Van fysicochemische processen tot

de cel – deel II

Bachelor geneeskunde – academiejaar 2013-2014

1

Referentiekader opleiding geneeskunde

CanMEDS rollen

2

de 7 rollen van de arts

• Medisch deskundige

• Wetenschapper

• Communicator

• Samenwerker

• Manager

• Gezondheidsbevorderaar

• Professional

Van fysicochemische processen tot de cel

Situering in opleiding geneeskunde

3

Behoort tot de lijn „kennis en grondslagen van de geneeskunde‟

In 1e semester van 1e fase van de bachelor geneeskunde

Draagt bij aan CanMEDS rollen: Wetenschapper / Medisch deskundige / Communicator

Van fysicochemische processen tot de cel

Situering in opleiding geneeskunde

Verwante opleidingsonderdelen: Van cel naar weefsel: structuur & functie

Geïntegreerd metabolisme

Bereidt voor op orgaansystemen: ademhaling, nier, neuro, bloedsomloop…

4

Doelstellingen

5

Inzicht verschaffen in de grondslagen van de cellulaire

structuur en functie in het menselijk lichaam

Met klemtoon op fundamentele processen die in nagenoeg elk

celtype van het menselijk lichaam voorkomen

Integreren van verschillende wetenschappelijke disciplines

Chemie, biologie, fysica, histologie, biochemie, genetica, fysiologie…

Aandacht voor de wisselwerking tussen structuur en functie.

Aanbrengen van translationeel denken door celbiologische

inzichten in een medische context te plaatsen.

Begrijpen van ziektemechanismen: mutaties, toxines, virussen…

Ontwikkeling en werkingsmechanisme van geneesmiddelen

Kennismaking met de wetenschappelijke methode

Didactisch team

6

Jan

Eggermont

Thomas

Voets

Rudi

Vennekens

Peter

Vangheluwe

Valerie

Van Emelen

hoorcolleges

werkzittingen

monitoraat

Studiemateriaal

7

Handboeken Becker‟s World of the Cell, 8th edition (Pearson) Cellular Physiology and Neurophysiology, 2nd edition (Elsevier Mosby)

Syllabus: Illustraties bij de hoorcolleges van TV en JE Uitgegeven door Medica

Indien extra slides in hoorcollege verspreiding via Toledo

Toledo: elektronisch leerplatform van K.U.Leuven Bijkomende illustraties, voorbeelden

Discussiefora

Link naar monitoraat

Praktische aankondigingen

8

activiteit docent datum hoofdstuk onderwerp

HC-1 JE 24/sep 4 cellen en organellen: algemene eigenschappen van cellen

HC-2 JE 27/sep 4 cellen en organellen: de opbouw van een eukaryote cel

HC-3 JE 30/sep 7 membranen: structuur en functie

HC-4 JE 1/okt 7 membranen: membraanlipiden

HC-5 JE 7/okt 7 membranen: membraaneiwitten

WZ-1 JE 8/okt 7 intro: structuur en functie van membranen

HC-6 TV 11/okt 8 membraantransport: eenvoudige diffusie

HC-7 TV 14/okt 8 membraantransport: osmose

HC-8 TV 15/okt 8 membraantransport: energetische aspecten van transmembranair transport

HC-9 JE 16/okt 8 membraantransport: gefaciliteerde diffusie

HC-10 JE 18/okt 8 membraantransport: actief transport

WZ-2 JE/PVG 22/okt 7/8 responsie: structuur en functie van membranen / intro: transmembranair transport

HC-11 JE 25/okt 12 endomembraan: endoplasmatisch reticulum en Golgi apparaat

HC-12 JE 28/okt 12 secretorische route: modificering en sortering van eiwitten

HC-13 JE 29/okt 12 endocytotische route: sortering en vertering van eiwitten

HC-14 JE 4/nov 12 vesiculair transport

WZ-3 PVG/PVG 5/nov 8/12 responsie: transmembranair transport / intro: secretorische en endocytotische route

HC-15 TV 8/nov 13 signaaltransductie in prikkelbare cellen: de cel als elektrisch circuit

HC-16 TV 12/nov 13 signaaltransductie in prikkelbare cellen: selectiviteit en schakeling van ionenkanalen

HC-17 TV 15/nov 13 signaaltransductie in prikkelbare cellen: spanningsgeschakelde ionenkanalen en de actiepotentiaal

HC-18 TV 18/nov 13 signaaltransductie in prikkelbare cellen: voortgeleiding en modulatie van de actiepotentiaal

WZ-4 PVG/RV 19/nov 12/13 responsie: secretorische en endocytotische route / intro: prikkelbaarheid

HC-19 JE 22/nov 13 signaaltransductie in prikkelbare cellen: synaptische communicatie

HC-20 JE 25/nov 14 signaaltransductie: signaalmoleculen en receptoren

HC-21 JE 26/nov 14 signaaltransductie: GPCR & signaaltransductie via cAMP

HC-22 JE 29/nov 14 signaaltransductie: GPCR & signaaltransductie via IP3 en DAG

HC-23 JE 2/dec 14 signaaltransductie: proteïnekinase-geassocieerde receptoren

WZ-5 RV/PVG 3/dec 13/14 responsie: prikkelbaarheid / intro: signaaltransductie

HC-24 JE 6/dec 15 cytoskelet: microtubuli

HC-25 JE 9/dec 15 cytoskelet: actinefilamenten en intermediare filamenten

HC-26 JE 10/dec 16 beweging: kinsesine en dyneine motoren

HC-27 JE 13/dec 16 beweging: myosine motor en sarcomeer

WZ-6 PVG 16/dec 14 responsie: signaaltransductie

HC-28 JE/TV 17/dec 16 herhalingsles

Werkzittingen

9

Werkzittingen Structuur en functie van membranen Jan Eggermont

Transmembranair transport Peter Vangheluwe

Secretorische/endocytotische route Peter Vangheluwe

Prikkelbaarheid Rudi Vennekens

Signaaltransductie Peter Vangheluwe

Wat? Voorbeelden

Toepassingen

Gelegenheid tot vragen stellen

Studiemateriaal via Toledo

Helpdesk

10

Vragen stellen aan docenten

Tijdens of na het hoorcollege

Monitoraat: Valerie Van Emelen

Afspraak maken bij monitor: zie Toledo

Discussieforum op Toledo

Opvolging door studenten en docent

Examen

11

Geïntegreerd meerkeuzevraag examen

50 vragen

Leerstof verwerkt doorheen alle vragen

Meerkeuzevragen

Voor elke vraag is er slechts 1 correct antwoord.

Keuze tussen 4 antwoordmogelijkheden

Quotering:

Correct antwoord: +1

Fout antwoord: -0.33

Geen antwoord: 0

Goede afspraken maken goede vrienden

12

We beginnen stipt op tijd.

We zitten neer bij het aanvangsuur van het hoorcollege.

Een aula is geen cafetaria.

Blikjes, andere dranken, wafels enz zijn uit den boze.

Spreken mag, maar na het vragen van het woord.

Bij problemen, steek de hand op.

Tijdens het hoorcollege concentreren we ons op de

leerstof.

Cellen en organellen (BWC4)

1. Eigenschappen en strategieën van cellen

13

Eigenschappen en strategieën

van cellen

Essentiële vraag

Hoe functioneren cellen in hun

specifieke context?

Antwoord

Door variaties in algemene

karakteristieken

Complexiteit van organisatie

Moleculaire componenten

Grootte en vorm

Specialisatie

14 Figure 1-1

Indeling van cellen in functie van

organisatie en functie

15

Fundamenteel verschillende types van cellulaire

organisatie

Morfologisch

Moleculair

Functioneel

Klassieke indeling: prokaryoten eukaryoten

Op basis van aan/afwezigheid van membraanomgeven kern

Huidige indeling: bacteria archaea eukarya

Celbiologie

Prokaryoot Eukaryoot

Fig 4-3

Fig 4-5

16

Probleem: te simpele indeling

• Te sterke nadruk op morfologische karakteristiek: +/- kern

• Houdt geen rekening met moleculaire/functionele diversiteit van prokaryoten

Huidige indeling in 3 domeinen

Bacteria Archaea Eukarya

17

3 domeinen ifv vorm, moleculaire samenstelling, functie

Evolutionaire verwantschap: gemeenschappelijke voorouder: “oercel”

Bacteria Archaea Eukarya

Vorm Klein, geen kern Klein, geen kern Groot met kern

Voorbeelden Klassieke bacteriën:

- Escherichia coli

- Pseudomonas

- …

Extreme levensvormen:

- Methanogenen

- Halofielen

- Thermofielen

Planten, gisten,

dieren

18

Algemene eigenschap: celgrootte

19

Variaties in celgrootte: mmeter schaal

Bacteria/archaea

Uitersten: tot 0,2 mm

Eukarya

Uitersten: neuronen met meter(s)lange axonen

1 mm 100 mm 5 mm 10 mm

Waarom beperking in celgrootte?

20

Waarom is mmeter schaal ideaal voor cellulaire functie?

