99%) voor RA (Tabushi et al., 2008).

FIG. 1.5.3: VIMENTINE: EEN VIMENTINE MONOMEER HEEFT EEN CENTRAAL Α- HELICAAL DOMEIN, MET AAN ELK EINDE EEN NIET HELICAAL AMINO (KOP) AND CARBOXY (STAART) EIND DOMEIN. TWEE MONOMEREN TWISTEN ROND ELKAAR EN VORMEN ZO EEN “COILED- COIL” DIMEER. TWEE DIMEREN VORMEN SAMEN EEN TETRAMEER, WAT, OP ZIJN BEURT, EEN “SHEET” VORMT NA INTERACTIE MET ANDERE TETRAMEREN (http://en.wikipedia.org/wiki/File:PBB_Protein_VIM_image.jpg).

15

2. OBJECTIEVEN

Een op zichzelf onschuldige inflammatie in het gewricht veroorzaakt een influx van inflammatoire cellen

(granulocyten, monocyten, lymfocyten). In normale omstandigheden sterven deze geïnfiltreerde cellen

door apoptose en worden dan opgeruimd via fagocytose. Gezien apoptose een Ca2+- influx tot gevolg

heeft, verhoogt de calciumconcentratie intracellulair gevoelig, waardoor de calcium- dependente PAD’s

worden gestimuleerd. Intracellulaire proteïnen, zoals vimentine, fibrinogeen en fibronectine, raken

hierdoor gecitrullineerd. Wanneer er zich echter massale apoptose voordoet, ten gevolge van toxische

componenten of een infectie, of wanneer het opruimingssysteem faalt, kunnen apoptotische cellen

necrotisch worden. Door het afsterven van deze cellen komen de intracellulair gecitrullineerde proteïnen

en de geactiveerde PAD enzymen vrij. Deze enzymen, voornamelijk PAD 2 en PAD 4, kunnen nu ook

extracellulaire synoviale proteïnen (zoals fibrinogeen) citrullineren. In personen die de gecitrullineerde

eiwitten/peptiden kunnen presenteren aan T- cellen, via het HLA 2 systeem, kan een immuunrespons

specifiek tegen deze gecitrullineerde antigenen worden opgewekt. Dit resulteert in de activatie van

autoreactieve B- cellen wat leidt tot de vorming van ACPA’s. Deze lokaal aangemaakte ACPA’s, welke

ook kunnen binnengedrongen zijn in het gewricht vanuit andere geïnflammeerde plaatsen in het

lichaam, kunnen dan reageren met de overvloedig aanwezige gecitrullineerde antigenen en vormen zo

immuuncomplexen.

Immuuncomplexen stimuleren op hun beurt APC’s door binding van het complement en Fc- receptoren.

Ze trekken ook nieuwe granulocyten en monocyten aan die worden geactiveerd, vervolgens afsterven

en een nieuwe lading geactiveerde PAD’s vrijlaten zodat steeds meer proteïnen gecitrullineerd raken.

Geactiveerde APC’s zullen dus steeds meer gecitrullineerde antigenen kunnen presenteren. Dit leidt tot

meer activatie van T- en B- cellen, waardoor de ACPA en RF productie blijft toenemen. Op deze manier

worden ook meer en meer pro- inflammatoire cytokines (zoals TNF, IL- 1 en IL- 6) geproduceerd, welke

het inflammatie proces nog onderhouden.

Men komt terecht in een vicieuze cirkel die jaren kan doorgaan en welke uiteindelijk, samen met nieuwe

trauma’s of risicofactoren uit de omgeving (zoals roken), bijdragen tot de ontwikkeling van chronische

(d.w.z. meer dan 6 weken) RA (van Venrooij & Pruijn, 2008). Ook al zijn de initiële omstandigheden die

leiden tot de anti- gecitrullineerde immuunrespons nog onbekend, toch weet men dat in principe elk

trauma of elke infectie, die celdood veroorzaakt van PAD bezittende cellen, genoeg is om citrullinatie te

16

initiëren. Maar dat, enkel wanneer er sprake is van (genetische) voorbeschiktheid, een immuunrespons

tegen deze gecitrullineerde proteïnen optreedt en de vorming van ACPA’s met zich meebrengt.

FIG. 2: DE VIJF BELANGRIJKSTE STAPPEN IN DE RA CYCLUS: STAP1, BINNENTREDEN EN DOOD VAN INFLAMMATOIRE CELLEN IN HET SYNOVIUM; STAP 2, PAD ACTIVATIE EN PROTEÏNE CITRULLINATIE; STAP 3, IMMUUNRESPONS TEGEN GECITRULLINEERDE ANTIGENEN; STAP 4, VORMING VAN GECITRULLINEERDE IMMUUNCOMPLEXEN EN HUN EFFECTEN; STAP 5, AANTREKKEN VAN NIEUWE INFLAMMATOIRE CELLEN (van Venrooij & Pruijn, 2008).

Inflammatie bij RA wordt onder meer veroorzaakt door IC die het complement, voornamelijk C3a en C5a

anafylatoxinen activeren. Het is dus belangrijk deze IC grondig te bestuderen. Men weet dat deze IC

worden gevormd door de binding van autoantilichamen aan lichaamseigen proteïnen. Wat men

vermoedt is dat fibrinogeen β, fibrinogeen γ, fibronectine en vimentine deze lichaamseigen antigenen

zijn. Het doel van dit onderzoek is dus met behulp van antilichamen, specifiek tegen deze

lichaamseigen antigenen, de aanwezigheid van de eiwitten aan te tonen in IC van RA patiënten.

Men vermoedt ook dat ACPA’s de specifieke immuunrespons in RA veroorzaken. Het is dus een

interessante theorie dat deze ACPA’s aanwezig zouden zijn in immuuncomplexen en dat de antigenen

dus gecitrullineerde eiwitten zijn. In een volgende stap van het onderzoek is het dus de bedoeling om

aan te tonen dat de eventueel gevonden lichaamseigen proteïnen in IC ook nog eens gecitrullineerd

voorkomen.

Indien deze theorie zou bevestigd worden is het nog belangrijk te kijken of er een verschil kan worden

aangetoond in deze resultaten, tussen CCP- negatieve en CCP- positieve patiënten.

17

3. MATERIALEN EN METHODEN

3.1. IMMUNOPRECIPITATIE VAN SERUM MET PROTEÏNE G

3.1.1. Principe

Onderstaande immunoprecipitatie maakt gebruik van sepharose beads gecoat met proteïne G. Dit

proteïne G heeft de eigenschap te binden aan het Fc- deel van IgG’s en bindt bijgevolg vrije IgG’s en

immuuncomplexen. Na centrifugatie van de beads kunnen de proteïne G - IgG - complexen worden

geïsoleerd van de rest van het staal.

3.1.2. Materialen

- ImmunoPure Immobilized Protein G (Pierce, Rockford, USA)

- PBS 1x (Bio- Rad, Hercules, CA)

- Laemmli- buffer: 2% SDS, 10% glycerol, 50 Mm TrisHCl pH 6,8 (MP, Illkirch, France)

- β- mercaptoethanol (BME) 5% (Merck, Darmstadt, Germany)

- spin cups – cellulose acetaat filter (Pierce, Rockford, USA)

- Lobind eppendorf epjes (Eppendorf, Hamburg, Germany)

3.1.3. Methode

1. Breng 400 µL proteïne G (kamertemperatuur) in Lobind Eppendorf en centrifugeer 5 min. aan 1500

rpm

2. Voeg er 400 µL PBS 1x bij, vortex, centrifugeer 5 min. aan 1500 rpm en verwijder supernatans

3. Herhaal stap 2

4. Breng 50 µL staal in 450 µL PBS1x, breng dit op de beads, vortex en laat 4 u roteren in koele

kamer (T=4°). Breng dan over in spin cups met cellulose acetaat filter

5. Centrifugeer 5 min. aan 1500 rpm en breng supernatans in een Lobind Eppendorf epje (genaamd

N1)

6. 6 wasstappen (N2- N7): 400 PBS 1x; 5 min. aan 1500 rpm

7. Breng beads over in Lobind Eppendorf + 500 µL LB+ (Laemmli buffer + 5 % BME)

8. Kook op in thermomixer 95 °C 10 min., laat afkoelen, vortex en pipetteer over in epje met filter

9. Centrifugeer 5 min. aan 5000 rpm, spoel na met 400 µL PBS 1x en breng supernatans in N8

18

3.2. IMMUNOPRECIPITATIE VAN SYNOVIAAL VOCHT MET PROTEÏNE G

3.2.1. Principe

Hyaluronzuur, een glycosaminoglycaan, is het hoofdbestanddeel van het synoviaal vlocht

(gewrichtsvloeistof). Het werkt als smeermiddel bij alle gewrichtsbewegingen. Door de hoogmoleculaire

structuur is deze vloeistof viskeus genoeg om niet uit het gewricht weggeperst te worden. Om deze

reden is bij immunoprecipitatie van synoviaal vocht een voorbehandeling nodig.

3.2.2. Materialen

- Hyaluronidase (Sigma, St. Louis, MO, USA)

- ImmunoPure Immobilized Protein G (Pierce, Rockford, USA)

- PBS 1x (Bio- Rad, Hercules, CA)

- Laemmli- buffer

- β- mercaptoethanol 5% (Merck, Darmstadt, Germany)

3.2.3. Methode

1. Stap 1-3 van protocol IP van serum

2. Voeg bij 50 µL staal 5 µL hyaluronidase toe en plaats 30 min. bij 37° C in thermomixer

3. Voeg 445 µL PBS 1x toe, breng alles op de beads, vortex en laat 4 u roteren in koele kamer (T=4°)

4. Verder stap 5-10 van protocol IP van serum

3.3. ACETONPRECIPITATIE (AP)

3.3.1. Principe

Deze techniek wordt gebruikt voor het verwijderen van componenten die kunnen interfereren met

verdere analyses. Een teveel aan zouten in het staal, kan bijvoorbeeld interfereren met de iso-

elektrische focussering (IEF). AP is dus een extra opzuivering van de eiwitfractie waarbij de aanwezige

proteïnen neerslaan in koude aceton. Na centrifugatie kan dan het supernatans met interfererende

componenten, zoals zouten, worden verwijderd. De ontstane pellet bevat nu enkel de eiwitten, die voor

19

verdere toepassing opnieuw moeten worden opgelost. Dit kan best gebeuren met behulp van buffers

die compatibel zijn met de volgende analysestappen.

