HALFJAARLIJKS INFOBLAD - NR. 9 JANUARI 2013 Labinfo · 2014. 3. 11. · Het budgettair en...
46
Labinfo NATIONALE REFERENTIE LABORATORIA NRL Informatieblad voor de erkende laboratoria voedselveiligheid HALFJAARLIJKS INFOBLAD - NR. 9 JANUARI 2013 FAVV AC-Kruidtuin - Food Safety Center Kruidtuinlaan 55, 1000 Brussel Verantwoordelijke uitgever : Gil Houins p. 4 MLVA: een waardevolle epidemiologische tool ? p. 8 Implementatie van RT-PCR in het FLVVT in het kader van het TSE stappenplan p. 12 GC-MS/MS als een nieuwe mogelijkheid voor de bevestiging van analyses op de aanwezigheid van PCDD/Fs en DL-PCBs in food en feed p. 16 Tankmelk, een bijkomende matrix voor de opsporing en uitroeiing van IBR in rundveebedrijven. p. 20 Materialen uit kunststof bestemd voor direct contact met voeding: Wat is de impact voor de laboratoria van de recente Verordening (EU) 10/2011? p. 25 Nieuwe technieken en methoden ontwikkeld door het Belgische NRL-GGO voor het identificeren van niet-geautoriseerde GGO’s in het UGMMONITOR project p. 28 Screening van residuen van bestrijdingsmiddelen door time-of-flight analysatoren (ToF): Mythe of realiteit? p. 35 Inleiding tot het FP7 – QBOL onderzoeksproject p. 43 Workshops & Symposia
Transcript of HALFJAARLIJKS INFOBLAD - NR. 9 JANUARI 2013 Labinfo · 2014. 3. 11. · Het budgettair en...
Labinfo
LNRN A T I O N A L ER E F E R E N T I ELABORATORIA
L A B O R ATO I R E SN A T I O N A U XD E R E F E R E N C ENRLN A T I O N A L
R E F E R E N C ELABORATORIESNRL
Informatieblad voor de erkende laboratoria voedselveiligheid
HALFJAARLIJKS INFOBLAD - NR. 9 JANUARI 2013
FAVV AC-Kruidtuin - Food Safety CenterKruidtuinlaan 55,1000 Brussel
Vera
ntw
oord
elijk
e ui
tgev
er :
Gil
Hou
ins
p. 4 MLVA: een waardevolle epidemiologische tool ?
p. 8 Implementatie van RT-PCR in het FLVVT in het kader van het TSE stappenplan
p. 12 GC-MS/MS als een nieuwe mogelijkheid voor de bevestiging van analyses op de aanwezigheid van PCDD/Fs en DL-PCBs in food en feed
p. 16 Tankmelk, een bijkomende matrix voor de opsporing en uitroeiing van IBR in rundveebedrijven.
p. 20 Materialen uit kunststof bestemd voor direct contact met voeding: Wat is de impact voor de laboratoria van de recente Verordening (EU) 10/2011?
p. 25 Nieuwe technieken en methoden ontwikkeld door het Belgische NRL-GGO voor het identifi ceren van niet-geautoriseerde GGO’s in het UGMMONITOR project
p. 28 Screening van residuen van bestrijdingsmiddelen door time-of-fl ight analysatoren (ToF): Mythe of realiteit?
p. 35 Inleiding tot het FP7 – QBOL onderzoeksproject
p. 43 Workshops & Symposia
2
LabInfoInformatieblad voor de erkende laboratoria voedselveiligheid
RedactiegroepDirk Courtheyn, Mieke De Mits, Conny De Schepper, Alain Dubois, Marc Evrard, Alain Laure, Bert Vandenborre, Mieke Van de Wiele, Eva Wevers en Marie-Christine Wilem
Auteurs van dit nummerGeert De Poorter, Geertrui Rasschaert, Koen de Reu, Marc Heyndrickx, Jeroen Vancutsem, Ruth Vanhoof, Mandy Lekens, Gauthier Eppe, Jean-François Focant, Jean-Baptiste Hanon, Brigitte Caij, Els Van Hoeck, Tina N’Goy, Caroline Evrard, Fabien Bolle, Marie-Alice Fraiture, Philippe Herman, Gilbert Berben, Frédéric Debode, Eric Janssen, Isabel Taverniers, Marc De Loose, Nancy Roosens, Laure Joly, Vincent Hanot en Martine Maes VertalingVertaaldienst van het AgentschapRedactiegroep
Foto’s en illustratiesAangebracht door de laboratoria
VormgevingGert Van Kerckhove
RedactieadresLabInfop.a. D. CourtheynFAVVAC-Kruidtuin – Food Safety Center4de verdieping, bureel K04/120218Kruidtuinlaan 551000 BrusselTel.: [email protected]
LNRN A T I O N A L ER E F E R E N T I ELABORATORIA
L A B O R ATO I R E SN A T I O N A U XD E R E F E R E N C ENRLN A T I O N A L
R E F E R E N C ELABORATORIESNRL
32
Beste lezer,
Het budgettair en economisch moeilijke jaar 2012 ligt achter ons. Traditiegetrouw werd het jaareinde door het merendeel onder ons afgesloten met feesten en een blik op de toekomst.
Wat 2013 ons zal brengen is een raadsel. Op economisch vlak is het einde van de tunnel bijlange nog niet in zicht. Dit mag echter niet betekenen dat we bij de pakken moeten blijven zitten. We dienen onze sterktes voluit uit te spelen en niet nalaten deze te belich-ten; en in de laboratoriumwereld zijn onze analytische sterktes zonder twijfel onze flexibili-teit, onze enorme knowhow, en bovenal een breed gala aan mogelijke analyses waarmee we alle bestaande en nieuw opduikende voedselbedreigingen de baas kunnen.
Met het nieuwe Koninklijk Besluit op de erkenningen van de laboratoria is er een mo-derne toekomstgerichte wettelijke basis gecreëerd die onafhankelijke laboratoria moet toelaten om een niet onaardig deel van het jaarlijkse controleprogramma van het FAVV uit te voeren. Dit vertegenwoordigt een waarde van meer dan 3 miljoen €. Samen met de autocontrole markt zijn dit de twee preferentiële markten waarop de externe private labs zich dienen te richten.
2013 zal ook het jaar zijn waarin het FAVV stopt met het systematisch testen van runderen op BSE. Na twaalf jaar, na meer dan 130 miljoen € aan analysekosten valt het doek ein-delijk. De “TSE-weg” was lang en moeizaam maar de bestrijding van TSE heeft resultaten afgeworpen waarop alle TSE laboratoria terecht trots mogen zijn. Het is duidelijk dat de samenwerking tussen de overheid en de private sector in dit domein een voorbeeld is van een geslaagde PPS constructie.
Er werden ook nieuwe NRL’s aangesteld in verschillende domeinen van de scheikunde, dit in het overeenstemming met Verordening EG 882/2004. De wet op de overheidsopdrach-ten werd hiervoor toegepast en het moet mij van het hart dat dit een enorme administra-tieve lijdensweg was. Objectivering en transparantie zijn blijkbaar moeilijk te verzoenen met snelheid en pragmatisme.
Ik toast op een goede samenwerking, veel leesgenot van de Labinfo nummers en bovenal wens ik u en uw dierbaren een goede gezondheid toe.
Geert De PoorterDirecteur-generaal Laboratoria
Editoriaal
4
MLVA: een waardevolle epidemiologische tool ?Geertrui Rasschaert, Koen De Reu en Marc Heyndrickx
ILVO-T&V, Instituut voor Landbouw en Visserij Onderzoek – Eenheid Technologie en Voeding, Brusselsesteenweg 370, B-9090 Melle
Sinds enkele jaren is MLVA een nieuwe tool in epidemiologisch onderzoek. In dit artikel wordt ingegaan op het principe van MLVA, de voor- en nadelen van de techniek en enkele voorbeelden. MLVA staat voor ‘multi-locus variable number of tandem repeats assay’. De techniek is gebaseerd op de natuurlijke variatie in het aantal tandem herhaalde DNA sequenties dat voorkomt op vele verschillende plaatsen, de zg. loci, in het genoom van vele bacteriën. Tandem herhalingen zijn kop-aan-staart herhalingen van een DNA sequentie-motief. Een MLVA houdt in dat het aantal herhalingen voor een aantal loci bepaald wordt. Zo bekomt men een numerieke code, bv. 5-3-7-4, zoals weergegeven in Figuur 1. Het eerste cijfer slaat op het aantal herhalingen van het eerste DNA sequentie motief voor het eerste onderzochte locus, het tweede cijfer op het aantal herhalingen van het tweede DNA sequentiemotief voor het tweede onderzochte locus, enzovoort … Deze variatie in herha-lingen wordt veroorzaakt doordat het Taq polymerase bepaalde segmenten foutief kopieert tijdens ‘slipped strand mispairing’. Het Taq polymerase blijft als het ware haperen in bepaalde regio’s van het genoom waardoor be-paalde sequenties gedupliceerd of verwijderd worden. Zulke fouten gebeuren heel snel, vandaar dat MLVA eerder snelle evoluties van een bacteriële populatie in kaart brengt.
A.
B.
locus1 locus2 locus3 locus4
Stam A: 5-3-7-4
Stam B: 3-4-9-2
Figuur 1:(A) Een voorbeeld van het aantal tandem herhalingen van vier loci van twee bacteriële stammen,(B) de gel die men bekomt wanneer men MLVA gebruikt om deze twee stammen te typeren.
54
Praktisch gezien wordt eerst een multiplex PCR uitgevoerd, waarbij het DNA van een vijf à zes loci geamplificeerd wordt. Vervolgens wordt de lengte van de verschillende fragmenten in het PCR product heel precies bepaald via capillaire electroforese. Wanneer men de lengte van zo een herhalend element kent, kan men het aantal herhalin-gen berekenen. Dit wordt automatisch gedaan via gespecialiseerde software zoals BioNumerics.
Het grootste voordeel van deze techniek is het goede discriminerende vermogen. Het is vaak ongeveer even discriminerend als pulsed field-gel electroforese (PFGE), die over het algemeen als de gouden standaard wordt beschouwd om isolaten van elkaar te gaan onderscheiden. Bovendien is de techniek sneller en minder arbeidsin-tensief dan PFGE. Men kan de bekomen data, net zoals de klassieke typeringsmethoden, visualiseren met dendro-grammen maar ook met ‘minimum spanning trees’ (MST) die gebruikt worden om evolutionaire verwantschap-pen te visualiseren. Nadelen van deze techniek zijn dat het voor elk species, serotype, …. opnieuw geoptimaliseerd moet worden, wat vrij veel tijd in beslag neemt. Zo moeten de juiste primers gekozen worden, de multiplex PCR moet geopti-maliseerd worden, de capillaire electroforese moet op punt gesteld worden. Voor bepaalde bacteriën zoals E. coli O157, Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis bestaan er echter reeds internationale protocols en kan men zijn bekomen resultaten vergelijken met online databanken. Op het Instituut voor Landbouw en Visserij Onderzoek (ILVO), eenheid Technologie en Voeding is voor zowel MRSA ST398 als voor Salmonella Enteritidis een MLVA ontwikkeld en succesvol toegepast. MRSA ST398, de zoge-naamde landbouw-geassocieerde MRSA, wordt sinds een aantal jaar vaak bij varkens geïsoleerd. Het doctoraats-onderzoek van M. Verhegghe had o.a. als doelstelling om de variatie van MRSA ST398 op een bedrijf te onderzoe-ken, om na te gaan of biggen gekoloniseerd worden door hun moeder en of een varken heel zijn leven drager blijft van hetzelfde MRSA ST398 type. Hiervoor werden op een aantal bedrijven zeugen in de kraamstal en hun biggen vanaf geboorte tot slachtleeftijd op regelmatige basis bemonsterd en werden de bekomen MRSA ST398 isolaten getypeerd a.d.h.v. MLVA. Hieruit bleek dat binnen elk bedrijf een grote variëteit aan MRSA ST398 types kon teruggevonden worden, dat de biggen slechts zelden gekoloniseerd waren met hetzelfde MRSA ST398 type als hun moeder en dat ze drager konden zijn van verschillende types doorheen hun leven. In het dendrogram (Fi-guur 2) wordt de MLVA types getoond van een zeug (sow3) en drie van haar biggen (pig 23, pig 24, en pig 26). De zeug was op dag 3, dag 6 en dag 20 na werpen telkens gekoloniseerd met een ander MLVA type en haar biggen waren op geen enkel moment gekoloniseerd met een MLVA type afkomstig van de moederzeug.
6
Figuur 2: Dendrogram van de MRSA ST398 MLVA types van één zeug (sow 3) bemonsterd op regelmatige tijdstippen in de kraamstal en drie van haar biggen (pig 23, pig 24, pig 26) bemonsterd vanaf drie dagen na geboorte tot slachtleeftijd waarbij d slaat op aantal dagen na het werpen.
In het doctoraat van I. Dewaele over Salmonella Enteritidis op persisterende Salmonella positieve leghennen bedrijven werd een MLVA geoptimaliseerd ten einde contaminatiebronnen en –routes op dergelijke bedrijven in kaart te brengen. Er werden een vijftal probleembedrijven gedurende drie opeenvolgende legrondes opgevolgd. In tegenstelling tot bovenstaand voorbeeld, bleek het aantal verschillende MLVA types op de meeste bedrijven vrij beperkt en dat vooral in het eierlokaal andere types circuleerden dan in de legstallen. Dit wordt gevisualiseerd in Figuur 3 aan de hand van een minimum spanning tree. Hier stelt elke cirkel één MLVA type voor, hoe groter de cirkel hoe meer isolaten behoren tot dit MLVA type. De grootste cirkel stelt het ancestrale type voor, waarvan de andere types afgeleid zijn. De lengte van de ‘takken’ stelt de evolutionaire afstand t.o.v. de andere MLVA types voor. De kleuren zijn in dit voorbeeld gekozen in functie van de verschillende bemonsterde plaatsen.
VNTR_vals
100
50
VNTR_vals
ClfA
ClfB
sdrC
sdrE
SIRU
33.0 55.0 36.0 6.0 3.0
34.0 58.0 36.0 6.0 3.0
32.0 54.0 34.0 6.0 3.0
33.0 57.0 37.0 1.0 3.0
33.0 57.0 37.0 6.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 36.0 7.0 3.0
33.0 57.0 36.0 7.0 3.0
33.0 57.0 36.0 4.0 3.0
33.0 58.0 36.0 7.0 3.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 58.0 38.0 8.0 4.0
34.0 58.0 38.0 8.0 3.0
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
pig 23, d27
pig 24, d27
pig 23, d3
sow 3, d3
sow 3, d6
pig 24, d35
pig 26, d35
pig 24, d48
pig 26, d48
pig 24, d62
pig 23, d77
pig 23, d108
pig 23, d159
pig 26, d159
pig 23, d6
pig 26, d27
sow 3, d20
pig 24, d77
pig 24, d3
pig 24, d6
pig 26, d6
pig 23, d20
pig 24, d20
pig 26, d20
pig 23, d35
pig 23, d48
pig 23, d62
pig 26, d77
pig 24, d108
pig 26, d108
pig 24, d159
pig 26, d62
pig 26, d3
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
VNTR_vals
100
50
VNTR_vals
ClfA
ClfB
sdrC
sdrE
SIRU
33.0 55.0 36.0 6.0 3.0
34.0 58.0 36.0 6.0 3.0
32.0 54.0 34.0 6.0 3.0
33.0 57.0 37.0 1.0 3.0
33.0 57.0 37.0 6.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 37.0 7.0 3.0
33.0 57.0 36.0 7.0 3.0
33.0 57.0 36.0 7.0 3.0
33.0 57.0 36.0 4.0 3.0
33.0 58.0 36.0 7.0 3.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 59.0 38.0 8.0 4.0
34.0 58.0 38.0 8.0 4.0
34.0 58.0 38.0 8.0 3.0
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
pig 23, d27
pig 24, d27
pig 23, d3
sow 3, d3
sow 3, d6
pig 24, d35
pig 26, d35
pig 24, d48
pig 26, d48
pig 24, d62
pig 23, d77
pig 23, d108
pig 23, d159
pig 26, d159
pig 23, d6
pig 26, d27
sow 3, d20
pig 24, d77
pig 24, d3
pig 24, d6
pig 26, d6
pig 23, d20
pig 24, d20
pig 26, d20
pig 23, d35
pig 23, d48
pig 23, d62
pig 26, d77
pig 24, d108
pig 26, d108
pig 24, d159
pig 26, d62
pig 26, d3
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Figuur 2: Dendrogram van de MRSA ST398 MLVA types van één zeug (sow 3) bemonsterd op regelmatige tijdstip-pen in de kraamstal en drie van haar biggen (pig 23, pig 24, pig 26) bemonsterd vanaf drie dagen na geboorte tot slachtleeftijd waarbij d slaat op aantal dagen na het werpen.
In het doctoraat van I. Dewaele over Salmonella Enteritidis op persisterende Salmonella positieve leghennen bedrijven werd een MLVA geoptimaliseerd ten einde contaminatiebronnen en –routes op dergelijke bedrijven in kaart te brengen. Er werden een vijftal probleembedrijven gedurende drie opeenvolgende legrondes opgevolgd. In tegenstelling tot bovenstaand voorbeeld, bleek het aantal verschillende MLVA types op de meeste bedrijven vrij beperkt en dat vooral in het eierlokaal andere types circuleerden dan in de legstallen. Dit wordt gevisualiseerd in Figuur 3 aan de hand van een minimum spanning tree. Hier stelt elke cirkel één MLVA type voor, hoe groter de cirkel hoe meer isolaten behoren tot dit MLVA type. De grootste cirkel stelt het ancestrale type voor, waarvan de andere types afgeleid zijn. De lengte van de ‘takken’ stelt de evolutionaire afstand t.o.v. de andere MLVA types voor. De kleuren zijn in dit voorbeeld gekozen in functie van de verschillende bemonsterde plaatsen.
