De differentiële effecten van androgenen en oestrogenen op ......II. Abstract Doelstelling: in deze...

Universiteit Gent

Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen

Opleiding Lichamelijke Opvoeding en Bewegingswetenschappen

Academiejaar 2012-2013

De differentiële effecten van androgenen en oestrogenen

op de hypertrofie en atrofie signaalwegen in de

mannelijke skeletspier

Masterproef voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Lichamelijke

Opvoeding en de Bewegingswetenschappen.

Door: Lauren Pringels

Promotor: Prof. Dr. Derave Wim

Begeleider: De Naeyer Hélène

I. Voorwoord Beste lezer,

het is niet zonder trots dat ik u deze scriptie, als finaal punt van mijn studies Sport-en

bewegingswetenschappen, presenteer. De keuze om een thesisonderwerp te vinden binnen het

vakgebied fysiologie was voor mij een uitgemaakte zaak. Mijn interesse in de structuur en

functies van de menselijke cel, spieren, organen en het skelet werden reeds aangewakkerd in

het middelbaar onderwijs. Deze interesse groeide nadien, dankzij mijn gekozen universitaire

studie, uit tot een fascinatie. Via verschillende vakken binnen de opleiding, zoals biochemie,

algemene fysiologie, inspanningsfysiologie en trainingsleer, kon ik mij immers verdiepen in

de complexe processen die zich afspelen binnen het menselijke lichaam. Het feit dat de

wetenschap nog steeds groeit en er bijgevolg meer mogelijkheden ontstaan om de nog

aanwezige ‘blinde vlekken’ in te vullen, is een grote motivatie voor mij. Ik was dan ook

verheugd dat ik deel kon uitmaken van een dierexperimenteel onderzoek dat kaderde in een

doctoraatstudie van Hélène de Naeyer. Deze studie was zeer spannend en leerrijk.

Bij deze wil ik Hélène uitdrukkelijk bedanken voor haar hulp, raad, geduld en tijd die ze in

mij heeft geïnvesteerd. Het enthousiasme dat ze uitstraalt i.v.m. deze toch wel moeilijke

materie, overtuigde mij telkens weer om verder nauwkeurig onderzoekswerk te doen. Het is

dan ook dankzij haar dat ik deze thesis heb kunnen volbrengen.

Tevens zou ik Prof. Dr. W. Derave willen bedanken voor zijn opbouwende kritiek en tevens

de vrijheid die hij mij bood bij het uitwerken van mijn thesis.

Tot slot wil ik mijn familie, van wie ik veel steun kreeg tijdens dit intense jaar, bedanken.

Mijn mama, papa, broer en zus bleven immers, ook tijdens de moeilijke momenten, in mij

geloven.

Dankjewel iedereen!

II. Abstract Doelstelling: in deze studie werd onderzoek verricht naar de mogelijke effecten van twee

geslachthormonen, namelijk testosteron en estradiol, op de hypertrofie en atrofie

signaalwegen in de skeletspier.

Methode: de studie omvat een dierexperimenteel onderzoek met 100 mannelijke C57BL/6

muizen die ad random onderverdeeld werden in één van de vier onderzoeksgroepen: de

controlegroep (SHAM), een groep die na orchidectomie niet behandeld werd met sex-

steroïden (ORX + V) en 2 groepen die na orchidectomie respectievelijk met testosteron en

estradiol behandeld werden (ORX + T, ORX + E). Na 1, 7 en 30 interventiedagen werden drie

verschillende spieren gedissecteerd, namelijk de m. Soleus (SOL), de m. Extensor Digitorum

longus (EDL) en het m. Levator Ani-Bulbocavernosus complex (LA/BC). Van deze spieren

werd vooraleerst de massa bepaald. Nadien werd de mRNA expressie onderzocht van de

ubiquitine ligases, Atrogin-1 en MuRF-1, en van Myostatine. Tevens werd in de EDL de

eiwitexpressie gemeten van MuRF-1 en Myostatine.

Resultaten: in het LA/BC complex veroorzaakte androgeen deprivatie, als gevolg van

orchidectomie, een progressief verlies van 56.7%. Hierbij was er een achtvoudige upregulatie

van Atrogin-1 en een viervoudige upregulatie van MuRF-1 mRNA expressie zichtbaar.

Testosteronsuppletie was in staat om zowel het gewichtsverlies, als de upregulatie van de

ubiquitine ligases te inhiberen. Estradiolsuppletie daarentegen vertoonde deze beschermende

effecten t.o.v. een spiermassa-afname niet, maar kon de upregulatie van het ubiquitine-

proteasoom systeem wel limiteren. De atrogenen in de snelle spiervezels van de EDL bleken,

als gevolg van een lagere androgeenreceptor expressie, minder responsief te zijn op

testosteron. De atrogenen in de SOL waren daarentegen gevoeliger voor androgenen, hetgeen

resulteerde in significante upregulaties van zowel MuRF-1, als Atrogin-1 na orchidectomie.

Op eiwitniveau waren er geen significante verschillen merkbaar in de expressie van het

Myostatine en MuRF-1 proteïne in de EDL.

Conclusie: het LA/BC complex vertoont zowel op spier- als op genniveau duidelijke

significante verschillen na orchidectomie. Estradiol- en testosteronsuppletie blijken deze

effecten respectievelijk te kunnen reduceren of volledig op te heffen waaruit gesuggereerd

kan worden dat beide sex-steroïden effectief de atrofiesignaalweg kunnen beïnvloeden door

een upregulatie van het ubiquitine-proteasoom systeem te induceren. Echter, aangezien de

upregulaties in genexpressies van de EDL of de SOL beperkt zijn en er tevens geen effecten

blijken te zijn op eiwitniveau in de EDL, kunnen voorgaande vaststellingen momenteel nog

niet veralgemeend worden voor de locomotorische spieren.

Inhoud

I. Voorwoord ..................................................................................................................................................... 2

II. Abstract .......................................................................................................................................................... 3

1. Literatuurstudie .............................................................................................................................................. 1

1.1 Inleiding ................................................................................................................................................. 1

1.2 Spieratrofie versus spierhypertrofie ....................................................................................................... 2

1.2.1 Oorzaken spieratrofie .................................................................................................................... 3

1.2.1.1 Pathologie ................................................................................................................................. 3

1.2.1.2 Sarcopenie ................................................................................................................................ 3

1.2.1.3 Disuse ....................................................................................................................................... 4

1.2.1.4 Genetische spierziekte .............................................................................................................. 5

1.2.1.5 Malnutritie ................................................................................................................................ 6

1.2.2 Huidige Therapieën ....................................................................................................................... 7

1.2.2.1 Fysieke activiteit ....................................................................................................................... 7

1.2.2.2 Gentherapie .............................................................................................................................. 8

1.2.2.3 Nutritie...................................................................................................................................... 8

1.2.2.4 Farmacologie ............................................................................................................................ 9

1.3 Testosteronsuppletie als farmacologische interventie.......................................................................... 10

1.3.1 Endogene productie van testosteron ........................................................................................... 10

1.3.2 Werking testosteron .................................................................................................................... 11

1.3.2.1 Nucleus ................................................................................................................................... 11

1.3.2.2 Cellulair .................................................................................................................................. 11

1.3.2.3 Somatische neveneffecten ...................................................................................................... 11

1.3.2.4 Ontwikkeling van SARM’s .................................................................................................... 12

1.4 Oestrogeensuppletie als farmacologische interventie .......................................................................... 13

1.5 Signaalpathways .................................................................................................................................. 14

1.5.1 Signaalweg spieratrofie ............................................................................................................... 14

1.5.2 Triggers spieratrofiesignaalweg .................................................................................................. 16

1.5.3 Signaalweg spierhypertrofie ....................................................................................................... 17

1.6 Link tussen beide pathways: IGF1-AKT-FoxO signaalweg ................................................................ 19

1.7 Werking van testosteron op de signaalwegen ...................................................................................... 20

2. Hypothese en onderzoeksdoel ...................................................................................................................... 21

3. Materialen en methode ................................................................................................................................. 22

3.1 Studie design ....................................................................................................................................... 22

3.2 Meetmethode ....................................................................................................................................... 23

3.2.1 Meting lichaamsgewicht en massa spierbiopten ......................................................................... 23

3.2.2 Genexpressie: q-PCR-analyse op spierbiopten ........................................................................... 23

3.2.2.1 RNA-isolatie ........................................................................................................................... 23

3.2.2.2 cDNA-synthese....................................................................................................................... 23

3.2.2.3 q-PCR ..................................................................................................................................... 24

3.2.2.4 Registratie Ct-waarde ............................................................................................................. 25

3.2.2.5 Primers.................................................................................................................................... 25

3.2.2.6 Smeltcurve .............................................................................................................................. 26

3.2.2.7 Referentiegenen ...................................................................................................................... 26

3.2.2.8 Delta-Delta Ct-methode .......................................................................................................... 26

3.2.3 Eiwitexpressie ............................................................................................................................. 27

3.2.3.1 Eiwitisolatie ............................................................................................................................ 27

3.2.3.2 Western blotting ..................................................................................................................... 27

3.2.4 Statistische analyse ..................................................................................................................... 28

4. Resultaten ..................................................................................................................................................... 29

4.1 Effecten van orchidectomie en testosteron- of estradiolsuppletie op zaadblaasjes, lichaamsgewicht en

spiermassa. ........................................................................................................................................................ 29

4.1.1 Zaadblaasjes ................................................................................................................................ 29

4.1.2 Lichaamsgewicht ........................................................................................................................ 30

4.1.3 Spiermassa .................................................................................................................................. 31

4.1.3.1 Massa m. Extensor digitorum longus ..................................................................................... 31

4.1.3.2 Massa m. Soleus ..................................................................................................................... 32

4.1.3.3 Massa m. Levator Ani –Bulbocavernosus complex ............................................................... 33

4.2 Effecten van orchidectomie en testosteron- of estradiolsuppletie op genexpressie atrofieregulators

Atrogin-1, MuRF1 en Myostatine .................................................................................................................... 34

4.2.1 Genexpressie in m. Extensor digitorum longus .......................................................................... 34

4.2.2 Genexpressie in m. Soleus ......................................................................................................... 35

4.2.3 Genexpressie in m. Levator Ani –Bulbocavernosus complex .................................................... 37

4.3 Effecten van orchidectomie en testosteron- of estradiolsuppletie op eiwitexpressie atrofieregulators

MuRF1 en Myostatine ...................................................................................................................................... 39

5. Conclusie en discussie .................................................................................................................................. 40

5.1 Overzicht van resultaten als leidraad voor discussie .......................................................................... 40

5.2 LA/BC vs. EDL en SOL als spiermodel .............................................................................................. 41

5.3 Invloed van testosteron op lichaamsgewicht en spiermassa ................................................................ 41

5.4 Spiervezel-specifieke effecten op testosteron- en estradiolsuppletie ................................................... 42

5.5 Invloed van de tijd op spiermassa en genexpressie atrogenen ............................................................. 44

5.6 Testosteron- vs. estradiolsuppletie ...................................................................................................... 45

5.7 Aandeel Myostatine, als inhibitor van eiwitsynthese, in atrofieproces ................................................ 46

5.8 Gestegen genexpressies correleren niet met stijging atrogeenproteïnen .............................................. 46

5.9 Besluit .................................................................................................................................................. 48

6. Referentielijst ............................................................................................................................................... 49

1

1. Literatuurstudie

1.1 Inleiding

Skeletspiermassa omvat ongeveer 40% van het totale lichaamsgewicht. Een adequate

hoeveelheid spiermassa is van cruciaal belang voor de gezondheid, aangezien deze

verschillende belangrijke functies vervult: locomotie, ademhaling, thermogenese en

bescherming van de interne organen. De regulatie van spiermassa is interessant voor diverse

groepen mensen. Zo zijn atleten en bodybuilders voornamelijk geïnteresseerd in een toename

van spiermassa, spierhypertrofie. Anderen zijn daarentegen bezorgd om het verlies van

spiermassa, spieratrofie. Dit kan het gevolg zijn van chronische katabole ziekten zoals kanker-

geïnduceerde cachexie, HIV en aids, of door het verouderen en kan leiden tot zwakte, verlies

van onafhankelijkheid en een stijging van het risico op sterfte (Glass, D. 2010).

Spiermassa is een zeer plastisch weefsel dat in staat is zich aan te passen, afstemmend op de

functionele eisen die opgelegd zijn aan de spier. Bij systematische toenemende belasting van

de spier zal er een stijging van de massa optreden, terwijl daarentegen door verminderd

spiergebruik, bij immobilisatie of een sedentaire levensstijl, er atrofie ontstaat van de spier.

Het spierverlies of -winst is afhankelijk van een proteïne turnover, een delicate balans tussen

de productie van myofibrillen en degradatie van bestaande proteïnen waarbij door stimulatie

of inhibitie van factoren het evenwicht verschoven kan worden. Deze stimulatie kan, naast

mechanische en metabole stimuli, ook verkregen worden door hormonale factoren.

Testosteron suppletie doet de spiermassa en -kracht toenemen door hypertrofie te induceren

van zowel type I als type II vezels en veroorzaakt tevens een stijging van het aantal myonuclei

en satellietcellen. Uit onderzoek is gebleken dat behandeling met testosteron kan dienen als

mogelijke therapeutische interventie bij patiënten met spieratrofie-gerelateerde aandoeningen.

De neveneffecten en het moeilijk bepalen van de juiste dosering vormen echter een

belemmering van zo’n behandeling. De onderliggende mechanismen van spieratrofie en

-hypertrofie, zijn echter nog niet volledig ontrafeld. Het doel van deze studie is om een beter

zicht te hebben op de moleculaire pathways die leiden tot een toename of afname van

spiermassa van zowel trage als snelle spiervezels in een castratie-geïnduceerd spieratrofie

model. Dit onderzoek zou nieuwe therapeutische targets kunnen bieden voor de behandeling

van spierverlies (Bhasin et al. 2006).

2

1.2 Spieratrofie versus spierhypertrofie Atrofie wordt beschreven als een daling van de celgrootte, voornamelijk veroorzaakt door een

daling van organellen, cytoplasma en proteïnen. Verschillende fenomenen kunnen hierbij

optreden op cellulair niveau: een verlies van myofibrillen door proteolyse, een afname van het

aantal myonuclei door necrose of apoptose, een daling van het aantal satellietcellen door

apoptose en tenslotte een daling van de regeneratiecapaciteit van de spier (Mitchell & Pavlath,

2004).

Spierhypertrofie wordt gedefinieerd als een toename in spiermassa, dat bij een volwassene

het resultaat is van een toename in omvang, in tegenstelling tot het aantal, van reeds bestaande

skeletspiervezels (Glass, D. 2005). De groei of daling van spiermassa hangt, net zoals alle

andere weefsels in het lichaam, af van de proteïne turnover en een cellulaire turnover. Bij

hypertrofie van spiervezels zal de proteïnesynthese van groter belang zijn dan de degradatie.

De cellulaire turnover speelt voornamelijk een grote rol tijdens spierontwikkeling in het

embryo. Nadien zullen de satellietcellen zich nestelen tussen de groeiende vezels tijdens de

postnatale spiergroei, hetgeen gelijktijdig een gestegen proteïnesynthese induceert. Ondanks

het belang van de satellietcellen, die in tegenstelling tot spiervezels wel mitotische delingen

kunnen ondergaan en dienen voor herstel van de vezels en toevoegen van nieuwe celkernen,

zal de cellulaire turnover slechts een kleine bijdrage leveren tot de homeostase van een

volwassen spiervezel (Moss & Leblond, 1971; Bonaldo & Sandri, 2013). Bijgevolg is de

cellulaire turnover niet belangrijk in de daadwerkelijke atrofische processen, en wordt de

nadruk gelegd op de proteïne turnover: een evenwicht tussen proteïnesynthese en –degradatie.

Genetische studies bij zoogdieren hebben aangetoond dat de signaalwegen, die accumulatie

van nieuwe proteïnen of afbraak van reeds bestaan proteïnen induceren, sterk gereguleerd

zijn, alsook dat beide pathways onderling elkaar beïnvloeden (Sandri, M. 2008). De etiologie

van spieratrofie, waarbij verschillende katabole stimuli de afbraak van eiwitten promoten, kan

zeer divers zijn.

3

1.2.1 Oorzaken spieratrofie

Verlies van skeletspiermassa kan optreden als complicatie van een ziekte (cachexie), als

gevolg van het verouderen (sarcopenie), door denervatie en immobilisatie (disuse atrofie),

genetische spierziektes (musculaire dystrofie) en tenslotte door malnutritie of starvatie.

Hieronder wordt het contrast weergegeven tussen elke aandoening en wordt een vergelijking

gemaakt in metabole oorzaak van het verlies van spiermassa. Het begrijpen van de

onderliggende mechanismen is immers noodzakelijk voor de ontwikkeling van strategieën en

therapieën voor het behouden van spiermassa en functionaliteit (Evens et al. 2010).

1.2.1.1 Pathologie

Cachexie is een complex metabool syndroom, geassocieerd met de onderliggende ziekte, en

welke gekarakteriseerd wordt door een laag lichaamsgewicht, spieren/of vetverlies. Het

wordt geïnduceerd door een gestegen proteïne katabolisme. Cachexie kan optreden als een

complicatie van hartfalen, HIV, COPD of kanker waarbij de pro-inflammatoire cytokines de

spiermassa reduceert door celbeschadiging en activatie van het immuunsysteem (Evans et al.