3.3.2. Materialen

- Koude aceton (- 20°C), verhouding aceton- eiwitoplossing: 900 µl/100 µl (Sigma, St. Louis, MO,

USA)

- acetoncompatibele centrifugeer tube bestaande uit polypropyleen (Greiner, Frickenhausen,

Duitsland)

- Koude centrifuge (4°C)

- Centrivap

3.3.3. Methode

1. Koel het gewenste volume aceton af tot - 20° C

2. Breng proteïnestaal in epjes (in ijs), voeg 9 maal het staalvolume koude aceton toe, vortex en laat

overnacht incuberen bij - 20° C

3. Draai de stalen af in de koude centrifuge gedurende 10 min. aan 14 000 rpm

4. Neem de aceton af en droog de stalen verder in de centrivap

5. Vries de stalen in of hersuspendeer in een geschikte buffer

3.4. PROTEÏNEBEPALING: COOMASSIE

3.4.1. Principe

Deze colorimetrische methode wordt gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van proteïnen in een

oplossing. Coomassie maakt gebruik van een range die ligt tussen 0 en 2 mg/ml eiwitgehalte. Eens

Coomassie op het staal met eiwitten wordt gebracht, ontstaat een shift van bruin naar blauw ten

gevolge van de vorming van coomassiekleurstof- proteïne complexen. De gebruikte golflengte voor het

bepalen van deze blauwe kleur is 595 nm (http://www.piercenet.com/files/compapchart.pdf).

Met behulp van een standaardreeks van albumine kan een ijklijn worden opgesteld, waaruit de

extinctiecoëfficiënt kan worden gehaald. Deze is nodig voor het bepalen van de proteïneconcentratie,

wat gebeurd met de Wet van Lambert

met A = absorptie

L = afgelegde weg van het licht

c = concentratie van de te onderzoeken stof

ε = molaire extinctie coëfficiënt

3.4.2. Materialen

- 96 Well Microplates (greiner bio

- Coomassie Protein Assay Reagent Kit:

o Coomassie Protein

fosforzuur (Pierce, Rockford, USA

o Albumine Standard Ampules, 2 mg/ml: Bovine serum albumin (BSA) bij een

concentratie van 2 mg/ml in een 0,9% zoutoplossing en een 0,05%

natriumazideoplossing (

- Spectrofotometer: Tecan

3.4.3. Methode

1. Bereid standaardreeks (working range

2000; 1500; 1000; 750; 500; 250; 125; 25; 0 µg/ml

2. Vul 96- wellplaat in duplo zowel voor standaardreeks als

3. Voeg overal 200 µL Coomassie bij en laat 10 min. incuberen

4. Meet spectrofotometrisch de absorbantie bij een golflengte van 595 nm. Uit de ijklijn kan de

concentratie van het te onderzoeken staal worden berekend.



wat gebeurd met de Wet van Lambert- Beer.

= afgelegde weg van het licht

= concentratie van de te onderzoeken stof

= molaire extinctie coëfficiënt

96 Well Microplates (greiner bio- one)

Coomassie Protein Assay Reagent Kit:

Coomassie Protein Assay Reagent, 950ml: Coomassie G- 250 kleurstof, methanol,

Pierce, Rockford, USA)

Albumine Standard Ampules, 2 mg/ml: Bovine serum albumin (BSA) bij een


natriumazideoplossing (Pierce, Rockford, USA)

working range: 100- 1500 µg/ml) met BSA concentraties respectievelijk:

2000; 1500; 1000; 750; 500; 250; 125; 25; 0 µg/ml

plaat in duplo zowel voor standaardreeks als staal (5 µL)

Voeg overal 200 µL Coomassie bij en laat 10 min. incuberen

Meet spectrofotometrisch de absorbantie bij een golflengte van 595 nm. Uit de ijklijn kan de

concentratie van het te onderzoeken staal worden berekend.

20



250 kleurstof, methanol,

Albumine Standard Ampules, 2 mg/ml: Bovine serum albumin (BSA) bij een


1500 µg/ml) met BSA concentraties respectievelijk:

Meet spectrofotometrisch de absorbantie bij een golflengte van 595 nm. Uit de ijklijn kan de

21

3.5. SODIUMDODECYLSULFAAT POLYACRYLAMIDE GELELEKTROFORESE (SDS- PAGE)

3.5.1. Principe

Dit is een techniek die wordt gebruikt voor het scheiden van proteïnen op basis van hun moleculair

gewicht, onafhankelijk van hun intrinsieke lading. Deze denaturatie gebeurt door toevoeging van

sodiumdodecyl sulfaat (SDS), onder de vorm van een sample (Laemmli) buffer, en door toevoeging van

β - mercaptoethanol (BME) aan het staal.

SDS is een detergent dat de eigenschap heeft proteïnen te denatureren. Gezien de sterk negatief

geladen eindstandige sulfaatgroep zorgt SDS ook voor een intrinsieke negatieve lading van de

proteïnen. Op deze manier zullen ze in een elektrisch veld steeds naar de anode migreren. BME

daarentegen is een reductans dat denaturatie van proteïnen veroorzaakt door het breken van hun

disulfidebindingen. Na toevoegen van deze denaturanten wordt het mengsel nog onderworpen aan een

temperatuur van 95 ° C. Wat op zijn beurt bijdraagt tot de denaturatie van de proteïnen

(http://www.abcam.com/technical).

Gelelektroforese kan in 1 dimensie of in 2 dimensies gebeuren.

3.5.2. 1D SDS PAGE

Deze techniek wordt routinematig gebruikt voor scheiding van de meest voorkomende eiwitten en

nucleïnezuren (http://www.abcam.com/technical).

De scheidingsgel wordt gevormd door polymerisatie van acrylamide monomeren tot onvertakte ketens

in een driedimensionaal poreus netwerk. Hiervoor wordt N,N’- methyleen- bisacrylamide toegevoegd ter

crosslinking van de polyacrylamide ketens. De hoeveelheid acrylamide/ bisacrylamide bepaalt de

grootte van de gelporiën, wat op zich het scheidend vermogen van de gel bepaalt. De reactie vereist

tevens een activator, ammoniumpersulfaat (APS), en een katalysator, N,N,N’,N’-

tetramethylethyleenamine (TEMED) (http://www.abcam.com/technical).

De gels bestaan uit een stacking gel en een running gel. De stacking gel, met een lager acrylamide/

bisacrylamide percentage en dus grotere poriën, dient voor het aanconcentreren van het staal in een

22

compacte band. Op deze manier vertrekken alle eiwitten van op dezelfde plaats voordat de echte

scheiding, met behulp van de running gel, begint. Om dit te bekomen, bezitten beide onderdelen van

deze Laemmli gel, stacking en running gel, een verschillende pH. De running gel wordt gebufferd met

Tris en op pH 8,8 gebracht met HCl. De stacking gel wordt ook gebufferd met Tris maar wordt met HCl

op pH 6,8 gebracht. De elektrode buffer is ook Tris, maar wordt op een derde, verschillende pH (8,3)

gebracht met enkel glycine. De gels worden gerund bij een constante voltage.

Glycine is een zwak zuur en kan voorkomen als ongeladen zwitterion of als geladen glycinaat anion

(negatief geladen). Bij een lage pH zal het dus voorkomen als ongeladen molecule gezien het dan

geprotoneerd is. Wanneer de pH wordt verhoogd, treedt het op als anion. Dus wanneer de stroom wordt

aangeschakeld, willen de glycine ionen weg van de kathode lopen en migreren naar het staal en de

stacking gel. Daar is de pH laag dus verliezen ze hun lading en hun snelheid. Ondertussen lopen in de

stacking gel de negatief geladen chloorionen richting anode. Dit zorgt samen voor een zone van lage

geleiding en dus een zeer hoge elektrische resistentie, zodat alles in deze smalle band geconcentreerd

zit. Het effect van deze hoog gevolteerde bewegende zone is dat alle proteïnen de running gel op

ongeveer een gelijk tijdstip bereiken. Wanneer deze smalle band de running gel uiteindelijk raakt,

verhoogt de pH terug en glycine raakt gedeprotoneerd. Dit heeft tot gevolg dat de snelheid van de nu

negatief geladen glycine stijgt en deze van de proteïnen afneemt (afhankelijk van de poriegrootte van

de gel). Op deze manier bevinden de proteïnen zich in een relaxter, uniform elektrisch veld, waar ze

kunnen bewegen naar hun eigen plek in de gel, enkel en alleen afhankelijk van hun grootte en

moleculair gewicht (http://mullinslab.ucsf.edu/protocols/html/SDS_PAGE_protocol.htm).

FIG. 3.5.1: 1D SDS PAGE: STALEN KUNNEN IN DE WELLETJES WORDEN GELADEN EN BIJ AANSCHAKELEN VAN DE STROOM WORDEN ZE AANGECONCENTREERD IN DE STACKING GEL; DAARNA LOPEN ZE DOOR DE RUNNING GEL WAAR ZE ZULLEN GESCHEIDEN WORDEN OBV HUN MG. ZO ZULLEN DE GROTE MOLECULEN HOGER IN DE GEL BLIJVEN ZITTEN DAN DE KLEINE (AFHANKELIJK VAN DE PORIEGROOTTE) (http://web.chemistry.gatech.edu/~williams/bCourse_Information/4581/techniques/gel_elect/gel.jpg).

