I

190517

Contents: 190517

１

2

3

P1 Tn10４

Garza et al, 1995

Garza et al, 1995

allele specificity5Garza et al, 1995 Zhou et al, 1998

遺伝子型・表現型の見方Maloy and Hughes, Methods in Enzymology 421:3-8 (2007)

( pyrpyrC: dihydroorotase, pyrD: dihydroorotate dehydrogenase

pyrA, B...

allele numberpyrD1 pyrD2 pyrD

pyrC Tn10 pyrC::Tn10

pyrC ΔpyrC

(Pof+) Pof-) (Kmr)

論文に書かれているTableの例

φ80lacZ DM15 lac a

(Asai et al, 1997)

DH5αの遺伝子型

recA1: RecA

hsdR17: HsdR

endA1: endonuclease EndA DNA

supE44: (UAG) suppressor tRNA

thi-1:

relA1: ppGpp

gyrA96: DNA gyrase A subunit

Δ(argF-lacZYA)U169: U169 argF lac operon

Φ80d lacZΔM15: Φ80 lacZΔM15LacZ C (ω)

DH5α HsdR

endALacZ ω α

変異体の性質を調べる

suppressor

“allele specific”

A B

A-B A B

suppressormutation

allele specific

細菌べん毛の変異体（輸送装置）

(Minamino et. al, 2008)

(Minamino et. al, 2000)

FliIK188I ATP

FliI(K188I)

細菌べん毛の変異体（固定子）

(Minamino et. al, 2008)

(Blair et. al,1991)

motB17

motB

pGM1: motB

motB6, motB8 (A39V) (E205K)

(R13 stop)

2006

Mike

MotB

べん毛モーターのエネルギー変換素子：固定子

MotA MotB H+)MotA FliG

1993年頃にどこまで分かっていたか？

Irikura et al, 1993

固定子はモーターのどの因子と相互作用するのか？

固定子MotA: MotB: MotA

回転子FliG: FliM: FliN: C

MotA MotB H+

MotA MotBMotA MotB FliG, FliM, FliN

遺伝学的に調べたい motB 変異体から、運動能を回復するサプレッサーを取る

サプレッサー単離実験のデザインDavid Blair motA, motB

motB (MotB

motA, fliG, fliM, fliN

AG64 (motA+ DmotB uvrC279::Tn10)

AG64 EMS mutagenesis

pMB plasmid (motB missense mutation)

Mot+,

P1virP1vir RP6647 (motA+ DmotB )/pMB Tetr Mot+

motA, fliG, fliM, fliN PCR

サプレッサー単離に用いた motB 変異

(Blair et. al,1991)

motB17

motB

pGM1: motB

motB6, motB8 (A39V) (E205K)

(R13 stop)

David Blair

(Garza et al, 1995)

サプレッサー単離に用いた菌株の説明

AG64 (DmotB uvrC279::Tn10)

RP437 (wild type)

RP6647 (DmotB )

pGM1 (PlacUV5 -motB, Ampr)pMB plasmids (PlacUV5 -motB*, Ampr): pGM1 motB

motA motB cheA

motA DmotB cheA

motA DmotB cheA

uvrC

Tn10 (Tetr)

極性効果（Polar effect)mRNA

z

y, a

mRNA

サプレッサー単離に用いた菌株の説明

AG64 (DmotB uvrC279::Tn10)

RP437 (wild type)

RP6647 (DmotB )

pGM1 (PlacUV5 -motB, Ampr)pMB plasmids (PlacUV5 -motB*, Ampr): pGM1 motB

motA motB cheA

motA DmotB cheA

motA DmotB cheA

uvrC

Tn10 (Tetr)

変異の抑圧（suppression)

AG64 motB pMB motB

AG64 EMS pMBMotB

EMS motB

motA DmotB cheA

uvrC

Tn10 (Tetr)

motB

pGM1

相補motB*

pMB

x

相補できないx

抑圧する gene Xx

トランスポゾンを使ってマッピング

motA, fliG, fliM, fliNuvrC Tn10 AG64

P1vir Tn10

AG64 (DmotB uvrC279::Tn10)

17 kb22 kb

P1vir DNA 110 kbmotA uvrC P1 75%fliG, fliM, fliN uvrC P1 20 - 25%

Tetr Mot+

トランスポゾンTn10

IS: insertion sequence

Tn10

IS10 right

(Harring et. al., 1982)

(Benjamin and Kleckner, 1989)

IS10 Tn10

P１ファージによる形質導入

Generalized transduction (λ Specialized transduction)DNA ランダム

(DNA

P1vir

~4,600 kbP1 ~110 kb

P1ファージとトランスポゾンを使って変異をマッピング

Tn10 P1 Tn10

P1

Tn10

100%

xTn10

xx

co-transduction

20%

50%

100%

(Jeffrey H. Miller, 1992)

トランスポゾンを使ってマッピング

P1vir

P1vir RP6647 (motA+ DmotB )/pMB Tetr Mot+

pMB

P1vir RP6647/pMBTetr Mot+

motA uvrC P1 75%

fliG, fliM, fliN uvrC P1 20 - 25%

75% motA

20 - 25% fliG, fliM, fliN

これらの抑圧変異体を選択し、PCRで各遺伝子を増幅してシークエンスする

抑圧変異の殆どは motA に発見されたRP6647(DmotB)

pGM1 or pMB (motB*)

WT/WT

WT/G164D L211F/G164D

WT/P159I A191V/P159I

allele specific suppression

A B

A-B A B

suppressormutation

allele specific

変異部位

FliG E108KFliG R190H

MotB MotA

+

-+

-+

+

-

-

Zhou et al., PNAS (1998); Blair, FEBS lett. (2003)

FliGとMotAの間の相互作用

1

motB RP6647motA, motBWT (wild type)

MotB G164DMotA L211F G199S G164D

MotB A39V

MotA A191V

MotA, MotB

a: MotB (WT), MotA (WT)b: MotB (G164D), MotA (WT)c: MotB (G164D), MotA (L211F)d: MotB (G164D), MotA (G199S)

RP6647 (ΔmotB )motB, motAa

b c d

A39VA191V

1

motB RP6647motA, motBWT (wild type)

MotB G164DMotA L211F G199S G164D

MotB A39V

MotA A191V

MotA, MotB

a: MotB (WT), MotA (WT)b: MotB (G164D), MotA (WT)c: MotB (G164D), MotA (L211F)d: MotB (G164D), MotA (G199S)

RP6647 (ΔmotB )motB, motAa

b c d

A39VA191V

MotB G164D MotA L211F G199SMotA G164D MotB

MotA MotBMotA MotB