2008; Evans, W.J. 2010). Aangezien de spieren het grootste proteïnereservoir is en bijgevolg

een bron van aminozuren, die gebruikt kunnen worden als energieproductie door vele organen

zoals het hart, lever en de hersenen, zal deze aangesproken worden tijdens de katabole

periodes die gerelateerd zijn aan de ziekte. Anorexia, inflammatie, insulineresistentie en een

gestegen spierproteïne-afbraak zijn het meest frequent geassocieerd met bovenstaand

vermelde slopende, chronische ziekten. Daarnaast is ook de testosteron-concentratie gedaald,

wat resulteert in een downregulatie van proteïnesynthese. Patiënten met kanker kunnen zo tot

80% van hun spiermassa verliezen (Baracos, V.E. 2001). Dit excessief verlies verzwakt de

doeltreffendheid van vele verschillende therapeutische behandelingen (Bonaldo & Sandri,

2013). Cachexie is klinisch relevant omwille van een stijging van de morbiditeit en mortaliteit

van de patiënt (Evans et al. 2008).

1.2.1.2 Sarcopenie

Sarcopenie is het leeftijdsgerelateerd verlies van vetvrije massa waarbij zowel de spierkracht,

met een daling van 10% per decennium vanaf het 50e levensjaar (Hughes et al. 2002), alsook

de maximale zuurstofopname (VO2Max), die gerelateerd is aan de spiermassa, afneemt met 3

tot 8% per decennium vanaf 30e levensjaar (Astrand, I. 1973). Dit resulteert in daling van

zowel de functionele kracht als aerobe capaciteit en is zo verantwoordelijk voor de

ontwikkeling van zwakheid bij ouderen.

4

De kritische grens voor zelfstandig functioneren ligt immers op 18ml/min/kg bij vrouwen en

15 ml/min/kg bij mannen. Aangezien er nog geen klinische tests zijn om sarcopenie te

definiëren wordt er gebruik gemaakt van een operationele formule: indien de

skeletspiermassa, gedeeld door de lengte, meer dan 2 standaardafwijkingen onder het

gemiddelde van de jonge populatie ligt, spreekt men van sarcopenie.

De etiologie van sarcopenie is multifactorieel en complex: zowel een daling van de fysieke

activiteit, dalingen van androgeenconcentratie, nutritionele tekorten, chronische inflammaties

als insulineresistentie induceren het verlies van spiermassa (Thomas, D. 2007). De daling in

spierkracht en spiermassa bij vrouwen zal het sterkst zijn na de menopauze, waarbij de daling

van oestrogenen versnelt (Poehlman et al. 1995).

In tegenstelling tot cachexie is sarcopenie universeel en geen ziekte. Sarcopenie wordt

gekarakteriseerd door een daling van de spiermassa, waarbij zowel de dwarse spierdoorsnede

als het aantal spiervezels (Greenlund & Nair, 2003), het aantal neuromusculaire juncties en

het aantal motor units afneemt (Faulkner et al. 2007). Het zijn voornamelijk de type II vezels

die aangetast zijn en atrofiëren, doordat de grote motoneuronen afsterven (Doherty et al.

1993; Léger et al. 2011). Doch zullen door reïnnervatie, via sprouting, enkele spiervezels die

oorspronkelijk door type II motor units werden geënerveerd, geïncorporeerd worden binnen

een type I motor unit en alzo gespaard blijven. Hierdoor stijgt het aantal spiervezels binnen

een type I motor unit alsook het percentage van type I spiervezels binnen een spier, hetgeen

de kans op vallen bij ouderen meer in de hand werkt, aangezien het net de type 2 spiervezels

zijn die snelle contractiele eigenschappen bevat (Faulkner et al. 2007).

1.2.1.3 Disuse

Disuse atrofie wordt geïnduceerd door een reductie van de belasting op spiervezelcontractie.

Zo zal er bij lange periodes van bedlegerigheid, denervatie of immobilisaties een proces tot

stand komen waarbij er een daling is in de dwarsdoorsnede van de spiervezel en bijgevolg van

de spierkracht en –massa (Zhang et al. 2007). Er zal een stijging optreden van zowel

vermoeidheid, insulineresistentie en myofibrillair eiwitverlies in de spieren. Disuse atrofie is

echter niet enkel een afbrekend proces: zo zal er tevens een transitie plaatsvinden van traag

naar snel spiervezeltype. De genen, verantwoordelijk voor de fast-twitch, glycolytische

fenotypes zullen hierbij upgereguleerd worden. Hoewel er dus wel degelijk proteïneverlies in

myofibrillen van de trage spiervezels zal optreden, zullen de spiervezels in de snelle spieren

hiervan grotendeels gespaard blijven (Stevenson et al. 2003).

5

Atleten worden vaak geconfronteerd met een onderbreking van het trainingsproces, omwille

van blessures, ziekte of competitiestop. Ook voor hen is het relevant om de fysiologische

veranderingen op spierniveau te identificeren. Zo blijkt de capillarisatie in elke type

spiervezel te dalen met 6.3% binnen de eerste 4 weken van detraining. Tevens zal er hierbij

een significante reductie optreden van de oxidatieve enzymen met ongeveer 15%, wat

resulteert in een verminderde mitochondriale ATP-productie en alzo verantwoordelijk is voor

de spiervermoeidheid. De dwarsdoorsnede van de spiervezel daalt met 6.4%, met als gevolg

dat ook de spierkracht zal afnemen, en dit met 13.6% (Mujika & Padilla, 2000).

Verschillende studies hebben reeds aangetoond dat een verlengde inactiviteit geassocieerd is

met een stijging van de oxidatieve stress in de skeletspiermassa (Powers et al. 2011, Min et al.

2012). Deze oxidatieve stress wordt veroorzaakt door een toenemende productie van reactive

oxygen species (ROS) in de mitochondriën. Naast het promoten van de expressie van de

proteases, die betrokken zijn bij het atrofie-proces, versnellen ROS ook eiwitafbraak.

Antioxidanten (o.a. vitamines, superoxide dismutases) maken ROS onschadelijk en kunnen

bijgevolg als behandeling dienen om preventief de spieratrofie gedeeltelijk te remmen tijdens

immobilisatie (Min et al. 2012).

1.2.1.4 Genetische spierziekte

De musculaire dystrofieën (MD) vormen een heterogene groep van genetische, erfelijke

spieraandoeningen die gekarakteriseerd worden door een progressieve degeneratie van

spiervezels met spierzwakte als gevolg. Hierbij zijn er genetische defecten opgetreden in de

genen die coderen voor proteïnen, zoals dystrofines, sarcoglycanen en laminines, die

noodzakelijk zijn bij de opbouw van spiermassa (Emery, A. 2002).

De verschillende vormen van MD kunnen sterk afwijken, zowel in de gradatie van

spierverzwakking, als in spieren die worden aangetast. Afhankelijk van deze lokalisatie van

de spierzwakte, alsook het overervingspatroon en de leeftijd waarop de ziekte zich presenteert

worden er 6 verschillende types musculaire distrofieën onderscheiden: ‘Emergy-Dreifuss”

musculaire dystrofie, Duchenne en Becker musculaire dystrofie, distale musculaire dystrofie,

‘limb-girdle’ musculaire dystrofie, fascioscapulohumerale musculaire dystrofie en

oculopharyngeale musculaire dystrofie (Mercuri & Muntoni, 2013).

6

1.2.1.5 Malnutritie

De dagelijkse eiwitinname bij ouderen is vaak ontoereikend. Zo blijkt dat 10-25% van de

ouderen een voedselpatroon vertoont waarbij minder dan 30g eiwitten per dag geconsumeerd

worden (National Center for Health Statistics, 1980). Dit heeft reeds negatieve gevolgen op

korte termijn: zo treedt er na 3 weken een daling van spiermassa en –kracht op van

betrekkelijk 10 en 15%, bij een dagelijkse inname van slechts 0.45g eiwitten per kg

lichaamsgewicht. Bij ernstige malnutritie, zoals bij anorexia nervosa, kan de totale

hoeveelheid lichaamsproteïnen dalen met 20 tot 30% en spierproteïnen tot zelfs 50% (Goulet,

O. 1998). Aanvankelijk zal de mens bij uithongering wel eerst een beroep doen op de

glycogeenvoorraden en vetreserves alvorens de spiermassa aan te spreken. Een van de

belangrijkste metabole adaptaties van de skeletspier hierbij is het sparen van glucose als

energiebron opdat een voortdurende glucosevoorziening aan de hersenen verzekerd wordt.

Malnutritie kan bovendien insulinedeficiëntie induceren, hetgeen proteïnesynthese inhibeert

en voornamelijk de myofibrillaire eiwitten zijn hier gevoelig voor. Spieren met een groter

aandeel snelle spiervezels, zoals m. Gastrocnemius, zullen ernstiger aangetast worden dan de

trage spieren zoals m. Soleus (Sugden, P. 1991). Naast de inhibitie van proteïnesynthese

induceert vasten tevens een verlies van spiermassa. Deze daling is het gevolg van een

toename in het aantal circulerende glucocorticoïden en het optreden van proteolytisch proces,

waarbij ubiquitinen en proteasomen geactiveerd worden en zo myofibrileiwitten afbreken.

Zo kunnen de vrije aminozuren, afkomstig van de spieren voorzien worden als energiebron

door oxidatie in de spieren zelf, of door gluconeogenese in de lever. Naast een tekort aan

proteïne-inname, kan ook vitamine te kort schadelijke effecten hebben op zowel spiermassa,

als –functionaliteit. Een vitamine D-tekort tast voornamelijk de type II vezels aan, waar

atrofie optreedt. Voornamelijk ouderen kampen met dit tekort, wat mede de grotere kans op

vallen verklaart (Ceglia, L. 2008).

7

1.2.2 Huidige Therapieën

Bij het onderzoek naar de ontwikkeling van therapieën ter preventie van atrofie, of

vermindering of stopzetting van spierafbraak, is het noodzakelijk om zowel de oorzaken van

de geïnduceerde atrofie te kennen alsook de signaalwegen die de spier proteïne turnover

regelen, te begrijpen. Er zijn echter enkele moeilijkheden waar we mee te kampen hebben om

de verkregen informatie te synthetiseren. Zo is er een waaier aan gevarieerde omgevings-en

fysiologische stimuli betrokken bij het verlies van skeletspiermassa: atrofie zal meestal

optreden door een ziekte of blessure, hetgeen de signaal pathways indirect kan beïnvloeden en

tevens een belemmering vormt. Daarom is het moeilijk om ons concreet op een ‘keypoint’

vast te pinnen binnen de regulatie van de proteïne turnover, en is het bijgevolg niet evident

om een specifieke, effectieve behandeling te kiezen (Urso, M. 2009). De volgende therapieën

kunnen alleenstaand of in combinatie met elkaar een oplossing bieden bij de behandeling van

spieratrofie om de spiermassa te verhogen, alsook de functionele capaciteiten te bevorderen.

1.2.2.1 Fysieke activiteit

Conditie- en krachttraining zijn tot op heden de enige bewezen behandelingen ter preventie

van atrofie of het ongedaan maken van spierverlies. De vroegere visie dat ouderen zich niet

meer goed aanpassen aan training is achterhaald. De trainingsadaptaties kunnen minder

uitgesproken zijn bij de jongere populatie maar zowel de aërobe uithouding als de spierkracht

kunnen toenemen door kracht- en uithoudingstraining. Zo bleek bij een interventie van 1 jaar

waarbij ouderen van 60-70 jaar, gedurende 4 keer per week, 45’ trainden aan een intensiteit

van 80% HfMax, dat algemeen de VO2Max gestegen was met 25%, alsook positieve

trainingseffecten op de spieren verkregen werd. Zo steeg in de m. Gastrocnemius de

oppervlakte van elk spiervezeltype, de capillariteit en de enzymactiviteit (Coggan et al. 1992).

Er zijn echter verschillende moeilijkheden om oefeningen op te leggen aan een grote

populatie. Eerst en vooral zijn er zowel ervaren trainers, adequate faciliteiten en gemotiveerde

patiënten nodig. Daarbij zijn de meeste patiënten nog te ziek om aan trainingsprogramma’s

effectief deel te nemen, zijn ze niet gewoon aan sport te doen of doen ze het gewoon niet

graag. Ten slotte moeten de trainingen voortgezet worden om zijn effectiviteit te behouden.

Het is reeds een hele opgave om patiënten te overtuigen te trainen in het kader van revalidatie

en herstel, en nog zwaarder is het om een lange-termijn gewoonte bij de patiënt te

ontwikkelen om het trainingsschema gedurende de rest van zijn levensjaren te volgen.

8

Tevens is het bij patiënten, die te kampen hebben met een ernstige blessure, onmogelijk om te

trainen, voornamelijk binnen de eerste dagen wanneer de meest kritische stijging van

atrofiesignalen voorkomen. In die optiek is het nodig om farmaceutische behandelingen te

ontwikkelen (Glass, O. 2010; Urso, M. 2009).

1.2.2.2 Gentherapie

Een veelbelovende therapie, maar momenteel nog toekomstmuziek, is de toediening van één

specifiek agens die het behoud reguleert van spiermassa door een optimale concentratie van

een afzonderlijke transcript binnen de spier. Ondanks de vooruitgang in moleculair

biologische technieken en experimenten op testpersonen, dewelke de identificatie van

moleculaire targets vergemakkelijkt heeft, is er een evidentie dat de fenotypische gevolgen

niet altijd ontstaan door een set van transcriptionele adaptaties. Daardoor ontbreken

momenteel nog steeds strategieën om via genetische manipulaties spieratrofie stop te zetten

(Trollet et al. 2008).

1.2.2.3 Nutritie

Doordat het testen van interventies met nutritionele supplementen als algemeen veilig wordt

beschouwd en deze interventies makkelijker uitvoerbaar zijn, in tegenstelling tot de

farmaceutische therapie, ontstaat er een veel snellere ontwikkeling en implementatie van

nutritionele therapieën. (Urso, M. 2009). Diëten, die hoge concentratie proteïnen en/of

vitaminen inhouden, kunnen de proteïnesynthese vergroten, de vet-vrije massa promoten en

bescherming bieden van cellulaire componenten. Hierbij speelt de kwaliteit van de eiwitten

een grotere rol: zo zullen de essentiële aminozuren de proteïnesynthese stimuleren, terwijl de

niet-essentiële aminozuren niet effectief zijn (Smith et al. 1998). Uit een experimentele studie

met ratten bleek dat een proteïnedieet, bestaande uit 15% caseïne en 3% leucine, een

stimulerend effect heeft op de spiermassa. Dit gebeurt door enerzijds een inductie van

proteïnesynthese alsook door de reductie van de myofibrillaire proteïne-afbraak. (Yoshizawa

et al. 1999). Er kan bijgevolg geconcludeerd worden dat het supplementeren van leucine, bij

personen met malnutritie, het verlies van spiermassa kan tegengaan (Sugawara et al. 2007).

Supplementatie van vitamine D, blijkt voornamelijk bij de oudere personen van groot belang.

Naast het remmen van botafbraak, opdat botmassa behouden blijft, heeft vitamine D tevens

zeer voordelige effecten op de spiermassa. Hierbij zal een toename kunnen induceren van

zowel de diameter, als het aantal type II spiervezels, waardoor de kans op vallen met 22% kan

afnemen (Bischof et al. 2003; Ceglia, L. 2008).

9

Naast inname van supplementen kan tevens een reductie in calorie-inname van 8% een

potentiële bescherming bieden tegen de negatieve effecten van sarcopenie door inhibitie van

de inflammatoire signaalweg en reductie van oxidatieve stress, hetgeen de spiereiwitten

afbreekt (Marzetti et al. 2008).

1.2.2.4 Farmacologie

Farmacologische behandeling focust op het toedienen van geneesmiddelen, oraal of via

injectie, die acute effecten uitoefenen op de atrofie- en hypertrofiesignaalwegen. Dergelijke

therapeutische interventies kunnen voorgeschreven worden omdat de ernst van de ziekte of

spieratrofie de patiënt niet in staat stelt om door middel van fysieke activiteit of nutritie de

disbalans tussen eiwitsynthese en -afbraak te herstellen. Testosteron en zijn synthetische

vormen hebben reeds effectiviteit bewezen in het manipuleren van de skeletspiergroei (Urso,

M. 2009).

Door gebruik van anabole middelen kan skeletspierhypertrofie geïnduceerd worden door

enerzijds een gestegen DNA transcriptie van de myofibrillaire eiwitten en anderzijds door een

verhoogde activatie van de satellietcellen te veroorzaken (Urso, M. 2009). Zowel interventies

met testosteron enanthaat, een synthetische vorm van het geslachtshormoon testosteron dat

langdurige effecten heeft (Rogerson et al. 2007), recombinant IGF-1 (Balhara, B. 2012),

oxandrolon, een anabole steroïde dat niet aromatiseert (Balagopal et al. 2006), recombinant

groeihormoon (Pupim et al. 2005), clenbuterol, een β2-adrenerge receptor agonist (Lynch &

Ryall, 2008), IGF-1 insuline (Chow et al. 2006), nandrolone decanoate (Johansen et al. 2006)

als creatine (Deldicque et al. 2005) hebben reeds effectiviteit bewezen in het manipuleren van

skeletspiergroei. De anabole effecten van testosteron op de spiermassa en -kracht zijn

aangetoond bij zowel de jongere, als bij de oudere generatie. (Bhasin et al. 2005). De

interventie had hierbij, naast de gunstige fenotypische veranderingen, tevens een impact op de

expressie van genen die de eiwitsynthese en -degradatie reguleren. Dit toont de effectiviteit

aan van het anabole agens op het lichaam in zijn geheel, maar tevens op moleculair niveau.