23

3.5.2.1. Gieten van de gel

3.5.2.1.1. MATERIALEN

- 40% Acrylamide/Bis- oplossing (Bio- Rad, Hercules, CA)

- Tris HCL pH 8,8 (running gel) (MP, Illkirch, France); Tris HCL pH 6,8 (stacking gel) (MP, Illkirch,

France)

- SDS (MP, Illkirch, France)

- MQ- H2O

- APS (activator) (Sigma, St. Louis, MO, USA)

- TEMED (katalysator) (Sigma, St. Louis, MO, USA)

- Pasteurpipet (VWR, Leuven, België)

- Criterion cassette (Bio- Rad, Hercules, CA)

3.5.2.1.2. METHODE

1. Maak running gel door samenvoegen van:

a. 25ml 40% Acrylamide/Bis- oplossing

b. 25 ml1,5 M Tris HCL pH 8,8 (MP, Illkirch, France)

c. 48,5 ml MQ- H2O

d. 1 ml 10% SDS (MP, Illkirch, France)

e. Voeg als laatste 500 µL 10% APS en 50 µL TEMED toe aan het gelmengsel

2. Vul met behulp van een pasteurpipet een Criterion cassette met running gel tot op 1 cm van de

bovenrand

3. Breng hierboven een laagje MQ- H2O waardoor eventuele luchtbellen verdwijnen

4. Laat 1uur polymeriseren

5. Maak terwijl stacking gel door samenvoegen van:

a. 2,5 ml 4% AcrylBis

b. 6,3 ml 0,5 M Tris HCL pH 6,8 (MP, Illkirch, France)

c. 15,9 ml MQ- H2O

d. 250 µL 10% SDS

e. Voeg als laatste 125 µL 10% APS en 25 µL TEMED toe aan het gelmengsel

6. Verwijder het laagje water bovenop de running gel en breng stacking gel aan

24

7. Verwijder luchtbellen, plaats kam en laat stollen

8. Verpak de SDS- polyacrylamidegel in een hermetisch afgesloten plastiek zakje samen met een

vochtig doekje en bewaar in koele kamer (4° C)

3.5.2.2. Laden en lopen van de gel


- Sample buffer = Laemmli buffer:

o 1,2 ml Tris HCL 0,5 M pH 6,8 (MP, Illkirch, France)

o 4,8 ml MQ- H2O

o 1 ml glycerol (MP, Illkirch, France)

o 2 ml 10% SDS (MP, Illkirch, France)

o Spatelpuntje broomfenolblauw

- Running buffer:

o 2,5 mM Tris (MP, Illkirch, France)

o 0,1 % SDS (MP, Illkirch, France)

o 192 mM glycine (MP, Illkirch, France)

o At 5 L MQ- H2O

- BME (Merck, Darmstadt, Germany)

- Thermomixer

- Vivaspin

- Criterion Cell (Bio- rad, Hercules, CA)

- MagicMark western protein standard (Invitrogen) of Precision Plus (Bio- Rad, Hercules, CA)

- Prestained SDS- PAGE standards broad range (Bio- Rad, Hercules, CA)

3.5.2.2.2. METHODE

1. Voorbereiding staal, voor laden van de gel:

a. Voeg samen: staal en LB+

b. Plaats 5 min. bij 95° C in thermomixer

c. Centrifugeer 10 min. aan 15 000 rpm

25

2. Plaats Criterion Cell in ijs, verwijder kam van de Criterion cassette en plaats de cassette in de

Criterion cell

3. Vul de elektroforesetank met running buffer

4. Laad staal en merkers (MagicMark western protein standard en Prestained SDS- PAGE standards

broad range) (10 µL van elke merker) en sluit de Criterion Cell af

5. 30 min. 150 V, 1 uur 200 V

3.5.3. 2D SDS PAGE

Dit houdt een twee- dimensionale scheiding van de verschillende eiwitten in. Twee dimensioneel wil

zeggen dat de eiwitten niet enkel op basis van grootte en moleculair gewicht worden gescheiden, maar

ook via iso- elektrisch punt.

FIG. 3.5.2: 2D SDS PAGE VERLOOPT IN TWEE DIMENSIES, EEN EERSTE SCHEIDING VAN DE PROTEÏNEN GEBEURT VOLGENS HUN IEP, VERVOLGENS WORDEN DE EIWITTEN NOG GESCHEIDEN OBV HUN MG (http://edoc.hu- berlin.de/dissertationen/zabel- claus- 2003- 01- 17/HTML/zabel_html_750d62da.jpg).

3.5.3.1. In sample rehydratatie van de IPG strips

Om het staal voor te bereiden op een scheiding in de eerste dimensie, wordt het gemengd met

rehydratatiebuffer en geladen op een IPG strip dat een geïmmobiliseerd pH- gradiënt bevat. Zowel de

grootte als de pH- gradiënt van de strips kan variëren.

De gebruikte rehydratatiebuffer bestaat uit ureum, thioureum, CHAPS, CA, DTT en broomfenolblauw.

Ureum en thioureum zijn twee chaotrope stoffen, gebruikt voor het denatureren van de proteïnen door

het ontdoen van hun quaternaire, tertiaire en secundaire structuren. Ze dienen ook voor het

solubiliseren van de gedenatureerde proteïnen. CHAPS, een neutraal zwitterionisch detergent,

26

bevordert dit solubilisatieproces en minimaliseert proteïne- aggregatie. Carrier amfolieten (CA) zijn

zouten, die worden toegevoegd om de stroom op gang te brengen. Het reductans dithiothreitol (DTT)

verbreekt de inter- en intra- moleculaire disulfidebruggen. Het zorgt er ook voor dat de proteïnen in deze

gereduceerde toestand blijven. Broomfenolblauw, een blauwe kleurstof, wordt toegevoegd om het IEF

zichtbaar te kunnen volgen.


- Rehydratatiebuffer:

o 7M ureum (Sigma, St. Louis, MO, USA)

o 2M thioureum (Acros, Geel, België)

o 2% % [(3- cholamido- propyl)dimethylammonia]- 1- propaan sulfaat (CHAPS) (MP, Illkirch,

France)

o 0,2% carrierampholyte (CA) pH 3- 4 (stock 40%) (Amersham)

o 100 nM dithiothreitol (DTT) (MP, Illkirch, France)

o Broomfenolblauw

- ReadyStripTM IPG Strip (pH 4- 7 of 3- 10, 11 cm) (Bio- Rad, Hercules, CA)

- Reswelling Tray

- Covering oil (Bio- Rad, Hercules, CA)

3.5.3.1.2. METHODEN

1. Voeg 200 µL rehydratatiebuffer toe aan elk staal,vortex, plaats in ultrasone bad ter heroplossing

van de eiwitten en centrifugeer 5 min. aan 14000 rpm

2. Wanneer geen pellet: ga verder

Wanneer pellet zichtbaar herhaal stap 1

3. Breng de stalen in de verschillende laantjes van de Reswelling Tray

4. Leg de IPG strips in de vloeistof met de gelkant naar beneden (verwijder luchtbellen)

5. Breng 3 ml covering oil aan bovenop de strips en laat minstens 6 u rehydrateren

27

3.5.3.2. Isoëlektrische focussing (IEF): 1e dimensie

IEF is een scheiding van proteïnen volgens hun isoëlektrisch punt (pI). Dit is het punt waar de

nettolading van proteïnen, die zowel basische als zure groepen (amfoteer) bevatten, nul is. Het pI hangt

enkel af van de pH. De IPG strip met het proteïnemengsel beheerst een bepaalde pH- gradiënt.

Wanneer deze in een elektrisch veld wordt gebracht, zullen de proteïnen migreren doorheen deze

gradiënt tot het punt waar de pH- waarde overeenkomt met hun eigen pI (Tilleman et al., 2005). Een eiwit

zal migreren naar zijn tegengestelde pool: een netto positief geladen eiwit zal naar de kathode toe

bewegen, terwijl een netto negatief geladen eiwit naar de anode migreert. Geleidelijk aan zullen ze hun

respectievelijke positieve en negatieve lading verliezen tot ze de netto lading nul bereiken. Op dat punt

worden ze dan gefocuseerd.


- IEF- chamber (Bio- Rad, Hercules, CA)

- Protean IEF cell (Bio- Rad, Hercules, CA)

3.5.3.2.2. METHODE

1. Leg op elk contactpunt van de elektrode 2 wiekjes met 10 µL MQ H2O

2. Haal de IPG strip met het proteïnenmengsel uit de Reswelling Tray en plaats het in de IEF-

chamber met de gelkant naar beneden op de wiekjes

3. Breng covering oil aan op de strip en plaats de IEF- chamber in de Protean IEF cell

4. Activeer het geschikte programma

3.5.3.3. SDS- PAGE: 2e dimensie

Deze techniek wordt voornamelijk gebruikt voor finger printing.

Zoals eerder beschreven is het een techniek die wordt toegepast om eiwitten te scheiden op basis van

hun moleculair gewicht. Gezien de eiwitten in de IPG- strip reeds gescheiden zijn op basis van hun pI, is

dit een twee dimensionele scheiding.

28

De IPG strip wordt voor gebruik van SDS- PAGE geëquilibreerd met behulp van een buffer bestaande

uit TrisHCl, ureum, glycerol en SDS met dithiothreitol (DTT) enerzijds en met iodoacetamide (IAA)

anderzijds. DTT reduceert de eiwitten, maar gezien deze reactie reversiebel is, wordt er ook

geëquilibreerd met IAA, welke met behulp van alkylering ervoor zorgt dat de hervorming van de

bindingen wordt verhinderd.

Om een scheiding in tweede dimensie te krijgen, onafhankelijk van de vorm en van de intrinsieke lading,

worden de eiwitten gedenatureerd. Zowel de Laemmli- buffer in de laatste fase van de IP als de

equilibratiebuffer spelen hierbij een belangrijke rol. Dit voornamelijk door de aanwezigheid van SDS. Dit

anionisch detergent bezit denaturerende eigenschappen en wentelt zich uiteindelijk rond de moleculen,

die het op deze manier een negatieve lading bezorgt. Alle eiwitten bezitten nu dezelfde m/z- waarde,

zodat deze scheiding effectief onafhankelijk van de intrinsieke lading gebeurt.

Net zoals bij de 1D SDS- PAGE wordt hier weer gebruik gemaakt van een polyacrylamidegel dat een

driedimensioneel poreus gelnetwerk voorstelt. In de praktijk wordt ook hier gebruik gemaakt van het

discontinue systeem van Laemmli, maar de stacking gel wordt nu achterwege gelaten gezien de

aanconcentrering reeds plaatsvond in de IPG strip.

De migratie van de eiwitten door aanleggen van een elektrisch veld verloopt op dezelfde manier als

beschreven bij 1D SDS- PAGE. Proteïnen met een lager moleculair gewicht zullen sneller doorheen de

gel bewegen dan de grotere. Door gebruik te maken van standaardproteïnen kan dit moleculair gewicht

geschat worden.