Oppervlakte/volume verhouding capaciteit van membraantransport

Diffusiesnelheid van moleculen verspreiding in de cel

Voldoende hoge concentraties van moleculen snelheid van enzymatische reacties

Oppervlakte/volume verhouding

21

Volume van cel

Hoe groter de cel, des te meer moleculen uitgewisseld moeten

worden: opname en afgave van ionen, glucose, AZ,…

Oppervlakte van de cel

Bepaalt de transportcapaciteit voor uitwisseling met de

extracellulaire ruimte

Grotere cel kleinere oppervlakte/volume verhouding

Dus proportioneel kleinere transportcapaciteit in vergelijking

met de cellulaire nood

Figure 4-1 Unlabeled

22

Figure 4-1 Labeled

23

Figure 4-2 Labeled

Q: hoe capaciteit van membraantransport vergroten?

A: vergroten van membraanoppervlak door uitstulpingen

Microvilli in cellen met absorptiefunctie: darmepitheel, nierepitheel, ….

24

Diffusiesnelheid van moleculen

25

Moleculen in cytoplasma bewegen door diffusie

Passief proces: van hoge naar lage concentratie

Willekeurig in 3 dimensies

Hoe groter de afstand, des te groter de diffusietijd

t=𝑥2

2𝐷

t = diffusietijd

x = lineaire diffusieafstand (in 1 dimensie)

D = diffusiecoëfficient (bepaald door MW)

Lengte (mm) 10 20

Afstand tot centrum (mm) 5 10

Dglucose 5 X 10-6 cm2/s 5 X 10-6 cm2/s

Diffusietijd (ms) 25 100

x2

x4

Behouden van voldoende hoge concentraties

26

Snelheid van enzymatische reactie

Concentratie aan reagentia

Concentratie aan enzyme

bepaalt kans op succesvolle binding van R aan E

Lengte (mm) 10 20

Volume (mm3) 1000 8000

Concentratie (mM) 5 5

Aantal nmol 5 40

x2

x8

Figure 4-5

Q: hoe concentraties in stand houden bij grotere celvolumes?

A: compartimentalisering van cel dmv organellen lokale domeinen met hoge

concentraties van ionen, enzymen, … functionele specialisatie

pH 4,5

Ca2+ 1 mM

27

Verschillen tussen bacteria, archaea en

eukarya

28

Bacteria Eukarya

29

Bacteria

- Geen membraanomgeven kern

- DNA nucleoid; geen histonen

- Expressie: geen RNA processing

Eukarya

- Membraanomgeven kern

- DNA chromosomen; histonen

- Expressie: RNA processing

Figure 4-5 Figure 4-3

Bacteria Eukarya

30

Bacterie

- Geen organellen

Eukarya

- Organellen: endoplasmatisch

reticulum, Golgi, lysosomen, …

- functionele specialisatie

Figure 4-5 Figure 4-3

Bijkomende specifieke eigenschappen van

eukarya

31

Cytoskelet structuur en vorm van cel

- Microfilamenten (actine)

- Microtubuli

- Intermediaire filamenten

Vesiculair transport langsheen cytoskelet

- Transport tussen organellen

- Endocytose: opname van moleculen

- Exocytose: afgave van moleculen

Figure 4-7 Figure 4-23

Figure 2-20

Virus: structurele eigenschappen

32

Grootte: 25 tot 300 nm

Opbouw

Kern = genoom

DNA of RNA

Enkelstrengig of dubbelstrengig

Capside of eiwitmantel

Eén eiwit of verschillende types eiwitten

Optioneel: membraanenveloppe

Geen cytoplasma, geen organellen, geen

ribosomen

Figure 21 A1

Virus: infectieuze cyclus

pathogene eigenschappen

33

Binnendringen van gastcel

Specificiteit of tropisme

bepaalt ziektepatroon

Ontmanteling van virus

Replicatie van virale componenten

Via processen van gastcel

Assemblage van nieuwe viruspartikels

Vrijstelling van viruspartikels

Verspreiding naar andere cellen

Diversiteit in virussen

34

Grootte en vorm

Opbouw

DNA RNA; ss ds

Eiwitmantel: component(en)

Membraanenveloppe

Infectieuze cyclus

Gastcel

Bacterie, plant, dier, mens

Effect op gastcel

Lysis, …

Figure 4-26

Even filosoferen…

35

Leeft een virus?

Wie is het meest geëvolueerd: de mens of de bacteriën?

Welke voor- en nadelen hebben bacteriën in vergelijking

met een meercellige eukaryoot?

De mens bevat meer bacteriële cellen dan lichaamscellen.

Microbioom = het collectief genoom van micro-organismen die

in een bepaalde niche leven.

Het menselijk

microbioom

36

Cellen en organellen (BWC4)

2. Overzicht van een eukaryote cel

37

Indeling van eukaryote cel

Compartimentalisering van de cel

38

Plasmamembraan

Kern

Cytoplasma = interne volume

van cel behalve de kern

Cytosol

semifluide vloeistof

Organellen

compartimenten

met specifieke functies

Cytoskelet

Figure 4-5a

39

Figure 4-5a

Table 4-2

40

Plasmamembraan

41

Elke cel is omgeven door plasmamembraan

Grens tussen intracellulair en

extracellulair compartiment

Permeabiliteitsbarrière

Behoudt samenstelling van intracellulair

compartiment

Samenstelling:

Membraanlipiden

Membraaneiwitten

Figure 4-9a

42

Amfipathische moleculen

43

Figure 2-11 Figure 2-10

Figure 4-9

44

Samenstelling van plasmamembraan

(zie ook hoofdstuk 7)

Membraanlipiden Membraaneiwitten

45

Amfipathische moleculen

Spontane vorming van

lipidendubbellaag

Grote diversiteit

Amfipathisch (integrale

membraaneiwitten)

Functies

Signaaltransductie

Transport

Celadhesie

Metabolisme

Figure 2-12

Kern

(zie ook hoofdstuk 18)

46

Meest prominente structuur in eukaryote cel

Bevat DNA chromosomen chromatine

Omgeven door

kernenveloppe

Dubbele

membraan

Kernporien

Transport van

RNA, eiwitten

Nucleoli

rRNA synthese

Figure 4-10

47

Figure 4-10

Mitochondria

48

Aanwezig in alle eukaryote cellen ( tot > 100/cel)

Structuur

Dubbele membraan

Buitenste mitochondriale membraan

Binnenste mitochondriale membraan cristae (instulpingen)

Matrix = intern compartiment

Bevat circulair DNA, RNA, eiwitten

Expressie van beperkt aantal mitochondriale genen

Maar: meeste eiwitten geïmporteerd vanuit cytosol

Functie: synthese van ATP

Cellulaire ademhaling

Figure 4-11

49

Voordeel van cristae?

Variatie in aantal en locatie van

mitochondria

50

Figure 4-13 Figure 4-12

spermatozoön spiercel

Endosymbiont theorie

Oorsprong van mitochondria en chloroplast

51

Structurele gelijkenis met bacteriën

Grootte en vorm: 1 mm, langwerpig

Bevat circulair DNA zonder histonen

Gelijkaardige ribosomen: rRNA, eiwitten

Genexpressie

Endosymbiont theorie

Initieel: protoeukaryoot zonder mitochondria en chloroplasten

Fagocytose van bacteriën

Later: evolutie tot mitochondria en chloroplasten

Figure 11 A

Endoplasmatisch reticulum

52

Structuur

Netwerk verspreid over ganse cytoplasma

Omgeven door enkelvoudige membraan

Membraan continu met buitenste membraan van kernenveloppe

Lumen: interne ruimte omgeven door ER membraan

Twee functionele types

Ruw ER: bekleed met ribosomen

Synthese van membraaneiwitten en secretorische eiwitten

Glad ER: zonder ribosomen

Synthese van lipiden en steroiden

Detoxificatiereacties: inactivering van toxische stoffen,

Opslagplaats van Ca2+ signaaltransductie

Figure 4-15

53

Golgi apparaat

54

Structuur

Stapel van cisternae = platte vesikels met enkele membraan

Perinucleair gelegen

Onderverdeling in

Cis-, mediaal- en trans-Golgi

Functie

Onderdeel van secretorische route

Modificering van secretorische en membraaneiwitten

Voorbeeld: afwerken van glycosylering

Sortering van eiwitten in functie van bestemming:

plasmamembraan, endosomen, lysosomen

Figure 4-16 Labeled

55

Secretorische route

Ruw ER

Synthese van secretorische

en membraaneiwitten

Golgi complex

Modificatie van eiwitten

Sortering van eiwitten

Secretorische vesikels

Opslag en transport van

eiwitten

Plasmamembraan

Afgave van eiwitten

56

Figure 4-17

Lysosoom

57

Structuur

Vesikels met enkelvoudige membraan

Lumen

pH: 4,5

Bevat zure hydrolasen

Functie

Eindpunt van endocytotische en (auto)fagocytotische route

Afbraak van DNA, RNA, eiwitten, lipiden, suikers,…

Vrijstelling van afbraakproducten in cytosol

Figure 4-18

Peroxisoom

58

Structuur

Vesikels met enkele membraan

Lumen

Catalase: 2 H2O2 2 H2O + O2

Functie

Afbraak van H2O2

Oxidering van lange vetzuren

Afbraak van toxische producten

Figure 4-19

Cytoskelet

59

Driedimensioneel netwerk van „kabels‟

Microfilamenten actine

Microtubuli tubuline

Intermediaire filamenten desmine, keratine

Functie

Geeft vorm en stevigheid aan de cel

Kabels voor vesiculair transport

Kern- en celdeling: transport van chromosomen, dochtercellen

Cellulaire beweging van cel cilia,flagella

Contractie van spiercellen

Figure 4-23

Figure 4-24 Labeled

60

Microtubuli

Structuur

Holle cilinder opgebouwd uit 13

protofilamenten

Diameter 25 nm

Protofilament: seriële aaneenschakeling

van tubuline dimeren

Polariteit - dynamisch

Cellulaire structuren

Cilia, flagella

Delingsspoel

3D netwerk

centrum periferie

Figure 4-24

Figure 4-23

61

Microfilamenten

Structuur

Dubbelhelix van actinefilament (F-actine)

