UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

PROGRAMA DE PÓS–GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

JESSIKA GONÇALVES DOS SANTOS

APLICAÇÃO DE ULTRASSOM EM MANGAS ‘TOMMY ATKINS’

MINIMAMENTE PROCESSADAS: ASPECTOS FISIOLÓGICOS E DE

QUALIDADE

FORTALEZA–CE

2013

JESSIKA GONÇALVES DOS SANTOS

APLICAÇÃO DE ULTRASSOM EM MANGAS ‘TOMMY ATKINS’

MINIMAMENTE PROCESSADAS: ASPECTOS FISIOLÓGICOS E DE

QUALIDADE

Dissertação de Mestrado apresentada

ao Programa de Pós–Graduação em

Bioquímica, do Departamento de

Bioquímica e Biologia Molecular da

Universidade Federal do Ceará, como

requisito parcial para a obtenção do

Título de Mestre em Bioquímica. Área

de concentração: Bioquímica Vegetal.

Orientadora: Dra. Maria Raquel

Alcântara de Miranda.

Coorientador: Dr. Fabiano André

Narciso Fernandes.

FORTALEZA–CE

2013

iv

Dedico este trabalho a minha

mãe, companheira absoluta

de todos os momentos. Aos

meus familiares e amigos.

v

AGRADECIMENTOS

Primeiramente e antes de qualquer coisa agradeço a Deus, pois

sem Ele nada é possível. Por ter guiado meus caminhos e me conduzido

a esta conquista.

Ao afeto, compreensão e paciência da minha querida mãe,

Terezinha, grande incentivadora e que sempre tinha um “colinho” pra

oferecer em momentos de dificuldade.

A minha família, que sempre será meu porto seguro. Em especial a

minha sobrinha Kévina e minha irmã Neila, cuja amizade, apesar das

diferenças, foi ficando cada vez mais importante.

A minha orientadora, Dra. Maria Raquel Alcântara de Miranda, pela

confiança, apoio, motivação, muitos ensinamentos e atenção.

Ao professor Dr. Fabiano André Narciso Fernandes, por me

receber em seu laboratório no Departamento de Engenharia Química da

UFC, pela ajuda no desenvolvimento deste trabalho, pelos conhecimentos

repassados, disponibilidade, simpatia e paciência.

Ao Dr. Ebenézer de Oliveira Silva pela gentileza de compartilhar

sua experiência ao aceitar participar desta banca.

A todos os companheiros do Laboratório de Bioquímica e Fisiologia

Pós–Colheita de Frutos, pelo acolhimento, carinho, ótima convivência e

por todas as dúvidas tiradas. Lugar mais do que especial onde cultivei

grandes amizades que levarei para toda a vida.

Aos colegas dos demais laboratórios que em algum momento me

auxiliaram, e principalmente pelas amizades conquistadas, em especial

às meninas do laboratório de Bioenergética.

Aos amigos que estão perto e àqueles que estão longe.

Ao Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da

Universidade Federal do Ceará pelo Programa de Pós–Graduação e sua

contribuição para a minha formação.

A CAPES, pela concessão da bolsa.

Aos demais, que de alguma forma contribuíram para a

concretização deste estudo.

vi

"Para realizar grandes

conquistas, devemos não

apenas agir, mas também

sonhar; não apenas planejar,

mas também acreditar."

Anatole France.

"Aqui, no entanto, nós não

olhamos para trás por muito

tempo. Nós continuamos

seguindo em frente,

abrindo novas portas e

fazendo coisas novas porque

somos curiosos... e a

curiosidade continua nos

conduzindo por novos

caminhos. Siga em frente."

Walt Disney.

vii

RESUMO

Atualmente é crescente a busca por uma alimentação mais saudável e

com isso surge a possibilidade da inclusão de frutos e hortaliças nos

hábitos alimentares. A manga é um fruto bastante consumido e produzido

no Brasil e os minimamente processados (MP) representam praticidade

porque são produtos que já vem prontos para consumo, sem perda de

tempo com operações de descasque, corte, etc. Durante as etapas de

processamento há um estresse dos tecidos, que leva à geração de

radicais livres que podem causar a degradação do fruto, por isso, se faz

necessário a utilização de tratamentos capazes de minimizar as perdas

de qualidade. Nesse contexto surge o ultrassom (US) que é uma

tecnologia emergente com potencial de exploração e utilização. As ondas

ultrassônicas provocam principalmente a compressão e expansão dos

tecidos, cujos resultados vão depender da matriz alimentar. Este trabalho

teve como objetivo avaliar o efeito do US na qualidade de mangas

‘Tommy Atkins’ MP, analisando o sistema de defesa antioxidante,

componentes do metabolismo oxidativo e a atividade de enzimas

hidrolíticas da parede celular. Para tanto, as amostras foram expostas à

sonicação na frequência de 25 kHz por 30 minutos em banho de US.

Observou–se que o tratamento causou uma redução na acidez titulável

(AT) e nos sólidos solúveis (SS), porém após sete dias de

armazenamento a 4 oC, manteve elevada a relação SS/AT (46,54). Os

teores de açúcares também foram reduzidos (15%), bem como água foi

incorporada (4,6%), o que mostra uma modificação na estrutura celular,

que pode ser comprovada pelo decréscimo na firmeza após sete dias (de

241,73 para 139,38 N) e aumento na atividade da pectinametilesterase. A

cor foi degradada após sete dias (∆L = 3,24 e ∆C = 4,42), resultando em

escurecimento, contudo as amostras controle também escureceram. Em

relação ao sistema antioxidante, não houve grandes modificações, tendo

em vista ser um fator benéfico se comparado a outros métodos de

conservação, com destaque apenas para a perda de vitamina C (de

328,10 para 190,18 mg ácido ascórbico/kg matéria fresca (MF)). Houve

viii

ainda redução na peroxidação de lipídios de membrana com o tratamento

(de 23,58 para 18 ηmol MDA/g MF). Conclui–se com base neste estudo,

que a aplicação de US em mangas ‘Tommy Atkins’ MP tem seus pontos

negativos na firmeza e na cor, contudo, não afetou drasticamente os

sistemas antioxidante enzimático e não enzimático, além de levar a uma

redução no teor de açúcar. Todavia, fica claro a necessidade de explorar

esta tecnologia na fisiologia pós–colheita de frutos, assim como, otimizar

e combinar a técnica com outros processos que diminuam seus efeitos

negativos e favoreçam os positivos.

Palavras–chave: Bioativos; enzimas; processamento; sonicação.

ix

ABSTRACT

Currently is growing to search for healthier eating with that comes the

possibility for inclusion of fruits and vegetables in the diet. Mango fruit is

widely consumed and produced in Brazil and fresh–cut (FC) represents

convenience because them are products that comes ready for

consumption without loss of time with operations peeling, cutting, etc., and

these steps there is a stress tissue leading to generation of free radicals

that can lead to a degradation fruit, so it is necessary a type of processing

that minimize the loss of quality and yet ensures the safety of the final

product. In this context arises the ultrasound (US) that is an emerging

technology that has potential for exploitation and utilization. The ultrasonic

waves cause primarily tissue compression and expansion, whose the

results will depend on the food matrix. This study aimed to evaluate the

effect of US in quality of FC 'Tommy Atkins' mangoes, analyzing the

antioxidant defense system, metabolism oxidative compounds and the

activity of cell wall hydrolytic enzymes. The samples were exposed to 25

kHz frequency sonication for 30 minutes in US bath. It was observed that

the treatment caused a reduction in titratable acidity (TA) and soluble

solids (SS), but after seven days of storage at 4 oC, maintaining the high

SS/TA ratio (46.54). The sugars was also reduced (15%) and water

incorporated (4.6%), which indicates a change in cell structure, that can be

evidenced by decreased in firmness after seven days (from 241.73 to

139.38 N) and increased activity of pectinmethylesterase. The color was

degraded after seven days (ΔL = 3.24 and ΔC = 4.42), resulting in

darkening, but the control samples also darkened. In relation to the

antioxidant system, there were no significant changes in order to be a

beneficial factor compared to other preservation methods, particularly only

to the loss of vitamin C (328.10 to 190.18 mg ascorbic acid/kg weight fresh

(WF), still there was a reduction in lipid peroxidation of membrane (from

23.58 to 18 ηmol MDA/g WF). It concluded to base on this study, FC

'Tommy Atkins' mango has its drawbacks on firmness and color, however,

did not affect severely the enzymatic and non–enzymatic antioxidant

x

systems, and lead to a reduction in sugar content. However, it is clear the

necessitate to explore the application of this technology in post harvest

fruits physiology as well as to optimize and to combine the technique with

other processes that reduce their negative effects and promote the

positives.

Keywords: Bioactive; enzymes; processing; sonication.

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Manga ‘Tommy Atkins’ .......................................................... 4

Figura 2 – Aparelho de ultrassom de banho ......................................... 8

Figura 3 – Vias de formação das espécies reativas de oxigênio

(EROs) em células vegetais .................................................................. 12

Figura 4 – Etapas da oxidação de ácidos graxos .............................. 13

Figura 5 – Estrutura de um grupo fenol ............................................... 14

Figura 6 – Estrutura de um flavonoide ................................................. 15

Figura 7 – Estrutura de um carotenoide (β–caroteno) ........................ 16

Figura 8 – Estrutura do ácido ascórbico ............................................. 17

Figura 9 – Reação catalisada pela enzima G–POD na qual a mesma

converte o guaiacol e o peróxido de hidrogênio em tetraguaiacol........

................................................................................................................. 19

Figura 10 – Manga ‘Tommy Atkins’ MP ................................................ 24

Figura 11 – Fluxograma de processamento mínimo e tratamento com

US de manga ‘Tommy Atkins’ ............................................................... 25

Figura 12 – Conteúdo de açúcares totais (A) e de açúcares redutores

(B) em mangas minimamente processadas, tratadas com US e

armazenadas por sete dias a 4 oC ........................................................ 42

Figura 13 – Firmeza em mangas minimamente processadas, tratadas

com US e armazenadas por sete dias a 4 oC ...................................... 45

Figura 14 – Peroxidação lipídica (A) e conteúdo de peróxido de

hidrogênio (B) em mangas minimamente processadas, tratadas com

US e armazenadas por sete dias a 4 oC ............................................... 48

Figura 15 – Conteúdo de antocianinas (A), de flavonoides amarelos

(B) e de polifenóis extraíveis totais (C) em mangas minimamente

processadas, tratadas com US e armazenadas por sete dias a 4 oC.....

................................................................................................................. 50

xii

Figura 16 – Conteúdo de carotenoides (A), de vitamina C (B) e

atividade antioxidante total (C) em mangas minimamente

processadas, tratadas com US e armazenadas por sete dias a 4 oC.....

................................................................................................................. 53

Figura 17 – Atividade das enzimas antioxidantes APX (A), CAT (B) e

SOD (C) em mangas minimamente processadas, tratadas com US e

armazenadas por sete dias a 4 oC ........................................................ 56

Figura 18 – Atividade das enzimas responsáveis pelo escurecimento

G–POD (A) e PPO (B) em mangas minimamente processadas,

tratadas com US e armazenadas por sete dias a 4 oC ........................ 59

Figura 19 – Atividade da enzima fenilalanina amônia liase (PAL) em

mangas minimamente processadas, tratadas com US e armazenadas

por sete dias a 4 oC ................................................................................ 61

Figura 20 – Atividade das enzimas PME (A) e PG (B) em mangas

minimamente processadas, tratadas com US e armazenadas por sete

dias a 4 oC ............................................................................................... 62

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Efeito do ultrassom em alimentos sonicados ................... 10

Tabela 2 – Atividade antioxidante de alguns flavonoides .................. 15

Tabela 3 – pH, acidez titulável (AT), sólidos solúveis (SS) e razão

SS/AT em mangas minimamente processadas, tratadas com US e

armazenadas por sete dias a 4 oC ........................................................ 40

Tabela 4 – Parâmetros de cor em mangas minimamente processadas,

tratadas com US e armazenadas por sete dias a 4 oC ........................ 43

xiv

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 1

2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................. 3

2.1 Mangueira (Mangifera indica L.) ....................................................... 3

2.2 Minimamente Processados ............................................................... 5

2.3 O tratamento com ultrassom ........................................................... 7

2.4 Estresse oxidativo e sistema de defesa ........................................ 11

2.5 Enzimas hidrolíticas da parede celular vegetal ............................ 21

3 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................... 24

3.1 Material ............................................................................................. 24

3.2 Métodos ............................................................................................ 24

3.2.1 Processamento mínimo e tratamento com ultrassom ............... 24

3.2.2 Avaliações físicas e físico–químicas .......................................... 26

3.2.2.1 Potencial hidrogeniônico .......................................................... 26

3.2.2.2 Acidez titulável ........................................................................... 26

3.2.2.3 Sólidos solúveis ...................................................................... ...27

3.2.2.4 Conteúdo de açúcares totais e redutores ................................ 27

3.2.2.5 Cor ............................................................................................... 28

3.2.2.6 Firmeza ....................................................................................... 28

3.2.2.7 Umidade em base seca .............................................................. 28

3.2.2.8 Perda de água e de sólidos ....................................................... 29

3.2.2.9 Conteúdo de proteína solúvel total .......................................... 29

3.2.3 Sinalizadores de estresse oxidativo ........................................... 29

3.2.3.1 Atividade da fenil alanina amônia liase .................................... 29

3.2.3.2 Grau de peroxidação lipídica .................................................... 30

3.2.3.3 Conteúdo de peróxido de hidrogênio ...................................... 30

3.2.4 Antioxidantes não enzimáticos e capacidade antioxidante total..

xv

................................................................................................................. 31

3.2.4.1 Antocianinas totais e flavonoides amarelos ........................... 31

3.2.4.2 Polifenóis extraíveis totais ........................................................ 31

3.2.4.3 Carotenoides .............................................................................. 32

3.2.4.4 Vitamina C .................................................................................. 32

3.2.4.5 Capacidade antioxidante total .................................................. 33

3.2.5 Enzimas antioxidantes ................................................................. 34

3.2.5.1 Atividade da ascorbato peroxidase .......................................... 34

3.2.5.2 Atividade da catalase................................................................. 35

3.2.5.3 Atividade da superóxido dismutase ......................................... 35

3.2.6 Enzimas responsáveis pelo escurecimento ............................... 36

3.2.6.1 Atividade da polifenoloxidase .................................................. 36

3.2.6.2 Atividade da guaiacol peroxidase ............................................ 36

3.2.7 Enzimas hidrolíticas da parede celular ....................................... 37

3.2.7.1 Atividade da pectinametilesterase ........................................... 37

3.2.7.2 Atividade da poligalacturonase ................................................ 38

3.3 Delineamento experimental e análise estatística .......................... 39

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 40

4.1 Qualidade da manga minimamente processada e tratada com

ultrassom ................................................................................................ 40

4.2 Avaliação de componentes do metabolismo oxidativo ............... 48

4.3 Antioxidantes não enzimáticos e capacidade antioxidante total.....

................................................................................................................ 50

4.4 Enzimas antioxidantes .................................................................... 56

4.5 Enzimas responsáveis pelo escurecimento .................................. 59

4.6 Enzima marcadora de estresse ...................................................... 61

4.7 Enzimas hidrolíticas da parede celular vegetal ............................. 62

xvi

5 CONCLUSÃO ...................................................................................... 65

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 66

1

1 INTRODUÇÃO

A manga é um fruto tropical de importância comercial para o país e

sua utilização como produto minimamente processado (MP) gera renda,

minimiza desperdícios e agrega valor.