- Equilibratiebuffer:

o 50 mM TrisHCl pH 8,8 (stock 1M) (MP, Illkirch, France)

o 6 M ureum (Sigma, St. Louis, MO, USA)

o 20% glycerol (stock 80%) (MP, Illkirch, France)

o 2% SDS (MP, Illkirch, France)

- Dithiothreitol (DTT) (MP, Illkirch, France)

- Joodacetamide (MP, Illkirch, France)

- Criterion cell

29

- Agaroseoplossing:

o 0,5% agaroseoplossing in elektroforesebuffer (100 ml running buffer + 0,5g agarose)

o broomfenolblauw

- Precision Plus Protein All blue Standards (Bio- Rad, Hercules, CA)

- 2D Criterion cassette

- Of Ready/CriterionTM Gel 10% TrisHCl (Bio- Rad, Hercules, CA)

- Runningbuffer zie 1D SDS- PAGE

3.5.3.3.2. METHODE

1. Laat elke IPG- strip 15 min. equilibreren in 15 ml equilibratiebuffer met 2% DTT en daarna 15 min.

met 4% joodacetamide om de DTT weg te wassen

2. Breng ondertussen de agaroseoplossing aan de kook

3. Plaats de Criterion cell in ijs en vul deze met running buffer tot ‘fill’

4. Plaats de 2D Criterion cassette, na verwijderen van de kam, in de Criterion cell

5. Breng de vloeibare agaroseoplossing met behulp van een pasteurpipet in de well van de Criterion

cassette en plaats hierin de geëquilibreerde IPG- strip

6. Plaats de Precision Plus Protein All blue Standards voor de IPG- strip

7. Vul de Criterion cassette volledig met running buffer eens de agaroseoplossing is gestold

8. Laat gedurende 30 min. een stroom van 150 Volt over de cassette lopen en verhoog vervolgens

naar 200 Volt gedurende 1 uur

3.6. SYPRO RUBY KLEURING

3.6.1. Principe

Dit is een fluorescente kleuring van polyacrylamidegels, zodat een beeld kan worden gemaakt van het

ontstane proteïnepatroon na SDS- PAGE. Deze kleuring heeft een detectielimiet van 1 ng.

De eiwitten in de gel worden eerst gefixeerd met behulp van een fixatieoplossing. Er wordt gebruik

gemaakt van een 10% methanol en 7% azijnzuuroplossing. Daarna wordt hij minimum 3 uur gekleurd

met SYPRO Ruby Protein gel stain, een kleurstof die wordt gebruikt voor analyses van zowel 1D als 2D

SDS- PAGE. SYPRO Ruby bindt niet- covalent aan eiwitten, maar associeert bij zure pH met de

30

primaire amines. De sterkste interacties treden op met lysine, arginine en histidineresidu’s

(http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/datasheet5/s4942dat.Par.0001.File.tmp/s4942dat.pdf).

Hierna wordt de gel opnieuw overgebracht in de fixatieoplossing om het eiwit- kleurstofcomplex goed te

fixeren op de gel en zo achtergrond fluorescentie te reduceren (http://www3.bio-

rad.com/cmc_upload/Literature/13023/4006173B-wMS.pdf). De detectie vindt plaats met behulp van UV-

licht (300 nm) in de versadoc.

Een voordeel van deze techniek is dat achteraf de proteïnen in de gel nog kunnen worden gebruikt voor

verdere analyses, zoals massaspectrometrie, zonder hinder te ondervinden van mogelijke interferenties

tengevolge van de kleuring

(http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/datasheet5/s4942dat.Par.0001.File.tmp/s4942dat.pdf).

3.6.2. Materialen

- Fixatieoplossing:

o 10% methanol (Merck, Darmstadt, Germany)

o 7% azijnzuur (Merck, Darmstadt, Germany)

- SYPRO Ruby Protein Gel Stain (Bio- Rad, Hercules, CA)

- Plastiek donker bakje (afscherming van licht)

- Versadoc imaging system (Bio- Rad, Hercules, CA)

3.6.3. Methode

1. Fixeer de gel met fixatieoplossing gedurende 30 min.

2. Verwijder deze wassolutie en kleur daarna gedurende minimum 3 uur met SYPRO Ruby Protein

Gel Stain (afgeschermd van licht)

3. Incubeer de gel nu 30 min. tot een uur met fixatieoplossing en herhaal deze stap

4. Was 5 min. met MQ- H2O en detecteer dan met de versadoc

31

3.7. WESTERN BLOTTING

3.7.1. Principe

Met behulp van Western Blotting worden proteïnen in een gelstructuur (gescheiden via SDS- PAGE)

naar een nitrocellulosemembraan of een polyvinylidene fluoride membraan (PVDF) getransfereerd.

Het nitrocellulosemembraan geniet de voorkeur omdat er met relatief grote eiwitten wordt gewerkt.

De meest gebruikte transfermethode is de elektroforetische transfer, waarbij gebruik wordt gemaakt van

de elektroforetische mobiliteit. Net zoals de eiwitten met een elektrische lading (door de binding met

SDS) kunnen worden geïnduceerd tot het migreren door een gel met behulp van een elektrisch veld,

kunnen ze ook worden getransfereerd van de gel naar een membraan. Hierbij wordt zowel membraan

als gel “gesandwiched” tussen 2 sponzen en 2 filters. Dit geheel wordt tussen twee elektroden geplaatst

in een geleidende oplossing, zoals CAPS- oplossing. De negatieve elektrode bevindt zich aan de kant

van de gel. Op deze manier zullen de negatief geladen eiwitten (gezien vooraf scheiding via SDS-

PAGE) in de gel, bij aanbrengen van een elektrisch veld, naar de positief geladen elektrode lopen. Het

blotmembraan bevindt zich echter tussen de gel en de positief geladen elektrode. Op deze manier

vormt het membraan een perfecte kopie van het proteïnepatroon van de polyacrylamidegel

(http://www.abcam.com/technical).

Het nut van deze techniek is onder andere de mogelijkheid tot detecteren van de proteïnen met behulp

van antilichamen (=immunodetectie). Ook AMC- kleuring is enkel mogelijk op blot.

3.7.2. Materialen

- Trans Blot Cell (Bio- Rad, Hercules, CA)

- Zwart- witte blottingscassette (Bio- Rad, Hercules, CA)

- 10x CAPS- oplossing [3- (cyclohexylamino)- 1- propaan sulfonzuur] (MP, Illkirch, France):

22,13 g/l pH 11 met 2M NaOH(stock)

- Nitrocellulosemembraan (Bio- Rad, Hercules, CA)

32

3.7.3. Methode

1. Plaats de Trans Blot Cell in ijs

2. Breng de gel, het membraan, de 2 sponzen en de 2 filters in CAPS 1x –oplossing en laat 15 min.

staan

3. Maak de “sandwich” als volgt:

Zwart rooster, spons, filter, polyacrylamidegel, nitrocellulosemembraan, filter, spons, wit rooster

4. Sluit de blottingscassette correct af, plaats deze in de Trans Blot Cell (zwart rooster naar de

negatieve elektrode) en overgiet met 3 L CAPS 1x - oplossing

5. Sluit de Trans Blot Cell af en laat 3u een stroom van 50 Volt doorstromen

FIG. 3.7: WESTERN BLOTTING: TRANS BLOT CELL WORDT IN IJS GEPLAATST, DE “SANDWICH” (ZWART ROOSTER, SPONS, FILTER, GEL, MEMBRAAN, FILTER, SPONS, WIT ROOSTER) WORDT IN DE BUFFERTANK GEPLAATST IN CAPS- OPLOSSING EN STROOM WORDT AANGESCHAKELD. EIWITTEN WORDEN OP DEZE MANIER OVERGEBRACHT VAN GEL OP MEMBRAAN (http://www.bio- rad.com/cmc_upload/Literature/202781/Bulletin_5478A.pdf).

3.8. PONCEAU

3.8.1. Principe

De Ponceau- kleuring is een eiwitdetectie, die wordt uitgevoerd met behulp van een rode,

wateroplosbare, anionische diazo- kleurstof. De negatief geladen kleurstof kan binden aan de positief

geladen aminogroepen van de eiwitten. Het kan ook niet- covalent binden aan de apolaire regionen

aanwezig in proteïnen.

33

Ponceau is geen gevoelige detectie, het heeft slechts een detectielimiet van 500 ng, maar is wel

reversibel. Dit omdat Ponceau met de targetmoleculen interageert op een elektrostatische manier en

geen chemisch gemodificeerde interactie is. In dit laatste geval zou het de proteïnen permanent en echt

fysiek aanvallen, wat niet het geval is zodat het gekleurde blot later kan worden ontkleurd

(http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma-Aldrich/Product_Information_Sheet/p3504pis.Par.0001.

File.tmp/p3504pis.pdf). Ontkleuring gebeurt aan de hand van water, gevolgd door een 0,3% Tween 20 in

PBS1x oplossing.

3.8.2. Materialen

- Ponceau kleurstof:

o 1g Ponceau S poeder

o 950 ml MQH2O

o 50 ml azijnzuur (Upstate, Billerica, MA)

- MQH2O

- 0,3% Tween 20 (Upstate, Billerica, MA) in PBS 1x (Bio- Rad, Hercules, CA)

3.8.3. Methode

1. Was blot 5 min. in MQH2O en laat dan 5 min. kleuren in 10 ml Ponceau

2. Was met MQH2O voor trage ontkleuring en met 0,3% Tween 20 in PBS 1x voor snellere en

volledige ontkleuring

3.9. IMMUNODETECTIE

3.9.1. Detectie met behulp van antilichamen: anti- fibrinogeen β kleuring, anti- fibrinogeen γ

kleuring, anti- vimentine kleuring, anti- fibronectine kleuring.

Deze antilichamen kunnen worden gebruikt voor kleuring zodat er kan worden aangetoond of de

opgezuiverde immuuncomplexen hun antigenen bevatten.

Fibrinogeen is een glycoproteïne dat bestaat uit 3 paar verschillende polypeptide ketens (α β γ ketens).

Tegen elk van deze mogelijke epitopen werden antilichamen ontwikkeld.

34

Fibrinogeen γ antilichamen zijn primaire polyklonale antilichamen, aangemaakt tegen de γ keten van

fibrinogeen in konijnen. De β antilichamen zijn ook primaire polyklonale antilichamen, maar dan werden

aangemaakt tegen de β keten van fibrinogeen. Na chemiluminiscentie kan dan een patroon ter hoogte

van 52 kDa worden gedetecteerd voor fibrinogeen γ en rond 56 kDa voor fibrinogeen β

(http://www.abcam.com/Fibrinogen-gamma-chain-antibody-ab62527.html).