Diameter: 7 nm

F-actine: polymerisatie van actine

monomeren (G-actine)

Polariteit - dynamisch

Cellulaire structuren

Stress fibers

Corticaal cytoskelet (onder de

plasmamembraan)

Sarcomeer in spiercellen

Figure 4-24

Table 15-1

62

Intermediaire filamenten

63

Structuur

Kabel van 8 protofilamenten

Diameter: 8 – 12 nm

Protofilament: seriële aaneenschakeling

van tetrameren

Verschillende subtypes celtype

specifiek

Stabiele structuur

Cellulaire rol

“stelling” waaraan de ganse cel ophangt

Figure 4-24

Table 15-1

Membranen: structuur, functie en

samenstelling (BWC7)

3. Structuur en functie

64

Functies van membranen

65

Figure 7-2 Figure 7-1

Afbakening en permeabiliteitsbarrière

66

Figure 7-2

Figure 2-12

Afbakening Intra- versus extracellulair

Intracellulaire organellen

Permeabiliteitsbarrière Niet doorlaatbaar

voor hydrofiele en grote moleculen Ionen

Glucose, aminozuren,…

Eiwitten, DNA, RNA

Doorlaatbaar voor apolaire stoffen

Ontstaan van compartimenten met verschillende samenstelling (en dus functie) Ionen, metabolieten, eiwitten, DNA, RNA, …

Antimicrobiële peptiden

67

Wikipedia

Aangemaakt in huid, darm,

luchtwegen

Structuur

- peptiden: 10 à 50 AZ

- kationisch, amfipathisch

A B

Antimicrobiele peptiden

Werkingsmechanisme

68 Nature Reviews Microbiology 3, 238-250 (March 2005)

Subcellulaire localisering van specifieke

functies

69

Membranen bevatten

specifieke set van eiwitten

Plasmamembraan

ER membraan

…

Gevolg: specifieke functies

in organellen

ER: synthese fosfolipiden

Golgi: synthese sfingolipiden

Figure 7-2

Hoe ontstaat specifieke eiwitsamenstelling van membranen?

Transmembranair transport van moleculen

70

Permeabiliteitsbarrière

Lipidendubbellaag: niet doorlaatbaar voor hydrofiele en grote moleculen

Transportsystemen in membraan voor

Ionen: Na+, K+, Ca2+ …

Glucose, AZ, …

Eiwitten, DNA, RNA… Figure 7-2

Figure 2-12

Cellulaire communicatie

71

Cellulaire communicatie

Ontvangen en doorgeven

van signalen

Chemisch: hormonen, …

Elektrisch: zenuwimpuls

Signaaltransductie

Omzetten van extracellulair

signaal in cellulaire respons

Membraanreceptoren

binden van signaalmolecule

Resulteert in respons Figure 7-2

Celadhesie

72

Vasthechting aan

extracellulaire matrix

Binding aan collageen, …

Cel-cel interactie: adhesie

en communicatie

Tight junctions epitheel

Gap junctions hart

Adhesive junctions

Figure 7-2

Membraanstructuur

Observaties - 1

73

Selectieve permeabiliteit van membraan

- Apolaire stoffen gaan door membraan

- Polaire stoffen gaan niet door membraan

Elektronenmicroscopie van membraan

- Dikte: 6 a 8 nm

- Tramspoorpatroon

- 2 donkere, perifere lijnen

- Centrale heldere zone

Figure 7-4

Figure 7-3

Membraanstructuur

Observaties - 2

Samenstelling van membraan

- Basiscomponenten: lipiden en eiwitten

- Wisselende verhouding eiwitten/lipiden ifv type van membraan

74

Membraanstructuur

Observaties - 3

Laterale mobiliteit van lipiden en eiwitten in membraan

Fluïde natuur van membraan

Figure 7-11

75

Nota: fluïditeit lipiden >> fluïditeit eiwitten

Membraanstructuur

Fluid mosaic model (Singer & Nicolson)

76

Fluïde lipidendubbellaag: 6 a 8 nm

2 bladen van amfipathische lipiden

Cytosolisch blad

Exoplasmatisch blad

Centrale hydrofobe kern

Perifere polaire hoofdgroepen

Mozaiek van membraaneiwitten

Integrale membraaneiwitten

Transmembranair(e) segment(en): hydrofoob

Membraaneiwitten met vetanker

Perifere membraaneiwitten

Figure 7-5

Fluid mosaic model

Bouwstenen: membraanlipiden

77

Amfipathische structuur

Hydrofiel hoofd

Hydrofobe staart

Voorbeeld: fosfoglyceride

Glycerol ruggengraat

Hydrofobe staart: 2 vetzuurketens

Veresterd op C1 en C2 van glycerol

Hydrofiel hoofd

Negatief geladen fosfaat op C3

Bijkomende polaire elementen op P

Figure 2-11

Fluid mosaic model

Bouwstenen: integrale membraaneiwitten

78

Amfipathische structuur

Hydrofiele domeinen aan beide zijden

van de membraan

Exoplasmatisch domein: covalent

gebonden suikers

Hydrofoob domein ingebed in

lipidendubbellaag

1 of meerdere

transmembranaire a-helices

Structurele verankering in membraan

Functionele rol:

Vb: vorming van transmembranaire porie…

Figure 7-5

Fluid mosaic model

Eigenschappen

79

Spontane vorming van lipidendubbellaag

Zelfassociatie van amfipathische lipiden (cfr infra)

Drijvende kracht: hydrofobe interactie

Hydrofobe barrière

Centrale lipidendubbellaag

Fluïditeit

Laterale beweging van lipiden en eiwitten

Vorming van microdomeinen, vb lipid rafts

Specifieke associatie van lipiden en eiwitten

Figure 7-5

Spontane vorming van lipidendubbellaag

Niet-covalente zelf-associatie van lipiden

1-80

Laterale associatie van

hydrofobe staarten

Hydrofobe interactie

Laterale interacties tussen

hydrofiele hoofdjes

H-bruggen

Elektrostatische interacties

“ONS KENT ONS” Figure 2-11 Figure 2-12

Membranen: structuur, functie en

samenstelling (BWC7)

4. Membraanlipiden

81

Membraanlipiden

3 klassen

Basisstructuur: amfipathisch

Hydrofiel hoofd

Hydrofobe staart

3 klassen

Fosfolipiden

Hydrofiel hoofd bevat fosfaat

Meest frequente membraanlipide

Glycolipiden

Hydrofiel hoofd bevat suiker(s)

Sterolen

4-ring koolwaterstofstructuur

Figure 7-6

82

83

Figure 7-6

Fosfolipiden

Hydrofiel hoofd: fosfaat + …

Hydrofobe staart: VZ ketens

Grote moleculaire

diversiteit

Structuur van hoofd lading!