Bij dergelijke therapieën speelt echter ook omvang van de spierbelasting een significante rol

in de activatie van de eiwitsynthese-route, zo zullen de anabole steroïden slechts een

minimaal effect hebben wanneer de spier geen arbeid uitvoert (Urso, M. 2009).

10

1.3 Testosteronsuppletie als farmacologische interventie

1.3.1 Endogene productie van testosteron

Bij mannen wordt het steroïde geslachtshormoon testosteron voor 90% geproduceerd door de

interstitiële cellen, ook wel Leydigcellen genoemd, die zich bevinden in de ruimten tussen de

testiskanaaltjes in de testis. De androgeenproductie wordt gecontroleerd en gelimiteerd via de

hypothalame-hypofysaire-gonadale as met een negatief feedback mechanisme. Gonadotropine

releasing hormoon (GnRH) wordt vrijgesteld uit de hypothalamus, hetgeen de

hypofysevoorkwab aanzet tot secretie van het luteïniserend hormoon (LH) en follikel

stimulerend hormoon (FSH). Het LH bindt specifiek op het celmembraan van de Leydigcellen

die een hoge affiniteit voor dit hormoon vertonen. Het cAMP stimuleert de transfer van

cholesterol naar het mitochondriaal binnenmembraan, waar het gemetaboliseerd wordt tot

pregnenolon. Het verkregen pregnenolon verlaat de mitochondriën en wordt opgenomen in

het endoplasmatisch reticulum waar het door de plaatselijke enzymen achtereenvolgens

omgezet wordt tot progesteron, androstenedion en uiteindelijk testosteron (Midzak et al.

2008). Deze stijging in testosteronconcentratie kan via negatieve koppeling de synthese

blokkeren zowel door productie van gonadotropine releasing hormoon (GnRH), door de

hypothalamus te blokkeren, alsook door inhibitie van productie LH in de hypofysevoorkwab.

(Martini & Bartholomew, 2008).

Fig. 1. Schematische voorstelling van de regulering van

testosteronproductie via negatieve terugkoppeling.

11

1.3.2 Werking testosteron

Testosteron heeft diverse en belangrijke fysiologische effecten op het menselijk lichaam: het

stimuleert de spermaproductie en het libido, is noodzakelijk voor de ontwikkeling van

secundaire geslachtskenmerken, onderhoudt de botdensiteit, speelt een rol bij de productie

van rode bloedcellen en induceert een toename of behoudt van spiermassa (Bain, J. 2010).

1.3.2.1 Nucleus

Testosteron oefent zijn anabool effect voornamelijk uit door te binden met het androgeen

receptor (AR). Het complex testosteron-androgeen-receptor-betacatenine (AR-binding) dringt

vervolgens de nucleus binnen en bindt op een DNA sequentie waarbij het de expressie van

specifieke genen reguleert. Circulerend testosteron wordt tevens deels omgezet naar estradiol

door het enzym aromatase of naar het niet-aromatiseerbare dihydrotestosteron (DHT) door het

enzym 5α-reductase. DHT blijkt een 10x grotere affiniteit te hebben om te binden met de AR,

en tevens een verschillende expressie van genen te induceren (Deslypere et al. 1992).

1.3.2.2 Cellulair

Testosterontoediening blijkt efficiënt te zijn als behandeling om zowel skeletspiermassa als

spierkracht te doen toenemen bij androgeen-deficiënte mannen, hypogonadale mannen,

oudere mannen en mannen met verschillende chronische aandoeningen zoals kanker,

HIV/AIDS, COPD en brandwonden (Bhasin, S. 1997; Gold, J. 2006; Snyder, P.J. 1999). Deze

patiënten worden immers geconfronteerd met een onderdrukking van testosteron, hetgeen

geassocieerd is met een reductie van de vetvrije massa, fractionele spierproteïnesynthese en

tevens een stijging van de vetmassa (Mauras et al. 1998). Testosteron induceert de stijging in

spiermassa door hypertrofie te induceren van zowel type I-, als type II-vezels en door een

toename in het aantal myonuclei en satellietcellen (Bhasin et al. 2007; Kadi, F. 2008). De

effecten van testosteronsuppletie op een skeletspier hangt echter wel af van zijn

androgeengevoeligheid, de androgeen-receptor expressie (Kadi, F. 2008). Zo blijken type I-

vezels gevoeliger te zijn voor anabole agentia dan type II-vezels aangezien voor eenzelfde

spiermassatoename een lagere dosis testosteron nodig is (Hikim et al. 2002).

1.3.2.3 Somatische neveneffecten

Ondanks de reeds positieve effecten van testosteron op spierkracht en -massa, blijft

testosteron als therapie erg controversieel. Er zijn tal van neveneffecten die gepaard gaan met

testosterontoediening. De androgeenreceptoren zijn immers niet enkel aanwezig in de spieren,

maar tevens in de bijnier, prostaat, hypofyse, epididymis, nieren, lever en het hart. Ongeveer

50% van de menselijke myonuclei bevatten androgeenreceptoren.

12

Testosteron zal dus tevens op andere weefsels inwerken (Sar et al. 1990). De meest

gerapporteerde chronische neveneffecten van een testosteronbehandeling zijn een gestegen

hematocriet- en hemoglobinelevel. Testosteron stimuleert immers de productie van

erytropoëtine in de nieren en induceert zo erytropoëse. Daarnaast kan het ook rechtstreeks

inwerken op het beenmerg door een stijging te veroorzaken de erytropoëtine-gevoelige cellen

(Coviello et al. 2008). Andere neveneffecten zijn cardiovasculaire aandoeningen, acne,

slaapapneu, infertiliteit, leveraandoeningen en een daling van HDL (High Density

Lipoproteïnen). Deze lipoproteïnen zijn in staat om cholesterol vanuit de cellen naar de lever

te transporteren, waar deze vervolgens verwijderd wordt. Een daling in de concentratie HDL

is bijgevolg geassocieerd met een verhoging van de incidentie hart- en vaatziekten. (Montori,

V. 2010). Daarnaast blijkt een testosteronsuppletie bij de mannen tevens de prostaat aan te

tasten, omwille van zijn grote androgeengevoeligheid, waardoor de kans op kanker toeneemt.

Deze neveneffecten komen echter wel pas tot stand na langdurig en vaak excessief gebruik.

Een hogere testosterondosis is immers gerelateerd met een grotere frequentie van deze

neveneffecten (Bhasin et al. 2006).

1.3.2.4 Ontwikkeling van SARM’s

De neveneffecten en moeilijkheid voor de juiste dosering vormen een belemmering tot een

anabole steroïdebehandeling. De bezorgdheid over de lange termijnrisico’s voor de prostaat

en het cardiovasculair systeem hebben de ontwikkeling van Selectieve Androgeenreceptor

Modulatoren (SARM’s) in de hand gewerkt. Hierbij is de structuur van de steroïde zo

aangepast dat ze de anabole effecten op de spieren behouden en geen complexen zullen

vormen met andere steroïdreceptoren en bijgevolg geen negatieve effecten op de prostaat en

het cardiovasculair systeem hebben. De niet-steroïde SARM’s verschillen van testosteron in

verschillende aspecten: zo zullen SARMs geen aromatisatie of 5-α-reductase ondergaan, een

grotere androgeenreceptoren- en weefselspecificiteit hebben, vatbaar zijn voor modificaties en

tenslotte een agonistische werking hebben op de spieren en beenderen, en niet zozeer op de

prostaat en zaadblaasjes (Bhasin et al. 2006). SARM’s kunnen geclassificeerd worden binnen

4 categorieën: Aryl propionamide, Hydantoine, Quinoline en Tetrahydroquiline derivaten

(Bhasin & Jasuja, 2009).

Fig. 2. Structuurformule van Testosteron (1) en de SARM Quinoline (2), overgenomen van

http://en.wikipedia.org/wiki/Testosteron en http://en.wikipedia.org/wiki/Quinoline.

13

1.4 Oestrogeensuppletie als farmacologische interventie Het geslachtshormoon oestrogeen wordt niet meer beschouwd als louter een vrouwelijk

steroïde aangezien het ook geproduceerd wordt bij de man en bovendien belangrijke functies

vervult, zoals behoud van de minerale densiteit van het bot (van den Beld et al. 2000). Het

circulerend oestrogeenlevel in het bloed wordt voor 85% bepaald door aromatase-activiteit in

perifere weefsels, zoals de huid, vet en spieren, de overige 15% wordt geproduceerd door de

testes en de bijnieren (Nelson et al. 2001).

Er wordt gesuggereerd dat de effecten van testosteron, als spiermassaregulator, niet

uitsluitend het gevolg zijn van de directe stimulatie van de androgeen receptor maar dat

eiwitsynthese tevens gemedieerd wordt door gearomatiseerde testosteron, namelijk 17β-

estradiol (E2), het ligand van de oestrogeenreceptoren α en β (ESR1 en ESR2). Zowel

myoblasten, myotubes als volwassen spiervezels in de skeletspieren vertonen functionele

oestrogeenreceptoren, hetgeen wijst op een direct effect van oestrogenen op spierniveau

(Barros et al. 2006). Er is reeks een onderzoek uitgevoerd bij vrouwen, waarbij de daling van

de vetvrije massa na de menopauze kon afgeremd of tegengegaan worden door een

oestrogeensuppletie (Sorensen et al. 2001). Dergelijke therapieën met behandeling van 17β-

estradiol induceerden zowel een stijging van de spiermassa, als –kracht. Tevens blijkt uit een

dierexperimenteel onderzoek dat ook bij mannen estradiolsuppletie preventief kan werken

tegen verlies van spiermassa na castratie. Dit effect blijkt weliswaar minder groot te zijn dan

behandeling met DHT (Svensson et al. 2010). De androgeenreceptor en oestrogeenreceptor

gemedieerde signaalwegen verlopen grotendeels onafhankelijk van elkaar, zo worden slechts

13 genen door zowel E2 als DHT gereguleerd. Tegenover het totaal aantal geactiveerde

genen, respectievelijk 187 en 51 voor DHT en E2 ligt dit aantal dus vrij laag en kan er

bijgevolg besloten worden dat beide hormonen een verschillend mechanisme hanteren om

behoud van spiermassa te reguleren (Svensson et al. 2010). Tevens blijkt dat E2 een

beschermend effect kan bieden tegen apoptose van de spiercel. Zo zijn er

oestrogeenreceptoren ESR1 en ESR2 gedetecteerd in de mitochondriën van de spiercellen.

Aangezien het mitochondrium het voornaamste organel is bij het apoptoseproces, kan 17β-

estradiol een functie vervullen in deze regulatie (Vasconsuelo et al. 2008).

Het onderliggend mechanisme van E2, met zijn specifieke signaalweg, is nog niet helemaal

uitgeklaard en bovendien zijn de effecten op spierniveau bij de man onvoldoende

gerapporteerd om juiste conclusies te kunnen trekken.

14

1.5 Signaalpathways Doordat testosteronbehandeling gepaard gaat met veel neveneffecten en de productie van

doeltreffende SARM’s op zich laat wachten, kan besloten worden dat de farmacologische

behandeling vandaag de dag nog steeds niet op punt staat om efficiënt de spieratrofie te

bestrijden. Kennis van de onderliggende mechanismen van de twee tegenstrijdige pathways

die de proteïne turnover beïnvloeden kunnen bijgevolg nieuwe therapeutische targets bieden.

Hieronder worden de verschillende signaalwegen besproken.

1.5.1 Signaalweg spieratrofie

Spieratrofie, waarbij degradatie van proteïnen optreedt, ontstaat door een transcriptionele

upregulatie van genen die instaan voor de 3 voornaamste proteolytische systemen in cellen,

namelijk het ATP-afhankelijke ubiquitine-proteasoom systeem, het autofaag-lysosomaal

systeem en het Ca2+

-afhankelijk protease systeem. Het eerst genoemde afbraaksysteem is

verantwoordelijk voor 80 tot 90% van cellulaire proteïne degradatie en houdt een cascade in

van 3 successieve stappen waarbij 3 verschillende enzymatische componenten inwerken,

namelijk het E1-ubiquitine-activerend enzym, het E2- ubiquitine-conjugerend enzym en

tenslotte het E3-ubiquitine-ligase enzym, hetgeen verantwoordelijk is voor substraat

specificiteit. Het proces start met de intrede van het E1 enzym dat het ubiquitine eiwit

activeert in een ATP-afhankelijke reactie. Nadien zal het E2 enzym het geactiveerde

ubiquitine transferen naar het substraat, namelijk het af te breken eiwit. Dit substraat kan

gebonden worden met het ubiquitine via het E3-ubiquitine-ligase enzym. Vervolgens,

wanneer dit substraat-E3 complex gevormd is, zal dit een signaal vormen voor de E2-

ubiquitine-conjugerende enzymen om nog meer ubiquitine-eiwitten hieraan te binden, hetgeen

resulteert in een poly-ubiquitineketen. Deze keten wordt tenslotte aan het proteasoom

gebonden en afgebroken tot kleine peptides en herbruikbare ubiquitines (Ciechanover &

Schwartz, 2002). De 2 voornaamste en best beschreven enzymen in de spier, behorend tot de

familie van ubiquitine ligases, welke upgereguleerd zijn tijdens spieratrofie en aldus

verantwoordelijk zijn voor de proteïneafbraak, zijn MuRF-1 (muscle-specific ring finger

proteïn) en Atrogin-1 (MAFbx, muscle associated F-box proteïne) (Bodine et al. 2001, Gomes

et al. 2001). De transcriptie van beide genen wordt gestimuleerd door de FoxO (Forkhead box

O) proteïnen, een familie van transcriptiefactoren die bestaat uit 3 isovormen: FoxO1, FoxO3

en FoxO4 (Sandri, M. 2008). FoxO-activatie wordt gereguleerd door verschillende

posttranslationele modificaties zoals fosforylatie, acetylatie of mono- en poly-ubiquinatie

(Huang et al. 2007).

15

Het autofaag-lysosomaal systeem, waarbij organel- of eiwitaggregaten afgebroken en

verwijderd worden door lysosomen, is constitutief actief in skeletspieren en draagt ook bij tot

spieratrofie (Sandri, M. 2008). Deze autofagosomen worden geactiveerd in respons op

verschillende stimuli, zoals cellulaire stress, gebrek aan aminozuren en bij aanwezigheid van

cytokines (Bonaldo & Sandri, 2013). FoxO3 controleert hierbij de transcriptie van de

autofagie-gerelateerde genen en reguleert onafhankelijk van elkaar zowel de ubiqituine-

proteasomale- als de lysosomale autofagie-signaalweg (Mammucari et al. 2007). De snelle

glycolytische vezels vertonen een grotere hoeveelheid autofagosomen dan de tragere

oxidatieve vezels (Mizushima et al. 2004). Verschillende studies hebben reeds aangetoond dat

er een upregulatie is van cathepsin-L, een lysosomale cysteïne protease, tijdens verschillende

modellen van spierverlies (Deval et al. 2001).

Tot slot is er nog het calpain-systeem. Calpains zijn niet-lysosomale, Ca2+

-afhankelijke

cysteïne proteases, die zich in 3 vormen binnen de skeletspiervezels bevinden: de ubiquitine

calpains 1 en 2, ook respectievelijk µ-calpains en m-calpains genoemd, en spierspecifieke

calpains 3. De activatie treedt op door een stijgende Ca2+

-influx, vanuit het sarcoplasmatisch

reticulum naar de celkern, tijdens denervatie, starvatie of mechanische stress en speelt een rol

in de regulatie van atrofie binnen de skeletspier (Bartoli & Richard, 2005). Verschillende

studies hebben reeds aangetoond dat proteasomen niet in staat zijn om intacte myofibrillen te

degraderen en bijgevolg afhankelijk zijn van de Ca2+

-afhankelijke calpains (Williams et al.

1999). De ubiquitine calpains kunnen het sarcomeer, ter hoogte van de Z-lijn, afbreken

waardoor de actine- en myosinefilamenten passief in het cytoplasma vrijkomen. Deze zullen

vervolgens ubiquitinatie ondergaan en degradatie door het proteasoom. De calpains kunnen

bijgevolg beschouwd worden als de initiators van myofibrillaire degradatie en de proteasomen

eerder als de opruimers, doordat ze alle myofibrillaire fragmenten verwijderen en recycleren

tot aminozuren. Hierdoor kunnen de ubiquitine calpains de proteïne degradatie indirect

beïnvloeden. De relatieve bijdrage van elke calpain in de ontwikkeling van spieratrofie is

echter moeilijk te bepalen aangezien zowel hun signalen als hun plaats binnen de cel

verschillen (Vermaelen et al. 2007).

16

1.5.2 Triggers spieratrofiesignaalweg

De triggers om spierafbraak en bovenvermelde systemen te induceren zijn uitgebreid en

bevinden zich zowel binnen als buiten de spiercel. Circulerende mediatoren zoals pro-

inflammatoire cytokines, katabole hormonen zoals myostastine, glucocorticoïden, alsook een

lage energiebalans kunnen de proteïnedegradatie in gang zetten.