Fibronectine antiserum wordt geproduceerd in konijnen wanneer opgezuiverd humaan fibronectine

wordt gebruikt als immunogen. Fibronectine is een multifuntioneel, extracellulair matrix glycoproteïne

dat bestaat uit twee bijna identieke polypeptiden, gebonden via disulfidebindingen. Elk van deze

polypeptiden heeft een moleculair gewicht van 220 kDa. Bij de detectie van fibronectine zal rond deze

waarde een specifiek bandje worden waargenomen (mogelijks ook een bandje rond 94 kDa)


Anti- vimentine daarentegen wordt monoclonaal aangemaakt in muizen. Het antigen vimentine kan

worden gedetecteerd rond 58 kDa (Sigma Aldrich, product information).

3.9.2. Materialen

- 0,3% Tween 20 (Upstate, Billerica, MA) in PBS 1x (Bio- Rad, Hercules, CA)

- Primair en secundair antilichaam:

Primair AL Anti- fibrinogeen β

(1:5000)

(Cambio)

Anti- fibrinogeen γ

(1:400)

(Abcam)

Anti- vimentine

(1:400)

(Upstate)

Anti- fibronectine

(1:1000)

(Sigma Aldrich)

Secundair AL HRP-

geconjugeerd Anti-

rabbit IgG

(1:1000) (Pierce)

HRP-

geconjugeerd Anti-

rabbit IgG

(1:50000) (Pierce)

HRP-

geconjugeerd Anti-

mouse IgG

(1:1000) (Upstate)

HRP-

geconjugeerd Anti-

rabbit IgG

(1:1000) (Upstate)

- Luminol en peroxide (Pierce, Rockford, USA)

35

3.9.3. Methode

1. Blokkeer 1u in 0,3% Tween 20/PBS 1x en laat overnacht bij kamertemperatuur incuberen met

primair antilichaam

2. Was 3 x 5 min. in 0,3% Tween20/PBS1x

3. Laat 1u incuberen met het secundair antilichaam

4. Was 3 x 5 min. in 0,3% Tween20/PBS1x

5. Laat 5 min. kleuren in 5ml luminol gemengd met 5ml peroxide

6. Droog en lees met versadoc (chemiluminiscentie)

3.10. AMC- KLEURING

3.10.1. Principe

Anti- modified citrulline detectie wordt toegepast nadat de proteïnen geïmmobiliseerd zijn op het

nitrocellulosemembraan. Met 2,3- butanedione monoxime en antipyrine in een sterk zure oplossing

modificeert men de citrulline residu’s. Op deze manier wordt een ureido groep adduct gevormd. De

detectie van de gemodificeerde citrullines zelf gebeurt aan de hand van twee antilichamen. Een primair

polyklonaal antilichaam, konijn anticitrulline (gemodificeerd), wordt gebruikt om het gemodificeerd

antigen te detecteren. Daarna wordt het secundair antilichaam, geit anti- konijn IgG- HRP, toegevoegd.

Dit antilichaam is gericht tegen het Fc- deel van de IgG. De chemiluminiscente detectie wordt uitgevoerd

door toevoegen van luminol en peroxide. De intensiteit van dit lichtsignaal correleert met de hoeveelheid

antigen dat aanwezig is op het blot. Men maakt ook gebruik van een positieve AMC- controle om na te

gaan of de AMC- detectie goed is verlopen. Op deze manier wordt nagegaan of er geen vals positieve

of vals negatieve resultaten bekomen werden (www.millipore.com).

3.10.2. Materialen

- 0,1% albumin (Invitrogen, Carlsbad, California) in PBS 10x (Bio- Rad, Hercules, CA)

- Reagens A:

o 0,5% FeCl3 (1ml) (Upstate, Billerica, MA)

o 10 ml MQ- H2O

o 5 ml H2SO4 (Upstate, Billerica, MA)

36

o 4 ml H3PO4 (Upstate, Billerica, MA)

- Reagens B (Upstate, Billerica, MA)

- 3% non fat dry milk in PBS (Upstate, Billerica, MA) 10x

- 1:1000 verdunning van anti- citrilline in PBS (Bio- Rad, Hercules, CA)- MILK die 0,08% Tween

20 bevat

- 1:5000 verdunning van geit ant- konijn IgG- HRP in PBS (Bio- Rad, Hercules, CA)- MILK

- 0,05% Tween 20/PBS (Bio- Rad, Hercules, CA) 1x

- Luminol en peroxide (Pierce, Rockford, USA)

3.10.3. Methode

1. Was het blot 2 maal 5 min. met MQH2O

2. Laat 15 min. incuberen met 0,1% albumine in PBS 10x en was terug 2 maal 5 min. met MQH2O

3. Dep droog en laat overnacht in het donker en bij 37°C incuberen met 5 ml reagens A gemengd met

5ml reagens B

4. Was 4 tot 5 maal 3 min. met MQH2O

5. Laat 30 min. schudden met 3% non fat dry milk in PBS 10x

6. Laat 1 u incuberen met 1:1000 verdunning van anti- citrilline in PBS- MILK die 0,08% Tween 20

bevat en was daarna 2 maal 5 min. met MQH2O

7. Laat 1 u incuberen met 1:5000 verdunning van geit ant- konijn IgG- HRP in PBS- MILK en was

daarna 2 maal 5 min. met MQH2O

8. Laat 3 tot 5 min. incuberen met 0,05% Tween 20/PBS 1x en was 4 tot 5 maal 3 min. met MQH2O

9. Laat 5 min. kleuren 5ml luminol gemengd met 5ml peroxide

10. Dep droog en detecteer met de versadoc

3.11. STRIPPING VAN EEN BLOT

3.11.1. Principe

Een blot, reeds gebruikt voor immunodetectie, kan worden gestript met behulp van een stripping buffer

zodat alle antilichamen er worden afgehaald. Op deze manier is het membraan terug “schoon” zodat

een nieuwe immunodetectie kan plaatsvinden. De stripping gebeurt met een stripping buffer, die bestaat

uit o.a. SDS, BME en een Tris buffer, die op 50°C wordt gebracht. SDS is een detergent dat instaat

37

voor het verbreken van o.a. waterstofbruggen en ionaire bindingen. BME zal het antilichaam reduceren

en zal, samen met de warmte factor, zorgen voor het verbreken van de binding tussen antigen en

antilichaam.

Na elke strip van een blot wordt met behulp van het gepaste secundaire antilichaam getest of de

stripping volledig is verlopen.

3.11.2. Materialen

- Stripping buffer:

o 0,1 M BME (Merck, Darmstadt, Germany)

o 2% SDS (MP, Illkirch, France)

o 0,05 M Tris pH 6,8 (MP, Illkirch, France)

- 0,3% Tween 20 (Upstate, Billerica, MA)/ PBS (Bio- Rad, Hercules, CA) 1x

3.11.3. Methode

1. Was 3 maal 5 min. in 0,3% Tween 20/PBS 1x, verwarm ondertussen de stripping buffer op 50°C

2. Laat 30 min. strippen bij 50°C en was daarna 3 maal 5 min. in 0,3% Tween 20/PBS 1x

3. Laat 1 u incuberen met het gepaste secundair antilichaam en was terug 3 maal 5 min. in 0,3%

Tween 20/PBS 1x

4. Laat 5 min. kleuren met 5 ml luminol gemengd met 5 ml peroxide en lees met versadoc

5. Laat eventueel nog 15 tot 30 min. strippen bij 50 °C afhankelijk van de intensiteit van het signaal

gelezen met de versadoc en was daarna terug 3 maal 5 min. in 0,3% Tween 20/PBS 1x

38

4. RESULTATEN

4.1. VERGELIJKING VAN IC UIT RA SERUM VERSUS RA SF MET 1D SDS- PAGE

Vooreerst werd nagegaan of gecitrullineerde antigenen aanwezig waren in IC in serum. Dit zou

voornamelijk functioneel makkelijker geweest zijn, gezien serum rijkelijker aanwezig is dan SF. Tevens

is het afnemen van serum veel patiëntvriendelijker dan het afnemen van SF. Er werd zowel op serum

als SF een IP uitgevoerd ter isolatie van IC. Na proteïnebepaling met Coomassie kon 50 µg

proteïnemengsel (voor blot) en 20 µg proteïnemengsel (voor gel) gebruikt worden om twee 1D gels te

lopen.

Eén gel werd gebruikt voor SYPRO- kleuring waarmee, op basis van moleculair gewicht, kon worden

aangetoond waar de eiwitten zich in de gel bevonden (FIG. 4.1.A). Zowel voor RA serum als voor RA

SF kon in de laantjes met eiwitten, die niet gebonden waren aan protG (= sups en wasstappen), een

hele range aan eiwitten gevisualiseerd worden. Een sterke kleuring was zichtbaar rond een moleculair

gewicht van 60- 70kDa, wat overeenkomt met albumine (in het verleden bevestigd met

massaspectrometrie). In de fractie met IC bleek albumine zo goed als afwezig te zijn, terwijl een sterke

kleuring optrad rond 50kDa en 25kDa. Deze kleuring kwam overeen met de lichte en de zware keten

van de immunoglobulines. Uit onderstaande gels kon besloten worden dat met protG een opzuivering

van ICs uit RA serum en RA SF kon verkregen worden.

Een tweede gel werd gelopen, waarbij de eiwitten overgebracht werden op een nitrocellulosemembraan

met behulp van Western Blotting. Hierop werd een AMC- kleuring uitgevoerd. Zowel voor serum als SF

was geen citrullinatie zichtbaar in de laantjes met eiwitten die niet gebonden waren aan prot G (FIG.

39

4.1.B, laantje 1). In de eiwitten die wel gebonden waren aan protG (=IC) (FIG. 4.1.B, laantje 2) is geen

citrullinatie zichtbaar bij serum van RA patiënten maar wel bij SF. Citrullinatie was daar voornamelijk

zichtbaar rond 50kDa. Citrullinatie rond dit MG kon zowel wijzen op gecitrullineerd fibrinogeen als

gecitrullineerd vimentine. Het gekleurde bandje rond MG 250 kDa wees mogelijks op gecitrullineerd

fibronectine. Echter wanneer dit gecontroleerd werd met behulp AMC- kleuring na 2D SDS- PAGE kon

geen gecitrullineerd fibronectine worden aangetoond. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat

gecitrullineerd fibronectine net onder de detectielimiet van AMC- kleuring viel door een te sterke

spreiding van dit eiwit na 2D SDS- PAGE (zie 4.2.6).