Os alimentos MP atendem às tendências de mercado

representando economia de tempo, fácil preparo e redução de lixo gerado

pelo consumidor, porém, quando cortados, os vegetais apresentam

alterações fisiológicas provocadas por danos mecânicos, que aumentam

sua perecibilidade, reduzindo, consequentemente, sua vida útil (BASTOS,

2006a).

Assim, modificações na coloração original como escurecimento e o

amaciamento dos tecidos constituem fatores limitantes na

comercialização desses produtos. Frutos e hortaliças MP se deterioram

mais rapidamente do que o produto intacto (MORETTI, 2007). Além disso,

a instalação do processo de estresse oxidativo em decorrência de fatores

adversos como o processamento resulta em um desequilíbrio entre

compostos oxidantes e antioxidantes, culminando em perda de qualidade.

De modo geral, o prolongamento da vida pós–corte tem sido

determinado por meio da refrigeração e da modificação atmosférica nas

embalagens. No entanto, novas tecnologias complementares a estes

tratamentos e passíveis de serem utilizadas estão sendo largamente

desenvolvidas e estudadas (JACOMINO; SILVA; PINTO, 2009).

A utilização do ultrassom (US) na preservação de alimentos está

relacionada aos seus benefícios quando aplicados em alimentos (CRUZ;

VIEIRA; SILVA, 2007; TIWARI et al., 2009; CAO et al., 2010). Ao

empregar o US espera–se manter a qualidade das mangas MP e

prolongar a vida útil das mesmas, em detrimento a outros métodos de

preservação que trazem perdas aos produtos.

Nesse contexto, o trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos do

tratamento ultrassônico sobre a qualidade de mangas ‘Tommy Atkins’

minimamente processadas através de análises do sistema de defesa

2

antioxidante (enzimático e não enzimático), de componentes do

metabolismo oxidativo e da atividade de enzimas hidrolíticas da parede

celular.

3

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 A mangueira (Mangifera indica L.)

A mangueira, pertencente à família Anacardiaceae, é nativa do sul

e sudeste da Ásia, de onde se disseminou para diversas partes do

mundo, sendo atualmente produzida nas regiões tropicais e subtropicais

(CUNHA et al., 1994; ALVES et al., 2006; JAMES; NGARMSAK, 2010).

Apesar de sua origem indiana, a Mangifera indica L. foi introduzida no

Brasil pelos portugueses, no século XVI, e adaptou–se muito bem em

várias regiões, sendo algumas vezes confundida como fruteira nativa

(CEAGESP, 2004).

A manga é reconhecida por seu excelente sabor, aroma e

coloração característicos (BRUNINI; DURIGAN; OLIVEIRA, 2002), sendo

a sexta cultura em área colhida, com 75,2 mil hectares, no Brasil (MAPA,

2011).

Em 2011, a receita obtida com as exportações brasileiras de

manga totalizou US$ 140,9 milhões, valor 17,5% acima do registrado no

ano anterior. De janeiro a novembro do mesmo ano, o total exportado

pelo Brasil foi de 114.000,000 kg, de acordo com a Secretaria de

Comércio Exterior – Secex. Esse montante garantiu à manga o primeiro

lugar na pauta de exportações da fruticultura brasileira (SOARES, 2012).

De acordo com o USDA Foreign Agricultural Service (2012), o

Brasil apareceu como o quarto país exportador de manga para os

Estados Unidos, durante o triênio 2009/2011 e tomando como base o

Mango Crop Report (2012), as previsões eram de que a ‘Tommy Atkins’

seria a principal variedade de manga exportada pelo Brasil no ano de

2012, representando um total de 95%, seguida pelas variedades ‘Ataulfo’

(5%) e ‘Palmer’ (1%).

A cultivar Tommy Atkins (Figura 1) é originária da Flórida (EUA) e é

caracterizada por frutos grandes com médias de 12 cm de comprimento,

10 cm de largura, 9 cm de espessura e 500 g de peso. A forma é oval de

ápice arredondado com inserção peduncular moderadamente saliente,

4

casca grossa, bastante cerosa, resistente ao transporte e ao

armazenamento. Quando na maturidade fisiológica, o fruto apresenta

coloração arroxeado–púrpura e quando maduro, vermelho–amarelo–

brilhante (TODA FRUTA, 2003).

Fonte: Jessika Gonçalves dos Santos

Figura 1 – Manga ‘Tommy Atkins’

De acordo com Chitarra e Chitarra (2005), o amadurecimento é

considerado um conjunto de processos que ocorrem desde os últimos

estádios de desenvolvimento até as etapas iniciais de senescência. Nele,

há um aprimoramento das características sensoriais (sabor, odor, cor e

textura). O fruto torna–se mais macio e colorido devido à degradação da

clorofila e desenvolvimento de pigmentos carotenoides e flavonoides

(CHITARRA; CHITARRA, 2005). Tais mudanças conduzem o fruto a um

estado comestível e, com isso, apropriado para o consumo e

industrialização (BASTOS, 2006b).

A qualidade e composição química das mangas íntegras

dependem da cultivar, das condições climáticas, de práticas culturais,

maturidade e método de colheita (CARDELLO; CARDELLO, 1998;

KADER, 2008). Em estudos anteriores foi relatado que no estádio

maduro, a manga ‘Tommy Atkins’ possui aproximadamente 14 °Brix, 100

mg de vitamina C total/kg massa fresca (MF), 25000 µg carotenoides/kg

MF, 480 mg fenólicos totais/kg MF (RIBEIRO et al.,2007), pH 4,06, acidez

titulável de 3,13 g ácido cítrico/100mL (CRUZ et al., 2010).

5

2.2 Minimamente processados (MP)

De acordo com Moretti (2007) frutos e hortaliças MP são, em

essência, vegetais que passaram por alterações físicas, isto é, foram

descascados, picados, torneados e ralados, dentre outros processos, mas

mantidos no estado fresco e metabolicamente ativos.

O setor de alimentos MP tem como objetivos reduzir perdas, gerar

renda e empregos, proporcionar novos canais de comercialização e

escoamento da produção, através dos quais se espera alcançar um

importante impacto econômico e social (SILVA et al., 2011).

O processamento mínimo no Brasil teve início com a chegada das

redes de refeições rápidas ou fast foods, no final da década de 70 e

condizem perfeitamente com as características da sociedade moderna:

envelhecimento da população, urbanização, aumento da participação

feminina no mercado de trabalho, etc. (SILVA et al., 2011).

A nutrição tem um papel fundamental na melhoria e manutenção

de indicadores de saúde. Uma dieta equilibrada, com alto valor

nutricional, é necessária para assegurar o crescimento e o

desenvolvimento do organismo, para promover uma elevada capacidade

de trabalho e de bem–estar (FAO, 2012). Segundo a Food and Agriculture

Organization (FAO, 2012), é recomendada uma ingestão diária de pelo

menos 400 g de vegetais, então, o seu consumo deve ser estimulado. E

os frutos tropicais MP são particularmente atraentes por sua

conveniência, frescor, nutrição, segurança e pela experiência de comê–

los (JAMES; NGARMSAK, 2010).

O produto MP, geralmente, apresenta maior perecibilidade em

comparação ao produto intacto (MORETTI, 2007) e o prolongamento da

sua vida útil tem sido determinado pelo uso de baixas temperaturas e

embalagens com atmosferas modificadas. Técnicas complementares,

como o uso de inibidores de escurecimento e do etileno, aplicação de

cálcio, revestimentos comestíveis e irradiação, estão sendo desenvolvidas

e estudadas (JACOMINO; SILVA; PINTO, 2009). Nesse contexto, é

importante que novas tecnologias com potencial de aplicação no

6

seguimento, sejam avaliadas, porém, seu emprego efetivo depende do

conhecimento das respostas dos tecidos ao tratamento.

O processamento mínimo aumenta a taxa de respiração dos frutos,

consequentemente, diminui os níveis de açúcares, ácidos orgânicos e

vitaminas, com um impacto negativo no sabor. A perda de água é também

reforçada pela degradação da parede celular e resulta em perda de

turgescência (JAMES, NGARMSAK, 2010).

Os conceitos de qualidade e de segurança alimentar são

inseparáveis do conceito de produtos MP e devem figurar entre seus

principais apelos, independente da grande força motivacional dos

aspectos práticos e convenientes desses produtos.

A qualidade é uma combinação de atributos que compreende as

propriedades sensoriais (aparência, textura, sabor e aroma), o valor

nutricional decorrente dos compostos químicos e das características

funcionais, as propriedades mecânicas e os defeitos do produto

(CHITARRA; CHITARRA, 2005; BASTOS, 2006a). Além disso, o

processamento mínimo, pela sua proposta conceitual, deve garantir as

propriedades nutritivas e organolépticas originais dos produtos in natura

(SEBRAE, 2008).

Os cuidados relacionados aos MP devem continuar durante o

armazenamento, transporte e distribuição, para garantir a qualidade e

segurança. A vida útil dos MP é bastante variada e depende do produto

(taxa de respiração e produção de etileno), dos cuidados no controle

higiênico–sanitário, empregado durante todas as etapas, e de fatores

ambientais, como temperatura, umidade relativa, dentre outros. Em geral,

varia de 3 a 10 dias o tempo estimado por vários pesquisadores,

dependendo dos fatores mencionados (ROBS, 2011).

A medição dos sólidos solúveis (SS) proporciona um indicador

razoável dos níveis de açúcares (JAMES; NGARMSAK, 2010), que são

responsáveis pelo flavor, através da relação com os ácidos (CHITARRA;

CHITARRA, 2005). A sacarose é o açúcar que a manga ‘Tommy Atkins’

tem em maior quantidade (BERNARDES–SILVA; LAJOLO;

CORDENUNSI, 2003).

7

A cor é um dos atributos mais importantes, pois os consumidores

julgam os produtos com base em sua aparência. A vida útil pós–colheita

de MP é limitada devido às lesões fisiológicas resultantes de operações

essenciais de processamento, incluindo descasque, retirada da semente

e corte. Estes processos podem causar escurecimento na superfície, o

que limita a comercialização (FERNANDES; RODRIGUES, 2012), e pode

ser resultado da ação de enzimas como polifenoloxidase, peroxidases,

fenil amônia liase, lipoxigenase, e também de degradações não

enzimáticas dos compostos bioativos, antioxidantes, responsáveis pela

cor e sabor como carotenoides, fenólicos, vitamina C, etc.

A firmeza é um atributo de qualidade crítico para a aceitabilidade

do consumidor. Sua conservação está geralmente relacionada à

manutenção da estrutura do tecido, cujas alterações têm um impacto no

produto final. Alterações que levam ao amaciamento são acompanhadas

por vazamento de eletrólitos, solubilização e despolimerização dos

polissacarídeos da parede celular e rearranjos das suas associações

como resultado da ação combinada de várias enzimas modificadoras de

parede que atuam nas frações pécticas e hemicelulósicas (JAMES;

NGARMSAK, 2010).

2.3 O tratamento com ultrassom (US)

Os ultrassons são ondas acústicas inaudíveis, que cobrem uma

ampla faixa de frequência, associadas a comprimentos de onda

comparáveis às distâncias intermoleculares, que oferece uma grande

variedade de aplicações cuja exploração constitui a base do

desenvolvimento das aplicações de US (NOGUEIRA, 2010).

A utilização de US de alta intensidade (que produz efeitos

permanentes no meio) representa uma nova forma de exploração de

‘energia limpa’ que pode ser utilizada nas indústrias de diferentes

segmentos, dentre eles o alimentício (NOGUEIRA, 2010). Essa tecnologia

é eficaz em temperatura ambiente e minimiza os efeitos térmicos

8

negativos sobre os parâmetros de qualidade e auxilia na conservação dos

alimentos.

Durante a sonicação, quando as ondas ultrassônicas se chocam

contra a superfície de um material, elas geram uma força. Se a força é

perpendicular à superfície, ela resulta na compressão do alimento, ao

passo que, se a força é paralela à superfície, ela produz cisalhamento.

(FELLOWS, 2006).

Os efeitos principais do US são atribuídos aos fenômenos de

cavitação, emitidos a partir dos processos físicos que criam, aumentam e

implodem microbolhas de gases dissolvidos no líquido pela compressão e

descompressão de moléculas que constituem o meio, “efeito esponja”. Os

resultados disto são criação de canais microscópicos no tecido de frutos

(TARLETON, 1992; MCCLEMENTS, 1995; TARLETON; WAKEMAN,

1998, FUENTE–BLANCO et al., 2006).

Fonte: Jessika Gonçalves dos Santos

Figura 2 – Aparelho de ultrassom de banho

O colapso da bolha de cavitação cria um ponto de transição ativo

com temperatura elevada e pressão localizada, que foram estimadas ser

de até 5000 K e 5000 atm, respectivamente, o que pode acelerar

dramaticamente a reatividade química no meio (SUSLICK et al., 2011). A

baixas frequências, as bolhas de cavitação transiente são relativamente

menos numerosas, embora com dimensões elevadas, que privilegia os

efeitos físicos ao invés dos químicos (ESCLAPEZ, 2011).

A utilização de US na indústria de alimentos (Tabela 1) tem

crescido e, nos últimos anos, muitas aplicações da energia ultrassônica

9

têm sido investigadas quanto ao uso do mesmo afetando diretamente um

processo ou produto (FERNANDES; RODRIGUES, 2012). O tratamento

tem emergido como uma alternativa promissora que faz uso de

fenômenos físicos e químicos fundamentalmente diferentes em

comparação com as técnicas convencionais utilizadas atualmente no

processamento e preservação dos alimentos (YANG et al., 2012).

Este processo proporciona melhorias que vão desde a limpeza de

superfícies, secagem, emulsificação, preservação, homogeneização,

filtração, inativação de microrganismos e enzimas, extração de alguns

compostos, ruptura de células, desgaseificação de alimentos líquidos até

a aceleração da transferência de calor (CHEMAT; HUMA; KHAN, 2011;

YANG et al., 2012). Seu uso oferece ainda, vantagens em termos de

segurança, rendimento, produtividade e seletividade, tempo de

tratamento, qualidade, riscos físicos e uso de compostos químicos

reduzidos, além de ser ambientalmente amigável (FERNANDES;

RODRIGUES, 2009a; CHEMAT; HUMA; KHAN, 2011).