De NF-κB transcriptiefactoren, die een hoofdrol spelen bij de activatie van de immuunrespons

op een infectie of een inflammatie, zijn aanwezig in skeletspieren en treden tussen beide om

het effect van inflammatoire cytokines, voornamelijk tumor necrose factor-α (TNF-α), te

regelen bij spieratrofie en cachexie. Activatie van NF-kB, als gevolg van de inflammatoire

cytokines, zal een toename induceren van het ubiquitine ligase MuRF-1, wat resulteert in een

proteosomale degradatie van de spiereiwitten en zo atrofie induceert (Sandri. Et al. 2008).

Myostatine wordt voornamelijk gesecreteerd door skeletspieren en functioneert als een

negatieve regulator voor spiergroei door inhibitie van de satellietcelactivatie en -differentiatie

(McFarlane et al. 2006). Het breekt tevens spiermassa af door een upregulatie te induceren

van de ubiquitine ligases Atrogin-1 en MuRF-1, via inhibitie van Akt waardoor FoxO1

geactiveerd wordt. Overexpressie van follistatine, een inhibiter van Myostatine, promoot een

grote stijging van spiermassa (Lee, S.J. 2001).

Het glucocorticoïdenlevel stijgt significant bij vele pathologische condities die geassocieerd

zijn met spierverlies. Eenmaal de glucocorticoïden zich in de nucleus bevinden, zal de

glucocorticoïde receptor de expressie van het target gen KLF15 activeren. KLF15 participeert

in de spierafbraak door transcriptionele upregulatie van zowel FoxO1, Atrogin-1 en MuRF1

(Bonaldo & Sandri, 2013).

De energiebalans binnen de spiercel heeft tevens een belangrijke invloed op de spierafbraak.

Het enzym AMPK (adenosine-monofosfaat-kinase) speelt een rol bij de cellulaire

energetische homeostase en wordt geactiveerd tijdens metabole stress wanneer er grote vraag

is naar ATP. Het in werking treden van dit enzym induceert een activatie, via fosforylatie, van

FoxO3 waardoor een upregulatie ontstaat van Atrogin-1 en MuRF-1 en zo myofibrillaire

proteïnenafbraak tot stand komt (Nakashima & Yakabe, 2007).

17

1.5.3 Signaalweg spierhypertrofie

Het eiwit insulin-like growth factor 1 (IGF-1) is de best gekarakteriseerde spiergroei-

promotor die leidt tot proteïnesynthese, groei van skeletspiermassa en aldus spierhypertrofie.

Het circulerend IGF-1 wordt voornamelijk gesynthetiseerd door de lever en staat onder

controle van het groeihormoon (GH). Tevens is er een lokale autocriene productie door de

skeletspier, hetgeen belangrijk is voor structurele adaptaties van de spier ten gevolg van

krachttraining (Goldspink, G. 1999). De toename in massa door een upregulatie van het IGF-1

proteïne is gerelateerd met een fysiologische stijging van de spierkracht (Sandri, M. 2008).

De overexpressie van IGF-1 resulteert in activatie van phosphatidylinositol3-kinase (PI3K)

dat phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphates produceert, dat op zijn beurt het serine/threonine

kinase (Akt) activeert (Sandri, M. 2008). Er zijn 3 verschillende Akt-genen in het menselijk

lichaam, die elk een specifieke functie hebben: Akt1, Akt2 en Akt3. In de skeletspier wordt

haast uitsluitend Akt1 en Akt2 geactiveerd door stimulatie van respectievelijk IGF-1 en

insuline. Akt3 daarentegen komt voornamelijk in de hersenen voor (Sandri, M. 2008).

Krachtraining induceert uitsluitend een activatie van Akt1 in de contraherende spiervezels.

(Turinsky & Damrau-Abney, 1999). Ter hoogte van het plasmamembraan wordt Akt

geactiveerd, door fosforylatie, via minstens 2 verschillende kinases, het 3-phosphoinositide

dependent protein kinase-1 (PDK1) en het mTOR-rictor complex. Daaropvolgend ontstaan 2

relevante downstream takken die de proteïnesynthese controleren en onder controle staan van

Akt: enerzijds wordt de mTOR (mammalian target of rapamycin) pathway geactiveerd,

anderzijds zal de glycogeen synthase kinase 3β (GSK3β ) geïnhibeerd worden (Sandri, M.

2008). GSK3β blokkeert de eukaryotic initiation factor 2B (eIF2B), hetgeen noodzakelijk is

voor het translatieproces en aldus zo voor proteïnesynthese. Expressie van een inactieve

dominante negatieve kinasevorm van GSK3β induceert drastische hypertrofie in skeletale

myotubes (Rommel et al. 2001).

De kinase mTOR wordt beschouwd als de hoofdregulator van celgroei die signalen integreert

van groeihormonen, voeding en energetische status om de proteïnesynthese te controleren.

mTOR inhibeert het 4EBP1 proteïne, hetgeen op zijn beurt een onderdrukker is van de

proteïne synsthese. Daarnaast activeert mTOR p70S6K1

(ribosomale proteïne S6 kinase),

hetgeen de proteïne synsthese stimuleert (Sandri, M. 2008).

18

Fig. 3. Schematische weergave van de atrofie en hypertrofie signaalwegen.

19

1.6 Link tussen beide pathways: IGF1-AKT-FoxO signaalweg De processen van verschillende intracellulaire signaalwegen zijn voornamelijk anabool

(hypertrofie) of katabool (atrofie), doch bestaat er een cross-relatie tussen deze individuele

cascades zodat beiden gestimuleerd en geïnhibeerd kunnen worden door zowel verschillende

als gemeenschappelijke signaalwegen (Sandri, M. 2008).

De ubiquitine ligases MuRF-1 en Atrogin-1 kunnen onderdrukt worden door de hypertrofe

IGF-1 signaalweg via activatie van Akt, die de FoxO transcriptie inhibeert. Akt promoot

immers de export van FoxO uit de nucleus, naar het cytoplasma, door deze te fosforyleren.

Door de interactie met de factoren van de hypertrofie-pathway wordt bijgevolg de upregulatie

van zowel Atrogin-1 als MuRF-1 tegengewerkt. Toch blijkt een upregulatie van de IFG-1

signaalweg onvoldoende om atrofie volledig te blokkeren aangezien het enkel de transcriptie

voor nieuwe ubiquitine ligases kan blokkeren (Sacheck et al. 2004). Bovendien is de FoxO

activiteit gereguleerd door verschillende posttranslationele modificaties zoals fosforylatie,

acetylatie en mono- of poly-ubiquitinatie. Veel van deze regulatorische mechanismen zijn

Akt-onafhankelijk en kunnen een rol spelen in de spieratrofie die geïnduceerd is door

oxidatieve- of energetische stress (Sandri, M. 2008).

De crossregulatie is echter niet enkel gelimiteerd tot inhibitie van de ubiquitine ligases via

Akt. Zo kan een activatie van FoxO zorgen voor een upregulatie van 4EBP1, via inhibitie van

het mTOR-complex, dat op zijn beurt de eiwitsynthese en hypertrofie inhibeert. Wanneer dus

Akt onderdrukt wordt bij actieve proteïne afbraak, en FoxO wordt opgewekt, wordt tevens de

proteïnesynthese verder onderdrukt.

20

1.7 Werking van testosteron op de signaalwegen De klinische relevantie van hypogonadisme, hetgeen geassocieerd is met verschillende

ernstige atrofiecondities, heeft onderzoekers er toe aangezet tot het verdiepen van de kennis

omtrent de respons van de reductie van het circulerend testosteronlevel op de anabole en

katabole signaalwegen (White et al. 2013). Castratie is een effectieve techniek om de

endogene productie bij knaagdieren te elimineren, hetgeen zou resulteren in een daling van

het lichaamsgewicht, spieratrofie en een stijging van de vetreserves (Axell et al. 2006).

De beschikbare en circulerende testosteronconcentratie kan de eiwitsynthese en -afbraak

beïnvloeden door regulatie van Akt/mTOR/FoxO signaalweg die hierboven eerder werd

beschreven. Zo kan de androgeen-receptor binding een toename in IGF-1 mRNA expressie

induceren, waardoor een toename ontstaat van het lokale IGF-1 (Ferrando et al. 2001).

Daarentegen is afname van het circulerend testosteron geassocieerd met een reductie in zowel

circulerend als intramusculaire IGF-1 expressie (Mauras et al. 1998). Testosteron zou via

fosforylatie van zowel Akt als GSK3β, wat respectievelijk gestimuleerd en geïnhibeerd wordt,

een positieve stimulans kunnen geven aan het mTOR-complex ter promotie van

proteïnesynthese (Yin et al. 2009). De regulatie van mTORC1 door toediening van anabole

steroïden is echter nog niet helemaal duidelijk, dit in tegenstelling tot regulatie van mTORC1

door de PI3K/Akt signaalweg De effecten hangen echter mogelijks wel af van de spier, type

testosteron, alsook de duur van de supplementatie (White et al. 2013). Testosteron kan tevens

de proteïneafbraak regelen door de genexpressie van FoxO1 en Atrogin-1 rechtstreeks te

onderdrukken (Qin et al. 2010). Zo is het eerder aangetoond dat een daling van het

testosterongehalte, omwille van castratie, een stijging veroorzaakt van de ubiquitine ligases

Atrogin-1 en Murf-1 expressie in de m. Levator Ani (Pires-Oliveira et al. 2010).

Het is duidelijk dat de testosterongevoeligheid van de Akt/mTOR-signaalweg verder

onderzoek vergt opdat het belang van de variaties in het circulerend testosteronlevel, hetgeen

gezien wordt bij enkele slopende ziektes, op de spierproteïne turnover-regulatie duidelijk

wordt.

21

2. Hypothese en onderzoeksdoel Als hypothese wordt er aangenomen dat spieratrofie het resultaat is van een delicate balans

tussen proteïnesynthese en -degradatie door een wisselwerking van de hypertrofie en atrofie

signaalwegen. Castratie van de mannelijke C57BL/6 muizen resulteert in een daling van het

serum testosterongehalte (hypogonadisme), waardoor enerzijds proteïnesynthese afgeremd en

proteïnedegradatie gestimuleerd zal worden. Dit zou resulteren in een afname van spiermassa,

alsook het totale lichaamsgewicht.

De onderzoeksvragen hebben betrekking op de invloed van geslachtshormonen op het behoud

en/of toename van spiermassa. Hierbij wordt nagegaan wat de invloed is van castratie en

bijgevolg reductie van endogene productie van androgenen en oestrogenen op de expressie

van ubiquitine ligases Atrogin-1 en MuRF-1, alsook op Myostatine in de m. Soleus met trage

spiervezels (SOL), de m. Extensor Digitorum Longus met snelle spiervezels (EDL), en het m.

Levator Ani –Bulbocavernosus complex (LA/BC). Daarnaast wordt onderzocht of

behandeling met testosteron en estradiol deze effecten kan opheffen en dit wordt getoetst door

ook hierbij de expressie van bovenstaande genen na te gaan. Er wordt geopteerd om

verschillende spiertypes te gebruiken omwille van de verschillende kenmerken: zowel de

contractiele eigenschappen verschillen, alsook de androgeengevoeligheid. De keuze van

bovenvermelde genen is gebaseerd op hun belang in de atrofiesignaalwegen van de

skeletspieren die beschreven zijn in de wetenschappelijke literatuurstudie. Bovendien wordt

ook nagegaan wat de invloed van tijd is op de genexpressie. Daarnaast wordt ook op

eiwitniveau onderzocht of er veranderingen plaatsvinden in expressie. Aangezien een stijging

van mRNA van een bepaald eiwit niet rechtstreeks correleert met een verhoogde

eiwitproductie en/of –functie, wordt onderzocht of de stijging van Atrogin-1, MuRF-1 en

Myostatine zich ook manifesteert als eiwitten, en bijgevolg effectief kan bijdragen tot reductie

in spiermassa in de gekozen spieren.

Er worden concreet 7 onderzoeksvragen gesteld:

1. Is het LA/BC complex een goed spieratrofiemodel?

2.Wat is de invloed van testosteron op het lichaamsgewicht en de spiermassa?

3. Reageren de gekozen spiertypes verschillend op sex-steroïden suppletie?

4. Vertonen de massa’s en genexpressies in de spiervezels verschillen in functie van de tijd?

5. Heeft estradiolsuppletie dezelfde beschermende effecten als testosteronsuppletie?

6. Vertoont Myostatine, als inhibitor van eiwitsynthese, een upregulatie na orchidectomie?

7. Correleert een stijging van genexpressies met een stijging van de atrogenen op eiwitniveau?

22

3. Materialen en methode

3.1 Studie design Het onderzoek is een experimentele studie met 100 mannelijke C57BL/6 muizen van 8 weken

oud waarbij de muizen via simple random sample worden toegewezen aan één van de 4

testgroepen: 3 experimentele groepen en 1 controlegroep . De muizen die onderverdeeld zijn

in de controlegroep (SHAM) ondergaan een schijnoperatie, sham-operatie, om de effecten van

een chirurgische ingreep uit te sluiten. Er wordt hierbij onder isofluraan inhalatie een incisie

gemaakt ter hoogte van de testes die terug toegenaaid wordt zonder wegnemen van de testes.

Een tweede groep (ORX+V), ondergaat orchidectomie, met als doel de endogene

androgeenproductie te onderdrukken. In deze groep krijgen de muizen subcutaan een 0.5 cm

lange, lege silastic tube (vehicle) ingepland ter hoogte van de cervicale regio. De derde groep

(ORX+T) heeft dezelfde conditie als de vorige groep, hetzij dat in deze tube een fysiologisch

hoeveelheid testosteron aanwezig is (Sigma-Aldrich), 1/2 verdund met cholesterol, met een

dagelijkse hormoon release van 11.5 µg/dag. In de vierde en laatste groep (ORX+E2) worden

de muizen opnieuw gecastreerd maar bevat de tube een fysiologische hoeveelheid β-estradiol

(Sigma-Adrich), 1/16 verdund met cholesterol, met een dagelijkse hormoonrelease van 0.03

µg/dag. De keuze voor de silastic tubes en de bepaling van de cholesterol verdunning is

gebaseerd op wetenschappelijke literatuur (Vanderschueren et al. 2000).

Het succes van orchidectomie wordt gecontroleerd door het meten van het gewicht van de

zaadblaasjes. Ter controle van de doeltreffendheid van de behandeling met estradiol wordt de

uterusmassa van 4 mature vrouwelijke geovariectomeerde muizen bepaald, die eenzelfde

dosis β-estradiol toegediend krijgen. Tevens wordt zowel voor als na de interventieperiode het

lichaamsgewicht bepaald.

Deze studie behoort tot de experimentele cross-sectionele onderzoeken aangezien de analyses

worden gedaan op biopten, die op 1 bepaald tijdstip genomen worden. Bij aankomt in het

animalarium krijgen de dieren 2 weken de tijd om te acclimatiseren alvorens de interventie

start. Gedurende het experiment konden de proefdieren naar ‘hartelust’ eten en drinken. Het

protocol voor dit dierexperimenteel onderzoek werd goedgekeurd door de ethische commissie

dierproeven van de faculteit geneeskunde en gezondheidswetenschappen van de Universiteit

Gent.

23

3.2 Meetmethode

3.2.1 Meting lichaamsgewicht en massa spierbiopten

Na 1 dag, 7 dagen en 30 dagen worden respectievelijk 6, 35 en 59 dieren gesacrifieerd via

cervicale dislocatie. Voorafgaand aan de euthanasie wordt het lichaamsgewicht opnieuw

gemeten. Zowel volgende spieren: de m. Soleus (SOL), de m. Extensor digitorum longus

(EDL), de m. Levator Ani en de m. Bulbocavernosus (LA/BC), als de zaadblaasjes (ZB)

worden gedissecteerd. Dit gebeurt onder verdoving met een mix van 80% Ketamine (50

mg/ml, 100mg/kg) en 20% Xylazine (20 mg/ml, 10mg/kg). Al de verkregen biopten worden

onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof om ze later te bewaren op een temperatuur van

-80°C tot verdere analyse. Onmiddellijk na de ontdooiing van de spierbiopten wordt de

spiermassa van de SOL (SOL_massa), de EDL (EDL_massa), de LA/BC (LA/BC_massa) en

het gewicht van de ZB (ZB_massa) gemeten.

3.2.2 Genexpressie: q-PCR-analyse op spierbiopten

Dankzij de realtime-PCR-methode, een kwantitatieve PCR-methode (qPCR), is het mogelijk

om na RNA-isolatie, cDNA-synthese en het kiezen van efficiënte primers voor de

verschillende specifiek onderzochte genen, de veranderingen van genexpressie (upregulatie

of downregulatie) van zowel Atrogin-1, MuRF-1, als Myostatine (Mstn) te meten. De

belangrijkste stappen bij deze laboratoriumtechniek worden hieronder beschreven.

3.2.2.1 RNA-isolatie

Het RNA wordt, door gebruik te maken van ‘Tripure Isolation Reagent’ (Roche Diagnostics,

Vilvoorde, België) geïsoleerd uit de spierbiopten. Het verkregen RNA-staal wordt nadien

uitgezuiverd aan de hand van ‘RNaesy Mini Kit’ (Qiagen, Venlo, Nederland). Met behulp van

‘Rnase-Free Dnase kit’ (Qiagen, Venlo, Nederland) wordt vervolgens het contaminerend

DNA uit de geïsoleerde RNA-stalen geknipt en verwijderd. De RNA-concentratie (ng/µl)

wordt gemeten met de Nanodrop ND-2000 Spectrophotometer (Thermo-Scientific). De

zuiverheid van het RNA wordt beoordeeld aan de hand van absorptiemetingen bij

golflengtestralingen van 260 en 280nm. Op basis van de A260/A280 ratio kan tenslotte de

kwaliteit van het RNA gecontroleerd worden.