4.2. VERGELIJKING VAN IC UIT SERUM VERSUS SF MET 2D SDS- PAGE: RA SF, RA SERUM EN

GEZOND SERUM

Om de identiteit van de al dan niet gecitrullineerde antigenen te achterhalen werd overgestapt op 2D

SDS- PAGE. Op deze manier werden de eiwitten nog beter gescheiden, aangezien ze nu ook verspreid

zaten in de gel volgens hun IEF. Daarnaast was het ook belangrijk aan te tonen of de vermoede

lichaamseigen antigenen (vimentine, fibrinogeen β, fibrinogeen γ en fibronectine) al dan niet

voorkwamen in zowel SF als serum van RA. Hierbij werd ook getest of deze antigenen terug te vinden

waren in serum van gezonde patiënten.

In tweede instantie werd onderzocht of citrullinatie voorkwam in één van deze drie categorieën. Meer

bepaald of één van de gevonden antigenen gecitrullineerd bleek.

40

4.2.1. SYPRO Ruby kleuring

Om bovenstaande doelstellingen te bereiken werd een immunoprecipitatie uitgevoerd op een pool van

SF van 4 verschillende patiënten met RA (zowel CCP + als CCP - ), een pool van serum van 4

verschillende patiënten met RA en een pool van serum van 4 gezonde personen. Immuuncomplexen en

vrije IgG’s werden op deze manier geïsoleerd van de overige eiwitten in het serum of SF.

Op de immuuncomplexfractie werd eerst een AP voltrokken, waardoor de eiwitten werden neergeslaan

en de interfererende componenten (voornamelijk zouten) werden verwijderd. Dit werd voornamelijk

uitgevoerd omdat een teveel aan zouten problemen zou geven bij het IEF.

Na heroplossen van de immuuncomplexen in water, kon een eiwitbepaling met behulp van Coomassie

reagens uitgevoerd worden. 100 µg eiwit werd gerehydrateerd in strips met een pH- range van 4 tot 7.

Er werden zowel voor “RA SF”, “RA serum” als voor “gezond serum” 2 2D- PAGE gels gelopen. Telkens

werd 1 van deze 2 gels gebruikt voor een SYPRO- kleuring (FIG. 4.2.1), terwijl de eiwitten in de andere

gel werden geblot op een nitrocellulosemembraan. Aan de hand van een Ponceau- kleuring werd

vastgesteld dat de transmissie goed verlopen was.

De SYPRO- kleuring leek op het eerste zicht gelijkaardig bij de drie blots. Sterk geconcentreerde

banden werden telkens gedetecteerd rond het moleculair gewicht van 25 kDa en 50 kDa ter hoogte van

pH 4. Deze komen respectievelijk overeen met de zware en de lichte keten van Ig’s. De lichte ketens

werden ook gedetecteerd rond pI 5,5-7 en MG 25 kDa. De aanwezigheid van grote hoeveelheden IgG’s

was te verwachten aangezien gewerkt werd met geïsoleerde immuuncomplexen. Echter wanneer de

gels van dichterbij bestudeerd werden, bleken enkele verschillen. Mogelijke verschillen werden verder

bestudeerd met behulp van immunodetectie.

Bovenvermelde blots werden achtereenvolgens onderworpen aan immunodetectie met anti- fibrinogeen

β en anti- fibrinogeen γ, anti- fibronectine en anti- vimentine. Tussendoor werd telkens gestript met

behulp van een strippingbuffer op basis van SDS (detergent). De efficiëntie van de stripping werd

gecontroleerd door herincubatie met het desbetreffende secundair antilichaam.

41

4.2.2. Immunodetectie met anti- fibrinogeen β

Fibrinogeen β werd in de drie condities gevisualiseerd tussen 50 en 60 kDa en tussen pI 5 en 6. Enkel

bij RA SF werden ook spots gedetecteerd tussen MG 37- 50 kDa, pI 6- 7. Hoogstwaarschijnlijk waren dit

degradatieproducten van fibrinogeen β (FIG. 4.2.2).

De drie treintjes spots ter hoogte van MG 100 kDa en pI 5- 6 in RA SF werden later geconfirmeerd als

fibrinogeen γ (zie 4.2.3). Aankleuring van dit eiwit in deze detectie wees op crossreactiviteit van het

antilichaam tussen fibrinogeen β en fibrinogeen γ.

Ook de spots ter hoogte van MG 250 kDa werden later geconfirmeerd, namelijk als fibronectine (zie

4.2.4). Dit wees er dus op dit antilichaam tegen fibrinogeen β ook een zekere crossreactiviteit vertoont

met fibronectine.

Een typische formatie spots werd zowel bij RA SF, RA serum als gezond serum gedetecteerd tussen

MG 20- 30 kDa en tussen pI 4,5- 5. Deze spots bleken eigen aan aspecifieke bindingen wat later werd

bewezen (zie 4.4).

43

4.2.3. Immunodetectie met anti- fibrinogeen γ

Na uitvoering van de detectie met konijn anti- fibrinogeen γ blijkt duidelijk de aanwezigheid van dit

proteïne in immuuncomplexen, rond een MG van 100 kDa en pI 5- 6, enkel in SF van de RA patiënten.

Fibrinogeen γ wordt normaal verwacht rond 52 kDa (3.9.1). Aanwezigheid van spots rond 100 kDa wijst

hier op dimeren van fibrinogeen. Anti- fibrinogeen γ reactiviteit was echter niet zichtbaar in RA serum,

noch in serum van de gezonde pool (FIG. 4.2.3).

De vijf spots, centraal gelegen in het blot van RA SF, bleken overeen te komen met de

degradatieproducten van fibrinogeen β (zie hoger). Dit wees duidelijk op een mineure crossreactiviteit

met fibrinogeen β.

4.2.4. Immunodetectie met anti- fibronectine

Detectie met anti- fibronectine gaf op de drie blots een signaal rond MG 150- 250 kDa, maar blijkt

abundanter bij RA SF. Fibronectine omvat verschillende iso- vormen. Elke iso- vorm heeft een

verschillend MG en een verschillende pI- waarde. Er werd dan ook een duidelijk verschil in spreiding

van het eiwit over de blots waargenomen. In RA SF bestreek fibronectine naast een bredere pH- range

ook duidelijk een breder moleculair gebied ten opzichte van het serum van zowel gezonde als RA

patiënten (FIG. 4.2.4).

45

4.2.5. Immunodetectie met anti- vimentine

Vimentine werd gedetecteerd rond MG 50- 60 kDa en pI 4- 5. Deze detectie kon enkel in RA SF

waargenomen worden. Zowel in RA serum als in het gezonde serum kon geen vimentine worden

aangetoond (FIG. 4.2.5).

4.2.6. AMC- kleuring

Nadat het bewijs geleverd werd dat zowel vimentine, fibrinogeen β, fibrinogeen γ als fibronectine

aanwezig waren in SF RA, was een tweede doelstelling het aantonen van eventuele gecitrullineerde

eiwitten in IC.

Een AMC- kleuring werd daarom uitgevoerd op dezelfde blots waarop de immunodetectie plaatsvond.

Hieruit bleek dat vimentine en fibrinogeen β in het SF van de RA patiënt, in een gecitrullineerde vorm

aanwezig waren. Fibrinogeen β was ook zeer lichtjes zichtbaar in het serum van deze patiënten (FIG.

4.2.6). Dit wees erop dat gecitrullineerde immuuncomplexen duidelijk meer aangeconcentreerd zaten in

het knievocht van de RA- patiënten. Dit was logisch gezien de knie ook de belangrijkste plaats van

inflammatie is. In het gezond serum bleek geen citrullinatie aanwezig te zijn in IC.

Dit wees er dus duidelijk op dat zowel gecitrullineerd vimentine als gecitrullineerd fibrinogeen β in

immuuncomplexen uit SF van RA patiënten mogelijks antigenen zijn van de ACPA’s.

47

4.3. REPRODUCEERBAARHEID IN SF

Om de gevonden resultaten in het SF te confirmeren werd bovenstaand proefopzet herhaald met

opnieuw een pool van 4 RA- patiënten (zowel CCP + als CCP - ). IP werd in drievoud uitgevoerd en

gevolgd door proteïnebepaling met Coomassie. Daarna werd 2 maal 100 µg en 1 maal 50 µg

proteïnestaal onderworpen aan 2D SDS- PAGE. De 50 µg gel werd gebruikt voor een SYPRO-

kleuring, terwijl de 2 gels van 100 µg werden geblot. Op één van de twee blots werd een AMC- kleuring

uitgevoerd.

Het tweede blot werd achtereenvolgens onderworpen aan immunodetectie met anti- vimentine , anti-

fibrinogeen β en anti- fibrinogeen γ en anti- fibronectine. Deze volgorde werd gewijzigd ten opzichte van

vorige resultaten om toevalligheden uit te schakelen. Tussendoor werd ook telkens gestript. En ook hier

werd de strip steeds gecontroleerd met behulp van de desbetreffende secundaire antilichamen.

De resultaten, geleverd na deze proef, waren gelijkaardig aan het voorgaande proefopzet. De

aanwezigheid van alle proteïnen werd geconfirmeerd in de pool van SF van deze RA- patiënten. Ook de

vermoedelijke afbraakproducten van fibrinogeen β werden terug gedetecteerd. De crossreactiviteit

tussen fibrinogeen β en fibrinogeen γ kon opnieuw worden aangetoond. Net als de typische formatie

spots die te wijten was aan atypische bindingen (zie 4.4).

Zeer belangrijk was dat fibrinogeen β en vimentine met behulp van de AMC- kleuring opnieuw werden

gezien als gecitrullineerde antigenen. Kortom, het proefopzet confirmeerde duidelijk de resultaten

bekomen in het gelijkaardige opzet dat hierboven werd beschreven.