O valor nutricional do alimento que é submetido a sonicação pode

sofrer alterações. No entanto, o nível de degradação de compostos

bioativos como os antioxidantes devido à aplicação de US é relativamente

baixo e esta tecnologia pode ser considerada como uma boa alternativa

quando a retenção da qualidade nutricional é uma prioridade

(FERNANDES; RODRIGUES, 2012).

O US sozinho ou em combinação com o calor e/ou pressão é

eficaz contra várias enzimas pertinentes para a indústria de sucos, tais

como lipoxigenases, peroxidase e polifenoloxidase, bem como as

resistentes ao calor, lipase e protease. A eficácia do US no controle da

atividade enzimática é fortemente influenciada por fatores intrínsecos e

extrínsecos tais como a concentração da enzima, temperatura, pH, e

composição do meio, funcionando melhor quando combinado

(FERNANDES; RODRIGUES, 2012).

10

Tabela 1 – Efeito do ultrassom em alimentos sonicados (adaptada de

PINGRET; FABIANO–TIXIER; CHEMAT, 2012)

Alimento Analito Observações Referência

Suco de

tomate

Cor e ácido

ascórbico

Modificação da cor e

degradação do ácido

ascórbico

Adekunte et al.

(2010)

Tomate Licopeno Isomerização do

licopeno, com aumento

de 14% nos isômeros

cis e decréscimo de

76% nos trans

Eh; Teoh

(2012)

Sucos de

abacaxi, uva

e cranberry

pH e cor Mudanças em ambos Bermudez–

Aguirre;

Barbosa–

Cánovas

(2012)

Suco de

morango

Antocianinas e

ácido

ascórbico

Redução em ambos Tiwari et al.

(2008)

Suco de

laranja

Ácido

ascórbico e β–

caroteno

Redução em ambos

Vercet; Burgos;

López–Buesa

(2002)

Suco de

melancia

Compostos

minoritários

Degradação de ácido

ascórbico, licopeno e

fenólicos

Rawson et al.

(2011)

Agrião Cor Aumento da cor verde Cruz; Vieira;

Silva (2007)

A cisão das ligações H–O nas moléculas de água e produção de

peróxido de hidrogênio (H2O2) acontecem em meio sonicado, portanto são

importantes, visto que implicam na transformação de espécies químicas.

A este fenômeno de cisão homolítica, deu–se o nome de sonólise da

11

água, o qual leva à produção direta dos radicais livres H● e HO● no meio.

A elevada reatividade dos radicais livres (RL) favorece as interações

destas espécies com íons, moléculas, ou ainda, a associação destes,

gerando novas espécies moleculares, ou ainda, novos RL (KORN;

ANDRADE; BORGES, 2003).

Os RL formados podem atacar as enzimas e destruir pontes de

hidrogênio e interações hidrofóbicas entre as subunidades enzimáticas,

iniciando a sua dissociação e conduzindo à perda da atividade catalítica

(TARUN et al., 2006).

Em frutos, a quantidade de SS também é afetada pelo US se o

mesmo é imerso em água destilada ou numa solução hipotônica

(OLIVEIRA et al., 2010; RODRIGUES et al., 2009; FERNANDES;

RODRIGUES, 2007). Em geral, a perda de SS aumenta com a diminuição

da frequência. A perda total de SS pode ser tão elevada quanto 50%, se o

produto estiver imerso em água destilada por mais de 30 minutos

(FERNANDES; RODRIGUES, 2012).

Mais estudos são necessários para explorar e avaliar os benefícios

e restrições da aplicação de US no processamento mínimo

(FERNANDES; RODRIGUES et al., 2009b).

2.4 Estresse oxidativo e sistema de defesa

A instalação do estresse oxidativo decorre da existência de um

desequilíbrio entre compostos ou reações oxidantes e antioxidantes, em

favor da geração excessiva de RL ou em detrimento da velocidade de

remoção destes. Tal processo conduz à oxidação de biomoléculas com

consequente perda de suas funções biológicas e/ou desequilíbrio

homeostático, cuja manifestação é o dano oxidativo potencial contra

células e tecidos (BARBOSA et al., 2010).

Durante a respiração normal, algumas espécies reativas de

oxigênio (EROs) são produzidas na cadeia de transporte de elétrons, e

através de outras rotas metabólicas em locais distintos, dentro da célula

(Figura 3).

12

Fonte: Bhattacharjee (2005)

Figura 3 – Vias de formação das espécies reativas de oxigênio (EROs)

em células vegetais

Quando os tecidos estão sob condição de estresse, a taxa

respiratória é acelerada e mais EROs são produzidas (CHITARRA;

CHITARRA, 2005). As EROs podem ser divididas em radicais como ânion

superóxido (O2●−), radical hidroxila (HO●), alcooxil (RO●) e peroxil

(ROO●) e em não radicais como oxigênio, peróxido de hidrogênio (H2O2),

ozônio, ácido hipocloroso, etc. (ARORA et al., 2002).

O sistema de defesa antioxidante tem a função de inibir e/ou

reduzir os danos causados pela ação deletéria dos RL ou das espécies

reativas não radicais. Este tem o objetivo de limitar as espécies reativas

intracelulares e de controlar os danos (BARBOSA et al., 2010). A

peroxidação lipídica ou lipoperoxidação (LPO, Figura 4) é um dos

principais indicadores dos danos oxidativos e pode ser definida como

resultante da ação dos RL sobre os lipídeos insaturados das membranas

celulares levando à destruição da sua estrutura e até morte das células

(BENZIE, 1996).

13

Fonte: Damodaran, Parkin e Fennema (2010)

Figura 4 – Etapas da oxidação de ácidos graxos (adaptada)

A via de oxidação de ácidos graxos pode ser descrita por três

etapas gerais: iniciação, onde há a abstração de um hidrogênio de um

ácido graxo para formar um radical alquil; propagação, na qual ocorre a

adição de oxigênio ao radical alquil formando o radical peroxil e ainda a

adição de outro hidrogênio (oriundo de outro ácido graxo) a este último

com a formação do hidroperóxido de ácido graxo e também de novos

radicais alquil, estendendo a reação; e, a terminação, onde vai haver a

combinação de dois radicais para a formação de espécies não radicais

(DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).

Os sistemas antioxidantes são formados por componentes

enzimáticos e não enzimáticos, como as enzimas superóxido dismutase

(SOD), catalase (CAT) e ascorbato peroxidase (APX) e, compostos

fenólicos, carotenoides e ácido ascórbico, respectivamente (BARBOSA et

al., 2010).

14

Os fenólicos são caracterizados por conterem um grupo fenol, ou

seja, uma hidroxila funcional ligada à um anel aromático (Figura 5)

(CHITARRA; CHITARRA, 2005) e englobam desde moléculas simples até

outras com alto grau de polimerização (BRAVO, 1998), estando presentes

nos vegetais na forma livre ou ligados a açúcares e proteínas (CROFT,

1998). Entre os polifenóis, os flavonoides, os ácidos fenólicos, os taninos

e os tocoferóis, destacam–se como os mais comuns encontrados em

frutos e hortaliças (KING; YOUNG, 1999).

Fonte: Taiz e Zeiger (2009)

Figura 5 – Estrutura de um grupo fenol (adaptada)

A atividade antioxidante apresentada por vários produtos vegetais

está correlacionada ao seu conteúdo de compostos fenólicos (VELIOGLU

et al., 1998; KÄHKÖNEN et al., 1999). E esse potencial dos fenólicos

deve–se a sua ação como sequestradores de radicais e algumas vezes

como quelantes de metais (SHAHIDI et al., 1992), eliminando o oxigênio

singlete e triplete e decompondo hidroperóxidos (WANG; BALLINGTON,

2007).

Os flavonoides (Figura 6 e Tabela 2) são fenólicos que englobam

classes de pigmentos naturais cujo esqueleto básico contém 15 carbonos

organizados em dois anéis aromáticos, conectados por uma ponte de três

carbonos (TAIZ; ZEIGER, 2009). As antocianinas e os flavonóis são

compostos que pertencem ao grupo dos flavonoides e são responsáveis

pela coloração que varia de vermelho vivo à violeta e de branco ao

amarelo–claro, respectivamente (BOBBIO; BOBBIO, 1995). Além de

atuarem como pigmentos atrativos, eles participam também no

desenvolvimento e defesa dos vegetais contra o ataque de patógenos

(DIXON; HARRISON, 1990).

OH

15

Os compostos fenólicos em suco de amora não foram degradados

por US segundo estudo feito por Wong, Vaillant e Perez (2010), bem

como, antocianinas de suco de morango que também não foram

degradadas após sonicação (TIWARI et al., 2009).

Fonte: Taiz e Zeiger (2009)

Figura 6 – Estrutura de um flavonoide (adaptada)

Tabela 2 – Atividade antioxidante de alguns flavonoides (adaptada de

GONZALO; ALONSO, 2002)

Flavonoide Capacidade antioxidante total em

equivalentes de trolox*

Quercetina 4,7

Epigalocatequina 3,8

Catequina 2,4

Luteolina 2,1

Kaempferol 1,3

* concentração mM trolox que tem capacidade antioxidante igual a 1 mM da substância

em estudo.

A quercetina, o kaempferol, e a miricetina, de acordo com Gonzalo

e Alonso (2002), são os flavonoides mais conhecidos em frutos. Todavia,

Azevedo (2006) constatou a epicatequina como o majoritário em mangas

‘Tommy Atkins’.

Os carotenoides (Figura 6) são pigmentos tetraterpenóides, de 40

carbonos unidos por unidades opostas no centro da molécula,

responsáveis pelas cores do amarelo ao vermelho e que desempenham

um papel fundamental na saúde humana como precursores da vitamina A

(DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).

16

Fonte: Rodrigues–Amaya (2001)

Figura 7 – Estrutura de um carotenoide/β–caroteno (adaptada)

Os carotenoides acumulam–se em cloroplastos como uma mistura

de α e β–carotenos, β–criptoxantina, luteína, zeaxantina, violaxantina e

neoxantina, estando complexados não covalentemente com proteínas

(UENOJO; MARÓSTICA JÚNIOR; PASTORE, 2007) e desempenhando

importantes funções na fotossíntese e na fotoproteção (DAMODARAN;

PARKIN; FENNEMA, 2010), susceptíveis a isomerização e oxidação. Em

mangas cv. Tommy Atkins, a violaxantina aparece como carotenoide

majoritário (RODRIGUES–AMAYA; KIMURA; AMAYA–FARFAN, 2008).

Quando os frutos são processados, há a liberação de ácidos

orgânicos que pode provocar a isomerização dos carotenoides, pois estes

são altamente insaturados, causando alterações na cor (MATTIETTO;

LOPES; MENEZES, 2010).

A vitamina C é uma das vitaminas mais importantes para a nutrição

humana e tem o ácido L–ascórbico como sua principal forma

biologicamente ativa (HERNÁNDEZ; LOBO; GONZÁLEZ, 2006), cuja

fórmula química é C6H8O6 (Figura 8), atua como um antioxidante e, por

conseguinte, oferece alguma proteção contra o estresse oxidativo e

doenças relacionadas (DIPLOCK et al., 1998).

A manga pode ser considerada uma fonte de vitamina C

(JERONIMO et al., 2007). Porém, o processamento mínimo favorece a

degradação desta vitamina porque, além do corte aumentar a respiração

dos frutos, fazendo com que os ácidos orgânicos sejam utilizados no seu

metabolismo, há também a oxidação da mesma pelo aumento da

superfície de exposição e o contato com enzimas que podem degradá–la.

Como o US provoca a formação de RL (KORN, ANDRADE,

BORGES, 2003), o ácido ascórbico oriundo do fruto, pode reagir com os

mesmos resultando em sua degradação. Cao et al. (2012), porém, não

17

observaram modificações no conteúdo de vitamina C no dia da aplicação

do US em morangos, assim como Cheng et al. (2007) ao estudar suco de

goiaba sonicado.

Fonte: Fiorucci (2003)

Figura 8 – Estrutura do ácido ascórbico

O nível de degradação de antioxidantes devido à aplicação de US

é relativamente baixo e a tecnologia de processamento com US pode ser

considerada uma técnica alternativa potencial quando a retenção da

qualidade nutricional é uma prioridade (FERNANDES; RODRIGUES,

2012).

As enzimas antioxidantes são responsáveis, em conjunto com os

antioxidantes não enzimáticos, pela conservação pós–colheita dos frutos

combatendo as EROs que causam a deterioração e senescência dos

tecidos. Todavia, a ação das mesmas pode resultar em reações que

levam ao escurecimento e ocasionam a perda da qualidade visual e

nutricional. Essas enzimas estão relacionadas à comercialização e vida

útil dos frutos, pois suas atividades vão refletir diretamente na qualidade

dos mesmos, principalmente nos MP, cuja superfície de exposição e

descompartimentalização foram aumentadas, favorecendo as reações

degradativas.

A catalase (CAT, EC 1.11.1.6) é uma enzima envolvida na

detoxificação e na proteção contra o estresse oxidativo (FARR; KOGOMA,

1991) participando da remoção de peróxidos, mais especificamente,

convertendo o H2O2 em água e oxigênio molecular:

H2O2 H2O + O2

18

Podem ser divididas em três classes: I – removem o H2O2

produzido durante a fotorrespiração em tecidos fotossintéticos; II –

produzidas em tecidos vasculares e podem exercer uma função de

lignificação, mas sua exata função biológica permanece desconhecida; e

III – presentes abundantemente em sementes e plantas jovens, cuja

atividade está relacionada à remoção do H2O2 produzido durante a

degradação dos ácidos graxos nos glioxissomo (BREUSEGEM et al.,

2001).

A dismutase do superóxido (SOD, EC 1.15.1.1) é uma

metaloenzima com três classes dependendo do cofator metálico (Mn, Fe,

ou CuZn) que desempenha um papel essencial na proteção contra o

estresse oxidativo (SANTOS et al., 2000; MORAN et al., 2003), pois

catalisa a dismutação do radical superóxido (O2● −) a H2O2:

O2● − + O2

●− + 2H H2O2 + O2

As plantas, normalmente, têm Cu/Zn–SOD no citosol, Cu/Zn e/ou

Fe−–SOD no cloroplasto e Mn–SOD na mitocôndria (BAKER; ORLANDI,

1995).

As Peroxidases (G–POD, EC 1.11.1.7 e APX, EC 1.11.1.1) de

plantas são heme proteínas que podem estar ligadas covalentemente à

membrana (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010). Essas enzimas

catalisam reações redox usando o H2O2 como aceptores de hidrogênio

retirado de diferentes substratos como ácido ascórbico (APX), aminas

aromáticas e fenólicos como o guaiacol (G–POD). A remoção do H2O2

evita a formação do oxigênio singlete pela reação com o O2. A APX em

suco de melão foi inativada após tratamento com US (FONTELES et al.,

2012).