76
Figuur 3: Minimum spanning tree van MLVA van een Salmonella Enteritidis persisterend leghennen bedrijf. Elke cirkel stelt één MLVA type voor, waarbij de grootte evenredig is met het aantal isolaten. Elke kleur stelt een andere bemonsterde plaats voor (blauw: buitenomgeving; groen: eierlokaal; rood: legstal 1; geel: legstal 2; paars: legstal 3).
Men kan besluiten dat een MLVA optimaliseren veel tijd kost, maar dat eens het op punt staat, het wel een snelle tool is om een groot aantal isolaten te karakteriseren. Bijkomend voordeel is dat men MST kan gebruiken om op een meer biologische manier resultaten te visualiseren.
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
Out
side
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
A
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
EC
AE
CA
8
Implementatie van RT-PCR in het FLVVT in het kader van het TSE stappenplanJ. Vancutsem, R. Vanhoof en M. Lekens (FLVVT, Tervuren)
In het tweede stappenplan voor TSE (overdraagbare spongioforme encefalopathie) dat op 16 juli 2010 gepubli-ceerd werd, werd het kader geschetst van mogelijke wijzigingen van TSE-maatregelen in de EU voor de periode 2010-2015. De meeste geplande maatregelen van het eerste TSE-stappenplan voor de korte en middellange termijn zijn intussen verwezenlijkt en de positieve trend die in 2005 werd waargenomen, heeft zich verder door-gezet. Eén van de actiedoelstellingen in het tweede stappenplan is een verdere versoepeling van het voederver-bod uit 2001 omdat verwerkte dierlijke eiwitten (VDE) een belangrijke bron van hoogwaardige eiwitten zijn. Op dit ogenblik is het gebruik van VDE, met uitzondering van vismeel, verboden voor landbouwhuisdieren volgens Verordening 999/2001. Voor de versoepeling wordt gedacht aan het instellen van een tolerantieniveau voor VDE in diervoeders mits de ontwikkeling van voldoende betrouwbare kwantitatieve analyses en aan het opheffen van het voederverbod voor niet-herkauwers.In een eerste stap voor het versoepelen van het voederverbod werd een voorstel tot het toelaten van VDE van niet-herkauwers in visvoer ondersteund door de Europese lidstaten tijdens de stemming op 18 juli 2012 in het “Standing Committee on the Food Chain and Animal Health” (verslag beschikbaar op http://ec.europa.eu/food/committees/regulatory/scfcah/biosafety/sum_18072012_en.pdf ). Merk hierbij op dat het voorlopig enkel om vismeel gaat, maar dat het toelaten van VDE voor niet-herkauwers wel expliciet omschreven is in het stappenplan. Deze versoepeling is slechts mogelijk wanneer er gevalideerde analysemethoden beschikbaar zijn om vast te stel-len van welke diersoort de VDE afkomstig zijn (herkauwers, varkens, pluimvee). Ook zal de industrie investeringen moeten doen voor de gescheiden verwerking van de VDE van verschillende oorsprong.
Analysemethoden
Omdat het met microscopie niet mogelijk is om van de meeste aanwezige dierlijke bestanddelen zoals spierve-zels en botfragmenten de diersoort vast te stellen, kan voor de identificatie overgegaan worden op PCR. In 2010 werd de beslissing genomen om deze PCR-analyses te laten doorgaan in het FLVVT. Omdat deze analysetechniek nieuw was, nam het FLVVT in december 2010 deel aan een intensieve training georganiseerd door het EURL-AP. In 2011 werden voor deze analyse door het CODA twee extra analyseruimtes ter beschikking gesteld en werden een RT-PCR (real-time polymerase chain reaction)-toestel (Lightcycler 480 II) en een opzuiveringsrobot (MagMAX) aangekocht.
98
Afbeelding 1 en 2: RT-PCR-toestel (Lightcycler 480 II, links) en een opzuiveringsrobot (MagMAX, rechts)
In eerste instantie wordt gefocust op de detectie van DNA van herkauwers. Op dit moment zijn de methoden voor het opsporen van DNA van varkens en pluimvee nog in ontwikkeling. Het EURL-AP organiseerde in de periode december 2011 - februari 2012 een validatiestudie en in maart - mei 2012 een implementatietest voor de detectie van DNA van herkauwers waar het FLVVT aan deelnam. Deze test omvatte 10 monsters: 6 DNA-extracten en 4 diervoeders. Intussen werden in het FLVVT ook de eerste klantenmonsters geanalyseerd.
De PCR-analyse
De belangrijkste maatregel bij PCR-analyses is het vermijden van contaminatie. Tijdens de amplificatie wordt het DNA-materiaal miljoenen keren vermenigvuldigd en als dat DNA vrijkomt, kunnen monsters, laboruimtes,... on-bedoeld gecontamineerd worden met de doelsequenties. Daarom is er voor gezorgd dat alle stappen van de ana-lyse in verschillende afgesloten ruimtes plaatsvinden: het malen van het monster, het afwegen van het monster, extractie en opzuivering van het DNA, de plaatvoorbereiding en PCR. Bovendien worden werktafel en materiaal zowel voor als na de analyse grondig gereinigd met detergenten om DNA af te breken.Na het malen en afwegen van het monster wordt het DNA geëxtraheerd en opgezuiverd met een specifieke kit. Deze kit maakt gebruik van paramagnetische partikels waar het DNA aan bindt. Door een microcentrifugeerbuisje op een magnetische houder te plaatsen wordt in verschillende stappen met verschillende reagentia het DNA opgezuiverd en uiteindelijk geëlueerd. Dit kan ook geautomatiseerd met de robot gebeuren. Het opgezuiverde DNA is daarna klaar om op een PCR-plaat gezet te worden.
Implementatie van RT-PCR in het FLVVT in het kader van het TSE stappenplan J. Vancutsem, R. Vanhoof en M. Lekens (FLVVT, Tervuren) In het tweede stappenplan voor TSE (overdraagbare spongioforme encefalopathie) dat op 16 juli 2010 gepubliceerd werd, werd het kader geschetst van mogelijke wijzigingen van TSE-maatregelen in de EU voor de periode 2010-2015. De meeste geplande maatregelen van het eerste TSE-stappenplan voor de korte en middellange termijn zijn intussen verwezenlijkt en de positieve trend die in 2005 werd waargenomen, heeft zich verder doorgezet. Eén van de actiedoelstellingen in het tweede stappenplan is een verdere versoepeling van het voederverbod uit 2001 omdat verwerkte dierlijke eiwitten (VDE) een belangrijke bron van hoogwaardige eiwitten zijn. Op dit ogenblik is het gebruik van VDE, met uitzondering van vismeel, verboden voor landbouwhuisdieren volgens Verordening 999/2001. Voor de versoepeling wordt gedacht aan het instellen van een tolerantieniveau voor VDE in diervoeders mits de ontwikkeling van voldoende betrouwbare kwantitatieve analyses en aan het opheffen van het voederverbod voor niet-herkauwers. In een eerste stap voor het versoepelen van het voederverbod werd een voorstel tot het toelaten van VDE van niet-herkauwers in visvoer ondersteund door de Europese lidstaten tijdens de stemming op 18 juli 2012 in het “Standing Committee on the Food Chain and Animal Health” (verslag beschikbaar op http://ec.europa.eu/food/committees/regulatory/scfcah/biosafety/sum_18072012_en.pdf). Merk hierbij op dat het voorlopig enkel om vismeel gaat, maar dat het toelaten van VDE voor niet-herkauwers wel expliciet omschreven is in het stappenplan. Deze versoepeling is slechts mogelijk wanneer er gevalideerde analysemethoden beschikbaar zijn om vast te stellen van welke diersoort de VDE afkomstig zijn (herkauwers, varkens, pluimvee). Ook zal de industrie investeringen moeten doen voor de gescheiden verwerking van de VDE van verschillende oorsprong. Analysemethoden Omdat het met microscopie niet mogelijk is om van de meeste aanwezige dierlijke bestanddelen zoals spiervezels en botfragmenten de diersoort vast te stellen, kan voor de identificatie overgegaan worden op PCR. In 2010 werd de beslissing genomen om deze PCR-analyses te laten doorgaan in het FLVVT. Omdat deze analysetechniek nieuw was, nam het FLVVT in december 2010 deel aan een intensieve training georganiseerd door het EURL-AP. In 2011 werden voor deze analyse door het CODA twee extra analyseruimtes ter beschikking gesteld en werden een RT-PCR (real-time polymerase chain reaction)-toestel (Lightcycler 480 II) en een opzuiveringsrobot (MagMAX) aangekocht.
Afbeelding 1 en 2: RT-PCR-toestel (Lightcycler 480 II, links) en een opzuiveringsrobot (MagMAX, rechts)
10
Afbeelding 3: Schematisch verloop monstervoorbereiding voor PCR
Om het DNA te amplifi ceren worden primers, de probe en de mastermix met de nucleotiden en polymerase toe-gevoegd. Na toevoegen van de monsterextracten wordt de plaat in het PCR toestel gebracht en start de eigen-lijke reactie die 50 cycli omvat. De software berekent vervolgens de C
p (Crossing point)-waarde als het maximum van de tweede afgeleide van de
amplifi catiecurve, wat het punt is waarop de curve het sterkst stijgt. De bekomen Cp-waarde wordt dan verge-
leken met de cut-off waarde. Deze waarde is het aantal cycli, uitgedrukt als Cp-waarde, waarboven een signaal
beschouwd wordt als een vals positief monster. De cut-off is specifi ek voor het platform en kan zelfs niet zomaar naar een ander toestel binnen hetzelfde laboratorium worden overgedragen.
Om te beoordelen of een analysereeks correct is uitgevoerd worden er extra monsters als kwaliteitscontrole mee geanalyseerd in dezelfde run. Het gaat hierbij in de eerste plaats om een positieve en een negatieve extractiecon-trole welke tot doel hebben de kwaliteit (contaminatie) van de extractiereagentia na te gaan. Daarnaast worden er ook een positieve DNA controle en een NTC (no template controle) mee geanalyseerd om de kwaliteit van de PCR-reagentia na te gaan. Tenslotte wordt ook het mogelijk eff ect van de aanwezigheid van inhiberende com-ponenten op de PCR nagegaan door van elk monster een 10-voudige verdunning te analyseren. Indien er geen inhibitie is, zal het signaal in principe 3,3 (log
2(10)) cycli later verschijnen.
1110
Afbeelding 4: RT-PCR curves: vlakke lijn bij negatieve monsters, stijgende curve bij positieve monsters
In de toekomst zullen meer monsters met PCR geanalyseerd worden als het gebruik van VDE opnieuw geautoriseerd is en vermoedelijk zal de publieke opinie zich ook niet of slechts beperkt keren tegen het opnieuw introduceren van VDE in de voedselketen. De benodigde analysemethoden, zoals voor het opsporen van VDE van varkens en pluimvee met PCR-tech-nieken, zullen hiertoe nog verder worden ontwikkeld.
Literatuur:
• Het TSE-stappenplan 2: Een beleidsnota betreffende overdraagbare spongiforme encefalopathieën voor de periode 2010-2015 (16/07/2010)• Verordening (EG) nr. 999/2001 van het Europees Parlement en de Raad van 22 mei 2001 houdende vaststelling van voorschriften inzake preventie, bestrijding en uitroeiing van bepaalde overdraagbare spongiforme encefalopathieën, Official Journal of the European Union, L 147, p1–40 • Verordening (EG) nr. 152/2009 van de Commissie van 27 januari 2009 tot vaststelling van de bemonsterings- en analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders (Voor de EER relevante tekst), Official Journal of the European Union, L 54, p1–130• Fumière O., Marien A., Berben G. (2012) EURL-AP PCR Implementation Test 2012• Fumière O., Marien A., Berben G. (2012) Validation study of a real-time PCR method developed by TNO Triskelion bv for the detection of ruminant DNA in feedingstuffs (Draft)• Veys P. & Baeten V. (2007) CRL-AP Interlaboratory Study 2007 Final report• Summary report of the standing committee on the food chain and animal health held in Brussels on 18 July 2012• ISO 84276 (draft): Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - General requirements and definitions• Scientific Opinion on the revision of the quantitative risk assessment (QRA) of the BSE risk posed by processed animal proteins (PAPs). EFSA Journal 2011;9(1):1947
Om het DNA te amplificeren worden primers, de probe en de mastermix met de nucleotiden en polymerase toegevoegd. Na toevoegen van de monsterextracten wordt de plaat in het PCR toestel gebracht en start de eigenlijke reactie die 50 cycli omvat. De software berekent vervolgens de Cp (Crossing point)-waarde als het maximum van de tweede afgeleide van de amplificatiecurve, wat het punt is waarop de curve het sterkst stijgt. De bekomen Cp-waarde wordt dan vergeleken met de cut-off waarde. Deze waarde is het aantal cycli, uitgedrukt als Cp-waarde, waarboven een signaal beschouwd wordt als een vals positief monster. De cut-off is specifiek voor het platform en kan zelfs niet zomaar naar een ander toestel binnen hetzelfde laboratorium worden overgedragen. Om te beoordelen of een analysereeks correct is uitgevoerd worden er extra monsters als kwaliteitscontrole mee geanalyseerd in dezelfde run. Het gaat hierbij in de eerste plaats om een positieve en een negatieve extractiecontrole welke tot doel hebben de kwaliteit (contaminatie) van de extractiereagentia na te gaan. Daarnaast worden er ook een positieve DNA controle en een NTC (no template controle) mee geanalyseerd om de kwaliteit van de PCR-reagentia na te gaan. Tenslotte wordt ook het mogelijk effect van de aanwezigheid van inhiberende componenten op de PCR nagegaan door van elk monster een 10-voudige verdunning te analyseren. Indien er geen inhibitie is, zal het signaal in principe 3,3 (log2(10)) cycli later verschijnen.
Afbeelding 3: RT-PCR curves: vlakke lijn bij negatieve monsters, stijgende curve bij positieve monsters In de toekomst zullen meer monsters met PCR geanalyseerd worden als het gebruik van VDE opnieuw geautoriseerd is en vermoedelijk zal de publieke opinie zich ook niet of slechts beperkt keren tegen het opnieuw introduceren van VDE in de voedselketen. De benodigde analysemethoden, zoals voor het opsporen van VDE van varkens en pluimvee met PCR-technieken, zullen hiertoe nog verder worden ontwikkeld. Literatuur:
Het TSE-stappenplan 2: Een beleidsnota betreffende overdraagbare spongiforme encefalopathieën voor de periode 2010-2015 (16/07/2010)
12
GC-MS/MS als een nieuwe mogelijkheid voor de bevestiging van analyses op de aanwezigheid van PCDD/Fs en DL-PCBs in food en feed
Gauthier Eppe* en Jean-François Focant
CART University of Liège, Allée de la Chimie 3, B-6c Sart-Tilman, B-4000 Liège, BELGIUM
Inleiding
De risico’s van PCB’s en dioxinen voor de gezondheid van de mens hangen vooral samen met het gebruik van voedsel van dierlijke oorsprong. De afgelopen tien jaar toonden herhaalde gevallen van verontreinigd diervoeder duidelijk aan dat diervoeder een belangrijke mogelijke bron van verontreiniging is. Een verlaging van de inname van dioxinen door de mens hangt dan ook in sterke mate af van de acties die worden ondernomen om de ver-ontreiniging zoveel mogelijk te beperken van alles wat wordt gebruikt in de diervoeding, inclusief voedermidde-len, maar ook gerecycleerde producten en ingrediënten (zoals citruspulppellets, gerecycleerd vet, kleimineralen, cholinechloride, waterstofchloride uit de gelatineproductie, guar gum verdikkingsmiddel, biodiesel gerelateerde vetzuren, enz…)Niettegenstaande die acties kunnen zich nog alleenstaande gevallen van verontreiniging voordoen. Dankzij de toepassing van continue monitoring, van de op grenswaarden, actieniveaus en streefniveaus gesteunde strategie (die sindsdien werd afgeslankt tot grenswaarde-actieniveau) en de beschikbaarheid van een Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF) is het thans mogelijk om sneller en op een gecoördineerde manier op te treden om de mogelijke blootstelling van mensen tot een minimum te beperken wanneer een verontreinigingsincident wordt gemeld.