4.4. CONTROLE ASPECIFIEKE BINDING

Aangezien enkele niet definieerbare spots telkens terugkeerden (zie hoger), werd een nieuwe IP

uitgevoerd, opnieuw gevolgd door 2D SDS- PAGE van 2 maal 100 µg na proteïnebepaling met

Coomassie. De 2 gels werden weer geblot op een nitrocellulosemembraan. De blots werden in deze

proef elk blootgesteld aan een secundair HRP- gelabeld antilichaam. Met andere woorden het eerste

blot werd geïncubeerd met anti- muis antilichaam en het tweede met anti- konijn antilichaam.

48

Het anti- konijn secundair antilichaam werd als secundair antilichaam gebruikt bij immunodetectie met

anti- fibrinogeen β, anti- fibrinogeen γ en anti- fibronectine. Bij al deze detecties werd een formatie spots

gezien ter hoogte van MG 20- 30 kDa en pI 4,5- 5, welke niet kon worden toegekend aan een van deze

eiwitten. Wanneer een blot, waar nog geen detectie op plaatsvond, werd onderworpen aan een detectie

met enkel dit secundair HRP- gelabeld antilichaam, konden zowel de zware als lichte ketens van de

IgG’s worden gezien. En kon ook de bovenvermelde specifieke formatie spots worden teruggevonden.

Dit wees erop dat de spots aanwezig waren door aspecifieke bindingen (zie FIG. 4.4 links).

Het anti- muis secundair antilichaam werd gebruikt voor de detectie van vimentine. Op het vimentineblot

was ook een specifieke formatie aan spots waargenomen ter hoogte van 20- 30 kDa. Om aspecificiteit

na te gaan door het anti- muis antilichaam werd ook hier een nieuw blot onderworpen aan een detectie

met enkel dit HRP- gelabeld secundair antilichaam. Men vond opnieuw naast de zware en lichte ketens

van de IgG’s de typische formatie spots rond MG 20- 30 kDa (zie FIG. 4.4 rechts).

4.5. VERGELIJKING TUSSEN INDIVIDUELE PATIËNTEN CCP - EN CCP +

Tot nog toe werd gewerkt met een pool van patiënten en werd bewezen dat zowel fibrinogeen β als

vimentine gecitrullineerd aanwezig waren in IC in SF van deze RA- patiënten.

In volgend proefopzet werd getracht na te gaan of de gevonden resultaten patiëntafhankelijk waren of

konden worden doorgetrokken naar elke patiënt. Ook werd nagegaan of er een wezenlijk verschil

zichtbaar was tussen CCP - en CCP + patiënten.

49

Er werd gewerkt met zes verschillende patiënten, waarvan drie patiënten CCP - waren, de drie andere

waren CCP +. Alle patiënten waren ook RF positief, op patiënt 6 na (TABEL 4.5).

TABEL 4.5: VERGELIJKING CCP + EN CCP - RA- PATIËNTEN

Patiënt 1 (CCP+) 2 (CCP+) 3 (CCP+) 4 (CCP- ) 5 (CCP- ) 6 (CCP- )

CCP 1600 1600 767 10 1 1,1

RF 160 160 10240 160 80 0

Vooreerst werd een IP gedaan, gevolgd door acetonprecipitatie. Verder werden 2D gels gelopen die

vervolgens werden geblot op een nitrocellulosemembraan. Ook deze blots werden onderworpen aan

immunodetectie. Om toevalligheden uit te schakelen werd de volgorde van de antilichamen opnieuw

aangepast.

De zes blots werden achtereenvolgens onderworpen aan immunodetectie met anti- fibrinogeen γ, anti-

fibrinogeen β, anti- vimentine en tenslotte met anti- fibronectine. Hieruit bleek dat fibrinogeen γ,

fibrinogeen β en fibronectine bij alle patiënten aanwezig waren. Echter vimentine kon slechts bij twee

patiënten, namelijk patiënt 1 en 2, worden gedetecteerd.

Meer zelfs, het aanwezige vimentine bleek bij deze patiënten na AMC- kleuring ook gecitrullineerd te

zijn. Aanwezigheid van gecitrullineerd fibrinogeen β kon bij geen enkele patiënt worden aangetoond.

Er kon niet worden gesteld dat de CCP + patiënten, in tegenstelling tot de CCP - patiënten, allen

gecitrullineerde eiwitten in hun IC hadden. Maar de twee patiënten waar dit wel werd gezien bleken een

veel hogere CCP- en lagere RF waarde te bezitten ten opzichte van de andere patiënten. Dit leek dus

een mogelijk verklaring voor hun verschillend resultaat met de rest van de patiënten. Aanwezigheid van

gecitrullineerde antigenen/lichaamseigen proteïnen bleek dus patiëntafhankelijk en kwam enkel voor bij

CCP + patiënten.

50

5. DISCUSSIE

De vergelijking tussen RA serum en RA SF, betreft de aanwezigheid van gecitrullineerde antigenen,

werd reeds eerder onderzocht; maar vanuit een ander opzicht. Hierbij werd enkel naar solubele

antigenen gekeken en niet zozeer naar immuuncomplexen. Zo toonde Takizawa et al. (2006) in een

vergelijkende studie van RA SF met OA SF en RA serum gecitrullineerd fibrinogeen aan als solubel

antigen enkel in RA SF en niet in OA SF of RA serum. Tabushi et al. (2008) detecteerde naast

gecitrullineerd fibrinogeen ook gecitrullineerd fibronectine én gecitrullineerd vimentine als solubele

eiwitten in RA SF.

Sawada et al. (2008) kon met behulp van C1q ELISA aantonen dat er geen gecitrullineerde antigenen

aanwezig waren in IC in RA serum, maar wel in RA SF. Zij vonden gecitrullineerd fibronectine als

antigen in RA SF.

Ook in onze pool, van zowel CCP + als CCP - RA- patiënten, kon citrullinatie in IC in serum niet worden

aangetoond. Terwijl dit wel het geval was in IC van de pool van RA SF. Zo zagen we, na scheiding van

de IC- eiwitten met 1D SDS- PAGE, duidelijke bandjes ter hoogte van 50 kD en boven de 150kD, wat

vermoedelijk overeenkomt met respectievelijk gecitrullineerd fibrinogeen en/of gecitrullineerd vimentine

en mogelijks ook gecitrullineerd fibronectine. Echter na een twee- dimensionale scheiding van de

proteïnen konden de gecitrullineerde spots boven 150 kDa niet meer worden aangetoond. Mogelijks viel

dit net onder de detectielimiet door de bredere spreiding van het eiwit ten gevolge van de scheiding in 2

dimensies.

Met een gelijkaardig proefopzet werden de gevonden resultaten van IC in RA SF geconfirmeerd. Hieruit

bleek duidelijk dat opnieuw enkel gecitrullineerd fibrinogeen en gecitrullineerd vimentine aanwezig

waren in deze pool van RA SF.

Dit alles stond lijnrecht tegenover de bevindingen van Zhao et al. (2008). Zij toonden namelijk met

behulp van C1q ELISA gecitrullineerd fibrinogeen aan in IC in 50% van RA CCP + serum.

Een mogelijke verklaring voor dit verschil in resultaten tussen serum en SF van RA patiënten, ligt in het

feit dat voor de opzuivering van IC een andere techniek werd gebruikt.

51

In een volgend experiment werd nog nagegaan of er zich een verschil voordoet in deze gevonden

resultaten tussen CCP + en CCP - RA- patiënten. Zes patiënten, waarvan 3 CCP + en 3 CCP - , werden

achtereenvolgens onderworpen aan immunodetectie en AMC- kleuring.

Hieruit bleek dat 2 van de 3 CCP + patiënten gecitrullineerd vimentine in hun SF vertoonden. De derde

CCP + patiënt vertoonde slechts een heel lichte kleuring ter hoogte van dit eiwit bij de AMC detectie.

Een mogelijke verklaring hiervoor was zowel het verschil in CCP waarde als het grote verschil in RF

waarde van de twee eerste patiënten ten opzichte van deze derde patiënt. Wanneer namelijk een IP

met proteïne G wordt uitgevoerd, worden alle IgG’s (zowel vrije als gebonden in IC) opgezuiverd. Dit wil

zeggen dat wanneer een patiënt een zeer grote RF waarde (IgG- IgM complexen) bezit, deze in 100 µg

staal veel meer IgG’s zal hebben dan eiwitten in de IC. Dit kan er dus voor gezorgd hebben dat een vals

negatief beeld bekomen werd voor deze derde persoon, welke een RF waarde bezit die meer dan 60

keer groter is dan deze van de andere twee CCP + patiënten. Een tweede verklaring kan zijn dat het

negatief beeld bekomen werd doordat de CCP waarde van deze patiënt slechts de helft is van deze van

de twee andere.

Om hierover duidelijkheid te krijgen zou men in de toekomst na IP met proteïne G kunnen werken met

een zelfde aantal µl voor elke patiënt ipv een zelfde aantal µg. Op deze manier zou het grote aandeel

aan IgG’s door de hoge RF waarde beperkt moeten worden.

Bij de CCP - RA- patiënten kon geen citrullinatie worden gedetecteerd. Mogelijks wijst dit dus op een

degelijk verschil tussen CCP - en CCP + patiënten. Echter om dit te confirmeren moet een grotere

populatie RA- patiënten worden onderworpen aan immunodetectie, gevolgd door AMC- kleuring.

Ook patiëntafhankelijke en mogelijk ziektestatus gebonden resultaten kunnen worden vermeden door

dit proefopzet te herhalen met een grotere populatie RA- patiënten.

52

6. CONCLUSIE

Inflammatie bij RA wordt onder meer veroorzaakt door IC die het complement activeren. Het was dus

belangrijk om deze IC grondig te bestuderen. Dit werd gedaan door met behulp van proteïne G een

immunoprecipitatie uit te voeren. Op deze manier werden alle IgG’s, zowel de vrije als deze in IC,

opgezuiverd.

Aangezien in de literatuur wordt gesproken over fibrinogeen, fibronectine en vimentine als solubele

antigenen in het gewricht, was een eerste doel van dit onderzoek het aantonen van de aanwezigheid

van deze eiwitten in de (inflammatoire) IC die werden opgezuiverd. Met behulp van immunodetectie kon

worden aangetoond dat al deze eiwitten aanwezig waren in IC in het SF van RA- patiënten. Echter in IC

uit het serum van deze patiënten en in IC uit gezond serum kon dit niet worden aangetoond.