Especificamente para a G–POD, sua ação antioxidante se

confunde com a produção de substâncias que resultam no escurecimento

dos tecidos.

19

A reação geral de peroxidação, que resulta em escurecimento é a

que segue:

2 AH (doador de elétron) + H2O2 2H2O + 2A●

No caso de AH ser o guaiacol, haverá adição de radicais livres em

2A● (polimerização), resultando em tetrâmeros, marrons (Figura 8).

Fonte: Fatibello–Filho e Vieira (2002)

Figura 9 – Reação catalisada pela enzima G–POD na qual a mesma

converte o guaiacol e o peróxido de hidrogênio em tetraguaiacol

Outra enzima envolvida com o escurecimento oxidativo é a

polifenoloxidase (PPO, EC 1.14.18.1) que atua sobre os compostos

fenólicos, causando a sua oxidação a quinonas na presença de O2

(CHITARRA, CHITARRA, 2005). Essas enzimas pertencem ao grupo das

óxido–redutases e contém cobre como grupo prostético sendo

classificadas de acordo com o substrato utilizado: fenolase, catecolase,

tirosinase, cresolase ou difenolase (CHITARRA, CHITARRA, 2005) e

assim, mediar as reações a seguir (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA,

2010):

monofenol + O2 + 2H+ o–difenol + H2O

o–difenol + ½ O2 o–quinona + H2O

A ação da enzima não forma pigmentos marrons diretamente. As

quinonas resultantes (que já são compostos escuros) podem ainda

20

sofrem reações de condensação química (envolvendo aminas e

proteínas) gerando macromoléculas escuras chamadas de “melaninas”

(DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010). Assim, o escurecimento

enzimático dos tecidos vegetais depende do tipo de substrato,

concentração e localização e também do tipo de polímero formado a partir

da quinona (CHITARRA; CHITARA, 2005).

Acredita–se que o papel das PPOs em plantas seja de defesa

contra pestes e patógenos (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).

Em tecidos vivos, a enzima e o seu substrato fenólico estão separados

dentro das células. Quando há um dano na célula, os mesmos entram em

contato, ocorrendo então a reação, o que acarreta também, além do

escurecimento, a diminuição do valor nutritivo do produto (ESCRIBANO et

al., 1997).

Ndiaye et al. (2009) ao estudarem mangas minimamente

processadas branqueadas com vapor, demonstraram a inativação

completa da POD e PPO seguidos, porém, de um alto índice de

escurecimento

Fonteles et al. (2012) avaliaram o efeito da sonicação nas enzimas

POD e PPO em suco de melão. De acordo com os autores, houve um

aumento na atividade da POD em baixos tempos de processamento, por

outro lado a PPO diminuiu. Ao contrário, Cheng et al. (2007) verificaram

um aumento na atividade da PPO em suco de goiaba tratado com US.

Jang e Moon (2011) demonstraram que o US não inibiu a atividade

monofenolásica e estimulou a difenolásica da PPO em maçãs MP.

Outra enzima envolvida com respostas às condições estressantes

é a fenil amônia liase (do inglês PAL, EC 4.3.15), pois é a primeira enzima

da rota de síntese de compostos fenólicos, os quais participam

diretamente dos vários mecanismos de defesa das plantas. Quando um

vegetal é exposto a condições adversas de temperatura, danos

mecânicos conteúdo hídrico, luz e ataque de patógenos, a síntese de

metabólitos secundários de defesa como os fenólicos é ativada

(SREELAKSHMI; SHARMA, 2008).

21

A rota do ácido chiquímico converte os carboidratos derivados da

glicólise e da via das pentoses–fosfato em fenilalanina que é a precursora

dos fenólicos. Assim, a PAL está situada em um ponto de ramificação

entre o metabolismo primário e o secundário (TAIZ; ZEIGER, 2009), pois

catalisa a desaminação da fenilalanina com produção de ácidos trans–

cinâmico, sendo uma etapa reguladora importante na formação de muitos

compostos fenólicos (DIXON; PAIVA, 1995), tais como: ácidos cumárico,

caféico, ferrúlico e clorogênico, antocianinas, etc. (CHITARRA;

CHITARRA, 2005).

A atividade da PAL parece ser extremamente sensível ao estado

fisiológico da planta, (SREELAKSHMI; SHARMA, 2008) o seu aumento

indica condições de estresse dos tecidos, seja pela ação de agentes

bióticos ou não. No processamento mínimo de banana, o corte induziu a

aumentos significativos na atividade da PAL, bem como acúmulo de

compostos fenólicos (CHEN et al., 2009) que contribuem para o

escurecimento dos tecidos (KLAIBER et al., 2005). Assim, na prática, os

tratamentos que interferem com o aumento da atividade PAL ou com a

síntese e acumulação de compostos fenólicos reduzem a descoloração

de produtos MP (PEISER et al., 1998).

Na avaliação da injúria pelo frio em mangas íntegras armazenadas

sob baixas temperaturas, a atividade da PAL foi bem maior na casca que

na polpa dos frutos (CHIDTRAGOOL et al., 2011).

É difícil identificar o mecanismo de inativação enzimática específica

durante a sonicação. Pode ser devido a um singular ou combinação de

vários efeitos químicos e físicos que ocorrem simultaneamente

(O’DONNELL et al., 2010).

2.5 Enzimas hidrolíticas da parede celular vegetal

A firmeza dos frutos depende diretamente da integridade da

membrana plasmática e da parede celular, cujas primárias, típicas das

polpas, são formadas por esqueleto de microfibrilas de celulose imerso

em uma matriz de pectina e hemicelulose, glicoproteínas e água (KNEE,

22

2002). As secundárias, mais espessas e resistentes, são depositadas

quando a maior parte do crescimento está concluída, sendo sua

resistência e rigidez associadas à lignina (TAIZ; ZEIGER, 2009).

As pectinas, também presentes na lamela média (KASHYAP et al.,

2001), têm estruturas complexas, mas a maior parte consiste em

homopolímeros de resíduos de ácido D–poligalacturônico unidos por

ligações α (1→4). Alterações na composição péctica podem ocorrer

devido à modificação química desses compostos como a β–eliminação ou

por ação de enzimas hidrolíticas endógenas, as quais degradam pectina,

como a pectinametilesterase (PME) e poligalacturonase (PG) (VERLENT

et al., 2004).

A PME (EC 3.1.1.11) catalisa a remoção de ésteres metílicos da

pectina (ANTHON, 2002; DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010),

resultando na liberação de metanol e aumento do número de grupos

carboxilas (ANTHON, 2002), tornando a molécula parcialmente

desesterificada. Este processo, por si só não tem impacto direto sobre a

viscosidade do meio, no entanto, o grau mais baixo de esterificação da

molécula, torna–a um melhor substrato para a PG (PRESSEY; AVANTS,

1982). Se por um lado, a PME reforça a ação de PG hidrolisando as

ligações glicosídicas α (1→4) das cadeias de ácido poligalactorônico, por

outro lado, sabe–se que a pectina sob a forma desmetilada pode ligar–se

a íons de Ca2+ para formar pectato de cálcio formando redes de gel, como

aumentando a resistência ao ataque da PG e, assim, ajudar a preservar,

e até aumentar a firmeza do produto (PRESSEY; AVANTS, 1982;

PORRETA, 1996).

A PG (EC 1.2.1.15) cliva o ácido poligalacturônico reduzindo o

comprimento médio das cadeias de pectina (ANTHON, 2002; UENOJO;

PASTORE, 2007) causando uma degradação estrutural (KERTESZ,

1951). É a principal enzima com função hidrolítica da parede celular.

Terefe et al. (2009) demonstraram, ao estudar a inativação da PME

de suco de tomate sonicado, que o tratamento combinado de US e calor

melhora a inativação da enzima, sendo mais eficiente que o tratamento

térmico sozinho. Raviyan, Zhang e Feng (2005) também relataram um

23

aumento na taxa de inativação da PME em extrato bruto de tomate sob

termosonicação, em comparação apenas ao tratamento térmico.

Já ao estudar a inativação da PG de suco de tomate, Terefe et al.

(2009) perceberam que as diferentes isoformas são inativadas em taxas

distintas, atribuído a sinergia entre o calor e o US.

A viscosidade muito mais elevada do meio (por ex. suco de tomate)

resulta em menos cavitação e consequentemente, um efeito do US

menos pronunciado sobre a enzima (VERCET et al., 2002). Diferentes

componentes do suco, incluindo pectina, pode também agir como protetor

sobre a enzima (WHITAKER, 1972).

O US de baixa frequência faz com que ocorra a inativação de

enzimas por várias formas: aumento localizado de temperatura e pressão,

que acompanham o colapso das bolhas de cavitação; uma forte força de

cisalhamento e choques criados por bolhas estáveis e geração de radicais

livres, que oxidam resíduos de aminoácidos importantes para a

estabilidade e atividade catalítica (SALA et al., 1995). A sonicação pode,

ainda, causar a degradação de proteínas oligoméricas (TEREFE et al.,

2009).

24

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material

Foram utilizadas mangas (Mangifera indica L.) da cultivar Tommy

Atkins no estádio maduro, segundo a escala de padronização

estabelecida por GTZ (1992), obtidas no comércio varejista local da

cidade de Fortaleza–CE. Selecionadas ainda quanto à uniformidade de

cor da casca, forma e tamanho.

3.2 Métodos

3.2.1 Processamento mínimo e tratamento com US

Os frutos foram primeiramente lavados com sabão neutro em água

corrente para a retirada de sujidades aderidas à casca e sanitizados em

solução 150 ppm de hipoclorito de sódio. Então, foram mantidos em

geladeira a 10 oC (previamente sanitizada) pelo período de uma noite,

com a finalidade de diminuir as injúrias durante o processamento. Após

descasque, os frutos foram cortados longitudinalmente e em seguida

fatiados, desprezando–se a semente (Figura 10). As fatias foram, então,

imersas em solução sanitizante de hipoclorito de sódio 5 ppm durante 2

minutos (BASTOS, 2006a) e a água drenada. O fluxograma com as

etapas de processamento, adaptado de acordo com Moretti (2007), está

apresentado na Figura 11.

Fonte: Jessika Gonçalves dos Santos

Figura 10 – Manga cv. Tommy Atkins MP

25

Fonte: Moretti (2007)

Figura 11 – Fluxograma de processamento mínimo e tratamento com US

de manga ‘Tommy Atkins’ (adaptada)

Recepção

Enxágue com água

fria clorada

Processamento

Lavagem com

água e detergente

neutro

Sanitização com

água clorada e

drenagem

Embalagem

Resfriamento

Armazenamento a

4 °C

Tratamento com

US

26

Os frutos controle correspondentes ao tempo zero e não

submetidos ao US foram imediatamente homogeneizados em Ultra

Turrax® (IKA, modelo T25), diluídos em água destilada (1:1) e a polpa

congelada. Já os frutos controle do tempo sete dias foram submetidos às

mesmas condições daqueles tratados, até as análises.

Os demais frutos processados receberam o tratamento, que se deu

pela alocação das fatias de manga, escolhidas aleatoriamente, em um

Becker com água destilada (na proporção de 1:4) e submetidas ao banho

de US (Marconi, modelo USC 1450) na frequência de 25 kHz por 30

minutos. Após o tratamento com US, as fatias foram drenadas e

acondicionadas em bandejas de poliestireno expandido (isopor), cobertos

com filme de policloreto de polivinila (PVC) e armazenados por sete dias

em refrigeração (4 oC), simulando a armazenagem comercial.

Para definir os parâmetros utilizados neste estudo foram realizados

ensaios preliminares com 10, 20 e 30 minutos de exposição ao US (25

kHz). As fatias de manga foram avaliadas no dia de tratamento e após

sete dias de armazenamento refrigerado a 4 oC, quanto a cor, firmeza,

umidade, perda de água e de sólidos solúveis. Os melhores resultados

foram para o tratamento com US por 30 minutos (dados não mostrados).

3.2.2 Avaliações físicas e físico–químicas

3.2.2.1 Potencial hidrogeniônico (pH)

O pH foi medido através de processo eletrométrico, pelo uso de

pHmetro digital (Bel Engineering, modelo W3B) de acordo com AOAC

(1995).

3.2.2.2 Acidez titulável (AT)

A acidez das amostras foi determinada por processo volumétrico,

através de titulação (IAL, 1985). Aproximadamente, 1 g da amostra foi

pesado e diluído em 50 mL de água destilada, sendo então titulado com

27

NaOH 0,1N, utilizando–se fenolftaleína 1% como indicador. A titulação

procedeu até a mudança da cor da solução para levemente róseo. Os

resultados foram calculados de acordo com a equação 1 e expressos em

termos de percentagem de ácido cítrico.

(1) AT = 10 x Fa x Fb x Vb / Pa

Onde, Fa = fator do ácido málico; Fb = fator do NaOH; Vb = volume de

NaOH gasto na titulação; Pa = peso da amostra.

3.2.2.3 Sólidos solúveis (SS)

Os sólidos solúveis foram determinados por medida direta em

refratômetro digital portátil (Quimis, modelo Q7670145).

3.2.2.4 Conteúdo de açúcares totais e redutores

O açúcares totais e redutores foram quantificado pelos métodos da

Antrona (YEMN; WILLIS, 1954) e do Ácido 3,5–Dinitro–Salicílico, DNS

(MILLER, 1959), respectivamente.

Para a análise de açúcares totais, 5 g da polpa foram pesados e

diluídos em 50 mL de álcool etílico 80%. O conteúdo foi homogeneizado,

filtrado e em seguida, uma alíquota de 1 mL foi diluída em 50 mL de água

destilada. Em microtubos, o meio reacional constava de 50 µL da

segunda diluição e 200 µL de água destilada, que permaneceram em

banho de gelo até a adição de 500 µL do reagente de Antrona. Após

agitação, os microtubos foram colocados imediatamente em Banho–Maria

por 8 minutos a 100 oC, seguidos de resfriamento em banho de gelo para

paralisar a reação. Posteriormente, a absorbância foi medida a 620 ηm e

os cálculos se basearam em uma curva padrão de glicose sendo

expressos em g/kg massa fresca (MF).

Para a análise de açúcares redutores, 5 g da polpa foram pesados

e diluídos em 50 mL de água destilada. Após homogeneização e

filtragem, 75 µL da amostra, 75 µL de água destilada e 100 µL de DNS

28

foram adicionados em microtubos e homogeneizados, sendo mantidos em

Banho–Maria por 5 minutos a 100 oC. Decorrido o tempo, o material foi

resfriado em banho de gelo para paralisar a reação. Em seguida, aos

tubos foram adicionados 75 µL de água destilada. Após homogeneização,

a absorbância foi medida a 540 ηm e os cálculos se basearam em uma

curva padrão de glicose sendo expressos em g/kg MF.