Nood aan een efficiënte monitoring van dioxinen en PCB’s
Bij de screening van levensmiddelen op de aanwezigheid van dioxinen en PCB’s kunnen zowel biologische als fysisch-chemische methoden gebruikt worden. (1) Beide soorten van methoden moeten op basis van het totale toxiciteitsequivalent (TEQ) minder dan 5% vals conforme resultaten opleveren, een binnen laboratorium reprodu-ceerbaarheid (RSD
R) hebben van minder dan 25%, en vanzelfsprekend een percentage vals niet-conforme resul-
taten dat laag genoeg is om het gebruik ervan als screening instrument nuttig te maken. Daarnaast moeten alle niet-conforme resultaten worden bevestigd bij middel van gaschromatografie-hogeresolutiemassaspectrometrie (GC-HRMS) en moeten ook tot 10% van de conforme monsters worden bevestigd. Bioassays en GC-MS methoden moeten thans voldoen aan verschillende niveaus van specifieke eisen en leveren verschillende informatie op { Verordening (EU) nr. 278/2012 van de Commissie (2); Verordening (EG) nr. 252/2012 van de Commissie (3) }. Het expertiseniveau is groter voor GC-MS screeningmethoden en vergelijkbaar met dat van de GC-HRMS methoden, die worden toegepast om resultaten te bevestigen, waarbij alleen het te gebruiken type massa-analysator en de te halen LOQ’s verschillen. Bijgevolg wordt GC-MS screening, hoewel die aanvankelijk werd beschouwd als een
1312
economisch haalbaar alternatief voor GC-HRMS, in de praktijk zelden toegepast. De belangrijkste reden hiervoor is dat aangezien de analyse-eisen en ook de eisen inzake monsterbereiding identiek zijn (een monster bereiden voor GC-LMRS of voor GC-HRMS vergt dezelfde inspanning) het enige verschil eigenlijk zit in de investering voor de MS. HRMS toestellen kosten meer dan andere MS apparatuur die wordt gebruikt om te screenen, maar de reële financiële weerslag per monster op basis van een over de ganse levensduur van het toestel berekend rendement op investering is erg klein. Bijgevolg investeren veel analyselaboratoria liever in de fysisch-chemische tool voor bevestiging dan in het screeningequivalent daarvan.Onlangs werden echter een aantal studies gepubliceerd over de toepasbaarheid van de nieuwe generatie van triple quadrupool GC-MS/MS apparaten voor de bepaling van PCDD/Fs en dioxineachtige PCB’s in monsters van dierenvoer en levensmiddelen. (4,5,6,7) De resultaten van de vergelijking van GC-MS/MS met GC-HRMS gaven aan dat GC-MS/MS nu het potentieel heeft om als alternatieve bevestigingsmethode te worden gebruikt. Er werd een kernwerkgroep opgericht binnen het netwerk van Europees-referentielaboratorium (EU-RL) en nationale refe-rentielaboratoria (NRL’s) van de EU-lidstaten voor dioxinen en PCB’s in levensmiddelen en dierenvoer die tot doel had de mogelijkheden van de nieuwe MS-technieken/-instrumenten voor het bepalen van dioxinen en PCB’s in levensmiddelen en dierenvoer te evalueren.
Evaluatie van de GC-MS/MS systemen
30 jaar geleden was al duidelijk dat GC-MS de uitgelezen methode was voor het meten van de gehalten aan persistente organische polluenten (POP’s) en dan vooral voor PCDD/Fs. Massaspectrometrie maakt niet alleen een zeer specifieke kwantificering mogelijk, maar identificeert de doelverbindingen ook op ondubbelzinnige wijze. Het is echter zo dat niet alle GC-MS instrumenten PCDD/Fs kunnen meten. De complexiteit van het meten van die verbindingen hangt ook samen met de lage concentraties waarin zij voorkomen in milieumatrices, maar in het bijzonder in levensmiddelen en dierenvoer. De vereiste gevoeligheid wordt bereikt door middel van een com-binatie van hogeresolutie- en hogemassanauwkeurigheid waarbij dubbel focusserende magnetische sectorin-strumenten, gewoonlijk “hogeresolutiemassaspectrometers” (HRMS) genoemd, worden gebruikt die werken in de SIM-modus (selected ion monitoring). De nieuwe generatie triple quadrupole instrumenten bleek een aanzienlijk betere gevoeligheid te bezitten waardoor het tekort aan gevoeligheid ten aanzien van GC-HRMS sectorinstru-menten gedeeltelijk kan worden weggewerkt. Kotz en zijn collega’s meldden onlangs een bepaalbaarheidsgrens (LOQ) van 50 fg (absolute hoeveelheid op de kolom) voor TCCD. (6) Verder haalden ook Fürst en zijn collega’s hetzelfde prestatieniveau. Het laagste kalibratiepunt voor PCDD- en PCDF-congeneren bedroeg 100 fg op de kolom geïnjecteerde hoeveelheid, met een uitstekende lineariteit voor 0,1 tot 10 pg op de kolom geïnjecteerde hoeveelheid. (7)De werkgroep die binnen het netwerk van het EU-RL en de NRL’s werd opgericht, evalueerde de mogelijkheden van de nieuwe, eventueel in aanmerking komende, bevestigingsmethode aan de hand van een beoordeling van: - het werkbereik, waarbij in het bijzonder werd gefocust op de onderzijde van het werkbereik;- de lineariteit, precisie, juistheid en robuustheid van de systemen;- de bruikbaarheid bij routineanalyses op dierenvoer en levensmiddelen op het beoogde gehalte;- de vergelijking tussen de resultaten van GC-MS/MS en GC-HRMS (ten aanzien van de consensuswaarden bij interlaboratoriumvergelijkingen).
De conclusies van de evaluatie van de verschillende beschikbare gevoelige GC-MS/MS-systemen geven aan dat de recentste GC-MS/MS systemen van verschillende leveranciers kunnen worden gebruikt voor routineanalyses op PCDD/Fs en dioxineachtige PCB’s in dierenvoer en in levensmiddelen en mogelijkheden bieden als alterna-tieve bevestigingsmethode. (8)
14
Figuur 1: full scan spectrum versus MS/MS spectrum van 2,3,7,8-TCDD
Voorgestelde wijzigingen van de huidige criteria
In de EU-wetgeving werd een hele reeks van nieuwe prestatiecriteria toegevoegd. De definitie van bevestigings-methoden verwijst nu ook naar de mogelijkheid om gaschromatografie gekoppeld aan tandemmassaspectrome-trie (GC-MS/MS) te gebruiken in bevestigingsmethoden. De definitie van de bepaalbaarheidsgrens werd aange-past om rekening te houden met het zeer lage ruisniveau in MS/MS modus. Er werden ook nieuwe specifieke identificatiecritera toegevoegd voor GC-MS/MS die gebaseerd zijn op criteria die zijn vastgelegd in Beschikking 2002/657/EC van de Commissie (9) en methoden 1613 en 1668 van het EPA (US milieubeschermingsagentschap). Voor de toepassing van de GC-MS/MS methode is bijvoorbeeld de monitoring vereist van ten minste twee speci-fieke precursorionen in de MRM modus (multiple reaction monitoring), elk met één specifiek production voor alle gemerkte en niet-gemerkte analyten uit de analysescope. Meer informatie hierover is beschikbaar in Verordenin-gen 252/2012 en 278/2012. Die wijzigingen leggen strenge criteria vast voor zowel HRMS- en MS/MS-systemen met het oog op de instandhouding van de beste kwaliteit en de grootste betrouwbaarheid van analyses waarbij PCDD/F en PCB worden gemeten bij middel van bevestigingsmethoden. Volstaat dat ?Hetzij aangestipt dat het routinematig meten van sub ppb concentraties aan PCDD/Fs en DL-PCB’s een ware uitdaging is en blijkbaar het meest gevoelige detectiesysteem vereist, maar dat ook de extractie- en cleanup-processen een belangrijke rol spelen en zeker van invloed zijn op de kwaliteit en de betrouwbaarheid van de analyseresultaten.
Figure 1: full scan versus MS/MS spectra of 2,3,7,8-TCDD
1514
Referenties: 1. Focant J-F., Anal Bioanal Chem (2012) 403:2797–28002. Verordening (EG) nr. 152/2009 van de Commissie van 27 januari 2009, gewijzigd bij Verordening (EU) nr. 278/2012 van de Commissie van 28 maart 2012 (PB L 91, 28.3.2012, p. 8–22)3. Verordening (EU) nr. 252/2012 van de Commissie van 21 maart 2012 tot intrekking van Verordening (EG) nr. 1883/2006 (PB L 84, 23.3.2012, p. 1–22)4. Ingelido AM, Brambilla G, Abballe A, di Domenico A, Fulgenzi AR, Iacovella N, Iamiceli AL, Valentini SDe Filep E (2011) Rapid Commun. Mass Spectrom, 26: 236-2425. Sandy C, Fürst C, Bernsmann T, Baumesiter D (2011) Organohalogen Compd 73: 1370-13716. Kotz A, Malisch R, Wahl K, Bitomsky N, Adamovic K, Gerteisen I, Leswal S, Schachtele J, Tritschler R, Winterhalter H (2011) Organohalogen Compd 73 : 688-6917. P. Fürst, T. Bernsmann, D. Baumeister, C Sandy, Agilent Technologies publication 5990-6594EN (2010); http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5990-6594EN.pdf8. Kotz A, Malisch R, Focant J-F, Eppe G, Cederberg T, Rantakokko P, Fürst P, Bernsmann T, Leondiadis L, Lovász C, Scortichini G, Diletti G, di Domenico A, Ingelido AM, Traag W, Smith F and Fernandes A. (2012) Organohalogen compd, 74 in press9. 2002/657/EC: Beschikking van de Commissie van 12 augustus 2002 (PB L 221, 17.8.2002, p. 8–36)
*Corresponding AuthorGauthier EppeE-mail: [email protected]
16
Tankmelk, een bijkomende matrix voor de opsporing en uitroeiing van IBR in rundveebedrijven.
Jean-Baptiste Hanon en Brigitte CaijCODA-CERVAOperationele directie virale ziektenEenheid enzoötische en (her-)opduikende ziekten
Inleiding
Infectieuze boviene rhinotracheïtis (IBR) is een virale ziekte die zich voornamelijk manifesteert door ademhalings-problemen of voortplantingsstoornissen (abortus, onvruchtbaarheid) bij runderen. Ze wordt veroorzaakt door een herpesvirus, het boviene herpersvirus type 1 (BoHV-1). Eenmaal runderen geïnfecteerd zijn met het virus ondergaan ze een seroconversie en worden ze levenslang dragers van het virus dat latent aanwezig blijft in de ganglia. Na reactivatie door bijvoorbeeld stress kan het virus opnieuw worden uitgescheiden en gezonde dieren besmetten. Daarom hebben verschillende Europese landen, waaronder België, een uitroeiingsplan voor de ziekte opgesteld dat bestaat uit het opsporen en verwijderen van alle seropositieve dieren om zo tot veebeslagen te komen die volledig ziektevrij zijn. Die opsporing gebeurt dankzij de ELISA-tests die zowel op serummonsters kun-nen worden uitgevoerd als op melkmonsters van individuele dieren of tankmelk zoals de Europese wetgeving het toelaat (Beschikking 2004/558/EC van de Commissie gewijzigd bij besluit 2010/433/EU).
In de meeste Europese landen die een bestrijdingsplan tegen IBR hebben geïmplementeerd, wordt melk ge-bruikt als matrix ter opsporing van IBR in melkveebeslagen, hetzij voor het verwerven hetzij voor het behoud van de IBR-vrije status van het beslag. Dit is onder meer het geval in de buurlanden van België (Duitsland, Frankrijk, Nederland). In België voorziet het koninklijk besluit inzake infectieuze boviene rhinotracheïtis (KB van 22/11/2006 gewijzigd bij KB van 16/02/2011) in de mogelijkheid om de IBR-vrije status van een melkveebeslag te behouden (status I3 of I4) op basis van 6 analyses op tankmelk per jaar (aangevuld door een jaarlijkse serologie op dieren die niet bestemd zijn voor de melkproductie). Echter tot op heden zijn de IBR-ELISA kits die kunnen gebruikt worden voor melk nog niet onderworpen aan de certificeringsprocedure van het referentielaboratorium CODA-CERVA en kunnen bijgevolg niet gebruikt worden in het kader van de officiële bestrijding. De opsporing van IBR in veebesla-gen gebeurt dus momenteel via serologische analyse van individuele bloedmonsters op volwassen runderen.
1716
IBR serologische status en de gebruikte opsporingstests
In een geïnfecteerd bedrijf kan vaccinatie de virus circulatie doen verminderen en dus ook de besmetting van geïnfecteerde dieren. De gebruikte vaccins worden geproduceerd op basis van een IBR virusstam waarbij het gen dat codeert voor de glycoproteïne gE gedeleteerd is. Door gebruik te maken van dit gE-gedeleteerd vaccin is het mogelijk om een onderscheid te maken tussen dieren geïnfecteerd met het wildtype virus, die antistoffen tegen de gE glycoproteïne bezitten en gevaccineerde dieren. die geen antistoffen tegen de gE (gE-) hebben. Maar gevaccineerde dieren bezitten wel antistoffen tegen andere glycoproteïnes van het BoHV1 zoals antistoffen tegen de glycoproteïne gB (gB+). Daarentegen bezitten gezonde naïve dieren geen antistoffen tegen het virus. Geba-seerd of de verschillen in immunologische reacties van naïve, gevaccineerde en geïnfecteerde dieren, kunnen ELISA kits gebaseerd op de opsporing van gE of gB antistoffen de status van het dier bepalen
Naast de gE en gB ELISA-tests zijn er ook nog indirecte ELISAs beschikbaar die al de antistoffen tegen BoHV-1 de-tecteren. Op basis van de resultaten in de verschillende tests wordt het IBR-statuut bepaald overeenkomend met de hierna vermelde overzichtstabel :
Status Dier gE ELISA gB ELISA Indirecte ELISA
IBR besmet + + +
IBR gevaccineerd, niet besmet - + +
Niet besmet, niet geïnfecteerd - - -
Evaluatie van ELISA-tests voor de opsporing van IBR in melk met het oog op het gebruik ervan in België.
In de loop van 2011 heeft het CODA-CERVA tijdens een studie een eerste evaluatie uitgevoerd van verschillende ELISA-testen die beschikbaar zijn op de Europese markt voor de opsporing van IBR antistoffen in melk. Deze evaluatie had als doel de kenmerken van die tests op individuele melkstalen en op tankmelk te bepalen (gevoe-ligheid, specificiteit, opspoorbaarheid). Verschillende partners hebben tot de realisatie van deze studie bijgedra-gen, waaronder 92 rundveehouders uit heel België, de regionale diergeneeskundige labo’s (ARSIA en DGZ) en de organismen voor de controle van melk (Comité du Lait en het Melk Controlecentrum MCC) en 5 fabrikanten van ELISA-kits.
Zo werden zeven ELISA-kits geëvalueerd (2 gE Elisa-kits, 1 gB ELISA en 4 indirecte ELISA-kits). De studie resulteerde in aanbevelingen voor een toekomstige procedure voor officiële certificering van ELISA IBR-kits voor melk die kunnen gebruikt worden in het IBR-bestrijdingprogramma in België.
18
Bijzonderheden van de opsporing in tankmelk
Tankmelk is samengesteld uit de productie van een of meerdere melkbeurten van alle melkproducerende koeien in een melkveebeslag. De analyse van een tankmelkmonster door onderzoek naar antilichamen maakt het dus in principe mogelijk om de aanwezigheid van volwassen geïnfecteerde dieren in het beslag op te sporen, met uitzondering van koeien die geen melk meer geven of waarvan de melk niet in de tank werd gemengd (bijvoor-beeld door een uierontsteking). Het is dus van belang om de analyses van tankmelk meerdere keren per jaar te herhalen zodat het hele beslag wordt getest. De concentratie van antistoffen of immunoglobulines in de melk is ongeveer 10 keer lager dan in bloedserum. De concentratie varieert eveneens in de loop van de lactatieperiode, en is ook lager tijdens de piek van de melkproductie door het verdunningseffect. Bovendien wanneer de preva-lentie van IBR laag is in een beslag worden de antistoffen in de melk van geïnfecteerde dieren verdund door de melk van gezonde koeien. Het is dus belangrijk om over voldoende gevoelige ELISA-tests te beschikken waarbij lage hoeveelheden antistoffen kunnen worden opgespoord.
In vergelijking met de individuele serologische tests kunnen o.a. volgende voordelen voor het gebruik van tank-melk in het IBR opsporingsprogramma worden opgenoemd :- de monsters kunnen worden genomen via melkcontrole-organismen;- de lage kostprijs door het kleiner aantal te analyseren monsters;- de vroegtijdige opsporing van een eventuele besmetting van een beslag met vrije status door regelmatig herhaalde tests in de loop van het jaar (in tegenstelling tot de jaarlijkse serologische bilan).
Het voornaamste nadeel is de slechte stabiliteit van de verse melkmonsters waardoor aangepaste logistieke middelen nodig zijn om deze snel naar het laboratorium te voeren. Een bewaarmiddel toevoegen aan het mon-ster kan eventueel de bewaartermijn verlengen. Bovendien kunnen de monsters zonder probleem ingevroren bewaard worden als de melk afgeroomd is.
1918
Besluit
Aan de hand van de door het CODA-CERVA uitgevoerde studie konden verschillende soorten ELISA-kits ter op-sporing van IBR in melk getypeerd worden. De globale kenmerken van de 3 categorieën ELISA-tests kunnen als volgt worden samengevat :
gE ELISA gB ELISA Indirecte ELISA
Individueel melkstaal Gevoeligheid +/- ++ +++
Specificiteit + tot +++ +++ ++
Tankmelk Gevoeligheid - - +++
Detecteerbaarheid -(>10 to 15%)
+/-(>10%)
+++(<2%)
Specificiteit + +++ +++
Legende : +++ uitstekend / ++ zeer goed / + goed / +/- middelmatig / - slecht
Over het algemeen stelt men vast dat de indirecte ELISA-kits zeer performant zijn voor de opsporing van IBR op tankmelk in niet-gevaccineerde veebeslagen en kunnen dus worden aanbevolen als matrix in het kader van de opvolgingstesten voor het IBR-vrije statuut (I4-statuut). De gevoeligheid en de detecteerbaarheid van indirecte ELISAs op tankmelk zijn hoger dan die verkregen door een jaarlijkse éénmalige serologische opsporing in een steekproefsgewijs genomen aantal dieren zoals bepaald in het koninklijk besluit over IBR. Immers, men bepaalt de grootte van het te nemen aantal monsters bij de serologische controle zodanig dat een IBR-prevalentie van 15% kan gedetecteerd worden, terwijl bij indirecte ELISAs op tankmelk het mogelijk is zelfs minder dan 2 % besmette koeien te detecteren. Bovendien kunnen veelvuldige tests op tankmelk (om de 2 maanden) een eventuele herbesmetting van het beslag vroeger opsporen dan een serologische test die slechts één keer in het jaar wordt uitgevoerd.