Lengte en saturatie van VZ

2 grote types ifv structuur

Fosfoglyceride: glycerol ruggengraat

Sfingomyeline: sfingosine als ruggengraat

Figure 7-6

84

85

Figure 7-6

Fosfoglyceriden

86

Glycerol ruggengraat

Hydrofobe staart: 2 VZ ketens

Veresterd op C1 en C2 van glycerol

Variatie in

Lengte: C14 C20

Verzadiging

Hydrofiel hoofd

Fosfaat veresterd op C3

Bijkomende restgroep: -P-O-R

Variatie in lading: neutraal of -

Figure 3-29

Wikipedia

Table 7-2 Labeled

87

Vetzuren in membraanlipiden

88

Hydrofobe onderdeel van fosfolipiden en glycolipiden

Verantwoordelijk voor hydrofobe barrière van membraan

Variatie in lengte bepalend voor dikte van membraan

C12 tot C20

Variatie in saturatie bepalend voor fluïditeit van membraan

Verzadigde VZ: dichte opeenstapeling

Onverzadigde VZ: slechte laterale stapeling

Figure 3-28

Table 3-5 Labeled

89

laurinezuur

myristinezuur

palmitinezuur

stearinezuur

palmitoleinezuur

oliezuur

linolzuur

arachidonzuur

linoleenzuur

verz

adig

d

onve

rzad

igd

Essentiële vetzuren

niet aangemaakt in lichaam voeding

90

Linolzuur

C18:2(w-6)

Linoleenzuur

C18:3(w-3)

Wikipedia

Sfingomyeline

91

Ruggengraat: sfingosine

Amino-alcohol

Hydrofobe staart

Alifatische keten van sfingosine

VZ: amidebinding op sfingosine

Lange keten: C18, C20

Verzadigde keten

Hydrofiel hoofd

-P-choline: veresterd op –OH van sfingosine

Figure 7-6

92

Figure 7-6

Diversiteit in fosfolipidensamenstelling van

membranen

93

Figure 7-7

Glycosfingolipiden

Ruggengraat: sfingosine

Hydrofobe staart Alifatische keten van sfingosine

VZ: amidebinding op sfingosine Lange keten: C18, C20

Verzadigde keten

Hydrofiel hoofd 1 of meerdere suikers op –OH van sfingosine

2 grote types ifv identiteit van suikerhoofdje Cerebroside 1 neutrale suiker, vb galactose

Ganglioside negatief geladen oligosaccharide

94

Figure 7-6

galactocerebroside

Opmerking: sfingolipiden = sfingomyeline + glycosfingolipiden

Sterolen cholesterol

95

Basis: 4-ring koolwater

stof structuur

Beperkt amfipathisch

Klein hydrofiel hoofdje: -OH

Vormt geen lipidendubbellaag op zich

Schuift in tussen fosfolipiden en glycolipiden

Vermindert de fluïditeit van membraan

Precursor voor steroidhormonen en galzouten

Figure 7-6

Figure 3-30 Labeled

96

97

Wikipedia

98

ergosterol cholesterol

nystatine

Wikipedia

Asymmetrische verdeling van lipiden

Verschillen tussen membranen: PM ER

1-99

95% GL

5% C

50%

GL

35%

C

15% SL

Asymmetrische verdeling van lipiden

Verschillen tussen bladen: exo cyto

1-100

Cyto = PC / PS / PE / C

Exo = PC / PS / PE / C

Symmetrische verdeling

Asymmetrische

samenstelling

Exo = PC / SL / C

Cyto = PS / PE / PI / C

Asymmetrische verdeling van lipiden

Plasmamembraan Endoplasmatisch reticulum

101

Asymmetrische verdeling van fosfoglyceriden

PE, PS, PI: cytosolisch

PC: exoplasmatisch

Glycolipiden en sfingomyeline in exoplasmatisch blad

Extracellulaire suikers

Rijk aan cholesterol

In beide bladen

Symmetrische verdeling

van fosfoglyceriden

Cytosolisch blad =

exoplasmatisch blad

Weinig of geen

sfingolipiden

Weinig cholesterol

Asymmetrische verdeling van lipiden

Mechanismen

1-102

Plaats van biosynthese:

organel en blad

Fosfoglyceriden

Synthese in cytosolisch blad van

ER

Volgen transport naar Golgi en

PM via secretorische route

Glycolipiden en sfingomyeline

Synthese in exoplasmatisch blad

van Golgi apparaat

Volgen transport naar PM via

secretorische route

Figure 4-17

Asymmetrische verdeling van lipiden

Mechanismen

103

Flip-flop

Translocatie tussen 2 bladen

Spontane flip-flop: zelden (<1x/week)

Thermodynamisch ongunstig

Flippasen

ATP-gedreven transporters die flip-flop catalyseren

Selectiviteit inzake

Substraat

Richting: uni- versus bidirectioneel

Voorbeelden

ER: flippase voor PC, PS, PE: cytosolisch exoplasmatisch

PM: flippase voor PS en PE: exoplasmatisch cytosolisch

Figure 7-10

Asymmetrische samenstelling van

membranen: implicaties en belang

1-104

Glycolipiden in E-blad:

-Celrecognitie

-Celadhesie

Flipflop van PS tijdens apoptose

-Scramblase: bidirectionele flipflop

-PS in E-blad: herkend door macrofagen

-Signaal voor fagocytose

Apoptose

(scramblase)

PS en PI: negatief geladen lipiden in C-blad

-Bindingsplaats voor eiwitten

-PI = precursor voor second messengers

Segregatie van eiwitten tussen fluid / gel fase

-Preferentiële assocatie gel fase = rafts

-Vorming van signaaltransductiecentra in rafts

Fluïditeit van membraan

Observatie

Laterale mobiliteit van lipiden en eiwitten in membraan

Fluïde natuur van membraan

Figure 7-11

105

Fluïditeit van membraan

106

Laterale mobiliteit van lipiden en eiwitten in membraan

Spontaan

Temperatuurafhankelijk

Lipiden

snel: 1 mm/s (37 °C)

Eiwitten: trager

Grotere massa

Restrictie door binding aan cytoskelet

Bij 37 °C: membraan als 2-dimensionele vloeistof essentieel voor membraanfuncties

Figure 7-10

Fluïditeit van membraan

Fasetransitie: “gel-like” “fluid-like”

1-107

Structuur van membraan

Geordende associatie van lipiden, dense stapeling

Niet-geordende associatie, minder dense stapeling

Beperkte mobiliteit Hoge mobiliteit

Fluïditeit van membraan

Effect van temperatuur

108

Figure 7-12

Tm = transitietemperatuur: overgang gel fluïde fase

- <Tm: gel

- >Tm: fluid

Fluïditeit van membraan

Effect van vetzuursamenstelling

109

Lengte van vetzuurketen

Langere VZ ketens minder

fluïde

Tm,C20 = 76 °C

Tm,C10 = 32 °C

Verzadiging

Hoe meer cis-dubbele

bindingen meer fluïde

Tm,C18:0 = 70 °C

Tm,C18:2 = 5 °C

Figure 7-13

Fluïditeit van membraan

Effect van vetzuursamenstelling

110

Fosfolipiden met verzadigde vetzuren

- Recht verloop van VZ keten

- Dichte laterale stapeling

- minder fluïde

Fosfolipiden met onverzadigde vetzuren

- Knik in verloop van VZ keten

- Slechte laterale opstapeling

- fluïde

Figure 7-14

Fluïditeit van membraan

Effect van cholesterol

111

Aanwezig in beide bladen van membraan

Schuift in tussen fosfolipiden en glycolipiden

-OH H-brug met hydrofiel deel

4-ring KWS interactie met hydrofoob

Stabiliserend effect op fluïditeit

Bij hoge T stabilisering van VZ

Vermindert fluïditeit

Bij lage T verstoort laterale stapeling VZ

Beperkt gelvorming

Figure 7-15

Lipid rafts

Microdomeinen in de plasmamembraan

112

Eilandjes in plasmamembraan

Lipidensamenstelling

Glycolipiden en fosfolipiden

Bevatten lange, verzadigde VZ stapeling+

Cholesterol

Vorming van „gel-achtige‟ lipidendomeintjes

„drijven‟ rond in de fluïde membraan

Eiwitsamenstelling

Associatie van specifieke eiwitten met raft: receptoren, kinasen, transporteiwitten

Vorming van lipideneilandjes met specifieke functies

Membranen: structuur, functie en

samenstelling (BWC7)

5. Membraaneiwitten

113

Membraaneiwitten: de „mozaiek‟ component

van de membraan

114

Figure 7-16

Figure 7-17

- Ingebed of geassocieerd met

lipidendubbellaag

- Verschillen tussen membranen

- Hoeveelheid van eiwitten

- Myeline PM: 18%

- Binnenste mito: 76%

- Identiteit van eiwitten

Figure 7-18 Labeled

Klassen van membraaneiwitten

116

Figure 7-19

Indeling in functie van wijze van associatie met lipidendubbellaag:

- Integrale membraaneiwitten inbedding in hydrofobe deel van membraan

- Perifere membraaneiwitten niet-covalente associatie met lipidenhoofdjes of eiwitten

- Membraaneiwitten met vetanker associatie via een covalent gebonden lipide

Integrale membraaneiwitten

117

Transmembraaneiwitten bevatten 1 of meerdere

segmenten die doorheen lipidendubbellaag gaan

Singlepass / multipass ifv aantal transmembranaire segmenten

Cytoplasmatische en exoplasmatische domeinen

Figure 7-19

Amfipathische eiwitten

- Hydrofoob deel

inbedding in membraan

- Hydrofiel deel steekt

uit aan beide zijden van

membraan

Transmembranaire peptideketens

Probleem

2-118

Membraan = apolaire kern Peptideketen = polaire structuur

• Peptidebinding: CO-NH polair

• Zijgroepen: polair, geladen, ....