3.2.2.5 Cor

As medições de cor foram realizadas com um colorímetro digital

(Konika Minolta, modelo CR–410), utilizando as coordenadas cilíndricas

do sistema e o espaço de cor L, C e ângulo hue.

3.2.2.6 Firmeza

Para medir a firmeza das amostras foi utilizado um texturômetro

automático de bancada (Brookfield, modelo CT3 25K) acoplado a um

computador. A ponteira de prova empregada foi a de 2 mm. Os resultados

foram obtidos em grama–força e convertidos para Newton.

3.2.2.7 Umidade em base seca

A umidade em base seca foi avaliada por secagem das amostras

em estufa a 60 oC por 24 horas, de acordo com o método 934.06 da

Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 1990). E calculada de

acordo com as equações 2 e 3, respectivamente:

(2) U = Pi – Pfe (para amostras controle)

(3) U = P US – Pfe (para amostras tratadas)

Onde, Pi = peso inicial da amostra; Pfe = peso final da amostra após a

estufa; P US = peso da amostra após tratamento com US.

29

3.2.2.8 Perda de água e de sólidos

As amostras foram pesadas antes e após o tratamento e a

percentagem de perda de água (PA) e sólidos (PS), foram calculadas

pelas equações 4 e 5, respectivamente:

(4) PA = 100 x (Pi – P US) / Pi

(5) PS = 100 x (X controle – X US) / X controle

Onde, PA = perda de água; Pi = peso inicial da amostra; P US = peso da

amostra após tratamento com US; PS = perda de sólidos; X controle =

sólidos na amostra controle; X US = sólidos na amostra tratada com US.

3.2.2.9 Conteúdo de proteína solúvel total

A quantificação das proteínas solúveis totais foi realizada de

acordo com a metodologia de Bradford (1976), onde 10 µL de extrato

reagiram com 100 µL do reagente de Bradford, com posterior leitura na

absorbância de 595 ηm. A atividade de todas as enzimas se baseou no

conteúdo de proteínas totais de cada extrato.

3.2.3 Sinalizadores de estresse oxidativo

3.2.3.1 Atividade da enzima fenil alanina amônia–liase (PAL)

Tanto a obtenção dos extratos quanto a determinação da atividade

da PAL foram baseadas em modificações dos métodos originalmente

descritos por Mori, Sakurai e Sakuta (2001) e El–Shora (2002),

respectivamente. Para o extrato, 3 g de polpa foram homogeneizados em

3 mL de tampão Tris–HCl 100 mM (pH 8,4) e em seguida, centrifugados a

10.192 g por 10 minutos a 4 oC, sendo o sobrenadante utilizado como

extrato. Todos os passos subsequentes foram realizados a 4 oC.

Esta enzima atua catalisando a desaminação não oxidativa da

fenilalanina tendo como produto ácido trans–cinâmico e amônia, sendo

30

uma enzima–chave entre o metabolismo primário e o secundário. Para a

determinação da atividade enzimática o meio de reação foi composto por

3,5 µL de β–mercaptoetanol, 16,5 µL do extrato, 96,5 μL do tampão Tris–

HCl 100 mM (pH 8,4) e 33,5 µL de L–fenilalanina 40mM. A amostra foi

incubada por 1 hora na temperatura de 30 oC e em seguida, a

absorbância lida a 290 ηm. Para os cálculos, foi utilizado o fator de 0,94 e

os resultados dados em ηmol de ácido trans–cinâmico/h/mg P.

3.2.3.2 Grau de peroxidação lipídica

A determinação da peroxidação dos lipídios de membranas

biológicas foi feita conforme método descrito por Zhu et al. (2008), com

base na formação do malondialdeído (MDA), produto secundário da

oxidação de ácidos graxos polinsaturados, que ao reagir com o ácido

tiobarbitúrico (do inglês, TBA) pode ser lido por espectrofotometria.

Para a análise, 2 g de polpa foram centrifugados com 10 mL de

ácido tricloroacético 0,1% (do inglês, TCA), na rotação de 3.248 g por 20

minutos a 4 oC. Foram adicionados, 75 µL do sobrenadante e 300 µL de

uma solução com TCA 20% e TBA 0,5% seguido de agitação e

aquecimento por 30 minutos a 95 oC. Decorrido o tempo da reação, a

mesma foi paralisada quando os tubos foram transferidos para banho de

gelo. Uma nova centrifugação, então, foi realizada a 3.000 g por 10

minutos. A absorbância do sobrenadante foi lida em 532 e 600 ηm

gerando absorbâncias específica e não específica, respectivamente. Os

cálculos foram obtidos utilizando o coeficiente de extinção molar do MDA

de 155 mM/cm e expressos em ηmol MDA/g MF.

3.2.3.3 Conteúdo peróxido de hidrogênio (H2O2)

A quantificação do H2O2 foi feita conforme descrito por Sergiev,

Alexieva e Karanova (1997). Onde, 0,5 g da polpa foram macerados com

TCA 5% por 5 minutos, em banho de gelo. Em seguida o material foi

centrifugado a 12.000 g por 15 minutos a 4 oC. No escuro, uma alíquota

31

de 20 µL do sobrenadante foi então adicionada a 20 µL de tampão fosfato

de potássio 10 mM, pH 7, e a 40 µL de iodeto de potássio 1M. A mistura

foi deixada, ainda em ambiente sem luz, reagindo durante uma hora.

Passado o tempo, a leitura foi feita a 390 ηm e os cálculos, baseados em

uma curva padrão de H2O2, foram expressos em µmol H2O2/g MF.

3.2.4 Antioxidantes não enzimáticos e capacidade antioxidante total

3.2.4.1 Antocianinas totais e flavonoides amarelos

A avaliação se baseou na metodologia de Francis (1982). Em um

graal, 1 g de polpa e 5 mL de solução etanol–HCl (1,5 M) foram

homogeneizados durante 5 minutos. Em seguida, o conteúdo foi

transferido para um balão de 10 mL e o volume aferido com a mesma

solução. Em frasco escuro, o conteúdo do balão ficou em repouso por

uma noite, sendo em seguida filtrado e a absorbância medida a 535 ηm

para antocianinas e 374 ηm para flavonoides amarelos. Para os cálculos,

foram utilizados os coeficientes de extinção molar de 76,6 e 98,2 M/cm,

para flavonoides amarelos e antocianinas totais, respectivamente. Os

resultados foram expressos em mg/kg MF.

3.2.4.2 Polifenóis extraíveis totais (PET)

A quantificação dos PET se deu através do método de Folin–

Ciocalteu descrito por Obanda e Owuor (1997) e modificado por Rufino et

al. (2006). Para a obtenção do extrato (LARRAURI et al., 1997), 5 g de

polpa foram pesados e receberam 4 mL de metanol 50%. Após

homogeneização, os tubos permaneceram em repouso na ausência de

luz e em temperatura ambiente durante uma hora. Em seguida, foram

centrifugados a 4.677 g por 30 minutos a 4 oC, sendo o sobrenadante

filtrado e recolhido para um balão volumétrico de 10 mL. Ao resíduo da

centrifugação foi adicionado mais 4 mL de acetona 70% que foi

homogeneizado e deixado em repouso, centrifugado e recolhido nas

32

mesmas condições descritas anteriormente. Posteriormente, o balão

volumétrico foi completado com água destilada constituindo o extrato de

análise.

Em microtubos mantidos no escuro, foram adicionados nesta

ordem: 100 µL do extrato, 650 µL de água destilada, 250 µL do reativo de

Folin–Ciocalteau e 500 µL de carbonato de sódio anidro 20%. Após

homogeneização, os tubos ficaram descansando por 30 minutos

protegidos da luz e na temperatura ambiente. A leitura aconteceu em

leitor de microplacas na absorbância de 700 ηm. Os resultados,

calculados com base em uma curva padrão de ácido gálico, foram

expressos em mg de equivalente à ácido gálico (EAG)/kg MF.

3.2.4.3 Carotenoides

O método descrito por Lichtenthaler e Wellburn (1983) foi utilizado

para esta análise. No escuro, 2 g da polpa foram macerados em banho de

gelo por 5 minutos, com 0,2 g de carbonato de cálcio e 7 mL de acetona

80%. O extrato foi filtrado diretamente num balão volumétrico âmbar de

25 mL. Uma alíquota foi retirada e lida nas absorbâncias de 470, 646 e

663 ηm. Para os cálculos foram utilizadas as seguintes equações:

(6) Clorofila a (µg/mL) = 12,21 x (A663) – 2,81 x (A646)

(7) Clorofila b (µg/mL) = 20,13 x (A646) – 5,03 x (A663)

(8) Carotenoides (µg/mL) = (1000 x (A470) – 3,27 x [clorofila a] – (104 x

[clorofila b]) / 227

Onde, A663, A646 e A470 = absorbâncias a 663, 646 e 470 ηm,

respectivamente.

Os resultados foram expressos em mg/kg MF.

3.2.4.4 Vitamina C total

A análise do conteúdo total de vitamina C foi feita de acordo com

Strohecker e Henning (1967). Na ausência de luz, 1 g de polpa foi

33

adicionado a 50 mL de ácido oxálico 0,5% (refrigerado) e uma alíquota de

5 mL foi colocada em um erlenmeyer completando–se o volume com

água destilada até 50 mL. Procedeu–se, então, a titulação com a solução

de Tillman refrigerada, até ponto de viragem, representado pela cor róseo

clara, persistente por 15 segundos, quando o reagente é reduzido de azul

a incolor tornando–se róseo em meio ácido. Os resultados foram

expressos em mg ácido ascórbico/kg MF.

3.2.4.5 Capacidade antioxidante total

Para a determinação da capacidade antioxidante total (do inglês,

TEAC – Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) foi seguido o método da

captura do radical ABTS•+ descrito originalmente por Re et al. (1999) e

modificado por Rufino et al. (2006). A análise baseou–se na captura do

radical 2,2’–azinobis (3–etilbenzotiazolina–6–ácido sulfônico) (ABTS●+),

formado da reação entre uma solução ABTS 7 mM com uma solução de

persulfato de potássio 140 mM, mistura a qual foi mantida no escuro e em

temperatura ambiente por 16 horas antes do seu uso. A solução de

ABTS●+ resultante foi diluída em álcool etílico P.A. para a absorbância de

0,700 ± 0,020 em 734 ηm. O radical foi utilizado nesta faixa de

absorbância.

O extrato analisado foi obtido da mesma forma que o utilizado na

análise de PET, contudo, partindo de 25 g de polpa para um balão de 25

mL, em três diferentes concentrações. Em ambiente escuro, foi

adicionado em microplaca, uma alíquota de 3 μL do extrato e 300 µL da

solução ABTS●+. Após 6 minutos de descanso a absorbância foi lida na

absorbância de 734 ηm.

Uma curva padrão construída a partir do composto de referência 6–

hidroxi–2,5,7,8–tetrametilchroman–2–ácido carboxílico (trolox) foi utilizada

para avaliar a TEAC. Partindo desta curva, foi obtida uma equação, a

partir da qual se calculou a absorbância referente a 1000 µM de trolox.

Os resultados foram apresentados em capacidade antioxidante

equivalente ao trolox correspondente a µM de trolox/g MF.

34

3.2.5 Enzimas antioxidantes

Os extratos enzimáticos foram preparados a partir de uma

modificação no protocolo descrito por Yang, Zheng e Cao (2009). A

amostra (1 g) foi adicionada a 5 mL de tampão gelado Tris–HCl 0,05M,

pH 8 contendo EDTA 0,1mM e macerada durante 5 minutos, seguido de

filtração em tecido de náilon de malha fina. O filtrado foi mantido em

repouso por uma hora a 4 oC, período no qual foram realizadas agitações

ocasionais. Decorrido o tempo, o homogeneizado foi transferido para

microtubos e centrifugado a 12.000 g por 15 minutos a 4 oC. O

sobrenadante constituiu o extrato enzimático para a determinação da

atividade das enzimas antioxidantes e da peroxidase do guaiacol (G–

POD). Todos as etapas a seguir foram realizadas a 4 oC.

3.2.5.1 Atividade da ascorbato peroxidase (APX)

A análise da APX tem como base a reação que ela catalisa, onde

H2O2 e ascorbato são convertidos em água e monodeidroascorbato. Foi

realizada utilizando o princípio proposto por Nakano e Asada (1981), onde

o ácido ascórbico é oxidado durante a degradação de H2O2. A reação

constituiu–se de 100 µL de tampão fosfato de potássio 0,05 M com EDTA

0,05 mM (pH 6,0), 30 µL de extrato, 10 µL de H2O2 0,03M e 10 µL de

ascorbato 0,015M. As leituras foram realizadas a cada minuto durante 20

minutos, na absorbância de 290 ηm. Para os cálculos, tomou–se por base

o coeficiente de extinção molar do ascorbato (2,8 mM/cm) e a atividade foi

expressa como μmol H2O2/min/mg proteína (P), considerando que são

necessários 2 mols de ácido ascórbico para reduzir 1 mol de H2O2

(AMANKO; CHEN; ASADA, 1994).

35

3.2.5.2 Atividade da catalase (CAT)

A atividade da CAT está relacionada à degradação de H2O2. Para

medir a atividade desta enzima foi utilizado o método de Beers e Sizer

(1952). O meio reacional foi composto de 120 µL de tampão fosfato de

potássio 0,1 M com EDTA 0,1 mM (pH 7), 10 µL de H2O2 0,5M e 20 µL de

extrato. A leitura foi feita a cada minuto, a 240 ηm, num intervalo de 20

minutos. Para os cálculos foi utilizado o coeficiente de extinção molar do

H2O2 (36 M/cm) e os mesmos foram expressos em µmol H2O2/min/mg P.

3.2.5.3 Atividade da superóxido dismutase (SOD)

A determinação da atividade da SOD (GIANNOPOLITIS; RIES,

1977), baseia–se na reação da riboflavina com o oxigênio molecular (O2)

que na presença da luz reage com o nitro azul de tetrazólio (NBT),

resultando na formação de formanzana, um produto colorido que pode ser

monitorado espectrofotometricamente. Para a marcha analítica, em

microplaca e no escuro, foram adicionados 100 µL de tampão fosfato de

potássio 0,05 M com EDTA 0,1 mM e metionina 19,5 mM (pH 7,8), 5 µL

de extrato, 15 µL de NBT 750 µM e 30 µL de riboflavina 10 µM,

obedecendo esta ordem. A mistura reacional foi transferida para uma

câmara com luz fluorescente de 20 W, onde permaneceu por 15 minutos.