Voor de dieren met I3 vrije status (toegelaten vaccinatie) is de indirecte ELISA niet geschikt aangezien die test de gevaccineerde dieren niet kan onderscheiden van de geïnfecteerde dieren. De gE ELISA-tests zijn minder gevoelig op tankmelk en kunnen een lage prevalentie van geïnfecteerde dieren in een beslag niet opsporen (opspoorbaar-heid >10 à 15%). Dit gebrek aan gevoeligheid wordt gedeeltelijk gecompenseerd door om de twee maanden tests op tankmelk te herhalen. Immers bij een nieuwe infectie van een ziektevrij beslag, kan men verwachten dat het percentage geïnfecteerde koeien snel meer dan 15% bedraagt. Bovendien bestaan er bepaalde procedures voor de behandeling van melk die de concentratie van immunoglobulines verhogen in monsters van tankmelk en de gevoeligheid en opspoorbaarheid van gE ELISA kits verbeteren. Dankzij deze procedures zou de verkregen gevoeligheid beter kunnen zijn dan die met een jaarlijkse serologische opsporing op een steekproefsgewijs geno-men monster op dieren zoals momenteel in België wordt toegepast.
Als conclusie wordt aanbevolen om zo spoedig mogelijk een procedure in te stellen voor de officiële certificering van indirecte ELISA kits ter opsporing van IBR in melk en tankmelk in het kader van de IBR-bestrijding in België. In dit kader werd ook contact opgenomen met de buurlanden die reeds deze ELISA IBR kits voor melk gebruiken in hun officieel bestrijdingsprogramma met als doel een mogelijk wederzijdse erkenning van gecertifiëerde loten van deze ELISA kits te bespoedigen.
Contact : [email protected].
20
Materialen uit kunststof bestemd voor direct contact met voeding: Wat is de impact voor de laboratoria van de recente Verordening (EU) 10/2011?
Els Van Hoeck, Tina N’Goy, Caroline Evrard en Fabien BolleWIV-ISP, Juliette Wytsmanstraat 14, 1050 Brussel
Verpakkingen en materialen die bestemd zijn om in direct contact te komen met voedingsmiddelen (Food con-tact materials, FCM), dienen aan verschillende eisen te voldoen, die neergeschreven zijn op Europees niveau. In dit kader, werd op 14 januari de Verordening (EU) nr. 10/2011 betreffende materialen en voorwerpen van kunststof die in contact komen met levensmiddelen (of kortweg “PIM”: Plastics implementation measure), gepubliceerd.[1] Deze Verordening vervangt de volgende documenten:• de richtlijn over kunststoffen (Directive 2002/72/EC); [2] • de richtlijn over de condities voor de migratietesten (Directive 82/711/EEC); [3] • de richtlijn over de keuze van de gebruikte simulanten (Directive 85/572/EEC) [4] en • de richtlijn over het gebruik van vinylchloride als monomeer. [5]Er zijn echter ook een aantal belangrijke veranderingen in deze nieuwe verordening, die een grote impact kunnen hebben voor de laboratoria die de migratieanalyses uitvoeren ter controle van de verpakkingen. Deze wijzigingen zullen hier verder besproken worden.
20
Toepassingsgebied van de verordening Nr. 10/2011
De laatste jaren worden steeds meer materialen gebruikt, bestemt voor contact met levensmiddelen, die niet en-kel uit kunststoff en bestaan, maar uit verschillende lagen van kunststof die aan elkaar bevestigd zijn met lijm. Ze kunnen ook bedrukt zijn, of bedekt met een laag vernis, of gebruikt worden als pakking in doppen of sluitingen die bestaan uit meerdere materialen. Naar deze materialen wordt verwezen als ‘meerlaagse, uit meerdere mate-rialen bestaande materialen en voorwerpen’. Iedere laag van deze materialen moet voldoen aan de Verordening, tenzij er een functionele barrière is tussen de kunststof en de voeding. Deze verordening is niet van toepassing op ionenwisselaarharsen, rubber en siliconen. Een aantal voorbeelden van materialen waarvoor deze verordening van toepassing is, zijn weergegeven in de onderstaande fi guur.
De richtlijn 2002/72/EC bevat verschillende lijsten voor monomeren en andere uitgangsstoff en en voor additie-ven, naargelang hun toelatingsstatus. Deze lijsten zijn samengevoegd in één lijst, namelijk de ‘EU lijst’. Alleen de stoff en die opgenomen zijn in deze ‘EU lijst’ mogen opzettelijk gebruikt worden voor de vervaardiging van materi-alen en voorwerpen van kunststof. Deze ‘EU lijst’ omvat:• monomeren en andere uitgangstoff en, • additieven met uitzondering van kleurstoff en, • polymerisatiehulpmiddelen met uitzondering van oplosmiddelen, • door microbiële fermentatie verkregen macromoleculen. Lijmen, inkten en vernissen bestaan niet noodzakelijkerwijs uit dezelfde stoff en als kunststoff en, daarom blijven deze componenten gereglementeerd via andere voorschriften van de Europese Unie of de lidstaten. Andere uit-zonderingen zijn het gebruik van kleurstoff en, solventen en niet opzettelijk toegevoegde stoff en (non-intentional added substances, NIAS). Het gebruik van nanodeeltjes is verboden, tenzij het risico geëvalueerd is door EFSA en het specifi eke gebruik wordt toegestaan.
22
Hoe moeten de migratietesten uitgevoerd worden?
De migratie van contaminanten uit verpakkingen en andere materialen naar de voeding wordt geëvalueerd aan de hand van migratietesten. Er zijn twee manieren om de migratie te evalueren, namelijk via specifi eke migratie of via globale migratie. Aangezien het moeilijk is om het materiaal samen te brengen met alle levensmiddelen waarmee het in aanraking kan komen, gebeurt de migratieanalyse met behulp van simulanten. In de onderstaande fi guur, zijn voorbeel-den weergegeven hoe de migratietesten kunnen uitgevoerd worden. Verpakkingen kunnen getest worden met behulp van een migratiecel. Borden, bekers, … worden gevuld met het simulant en keukenmaterialen worden ondergedompeld in het simulant.
Een overzicht van de keuze van de simulanten en de wijzigingen in de nieuwe Verordening, zijn weergegeven in de onderstaande tabel:
Type Voeding Simulant 2002/72/EEC EU Nr. 10/2011
Waterig (pH > 4,5) A Gedistilleerd H2O 10 % Ethanol (v/v)
Zuur (pH < 4,5) B 3 % Azijnzuur (m/v) 3 % Azijnzuur (m/v)
Alcoholisch C 15 % Ethanol (v/v) 20 % Ethanol (v/v)
Semi-vet D (b) 50 % Ethanol (v/v) D1: 50 % Ethanol (v/v)
Vet Olijfolie D2: Plantaardige olie
Droog E / MPPO (Tenax)
Verder worden de temperatuur en de duur van de migratie bepaald naargelang de reële gebruiksomstandighe-den of het worst case scenario. Deze condities werden vastgelegd in vorige richtlijnen, maar werden gegroepeerd en aangepast in de nieuwe Verordening 10/2011. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen globale migratie en specifi eke migratie. De nieuwe standaardtestcondities voor de globale migratie zijn weergegeven in de onder-staande tabel:
2322
Test Verwacht contact met voeding Condities voor migratietest
OM1 Contact met bevroren en gekoelde levensmiddelen
10 dagen @ 20°C
OM2 Langdurige opslag bij kamertem-peratuur + kort verwarmen
10 dagen @ 40°C
OM3 Kort verwarmen 2 uur @ 70°C
OM4 Toepassing bij hoge temperatuur 1 uur @ 100°C
OM5 Toepassing bij hoge temperatuur (tot 121°C)
2 uur @ 100°C of 1 uur refluxen @ 121°C
OM6 Gebruik van simulant A,B of C bij een temperatuur groter dan 40°C
4 uur @ 100°C of 4 uur refluxen
OM7 Toepassing van vette voeding bij hoge temperatuur
2 uur @ 175°C
Voor specifieke migratie worden zowel de contacttijden als de contacttemperaturen vastgelegd in de Verorde-ning nr. 10/2011. Beide zijn weergegeven in de onderstaande tabel (met in het rood, de wijzigingen ten opzichte van de oude richtlijnen).
Contacttijd volgens ‘worst case’ scenario Contacttijd voor de migratietest
t ≤ 5 min 5 min
5 min ≤ t ≤ 0,5 uur 0,5 uur
0,5 uur ≤ t ≤ 1 uur 1 uur
1 uur ≤ t ≤ 2 uren 2 uren
2 uren ≤ t ≤ 6 uren 6 uren
6 uren ≤ t ≤ 24 uren 24 uren
1 dag ≤ t ≤ 3 dagen 3 dagen
3 dagen ≤ t ≤ 30 dagen 10 dagen
30 dagen ≤ t Specifieke omstandigheden
Interpretatie van de resultaten Volgens de Verordening (EU) 10/2011, moeten alle resultaten gerapporteerd worden in mg/kg. Er zijn natuurlijk nog een aantal uitzonderingen:• Materialen die gevuld kunnen worden met een volume van 500 mL tot 10 L en/of materialen die gebruikt worden voor baby’s en jonge kinderen > In dit geval moet rekening gehouden worden met de reële oppervlakte-volumeverhouding. • Materialen met een volume kleiner dan 500 mL of groter dan 10 L en/of wanneer de berekening van het oppervlakte van het materiaal en het volume van de voeding niet praktisch is > In dit geval moet rekening gehouden worden met de conventionele oppervlakte-volumeverhouding van 6 dm² per kg levensmiddel.
24
Besluit
Deze nieuwe Verordening 10/2011 omvat een aantal wijzigingen in de condities/simulanten die moeten gebruikt worden in de migratietesten ter evaluatie van de gebruikte kunststoffen voor het vervaardigen van verpakkingen en andere materialen die in direct contact komen met levensmiddelen. Er was een overgangsperiode voorzien, maar vanaf 1 januari 2013, moeten alle laboratoria deze nieuwe migratiesimulanten en testcondities toepassen.
Referenties
[1] Commission Regulation No. 10/2011 on plastic materials and articles intended to come into contact with food.
[2] Council Directive 2002/72/EC relating to plastic materials and articles intended to come into contact with foodstuffs.
[3] Council Directive 82/711/EEC laying down the basic rules necessary for testing migration of the constituents of plastic materials and articles intended to come into contact with foodstuffs.
[4] Council Directive 85/572/EEC laying down the list of simulants to be used for testing migration of constitu-ents of plastic materials and articles intended to come into contact with foodstuffs.
[5] Council Directive 78/142/EEC on the approximation of the laws of the member states relating to materials and articles which contain vinyl chloride monomer and are intended to come into contact with foodstuffs.
2524
Nieuwe technieken en methoden ontwikkeld door het Belgische NRL-GGO voor het identificeren van niet-geautoriseerde GGO’s in het UGMMONITOR projectFraiture Marie-Alice1,3,4, Herman Philippe1, Berben Gilbert2, Debode Frédéric2, Janssen Eric2, Taverniers Isabel3, De Loose Marc3 en Roosens Nancy1
1 WIV-ISP (Platform Biotechnologie en Moleculaire Biologie; Dienst Bioveiligheid en Biotechnologie); 2 CRA-W (Centre Wallon de Recherches Agronomiques); 3 ILVO (Eenheid Technologie & Voeding); 4 UGent (Faculteit Farmaceutische Wetenschappen; Laboratorium voor Farmaceutische Biotechnologie)
Genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s) worden gedefinieerd als organismen “met uitzondering van men-selijke wezens, waarvan het genetische materiaal veranderd is op een wijze welke van nature door voortplanting en/of natuurlijke recombinatie niet mogelijk is.” (Richtlijn 2001/18/EG). De invoering en de controle op GGO’s in de levensmiddelen- en diervoederketens in de Europese markt zijn onderhevig aan de Europese wetgeving teneinde de vrijheid van keuze voor de consument te garanderen (Reg. EG nr. 1829/2003 en 1830/2003). De handhaving van deze wetgeving is echter complex om verschillende redenen. Ten eerste, het aantal en de diversiteit van gecommercialiseerde GGO’s zullen aanzienlijk toenemen in de komende 5 jaar. Ten tweede, naast genenover-dracht voor insect resistentie of herbicide tolerantie, zal een groter bereik van eigenschappen worden ontwikkeld (bijvoorbeeld abiotische stress tolerantie, weerstand tegen ziektes en nutritionele verbeteringen). Ten derde, de huidige gecommercialiseerde GGO’s worden voornamelijk geproduceerd door Amerikaanse en Europese bedrij-ven dewelke groot belang hebben bij het autoriseren van hun producten voor commercialisering op de Europese markt. Echter in 2015 zullen steeds meer GGO’s worden ontwikkeld door Aziatische technologische centra die bestemd zullen zijn voor de lokale consumptie. Het is zeer onwaarschijnlijk dat deze genetisch gemodificeerde gewassen eveneens zullen ingediend worden voor EU goedkeuring. Dus, de aanwezigheid van niet-toegelaten GGO’s (UGMs; unauthorized GMOs) op de Europese markt zal allicht aanzienlijk toenemen door hun accidentele aanwezigheid in grondstoffen en bewerkte voedingsmiddelen (Stein en Rodriguez-Cerezo, 2009). In dit verband moeten efficiënte en innovatieve methoden en technieken worden ontwikkeld voor het: (i) verbeteren van UGM detectie in de levensmiddelen- en veevoederketens en (ii) verzamelen van gegevens die hun veiligheidsrisico-evaluatie mogelijk maakt.Het project “UGMMONITOR” bestaat in de ontwikkeling van een platform in de moleculaire biologie en een database (bioveiligheidsinformatie) voor de detectie van UGMs in levensmiddelen en diervoeders. Het wordt gefinancierd door de Federale Overheidsdienst Volksgezondheid, Veiligheid van de Voedselketen en Leefmilieu (overeenkomst RF 11/6242) (begindatum: 1 mei 2012) en zal toelaten om high-tech methoden te ontwikkelen voor een betere controle op aanwezigheid van UGMs. Tot de doelen van dit project behoren het beschikbaar stellen van een database van UGMs met informatie die nuttig is voor risico-evaluatie, en het ontwikkelen van een geïntegreerde aanpak van high-tech methoden voor detectie van UGMs in levensmiddelen/diervoeders.
Hierna volgt een klein overzicht van de nieuwe methoden en technieken ontwikkeld door de verschillende partners.
26
Het Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid (WIV-ISP)
Enerzijds zal, voor het creëren van een ‘UGMMONITOR BIOVEILIGHEIDSDATABASE’ een grote inventaris gemaakt worden van UGMs en hun karakterisering, met bijzondere aandacht voor rijst. Daartoe zal informatie verzameld worden in een database, van bvb. GGO’s die zullen gecommercialiseerd worden in de komende jaren, types van levensmiddelen/diervoeders die kunnen gecontamineerd worden met UGMs, de beschikbare gegevens omtrent risicobeoordeling enz. Op deze manier zal deze database een waardevolle tool zijn voor het aanleveren van de nodige gegevens voor de handhaving van levensmiddelen- en diervoederketen controles in het bijzonder in het geval van crisissen.
Anderzijds zullen, op basis van de informatie in de database, nieuwe SYBR® Green screeningmethoden ontwikkeld worden, gericht op niet-geautoriseerde GG-rijst. In een tweede stap zal een strategie, die DNA walking koppelt aan nested PCR, worden geïntegreerd in de SYBR ® Green detectiemethoden ontwikkeld op het WIV-ISP en dienen als bewijs van de aanwezigheid van UGMs/GGO’s in een voedingsmatrix, op basis van isolatie van de transgene-endogene junctie(s). De verkregen amplicons zullen sequenced worden ter bevestiging van de aanwezigheid van transgene gewassen in het geanalyseerde monster. Deze strategie zal worden aangepast op rijst als modelgewas en geëvalueerd op gevoeligheid met betrekking tot het probleem van de “lage-niveau aanwezigheid” (“low level presence”).
Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek (ILVO)
Een nieuw anker-PCR protocol met geautomatiseerde fl uorescente detectie via capillaire gel electroforese (CGE), ontwikkeld binnen ILVO tijdens het FOD-RF project GMODETEC, zal in dit project getest worden op rijst DNA. Eerst zal een selectie gemaakt worden van fl ankerende sequenties die gekend moeten zijn, op basis van de gDNA library voor rijst die zal gescreend worden. Voor geselecteerde target elementen zullen telkens 3 “anker primers” ontwikkeld worden (primers 2 en 3 “nested” ten opzichte van primer 1), die met verschillende restrictie-enzymen (en primers) zullen gecombineerd worden. Een databank van unieke anker-PCR fi ngerprint patronen zal worden aangelegd voor een set aan gekende, bekende rijst events. Van het geoptimaliseerde protocol zullen daarna de gevoeligheid, detectiegrens en specifi citeit worden bepaald.