3.2.2.2 cDNA-synthese

De omzetting van enkelstrengig RNA naar dubbelstrengig cDNA gebeurt met behulp van de

‘iScript cDNA Synthesis kit’ (BioRad, Nazareth, België). Bij dit proces worden de instructies

van de fabrikant gevolgd.

24

3.2.2.3 q-PCR

De real-time quantitative polymerase chain reaction is een laboratoriumtechniek die DNA

zowel kan amplificeren als simultaan quantificeren. Aangezien het aantal verkregen cDNA-

kopieën de up-of downregulatie van een gen weerspiegelt, kan op basis van deze techniek de

veranderingen op genniveau bestudeerd worden. Dit door middel van visualisatie via een

fluorescentiekleurstof, namelijk de SYBR Green PCR Master MIX (Applied Biosystems,

Halle, België), die kan binden aan het dubbelstrengig DNA. Naast deze kleurstof, bevat de

8µl reactiemix tevens 3µl cDNA (1/10 verdund), en 300nM forward en reverse primers.

De q-PCR-reactie is een cyclisch programma dat uitgevoerd wordt op het Lightcycler 480

system (Roche), waarbij tot 40x het cDNA-staal opgewarmd en afgekoeld wordt. De eerste

opwarming gebeurt bij een temperatuur van 95°C, en dit gedurende 10 minuten opdat de

polymerasen geactiveerd worden. Dit wordt gevolgd door 40 cycli waarbij de temperatuur

eenmaal stijgt tot 95°C gedurende 15 seconden, hetgeen resulteert in een denaturatie van de

cDNA-strengen tot enkelvoudige strengen. Hierdoor verliest cDNA de eigenschap om te

binden met de kleurstof en gaat fluorescentie verloren. Vervolgens wordt de temperatuur

teruggebracht naar 60°C en dit voor 60 seconden, hierbij hechten de 2 gekozen primers aan de

enkelvoudige strengen. Tot slot vindt de elongatie plaats via het polymerase, deze voegt

nucleotiden toe aan de primers opdat er zo een complementaire kopie gevormd wordt van de

template. Bij deze amplificatie van het target-gen kan het dubbelstrengige-cDNA opnieuw

binden met de SYBR Green PCR Master Mix, hetgeen resulteert in een toename van het

fluoresecentiesignaal.

Fig. 4. Schematische weergave van de q-PCR reactie.

25

3.2.2.4 Registratie Ct-waarde

Voor elke cyclus wordt de intensiteit van de fluorescentie gemeten en geplot in een grafiek.

Nadien wordt de fluoresecentietreshold bepaald, dit is een maat uitgedrukt in Ct-waarden en

is proportioneel voor de initiële hoeveelheid mRNA-materiaal van je gen dat aanwezig is in

elk staal. Hoe hoger de Ct-waarde is, hoe meer cycli er zijn moeten doorlopen om een

bepaalde hoeveelheid fluorescentie te bekomen en hoe lager bijgevolg de mRNA-concentratie

van een bepaald staal.

Fig. 5. Voorstelling van fluorescentiegrafiek.

3.2.2.5 Primers

Primers zijn korte enkelstrengige nucleotidensequenties, die basenparen kunnen vormen met

het gedenatureerde cDNA omwille van zijn complementariteit en zijn zo gekozen opdat het

specifiek zou binden met het gewenste gen. Aan de hand van een beschikbare database

(BLAST) wordt de specificiteit van de primers onderzocht. Hieronder wordt een overzicht

gegeven van de primersequenties (‘forward’ en ‘reverse’ primers) voor de verschillende

onderzocht genen (Atrogin-1, MuRF-1 en Myostatine), alsook voor de referentiegenen (Ppia,

Rplp0 en B2m).

Gen Forward Primer Sequentie: 5’ 3’ Reverse Primer Sequentie: 5’ 3’

Atrogin-1 GCA-GAG-AGT-CGG-CAA-GTC CAG-GTC-GGT-GAT-CGT-GAG

MuRF-1 TGG-AAA-CGC-TAT-GGA-GAA-CC ATT-CGC-AGC-CTG-GAA-GAT-G

Myostatine TGC-TAT-AAG-ACA-ACT-TCT-GCC-AAG-A AAG-AGC-CAT-CAC-TGC-TGT-CAT-C

Ppia CAA-ATG-CTG-GAC-CAA-ACA-CAA-ACG GTT-CAT-GCC-TTC-TTT-CAC-CTT-CCC

Rplp0 GGA-CCC-GAG-AAG-ACC-TCC-TT GCA-CAT-CAC-TCA-GAA-TTT-CAA-TGG

B2m CAT-GGC-TCG-CTC-GGT-GAC-C AAT-GTG-AGG-CGG-GTG-GAA-CTG

Fig. 6. Overzicht primersequenties (forward en reverse) voor onderzochte genen (Atrogin-1, MuRF-1

en Myostatine) en referentiegenen (Ppia, Rplp0 en B2m).

26

3.2.2.6 Smeltcurve

Om de specificiteit van de q-PCR voor het amplicon na te gaan wordt de smeltcurve

onderzocht. Hierbij worden de stalen na het doorlopen van de q-PCR reactie 15 sec

opgewarmd bij 95°C, 1 min afgekoeld tot 60°C en opnieuw 15 sec opgewarmd bij 95°C,

waarbij telkens om de 3°C het fluorescentiemateriaal gemeten werd. De grafiek zou slechts 1

duidelijk piek mogen vertonen, het cDNA-materiaal denatureert dan bijgevolg allemaal op

eenzelfde temperatuur zodat kan besloten worden dat de q-PCR specifiek verloopt voor het te

onderzoeken gen.

Fig. 7. Voorstelling smeltcurve.

3.2.2.7 Referentiegenen

De verkregen resultaten van de q-PCR, namelijk de Ct waarden, werden genormaliseerd ten

opzichte van 3 referentiegenen. De expressie van deze referentiegenen zijn onder

verschillende condities constant en stabiel aangezien ze het behoud van de cellulaire

basisfuncties reguleren. Door de normalisatie via de Δ-Δ Ct-methode, kan er een realistische

up- of downregulatie van de onderzochte genen aangetoond worden. Aan de hand van een

algoritmisch programma, GeNorm, werden de 3 optimale referentiegenen geselecteerd,

namelijk peptidylpropyl isomerase (Ppia), ribosomal protein large P0 (Rplp0) en beta-2

microglobulin (B2m) (Vandesompele et al. 2002).

3.2.2.8 Delta-Delta Ct-methode

De delta-delta Ct-methode was de laatste stap in de q-PCR analyse. Met deze methode

(formule) werden de Ct-waarden omgezet in ruwe data en vervolgens genormaliseerd tot

bruikbare waarden, namelijk relatieve expressieniveaus, opdat statistische verwerking

mogelijk werd. Vooraleerst werd voor een specifiek target gen, de verschillende Ct-waarden

van de samples vergeleken met het sample met de laagste Ct-waarde. Nadien werden de

bekomen waarden genormaliseerd ten opzicht van het geometrisch gemiddelde van de ruwe

data van de 3 geselecteerde 3 referentiegenen.

Formule delta-delta Ct-methode =

27

3.2.3 Eiwitexpressie

Ermee rekening houdend dat de biologische effecten van de mogelijke veranderingen in

MuRF-1 en Myostatine transcriptie afhankelijk is of deze veranderingen zich ook doorzetten

in gecodeerde eiwitten, werd de expressie geëvalueerd van zowel het MuRF-1 proteïne,

alsook het Myostatine proteïne. Dit werd gedaan door middel van Western blotting

(Immunoblotting) nadat de eiwitten werden geïsoleerd.

3.2.3.1 Eiwitisolatie

De totale hoeveelheid proteïnen werd allereerst geëxtraheerd uit ongeveer 9 mg van de SOL;

dit gebeurde door gebruik te maken van een RIPA buffer (15μl/staal) (Millipore, North Ryde,

NSW, Australia) door de toevoeging van een protease inhibitor mengsel (Sigma, Castle Hill,

NSW, Australia) en het gebruik van Halt fosfatase inhibitor Single_Use Cocktail (Themo

Scientific, Rockford, IL, USA). Na homogenisatie, werd het lysaat eerst gedraaid op 4°C,

gedurende 60 minuten, voordat het gecentrifugeerd werd, waarbij het een snelheid bereikte

van 1300 toeren per minuut op 4°C voor 60 minuten. Totale eiwitgehalte van de supernatant

werd bepaald met de BCA eiwit assay kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) waarbij

de instructies van de fabrikant werden opgevolgd.

3.2.3.2 Western blotting

De eiwitstalen (30 µg) werden gedenatureerd in een ladingsbuffer en gescheiden door een

12% SDS-PAGE gel in een buffer die 25mM Trisbase bevatte, 192mM glycine en 0.1% SDS,

pH 8.8. Na de scheiding werden de proteïnen overgebracht naar een PVDF membraan

(Millipore, Billerica, MA, USA) in een koude (4°C) transferbuffer (25mM Tris, 192 mM

glucine, 10% methanol, pH 8.3), gedurende 2 uur. De membranen werden vervolgens

geblokkeerd gedurende 1 uur op kamertemperatuur in 5% BSA en 5% afgeroomde melk in

PBS. De membranen werden vervolgens gedurende een hele nacht geïncubeerd waarbij het

voorzichtig gemengd werd bij 4°C en met de volgende antilichamen, die verdund zijn tot

1:1000 in 5% BSA/PBS voor Myostatine (Millipore) en 1:1000 verdund in 5% magere

melk/PBS voor MuRF-1 (ECM bioscience, Versailles, KY, USA). Na 4 x 5 minuten te zijn

gewassen met PBS, werden de membranen gedurende 1 uur geïncubeerd met IgG

antilichamen, die gelabeled zijn met een infrarood fluorescerende 800-nm kleurstof, (Alexa

Fluor 800, Invitrogen, Calrsbad. CA. USA) of met IgG antilichaam, die gelabeled zijn met

een infrarood-tl-680-nm kleurstof (iRdye 680L LT IgG, LI-COR Biosciences, Lincoln,

Nebraska USA).

28

Na het wassen van de specifieke eiwitten werden deze gevisualiseerd met behulp van het

Odyssey Imaging System (LO-COR Biosciences) en werden de individuele optische

proteïneband dichtheden gekwantificeerd met de Odyssey software. De te controleren

eiwitladingblots werden genormaliseerd t.o.v. het glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase

(GAPDH) eiwit (G8795, Sigma-Aldrich, Sydney, Australië).

3.2.4 Statistische analyse

Data van de genen eiwitexpressie werd geanalyseerd met het software programma SPSS

(SPSS 19.0, Chicago, IL). Hierbij werden de statistische verschillen tussen de gemiddelden

van de testgroepen bepaald door gebruik te maken van een one-way ANOVA-test, gevolgd

door een post-hoc analyse met de Fisher’s least significant difference test (LSD). Significantie

werd verondersteld indien de p-waarde kleiner was dan 0.05.

29

4. Resultaten

4.1 Effecten van orchidectomie en testosteron- of estradiolsuppletie

op zaadblaasjes, lichaamsgewicht en spiermassa

4.1.1 Zaadblaasjes

Orchidectomie veroorzaakt ten opzichte van de controle groep een sterk significant (p<0.001)

gewichtsverlies van de zaadblaasjes na 7 en 30 dagen met respectievelijk 67.6% en 88.5%.

Omwille van de grote androgeengevoeligheid van de zaadblaasjes, gaat testosteronsuppletie

na orchidectomie dit verlies in massa tegen en veroorzaakt zelfs een significant stijging in

gewicht (p<0.01). Zowel na 7, als na 30 dagen orchidectomie, is er hypertrofie opgetreden in

de zaadblaasjes bij de testgroep die behandeld is met testosteron en dit uit zich in

massatoename van 36.4% en 19.3%. Estradiolsuppletie daarentegen vertoont deze anabole

effecten niet en kan de gewichtsafname door orchidectomie niet tegengaan (p<0.001).

Fig. 8. Effecten van orchidectomie (ORX+V) (na 7 en 30 dagen) op het gewicht van de zaadblaasjes

met en zonder suppletie van seks-steroïden (estradiol (ORX+E) of testosteron (ORX+T)) bij de 4

testgroepen. Significantie ten opzichte van SHAM (controlegroep) wordt weergegeven door: *

(p<0.05), ** (p<0.01), *** (p<0.001).

30

4.1.2 Lichaamsgewicht

Na 7 dagen interventie zijn er nog geen effecten zichtbaar: er zijn ten opzichte van de

controlegroep immers geen significante reducties (overall Anova p=0.481) van het

lichaamsgewicht vastgesteld voor de verschillende testgroepen.

Na 30 dagen is er ten opzichte van de controlegroep (SHAM) wel een significante reductie

van het lichaamsgewicht vastgesteld (p<0.001), met 31.1%, voor de groep die orchidectomie

onderging zonder behandeling met sex-steroïden (ORX+V). Deze daling kan effectief

tegengegaan worden door testosteronsuppletie (ORX+T). Bij de estradiolsuppletie na

orchidectomie (ORX+E) blijkt dit compensatiemechanisme echter afwezig (p=0.001)

aangezien hier tevens een daling van het lichaamsgewicht is opgetreden met 11.0%

vergeleken met de controlegroep.

Fig. 9. Effecten van orchidectomie (ORX+V) (na 7 en 30 dagen) op lichaamsgewicht met en zonder

suppletie van seks-steroïden (estradiol (ORX+E) of testosteron (ORX+T)) bij de 4 testgroepen.

Significantie ten opzichte van SHAM (controlegroep) wordt weergegeven door: * (p<0.05), **

(p<0.01), *** (p<0.001).

31

4.1.3 Spiermassa

Figuren 10, 11 en 12 geven respectievelijk de spiermassa van de m. Soleus (SOL), de m.

Extensor digitorum longus (EDL) en het m. Levator Ani–Bulbocavernosus complex (LA/BC)

na 7 dagen en na 30 dagen interventie voor de 4 verschillende testgroepen.

4.1.3.1 Massa m. Extensor digitorum longus

Na 7 dagen blijken er nog geen significante verschillen te zijn in spiermassa tussen de 4

verschillende testgroepen (overall Anova p=0.970). De EDL vertoont 30 dagen na

orchidectomie wel een significante daling in massa (p=0.008). Deze daling van 13.0% wijst

op de invloed van endogene androgenen op de spiermassa. Testosteronsuppletie (ORX+T)

kan deze spiermassa-afname onderdrukken (p=0.907). Estradiolsuppletie (ORX+E) vertoont

deze effecten echter niet en kan spieratrofie niet verhinderen (p=0.007). Er blijken geen

significante verschillen te zijn opgetreden in mate van atrofie tussen de 2 verschillende

spieren voor de testgroepen ORX + V en ORX + E. De Ratio EDL/SOL blijft voor de

verschillende testgroepen constant na 7 interventiedagen (overall Anova p=0.426) en na 30

interventiedagen (overall Anova p=0.968)

Fig. 10. Effecten van orchidectomie (ORX+V) (na 7 en 30 dagen) op massa van SOL met en zonder



(p<0.01), *** (p<0.001).

32

4.1.3.2 Massa m. Soleus

Na 7 dagen blijken er nog geen significante verschillen te zijn in spiermassa tussen de 4

verschillende testgroepen in de SOL (overall Anova p=0.718). De massa vertoont 30 dagen na

orchidectomie wel een significante daling (p=0.023). Deze daling van 14.0% wijst op de

invloed van endogene androgenen op behoud van spiermassa. Testosteronsuppletie na

orchidectomie (ORX+T) kan deze spiermassa-afname immers onderdrukken (p=0.767).

Estradiolsuppletie (ORX+E) vertoont dit beschermend effect echter niet en kan spieratrofie

niet verhinderen (p=0.044).

Fig. 11. Effecten van orchidectomie (ORX+V) (na 7 en 30 dagen) op massa van SOL met en zonder



(p<0.01), *** (p<0.001).

33

4.1.3.3 Massa m. Levator Ani –Bulbocavernosus complex

Na 7 dagen interventie blijkt er in de LA/BC een significante daling te zijn opgetreden van de

spiermassa, met 22.3%, bij de groep die orchidectomie onderging zonder behandeling.

(p=0.002). Zowel estradiol-, als testosteronsuppletie kan de spiermassa-afname verhinderen.

Ook na 30 dagen orchidectomie is er een significante daling in massa vastgesteld. (p<0.001).

Deze daling van 56.7% blijkt, ten opzichte van de interventieperiode na 7 dagen, meer

uitgesproken te zijn en wijst op de invloed van endogene androgenen op de spiermassa.

Testosteronsuppletie na orchidectomie kan de spiermassa-afname onderdrukken en leidt tot

een uitgesproken hypertrofie (p=0.002). Hierbij blijkt de massa met 19.8% te zijn

toegenomen. Estradiolsuppletie vertoont deze effecten echter niet en kan spieratrofie na

orchidectomie niet verhinderen (p<0.001).

Er is een significant verschil merkbaar in de mate van spiermassareductie tussen enerzijds het

LA/BC complex en anderzijds de EDL en de SOL. Zo blijken, 30 dagen na orchidectomie, de

ratio’s LABC/EDL en LABC/SOL significant kleiner te zijn, als gevolg van een meer

uitgesproken reductie van 56.7% in massa van de LA/BC ten opzicht van 14.0% voor de SOL

en 13.0% voor de EDL (p<0.001).