Foram utilizados dois tipos de branco, o “claro” que consistia de

todos os reagentes com substituição do extrato por água destilada, que foi

incubado nas mesmas condições da amostra e o “escuro”, o qual foi

preparado igual ao branco “claro”, porém, não foi submetido à presença

da luz. Após o período de reação na presença da luz, procedeu–se com

as leituras de absorbância a 560 ηm. O branco “escuro” foi utilizado para

zerar o equipamento. De acordo com Beauchamp e Fridovich (1971) uma

unidade de atividade (UA) foi definida como a quantidade de enzima

necessária para inibir em 50% a fotorredução do NBT. A atividade

específica foi expressa como UAE/mg P.

36

3.2.6 Enzimas responsáveis pelo escurecimento

O extrato enzimático para a determinação da PPO foi preparado

segundo método (modificado) descrito em 1998, por Sojo, Nuñez–

Delicado e García–Carmona. Em graal imerso em gelo, foram adicionados

10 mL de tampão fosfato de potássio 0,1 M contendo 4% de Triton X–110

(pH 6,1), 1 g de polpa e 0,02 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP). A

solução foi macerada por 5 minutos até apresentar–se homogênea e

então, centrifugada a 4.993 g por 40 minutos a 4 oC. O precipitado foi

descartado e o sobrenadante foi transferido para Banho–Maria a 37 oC

por 10 minutos seguidos de centrifugação a 1.630 g por 20 minutos a 4 oC. Todos os passos a seguir foram realizados a 4 oC. O extrato para a a

análise da G–POD foi o mesmo utilizado para as enzimas antioxidantes.

3.2.6.1 Atividade da polifenoloxidase (PPO)

A determinação da atividade desta enzima (Robinson, 1987) se

deu com 80 µL de tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 6), 100 µL de

extrato e 5 µL do substrato pirocatecol 0,1 M. A amostra foi incubada por

30 minutos a 30 oC. A absorbância foi medida a 395 ηm, uma unidade de

atividade enzimática (UAE) foi definida como a variação de 0,001 na

absorbância e os resultados expressos como UAE/min/mg P.

3.2.6.2 Atividade da peroxidase do guaiacol (G–POD)

A atividade da G–POD, que está relacionada à degradação do

guaiacol na presença de H2O2 formando o tetraguaiacol, foi mensurada

conforme descrito por Amanko, Chen e Asada (1994). Foram adicionados,

em microplaca, 90 µL de tampão fosfato de potássio 0,1 M com EDTA 0,1

mM (pH 7), 50 µL de guaiacol 0,02 M, 50 µL de H2O2 e 10 µL do extrato

sendo incubados a 30 oC e sua absorbância medida em 470 ηm após 1 e

10 minutos. Para os cálculos foi utilizado o coeficiente de extinção molar

37

do tetraguaiacol (26,6 mM/cm) e os resultados foram dados em µmol

H2O2/min/mg P.

3.2.7 Enzimas hidrolíticas da parede celular vegetal

A extração enzimática para a determinação da

pectinametilesterase (PME) foi feita pela homogeneização de 5 g de polpa

em 20 mL de NaCl 0,2 M gelado. A solução resultante foi filtrada em papel

de filtro quantitativo e o filtrado utilizado como extrato enzimático

(KÖRNER; ZIMMERMANN; BERK, 2006).

O extrato para poligalacturonase (PG) foi preparado segundo o

método de Pressey e Avants (1973), no qual 12,5 g de polpa foram

pesados e homogeneizados com 25 mL de água destilada e depois

centrifugados a 3.248 g durante 10 minutos a 4 oC. O sobrenadante foi

descartado e o precipitado ressuspendido em 10 mL de água, seguido de

centrifugação nas mesmas condições já descritas. Esse procedimento foi

realizado duas vezes. O último precipitado foi ressuspenso e

homogeneizado por um minuto em 25 mL de NaCl 0,1 M gelado. O pH

desta solução foi ajustado para 6 e a mesma foi incubada a 4 oC por uma

hora. Decorrido o tempo de incubação, a solução foi centrifugada a 3.248

g por 20 minutos a 4 oC. O sobrenadante constituiu o extrato enzimático.

3.2.7.1 Atividade da pectinametilesterase (PME)

A atividade tem por base a quantificação dos grupos carboxílicos

livres formados pela enzima, quando a mesma atua sobre as ligações da

pectina. Sua determinação foi feita através de titulometria seguindo

Kertesz (1955).

Em um Becker, 5 mL do extrato enzimático juntamente com 30 mL

do substrato pectina cítrica 1% em NaCl 0,2 M (pH 7,0), foram titulados

com NaOH 0,01N com auxílio de uma bureta de 10 mL. A titulação cessa

quando o pH 7 (± 0,01) é atingido ficando estável por 10 minutos. O

volume de NaOH gasto é utilizado para calcular a atividade da PME,

38

sendo uma unidade de atividade definida como a quantidade de enzima

capaz de desmetilar a pectina correspondente ao consumo de 1 ηmol

NaOH/min/g MF. Os resultados foram dados em UAE/mg P.

3.2.7.2 Atividade da poligalacturonase (PG)

A análise de atividade da PG (BUESCHER; FURMANSKI, 1978)

tem por base a determinação da quantidade de açúcar redutor (AR)

liberado devido à atividade desta enzima. A determinação ocorreu em

duas etapas. Primeiramente, a tubos de ensaio foram adicionados, 300 µL

de extrato e 300 µL de água destilada. A solução foi agitada e em seguida

uma alíquota de 75 µL foi retirada para análise do conteúdo de AR (1),

conforme método do DNS descrito no item 3.2.2.8.

Na segunda etapa, 300 µL de extrato e 300 µL de ácido

poligalacturônico 0,25% em tampão acetato de sódio 37,5 mM (pH 5)

foram colocados em tubos de ensaio e agitados. A solução foi incubada

durante 3 horas a 30 oC. A reação foi interrompida com banho de água

quente (100 oC) por 5 minutos, seguido de banho de gelo. Da solução

resultante, foi retirada uma alíquota de 75 µL para determinação do

conteúdo de AR (2) de acordo com o método do DNS, exposto no item

3.2.2.8.

A quantidade de açúcares redutores se deu pela subtração dos

valores de AR (1) por AR (2). Como a atividade da enzima é expressa

com base no conteúdo de AR liberados, o AR (1) representa a atividade

da enzima no extrato enzimático e o AR (2) a atividade quando a enzima

é colocada em contato com o seu substrato. Os resultados foram

calculados com base em uma curva padrão de glicose e expressos em

μmol AR/min/mg P.

39

3.3 Delineamento experimental e análise estatística

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado,

com 3 repetições. Todas as análises foram feitas em triplicata. Vale

ressaltar que os resultados foram corrigidos de acordo com o fator de

diluição inicial (1:1). Os dados foram submetidos a analise de variância e

ao teste de Tukey a 5% de significância utilizando o programa SISVAR

(FERREIRA, 2005).

40

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Qualidade da manga minimamente processada e tratada com US

Os atributos de qualidade estão descritos na Tabela 3. O

tratamento com US resultou em um aumento significativo no pH de 4,27

para 4,34 no tempo zero, apesar deste não ter sido afetado pelo tempo de

armazenamento. Provavelmente a entrada de água, bem como redução

de alguns compostos após sonicação, pode explicar essa modificação

sofrida pelo pH.

Vilas Boas et al. (2004) encontraram valores de pH (4,54) para

mangas MP, semelhantes aos encontrados neste trabalho. Cruz et al.

(2010) também relataram pHs próximos aos deste estudo para frutos

íntegros armazenados sob condições ambientais. Bhat et al. (2011) não

verificaram alterações no pH de limão dourado após sonicação. Adekunte

et al. (2010) também não observaram modificações em suco de tomate

sonicado.

A acidez titulável (AT) diminuiu após a aplicação do US mostrando

um menor valor após sete dias, 0,22%. Esses resultados estão

condizentes com aqueles obervados para pH, quando o aumento induzido

pelo tratamento com US resultou na queda da acidez, que pode ser ainda

justificada pela grande redução no conteúdo de vitamina C (Figura 16B).

Todavia, morangos submetidos ao tratamento com US nas

mesmas condições utilizadas neste trabalho não apresentaram redução

na AT em relação ao controle (0,78%) (CAO et al., 2010). Bhat et al.

(2011) também não verificaram diferenças estatísticas na AT entre o

controle e as amostras de suco de limão dourado tratadas com 30 e 60

minutos de US. Portanto, a AT sofre influência do tratamento e também

da interação do mesmo com o fruto em questão.

Vilas Boas et al. (2004) encontraram valores semelhantes de AT

(0,23%) quando avaliaram mangas ‘Tommy Atkins’ MP e tratadas com

ácido ascórbico 1%, após seis dias de armazenamento. Já, Jeronimo et

41

al. (2007) relataram AT de 1,16% em mangas ‘Tommy Atkins’ inteiras

armazenadas por oito dias à 13 oC.

Tabela 3 – pH, acidez titulável (AT), sólidos solúveis (SS) e razão SS/AT

em mangas minimamente processadas, tratadas com US e armazenadas

por sete dias a 4 oC

Tratamento Tempo

(dias)

pH AT

(% ác.

cítrico)

SS

(oBrix)

SS/AT

Controle 0 4,27 Aa 0,33 Aa 12,99 Aa 39,36 Aa

US 0 4,34 Ba 0,26 Ba 9,18 Ba 35,30 Ba

Controle 7 4,32 Aa 0,32 Aa 12,71 Aa 39,71 Aa

US 7 4,34 Ba 0,22 Bb 10,24 Bb 46,54 Bb

* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,

respectivamente. Letras iguais na mesma coluna não diferem entre si estatisticamente ao nível de

5% de significância pelo Teste de Tukey.

De acordo com Chitarra e Chitarra (2005), a acidez em produtos

hortícolas é atribuída principalmente aos ácidos orgânicos dissolvidos nos

vacúolos das células, tanto na forma livre como combinados. O conteúdo

desses ácidos diminui com a maturação, em decorrência do seu uso

como substrato no processo respiratório ou na conversão em açúcares. O

processamento também pode afetar estes valores e isto justificaria ou

influenciaria parte da redução nos valores de AT.

Apesar de valores ligeiramente maiores de pH (Tabela 3), a AT das

amostras sonicadas diminuiu, provavelmente devido a prevalência de

ácidos orgânicos ligados à outras moléculas, o que pode ser sustentado

pela redução no teor de sólidos solúveis (SS) ou então, pela absorção de

água pelos tecidos durante o tratamento com US.

Os valores de SS diminuíram significativamente após o tratamento

com US, contudo, após sete dias de armazenamento, apenas as

amostras sonicadas apresentaram valores maiores (10,24 oBrix) do que

no dia do tratamento (9,18 oBrix).

42

Os resultados aqui mostrados contradizem os encontrados por Cao

et al. (2010) e Adekunte et al. (2010) que não observaram diferença

significativa em morangos e em suco de tomate tratados com US,

respectivamente. Porém, corroboram com os resultados de Oliveira et al.

(2010), que observaram a perda destes sólidos ao avaliarem o US como

pré–tratamento na desidratação de jambo.

Durante o amadurecimento, uma das principais modificações

característica dos frutos é o acúmulo de açúcares com simultânea

redução da acidez, conferindo uma maior qualidade sensorial ao produto

(CHITARRA; CHITARRA, 2005). A relação SS/AT não sofreu variações

significativas nas amostras controle com o armazenamento. Todavia, o

tratamento interferiu nas variáveis que compõem tal relação, acarretando

na diminuição da mesma, contudo, após os 7 dias a 4 oC, o ratio SS/AT

foi superior (Figura 3).

O US reduziu significativamente (aproximadamente 15%) o

conteúdo dos açúcares totais de modo que no dia zero, o controle tinha

215,65 g/kg de açúcar total e após o tratamento, esse valor caiu para

185,37 g/kg (Figura 12A). O principal decréscimo foi observado no final do

armazenamento dos frutos tratados que apresentaram 160,02 g/kg,

contudo, foram mantidas as mesmas diferenças em relação ao tempo

zero, pois a baixa temperatura e a embalagem coberta com PVC

reduziram a perda de água.

Gonzales–Aguilar et al. (2001) encontraram valores superiores de

açúcares para mangas ‘Tommy Atkins’ após tratamento com UV–C por

20 minutos e armazenamento por 14 dias a 5 oC mais sete dias a 20 oC

(de 55,26 para 73,53 mg sacarose/g MF).

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Período de armazenamento (dias)

Controle

US

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Ba Aa

Bb

B

* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,

respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de

significância pelo Teste de Tukey.

Figura 12 – Conteúdo de açúcares totais (A) e de açúcares redutores (B)

em mangas minimamente processadas, tratadas com US e armazenadas

por sete dias a 4 oC

A Figura 12B mostra que grande parte dos açúcares presentes

eram redutores, com o maior valor (203,36 g/kg) encontrado para o

controle no tempo zero. Esses resultados apresentaram o mesmo

comportamento que o observado para os açúcares totais (Figura 12A),

sendo influenciado negativamente pelo US e pelo armazenamento, isto é,

diminuindo com ambos.

44

A perda de açúcares após tratamento com US já foi confirmada por

diversos autores em frutos como banana, melão, jambo e morango

(FERNANDES; RODRIGUES, 2007; FERNANDES; GALLÃO;

RODRIGUES, 2008; OLIVEIRA et al., 2010; GARCIA–NOGUERA et al.,

2010). O US atua sobre os tecidos de forma semelhante a uma esponja,

comprimido–os repetidamente. De acordo com Rodrigues et al. (2009) o

“efeito esponja” (compressão e expansão) pode ser responsável pela

expulsão de pequenas moléculas solúveis, como glicose e frutose

(açúcares redutores) devido ao seus tamanhos e porosidade do fruto.

A cor é uma característica fundamental por ser um fator de

atratividade e exercer influência direta sobre a escolha do consumidor

(Tabela 4). A luminosidade (L) diminuiu com o tempo de armazenamento

de forma significativa, porém, só foi influenciada pelo US após sete dias a

4 oC, atingindo 67,98. O croma (C) apresentou o mesmo comportamento

que a luminosidade, atingindo 66,91. No momento da aplicação do US, a

cor teve um leve aumento como pode ser observado através da variação

do ângulo hue de 82,78 para 83,12 (∆H = –0,34), porém, após os sete

dias, os valores decaíram tanto para o controle como para as amostras

tratadas.

Tabela 4 – Parâmetros de cor em mangas minimamente processadas,

tratadas com US e armazenadas por sete dias a 4 oC

Tratamento Tempo (dias) L C ohue

Controle 0 75,33 Aa 74,56 Aa 82,78 Aa

US 0 75,25 Aa 74,25 Aa 83,12 Ba

Controle 7 71,22 Ab 71,33 Ab 81,31 Ab

US 7 67,98 Bb 66,91 Ab 80,79 Bb

* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,

respectivamente. Letras iguais na mesma coluna não diferem entre si estatisticamente ao nível de

5% de significância pelo Teste de Tukey.