Figure 2-12

Figure 3-2

119

Subtype van integrale membraaneiwitten

Transmembraaneiwitten

120

Transmembranaire a-helix: 1 of meerdere

20 a 30 aminozuren lang

Hydrofobe R-groepen

Inbedding in lipidendubbellaag

Exoplasmatisch deel

Hydrofiel

Eventueel suikergroepen glycocalix

Cytoplasmatisch deel

Hydrofiel

Figure 7-21

Figure 3-8 Labeled

121

Figure 3-2

122

Perifere membraaneiwitten

123

Niet-covalente interactie met membraanlipiden of andere membraaneiwitten Elektrostatische interacties / H-bruggen

Vb corticaal cytoskelet in rode bloedcel Spectrine, ankyrine, band 4.1 eiwitten verbinden

transmembraaneiwitten met actine cytoskelet

Figure 7-19

Hydrofiele eiwitten:

geassocieerd aan 1 zijde

van membraanoppervlak

Figure 7-20

Figure 7-20 Labeled

Membraaneiwitten met vetanker

125

Type van vetanker: verschilt naargelang blad van membraan GPI anker exoplasmatisch blad

Vetzuurketen (C14:0 of C160) cytosolisch blad

Isoprenylanker (farnesyl of geranylgeranyl) cytosolisch blad

Covalente binding van vetanker aan eiwit Vereist enzymatische reactie farmacologisch doelwit!

Figure 7-19

Hydrofiele eiwitten:

- Covalent gebonden

lipide = vetanker

- Vetanker schuift in

de lipidendubbellaag

- Peptidedeel:

exoplasmatisch ofwel

cytoplasmatisch

GPI = glycosylfosfatidylinositol

- glycolipide in

exoplasmatisch blad

Topologie van transmembraaneiwitten

126

Aantal transmembranaire segmenten + oriëntatie tov membraan

Wordt bepaald bij biosynthese; nadien geen verandering

Exoplasmatische cytoplasmatische delen

Vb bacteriorhodopsin

7 transmembranaire a-helices

Inbedding in membraan

Vorming van kanaal voor H+

Exoplasmatisch deel

N-terminus van peptideketen

Lussen tussen a-helices

Cytoplasmatisch deel

C-terminus van peptideketen

Lussen tussen a-helices

Figure 7-21

Topologie van transmembraaneiwitten

Voorstelling aan hand van

hydropathieplot

Score van AZ ifv aard van R-groep

Hydrofobe R-groep score > 0

Hydrofiele R-groep score < 0

Positieve zone voorspeld

transmembranair segment

Negatieve zones

exoplasmatische of

cytoplasmatische delen

Figure 7-23

127

Functies van membraaneiwitten

128

Staan in voor biologische activiteit van membraan

Enzymatische reacties

Vb Gluclose-6-fosfatase

Transporteiwitten

Carriers, kanalen, pompen,

symporters, antiporters

Receptoren en

signaaltransductie-eiwitten

Celadhesie aan

extracellulaire matrix

Cel-celinteractie adhesie en communicatie

Figure 7-2

Glycosylering van membraaneiwitten

129

Aanwezigheid van suikers in exoplasmatisch blad tgv

Glycolipiden: suiker(s) als hoofd

Glycoproteinen: covalente binding van suikergroep aan AZ

N-linked: aan N van Asn

O-linked: aan O van Ser of Thr

Glycosylering = covalente binding van suiker aan AZ

Gebeurt in ER tijdens biosynthese

Nadien modificatie van suikers in Golgi apparaat

Verschillend tussen eiwitten Figure 7-25

Glycosylering van membraaneiwitten

voorbeeld: glycoforine

130

Singlepass membraan eiwit in RBC

Extracellulaire N-terminus

16 suiker-groepen

1 N-linked

15 O-linked

Negatieve lading afstoting van RBC Figure 7-26

Figure 7-21

Glycocalixlaag

131

Extracellulaire suikerlaag

aan celoppervlak

Glycolipiden en glycoproteïnen

Moleculaire diversiteit ifv

samenstelling van suikers

Functie

Celadhesie

Celrecognitie

ABO bloedgroepensysteem

Binding van antilichamen

Signaaltransductie: binding van

signaalmoleculen

Figure 7-27

Toepassing glycocalix

ABO bloedgroepen

ABO bloedgroepsysteem

Bepaald door

oligosaccharidesamenstelling

van glycocalix

Variatie in ABO bloedgroepen

Aan- of afwezigheid van

specifiek glycoslytransferase

voor aanhechting van terminale

suiker

Genetisch bepaald: allellische

diversiteit

132

Mobiliteit van membraaneiwitten

133

Laterale mobiliteit van membraaneiwitten

Temperatuurafhankelijk, zie ook mobiliteit van lipiden

Grote variatie in snelheid van beweging

Mobiliteit van membraaneiwitten

Beperkingen

134

Observatie

Sommige membraaneiwitten bewegen trager dan andere

Clustering van membraaneiwitten in groepjes/domeinen

Conclusie: mobiliteit van sommige eiwitten is beperkt

Mechanisme van beperkte mobiliteit Figure 7-20

Associatie van eiwit met cytoskelet

Figure 17-9

Indeling van membraan in compartimenten

Vb tight junctions scheiding van apicale

en basolaterale regio

Transmembranair transport (BWC8)

6. Eenvoudige diffusie

135

136

Diffusie: spontane beweging van moleculen

in en rond de cel

137

Theoretische aspecten van diffusie Microscopische aspecten – random beweging

Macroscopische aspecten – wet van Fick

Cellulaire implicaties van diffusie Diffusie van moleculen binnen een compartiment

Transmembranaire diffusie (passief transport)

Osmose

Random beweging van partikels in vloeistof

138

Robert Brown (1773-1858) Jan Ingenhousz (1730-1799)

Brownse beweging

139

Random beweging van 1 partikel in 1-D

140

Per tijdsdeel ∆t legt het

deeltje een afstand ∂ af, naar

links of naar rechts.

CPN 2-3

Random beweging van 2000 partikels in 1-D

141

Initieel zijn alle partikels op positie x=0

Per tijdsdeel ∆t legt elk deeltje een afstand ∂ af, naar links of naar rechts.

Distributie wordt steeds breder

Gemiddelde positie blijft op x=0

CPN 2-4

Gemiddelde verplaatsing (1-D)

142

“Hoe ver van het vertrekpunt diffundeert een partikel gemiddeld na tijd t?”

( ) ( 1)i ix n x n

1 1 1

( 1) ( 1)

( )

N N N

i i

i i ii

x n x n

x nN N N

( ) ( 1) (0)i i ix n x n x

( ) : positie van partikel na stappen van lengte ix n i n

=0

Gemiddelde positie blijft op x=0 we leren niets over werkelijke verplaatsing

Oplossing: gemiddelde kwadratische verplaatsing

Gemiddelde kwadratische verplaatsing (1-D)

(Root-Mean-Squared (RMS) Displacement)

143

22 2 2( ) ( 1) ( 1) 2 ( 1)

i ii ix n x n x n x n

2 2

2 1 1 1

( 1) 2 ( 1)

( )

N N N

i i

i i ii

x n x n

x nN N N

=0

2 2 2 2 2 2 2( ) ( 1) ( 2) 2 ... (0)i i i ix n x n x n x n

tt n t n

t

2

Diffusie-coefficient2

Dt

2 ( ) 2ix t Dt

1-D 1 2RMS displacement ( ) 2D

rms id x t Dt

144

0t

4t

8t

12t

16t

20t

24t

28t

-8 -6 -4 -2 0 2 4 6

Positie

Tijd

Simulatie: gemiddelde verplaatsing

145

Simulatie: kwadratische verplaatsing

0t

4t

8t

12t

16t

20t

24t

28t

02

82

162

242

322

402

482

562

Positie2

Tijd

146

0t

4t

8t

12t

16t

20t

24t

28t

-2 0 2 4 6

gemiddelde

kwadratisch gemiddelde

Positie

Tijd

Gemiddelde kwadratische verplaatsing

(2-D en 3-D)

147

1 2D

rmsd Dt

2 4D

rmsd Dt

3 6D

rmsd Dt

2 2 2

2 1 1 2 2D D D

rms x yd d d Dt Dt

Op gelijkaardige wijze, in 3-D…

Stelling van Pythagoras CPN C-1

148

Conclusie: Random diffusie ~√t

CPN 2-5

149

150

Typische diffusie-constanten voor opgeloste

moleculen in water

151

D (in cm2/s)

O2 20×10-6

CO2 19×10-6

glucose 6×10-6

ethanol 15×10-6

Na+ 12×10-6

Cl- 20×10-6

Rekenvoorbeeld: snelheid van diffusie

152

Voorbeeld: hoe lang duurt het eer glucose gemiddeld 10 mm heeft gediffundeerd? En 1cm?

3

2 23

6 2

6 10 μm 0.001 cm

0.001 cm0.027 s 27 ms

6 6 6 10 cm /s

D

rms

D

rms

d Dt

dt

D

3

2 23

6 2

6 1 cm

1 cm7 uur en 42 minuten!!