Men vermoedt ook dat ACPA’s betrokken zijn in de specifieke immuunrespons in RA. Het is dus een

interessante theorie dat deze ACPA’s aanwezig zouden zijn in immuuncomplexen en dat de antigenen

dus gecitrullineerde eiwitten zijn.

Een tweede doel was dus citrullinatie in de opgezuiverde IC opsporen, meer bepaald citrullinatie van de

gedetecteerde proteïnen in het eerste proefopzet. Hiervoor werd gebruik gemaakt van AMC- kleuring na

1D gelelektroforese, welke aangaf dat gecitrullineerde eiwitten te vinden waren in IC van het SF van

RA- patiënten ter hoogte van 50 kDa en boven de 150 kDa, maar niet in IC uit het serum van deze

patiënten.

Vervolgens werden de IC uit RA SF, RA serum en gezond serum met elkaar vergeleken na 2D

gelelektroforese. Echter na 2 dimensionale scheiding, zowel volgens IEF als MG, kon de aanwezigheid

van gecitrullineerd fibrinogeen en gecitrullineerd vimentine (beide rond 50 kDa) worden aangetoond bij

IC uit RA SF. Citrullinatie boven een moleculair gewicht van 150 kDa (vermoedelijk fibronectine) was

echter niet meer zichtbaar. Bij IC uit gezond serum en RA serum kon zo goed als geen citrullinatie meer

gedetecteerd worden.

Nu bevestigd werd dat gecitrullineerde lichaamseigen proteïnen, fibrinogeen en vimentine, mogelijke

antigenen zijn voor ACPA’s, is het nog belangrijk om in een laatste proefopzet na te gaan of er

verschillen kunnen worden aangetoond in deze resultaten tussen CCP - en CCP + RA- patiënten.

53

Met behulp van zes verschillende patiënten, waaronder evenveel CCP - als CCP +, kon vorige

proefopzet werden herhaald.

Hieruit kon worden geconcludeerd dat alle patiënten de lichaamseigen eiwitten bevatten in hun IC, maar

dat slechts 2/3 van de CCP + patiënten gecitrullineerd vimentine in IC in hun SF bevatten.

Gecitrullineerd fibrinogeen, dat in een pool van CCP - en CCP + patiënten, kon worden aangetoond,

werd niet meer gedetecteerd bij de individuele patiënten. In IC van SF van de CCP - patiënten konden

nergens gecitrullineerde antigenen gedetecteerd worden. Mogelijks zijn deze resultaten

patiëntafhankelijk of zelfs afhankelijk van de ziektestatus.

54

7. LITERATUURLIJST

Chang, X.; Yamada, R.; Suzuki, A.; Kochi, Y.; Sawada, T.; Yamamoto, K. (2005). Citrullination of fibronectin in rheumatoid arthritis synovial tissue. Rheumatology, 44, 1374-1382 György, B.; Tóth, E.; Tarcsa, E.; Falus, A.; buzás, E.I. (2006). Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 38, 1662- 1677 (review)

http://64.143.176.9/library/healthguide/en- us/images/media/medical/hw/h9991226.jpg (15 mei 2009)

http://edoc.hu- berlin.de/dissertationen/zabel- claus- 2003- 01- 17/HTML/zabel_html_750d62da.jpg (15 mei 2009)

http://en.wikipedia.org/wiki/File:PBB_Protein_FN1_image.jpg (15 mei 2009)

http://en.wikipedia.org/wiki/File:PBB_Protein_VIM_image.jpg (15 mei 2009) http://mullinslab.ucsf.edu/protocols/html/SDS_PAGE_protocol.htm (15 mei 2009)

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/26/T- cell_dependent_b- cell_act.jpg (15 mei 2009)

http://web.chemistry.gatech.edu/~williams/bCourse_Information/4581/techniques/gel_elect/gel.jpg (15 mei 2009) http://www.abcam.com/Fibrinogen-gamma-chain-antibody-ab62527.html (15 mei 2009) http://www.abcam.com/technical (15 mei 2009)

http://www.bio- rad.com/cmc_upload/Literature/202781/Bulletin_5478A.pdf (15 mei 2009)

http://www.bio.davidson.edu/courses/immunology (15 mei 2009)

http://www.bio.davidson.edu/courses/immunology/Students/spring2006/Dresser/RA.html (15 mei 2009)

http://www.bmsc.washington.edu/people/teller/fig1.gif (15 mei 2009) http://www.millipore.com (15 mei 2009)

http://www.niams.nih.gov/Health_Info/Rheumatic_Disease (15 mei 2009) http://www.piercenet.com/files/compapchart.pdf (15 mei 2009)

http://www.rpv- gorinchem.nl/wat_is_reuma.htm (15 mei 2009) http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/datasheet2/f3648dat.Par.0001.File.tmp/f3648dat.pdf (15 mei 2009)

55

http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/datasheet2/f3648dat.Par.0001.File.tmp/f3648dat.pdf (15 mei 2009) http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/datasheet5/s4942dat.Par.0001.File.tmp/s4942dat.pdf (15 mei 2009) http://www.thermo.com/pierce (15 mei 2009) http://www3.bio-rad.com/cmc_upload/Literature/13023/4006173B-wMS.pdf (15 mei 2009)

http://z.about.com/f/p/440/graphics/images/en/17128.jpg (15 mei 2009) Janeway, C.A.; Travers, P.; Walport, M.; Shlomchik, M. (2001). Immuno biology 5, The immune system in health and disease. Garland Publishing, a member of the Taylor & Francis Group, NY Klareskog, L.; Rönnelid, J.; Lundberg,K.; Padyukov, L.; Alfredsson, L. (2008). Immunity to Citrullinated Proteïns in Rheumatoid Arthritis. Annu. Rev. Immunol., 26, 651-75 Nakayama-Hadama, M.; Suzuki, A.; Furukawa, H.; Yamada, R.; Yamamoto, K. (2008). Citrullinated Fibrinogen Inhibits Thrombin-catalysed Fibrin Polymerization. J. Biochem., 144, 393-398 Sawada, T.; Hashimoto, S.; Kanzaki T.; Suzuki, A.; Yamada, R.; Shoji, A.; Hayashi, H.; Tahara, K.; Yamamoto, K. (2008). Identification of Citrullinated Antigen as Component of Immune Complex in Synovial Fluids from Patients with Rheumatoid Arthritis Sawada, T.; Hashimoto, S.; Kanzaki, T.; Suzuki, A.; Yamada, R.; Shoji, A.; Hayashi, H.; Tahara, K.; Yamamoto, K. (2008). Identification of Citrullinated Antigen as Component of Immune Complex in Synovial Fluids from Patients with Rheumatoid Arthritis. Arthritis & Rheumatism, 58 (9). Sigma Aldrich, product information Smith, J.B.; M.D.; Haynes M.K. (2002). Rheumatoid Arthritis – A Molecular Understanding. Ann Intern Med., 136, 908-922 (review) Tabushi, Y.; Nakanishi, T.; Takeuchi, T.; Nakajima, M.; Ueda, K.; Kotani, T.; Makino, S.; Shimizu, A.; Hanafusa, T.; Takubo, T. (2008). Detection of citrullinated proteins in synovial fluids derived from patients with rheumatoid arthritis by proteomics-based analysis. Ann Clin Biochem, 45, 413-417 Takizawa, Y.; Suzuki, A.; Sawada, T.; Ohsaka, M.; Inoue, T.; Yamada, R.; Yamamoto, K. (2006). Citrullinated fibrinogen detected as a soluble citrullinated autoantigen in rheumatoid arthritis synovial fluids. Ann Rheum Dis, 65, 1013-1020 Tilleman, K.; Deforce, D.; Elewaut, D. (2005). Rheumatology: a close encounter with proteomics. Rheumatology, 44, 1217-1226 (review). Tilleman, K.; Van Steendam, K.; Cantaert, T.; De Keyser, F.; Elewaut, D.; Deforce, D. (2008). Synovial detection and autoantibody reactivity of processed citrullinated isoforms of vimentin in inflammatory arthritides. Rheumatology, 47 (5), 597 – 604.

56

van Venrooij, W.J.; Pruijn, G.J.M. (2008). An important step towards completing the rheumatoid arthritis cycle. Arthritis Research & Therapy, 10 (5), 117-119 (editorial) Vincent, C.; Nogueira, L.; Clavel, C.; Sebbag, M.; Serre, G. (2005). Autoantibodies to citrullinated proteins: ACPA. Autoimmunity, 38 (1), 17-24 Vossenaar, E.R.; van Venrooij, W. (2004). Citrullinated proteins: sparks that may ignite the fire in rheumatoid arthritis. Arthritis Research & Therapy, 6 (3), 107-111 (commentary) Weissmann, G.; M.D. (2004). Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. J Clin Rheumatol, 10, S26-S31 Weissmann, G.; M.D.; M.A.C.R. (2006). The pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Bulletin of the NYU Hospital for Joint Diseases, 64 (1&2), 12-15 Wijelath, E.S.; Murray, J.; Rahman, S. (2002). Novel vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res, 91, 25-31 Yasuda, T.; Kakinuma, T.; Julovi, S.M. (2004). COOH-terminal heparin-binding fibronectin fragment induces nitric oxide production in rheumatoid cartilage through CD44. Rheumatology, 43, 1116-20 Yasuda, T.; Nakagawa, T.; Julovi, S.M.; Nakamura T. (2003 a). Matrix metalloproteinase production by COOH-terminal heparin-binding fibronectin fragment in rheumatoid synovial cells. Lab Invest, 83, 153-62 Yasuda, T.; Poole, A.R.; Shimizu, M. (2003 b). Involvement of CD44 in induction of matrix metalloproteinases by a COOH-terminal heparin-binding fragment of fibronectin in human articular cartilage in culture. Arthritis Rheum, 48, 1271-80 Zhao, X.; Okeke, N. L.; Sharpe, O.; Batliwalla, F. M.; Lee, A. T.; Ho, P. P.; Tomooka, B. H.; Gregersen, P. K.; Robinson, W. H. (2008). Circulating immune complexes contain citrullinated fibrinogen in rheumatoid arthritis. Arthritis Research & Therapy, 10 (4).

IDENTIFICATIE VAN ANTIGENEN AANWEZIG IN...

Documents

Transcript of IDENTIFICATIE VAN ANTIGENEN AANWEZIG IN...