Em relação ao armazenamento, houve perda de cor, luminosidade

(∆L = 3,24) e de cromaticidade (∆C = 4,42), indicando um escurecimento

que está provavelmente associado à ruptura de células, introdução de

45

água, perda de açúcares, de vitamina C (Figura 16B) e de pigmentos

responsáveis pela coloração característica da manga.

Donadon et al. (2003) também observaram, em manga ‘Parvin’ MP,

uma evolução gradativa de amarelo escuro para amarelo alaranjado no

decorrer do tempo de armazenamento e redução nos valores de L com o

tempo. E esta redução geralmente acontece, tal como já foi descrito para

mangas MP de diversas cultivares: Tommy Atkins, Ataulfo, Kent e Keitt

(RATTANAPANONE et al., 2001; GONZÁLEZ–AGUILAR et al., 2008;

DJIOUA et al., 2009). Todavia, Tiwari et al. (2008) relataram que o uso do

US afetou muito pouco (pequena redução) a cor e os conteúdos de ácido

ascórbico e antocianinas após o processamento do suco de morango.

Segundo Chidtragool et al. (2011) o escurecimento da polpa de

mangas não foi correlacionado com atividade enzimática da principal

enzima da rota dos fenólicos, a PAL. Porém, as enzimas tradicionalmente

responsáveis pelo escurecimento como a G–POD e PPO, podem estar

relacionadas a esse efeito após o armazenamento das amostras. A

degradação da cor após sonicação pode ser atribuída ainda à reações de

oxidação que ocorrem como resultado da interação com os radicais livres

gerados durante o tratamento (MASON, 1991).

A propriedade mecânica mais relevante de frutos que se

correlaciona com US é a firmeza. É uma característica muito importante,

que reflete as alterações no tecido durante a maturação e o

armazenamento. Assim, a firmeza é, geralmente, associada com o

amadurecimento, frescor, retenção de boa qualidade e, portanto, com a

viabilidade comercial (MIZRACH, 2008).

A firmeza dos frutos processados decaiu com o período de

armazenamento, porém, apenas após o armazenamento, é que as

mangas tratadas com US apresentaram diferença significativa na firmeza

em relação ao controle, 139,34 e 359,33 N, respectivamente (Figura 13).

Após a sonicação, as amostras perderam água e sólidos e isso

pode ter contribuído grandemente para a redução destes valores, bem

como afetado a porosidade do fruto (Figura 20A e B). Então, percebe–se

que o tratamento não foi eficiente na manutenção da firmeza das mangas.

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Período de armazenamento (dias)

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* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,

respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de

significância pelo Teste de Tukey.

Figura 13 – Firmeza em mangas minimamente processadas, tratadas com

US e armazenadas por sete dias a 4 oC.

Cao et al. (2010) ao contrário dos resultados aqui expressos,

concluíram que a firmeza em morangos sonicados não foi alterada,

todavia, também diminuiu com o armazenamento. Após tratamento

ultrassônico em abacaxi, Fernandes, Gallão e Rodrigues (2009),

observaram que as células tornaram–se mais distorcidas e que canais

microscópicos foram formados por causa da perda de adesão celular que

produziu espaços intercelulares, diferente do que foi observado em

melões pelos mesmos autores (2008), onde os canais microscópicos

foram formados por achatamento e alongamento das células. Portanto, as

mudanças vão depender do tipo de fruto.

A degradação dos tecidos acontece normalmente com o avanço

da maturação e a diminuição na firmeza está diretamente associada a

estes eventos oriundos do metabolismo dos tecidos, incluindo as

modificações nos polissacarídeos da parede celular, bem como a

deterioração enzimática da mesma.

A firmeza também sofre influência do corte ou processamento de

um produto hortícola, pois este causa a descompartimentalização celular,

47

expõe o interior do produto e aumenta a taxa de evaporação da água,

promovendo também o extravazamento do suco celular que se concentra

na superfície. Isso promove a formação de uma solução hipertônica que

favorece a perda de água a partir das células intactas (JACOMINO et

al.,2004).

Os resultados mostraram que após o tratamento com US houve

uma perda de água negativa, significando aumento de água nas amostras

(4,6%) e consequentemente de umidade (de 6,80 para 7,27 em base

seca), porém a perda de sólidos foi de 24,38%. E essa perda está

condizente com os resultados apresentados para conteúdo de SS (Tabela

3), porém, podem ser associados aos encontrados para os açúcares

(Figura 12A e B), bem como para o ganho de água.

Os efeitos mecânicos do ultrassom proporcionam uma maior

penetração do solvente em materiais celulares e melhoram a

transferência de massa (MASON, 1996). Assim, as mudanças podem ser

explicadas pelo efeito de compressão e expansão que o US causa nos

tecidos e pela diferença de concentração entre o fruto e o meio no qual

ele foi imerso (água destilada) resultando na transferência de sólidos da

manga para o meio externo, bem como de absorção de água pelo fruto.

Pois, em um meio líquido, a sonicação provoca a cavitação que consiste

na formação de bolhas que podem entrar em colapso e explodir gerando

uma pressão localizada, além de produzir microjatos na superfície do

alimento que podem introduzir o líquido para o interior do sólido e

aumentar a transferência de massa em ambas as direções (MASON et al.,

2005; SHAMAEI; EMAM–DJOMEH; MOINI, 2011).

Fernandes e Rodrigues (2007) e Azoubel et al. (2010) também

observaram comportamento semelhante em bananas tratadas com US,

que perderam sólidos 21,3% e 2,4%, respectivamente. Já Fernandes,

Gallão e Rodrigues (2009) observaram perda de açúcar (23,2%) e de

água (3,1%) em amostras de abacaxi sonicadas. De um ponto de vista

geral, todos os efeitos produzidos por US podem influenciar fenômenos

de transferência de massa. Nos tratamentos com um sólido imerso em um

fluido, o US pode acelerar o transporte interno fazendo entrar ou sair

48

fluidos na matriz sólida, facilitando também as trocas entre a superfície

sólida e o fluido circundante (CÁRCEL et al., 2012).

4.2 Avaliação de componentes do metabolismo oxidativo

A peroxidação lipídica ou lipoperoxidação (LPO) pode ser

entendida como um conjunto de eventos bioquímicos que resultam da

ação dos RL ou EROs sobre os lipídios insaturados levando a destruição

das membranas celulares (BENZIE, 2006).

O grau de LPO das mangas processadas foi significativamente

reduzido pelo US, mas não com o armazenamento (Figura 14A). No

tempo zero, os frutos controle apresentaram 23,58 ηmol MDA/g MF,

enquanto os tratados apresentaram 18,00 ηmol MDA/g MF. Esses valores

não podem ser associados com os resultados para firmeza (Figura 13),

pois apesar da redução observada para os frutos tratados com US, estes

não estavam mais firmes que os controles. Esse resultado mostra que

para a manga, outros fatores como a composição da parede celular

contribuem fortemente para a estruturação e firmeza dos tecidos, além da

integridade da membrana plasmática.

Diferentemente, o grau de LPO aumentou (de aproximadamente

34 para 45 ηmol MDA/g MF) imediatamente quando mangas ‘Keitt’ MP

foram tratadas termicamente a 46 oC por 30 minutos (DJIOUA et al.,

2009). Neste caso o tratamento térmico desnatura as proteínas da

membrana, levando ao acréscimo da LPO e apesar de ter um efeito

diferente do US é utilizado comumente para tratar MP.

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* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,

respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de

significância pelo Teste de Tukey.

Figura 14 – Peroxidação lipídica (A) e conteúdo de peróxido de hidrogênio

(B) em mangas minimamente processadas, tratadas com US e

armazenadas por sete dias a 4 oC

Ding et al. (2007) ao avaliarem mangas cv. Zill íntegras tratadas

com ácido oxálico encontraram valores iniciais de 0,0014 µmol MDA/g

MF, e após dez dias de armazenamento a 5 oC, estes valores subiram

para 0,0022 µmol MDA/g MF, mostrando também que o tratamento não

foi satisfatório para redução deste parâmetro. Todavia, Wang et al. (2008)

relataram uma redução (19,6%) na LPO em manga íntegras 'Tainong'

50

tratadas com 2,4–diclorofenoxiacético após sete dias de armazenamento

a 4 oC.

O H2O2 é uma ERO utilizada como sinalizador ou indicador de

estresse oxidativo. Os níveis de H2O2 não foram afetados pelo US, mas

sim pelo armazenamento, de modo que após sete dias, os frutos controle

tinham 0,0318 e os tratados 0,0271 µmol/g MF (Figura 14B). Ding et al.

(2007) avaliando ainda, o conteúdo de H2O2, encontraram valores de 1,5

µmol/g MF em mangas ‘Zill’ sem tratamento armazenadas a 5 oC.

Os resultados aqui demonstrados indicam que a sonicação não

induziu a danos oxidativos causados pelo H2O2 e, além disso, ao se

relacionar esses resultados com os de LPO (Figura 14A) observa–se que

outra ERO, que não o H2O2, pode ser responsável pela maior peroxidação

das mangas não tratadas.

Corroborando com essa ideia, outro estudo mostra que a sonólise

da água (cisão das ligações H–O) provocada por ondas ultrassônicas

implica na produção direta de outros radicais que não o H2O2, como H● e

HO● (KORN; ANDRADE; BORGES, 2003).

4.3 Antioxidantes não enzimáticos e capacidade antioxidante total

Apesar da manga ter um baixo conteúdo de antocianinas, o

objetivo foi observar o efeito do tratamento sobre esse composto (Figura

15A). O tratamento com US reduziu o conteúdo de antocianinas apenas

no tempo zero (4,15 mg/kg MF), o qual se manteve constante com o

armazenamento. Porém, os frutos controle apresentaram um decréscimo

após os sete dias a 4 oC (de 6,20 para 5,30 mg/kg MF).

Tiwari et al. (2009) verificaram que antocianinas de suco de

morango não foram degradadas após sonicação, no entanto, Tiwari et al.

(2010) verificaram alta retenção de antocianinas em suco de uva sonicado

quando comparado ao de morango (TIWARI et al., 2008) e ao de amora

(TIWARI; O’DONNELL; CULLEN, 2009).

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Controle

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C

* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,

respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de

significância pelo Teste de Tukey.

Figura 15 – Conteúdo de antocianinas (A), de flavonoides amarelos (B) e

de polifenóis extraíveis totais (C) em mangas minimamente processadas,

tratadas com US e armazenadas por sete dias a 4 oC

52

Os flavonoides amarelos, juntamente com os carotenoides

contribuem grandemente para a coloração amarela das mangas.

O conteúdo de flavonoides amarelos (14,44 mg/kg MF) diminuiu

significativamente após o tratamento com US para 11,58 mg/kg MF, mas

apresentou um aumento durante o armazenamento para 13,23 mg/kg MF,

apesar de não diferir do controle (13,53 mg/kg MF) (Figura 15B). Esse

aumento pode estar ligado à atividade da PAL (Figura 19) que atua no

metabolismo secundário tendo os compostos fenólicos como seu produto

final.

Ashokkumar et al. (2008) relataram que a atividade antioxidante

dos componentes, tais como os flavonoides, pode aumentar por causa do

incremento no grau de hidroxilação das moléculas, devido aos radicais

HO● formados no processo de sonicação. Bhat et al. (2011) verificaram

um aumento nos flavonoides totais em suco de limão dourado após

tratamento com US por 30 e 60 minutos.

Os valores de polifenóis totais não diferiram com o tratamento,

porém, com o tempo, aumentando de 260,15 para 304,71 mg EAG/kg MF

no caso do controle e de 250,93 para 299,81 mg EAG/kg MF no US

(Figura 15C). Esse aumento, assim como o de flavonoides pode ter

relação com a PAL (Figura 19). Também há o fato de haver a

descompartimentalização celular com o corte, que coloca em contato a

enzima com seus substratos que estavam espacialmente separados,

favorecendo sua atividade. E pode justificar ainda, o escurecimento

avaliado na Tabela 1, onde os valores de L e C diminuíram com o

armazenamento, uma vez que esses compostos são substratos para as

enzimas responsáveis por deteriorações na cor. De acordo com estudo

realizado por Azevedo (2006) o fenólico mais abundante na manga foi a

epicatequina (27,26 mg/g MF).

Já, Bhat et al. (2011) observaram diferenças significativas entre as

amostras tratadas com US (272 mg EAG/g MF) e o controle (263,08 mg

EAG/g MF) no suco de limão dourado, assim como, Sales e Ressurrecion

(2010) que noticiaram um aumento nos fenólicos após tratamento de

53

amendoim com US. Pois, segundo Ashokkumar et al. (2008), a adição de

grupos HO● gerados sonoquimicamente ao anel aromático destes

compostos gera um aumento nas formas extraíveis, além da ruptura das

células que também poderia provocar a liberação dos mesmos. Porém,

Fonteles et al. (2012) verificaram uma redução nos fenólicos do suco de

melão após a aplicação de US e concluíram que o efeito do US depende

das condições de processamento da matriz alimentar.

A violaxantina é o carotenoide mais encontrado na manga ‘Tommy

Atkins’ (RODRIGUES–AMAYA; KIMURA; AMAYA–FARFAN, 2008).

Ocorre um decréscimo do teor de carotenoides com o amadurecimento

(MEDINA et al. 1981), porém, os mesmos não foram afetados pelo US e

nem pelo armazenamento com valor médio de 11,06 mg/kg MF (Figura

16A). A manutenção dos carotenoides pode ser explicada pelo fato de

serem lipofílicos e, portanto, não serem eliminados por lixiviação com o

tratamento.

Os resultados observados para flavonoides e carotenoides não

podem ser individualmente relacionados aos de luminosidade e

cromaticidade (L, C, Tabela 4) que mostram uma queda significativa no

brilho, bem como um aumento no desgaste da cor amarela, após o

armazenamento, gerando um escurecimento nos frutos tratados.

Neste trabalho, houve diferença significativa entre os frutos

controle e os tratados em relação ao conteúdo de vitamina C (Figura

14B). O US promoveu um decréscimo para 190,18 mg/kg MF que se

manteve durante o armazenamento. Segundo Chitarra (1998), o ácido

ascórbico pode ser oxidado por uma série de mecanismos bioquímicos

que são responsáveis pela perda de sua atividade vitamínica e também

pela formação de pigmentos escuros, além de diminuir com o

amadurecimento (MEDINA et al., 1981). Diferentes enzimas podem

catalisar a sua degradação direta ou indiretamente, como o aumento na

atividade da APX (Figura 17A).

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* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,

respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de

significância pelo Teste de Tukey.