6 6 6 10 cm /s

D

rms

D

rms

d Dt

dt

D

Diffusie van gassen: O2 en CO2

153

In haarvaten (capillairen) in weefsels:

O2 diffundeert van haarvat naar weefsel

CO2 diffundeert van weefsel naar haarvat

In de longen:

O2 diffundeert van lucht naar haarvat

CO2 diffundeert van haarvat naar lucht

Meeste cellen in

hersenen of hart liggen

op 10-20 mm van capillair!

WotC 8-3

Macroscopische diffusie: de wetten van Fick

154

Adolf Eugen Fick

(°1829 in Kassel, †1903 in Blankenberge)

Adolf Gaston Eugen Fick

( 1852-1937)

1ste wet van Fick

155

J : flux (mol m-2 s-1)

D : diffusiecoefficient (m2 s-1)

C : concentratie (mol/m3)

x : lengte (m)

dCJ D

dx

1ste wet van Fick: richting van flux

156

CPN 2-2

Diffusie doorheen membranen

157

membraan

water

C

C

Wordt in belangrijke mate bepaald door de partitie-coëfficient

oc tanol

water

C

C

Diffusie doorheen membranen

158

Comem

=Co

Cimem

=Ci

dC CJ D D

dx x

mem mem

i o

i o

i o

C CD

x

C CD

x

P C C

PermeabiliteitsconstanteD

Px

CPN 2-6

Diffusie doorheen membranen

159

=0 J=0!

CPN 2-6

Toepassing: gas transport in long

160

: volume gas getransporteerd per tijdseenheid

: oppervlakte

: dikte van barriere

gas b a

gas

DV A p p

th

V

A

th

CPN B2-2

Transmembranair transport (BWC8)

7. Diffusie en Osmose

161

Afname van concentratie-gradient over de

plasmamembraan

162

Ci

Co i oJ P C C

Aantal mol dat per tijdseenheid door de PM diffundeert: CellJ A

Extracellulair volume >> celvolume Co blijft constant.

i Cell

Cell

dC Ad CJ

dt dt V

: oppervlakte/volume verhouding (surface-to-volume ratio)Cell

Cell

A

V

Afname van concentratie-gradient over de

plasmamembraan

163

Cell Cell

Cell Cell

A Ad CJ P C

dt V V

(met )Cell

Cell

Ad Ckdt k P

C V

0 0

t t

t t

d Ckdt

C

ln ( ) ln (0)

1( ) (0) (0) (met )

t

kt

C t C kt

C t C e C ek

Afname van concentratie-gradient over de

plasmamembraan

164

( ) (0) t

C t C e

Cell

Cell

V

A P

t = ∆C = ∆C(0)/e

= 0.37∆C(0)

CPN B2-3

Typische waarden voor P en

165

Molecule P (cm/s) τ*

Water 10-4-10-3† 0.5-5 sec

Ureum 10-6 ∼8 min

Glucose,

aminozuren

10-7 ∼1.4 hr

Cl- 10-11 ∼1.6 yr

K+, Na+ 10-13 ∼160 yr

*Voor een cel met een diameter van 30 mm

2

-1

3

4 3 6 62000 cm

4 0.003 cm

3

Cell

Cell

A r

V r dr

Diffusie van opgeloste stoffen osmose

166

Scheidingswand permeabel

voor opgeloste stof

diffusie

Scheidingswand enkel

permeabel voor water

osmose WotC 8-4

Osmotische druk en osmolariteit

167

-1 -1

: osmotische druk

: universele gasconstante (8.314 J K mol )

: absolute temperatuur (in Kelvin)

: totale concentratie aan opgeloste stofSolute

R

T

C

SoluteRTC

Wet van van’t Hoff

Jacobus Henricus van 't Hoff

(1852-1911)

Nobelprijs chemie 1901 =Osmolariteit

Osmotische druk en osmolariteit

168

Osmolariteit (in Osm) = concentratie aan opgeloste particels (molecules of ionen)

Vb. 200 mM glucose-oplossing : 200 mOsm

200 mM NaCl –oplossing: 400 mOsm

(200 mM Na+ en 200 mM Cl-)

200 mM MgCl2 –oplossing: 600 mOsm

(200 mM Mg2+ en 400 mM Cl-)

Typische waarde voor plasma: ~290 mOsm

Osmotische druk en osmolariteit

169

A B SoluteRT C

Is gelijk aan hydrostatische druk nodig om

netto waterverplaatsing tegen te gaan.

WotC 8-4

170

Watertransport wordt bepaald door

osmotische en hydrostatische druk

: waterdebiet doorheen membraan (volume/t)

: verschil in hydrostatische druk

: verschil in osmotische druk

: waterdoorlaatbaarheid

: reflectie-coefficient

V f h

V

h

f

J

P

K

J K P

Starling-vergelijking

Corrigeert voor permeabiliteit van opgeloste stof

Toniciteit versus osmolariteit

171

Osmolariteit:

Totale concentratie aan opgeloste particels, zonder onderscheid.

Toniciteit:

Concentratie aan membraan-impermeabele opgeloste particels.

1 Solute

water

P

P =0 : opgeloste stof diffundeert even gemakkelijk door de membraan als water

=1 : opgeloste stof is membraan-impermeabel

Membraan-permeabele stoffen zoals ureum of ethanol

dragen wel bij aan Osmolariteit

Membraan-permeabele stoffen zoals ureum of ethanol dragen

niet bij aan Toniciteit leiden niet tot waterverplaatsing

Gevolgen van anisotone oplossingen

172

WotC 8A-1

Gevolgen van anisotone oplossingen

173

Hypertoon Isotoon Isotoon

Hypotoon Isotoon Isotoon

0

0

finaal

nieuw

V C

V C

Vfinaal

V0

V0

CPN 3-5

Isotone oplossingen in de kliniek

174

Transmembranair transport (BWC8)

8. Energetische aspecten van transmembranair transport

175

1ste wet van Fick

176

J : flux (mol m-2 s-1)

D : diffusiecoefficient (m2 s-1)

C : concentratie (mol/m3)

x : lengte (m)

dCJ D

dx

Deze wet houdt geen rekening met de invloed

van een elektrisch veld op geladen deeltjes!

Kracht van een elektrisch veld op een lading

177

V dV0

dx

+ F

dVF q

dx

- F

F: kracht (in Newton)

q: lading (in Coulomb)

V: Elektrische spanning (in Volt)

Flux van een geladen deeltje in elektrisch veld

178

total diffusie elektrisch

total

J J J

dC zDFC dVJ D

dx RT dx

R = 8.315 J K-1 mol-1

F = 96500 C mol-1

z: valentie

Energetische beschouwingen bij de beweging

van moleculen doorheen membranen

179

X

G : verandering in vrije energie

0 G

0 G

: reactie zal spontaan opgaan

: omgekeerde reactie zal opgaan

0 G : reactie is in evenwicht

180

WotC 8

Wij gebruiken SI-eenheden…

181

Grootheid SI-basiseenheid

naam symbool

Lengte meter m

massa kilogram kg

tijd seconde s

elektrische stroom ampère A

absolute temperatuur kelvin K

hoeveelheid stof mol mol

lichtsterkte candela cd

De 7 SI-basiseenheden

G, M, k, m, m, n, p, f, a: 109, 106, 103, 10-3, 10-6, 10-9, 10-12, 10-15, 10-18

Prefixen:

Wij gebruiken SI-eenheden…

182

Afgeleide SI-eenheden

(Kunnen uitgedrukt worden in termen van SI-basiseenheden)

Voor Energie: Joule (J) = kg.m2/s2

1 cal (calorie) = 4.184 J (Joules)

! In voeding/dieet: 1 Calorie = 1 kcal

Voorbeeld 1

c mG G G

K+ Vm

[K+]i = 150 mM

[K+]o = 5 mM

=-80 mV

ln im

o

CG RT zFV

C

R = 8.315 J K-1 mol-1

F = 96500 C mol-1

z: valentie (+1 voor K+)

G = +8484 J mol-1 –7720 J mol-1

= +764 J mol-1

Energetisch ongunstig

183

c mG G G

Na+ Vm

[Na+]i = 10 mM

[Na+]o =150 mM

=-80 mV

ln im

o

CG RT zFV

C

G = -6755 J mol-1 –7720 J mol-1

= -14475 J mol-1

Energetisch zeer gunstig

Voorbeeld 2

R = 8.315 J K-1 mol-1

F = 96500 C mol-1

z: valentie (+1 voor Na+)

184

Evenwichtspotentiaal voor ionen

185

0 G

mc GG

ln im

o

CRTV

zF C

als

dus als

Evenwichtspotentiaal voor een ion X:

]X[

]X[ln

zF

RTE

o

iX

Walther Hermann Nernst

Nobelprijs Chemie (1920) « Nernst-vergelijking »

Evenwichtspotentiaal voor ionen

186

Vm = EK

Lipidendubbellaag = condensator

187

Capaciteit van een biologisch membraan: ~0.01 pF/mm2

Capaciteit van een condensator ~ oppervlakte van de platen

Grootheden: Capaciteit (C), lading (Q)

Eenheid van capaciteit: Farad (F)

Eenheid van lading: Coulomb (C)

Q V C

Ladingverplaatsing en membraanpotentiaal

188

Rekenvoorbeeld:

Een bolvormige cel heeft een diameter van 10 mm, en een initiele Vm van 0 mV. De

intracellulaire K+ concentratie, [K+]i, bedraagt 150 mM. Door het openen van K+-

kanalen stromen K+-ionen naar buiten. Hoeveel K+-ionen moeten de cel verlaten om

een Vm van -80 mV te bereiken? Welk effect heeft dit op [K+]i?