Naast de ontwikkeling van nieuwe high-tech methoden en technologieën, zullen bestaande technieken geëvalu-eerd worden op hun bruikbaarheid voor het opsporen van UGMs en tevens uitgebreid naar GGO rijst als mo-delplant. Hiertoe behoren generische DNA kwaliteits- of integriteitstesten, PCR inhibitietesten, PCR-gebaseerde screening testen en combinatie van screening elementen in een matrix model, PCR element hopping en event-specifi eke PCR analyse. Een combinatie van de hierboven beschreven tools zal gebruikt worden om na te gaan in hoeverre hiermee de natuur van een “onverklaarbaar signaal” verder kan geanalyseerd worden.
2726
Centre Wallon de Recherches Agronomiques (CRA-W)
De bijdrage van CRA-W aan het project betreft voornamelijk de beoordeling van nieuwe DNA analytische technie-ken die behoren tot de zogenaamde “Next Generation Sequencing” (NGS) categorie voor detectie van genetische modifi caties op rijst als model. In de afgelopen jaren is de sequeneringstechnologie inderdaad steeds effi ciënter geworden. Het is nu mogelijk om een volledig genoom op korte tijd tegen een betaalbare prijs te sequeneren. De limieten van de aanpak zijn echter meer en meer te situeren bij de processing van de gegenereerde grote datasets. Op basis van de resultaten verkregen met rijst, zal het mogelijk zijn te stellen wanneer dergelijke technie-ken van belang kunnen zijn in een globale strategie van opsporing van UGMs. De toe te passen techniek bestaat uit de uitvoering van een NGS aanpak, echter waar slechts een fractie van het totale DNA extract gesequeneerd wordt, na een verrijkingsstap die fragmenten selecteert waarin een stuk van een bekende screening element aanwezig is. Een overdracht van enkele real-time PCR DNA targets naar analytische pyrosequencing waar targets gesequeneerd worden in slechts 2 uur tegen een prijs vergelijkbaar met die van real-time PCR, zal ook worden beoogd.
Daarnaast is het CRA-W ook betrokken bij de ontwikkeling van nieuwe screening elementen met een speciale focus op transgene dieren (genetische gemodifi ceerde vis).
En nu?
Corrigendum:
In de inleiding van het artikel “Het GMOseek onderzoeksproject (2009 – 2011) voor het opsporen van GGO’s” verschenen in Labinfo Nr. 7 van januari 2012 dient de zin:
“Het GMOseek onderzoeksproject (SAFEFOODERA: “Food Safety – forming a European platform for protec-ting consumers against health risks”) werd gefi nancierd door de Europese Commissie in het kader van het ERA-NET platform voor de bescherming van de consument tegen gezondheidsrisico’s en liep van 1 juni 2009 t/m 31 mei 2011.”
gelezen te worden als:
“Het GMOseek onderzoeksproject (SAFEFOODERA: “Food Safety – forming a European platform for protec-ting consumers against health risks”) werd gefi nancierd door het Food Standards Agency (FSA, Ver-enigd Koninkrijk) en het Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmiddelsicherheit (BVL, Duitsland) in het kader van het ERA-NET platform voor de bescherming van de consument tegen gezond-heidsrisico’s en liep van 1 juni 2009 t/m 31 mei 2011.”
28
Screening van residuen van bestrijdingsmiddelen door time-of-flight analysatoren (ToF): Mythe of realiteit?
Laure Joly en Vincent HanotWIV-ISP, Juliette Wytsmanstraat 14, 1050 Brussel
Bericht aan de passagiers bestrijdingsmiddelen, u moet …… zich aanbieden aan het loket van de luchthaven
Bijna 800 bestrijdingsmiddelen zijn momenteel door de Europese Unie geïnventariseerd. Momenteel is de triple quadrupole MRM-mode (Multiple Reaction Monitoring) met vloeistof- of gaschromatografie de analysator die doorgaans het meest gebruikt wordt om gelijktijdig naar verschillende honderden molecules te zoeken. Met dit toestel wordt elk potentieel bestrijdingsmiddel gevolgd via twee MRM-transities. Het aantal samen te analyseren bestrijdingsmiddelen neemt echter voortdurend toe en het aantal MRM-transities is jammer genoeg niet on-beperkt. Niettemin zijn er op dit ogenblik alternatieve oplossingen in ontwikkeling voor deze triple quadrupole analyses. Hieronder is de ToF (Time of Flight) analysator ongetwijfeld de meest ondersteunde en kan men een “screening” uitvoeren voorafgaand aan de kwantificering van de bestrijdingsmiddelen. Bovendien blijkt dat dit type massa-spectrometrie perfect voldoet aan de nieuwe SANCO 12495/2011 criteria [1]. Ten slotte, gezien de laatste ontwik-kelingen van de constructeurs, blijkt dat het meer dan ooit tijd is dat onze bestrijdingsmiddelen…
… zich naar de gate begeven om aan boord te gaan
De time-of-flight analysator (ToF) maakt het mogelijk de verhouding massa/ionlading (m/z) van een ion af te leiden uit de tijd (t) die het nodig heeft om de flight tube te doorlopen en de detector te bereiken. Voordat de ionen de tube ingaan worden ze geaccelereerd dankzij een elektrische potentiaal (U) met een gekende waarde. De potentiële energie die op die manier opgeslagen wordt komt overeen met
Ep = zeU, met e de elementaire lading.
Eens in de tube (met lengte L) evolueren de ionen onder ultravacuümtoestand en wordt hun potentiële energie volledig omgezet in kinetische energie :
Ec = 1/2mv2, met v de snelheid van het ion
Aangezien Ep = Ec en v = L/t, blijkt dat :
m/z = t2 . Cste
In de praktijk betekent dit dat een ion met een verhouding m/z gelijk aan 100 er twee keer zo lang over doet om de flight tube te doorlopen dan een ion met een ratio m/z gelijk aan 25. Nu de theorie verwerkt is, is het tijd om…
2928
… de geluidsmuur te doorbreken
De opeenvolgende technologische vorderingen hebben de werking van de ToF radicaal veranderd.Eerst en vooral kon door het plaatsen van een reflectron (spiegel of elektrostatische reflector) het verschil in potentiële energie tussen ionen met dezelfde ratio m/z worden gecompenseerd door een verschillende traject-lengte binnen dezelfde reflectron, zodat ze samen op de detector toekomen. In tweede instantie het opstellen van de pusher. Aangezien de electrospray bron op ononderbroken wijze ionen opwekt, wordt het gevaarlijk om een referentietijd (t = 0) te bepalen eigen aan elk ion en ter aanduiding van de invoering ervan in de buis. Om dit lastig probleem op te lossen, wordt vandaag de dag een “pusher” aangewend. Door toepassing van een orthogonale acceleratie van ionen kan dit onderdeeltje de ionen aan de ingang van de ToF bijeenbundelen. Bovendien kan dit ingenieus procedé eveneens de aanwezigheid van ongeladen deeltjes vermijden. Tenslotte ziet men erop toe dat een zeer lage druk (~5.10-11 bar) in de ToF wordt aangehouden en dit om elke fragmentering te vermijden die kan ontstaan doordat versnelde ionen en de omgeving met elkaar botsen.
Figuur 1: Traject van ionen in een flight tube, de reflectron compenseert het verkregen energieverschil voordat ze de flight tube binnengaan: de blauwe en rode ionen met dezelfde massa komen op hetzelfde moment in de detector toe.
… de geluidsmuur te doorbreken
De opeenvolgende technologische vorderingen hebben de werking van de ToF radicaal veranderd. Eerst en vooral kon door het plaatsen van een reflectron (spiegel of elektrostatische reflector) het verschil in potentiële energie tussen ionen met dezelfde ratio m/z worden gecompenseerd door een verschillende trajectlengte binnen dezelfde reflectron, zodat ze samen op de detector toekomen. In tweede instantie het opstellen van de pusher. Aangezien de electrospray bron op ononderbroken wijze ionen opwekt, wordt het gevaarlijk om een referentietijd (t = 0) te bepalen eigen aan elk ion en ter aanduiding van de invoering ervan in de buis. Om dit lastig probleem op te lossen, wordt vandaag de dag een "pusher" aangewend. Door toepassing van een orthogonale acceleratie van ionen kan dit onderdeeltje de ionen aan de ingang van de ToF bijeenbundelen. Bovendien kan dit ingenieus procedé eveneens de aanwezigheid van ongeladen deeltjes vermijden. Tenslotte ziet men erop toe dat een zeer lage druk (~5.10-11 bar) in de ToF wordt aangehouden en dit om elke fragmentering te vermijden die kan ontstaan doordat versnelde ionen en de omgeving met elkaar botsen.
Pusher
Detector
Reflectron
Source
Pusher
Detector
Reflectron
Source
Figuur 1: Traject van ionen in een flight tube, de reflectron compenseert het verkregen energieverschil voordat ze de flight tube binnengaan: de blauwe en rode ionen met dezelfde massa komen op hetzelfde moment in de detector toe. Vóór de take-off…
30
Vóór de take-off…… nemen we contact op met de controletoren
Logboek van de copiloot
De resolutie is de capaciteit van de analysator om twee verwante verbindingen m/z te scheiden en wordt aangeduid door R=m/δm. Het meten van de resolutie voor een ion dat van de massa (m) gescheiden is bestaat uit het meten van het massadefect (δm) op halve hoogte.
De nauwkeurigheid betref-fende de m/z meting van de geanalyseerde molecule geeft het vermogen weer om een massa zo dicht mogelijk bij de theoretische massa te benade-ren. Deze meting moet precies en exact zijn.
In de massa spectrometrie wordt de meetfout (die de nauwkeurigheid definieert) uitgedrukt ofwel in dalton (abso-lute waarde),fout (Da) = M
exp - M
th
- ofwel in parts per million (relatieve waarde), fout (ppm) = | M
exp – M
th| / M
th * 106
Identificatie van bestrijdingsmiddelen is gedeeltelijk gebaseerd op de moleculaire massa in het geval van een ToF en niet op MRM ouder-fragment transities zoals het geval zou zijn met een triple quadrupool. Het is dus cruciaal de massa’s nauwkeurig te meten wanneer een ToF analysator wordt gebruikt. Om zich ervan te verzekeren dat de gemeten massa zo dicht mogelijk bij de the-oretische waarde ligt, worden gevoeligheid, nauwkeurigheid en resolutie als volgt geoptimaliseerd : • In eerste instantie worden de werkingsparameters van de bron, van de transfer en van de ToF geoptimaliseerd met een compo-nent met een massa die gelijk is aan die van de te ontleden bestrij-dingsmiddelen. • In tweede instantie wordt een externe kalibratie uitgevoerd om een massa te krijgen die dicht bij de exacte massa op elk punt van het spectrum wordt gemeten. Dergelijke kalibraties worden dagelijks of wekelijks uitgevoerd naargelang het te onderzoeken nauwkeurigheidsniveau. • Ten slotte wordt voortdurend een interne kalibratie uitgevoerd: een referentiecomponent of “lock mass” wordt in de bron geïntro-duceerd samen met analyten en dit gedurende de hele analyse. Deze laatste fase maakt het mogelijk de variaties te doorbreken die na verloop van tijd zouden kunnen ontstaan (te wijten aan bijvoorbeeld temperatuursveranderingen). De vluchtomstandig-heden lijken nu optimaal en we kunnen ons…
… vluchtplan opstellen
Eerst en vooral, rekening houdend met het feit dat er vooraf geen enkele selectie van massa gebeurd is door de ToF analysator, zijn alle ionen die binnen de bron gegenereerd zijn gelijktijdig opge-spoord: de meeste opgespoorde ionen zijn die van de matrix. Het chromatogram verkregen voor een matrix van een mandarijn die geen enkel bestrijdingsmiddel bevat wordt weergegeven in figuur 2. Met een triple quadrupool worden dezelfde ionen gegenereerd in de bron, maar de analysator dient als filter en die ionen worden niet opgespoord.
3130
Figuur 2: Chromatogram van een matrix van mandarijn die geen enkel bestrijdingsmiddel bevat
Ten slotte worden de bestrijdingsmiddelen geïdentifi ceerd waarbij men zich baseert op de hoge resolutie en de hoge massanauwkeurigheid van de ToF analysator. De gezochte massa is de monoïsotopische massa die over-eenstemt met de eerste piek van het isotopisch profi el. Die piek houdt slechts rekening met de massa’s van de meest stabiele isotopen (fi guur 3). Ter vergelijking, met een triple quadrupool zijn de gemiddelde ionenmassa’s de gezochte massa’s.
Figuur 3: in het zwart de gemiddelde theoretische massa van cyprodinil en in het paars de theoretische monoïsotopische massa
0 2 4 6 8 10 12 14 Time (min)
220 225 230
Average mass226.2969
Monoisotopicmass
226.1344
m/z
32
Na deze beschouwingen, is het tijd voor…… een proefvlucht
Bij de analyse met een ToF vergelijkt een softwareprogramma de theoretische monoïsotopische massa’s (Mth
) van elk bestrijdingsmiddel met verschillende massa’s van het massaspectrum (M
exp). Een tolerantie van 5 à 10 ppm
wordt over het algemeen aanvaard. Aan de hand van het totale chromatogram van een monster van mandarijn (fi guur 4a), wordt de aanwezigheid van cyprodinil bevestigd met een chromatografi sche retentietijd van 8.38 min door het chromatogram dat overeenstemt met zijn theoretische monoïsotopische massa (226.1344) met een tolerantie van 10 ppm te fi ltreren (fi guur 4b).
Figuur 4: (a) chromatogram van een monster van mandarijn, (b) chromatogram van hetzelfde monster dat gefi l-terd is voor de massa 226.1344 (theoretische massa van cyprodinil) met een tolerantie van 10 ppm
Het massaspectrum gekoppeld aan de retentietijd van 8.38 min wordt weergegeven in fi guur 5a. De software om de ruis weg te fi lteren is zeer nuttig om een bestrijdingsmiddel te identifi ceren onder het zeer groot aantal massa’s (fi guur 5b).
Time2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00
%
0
100
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00
%
0
1001: TOF MS ES+
BPI1.02e5
1: TOF MS ES+ 226.134 10PPM
1.42e38.38
a)
b)
(min)Time
(min)Time
3332
m/z200 400 600 800 1000
%
0
100SG20110126-9 2184 (8.421) Cm (2153:2191)
b)4.78e4
300.2084
m/z200 400 600 800 1000
%
0
100100100SG20110126-9 2184 (8.421) Cm (2152:2191-(2128:2151+2191:2217))
1.19e4a)217.1115217.1115217.1115 226.1350226.1350226.1350
SG20110126-9 2184 (8.421) Cm (2153:2191)SG20110126-9 2184 (8.421) Cm (2152:2191-(2128:2151+2191:2217))
Figuur 5: massaspectra gekoppeld aan de retentietijd van 8.38 min zonder (a) en met (b) aftrek van de ruis.
Na deze geslaagde luchtdoop, is het tijd…… voor een langeafstandsvlucht
Bij een screening worden honderden bestrijdingsmiddelen onderzocht: er wordt gepeild naar de gekende retentietijd/theoretische monoïsotopische massa van ieder bestrijdingsmiddel. De voorafgaande stappen worden honderden keren automatisch of halfautomatisch herhaald. De verschillende spanningen van de bron (capillair, conisch) en de transmissiespanningen van een ToF kunnen echter niet worden geïndividualiseerd. Immers, omgekeerd aan wat gebeurt met een triple quadrupool zijn met een ToF gemiddelde generieke vereisten voor alle bestrijdingsmiddelen van toepassing. Elke niet optimale span-ning voor een gegeven bestrijdingsmiddel vermindert bijgevolg de kans dat die intact op de detector aankomt. Een gebrekkige spanning is voldoende om een bestrijdingsmiddel slecht te ioniseren, slecht te fragmenteren of niet door te geven. Een lichte massaverschuiving bij het kalibreren is ook voldoende om het bestrijdingsmiddel uit de tolerantiezone van 10 ppm te wippen. Die verschuivingen komen voor wanneer de intensiteit van het signaal te zwak is: de vorm van de piek is slecht gedefi nieerd en de massanauwkeurigheid vermindert, maar ook wanneer het signaal te intens is. Verzadiging van de detector leidt tot een vervorming van de piek en er vindt een verschuiving van de massa plaats. Een kalibratieverlies na verloop van tijd of een kortstondige verblinding van de detector door een zeer intense piek van de matrix kunnen eveneens leiden tot problemen met massanauwkeurigheid.De matrices waarin de bestrijdingsmiddelen worden onderzocht zijn zeer gevarieerd en beïnvloeden elk op hun manier de ionisatie, de transmissie en de opsporing van bestrijdingsmiddelen: een drastisch verlies van gevoe-ligheid kan worden opgemerkt met een bijzondere matrix voor een gegeven bestrijdingsmiddel zonder dat de vorige analyses in andere matrices een dergelijk probleem konden doen vermoeden.De snelheid van de scan beïnvloedt eveneens de gevoeligheid: hoe trager, hoe hoger de gevoeligheid van het toestel, maar daartegenover vermindert het aantal punten per piek. Dit treft de deconvolutie software en dus ook de massanauwkeurigheid.De verschillende constructeurs stellen alles in het werk om tegelijk de gevoeligheid, de resolutie en de nauw-keurigheid op de nieuwe generatie ToF te verbeteren. Maar het kritisch oog van de analist is nog altijd nodig om vals positieve en vals negatieve resultaten met een ToF te vermijden. Een vals positief resultaat is op zich geen probleem omdat de bevestiging dit resultaat nietig kan verklaren, een vals negatief resultaat daarentegen heeft geen tweede kans. Dit is het einde van de reis, dus is het tijd…
34
… om zachtjes te landen
Tot slot, de ToF is een zeer performant toestel gebaseerd op een eenvoudig principe: de tijd meten waarbinnen een ion een traject aflegt om de massa ervan te kennen. De hoge resolutie, de hoge nauwkeurigheid en de grote gevoeligheid van die toestellen maken het mogelijk om zich enkel te baseren op het meten van de monoïsotopi-sche massa van het bestrijdingsmiddel om die te kunnen identificeren. Men moet daarentegen steeds kritisch blijven wat de resultaten betreft ten opzichte van alle moeilijkheden die bestrijdingsmiddelen met zich kunnen meebrengen in de extractie- en zuiveringsfase, bij de chromatografie en opsporing of bij de verwerking van de resultaten door de software. Gelukkig worden de voornaamste foutenbronnen (vals positieven en vals negatieven) tegengehouden door de verschillende waarschuwingen in de SANCO-criteria. De analist moet aantonen dat hij de detectielimiet (SDL, screening detection limit) van het bestrijdingsmiddel in minstens 95% van de monsters kan opsporen. Vandaag de dag gebruiken verschillende laboratoria op Europees vlak de ToF technologie om in routine screening analyses uit te voeren.