Figura 16 – Conteúdo de carotenoides (A), de vitamina C (B) e atividade

antioxidante total (C) em mangas minimamente processadas, tratadas

com US e armazenadas por sete dias a 4 oC

55

O decréscimo ocasionado pelo US pode ser explicado pelo fato do

tratamento degradar diretamente a estrutura da vitamina, ou liberá–la por

lixiviação junto aos sólidos perdidos, assim como ocasionar um aumento

na produção de EROs que seriam neutralizados por essa vitamina,

levando a uma redução em seu conteúdo. Então, os radicais HO●

produzidos pela cavitação podem degradar o ácido ascórbico ou ainda

isso pode resultar de termólise ou combustão associada à bolha de

cavitação (FERNANDES; RODRIGUES, 2012).

Quando se comparou o conteúdo de vitamina C em tomate tratado

termicamente e ultrassonicamente, concluiu–se que com o US houve um

maior nível retido do que com o calor (ERCAN; SOYSAL, 2011). Um

trabalho mostrou que os níveis de ácido ascórbico aumentaram após

tratamento de suco de goiaba com US de 110 para 119 mg/100mL

(CHENG et al., 2007). Já, Cao et al. (2010) não observaram diferenças

significativas no conteúdo desta vitamina em morangos tratados e não

tratados com US (média de 83,26 mg/100 g).

A capacidade ou atividade antioxidante total (AAT) das mangas

processadas não sofreu influência do tratamento com US ou do

armazenamento com 0,64 trolox/kg para os frutos controle, no tempo zero

(Figura 16C).

Ao contrário do que foi encontrado aqui, um aumento na AAT (de

577,2 para 665,9 mg equivalente de ácido ascórbico/g MF) de suco de

limão foi observado após sonicação (Bhat et al., 2011). Sogi et al. (2012)

também noticiaram um aumento na AAT (de 261,5 μM trolox/100g MF,

para 338.0 to 416,4 μM trolox/100g MF) após tratamento de mangas

‘Tommy Atkins’ MP com infravermelho.

56

4.4 Enzimas antioxidantes

O tratamento com US influenciou significativamente a atividade da

peroxidase do ascorbato (APX, Figura 17A) apenas no tempo zero

aumentando para 0,029 µmol H2O2/min/mg P, em relação ao controle.

Após o período de armazenamento, houve uma redução significativa,

porém, sem diferença entre os tratamentos (controle, 0,027 µmol

H2O2/min/mg P).

O incremento na atividade da APX (Figura 17A) no início do

experimento pode ser associado à queda nos níveis de vitamina C total

(Figura 16B), pois implica no maior gasto dessa vitamina como doadora

de elétrons na reação catalisada pela enzima, todavia, essa relação não

se mantém após o armazenamento.

O aumento observado logo após a sonicação pode ser explicado

pela formação das bolhas de cavitação, que de acordo com Mason

(1998), resultam em uma força de cisalhamento que pode alterar a

conformação das proteínas. Já ao ser relacionado com o conteúdo de

H2O2 (Figura 14B), a maior atividade da APX após o armazenamento

pode explicar a redução nessa ERO, então.

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Período de armazenamento (dias)

Controle

US

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Aa

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C

* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,

respectivamente. Letras iguais na mesma coluna não diferem entre si estatisticamente ao nível

de 5% de significância pelo Teste de Tukey.

Figura 17 – Atividade das enzimas antioxidantes APX (A), CAT (B) e SOD

(C) em mangas minimamente processadas, tratadas com US e

armazenadas por sete dias a 4 oC

58

Fonteles et al. (2012) obtiveram resultados de completa inativação

e de atividade residual inferior a 52% da APX em suco de melão tratado

com US a 19 kHz. Quando peras foram sonicadas a 40 kHz a atividade da

APX foi de 11,79 contra 10,36 UAE/mg P para o controle (Yang et al.,

2012).

Quanto à catalase (CAT, Figura 17B) nas mangas processadas, o

tratamento com US não induziu nenhuma mudança significativa, diferente

do período de armazenamento que aumentou a atividade do controle para

377 µmol H2O2/min/mg P. A CAT aparentemente foi a mais importante na

remoção de H2O2 em mangas, pois sua ação foi maior do que a da APX

(Figura 17A) e ainda, parece estar mais claramente associada ao

conteúdo de H2O2 (Figura 14B), sendo influenciado pelo armazenamento,

mas sem diferença entre os tratamentos.

A atividade da SOD não sofreu modificações significativas com o

tratamento nem com o tempo (Figura 17C) apresentando um valor médio

de 17,93 UAE/mg P. Esse resultado denota uma estabilidade da enzima e

denota a sua importância para o metabolismo antioxidante desse fruto.

A atividade da CAT e da SOD, quando avaliadas por Yang et al.

(2012) em peras, demonstraram um comportamento de decréscimo após

sonicaçao: 32,94 para 31,03 UAE/mg P e 84,52 para 74,34 UAE/mg P,

respectivamente. Ding et al. (2007) observaram que a atividade da APX,

CAT e SOD em mangas íntegras cv. Zill aumentou após armazenamento

a 5 oC.

Em relação ao metabolismo antioxidante das mangas processadas,

o US exerceu um efeito inicial que foi revertido com o tempo de

armazenamento nas variáveis conteúdo de antocianinas e flavonoides e

na atividade da APX. Já, quanto a LPO e o conteúdo de vitamina C, o

efeito de redução perdurou durante o armazenamento, enquanto as

atividades das enzimas SOD e CAT não foram sequer influenciadas por

esse tratamento.

O principal efeito observado, de redução na LPO e no conteúdo de

vitamina C pode ser interpretado diferentemente, pois a menor

59

peroxidação poderia ter induzido a maior integridade dos tecidos, porém,

isso não foi observado na avaliação da firmeza, enquanto que a redução

do conteúdo de vitamina C diminui a qualidade desse produto, apesar da

manga não ser um fruto caracteristicamente rico nessa vitamina.

4.5 Enzimas responsáveis pelo escurecimento

A sonicação diminuiu estatisticamente a atividade da G–POD

apenas no tempo zero para 0,0046 μmol H2O2/min/mg P, porém, esse

efeito foi perdido com o armazenamento, de modo que após os sete dias,

ambos os tratamentos diferiram estatisticamente do tempo zero, atingindo

0,0057 μmol H2O2/min/mg P (Figura 18A). Esses resultados estão em

concordância com os dados apresentados para L e C (Tabela 4)

indicando que a atividade da POD induziu o escurecimento dos frutos

após armazenamento.

O processamento ou corte, por si só, permite que enzimas

envolvidas nas reações de escurecimento, como PODs e a PPO, sejam

unidas com seus substratos, os quais muitas vezes estão em

compartimentos celulares distintos (JACOMINO et al., 2004). Além da cor,

pois oxida o guaiacol para reduzir o H2O2 transformando o primeiro em um

produto colorido, a atividade da G–POD contribui para alterações

deteriorantes no aroma, sabor, textura e valor nutricional de alimentos

frescos ou armazenados (ARAÚJO, 2004).

Fonteles et al. (2012) observaram que a atividade da G–POD

dependia do tempo de processamento com US devido ao rompimento

celular da polpa do fruto, sendo a enzima intracelular liberada no meio,

ocasionando o aumento da sua atividade. Ou seja, para tempos de

exposição baixos, a taxa de liberação da enzima é mais elevada do que

sua taxa de desnaturação, sendo o contrário verdadeiro. Ndiaye, Xu e

Wang (2009) demonstraram inativação completa da G–POD em fatias de

manga quando o branqueamento a vapor foi aplicado por 5 minutos,

porém, também observaram um alto índice de escurecimento.

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Controle

US

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B

* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,

respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de

significância pelo Teste de Tukey.

Figura 18 – Atividade das enzimas responsáveis pelo escurecimento G–

POD (A) e PPO (B) em mangas minimamente processadas, tratadas com

US e armazenadas por sete dias a 4 oC

As PPOs são enzimas intracelulares (GOMES et al., 2001) que

atuam sobre compostos fenólicos causando, na presença de O2, a

oxidação dos mesmos resultando em quinonas (CHITARRA, CHITARRA,

2005).

Não foram observadas diferenças significativas na atividade da

polifenol oxidase (PPO, Figura 18B) entre os tratamentos e nem durante o

61

tempo de armazenamento, com valores médios de 0,13 UAE/min/mg P.

Esse resultado demonstra que a sonicação não foi capaz de inativar em

qualquer nível essa enzima, todavia, a sua atividade também não pôde

ser relacionada com os parâmetros de cor (Tabela 4), o que indica que a

G–POD (Figura 18A) é então, a principal enzima envolvida com

escurecimento na manga.

A não eficácia do US aqui observada na inativação desta enzima

na manga pode estar relacionada a potência utilizada que foi de 150

W/cm2. Quando a atividade de PPO em suco de melão sonicado foi

analisada sob diferentes intensidades de tratamento, observou–se que a

melhor condição para redução da mesma foi a de 10 minutos de

tratamento a 376 W/cm2 (FONTELES et al., 2012). Um experimento com

maçãs MP tratadas com US mostrou que a atividade monofenolásica da

PPO foi inibida enquanto a difenolásica foi estimulada (JANG; MOON,

2011). Contudo, a atividade desta enzima aumentou em sucos de goiaba

sonicados (CHENG et al., 2007).

4.6 Enzima marcadora de estresse

A atividade da fenilalanina amônia liase (PAL) aumentou

significativamente com a sonicação para 19,52 µmol ác. trans–

cinâmico/h/mg P (Figura 19). Com o armazenamento, a atividade

continuou aumentando sem diferença entre os tratamentos, com valores

de 24,06 µmol ác. trans–cinâmico/h/mg P para o controle.

A PAL catalisa a desaminação da fenilalanina com produção de

ácido trans–cinâmico, sendo essa reação importante na formação dos

compostos fenólicos e sua atividade foi relacionada a condições adversas

(SREELAKSHMI; SHARMA, 2008). Portanto, o acréscimo inicial

observado para a atividade da PAL denota uma situação de estresse

induzido pelo tratamento com US, todavia, não refletiu em aumento nas

antocianinas ou flavonoides (Figura 15A e B), porém, pode estar ligado ao

maior conteúdo de fenólicos com o tempo.

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* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,

respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de

significância pelo Teste de Tukey.

Figura 19 – Atividade da enzima fenilalanina amônia liase (PAL) em

mangas minimamente processadas, tratadas com US e armazenadas por

sete dias a 4 oC

Segundo Chidtragool et al. (2011) a atividade da PAL na casca de

manga foi muito mais elevada que na polpa e isso se correlacionou com o

nível mais alto de compostos fenólicos na casca.

4.7 Enzimas hidrolíticas da parede celular vegetal

A atividade da enzima PME (Figura 20A) sofreu influência do

tempo de armazenamento e do US apenas após os sete dias a 4 oC

atingindo 185.597,27 UAE/min/mg P, sendo mais que o dobro da

atividade do controle no mesmo tempo, 75.708,98 UAE/min/mg P. Esses

resultados podem ser associados aos apresentados para a firmeza

(Figura 13), os quais decaíram fortemente após o armazenamento dos

frutos tratados, de 241,73 para 139,38 N, sugerindo que o amaciamento

da polpa da manga está mais relacionado com a degradação da parede

63

celular do que da membrana plasmática, segundo o grau de peroxidação

lipídica (Figura 14A).

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Período de armazenamento (dias)

Controle

US

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Ba

B

* Letras maiúsculas e minúsculas representam o tratamento e o período de armazenamento,

respectivamente. Letras iguais não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de

significância pelo Teste de Tukey.

Figura 20 – Atividade das enzimas PME (A) e PG (B) em mangas

minimamente processadas, tratadas com US e armazenadas por sete

dias a 4 oC

As substâncias pécticas constituem o grupo de polissacarídeos da

parede celular vegetal mais modificado durante o amadurecimento de

alguns frutos, com o aumento da sua solubilização e despolimerização

64

associados ao amaciamento (OLIVEIRA et al., 2006). Todavia, segundo

Tucker (1993), é improvável que uma única enzima seja responsável por

mudanças na firmeza, pois o processo deve envolver uma interação

complexa de enzimas amilásicas, pécticas e galactosidásicas.

Quando Terefe et al. (2009) avaliaram o efeito da temperatura e da

sonicação na inativação da PME em suco de tomate, observaram que o

aquecimento do suco a 50 oC não foi efetivo, porém, quando aplicado em

combinação com o US causou uma redução significativa na atividade

enzimática. Raviyan, Zhang e Feng (2005) também observaram efeito

sinergístico entre altas temperaturas e US na inativação de PME de

tomate.

Ao catalisar a desmetilação da cadeia de pectina, a PME permite

que a PG possa hidrolisar as ligações glicosídicas liberando os resíduos

de ácido galacturônico. Diferente da PME (Figura 20A), a atividade da PG

(Figura 20B) foi estimulada pelo tratamento com US no tempo zero para

59.708,09 nmol AR/min/mg e se manteve após o armazenamento, no

entanto, não sofreu modificação com o tempo e isso pode ter relação com

a atmosfera modificada criada pela embalagem.

Esse resultado corrobora com aqueles apresentados para PME e

firmeza (Figura 13) indicando que o tratamento com US não foi

interessante do ponto de vista da manutenção da firmeza das mangas

minimamente processadas. Terefe et al. (2009) também avaliaram a

inativação da PG e seus resultados mostraram que o aquecimento do

suco de tomate entre 50 e 75 oC seguido de sonicação ocasionou a

inativação da PG.

65

5 CONCLUSÃO

Através deste estudo, foi verificado que o tratamento com US em

mangas ‘Tommy Atkins’ MP afetou negativamente parâmetros de

qualidade importantes como a firmeza e a cor, justificados principalmente

pelo aumento na atividade da PME e degradação de vitamina C.

Como os frutos MP são produtos que serão armazenados deve–se,

fazer uma avaliação levando em maior consideração o tempo de

armazenamento. E, em detrimento a outros métodos de conservação, a

sonicação não provocou a formação de H2O2, bem como não afetou

drasticamente os sistemas antioxidante enzimático e não enzimático.

Concluiu–se ainda, que a manga MP também responde ao

tratamento perdendo açúcar, o que tem duas vertentes de análise

distintas: perda de sabor ou abrangência de público mais específico para

este tipo de produto.

Nessas condições, a sonicação, sozinha, não seria interessante

para a manutenção da qualidade das mangas MP. Porém, modificações

nas condições apresentadas, tais como combinação com calor, agentes

anti escurecimento, uso de atmosfera modificada, dentre outros, poderiam

minimizar os efeitos negativos e destacar os benefícios ocasionados pelo

US.

Não obstante, vê–se claramente a necessidade de maiores

estudos no setor da pós–colheita, em especial com frutos MP, tendo em

vista suprir a demanda por produtos de maior qualidade, considerando

ainda, que o US tem grande potencial de utilização neste sentido.

66

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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