Conclusie: (relatief) weining ionenverplaatsing

volstaat voor veranderingen in Vm

De Nernst-vergelijking praktisch

189

[ ]ln

[ ]

[ ]ln

[ ]

[ ]2.304log

[ ]

[ ]60log (in mV)

[ ]

iX

o

oX

i

oX

i

oX

i

XRTE

zF X

XRTE

zF X

XRTE

zF X

XE

z X

Elk ion heeft zijn evenwichtspotentiaal

190

Ion Ci (mM) Co (mM) EX

K+ 150 5 -87 mV

Na+ 10 150 +69 mV

Ca2+ 10-4 2 +127 mV

Cl- 30 150 -40 mV

Typische richtwaarden voor zoogdiercellen

Asymetrische ionenverdelingen ontstaan

door actief transport

191

Actief transport = transport tegen elektochemische gradient in

c mG G G ln im

o

CG RT zFE

C

Transport van ion/molecule X met GX > 0

gekoppeld aan proces Y met GY < 0

Gtotaal (= GX+ GY) < 0

Primair secundair actief transport

192

ATP ADP + Pi

G -30000 J mol-1

Na+buiten Na+

binnen

G -15000 J mol-1

Afhankelijk van Vm en Ci/Co

Secundair actief transport:

Symporters Antiporters

Primair actief transport:

Pompen

Transmembranair transport (BWC8)

9. Gefaciliteerde diffusie

193

Transmembranair transport in eukaryote

cel

Overkomen van de permeabiliteitsbarrière van de lipidendubbellaag

Gassen: O2, CO2, NO, …

Ionen: Na+, K+, Ca2+, Cl-,…

Metabolieten: glucose, AZ, …

Doorheen lipidendubbellaag

Eenvoudige diffusie

Via transporteiwit

Gefaciliteerde diffusie

Actief transport Figure 8-1

194

Table 8-1 Labeled

Eenvoudige diffusie: OK voor gassen en hydrofobe moleculen (en ook beperkt voor H2O)

Lukt niet voor ionen, polaire moleculen (glucose, AZ, …)

vergt een transporteiwit

195

Energetische beschouwingen bij de beweging

van moleculen doorheen membranen

196

X

G : verandering in vrije energie

0 G

0 G

: reactie zal spontaan opgaan

: omgekeerde reactie zal opgaan

0 G : reactie is in evenwicht

Asymetrische ionenverdelingen ontstaan

door actief transport

197

Actief transport = transport tegen elektrochemische gradient in

c mG G G ln im

o

CG RT zFE

C

Transport van ion/molecule X met GX > 0

gekoppeld aan proces Y met GY < 0

Gtotaal (= GX+ GY) < 0

Eenvoudige diffusie

Diffusie doorheen membranen

198

Comem

=Co

Cimem

=Ci

dC CJ D D

dx x

mem mem

i o

i o

i o

C CD

x

C CD

x

P C C

PermeabiliteitsconstanteD

Px

CPN 2-6

=0 J=0!

Gefaciliteerde diffusie

199

Passief: volgens elektrochemische gradiënt (G < 0)

Transmembranair transport via membraaneiwit

Functionele indeling ifv transporteitwit en mechanisme

Carriers Ionenkanalen

Transporteiwit Transmembranair eiwit Transmembranair eiwit (porie)

Mechanisme Reactiecyclus

- Binding aan ene zijde

- Conformatieverandering

- Dissociatie aan andere zijde

Schakelproces

- Gesloten open

- Indien open: stroom van

verschillende ionen

Snelheid 100 a 1000 moleculen/s 106 tot 108 ionen/s

Gefaciliteerde diffusie via carrier eiwitten

Mechanisme

200

Carrier

Transmembranair eiwit: integraal

Bindingsplaats voor transportsubstraat S

2 conformaties in functie van oriëntatie van bindingsplaats

Bindingsplaats naar binnen

Bindingsplaats naar buiten

Spontane overgang tussen beide conformaties

Transport = enzymatische reactiecyclus

Binding van S aan ene zijde van membraan

Conformatieverandering

Afgave van S aan andere zijde van membraan

Conformatieverandering

Se + carrier S-carrier Si + carrier

Figure 8-7

Eigenschappen van gefaciliteerde diffusie

via carrier eiwitten: passief transport

201

Passief transport volgens elektrochemische gradiënt (G < 0)

Voor neutrale substraten

transport van hoge naar lage concentratie

Preferentiële binding aan zijde met hoogste concentratie

Preferentiële dissociatie aan zijde met laagste concentratie

Se + carrier S-carrier Si + carrier

Figure 8-7

202

elektrischieconcentrattotaal GGG

o

i

C

CRT ln mzFV

o

i

C

CRT ln

Vermits z = 0

io CCG 0

i

o

Voor influx van neutraal molecule: wanneer is G < 0

Eigenschappen van gefaciliteerde diffusie

via carrier eiwitten: specificiteit

203

Specificiteit van transport

Bepaald door selectieve binding van substraat aan bindingsplaats in carrier

Discriminatie tussen

Verwante moleculen

Stereoisomeren

Se + carrier S-carrier Si + carrier

Figure 8-7

Figure 6-5

Eigenschappen van gefaciliteerde diffusie

via carriers: saturatie

204

Vmax = maximale transportsnelheid saturatie van transport

Bepaald door aantal uniporters in de membraan

kcat = turnover number 102 a104 s-1

Km = [S] waarbij v= Vmax/2

Maat voor affiniteit van uniporter voor S

Carrier enzyme

volgt Michaelis-Menten kinetica

- v= initiële transportsnelheid (mol/s)

- [S] = substraatconcentratie

Se + carrier S-carrier Si + carrier

Figure 6-8

Figure 6-9

Toepassing: onderscheid eenvoudige versus

gefaciliteerde diffusie

205

Figure 8-5

Eigenschappen van gefaciliteerde diffusie

via carriers: inhibitie

206

Competitieve inhibitie

Inhibitor bindt op zelfde

plaats als substraat

Niet-competitieve inhibitie

Inhibitor bindt op andere

plaats als substraat

Figure 6-14

Carrier eiwitten

Uniporters versus gekoppelde transporters

207

Uniporter Transporteert 1 substraat

gefaciliteerde diffusie

Gekoppelde transporter Transporteert 2 substraten in

gekoppelde wijze

Symporters: zelfde richting

Antiporters: tegengestelde richting

Figure 8-6

Primair secundair actief transport

208

ATP ADP + Pi

G -30000 J mol-1

Na+buiten Na+

binnen

G -15000 J mol-1

Afhankelijk van Vm en Ci/Co

Secundair actief transport:

Symporters Antiporters

Primair actief transport:

Pompen

Voorbeeld: cellulaire opname/afgave van

glucose via GLUT

209

Probleem: plasmamembraan is weinig permeabel voor glucose

Pglucose = 10-8 cm.s-1

Eenvoudige diffusie van glucose: zeer traag verloop

Oplossing: glucosetransporter (GLUT) in PM

Uniporter voor glucose

Snelle opname/afgave van glucose via gefaciliteerde diffusie

Figure 8-7

210 5 Regelbare Vmax Spier, vetweefsel GLUT4

[glucose]bloed

GLUT isovormen

1 [glucose]bl >> Km werkt aan Vmax Hersenen GLUT3

17 [glucose]bl << Km V ≈ [glucose]bl Lever, -cel GLUT2

3 Erythrocyten, … GLUT1

Km (mM) Opmerking Expressie Isovorm

0 10 20 30 40 50 0

2

4

6

8

10

V (

rel)

glucose [mM]

GLUT1 GLUT2 GLUT3 GLUT4

Isovormen = groep van eiwitten

- structureel verschillend

- gelijkaardige functie

GLUT-gemedieerd transport van glucose

Eigenschappen

211

Passief volgens concentratiegradiënt van glucose

Extracellulaire concentratie 5 mM

Indien [glucose]intracellulair < [glucose]extracellulair opname

Indien [glucose]intracellulair > [glucose]extracellulair afgave

Specificiteit

D-glucose >> L-glucose

GLUT-1: Glucose ≥ galactose > mannose

Saturatie en maximale transportsnelheid

Bepaald door aantal GLUT uniporters in plasmamembraan

GLUT-4: regelbare Vmax

Inhibitie

Competitieve inhibitie door glucose-analogen

Eigenschap

Specificiteit van GLUT-1 transport

212

Eigenschap

Saturatie van GLUT transport

213

Functie van GLUT-1

Cellulaire opname van glucose

214

[glucose] ~5 mM [glucose] ~1 mM

G G G-6-P

ATP ADP

glucokinase

Glucokinase

- Km,glucose 1,5 mM

- Exergonische reactie

[glucose]