Fig. 12. Effecten van orchidectomie (ORX+V) (na 7 en 30 dagen) op massa van LA/BC met en zonder

suppletie van sex-steroïden (estradiol (ORX+E) of testosteron (ORX+T)) bij de 4 testgroepen.


(p<0.01), *** (p<0.001).

34


op genexpressie atrofieregulators Atrogin-1, MuRF1 en Myostatine

4.2.1 Genexpressie in m. Extensor digitorum longus

Fig. 13,14 en 15. Effecten van orchidectomie (ORX+V) (na1, 7 en 30 dagen) op genexpressie van

MuRF-1, Atrogin-1en Myostatine in de EDL met en zonder suppletie van sex-steroïden (estradiol

(ORX+E) of testosteron (ORX+T)) bij de 4 testgroepen. Significantie ten opzichte van SHAM

(controlegroep) wordt weergegeven door: * (p<0.05), ** (p<0.01), *** (p<0.001).

35

In de snelle spier, de m. Extensor digitorum longus, zijn er tussen de testgroepen geen

significante verschillen in de MuRF-1 mRNA expressie voor de 3 tijdstippen (overall Anova

p=0.151, p=0.741, p=0.696 voor respectievelijk interventiedag 1, 7 en 30). Atrogin-1 mRNA

expressie vertoont daarentegen wel significante verschillen tussen de testgroepen (overall

Anova p=0.036). Zo is er na 30 dagen, ten opzichte van de controlegroep, een upregulatie

van Atrogin-1 (p=0.015) voor de testgroep die na orchidectomie behandeld werden met

estradiol. De mRNA expressie van Myostatine tenslotte, vertoont uitsluitend op testdag 7

significante verschillen tussen de testgroepen (overall Anova p=0.006). Er is een upregulatie

zichtbaar, ten opzichte van de controlegroep, bij de testgroep die na orchidectomie geen

behandeling kreeg met sex-steroïden suppletie (p=0.012), alsook bij de testgroep die na

orchidectomie behandeld werd met estradiol (p=0.004).

4.2.2 Genexpressie in m. Soleus

36

Fig. 16,17 en 18. Effecten van orchidectomie (ORX+V) (na1, 7 en 30 dagen) op genexpressie van

MuRF-1, Atrogin-1en Myostatine in de SOL met en zonder suppletie van sex-steroïden (estradiol

(ORX+E) of testosteron (ORX+T)) bij de 4 testgroepen. Significantie ten opzichte van SHAM

(controlegroep) wordt weergegeven door: * (p<0.05), ** (p<0.01), *** (p<0.001).

De MuRF-1 mRNA expressie in de trage spier, de m. Soleus, vertoont na 7 dagen interventie

een upregulatie van 41.3% bij de testgroep ORX + E (p=0.003) en tevens een trend tot

significante stijging bij de testgroep ORX + V (p=0.068). Na 30 dagen interventie blijkt deze

upregulatie van MuRF-1 enkel bij de testgroep ORX+V stand te houden (p=0.04).

De Atrogin-1 mRNA expressie in de SOL vertoont bij de testgroep ORX + V na 7 dagen

interventie een significante stijging, ten opzichte van de controlegroep, van 39.7% (p=0.032).

Na 30 dagen interventie zijn er significante reducties merkbaar (downregulaties) van de

Atrogin-1 mRNA expressie voor de testgroepen die behandeld werden met sex-steroïden. Zo

is er een daling in mRNA expressie ten opzichte van de controlegroep van 29.2% bij de

testgroep ORX + T (p=0.012) en een daling van 39.0% bij de testgroep ORX + E (p=0.004).

De mRNA expressie van Myostatine tenslotte, vertoont noch op testdag 7, noch op testdag 30

significante verschillen tussen de testgroepen (overall Anova p=0.434 (7 dagen) en p=0.469 (

30 dagen)).

37

4.2.3 Genexpressie in m. Levator Ani –Bulbocavernosus complex

Fig. 19 en 20 Effecten van orchidectomie (ORX+V) (na 7 en 30 dagen) op genexpressie van MuRF-1

en Atrogin-1 in de LA/BC met en zonder suppletie van sex-steroïden(estradiol (ORX+E) of

testosteron (ORX+T)) bij de 4 testgroepen. Significantie ten opzichte van SHAM (controlegroep)

wordt weergegeven door: * (p<0.05), ** (p<0.01), *** (p<0.001).

In het androgeen gevoelige m. Levator Ani–Bulbocavernosus complex zijn er voor zowel de

MuRF-1 als voor de Atrogin-1 mRNA expressie (overall Anova p<0.001) voor beide

testmomenten, significante verschillen gevonden tussen de 4 testgroepen. In LA/BC ontstaat

er, ten opzichte van de controlegroep, een viervoudige en achtvoudige significante stijging in

mRNA expressie van respectievelijk MuRF-1 en Atrogin-1 (p<0.001) na 7 dagen

orchidectomie (ORX + V). Testosteronsuppletie (ORX + T) kan deze upregulaties na

orchidectomie voor beide testmomenten volledig onderdrukken.

38

Estradiolsuppletie vertoont deze compensatie-effecten echter niet. Er is voor deze testgroep

(ORX + E) immers een significante upregulatie zichtbaar van zowel MuRF-1 (p=0.015),

alsook van Atrogin-1 (p=0.003).

Toch blijken de upregulaties van beide genexpressieniveaus na estradiolsuppletie significant

te verschillen met de testgroep die niet behandeld werd met sex-steroïden. (p<0.001). De

overexpressie van MuRF-1 mRNA en Atrogin-1 mRNA, na 7 dagen orchidectomie, werd

gereduceerd met respectievelijk 170.6% en 479% . Estradiolsuppletie heeft bijgevolg wel een

onderdrukkend effect op de upregulatie van beide ubiquitine ligases.

Na 30 dagen interventie zijn bovenstaande effecten van de verschillende behandelingen

(testgroepen) op beide genexpressies opnieuw zichtbaar (overall Anova p<0.001). Atrogin-1

mRNA expressie vertoont nog steeds een achtvoudige stijging (p<0.001). De upregulatie van

MuRF-1 blijkt echter wel licht gedaald. Testosteronsuppletie is in staat om de upregulaties

van beide mRNA genexpressies volledig te inhiberen (p=0.972 (MuRF-1) en p=0.558

(Atrogin-1). Hoewel estradiolsuppletie ook na 30 dagen interventie de mRNA expressies niet

op baselineniveau kan terugbrengen, blijkt deze nog steeds een remmend effect te hebben op

de genexpressie van zowel MuRF-1 (p=0.029), alsook Atrogin-1 (p=0.003).

39


op eiwitexpressie atrofieregulators MuRF1 en Myostatine

Fig. 21 en 22 Effecten van orchidectomie (ORX+V) (na 1,7 en 30 dagen) op eiwitexpressie van

MuRF-1 en Myostatine in de EDL met en zonder suppletie van sex-steroïden (estradiol (ORX+E) of

testosteron (ORX+T)) bij de 4 testgroepen. Significantie ten opzichte van SHAM (controlegroep)

wordt weergegeven door: * (p<0.05), ** (p<0.01), *** (p<0.001).

In de snelle spier, de m. Extensor digitorum longus, blijken er op eiwitniveau geen

significante verschillen te zijn opgetreden in de expressie van MuRF-1 en Myostatine

proteïnen tussen de verschillende testgroepen na 1,7 of 30 dagen interventie (overall Anova

p=1,00, p=0,949, p=0,451 (MuRF-1) en p=0,405, p=0,780, p=0,828 (Myostatine)).

40

5. Conclusie en discussie

5.1 Overzicht van resultaten als leidraad voor discussie

Fig. 23. Schematische weergave van de

resultaten binnen ons spiermodel.

41

5.2 LA/BC vs. EDL en SOL als spiermodel Dit dierenmodel met gecastreerde muizen toont het belang aan van een constante serum

testosteronconcentratie opdat de vetvrije massa in stand gehouden wordt. Tevens bevestigt het

de anabole effecten van testosteronsuppletie zodat deze efficiënt kan ingezet worden als

mogelijke therapie bij het behandelen van mensen die geconfronteerd worden met een verlies

van spiermassa. Hierbij kunnen zowel patiënten met cachexie of andere slopende ziektes,

alsook ruimtevaarders, patiënten met breuken en tot slot ouderen, geholpen worden. Het

LA/BC complex blijkt een ideale predictor te zijn van de effectiviteit van de anabole

androgenen. Aangezien dit complex voor ongeveer 74% bestaat uit androgeenreceptoren zal

deze sterk reageren op de testosteronsuppletie. Omwille van deze hoge responsiviteit werd

het LA/BC complex reeds veel gebruikt als model in voorgaande studies (Pires-Oliveira et al.

2010; Serra et al. 2011; Mendler et al. 2007). Echter, in de menselijke skeletspier is de

androgeengevoeligheid lager: ‘slechts’ 50% van de menselijke myonculei bevatten immers

androgeenreceptoren. Bijgevolg is het LA/BC complex niet representatief voor de

locomotorische spieren en zal deze aldus een vertekend beeld kunnen geven van de up-en

downregulaties in genexpressies.

5.3 Invloed van testosteron op lichaamsgewicht en spiermassa Het stopzetten van de endogene productie van testosteron, via orchidectomie, veroorzaakt na

30 dagen een daling in zowel het lichaamsgewicht (-31.1%), alsook in het gewicht van de

zaadblaasjes (88.5%). We kunnen bijgevolg besluiten dat de castratie gelukt is. Na het

toedienen van testosteron zien we terug een stijging in het gewicht van de zaadblaasjes. Deze

stijging bereikte echter een waarde tot boven het baselineniveau. Hieruit kan geconcludeerd

worden dat de gekozen dosis testosteron, namelijk 11.5 µg/dag, te hoog is en bijgevolg meer

dan louter een ‘replacement’ van de endogene productie, waardoor er hypertrofie kan

optreden in de onderzochte spieren. Deprivatie van testosteron induceert effectief een reductie

van het gewicht van de drie verschillende spiertypes. Zowel de spiermassa van EDL, SOL als

LA/BC daalt met respectievelijk 13,0% , 14.0% -en 56.7%. Deze resultaten bevestigen de

bevindingen van enkele studies van o.a. Jiang & Klueber, 1989 en Rowe, R.W. 1968, die

aantonen dat een daling in het circulerend androgenenniveau resulteert in een significante

daling van spiermassa. Deze dalingen in spiermassa van spieren met snelle spiervezels (EDL)

en spieren met trage spiervezels (SOL) werden echter voordien, in vorige studies, niet altijd

geconstateerd (Axell et al. 2006; Pires-Oliveira et al. 2010).

42

Zo kon Antonio et al. 1999, in een onderzoek, waarbij de m. Plantaris als snelle spier werd

onderzocht, geen significante daling in de spiermassa na testosteron deprivatie vinden. In

onze studie blijkt bovendien testosteronsuppletie steeds de daling van spiermassa tegen te

gaan. Er is zelfs een uitgesproken hypertrofie opgetreden in het LA/BC complex, als gevolg

van de hoge dosis testosteron, aangezien de massa significant is gestegen met 19.8%. Dit

weerlegt een studie van Tingus & Carlsen, 1993, die er niet in slaagden om significante

verschillen in de spiermassa te detecteren na suppletie van een anabole steroïde, stanozolol.

5.4 Spiervezel-specifieke effecten op testosteron- en

estradiolsuppletie Er zijn zowel op spier- als op genniveau significante verschillen zichtbaar tussen enerzijds het

m. Levator Ani–Bulbocavernosus complex (LA/BC) en anderzijds beide onderbeenspieren.

Zo treedt er in onze studie, na 30 dagen interventie, een daling op van de spiermassa in het

LA/BC complex van 56.7%. tegenover 13.0% en 14.0% in respectievelijk de SOL en de EDL.

Aangezien, volgens Bhasin et al. 2006, de effecten van testosteron op spiermassa afhankelijk

zijn van de androgeen-receptor expressie, kan besloten worden dat ook in deze studie het

LA/BC complex responsiever is op testosteron dan de skeletspieren SOL en EDL. Dit uit zich

ook in significante resultaten op genniveau: zo blijkt testosteron deprivatie in het androgeen

gevoelige LA/BC complex een uitgesproken achtvoudige, significante stijging te veroorzaken

in de mRNA expressie van Atrogin-1 en MuRF-1 ten opzichte van de controlegroep. Deze

stijging in genexpressies van de atrofieregulators correleert bijgevolg met de sterke daling in

de spiermassa van LA/BC.

Er zijn geen significante verschillen gevonden in de mate van spiermassa-afname tussen de

twee verschillende spiertypes, SOL en EDL. De ratio EDL/SOL, tussen de verschillende

testgroepen, blijft immers voor beide testmomenten constant. Hieruit zou geconcludeerd

kunnen worden dat, in tegenstelling tot de bevindingen van Kadi F. 2008 en Léger at al. 2011,

de type I-spiervezels (SOL) geen grotere sensitiviteit vertonen voor testosteron dan de type II-

spiervezels (EDL) en dat de type I-spiervezels niet sterker atrofiëren na androgeen deprivatie

in onze studie. Echter, aangezien er op genniveau wel verschillen zichtbaar zijn tussen beide

skeletspieren moeten we voorzichtig zijn met de bovenvermelde vaststelling. Zo zijn er in de

snelle spiervezels van de EDL geen significante upregulaties van de MuRF-1 en Atrogin-1

mRNA expressies voor de groepen die niet behandeld zijn met sex-steroïden. In de trage

spiervezels van de SOL zijn er daarentegen wel significante effecten van androgeen deprivatie

op expressie van de ubiquitine ligases.

43

Zo is er een duidelijke upregulatie van de Atrogin-1 mRNA expressie na 7 dagen

orchidectomie. Voorgaande resultaten werden tevens gevonden bij een gelijkaardige

onderzoeksmodel van Pires-Oliveira et al, 2010. Ook hier vertoont de EDL geen significante

upregulaties van Atrogin-1 of MuRF-1 mRNA expressie, na orchidectomie. Een mogelijke

verklaring hiervoor is dat de EDL slechts voor 7% bestaat uit androgeengevoelige receptoren

waardoor het dus minder responsief is op testosteron (Monks, DA. 2004). In ons onderzoek

blijkt er in de EDL slechts één significant lichte stijging te zijn opgetreden. Zo was er een

upregulatie van mRNA Atrogin-1 expressie voor de groep die behandeld is met estradiol.

Hiervoor is echter geen duidelijke verklaring.

Uit voorgaande resultaten kunnen we concluderen dat er betrekkelijk meer significante

upregulaties zijn van mRNA expressies van beide ubiquitine ligases in het LA/BC complex

ten opzichte van skeletspieren. Dit suggereert dat, omwille van de lage

androgeengevoeligheid in beide skeletspieren, testosteron geen invloed heeft op het

atrofieproces in de EDL en een beperkte invloed heeft op de atrogenen in de SOL. De

mogelijke invloed van androgene hormonen op de regulatie van de ubiquitine ligases werd

eerder in vraag gesteld door MacLean et al. 2008, die tevens geen gestegen expressie vond

voor de atrogenen in de m. Gastrocnemius bij AR knockout muizen. De lage responsiviteit

van verschillende spieren op de androgenen was coherent met het onvermogen om de

Atrogin-1 en Murf-1 mRNA expressies in de EDL te laten toenemen na orchidectomie. Dit

indiceert dat de fysiologische levels van androgenen niet voldoende zijn om de ubiquitine

ligases in de EDL te onderdrukken. Toch blijken uit verschillende andere onderzoeken van

o.a. Ibebunjo et al. 2011 en White et al. 2013, dat androgeendeprivatie wel degelijk kan

resulteren in overexpressies van MuRF-1 mRNA in een skeletspier. Zo werd er in het

onderzoek van Ibebunjo een significante drie- tot viervoudige upregulatie gevonden in de m.

Triceps Brachii, na respectievelijk 7 en 38 dagen orchidectomie. Testosteronsuppletie bleek

hierbij efficiënt om deze upregulaties tegen te gaan. In dit onderzoek werd echter een grotere

dosis testosteron toegediend (10mg/kg/dag), hetgeen de uitgesproken effecten op

genexpressieniveau deels kan verklaren. White et al. 2013 bevestigde in zijn onderzoek de

bevindingen van Ibebunjo. Er waren immers significante mRNA overexpressies opgetreden in

een skeletspier voor beide atrogenen. Zo ontstond er een upregulatie van MuRF-1 en Atrogin-

1 in de m. Gastrocnemius met respectievelijk 75% en 50% na 28 dagen orchidectomie.