Logboek
[1] SANCO 12495/2011 Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed
3534
Inleiding tot het FP7 – QBOL onderzoeksprojectMartine Maes
ILVO, Instituut voor Landbouw en Visserij Onderzoek, Eenheid Plant,Burg. Van Gansberghelaan 96 bus 2, 9820 Merelbeke
QBOL (Quarantine organisms Barcode Of Life) is een project van 3 jaar (2009 - 2012) dat wordt gefinancierd bin-nen het 7de kaderprogramma van de Europese Unie. Het doel van QBOL is DNA-barcode informatie aan te maken voor getuigenspecimens van quarantainepathogenen en -parasieten. De DNA-sequentie wordt de basis van een publiek toegankelijke, doorzoekbare online databank. Met dat gratis instrument zal men bij middel van de DNA-barcode snel quarantainepathogenen en –parasieten kunnen identificeren op soort niveau. Er zullen volledige protocollen worden opgesteld waarmee eenieder die vertrouwd is met eenvoudige moleculaire technieken zoals PCR snel en makkelijk quarantaineorganismen zal kunnen identificeren.
Focus op: Barcodes voor bacteriën
Het onderzoek met betrekking tot QBOL is opgebouwd rond de verschillende groepen quarantaineorganismen: bacteriën, schimmels, aaltjes, ongewervelde dieren, fytoplasma’s en virussen. De afzonderlijke soorten waarnaar onderzoek wordt gedaan werden bepaald op basis van de EU-richtlijn (2000/29/EG van 8 mei 2000) en de EPPO lijst van organismen waarvoor reglementering als Q organisme aanbevolen wordt (A1, A2 en alarmlijsten). Dr. Martine Maes van het Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek (ILVO) staat aan het hoofd van de ‘Bacte-ria Barcoding’ groep.Binnen die groep zijn de taken in verband met barcoding verdeeld over verschillende QBOL partners: 1. Voor Xanthomonas: Instituut voor Landbouw & Visserij Onderzoek (ILVO), België2. Voor Clavibacter: Laboratorium voor Microbiologie van de Universiteit Gent (UGent), België3. Voor Ralstonia solanacearum en Xylella fastidiosa: Agroscope Changins-Wädenswil Research Station (ACW),
Zwitserland.Er werden totnogtoe zo’n 950 bacteriestammen bestudeerd en meer dan 1750 sequenties aangemaakt. Een be-langrijk werk daarbij was het verzamelen van alle relevante bacteriestammen die de diversiteit weergaven van de bestudeerde Q-bacteriën en hun taxonomisch verwanten en dubbelgangers, epifyten en saprofyten die zich op dezelfde waardplanten kunnen bevinden. De werkcollectie voor QBOL bestaat uit Q-bacteriën die werden geïsoleerd in de diverse geografische regio’s overal ter wereld waar de ziekten voorkomen en uit verschillende waardplanten. Zij werden bijeengebracht uit internationaal erkende bacterieverzamelingen (de meeste stammen werden verkregen uit de Belgische BCCM/LM-UGent collectie), werkcollecties en isolatiecampagnes.
36
Verspreiding van schadelijke bacteriën
Wereldwijd is de belangrijkste weg waarlangs bacteriën worden verspreid die van de handel in en het handelsverkeer van planten en zaaigoed. Sommige processen, zoals de productie van teeltma-teriaal, vinden bijvoorbeeld plaats in streken waar die bacterieziek-ten inheems zijn. Het materiaal wordt dan voor opkweek overge-bracht naar de EU. Bovendien gebeurt een bacteriële infectie van teeltmateriaal vaak zonder symptomen waardoor ze niet wordt opgemerkt tijdens de visuele inspectie bij binnenkomst in de EU. Naast teeltmateriaal kunnen ook insecten die verhandeld worden als bestuivers of als biologische bestrijding, een weg zijn waar-langs schadelijke bacteriën binnenkomen.
Schade en verlies
De omvang van de gevolgen van Q- en Q-alarm-bacteriën in de EU of de gebieden van de EPPO kan alleen maar worden geraamd. Totnogtoe waren de bestrijding van Q organismen en de daarmee gepaard gaande maatrege-len vrij succesvol in het vermijden van de grootschalige verspreiding en vestiging van de ziekteverwekker. Hierna wordt informatie weergegeven, gebaseerd op gegevens van EPPO, over schade en verliezen die worden veroor-zaakt door enkele belangrijke Q-bacteriën, met vermelding van de plaatsen waar die bacteriën inheems zijn of niet worden bestreden.
Inleiding tot het FP7 – QBOL onderzoeksproject
Martine Maes ILVO, Instituut voor Landbouw en Visserij Onderzoek, Eenheid Plant, Burg. Van Gansberghelaan 96 bus 2, 9820 Merelbeke
QBOL (Quarantine organisms Barcode Of Life) is een project van 3 jaar (2009 - 2012) dat wordt gefinancierd binnen het 7de kaderprogramma van de Europese Unie. Het doel van QBOL is DNA-barcode informatie aan te maken voor getuigenspecimens van quarantainepathogenen en -parasieten. De DNA-sequentie wordt de basis van een publiek toegankelijke, doorzoekbare online databank. Met dat gratis instrument zal men bij middel van de DNA-barcode snel quarantainepathogenen en –parasieten kunnen identificeren op soort niveau. Er zullen volledige protocollen worden opgesteld waarmee eenieder die vertrouwd is met eenvoudige moleculaire technieken zoals PCR snel en makkelijk quarantaineorganismen zal kunnen identificeren.
Focus op: Barcodes voor bacteriën
Het onderzoek met betrekking tot QBOL is opgebouwd rond de verschillende groepen quarantaineorganismen: bacteriën, schimmels, aaltjes, ongewervelde dieren, fytoplasma’s en virussen. De afzonderlijke soorten waarnaar onderzoek wordt gedaan werden bepaald op basis van de EU-richtlijn (2000/29/EG van 8 mei 2000) en de EPPO lijst van organismen waarvoor reglementering als Q organisme aanbevolen wordt (A1, A2 en alarmlijsten).
Dr. Martine Maes van het Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek (ILVO) staat aan het hoofd van de 'Bacteria Barcoding' groep.
Binnen die groep zijn de taken in verband met barcoding verdeeld over verschillende QBOL partners:
1. Voor Xanthomonas: Instituut voor Landbouw & Visserij Onderzoek (ILVO), België
2. Voor Clavibacter: Laboratorium voor Microbiologie van de Universiteit Gent (UGent), België
3. Voor Ralstonia solanacearum en Xylella fastidiosa: Agroscope Changins-Wädenswil Research Station (ACW), Zwitserland.
Er werden totnogtoe zo’n 950 bacteriestammen bestudeerd en meer dan 1750 sequenties aangemaakt. Een belangrijk werk daarbij was het verzamelen van alle relevante bacteriestammen die de diversiteit weergaven van de bestudeerde Q-bacteriën en hun taxonomisch verwanten en dubbelgangers, epifyten en saprofyten die zich op dezelfde waardplanten kunnen bevinden.
De werkcollectie voor QBOL bestaat uit Q-bacteriën die werden geïsoleerd in de diverse geografische regio’s overal ter wereld waar de ziekten voorkomen en uit verschillende waardplanten. Zij werden bijeengebracht uit internationaal erkende bacterieverzamelingen (de meeste stammen werden verkregen uit de Belgische BCCM/LM-UGent collectie), werkcollecties en isolatiecampagnes.
Verspreiding van schadelijke bacteriën
Wereldwijd is de belangrijkste weg waarlangs bacteriën worden verspreid die van de handel in en het handelsverkeer van planten en zaaigoed. Sommige processen, zoals de productie van teeltmateriaal, vinden bijvoorbeeld plaats in streken waar die bacterieziekten inheems zijn. Het materiaal wordt dan voor opkweek overgebracht naar de EU. Bovendien gebeurt een
• Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis: tomaat is de economisch belangrijkste waardplant terwijl een aan-tal gevoelige nachtschadigen mogelijke reservoirs van de ziekteverwekker kunnen zijn. Deze bacterie werd het eerst beschreven in 1910 in Noord-Amerika, waar ze vermoedelijk haar oorsprong vindt. Omdat tomatenzaad de belangrijkste lange-afstandsvector van de ziekteverwekker is, werkt de handel in zaaizaad de wereldwijde verspreiding van de ziekte in de hand. Er werden grote verliezen gemeld voor zowel kas- als vollegrondsteelten van tomaten als gevolg van ofwel het afsterven van jonge plantjes of misvormde vruchten. In Noord Carolina (USA) werd in sommige jaren een opbrengstdaling van 70% vastgesteld. Bij recente proeven in Frankrijk werd een opbrengstdaling van 20-30% opgetekend. Op lokaal vlak kan via het gebruik van besmet materieel de ziekte worden over-gebracht op andere planten in dezelfde serre of naar andere serres, percelen of bedrijven. Sinds de ziekte in 1910 voor het eerst werd gemeld in de USA heeft C. michiganensis subsp. michiganensis zich over de hele wereld verspreid.
bacteriële infectie van teeltmateriaal vaak zonder symptomen waardoor ze niet wordt opgemerkt tijdens de visuele inspectie bij binnenkomst in de EU. Naast teeltmateriaal kunnen ook insecten die verhandeld worden als bestuivers of als biologische bestrijding, een weg zijn waarlangs schadelijke bacteriën binnenkomen.
Schade en verlies
De omvang van de gevolgen van Q- en Q-alarm-bacteriën in de EU of de gebieden van de EPPO kan alleen maar worden geraamd. Totnogtoe waren de bestrijding van Q organismen en de daarmee gepaard gaande maatregelen vrij succesvol in het vermijden van de grootschalige verspreiding en vestiging van de ziekteverwekker. Hierna wordt informatie weergegeven, gebaseerd op gegevens van EPPO, over schade en verliezen die worden veroorzaakt door enkele belangrijke Q-bacteriën, met vermelding van de plaatsen waar die bacteriën inheems zijn of niet worden bestreden.
Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis: tomaat is de economisch belangrijkste waardplant terwijl een aantal gevoelige nachtschadigen mogelijke reservoirs van de ziekteverwekker kunnen zijn. Deze bacterie werd het eerst beschreven in 1910 in Noord-Amerika, waar ze vermoedelijk haar oorsprong vindt. Omdat tomatenzaad de belangrijkste lange-afstandsvector van de ziekteverwekker is, werkt de handel in zaaizaad de wereldwijde verspreiding van de ziekte in de hand. Er werden grote verliezen gemeld voor zowel kas- als vollegrondsteelten van tomaten als gevolg van ofwel het afsterven van jonge plantjes of misvormde vruchten. In Noord Carolina (USA) werd in sommige jaren een opbrengstdaling van 70% vastgesteld.
Bij recente proeven in Frankrijk werd een opbrengstdaling van 20-30% opgetekend. Op lokaal vlak kan via het gebruik van besmet materieel de ziekte worden overgebracht op andere planten in dezelfde serre of naar andere serres, percelen of bedrijven. Sinds de ziekte in 1910 voor het eerst werd gemeld in de USA heeft C. michiganensis subsp. michiganensis zich over de hele wereld verspreid.
Ralstonia solanacearum heeft een brede waaier van waardplanten maar de verschillende pathogene variëteiten (rassen) binnen de soort hebben een kleinere reeks van waardplanten. Binnen het EPPO-gebied heeft ras 3 maar weinig waardplantsoorten maar daartoe behoren wel belangrijke gewassen zoals aardappelen en tomaten en het onkruid Solanum dulcamara dat een grote rol speelt als reservoir van de bacterie langsheen waterlopen en in irrigatiesystemen. Daarnaast kunnen ook andere waardplanten worden aangetast in de warmere delen van het EPPO-gebied waar de bacterie reeds voorkomt. De grootste economische schade werd gemeld in aardappelen, tabak en tomaten in het zuidoosten van de USA en in Brazilië, Colombia, Zuid-Afrika, Indonesië en India. Soms werd een verlies van de hele tomatenoogst gemeld. Het is ook zo dat meer dan 200, vooral tropische en subtropsiche, plantensoorten gevoelig zijn voor een of meer rassen van R. solanacearum. In het stroomgebied van de Amazone in Peru is bijvoorbeeld de helft van de bananenplantages aangetast.
Xanthomonas oryzae omvat twee niet-Europese ziekteverwekkers bij rijst, de pathovars oryzae en oryzicola. Die pathovars tasten een aantal wilde of minder vaak gekweekte Poaceae aan maar ook onkruidsoorten die als locale vectoren kunnen optreden terwijl de verspreiding over grote afstanden gebeurt via besmet rijstzaad. Bacterieverwelkingsziekte wordt veroorzaakt door X. oryzae pv. oryzae en is de ernstigste ziekte die in Zuid-Oost-Azië voorkomt in rijst. Op de Filippijnen lopen de verliezen in gevoelige teelten op tot zo’n 22,5% in het regenseizoen en 7,2% in het droogseizoen. Het is bekend dat stikstofbemesting de
gevoeligheid voor de ziekte vergroot. X. oryzae pv. oryzicola veroorzaakt
3736
• Ralstonia solanacearum heeft een brede waaier van waard-planten maar de verschillende pathogene variëteiten (rassen) binnen de soort hebben een kleinere reeks van waardplanten. Binnen het EPPO-gebied heeft ras 3 maar weinig waardplant-soorten maar daartoe behoren wel belangrijke gewassen zoals aardappelen en tomaten en het onkruid Solanum dulcamara dat een grote rol speelt als reservoir van de bacterie langsheen waterlopen en in irrigatiesystemen. Daarnaast kunnen ook andere waardplanten worden aangetast in de warmere delen van het EPPO-gebied waar de bacterie reeds voorkomt. De grootste economische schade werd gemeld in aardappelen, tabak en tomaten in het zuidoosten van de USA en in Brazilië, Colombia, Zuid-Afrika, Indonesië en India. Soms werd een verlies van de hele tomatenoogst gemeld. Het is ook zo dat meer dan 200, vooral tropische en subtropsiche, plantensoor-ten gevoelig zijn voor een of meer rassen van R. solanacearum. In het stroomgebied van de Amazone in Peru is bijvoorbeeld de helft van de bananenplantages aangetast.
• Xanthomonas oryzae omvat twee niet-Europese ziekteverwek-kers bij rijst, de pathovars oryzae en oryzicola. Die pathovars tasten een aantal wilde of minder vaak gekweekte Poaceae aan maar ook onkruidsoorten die als locale vectoren kunnen optreden terwijl de verspreiding over grote afstanden gebeurt via besmet rijstzaad. Bacterieverwelkingsziekte wordt veroor-zaakt door X. oryzae pv. oryzae en is de ernstigste ziekte die in Zuid-Oost-Azië voorkomt in rijst. Op de Filippijnen lopen de verliezen in gevoelige teelten op tot zo’n 22,5% in het regenseizoen en 7,2% in het droogseizoen. Het is bekend dat stikstofbemesting de gevoeligheid voor de ziekte vergroot. X.
oryzae pv. oryzicola veroorzaakt bladstrepenziekte en is in een aantal gebieden belangrijk in zeer natte seizoenen en bij hoge stikstofgehalten. In India werden verliezen van 5-30% gemeld maar in het algemeen is bladstrepenziekte een minder be-langrijke ziekte dan de bacterieverwelkingsziekte. X. oryzae pv. oryzae is een gevaarlijke ziekteverwekker die niet voorkomt in Europese rijstteelten maar waarschijnlijk wel kan overleven in de landen rond de Middellandse Zee en dan ook een ernstig risico vormt voor het EPPO-gebied.
bacteriële infectie van teeltmateriaal vaak zonder symptomen waardoor ze niet wordt opgemerkt tijdens de visuele inspectie bij binnenkomst in de EU. Naast teeltmateriaal kunnen ook insecten die verhandeld worden als bestuivers of als biologische bestrijding, een weg zijn waarlangs schadelijke bacteriën binnenkomen.