44

5.5 Invloed van de tijd op spiermassa en genexpressie atrogenen De verschillen in androgeengevoeligheid uiten zich ook in de mate van de spiermassadaling in

functie van de tijd. Zo zijn in de locomotorische spieren louter significante gewichtsdalingen

gevonden na 30 dagen, terwijl er voor het LA/BC complex reeds na 7 dagen een

gewichtsafname is opgetreden van 22.3%. De expressies van beide ubiquitine ligases zijn, wat

betreft het verloop van upregulatie tijdens de verschillende interventieperiodes, nagenoeg

gelijk. Zo zijn de upregulaties van de MuRF-1 en Atrogin-1 mRNA expressies voor beide

testmomenten even groot waardoor gesuggereerd kan worden dat deze sterke upregulatie lang

aangehouden wordt. Dit staat in contrast met de bevindingen in een studie van Pires-Oliveira

et al. 2010. Zij stelden vast dat het atrofieproces in het LA/BC complex reeds snel en

progressief geactiveerd wordt na androgeen deprivatie, maar zich nadien geleidelijk herstelt

tot het baselineniveau. In een review van Foletta, VC. et al. 2011, werd de rol van de

ubiquitine ligases, als initiators van het atrofieproces, beschreven. Hierbij werd aangetoond

dat zowel Atrogin-1, MuRF-1 mRNA expressies sterk upgereguleerd worden bij het optreden

van een ziekte (1-5 dagen). Enkele maanden na deze fase, treed er vervolgens een

beschermend mechanisme op waarbij de expressie van de atrogenen daalt tot onder

baselineniveau opdat spieratrofie afgeremd kan worden. De studie van Jiao et al. 2009

bevestigde deze bevindingen: zo bleken na 11 weken orchidectomie de mRNA expressies van

zowel Atrogin-1 en MuRF-1 opnieuw gedaald te zijn. In ons onderzoek vindt het laatste

testmoment plaats na 30 dagen, hierdoor is het mogelijk dat het beschermingsmechanisme

nog niet is opgetreden. Verder onderzoek is bijgevolg noodzakelijk om de tijdsafhankelijke

upregulatie van de ubiquitine ligases te verduidelijken. Op basis van de bevindingen van

Pires-Oliveira werd er verwacht dat er een sterke upregulatie zou optreden van de ubiquitine

ligases, de eerste 24 uur na orchidectomie, De grafieken van MuRF-1 en Atrogin-1 mRNA

expressie vertonen effectief wel deze verwachte overexpressie ten opzichte van de

controlegroep. De effect sizes van de MuRF-1 en Atrogin-1 mRNA expressies in de EDL bij

de testgroep die orchidectomie onderging, worden met aan waarde van respectievelijk 0.66 en

0.81 beschouwd als ‘moderate’ en ‘large’. Echter, omwille van het beperkte aantal

proefdieren die gesacrifieerd werden die dag, zijn deze resultaten niet significant en kunnen er

geen concrete besluiten getrokken worden.

45

5.6 Testosteron- vs. estradiolsuppletie Estradiolsuppletie vertoont na 7 dagen interventie een beschermend effect tegen atrofie in het

LA/BC complex, aangezien er voor deze testgroep (ORX + E) geen significante daling was

van spiermassa ten opzichte van de controlegroep. Dit beschermend effect verdwijnt echter na

30 dagen interventie. In de andere spiergroepen vertoont estradiolsuppletie noch na 7, noch na

30 dagen interventie het compensatiemechanisme van testosteron. Er treedt immers atrofie op

en aldus heeft estradiol niet de te verwachte anabole effecten op de mannelijke

skeletspiermassa. Toch blijkt volgens Barros et al. 2006, dat zowel myoblasten, myotubes,

alsook volwassen spiervezels in de skeletspieren van mannelijke muizen functionele

oestrogeenreceptoren bevatten waarop 17β-estradiol (E2) kan binden en aldus zo spieratrofie

kan remmen en zelfs spierhypertrofie kan induceren (Sorensen et al. 2001). Zo toonden

Svensson et al. in hun onderzoek aan dat estradiolsuppletie het atrofieproces kon inhiberen en

het verlies van lichaamsgewicht, alsook van spiermassa in m. Quadriceps en de m.

Gastrocnemius kon tegengaan. Aangezien de effecten uitsluitend te zien zijn in het LA/BC

complex kan er gesuggereerd worden dat dit complex gevoeliger is voor estradiolsuppletie

door een verhoogde oestrogeenreceptorexpressie.

Testosteronsuppletie na orchidectomie, is daarentegen wel in staat de spiermassa van het

LA/BC complex te behouden door onderdrukking van beide ubiquitine ligases. Testosteron

blijkt bijgevolg een goede controle te hebben over de spiermassa door onrechtstreeks het

ubiquitine proteasoom-systeem te inhiberen Estradiolsuppletie is niet in staat deze

genexpressies terug te dringen tot baselineniveau, maar vertoont wel in het LA/BC complex

een significante daling in de genexpressies van MuRF-1 en Atrogin-1, ten opzichte van de

groep die niet behandeld is met geslachtshormonen. In de SOL blijkt, na 30 dagen interventie,

dat de toediening van beide sex-steroïden (testosteron en estradiol) de Atrogin-1 expressies

kan doen dalen in de SOL tot onder het baselineniveau. Echter, aangezien estradiolsuppletie

de spiermassa-afname in de SOL niet kan tegengaan, blijkt deze downregulatie niet

functioneel. Enkel testosteron vertoont een beschermend effect op de spiermassa van de trage

spieren. Dit weerlegt de bevindingen van Svensson et al. 2010, die aantoonde dat

estradiolsuppletie de reductie in spierafname kan beperken door eiwitsynthese te promoten en

tevens de atrofische processen deels te inhiberen.

46

5.7 Aandeel Myostatine, als inhibitor van eiwitsynthese, in

atrofieproces Ondanks verschillende studies van o.a. McFarlane et al. 2006, 2011 en Lee, S.J. 1999, die

aantonen dat Myostatine een negatieve regulator is van eiwitsynthese en bijgevolg spieratrofie

kan induceren via activatie van de ubiquitine ligases, zijn er in deze studie geen coherente

significante up- of downregulaties gevonden van de Myostatine mRNA expressies. Er zijn

uitsluitend in de EDL significante stijgingen zichtbaar van het Myostatine gen, na 7 dagen

interventie, in de testgroep die niet behandeld werden met seks-steroïden en de testgroep die

behandeld werd met estradiol. Hiervoor is echter geen duidelijke verklaring. In het onderzoek

van Ibebunjo et al. 2011, vertoonden de Myostatine mRNA expressies wel een significante

daling na orchidectomie. Nadat de spiermassa zich hersteld had, na behandeling met

testosterontoediening, ontstond er vervolgens een significante upregulatie van de Myostatine

mRNA expressie. Deze studie bevestigt de hypothese dat de expressie van Mystotatine, als

negatieve regulator van proteïnesynthese, afhankelijk is van de toestand waarin de spier

verkeert (atrofie of hypertrofie).

5.8 Gestegen genexpressies correleren niet met stijging

atrogeenproteïnen MuRF-1 en Atrogin-1 proteïne-expressies werden reeds in een aantal andere studies

onderzocht waarbij een mogelijke upregulatie, via het Western Blot protocol, werd bepaald

(Adams et al. 2008; Gaugler et al. 2011; Doucet et al. 2007). Onze resultaten van MuRF-1 en

Myostatine op eiwitniveau in de EDL komen niet overeen met deze van de genexpressies. Zo

blijkt het effect van 7 dagen orchidectomie (ORX + V) op de Myostatine proteïne expressie

afwezig, terwijl er wel een significante upregulatie is opgetreden van de Myostatine mRNA

genexpressie. Ondanks het belang van beide protëinen in het atrofieproces die zich, gezien de

afnames in spiermassa, wel degelijk manifesteren in de EDL, zijn er op eiwitniveau geen

significante upregulaties zichtbaar na testosteron deprivatie. De resultaten van de

eiwitexpressie in onze studie komen overeen met bevinden in verschillende andere

atrofiemodellen. Zo werd in een studie van Pires-Oliveira et al. 2012, tevens de eiwitexpressie

tussen verschillende testgroepen bestudeerd. Hierbij werd, in tegenstelling tot deze studie, de

expressie van het Atrogin-1 proteïne onderzocht. Ondanks significiante upregulaties op

genniveau, na orchidectomie, bleken ook hierbij geen verschillen te zijn opgetreden op

eiwitniveau.

47

In een studie van Doucet et al. 2007, bleken er significante upregulaties van Atrogin-1 en

MuRF-1 mRNA expressies te zijn opgetreden bij personen met COPD. Deze verschillen

zetten zich echter opnieuw niet door op eiwitniveau. Pires-Oliveira merkte in de

androgeengevoelige Levator Ani echter wel significant overexpressies van atrofie-

inducerende proteïnen op. Zo bleek na 30 dagen orchidectomie, de Atrogin-1 proteïne

concentratie verdrievoudigd te zijn. Testosteronsuppletie kon deze upregulatie na

orchidectomie tegenhouden. Het onderzoeken van zowel verschillen in mRNA expressie,

alsook in eiwitexpressie van atrofie-regulators is een meerwaarde voor de studie. Op deze

manier kan immers bepaald worden of, en zo ja, welke genexpressie juist een bepaalt proteïne

kan activeren of inhiberen. Aangezien er uitsluitend gestegen expressies zijn gevonden op

genniveau en niet op eiwitniveau, kan gesuggereerd worden dat de stabiliteit van het protëine

gereduceerd is (Drummond et al. 2008), of dat de mRNA translatie van de atrogenen

geïnhibeerd werd door MicroRNA’s. Deze post-transcriptionele regulators van genexpressies

oefenen hun functie uit door basevorming met complementaire sequenties in de mRNA

molecules (Janas et al. 2012; Eulalio et al. 2009). Drummond et al. 2008, toonde aan dat er

een verhoogde miRNA expressie is in de skeletspieren (cfr. Levator Ani). Bovendien kan een

acute anabole stimulus, zoals testosteronsuppletie, de miRNA expressie beïnvloeden. Er

wordt gesuggereerd dat microRNA’s zich richten op de transcripties die verantwoordelijk zijn

voor de skeletale spierkarakteristieken die ontstaan na een anabole stimulus, zoals spiergroei-

of afbraak (MuRF-1, Myostatine) en satellietcelfunctie.

48

5.9 Besluit Met deze studie wordt aangetoond dat orchidectomie een significante daling veroorzaakt in

spiermassa van zowel SOL als ELD, maar dat deze niet geassocieerd is met verhoogde

genexpressies van Atrogin-1, MuRF-1 en Myostatine, ondanks kleine transiënte

veranderingen in mRNA levels. In het LA/BC complex kan testosteron suppletie snel en

efficiënt de expressies van ubiquitine ligases Atrogin-1 en MuRF-1 onderdrukken, hetgeen

noodzakelijk is opdat het zijn anabole effecten, als mannelijke geslachtshormoon, op

spiermassa bewerkstelligt. Bijgevolg is een deprivatie van androgenen, als gevolg van

veroudering, hypoganadisme of cachexie, daardoor een bepalende factor in het verlies van

spiermassa door een upregulatie van het ubiquitine-proteasoom systeem te induceren. De

hoge androgeengevoeligheid van het LA/BC complex maakt dat deze biopten van de muizen,

niet als een goed model kunnen fungeren om het atrofieproces te onderzoeken en te

beschrijven voor locomotorische spieren. Er zijn immers belangrijke verschillen zichtbaar

tussen enerzijds LA/BC en anderzijds EDL en SOL. Echter, aangezien er in onze studie in de

EDL geen verschillen waren opgetreden op eiwitniveau en bijgevolg hierbij de functionaliteit

van de upregulatie van de atrogenen niet bewezen kan worden, kan er alsnog geopteerd

worden om het LA/BC complex te gebruiken als model. Omwille van zijn grotere

androgeengevoeligheid en de uitgesproken effecten op zowel spier- als genniveau kan

gesuggereerd worden dat dit zich op eiwitniveau zal uiten in een upregulatie van de

onderzochte ubiquitine ligases. Hierdoor kan het belang van de gestegen genexpressies in het

atrofieproces aangetoond worden. Ondanks de effectiviteit van testosteronsuppletie ter

inhibitie van atrofie-signaalwegen werd in deze studie geen rekening gehouden met de

hypertrofie-signaalweg. Zo kan er een mogelijke upregulatie, ten gevolge van de anabole

effecten van testosteron, optreden in mRNA expressie van regulators in hypertrofie

signaalweg, zoals Akt of PI3K. Verder onderzoek is bijgevolg nodig om de invloed van

testosteron op de interactie tussen de atrofie- en hypertrofie pathways te bepalen.

49

6. Referentielijst - Adams, Volker, Link, A., Gielen, S. et al. (2008) Modulation of Murf-1 and MAFbx

expression in the myocardium by physical exercise training. European Journal of

Cardiovascular Prevention and Rehabilitation, 15, 293-299

- Antonio, J., Wilson, J.D., George, F.W. et al. (1999) Effects of castration and androgen

treatment on androgen-receptor levels in rat skeletal muscles. Journal of Applied Physiology,

87, 2016-2019

- Astrand I, Astrand P.O., Hallback, I. et al. (1973) Reduction in maximal oxygen uptake with

age. Journal of Applied Psychology, 35(5), 649-654

- Axell, A.M., MacLean, H.E., Plant, D. et al. (2006) Continuous testosterone administration

prevents skeletal muscle atrophy and enhances resistance to fatigue in orchidectomized male

mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 291, 506-516

- Bain, J. Testosterone and the aging male: To treat or not to treat? (2010) Maturitas, 66(1),

16-22

- Balagopal, P., Olney, R., Darmaun, D. et al. (2005) Oxandrolone enhances skeletal muscle

myosin synthesis and alters global gene expression profile in Duchenne muscular dystrophy.

American Journal of Physiologie-Endocrinology and Metabolism, 290, 530-539

- Balhara, B., Misra, M. Levitsky, L. (2002) Recombinant Human IGF-1 (Insulin-Like

Growth Factor) Therapy: Where Do We Stand Today? Indian Journal of Pediatrics, 79, 244-

249

- Baracos, V.E. (2001) Management of muscle wasting in cancer-associated cachexia:

understanding gained form experimental studies. Cancer, 95(6), 1669-1677

- Barros, R.P.A., Machado, U.F., Warner. M. et al. (2006) Muscle GLUT4 regulation by

estrogen receptors ER beta and ER alpha. Proceedings of the national academy of sciences of

the united states of America, 103, 1605-1608

- Bartoli, M. and Richard, I. Calpains in muscle wasting. (2005) International Journal of

Biochemistry & Cell Biology, 37, 2115-2133

- Bhasin, S. and Jasuja, R. (2009) Selective androgen receptor modulators as function

promoting therapies. Current opinion in clinical nutrition and metabolic care, 12, 232-240

- Bhasin, S. et al. (2006) Drug Insight: testosterone and selective androgen receptor

modulators as anabolic therapies for chronic illness and aging. Nature Clinical Practice

Endocrinology & Metabolism, 2(3), 146-159

50

- Bhasin, S., Storer, T.W., Berman, N. et al. (1997) Testosterone replacement increases fat-free

mass and muscle size in hypogonadal men. Endocrinology & Metabolism, 82, 407-413

- Bhasin, S., Woodhouse, L., Singh, A.B. et al. (2005) Older men are as responsive as young

men to the anabolic effects of graded doses of testosterone on the skeletal muscle. The

Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 90(2), 678-688

- Bischoff, H.A., Stahelin, H.B., Dick, W. et al. (2003) Effects of vitamin D and calcium

supplementation on falls: A randomized controlled trial. Journal of Bone and Mineral

Research, 18, 343-351

- Bodine, S.C., Latres, E., Baumhueter, S. et al. (2001) Identification of ubiquitin ligases

required for skeletal muscle atrophy. Science, 294, 1704-1708

- Bonaldo, P. and Sandri, M. (2013) Cellular and molecular mechanisms of muscle atrophy.

Disease Models & Mechanisms, 6, 25-39

- Ceglia, L. (2008) Vitamin D and skeletal muscle tissue and function. Molecular Aspects of

Medicine, 29, 407-414

- Ciechanover, A. and Schartz, A.L. (2002) Ubiquitin-mediated degradation of cellular

proteins in health and disease. Hepatology, 35, 3-6

- Coggan, A.R., Spina, R.J., King, D.S. et al. (1992) Skeletal-muscle adaptations to endurance

training in 60-year old to 70-year old men and women. Journal of Applied Physiology, 72,

1780-1786

- Coviello, A.D., Kaplan, B., Lakshama, K.M. et al. (2008) Effects of graded doses of

testosterone on erythropoiesis in healthy young and older men. Journal of Clinical

Endocrinology & Metabolism, 93, 914-919

- Deldicque, L., Crassous, B., Koulmann, N. et al. (2005) Effects of creatine supplementation

on the time-course recovery of skeletal muscle regeneration after extensive damage. Science

& Sports, 20, 187-189

- Deslypere, J.P., Young, M., Wilson, J.D. et al. (1992) Testosterone and 5-alpha-

dihydrostestosterone interact differently with the androgen receptor to enhance transcription

of the MMTV-CAT reporter gene. Molecular and cellular endocrinology, 88, 15-22

- Deval, D., Mordier, S., Obled, C. et al. (2001) Identification of cathepsin L as a differentially

expressed message associated with skeletal muscle wasting, Biochemical Journal, 360, 143-

150

- Doherty, T.J., Vandervoort, A.A., Brown, W.F. (1993) Effects of aging on the motor unit – a

brief review. Canadian Journal of Applied Physiology, 18, 331-358

51

- Doucet, M., Russell, A., Leger, B. et al. (2007) Muscle atrophy and hypertrophy signaling in

patients with chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and

Critical Care Medicine, 176, 261-269

- Drummond, M., McCarthy, J.J., Fry, C.S. et al. (2008) Aging differentially affects human

skeletal muscle microRNA expression at rest and after an anabolic stimulus of resistance

exercise and essential amino acids. American Journal of Physiology-Endocrinology and

Metabolism, 295, 1333-1340

- Emery, A. (2002) Muscular dystrophy into the new millennium. Neuromuscular Disorders,

12, 343-349

- Eulalio, A. Huntzinger, E., Nishihare, T. et al. (2008) Deadenylation is a widespread effect of

miRNA regulation. RNA- a Publication of the RNA Society, 15, 21-32

- Evans, W.J, Morley JE, Argiles J, et al. (2008) Cachexia: a new definition. The American

Journal of Clinical Nutrition 7(6),793-799.

- Evans, W.J. (2010) Skeletal muscle loss: cachexia, sarcopenia, and inactivity. The American

Journal of Clinical Nutrition, 91, 1123-1127

- Faulkner, S., John, A., Dennis, R. et al. (2007) Age-related changes in the structure and

function of skeletal muscles. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 34,

1091-1096

- Ferrando, A.A., Sheffield-Moore, M., Wolf, S.E. et al. (2001) Testosterone administration in

severe burns ameliorates muscle catabolism. Critical Care Medicine, 29, 1936-1942

- Foletta, V.C., White, L.J., Larsen, A.E. et al. (2011) The role and regulation of

MAFbx/atrogin-1 and MuRF1 in skeletal muscle atrophy. Pflugers Archiv-European Journal

of Physiology, 461, 325-355

- Gaugler, M., Brown, A.L., Merrell, E. et al. (2011) PKB signaling and atrogene expression in

skeletal muscle of aged mice. Journal of Applied Physiologie, 111, 192-199

- Glass, D. (2005) Skeletal muscle hypertrophy and atrophy signaling pathways. International

Journal of Biochemistry & Cell Biology, 37, 1974-1984

- Glass, D. and Roubenoff, R. (2010) Recent advances in the biology and therapy of muscle

wasting. Annals of the New York Academy of Sciences, 1211, 25-36

- Gold, J., Batterham, M.J., Rekers, H. et al. (2006) Effects of nandrolone decanoate compared

with placebo or testosterone on HIV-associated wasting. HIV Medicine, 7, 146-155

- Goldpsing, G. (1999) Molecular and cellular studies of the influence of activity on the

maintenance of skeletal and cardiac muscle in relation to general health. Exercise for

Preventing Common Diseases, 1, 3-13

52

- Gomes, M.D., Lecker, S.H., Jagoe, R.T., et al. (2001) Atrogin-1, a muscle-specific F-box

protein highly expressed during muscle atrophy. Proceedings of the national academy of

sciences of the United States of America, 98, 14440-14445

- Goulet, O. (1998) Assessment of nutritional status in clinic practice. Baillieres Clinical

Gastroenterology, 12, 647-669

- Greenlund, L.J.S. and Nair, K.S. (2003) Sarcopenia consequences, mechanisms, and

potential therapies. Mechanisms of ageing and development, 124(4), 287-299

- Hikim, I.S., Artaza, J., Woudhouse, L. et al. (2002) Testosterone-induced increase in muscle

size in healthy young men is associated with muscle fiber hypertrophy. Am Journal of

Physiology Endocrinology Metabalism, 283, 154-164

- Huang , D.T., Schulman, B.A., Hunt, H.W. (2007) Structural insights into ubiquitin-like

protein transfer cascades. Febs Journal, 274, 61

- Hughes, V.A., Frontera, W.R., Roubenoff, R. et al. (2002) Longitudinal changes in body

composition in older men and women: role of body weight change and physical activity.

American Journal of Clinical Nutrition, 76, 473-481

- Ibebunjo, C., Eash, J., Li, C. et al. (2011) Voluntary running, skeletal muscle gene

expression, and signaling inversely regulated by orchidectomy and testosterone replacement.

American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 300, 327-340

- Janas, M.M., Wang, E., Love, T. et al. (2012) Reduced Expression of Ribosomal Proteins

Relieves MicroRNA-Mediated Repression. Molecular Cell, 46, 171-186

- Jiang, B. and Klueber, K.M. (1989) Structural and functional analysis of murine skeletal

muscle after castration. Muscle, & Nerve, 12, 67-77.

- Jiao, Q., Pruznak, A.M., Huber, D. et al. (2009) Castration differentially alters basal and

leucine-stimulated tissue protein synthesis in skeletal muscle and adipose tissue. American

Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 297, 1222-1232

- Johansen, K.L., Painter, P.L.; Sakkas, G.K. et al. (2006) Effects of resistance exercise

training and nandrolone decanoate on body composition and muscle function among patients

who receive hemodialysis: A randomized, controlled trial. Journal of the American society of

nephrology, 17(8), 2307-2314

- Kadi, F. (2008) Cellular and molecular mechanisms responsible for the action of testosterone

on human skeletal muscle. A basis for illegal performance enhancement. British journal of

Pharmacology, 154, 522-528

- Lee, S.J. (2001) Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proceedings of the

national academy of sciences of the united states of America, 98, 9306-9311

http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=WOS&search_mode=GeneralSearch&qid=30&SID=N1EgM4O7d7omL@9KK6N&page=1&doc=1&cacheurlFromRightClick=no



53

- Lynch, G.S. and Ryall, J.G. (2008) The potential and the pitfalls of beta-adrenoceptor

agonists for the management of skeletal muscle wasting. Pharmacology & Therapeutics, 120,

219-232

- MacLean, H.E., Chiu, W.S.M, Notini, A.J. et al. (2008) Impaired skeletal muscle

development and function in male, but not female, genomic androgen receptor knockout

mice. Faseb Journal, 8, 2676-2689

- Mammucari, C., Milan, G., Romanello, V. et al. (2007) FoxO3 controls autophagy in skeletal

muscle in vivo. Cell Metabolism, 6, 458-471

- Martini H.M. and Bartholomew E.F. (2008) Anatomie en Fysiologie, een inleiding, 4e ed.,

388-393. Amsterdam, Pearson Eductation Belelux.

- Marzetti, E., Lawler, J. Hiona, A. et al. (2008) Modulation of age-induced apoptotic

signaling and cellular remodeling by exercise and calorie restriction. in skeletal muscle. Free

Radical Biology and Medicine, 44, 160-168

- Mauras, N., Hayes, V., Welch, S. et al. (1998) Testosterone deficiency in young men:

Marked alterations in whole body protein kinetics, strength, and adiposity. Journal of

Clinical Endocrinology & Metabolism, 83, 1886-1892

- Maures, N., Hayes, V., Welch, S. et al. (1998) Testosterone deficiency in young men:

Marked alterations in whole body protein kinetics, strength, and adiposity. Journal of


- McFarlane, C., Mouly, V., Butler-Browne, G. (2011) Myostatin promotes the wasting of

human myoblast cultures through promoting ubiquitin-proteasome pathway-mediated loss of

sarcomeric proteins. American Journal of Physiology-Cell Physiology, 301, 1316-1324

- McFarlane, C., Plummer, E., Thomas, M. et al. (2006) Myostatin induces cachexia by

activating the ubiquitin proteolytic system through an NF-kappa B-independent, FoxO1-

dependent mechanism. Journal of cellular Physiology, 209, 501-514

- Mendler, L., Baka, Z., Kovacs-Simon, A. et al. (2007) Androgens negatively regulate

myostatin expression in an androgen-dependent skeletal muscle. Biochemical and

Biophysical Research Communications, 361, 237-242

- Mercuri, E. and Muntoni, F. (2013) Muscular dystrophies. Lancet, 381, 845-860

- Midzak, A. and Zirkin, B. (2008) Metabolic control of steroidogenesis and implications for

aging in the brown Norway rat Leydig cel. Biology of reproduction, 125, 82-83

- Min, K., Smuder, A.J., Powers, S.K. et al. (2012) Mitochondrial-targeted antioxidants protect

skeletal muscle against immobilization-induced muscle atrophy. Journal of Applied

Physiology, 111, 1459-1466

http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=WOS&search_mode=GeneralSearch&qid=56&SID=Q2h3DM714hih4dC69M5&page=1&doc=1&cacheurlFromRightClick=no


http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=WOS&search_mode=GeneralSearch&qid=25&SID=V2CjmfnkOlM8inpF5fn&page=1&doc=1&cacheurlFromRightClick=no



54

- Mitchel, P.O. and Pavlath, G.K. (2004) Skeletal muscle atrophy leads to loss and dysfunction

of muscle precursor cells. American Journal of Physiology, 287, 1753–1762

- Mizushima, N.Y., Yamamoto, A., Matsui, M. et al. (2004) In vivo analysis of autophagy in

response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome

marker. Molecular Biology of the Cell, 15, 1101-111

- Monks, D.A., O’Bryant, E.L., Jordan, C.L. et al. (2004) Androgen receptor immunoreactivity

in skeletal muscle: Enrichment at the neuromuscular junction. Journal of Comparative

Neurology, 473, 59-72

- Montori, V.M., Fernandez-Balsells, MM., Murad, M.H. et al. (2010) Adverse Effects of

Testosterone Therapy in Adult Men: A Systematic Review and Meta-Analysis. Journal of


- Morris, C.A., Morris, L. Jiang, L. et al. (2007) Mediation of testosterone action in muscle by

growth hormone IGF-1signaling. Faseb Journal, 21, 947-952

- Moss, F.P. and Leblond, C.P. (1971) Satellite cells as source of nuclei in muscles of growing

rats. The Anatomical Record, 170, 421-435

- Mujika, I., Padilla, S. (2000) Loss of training-induced physiological and performance

adaptations. Part I Short term insufficient training stimulus. Sports Medicine, 30, 79-87

- Nakashimi,, K. and Yakabe, Y. (2007) AMPK activation stimulates myofibrillar protein

degradation and expression of atrophy-related ubiquitin ligases by increasing FOXO

transcription factors in C2C12 myotubes. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 71,

1650-1656

- Nelson, L.R. and Bulun, S.E. (1999) Estrogen production and action. Journal of the

American academie of dermatology, 45, 116-124

- Pires-Oliveira, M. et al. (2012) Testosterone represses ubiquitin ligases atrogin-1 and Murf-1

expression in an androgen-sensitive rat skeletal muscle in vivo. Journal of Applied

Physiology 108: 266–273

- Pires-Oliveira, M., Gomes, M.D., Godinho, R.O. et al. (2010) Testosterone represses

ubiquitin ligases Atrogin-1 and MuRF1 expression in an androgen-sensitive rat skeletal

muscle in vivo. Journal of Applied Physiology. 108, 266-273.

- Poehlman et al. (1995) Sarcopenia in aging humans: the impact of menopause and disease.

Journals of gerontology, 50, 73-77

- Powers, S.K., Ashley, J., David, S. et al. (2011) Mechanistic links between oxidative stress

and disuse muscle atrophy. Antioxidants & Redox Signaling, 15, 2519-2528




55

- Pupim, L.B., Flakoll, P.J. Yu, C. et al. (2005) Recombinant human growth hormone

improves muscle amino acid uptake and whole-body protein metabolism in chronic

hemodialysis patients. American Journal of Clinical Nutrition, 82, 1235-1243

- Qin, W., Pan, J., Wu, Y. et al. (2010) Protection against dexamethasone-induced muscle

atrophy is related to modulation by testosterone of FOXO1 and PGC-1 alpha. Biochemical

and Biophysical Research Communications, 403, 473-478.

- Rogerson, S., Weatherby, R.P., Deakin, G. et al. (2007) The effect of short-term use of

testosterone enanthate on muscular strength and power in healthy young men. Journal of

strength and conditioning research, 21, 354-361

- Rommel, C., Bodine, S.C., Clarke, B.A. et al. (2001) Mediation of IGF-1-induced skeletal

myotube hypertrophy by PI(3)K/Akt/mTOR and PI(3)K/Akt/GSK3 pathways. Nature Cell

Biology, 11, 1009-1013

- Rowe, R.W. (1968) Effect of castration on muscle growth in mouse. Journal of experimental

zoology, 169, 59-64

- Sacheck, J.M., Ohtsuka, A., McLary, SC. et al. (2004) IGF-I stimulates muscle growth by

suppressing protein breakdown and expression of atrophy-related ubiquitin ligases, atrogin-1

and MuRF1. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 287, 591-601

- Sandri, M. (2008) Signaling in Muscle Atrophy and Hypertrophy. Physiology, 2, 160-170

- Sar, M., Lubahn, D.B., French, F.S., et al. (1990) Immunohistochemical localization of the

androgen receptor in rat and human tissues. Endocrinology, 127, 3180-3186

- Serra, C., Bhasin, S., Tangherlini, F. et al. (2011) The role of GH and IGF-I in mediating

anabolic effects of testosterone on androgen-responsive muscle. Endocrinology. 152, 193-

206

- Smith, K., Reynolgs, N., Downie, S. et al. (1998) Effects of flooding amino acids on

incorporation of labeled amino acids into human muscle protein. American Journal of

Physiology - Endocrinology and Metabolism, 275, 73-78

- Snyder, P.J., Peachey, H., Hannoush, P. et al. (1999) Effect of testosterone treatment on body

composition and muscle strength in men over 65 years of age. Journal of Clinical

Endocrinology & Metabolism, 84, 2647-2653

- Sorensen, M.B., Rosenfalck, A.M., Hojgaard, L. and Ottesen, B. (2001) Obesity and

sercopenia after menopause are reversed by sex hormone replacement therapy. Obesity

Research, 9, 622-626

56

- Stevenson E.J., Giresi P.G., Koncarevic. A, Kandarian S.C. (2003) Global analysis of gene

expression patterns during disuse atrophy in rat skeletal muscle. The Journal of Physiology,

551, 33-48

- Sugawara, T., Ito, Y., Nishizawa, N. et al. (2007) Supplementation with dietary leucine to a

protein-deficient diet suppresses myofibrillar protein degradation in rats. Journal of

Nutritional Science and Vitaminology, 53, 552-555

- Sugden, P. (1991) Regulation of protein turnover in skeletal and cardiac muscle. Biometrical

Journal, 273, 21-37

- Svensson , J., Windah, S., Swanson, C. (2010) Stimulation of both estrogen and androgen

receptors maintains skeletal muscle mass in gonadectomized male mice but mainly via

different pathways. Journal of Molecular Endrocinology. 45, 45-57.

- Thomas, D. (2007) Loss of skeletal muscle mass in aging: examining the relationship of

starvation. Sarcopenie and cachexia. Clinical Nutrition, 26(4), 389-99

- Tingus, S.J. & Carlsen, R.C. (1993) Effects of continious infusion of an anabolic steroid on

murine skeletal muscle. Medicine and Science in Sports and Exercise, 25, 485-494

- Trollet, C., Seno, M., Ghahramani, G. et al. (2008) RNAi-mediated knockdown of dystrophin

expression in adult mice does not lead to overt muscular dystrophy pathology. Human

Molecular Genetics, 17, 2622-2632

- Turinsky, J. and Damrau-Abney, A. (1999) Akt kinases and 2-deoxyglucose uptake in rat

skeletal muscles in vivo: study with insulin and exercise. American Journal of Physiology-

Regulatory Integrative And Comparative Physiology, 176, 277-282

- Urso, M. (2009) Regulation of muscle atrophy: wasting away from the outside in: an

introduction. Medicine & Science in Sports & Exercise, 41, 1856-1859

- Van den Beld, A.W., de Jong, F.H., Grobbee, D.E. et al. (2000) Measures of bioavailable

serum testosterone and estradiol and their relationships with muscle strength, bone density,

and body composition in elderly men. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 85,

3276-3282

- Vanderschueren D., Vandenput L., Boonen S., Van H.E., Swinnen J.V., Bouillon R. An aged

rat model of partial androgen deficiency: prevention of both loss of bone and lean body mass

by low-done androgen replacement. Endocrinology. 141(5): 1642-1647

- Vandesompele, J. et al. (2002) Accute normalization of real-time quantitative RT-PCR data

by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology, 3(7), 1-11.

- Vasconsuelo, A., Boland, R. Andra, M. et al. (2008) 17 beta-estradiol signaling in skeletal

muscle cells and its relationship to apoptosis. Steroids, 73, 859-863




57

- Vermaelen, M., Sirvent, P., Raynayld, F. et al. (2007) Differential localization of autolyzed

calpains 1 and 2 in slow and fast skeletal muscles in the early phase of atrophy. American

Journal of Physiology-cell Physiology, 292, 1723-1731

- White, J.P., Gao, S., Puppa, M.J. et al. (2013) Testosterone regulation of

Akt/mTORC1/FoxO3a signaling in skeletal muscle. Molecular and cellular endocrinology,

365, 174-186

- Williams, A.B., Decourten-Myers, G.M., Fischer, J.E. et al. (1999) Sepsis stimulates release

of myofilaments in skeletal muscle by a calcium-dependent mechanism. Faseb Journal,

13(11), 1435-1443

- Yin, H.N., Chai, J.K., Yu, Y.M. et al. (2009) Regulation of signaling pathways downstream

of IGF-I/insulin by androgen in skeletal muscle of glucocorticoid-treated rats. Journal of

Trauma-Injury Infection and Critical Care, 66, 1093-1090

- Yoshizawa, F., Kido, T., Nagasawa, T. Stimulative effect of dietary protein on the

phosphorylation of p70 S6 kinase in the skeletal muscle and liver of food-deprived rats.

Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 63, 1803-1805

- Zhang, P., Chen, X.P., Fan, M. (2007) Signaling mechanisms involved in disuse muscle

atrophy. Medical Hypotheses, 69, 310-321



De differentiële effecten van androgenen en oestrogenen op ......II. Abstract Doelstelling: in deze...

Documents

Transcript of De differentiële effecten van androgenen en oestrogenen op ......II. Abstract Doelstelling: in deze...