Schade en verlies
De omvang van de gevolgen van Q- en Q-alarm-bacteriën in de EU of de gebieden van de EPPO kan alleen maar worden geraamd. Totnogtoe waren de bestrijding van Q organismen en de daarmee gepaard gaande maatregelen vrij succesvol in het vermijden van de grootschalige verspreiding en vestiging van de ziekteverwekker. Hierna wordt informatie weergegeven, gebaseerd op gegevens van EPPO, over schade en verliezen die worden veroorzaakt door enkele belangrijke Q-bacteriën, met vermelding van de plaatsen waar die bacteriën inheems zijn of niet worden bestreden.
Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis: tomaat is de economisch belangrijkste waardplant terwijl een aantal gevoelige nachtschadigen mogelijke reservoirs van de ziekteverwekker kunnen zijn. Deze bacterie werd het eerst beschreven in 1910 in Noord-Amerika, waar ze vermoedelijk haar oorsprong vindt. Omdat tomatenzaad de belangrijkste lange-afstandsvector van de ziekteverwekker is, werkt de handel in zaaizaad de wereldwijde verspreiding van de ziekte in de hand. Er werden grote verliezen gemeld voor zowel kas- als vollegrondsteelten van tomaten als gevolg van ofwel het afsterven van jonge plantjes of misvormde vruchten. In Noord Carolina (USA) werd in sommige jaren een opbrengstdaling van 70% vastgesteld.
Bij recente proeven in Frankrijk werd een opbrengstdaling van 20-30% opgetekend. Op lokaal vlak kan via het gebruik van besmet materieel de ziekte worden overgebracht op andere planten in dezelfde serre of naar andere serres, percelen of bedrijven. Sinds de ziekte in 1910 voor het eerst werd gemeld in de USA heeft C. michiganensis subsp. michiganensis zich over de hele wereld verspreid.
Ralstonia solanacearum heeft een brede waaier van waardplanten maar de verschillende pathogene variëteiten (rassen) binnen de soort hebben een kleinere reeks van waardplanten. Binnen het EPPO-gebied heeft ras 3 maar weinig waardplantsoorten maar daartoe behoren wel belangrijke gewassen zoals aardappelen en tomaten en het onkruid Solanum dulcamara dat een grote rol speelt als reservoir van de bacterie langsheen waterlopen en in irrigatiesystemen. Daarnaast kunnen ook andere waardplanten worden aangetast in de warmere delen van het EPPO-gebied waar de bacterie reeds voorkomt. De grootste economische schade werd gemeld in aardappelen, tabak en tomaten in het zuidoosten van de USA en in Brazilië, Colombia, Zuid-Afrika, Indonesië en India. Soms werd een verlies van de hele tomatenoogst gemeld. Het is ook zo dat meer dan 200, vooral tropische en subtropsiche, plantensoorten gevoelig zijn voor een of meer rassen van R. solanacearum. In het stroomgebied van de Amazone in Peru is bijvoorbeeld de helft van de bananenplantages aangetast.
Xanthomonas oryzae omvat twee niet-Europese ziekteverwekkers bij rijst, de pathovars oryzae en oryzicola. Die pathovars tasten een aantal wilde of minder vaak gekweekte Poaceae aan maar ook onkruidsoorten die als locale vectoren kunnen optreden terwijl de verspreiding over grote afstanden gebeurt via besmet rijstzaad. Bacterieverwelkingsziekte wordt veroorzaakt door X. oryzae pv. oryzae en is de ernstigste ziekte die in Zuid-Oost-Azië voorkomt in rijst. Op de Filippijnen lopen de verliezen in gevoelige teelten op tot zo’n 22,5% in het regenseizoen en 7,2% in het droogseizoen. Het is bekend dat stikstofbemesting de
gevoeligheid voor de ziekte vergroot. X. oryzae pv. oryzicola veroorzaakt
38
• Gekweekte aardbeien zijn de belangrijkste waardplant van Xanthomonas fragariae, de oorzaak van de bladvlekkenziekte die gekenmerkt wordt door hoekige vlekken op de bladeren. De bacterie werd voor het eerst beschreven in 1962, in Noord-Amerika en werd waarschijnlijk van daaruit naar andere landen overgebracht via plantgoed. X. fragariae leidt tot opbrengst-verlies maar vernietigt de planten meestal niet hoewel bij nat weer en frequent beregenen zware verliezen kunnen optre-den. De ziekte is nu al aanwezig in een aantal aardbeiproduce-rende landen in de EU en kan een vaste stek verwerven in de meeste landen waar aardbeien worden geteeld. In een poging om de verspreiding ervan tegen te gaan werd X. fragariae op-genomen in een lijst van quarantaineziekten in teeltmateriaal en plantgoed.
Barcodes bepalen voor bacteriën
Prokaryoten zijn niet opgenomen in het Barcode of Life project. Het Canadian Centre for DNA Barcoding (CCDB) vermeldt de specifi eke feiten en kenmerken van het bacteriegenoom dat de ontwikkeling van barcodes voor bacteriën kan bemoeilijken. Er bestaat geen ‘universeel’ barcodegen voor bacteriën of prokaryoten. Hoewel de grootste biochemische en genetische diversiteit op aarde te vinden is in de prokaryotische domeinen van de Archaea en de bacteriën verschilt de natuurlijke diversifi catie en dus ook de taxonomische vorming van nieuwe soorten in aanzienlijke mate van de mechanismen die bekend zijn bij de eurokaryoten.
De mate van accumulatie van nieuwe mutaties en het verschijnsel van de laterale genoverdracht resulteert im-mers in een vrij snel evoluerend genoom, eveneens gepaard gaand met virulentie en specialisering in bepaalde waardplanten. Het is daarom moeilijk en wellicht onmogelijk om een universeel barcodegen te vinden voor bac-teriën en de strategie om de zeer aanzienlijke biodiversiteit van die groep van organismen in barcodes te vertalen is onvoldoende ontwikkeld. Een van de grootste moeilijkheden betreft het karakteriseren van de soorten. Dat is allicht ook het geval voor de soorten Xanthomonas, Clavibacter, Pseudomonas en Ralstonia waarin een aantal belangrijke plantenziektenverwekkers voorkomen.
De meeste Q-bacteriën moeten worden geïdentifi ceerd op pathovar- of subsoortniveau. Het is niet mogelijk om één enkel gen te gebruiken dat representatief en betrouwbaar is voor de identifi catie van alle plantpathogene bacteriën die vermeld zijn op de quarantainelijst. Voor elke ontwikkeling is een uitgebreide validatie vereist.
bladstrepenziekte en is in een aantal gebieden belangrijk in zeer natte seizoenen en bij hoge stikstofgehalten. In India werden verliezen van 5-30% gemeld maar in het algemeen is bladstrepenziekte een minder belangrijke ziekte dan de bacterieverwelkingsziekte. X. oryzae pv. oryzae is een gevaarlijke ziekteverwekker die niet voorkomt in Europese rijstteelten maar waarschijnlijk wel kan overleven in de landen rond de Middellandse Zee en dan ook een ernstig risico vormt voor het EPPO-gebied.
Gekweekte aardbeien zijn de belangrijkste waardplant van Xanthomonas fragariae, de oorzaak van de bladvlekkenziekte die gekenmerkt wordt door hoekige vlekken op de bladeren. De bacterie werd voor het eerst beschreven in 1962, in Noord-Amerika en werd waarschijnlijk van daaruit naar andere landen overgebracht via plantgoed. X. fragariae leidt tot opbrengstverlies maar vernietigt de planten meestal niet hoewel bij nat weer en frequent beregenen zware verliezen kunnen optreden. De ziekte is nu al aanwezig in een aantal aardbeiproducerende landen in de EU en kan een vaste stek verwerven in de meeste landen waar
aardbeien worden geteeld. In een poging om de verspreiding ervan tegen te gaan werd X. fragariae opgenomen in een lijst van quarantaineziekten in teeltmateriaal en plantgoed.
Barcodes bepalen voor bacteriën
Prokaryoten zijn niet opgenomen in het Barcode of Life project. Het Canadian Centre for DNA Barcoding (CCDB) vermeldt de specifieke feiten en kenmerken van het bacteriegenoom dat de ontwikkeling van barcodes voor bacteriën kan bemoeilijken. Er bestaat geen
‘universeel’ barcodegen voor bacteriën of prokaryoten. Hoewel de grootste biochemische en genetische diversiteit op aarde te vinden is in de prokaryotische domeinen van de Archaea en de bacteriën verschilt de natuurlijke diversificatie en dus ook de taxonomische vorming van nieuwe soorten in aanzienlijke mate van de mechanismen die bekend zijn bij de eurokaryoten.
De mate van accumulatie van nieuwe mutaties en het verschijnsel van de laterale genoverdracht resulteert immers in een vrij snel evoluerend genoom, eveneens gepaard gaand met virulentie en specialisering in bepaalde waardplanten. Het is daarom moeilijk en wellicht onmogelijk om een universeel barcodegen te vinden voor bacteriën en de strategie om de zeer aanzienlijke biodiversiteit van die groep van organismen in barcodes te vertalen is onvoldoende ontwikkeld. Een van de grootste moeilijkheden betreft het karakteriseren van de soorten. Dat is allicht ook het geval voor de soorten Xanthomonas, Clavibacter, Pseudomonas en Ralstonia waarin een aantal belangrijke plantenziektenverwekkers voorkomen. De meeste Q-bacteriën moeten worden geïdentificeerd op pathovar- of subsoortniveau. Het is niet mogelijk om één enkel gen te gebruiken dat representatief en betrouwbaar is voor de identificatie van alle plantpathogene bacteriën die vermeld zijn op de quarantainelijst. Voor elke ontwikkeling is een uitgebreide validatie vereist.
Symptomen van Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae
bladstrepenziekte en is in een aantal gebieden belangrijk in zeer natte seizoenen en bij hoge stikstofgehalten. In India werden verliezen van 5-30% gemeld maar in het algemeen is bladstrepenziekte een minder belangrijke ziekte dan de bacterieverwelkingsziekte. X. oryzae pv. oryzae is een gevaarlijke ziekteverwekker die niet voorkomt in Europese rijstteelten maar waarschijnlijk wel kan overleven in de landen rond de Middellandse Zee en dan ook een ernstig risico vormt voor het EPPO-gebied.
Gekweekte aardbeien zijn de belangrijkste waardplant van Xanthomonas fragariae, de oorzaak van de bladvlekkenziekte die gekenmerkt wordt door hoekige vlekken op de bladeren. De bacterie werd voor het eerst beschreven in 1962, in Noord-Amerika en werd waarschijnlijk van daaruit naar andere landen overgebracht via plantgoed. X. fragariae leidt tot opbrengstverlies maar vernietigt de planten meestal niet hoewel bij nat weer en frequent beregenen zware verliezen kunnen optreden. De ziekte is nu al aanwezig in een aantal aardbeiproducerende landen in de EU en kan een vaste stek verwerven in de meeste landen waar
aardbeien worden geteeld. In een poging om de verspreiding ervan tegen te gaan werd X. fragariae opgenomen in een lijst van quarantaineziekten in teeltmateriaal en plantgoed.
Barcodes bepalen voor bacteriën
Prokaryoten zijn niet opgenomen in het Barcode of Life project. Het Canadian Centre for DNA Barcoding (CCDB) vermeldt de specifieke feiten en kenmerken van het bacteriegenoom dat de ontwikkeling van barcodes voor bacteriën kan bemoeilijken. Er bestaat geen
‘universeel’ barcodegen voor bacteriën of prokaryoten. Hoewel de grootste biochemische en genetische diversiteit op aarde te vinden is in de prokaryotische domeinen van de Archaea en de bacteriën verschilt de natuurlijke diversificatie en dus ook de taxonomische vorming van nieuwe soorten in aanzienlijke mate van de mechanismen die bekend zijn bij de eurokaryoten.
De mate van accumulatie van nieuwe mutaties en het verschijnsel van de laterale genoverdracht resulteert immers in een vrij snel evoluerend genoom, eveneens gepaard gaand met virulentie en specialisering in bepaalde waardplanten. Het is daarom moeilijk en wellicht onmogelijk om een universeel barcodegen te vinden voor bacteriën en de strategie om de zeer aanzienlijke biodiversiteit van die groep van organismen in barcodes te vertalen is onvoldoende ontwikkeld. Een van de grootste moeilijkheden betreft het karakteriseren van de soorten. Dat is allicht ook het geval voor de soorten Xanthomonas, Clavibacter, Pseudomonas en Ralstonia waarin een aantal belangrijke plantenziektenverwekkers voorkomen. De meeste Q-bacteriën moeten worden geïdentificeerd op pathovar- of subsoortniveau. Het is niet mogelijk om één enkel gen te gebruiken dat representatief en betrouwbaar is voor de identificatie van alle plantpathogene bacteriën die vermeld zijn op de quarantainelijst. Voor elke ontwikkeling is een uitgebreide validatie vereist.
Symptomen van Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae
3938
bladstrepenziekte en is in een aantal gebieden belangrijk in zeer natte seizoenen en bij hoge stikstofgehalten. In India werden verliezen van 5-30% gemeld maar in het algemeen is bladstrepenziekte een minder belangrijke ziekte dan de bacterieverwelkingsziekte. X. oryzae pv. oryzae is een gevaarlijke ziekteverwekker die niet voorkomt in Europese rijstteelten maar waarschijnlijk wel kan overleven in de landen rond de Middellandse Zee en dan ook een ernstig risico vormt voor het EPPO-gebied.
Gekweekte aardbeien zijn de belangrijkste waardplant van Xanthomonas fragariae, de oorzaak van de bladvlekkenziekte die gekenmerkt wordt door hoekige vlekken op de bladeren. De bacterie werd voor het eerst beschreven in 1962, in Noord-Amerika en werd waarschijnlijk van daaruit naar andere landen overgebracht via plantgoed. X. fragariae leidt tot opbrengstverlies maar vernietigt de planten meestal niet hoewel bij nat weer en frequent beregenen zware verliezen kunnen optreden. De ziekte is nu al aanwezig in een aantal aardbeiproducerende landen in de EU en kan een vaste stek verwerven in de meeste landen waar
aardbeien worden geteeld. In een poging om de verspreiding ervan tegen te gaan werd X. fragariae opgenomen in een lijst van quarantaineziekten in teeltmateriaal en plantgoed.
Barcodes bepalen voor bacteriën
Prokaryoten zijn niet opgenomen in het Barcode of Life project. Het Canadian Centre for DNA Barcoding (CCDB) vermeldt de specifieke feiten en kenmerken van het bacteriegenoom dat de ontwikkeling van barcodes voor bacteriën kan bemoeilijken. Er bestaat geen
‘universeel’ barcodegen voor bacteriën of prokaryoten. Hoewel de grootste biochemische en genetische diversiteit op aarde te vinden is in de prokaryotische domeinen van de Archaea en de bacteriën verschilt de natuurlijke diversificatie en dus ook de taxonomische vorming van nieuwe soorten in aanzienlijke mate van de mechanismen die bekend zijn bij de eurokaryoten.
De mate van accumulatie van nieuwe mutaties en het verschijnsel van de laterale genoverdracht resulteert immers in een vrij snel evoluerend genoom, eveneens gepaard gaand met virulentie en specialisering in bepaalde waardplanten. Het is daarom moeilijk en wellicht onmogelijk om een universeel barcodegen te vinden voor bacteriën en de strategie om de zeer aanzienlijke biodiversiteit van die groep van organismen in barcodes te vertalen is onvoldoende ontwikkeld. Een van de grootste moeilijkheden betreft het karakteriseren van de soorten. Dat is allicht ook het geval voor de soorten Xanthomonas, Clavibacter, Pseudomonas en Ralstonia waarin een aantal belangrijke plantenziektenverwekkers voorkomen. De meeste Q-bacteriën moeten worden geïdentificeerd op pathovar- of subsoortniveau. Het is niet mogelijk om één enkel gen te gebruiken dat representatief en betrouwbaar is voor de identificatie van alle plantpathogene bacteriën die vermeld zijn op de quarantainelijst. Voor elke ontwikkeling is een uitgebreide validatie vereist.
Symptomen van Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae
Symptomen van Xanthomonas axonopodis pv. dieff enbachiae
40
Strategie in verband met barcoding
De barcode-identificatiestrategie voor de verschillende in deze studie geprioriteerde doelgroepen verloopt vol-gens een beslissingsschema. • Als eerste verkennende proef wordt de sequenering van het 16S rRNA gen voorgesteld als men vooraf geen
idee heeft van het type (genus) bacterie dat uit een plantaardig product werd geïsoleerd. • In de volgende stap gebruiken wij één universele genlocus om bacteriën binnen het genus van elkaar te
onderscheiden. Dat resultaat kan worden bevestigd bij middel van een tweede barcode.• Om een nog verder doorgedreven onderscheid te maken op het niveau van de pathovar of het fylotype wor-
den extra barcodes in andere kern- of bijgebieden van het gen geïdentificeerd.
Dat is de basis voor de identificatie van quarantainebacteriën en bijgevolg van het hele concept van de fytosani-taire risicobeoordeling.
Strategie in verband met barcoding
De barcode-identificatiestrategie voor de verschillende in deze studie geprioriteerde doelgroepen verloopt volgens een beslissingsschema. Als eerste verkennende proef wordt de sequenering
van het 16S rRNA gen voorgesteld als men vooraf geen idee heeft van het type (genus) bacterie dat uit een plantaardig product werd geïsoleerd.
In de volgende stap gebruiken wij één universele genlocus om bacteriën binnen het genus van elkaar te onderscheiden. Dat resultaat kan worden bevestigd bij
middel van een tweede barcode. Om een nog verder doorgedreven onderscheid te maken op het niveau van
de pathovar of het fylotype worden extra barcodes in andere kern- of bijgebieden van het gen geïdentificeerd.
Dat is de basis voor de identificatie van quarantainebacteriën en bijgevolg van het hele concept van de fytosanitaire risicobeoordeling.
Strategie in verband met barcoding
De barcode-identificatiestrategie voor de verschillende in deze studie geprioriteerde doelgroepen verloopt volgens een beslissingsschema. Als eerste verkennende proef wordt de sequenering
van het 16S rRNA gen voorgesteld als men vooraf geen idee heeft van het type (genus) bacterie dat uit een plantaardig product werd geïsoleerd.
In de volgende stap gebruiken wij één universele genlocus om bacteriën binnen het genus van elkaar te onderscheiden. Dat resultaat kan worden bevestigd bij
middel van een tweede barcode. Om een nog verder doorgedreven onderscheid te maken op het niveau van
de pathovar of het fylotype worden extra barcodes in andere kern- of bijgebieden van het gen geïdentificeerd.
Dat is de basis voor de identificatie van quarantainebacteriën en bijgevolg van het hele concept van de fytosanitaire risicobeoordeling.
Strategie in verband met barcoding
De barcode-identificatiestrategie voor de verschillende in deze studie geprioriteerde doelgroepen verloopt volgens een beslissingsschema. Als eerste verkennende proef wordt de sequenering
van het 16S rRNA gen voorgesteld als men vooraf geen idee heeft van het type (genus) bacterie dat uit een plantaardig product werd geïsoleerd.
In de volgende stap gebruiken wij één universele genlocus om bacteriën binnen het genus van elkaar te onderscheiden. Dat resultaat kan worden bevestigd bij
middel van een tweede barcode. Om een nog verder doorgedreven onderscheid te maken op het niveau van
de pathovar of het fylotype worden extra barcodes in andere kern- of bijgebieden van het gen geïdentificeerd.
Dat is de basis voor de identificatie van quarantainebacteriën en bijgevolg van het hele concept van de fytosanitaire risicobeoordeling.
4140
Lijst van prioritaire Q-bacteriën voor barcoding
Op de gecombineerde lijst van de EPPO en de EU (EU-Richtlijn 2000/29/EG) staan thans 27 Q- en Q-alert-bacteriën (fytoplasma’s en ‘candidatus’ bacteriën niet inbegrepen). Men weet intussen dat een aantal in de lijst vermelde Q-bacteriën heterogenetisch zijn en dat vele ook als pathovars worden vermeld. Die indeling beoogt een bijzonder doel en steunt op een pathologisch kenmerk dat taxono-misch irrelevant is.
Binnen QBOL werd een eerste doelgroep van Q-bacteriën bepaald; het gaat om een aantal Xanthomonas soorten en pathovars, 3 Clavibacter michiganensis sub-soorten, Ralstonia solanacearum en Xylella fastidiosa. Bij die keuze werd rekening gehouden met de Q-relevantie en de verwachte rendabiliteit alsook met de complexiteit binnen de taxa.
Ralstonia solanacearum
Lijst van prioritaire Q-bacteriën voor barcoding
Op de gecombineerde lijst van de EPPO en de EU (EU-Richtlijn 2000/29/EG) staan thans 27 Q- en Q-alert-bacteriën (fytoplasma’s en ‘candidatus’ bacteriën niet inbegrepen). Men weet intussen dat een aantal in de lijst vermelde Q-bacteriën heterogenetisch zijn en dat vele ook als pathovars worden vermeld. Die indeling beoogt een bijzonder doel en steunt op een pathologisch kenmerk dat taxonomisch irrelevant is.
Binnen QBOL werd een eerste doelgroep van Q-bacteriën bepaald; het gaat om een aantal Xanthomonas soorten en pathovars, 3 Clavibacter michiganensis subsoorten, Ralstonia solanacearum en Xylella fastidiosa. Bij die keuze werd rekening gehouden met de Q-relevantie en de verwachte rendabiliteit alsook met de complexiteit binnen de taxa.
Ralstonia solanacearum
De lijst van prioritaire bacteriën voor barcoding conform de wetgeving betreffende planten van de EU en de EPPO.
Bijlage 2000/29/EC EPPO
Xylella fastidiosa I A A1
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus I A A2
Pseudomonas solanacearum = Ralstonia solanacearum I A A2
Xanthomonas stammen die pathogen zijn voor citrusvruchten
II A A1
Xanthomonas oryzae pv. oryzae & oryzicola II A A1
Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus II A A2
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis II A A2
Xanthomonas campestris (axonopodis) pv. phaseoli II A A2
Xanthomonas vesicatoria &
X. campestris (axonopodis) pv. vesicatoria
II A A2
Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae A2
Xanthomonas axonopodis pv. allii A1
Xanthomonas fragariae II A A2
Xanthomonas translucens pv. translucens A2
- Xylella fastidiosa is een belangrijke ziekteverwekker bij planten; veroorzaakt dwerggroei bij perzik, brandvlekkenziekte bij oleander, Pierce’s disease en bonte chlorose bij citrusvruchten (CVC).
- Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus veroorzaakt een aardappelziekte die bekend staat als ringrot vanwege de manier waarop ze het vaatweefsel in aardappelknollen infecteert.
- Ralstonia solanacearum veroorzaakt bacteriële verwelking bij een groot aantal mogelijke waardplanten zoals aardappel, tomaat, peper, aubergine en Pelargonium.
Lijst van prioritaire Q-bacteriën voor barcoding
Op de gecombineerde lijst van de EPPO en de EU (EU-Richtlijn 2000/29/EG) staan thans 27 Q- en Q-alert-bacteriën (fytoplasma’s en ‘candidatus’ bacteriën niet inbegrepen). Men weet intussen dat een aantal in de lijst vermelde Q-bacteriën heterogenetisch zijn en dat vele ook als pathovars worden vermeld. Die indeling beoogt een bijzonder doel en steunt op een pathologisch kenmerk dat taxonomisch irrelevant is.
Binnen QBOL werd een eerste doelgroep van Q-bacteriën bepaald; het gaat om een aantal Xanthomonas soorten en pathovars, 3 Clavibacter michiganensis subsoorten, Ralstonia solanacearum en Xylella fastidiosa. Bij die keuze werd rekening gehouden met de Q-relevantie en de verwachte rendabiliteit alsook met de complexiteit binnen de taxa.
Ralstonia solanacearum
De lijst van prioritaire bacteriën voor barcoding conform de wetgeving betreffende planten van de EU en de EPPO.
Bijlage 2000/29/EC EPPO
Xylella fastidiosa I A A1
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus I A A2
Pseudomonas solanacearum = Ralstonia solanacearum I A A2
Xanthomonas stammen die pathogen zijn voor citrusvruchten
II A A1
Xanthomonas oryzae pv. oryzae & oryzicola II A A1
Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus II A A2
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis II A A2
Xanthomonas campestris (axonopodis) pv. phaseoli II A A2
Xanthomonas vesicatoria &
X. campestris (axonopodis) pv. vesicatoria
II A A2
Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae A2
Xanthomonas axonopodis pv. allii A1
Xanthomonas fragariae II A A2
Xanthomonas translucens pv. translucens A2
- Xylella fastidiosa is een belangrijke ziekteverwekker bij planten; veroorzaakt dwerggroei bij perzik, brandvlekkenziekte bij oleander, Pierce’s disease en bonte chlorose bij citrusvruchten (CVC).
- Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus veroorzaakt een aardappelziekte die bekend staat als ringrot vanwege de manier waarop ze het vaatweefsel in aardappelknollen infecteert.
- Ralstonia solanacearum veroorzaakt bacteriële verwelking bij een groot aantal mogelijke waardplanten zoals aardappel, tomaat, peper, aubergine en Pelargonium.
De lijst van prioritaire bacteriën voor barcoding conform de wetgeving betreff ende planten van de EU en de EPPO
Bijlage 2000/29/EC EPPO
Xylella fastidiosa I A A1
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus I A A2
Pseudomonas solanacearum = Ralstonia solanacearum I A A2
Xanthomonas stammen die pathogen zijn voor citrusvruchten II A A1
Xanthomonas oryzae pv. oryzae & oryzicola II A A1
Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus II A A2
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis II A A2
Xanthomonas campestris (axonopodis) pv. phaseoli II A A2
Xanthomonas vesicatoria &
X. campestris (axonopodis) pv. vesicatoriaII A A2
Xanthomonas axonopodis pv. dieff enbachiae A2
Xanthomonas axonopodis pv. allii A1
Xanthomonas fragariae II A A2
Xanthomonas translucens pv. translucens A2
42
- Xylella fastidiosa is een belangrijke ziekteverwekker bij planten; veroorzaakt dwerggroei bij perzik, brandvlekkenziekte bij oleander, Pierce’s disease en bonte chlorose bij citrusvruchten (CVC).
- Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus veroorzaakt een aardappelziekte die bekend staat als ringrot vanwege de manier waarop ze het vaatweefsel in aardappelknollen infecteert.
- Ralstonia solanacearum veroorzaakt bacteriële verwelking bij een groot aantal mogelijke waardplanten zoals aardappel, tomaat, peper, aubergine en Pelargonium.
- Xanthomonas axonopodis en Xanthomonas citri hebben verschillende pathovars en varianten die kanker veroorzaken bij citrusplanten.
- Rijst is de belangrijkste waardplant van Xanthomonas oryzae. De soort heeft twee niet-Europese pathovars: Xanthomonas oryzae pv. oryzae en Xanthomonas oryzae pv. oryzicola.
- Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus besmet alfalfa.- Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis veroorzaakt bacteriële verwelking bij tomaten.- Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli is de verwekker van bacteriebrand bij bonen.- De belangrijkste waardplanten van Xanthomonas vesicatoria & X. axonopodis pv. vesicatoria zijn tomaten en
Capsicum.- Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae is pathogeen voor araceeën en is het agressiefst op Anthurium.- Xanthomonas axonopodis pv. allii veroorzaakt schade in Allium teelten.- Xanthomonas fragariae veroorzaakt bladvlekkenziekte bij aardbei.- Xanthomonas translucens pv. translucens is de verwekker van bacteriële bladstrepenziekte in kleinkorrelige
graansoorten.
De database Q-bank bevat alle relevante gegevens die in QBOL werden aangemaakt met het oog op een correcte barcode-identi-ficatie van plantpathogene quarantaineorganismen.http://www.q-bank.eu/
Contact: Martine Maes ([email protected])
- Xanthomonas axonopodis en Xanthomonas citri hebben verschillende pathovars en varianten die kanker veroorzaken bij citrusplanten.
- Rijst is de belangrijkste waardplant van Xanthomonas oryzae. De soort heeft twee niet-Europese pathovars: Xanthomonas oryzae pv. oryzae en Xanthomonas oryzae pv. oryzicola.
- Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus besmet alfalfa.
- Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis veroorzaakt bacteriële verwelking bij tomaten.
- Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli is de verwekker van bacteriebrand bij bonen.
- De belangrijkste waardplanten van Xanthomonas vesicatoria & X. axonopodis pv. vesicatoria zijn tomaten en Capsicum.
- Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae is pathogeen voor araceeën en is het agressiefst op Anthurium.
- Xanthomonas axonopodis pv. allii veroorzaakt schade in Allium teelten.
- Xanthomonas fragariae veroorzaakt bladvlekkenziekte bij aardbei.
- Xanthomonas translucens pv. translucens is de verwekker van bacteriële bladstrepenziekte in kleinkorrelige graansoorten.
De database Q-bank bevat alle relevante gegevens die in QBOL werden aangemaakt met het oog op een correcte barcode-identificatie van plantpathogene quarantaineorganismen.
http://www.q-bank.eu/
Contact:
Martine Maes ([email protected])
4342
De opleidingen voor de erkende laboratoria, georganiseerd door het FAVV in samenwerking met de nationale referentielaboratoria, vindt U terug op de website van het FAVV
(www.favv.be > Beroepssectoren > Laboratoria > Seminaries & workshops).
Deze tabel wordt regelmatig geactualiseerd, gelieve daarom regelmatig de website te consulteren.
Andere interessante workshops en symposia zijn hieronder opgenomen.
Workshops & SymposiaDatum Onderwerp Plaats Meer informatie (website)
21-23.01.2013 8th Conference RME 2013: Food Feed Water Analysis: innovations and break-throughs!
Noordwijkerhout, The Netherlands
http://www.feedsafety.org/
28.01-1.02.2013 Advanced Food Analysis Wageningen, The Netherlands
http://www.vlaggraduateschool.nl/courses/food-analys.htm
20-21.02.2013 11th International Fresenius ConferenceFood Safety and Dietary Risk Assess-ment
Mainz/Germany http://www.akademie-fresenius.com/english/konferenz/output.php?thema=5&kurs=350
26.02-1.03.2013 4th MoniQA International Conference Budapest, Hungary http://budapest2013.moniqa.org
4.04.2013 ‘Waarborgen van voedselveiligheid: hoe gerust kun je zijn?’
Wageningen, The Netherlands
http://www.fimm.nl/symposium-microbio-logie/symposium-levensmiddelenmicrobi-ologie/
18-19.04.2013 New Trends on Methods for Pesticides and Drug Residues
Paris, France AOACI Europe section with ASFILAB www.aoaceurope.com
22-23.04.2013 8th International Fresenius Conference“Contaminants and Residues in Food”
Mainz/Germany http://www.akademie-fresenius.com/english/konferenz/output.php?thema=5&kurs=354
7-10.05.2013 EuroFoodChem XVII Istanbul, Turkey http://www.arber.com.tr/eurofoodchemxvii.org/index.php/homewith state-of-the-art knowledge and appli-cations in food chemistry and complemen-tary disciplines
22-24.05.2013 35th Mycotoxin Workshop Ghent, Belgium http://en.mytox.be/conferences/
23-24.05.2013 Workshop EU Ref Lab for Parasites Rome, Italy http://www.iss.it/crlp/index.php
3-7.06.2013 ISO/IDF Analytical Week Rotterdam, Nederland
24-25.06.2013 15th International Fresenius AGRO ConferenceBehaviour of Pesticides in Air, Soil and Water
Mainz/Germany http://www.akademie-fresenius.com/english/konferenz/output.php?thema=5&kurs=346
44
25-30.08.2013 The 33rd International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants (POP’s) - DIOXIN 2012
Daegu, Korea http://www.dioxin2013.org/
25.08-28.08.2013 127th AOAC Annual Meeting & Exposition
Chicago, USA http://www.aoac.org
25-29.08.2013 24th International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (WAAVP)
Perth Exhibition Cen-tre, Perth, Western Australia
http://www.waavp.org/
12-13.09.2013 18th Conference on Food Microbiology Brussels, Belgium www.bsfm.be
17.09.2013 Trends in Food Analysis VII Gent, Belgium
18.10.2013 5th symposium BWDS: Spatial Approach of Wildlife Diseases
Tervuren, Belgium http://www.bwds.be
24.10.2013 ‘Methoden in de levensmiddelen- microbiologie’
The Netherlands http://www.fimm.nl/symposium- microbiologie/microbiologische-methoden- onderzoek/
28.10-1.11.2013 IDF World Dairy Summit Yokohama, Japan http://www.fil-idf.org/Public/SiteEventType.php?ID=23123
5-8.11.2013 6th International Symposium on RECENT ADVANCES IN FOOD ANALYSISRAFA 2013
Prague, Czech Republic
http://www.rafa2013.eu/RAFA_2013_flyer_ 1.pdf
28-31.01.2014 HTC-13: International Symposium on Hyphenated Techniques in Chroma-tography and Hyphenated Chromato-graphic Analyzers
Brugge, Belgium http://www.kvcv.be/kalender/
26-30.10.2014 IDF World Dairy Summit Tel Aviv, Israel http://www.idfwds2014.com/
4544
25-30.08.2013 The 33rd International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants (POP’s) - DIOXIN 2012
Daegu, Korea http://www.dioxin2013.org/
25.08-28.08.2013 127th AOAC Annual Meeting & Exposition
Chicago, USA http://www.aoac.org
25-29.08.2013 24th International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (WAAVP)
Perth Exhibition Cen-tre, Perth, Western Australia
http://www.waavp.org/
12-13.09.2013 18th Conference on Food Microbiology Brussels, Belgium www.bsfm.be
17.09.2013 Trends in Food Analysis VII Gent, Belgium
18.10.2013 5th symposium BWDS: Spatial Approach of Wildlife Diseases
Tervuren, Belgium http://www.bwds.be
24.10.2013 ‘Methoden in de levensmiddelen- microbiologie’
The Netherlands http://www.fimm.nl/symposium- microbiologie/microbiologische-methoden- onderzoek/
28.10-1.11.2013 IDF World Dairy Summit Yokohama, Japan http://www.fil-idf.org/Public/SiteEventType.php?ID=23123
5-8.11.2013 6th International Symposium on RECENT ADVANCES IN FOOD ANALYSISRAFA 2013
Prague, Czech Republic
http://www.rafa2013.eu/RAFA_2013_flyer_ 1.pdf
28-31.01.2014 HTC-13: International Symposium on Hyphenated Techniques in Chroma-tography and Hyphenated Chromato-graphic Analyzers
Brugge, Belgium http://www.kvcv.be/kalender/
26-30.10.2014 IDF World Dairy Summit Tel Aviv, Israel http://www.idfwds2014.com/
LNRN A T I O N A L ER E F E R E N T I ELABORATORIA
L A B O R ATO I R E SN A T I O N A U XD E R E F E R E N C ENRLN A T I O N A L
R E F E R E N C ELABORATORIESNRL