V

[glucose]bloed

-cel pancreas: GLUT2

neuron: GLUT3

[glucose]

V

[glucose]bloed

[glucose]

V

[glucose]bloed

+Insuline

-Insuline

Skeletspier en adipocyt:

GLUT4

Km

Km

Vmax

215

neuron: GLUT3

[glucose]

V

[glucose]bloed

Km

216

SK

SVv

m

max SKm

maxVv

-cel pancreas: GLUT2

[glucose]

V

[glucose]bloed

Km

217

SK

SVv

m

max SKm S

K

Vv

m

max

Skeletspier en adipocyt: GLUT4

[glucose]

V

[glucose]bloed

+Insuline

-Insuline Vmax

218

Gefaciliteerde diffusie via kanalen

Kanaal = membraaneiwit met transmembranaire porie waardoor moleculen/ionen diffunderen volgens elektrochemische gradiënt passief transport

Stimulus

indien ionentransport elektrische stroom 3. Transport

Conformatieverandering door stimulus Open

versus gesloten

2. Schakeling

poort

Discriminatie tussen ionen

Na+ kanalen, K+ kanalen, Ca2+ kanalen...

1. Selectiviteit

porie

Eigen-

schappen

gesloten open

porie

poort

219

Soorten van kanalen

220

Ionenkanalen Porines Aquaporines

Selectiviteit Zie later Neen H2O, glycerol

Schakeling Zie later Neen Neen

Stroom Zie later Ja Neen

Structuur Zie later -barrel Tetramer

Functie Zie later Bacteriën, mitoch Transport van H2O

Figure 8-8

Transmembranair transport (BWC8)

10. Actief transport

221

Transmembranair transport in eukaryote

cel

Overkomen van de permeabiliteitsbarrière van de lipidendubbellaag

Gassen: O2, CO2, NO, …

Ionen: Na+, K+, Ca2+, Cl-

Metabolieten: glucose, AZ, …

Doorheen lipidendubbellaag

Eenvoudige diffusie

Via transporteiwit

Gefaciliteerde diffusie

Actief transport Figure 8-1

222

Table 8-1

Eenvoudige en gefaciliteerde diffusie: passief, volgens elektrochemische gradiënt

Lukt niet tegen concentratiegradiënt of elektrische gradiënt

vergt input van energie = actief transport

223

Toepassing: onderscheid eenvoudige versus

gefaciliteerde diffusie

224

Figure 8-5

Table 8-1

Eenvoudige en gefaciliteerde diffusie: passief, volgens elektrochemische gradiënt

Lukt niet tegen concentratiegradiënt of elektrische gradiënt

vergt input van energie = actief transport

225

Actief transport

226

Actief: tegen elektrochemische gradiënt vergt energie

Transmembranair transport via membraaneiwit

Functionele indeling ifv energievoorziening

Primair/direct actief Secundair/indirect actief

Transporteiwit Pomp = transport ATPase Gekoppelde transporter

Energievoorziening ATP hydrolyse

- Pomp bevat ATPase domein

- Energie ATP hydrolyse

transport

Gelijktijdig transport van 2

stoffen

- Stof 1: volgens gradiënt

- Stof 2: tegen gradiënt

Snelheid < 1000 moleculen/s 102 tot 104 ionen/s

Actief transport

227

Actief transport = transport tegen elektochemische gradient in

Transport van ion/molecule X met GX > 0

gekoppeld aan proces Y met GY < 0

Gtotaal (= GX+ GY) < 0

m

o

i zFVC

CRTΔG ln

mc GGΔG

Primair secundair actief transport

228

ATP ADP + Pi

G -30 -50 kJ mol-1

Na+buiten Na+

binnen

G -15 kJ mol-1

Afhankelijk van Vm en Ci/Co

Secundair actief transport:

Symporters Antiporters

Primair actief transport:

Pompen

c mG G G

Na+ Vm

[Na+]i = 10 mM

[Na+]o =150 mM

=-80 mV

ln im

o

CG RT zFV

C

G = -6755 J mol-1 –7720 J mol-1

= -14475 J mol-1

Energetisch zeer gunstig

Voorbeeld 2

R = 8.315 J K-1 mol-1

F = 96500 C mol-1

z: valentie (+1 voor Na+)

229

Indien Vm -40 mV is, hoe groot is G

(bij benadering)?

a. 0 J mol-1

b. -5 kJ mol-1

c. -10 kJ mol-1

d. -15 kJ mol-1

Figure 8-9 Labeled

230

Primair actief transport

Overzicht van ATPasen

231

P-type ATPase V-type en F-type ATPase ABC-type ATPase

a-subeenheid

- Transmembranair

- ATP hydrolyse

Vo/F0: transmembranair

V1/F1: ATP hydrolyse

2 transmembranaire domeinen

2 ATP bindende cassettes (ABC): ATP

hydrolyse

Autofosforylering op Asp

in cytosolisch domein

F-type: reversibele

werking

Primair actief transport

behalve CFTR = Cl- kanaal

Ionen: Na+, K+, Ca2+, H+

Lipiden (P4-type)

Uitsluitend H+

F-type: ATP synthese

Lipiden, AZ, suikers, peptiden, ionen,

....

Table 8-2 Labeled

232

P-type ATPasen

Familie van transport ATPasen

233

Structurele gelijkenissen: a-subeenheid = catalytische subeenheid

Functionele overeenkomsten: :E1 E2 reactiecyclus Autofosforylering op cytolisch Asp residu: overdracht van energie

Verschillen in Selectiviteit: ionen, lipiden

Subcellulaire lokatie: plasmamembraan, ER, Golgi, lysosomen, …

Voorbeelden van P-type ATPasen bij

zoogdieren

Na+/K+ pomp Plasmamembraan

Na+ efflux/K+ influx

H+/K+ pomp Plasmamembraan

H+ extrusiepomp

PMCA Plasmamembraan

Ca2+ pomp

SERCA: Sarcoplasmatisch/endo-

plasmatisch reticulum

Ca2+ pomp

SPCA Golgi apparaat

Ca2+ pomp P4 ATPase

Plasmamembraan

PS/PE flippase: exoplasmatisch cytosolisch blad

Endoplasmatisch

reticulum

3 Na+

2 K+

ATP

Na+-K+ pomp

ATP

2 Ca2+

SERCA

1 Ca2+

PMCA

ATP

H+

K+

ATP

H+-K+ pomp

Golgi

ATP

2 Ca2+

SPCA

234

P-type ATPasen

Opbouw van concentratiegradiënten

235

Endoplasmatisch

reticulum

3 Na+

2 K+

ATP

Na+-K+ pomp

ATP

2 Ca2+

SERCA

1 Ca2+

PMCA

ATP

Golgi

ATP

2 Ca2+

SPCA

Noot: Cl- gradiënt opgebouwd door

transporters en kanalen

5 – 40 120 Cl- (mM)

100 nM 1 mM Ca2+

140 5 K+ (mM)

10 145 Na+ (mM)

Ci Ce

Ca2+

Na+ K+

Extra- en intracellulaire

ionenconcentraties bij zoogdieren

V-type en F-type ATPasen

236

V-type

Intracellulaire organellen

Endosomen, lysosomen

Vacuool (plant en gist)

Aanzuring van lumen van

organellen

Lysosoom: pH 4,5

F-type

Bacteriën

Mitochondriën: binnenste

membraan

In mitochondriën:

omgekeerde werking

H+ gradiënt ATP

synthese

ABC-type ATPasen

Familie van importers en exporters

237

Multigen familie

≈ 48 genen bij de mens

ATP-gedreven pompen (behalve CFTR = Cl- kanaal)

Gemeenschappelijke eiwitstructuur

2 transmembraan domeinen (T1/2) transmembranaire porie

2 ATP bindende cassetten (ABC1/2) Binding en hydrolyse van ATP

Actief transport (import/export) van ionen, suikers, AZ, peptiden, lipiden

MDR1: extrusie van hydrofobe stoffen via

flippase-activiteit

MDR1: multidrugresistentie-eiwit

Actief transport: ATP hydrolyse

Exporter van amfipathische kationen:

Toxines

Farmaca: bv. chemotherapeutica

Brede substraatspecificiteit

Transporteert brede reeks van

amfipathische kationen

Overexpressie in tumoren multidrug resistentie

Opregeling van MDR1 tijdens chemotherapie

Therapieresistentie tegen breed spectrum van chemotherapie

X+

ABC

ATP ADP

238

4-239

Lage MDR1 expressie

Hoge MDR1 expressie

Tumor: heterogene celpopulatie

(genetische variatie)

chemotherapie

Multidrug-resistente tumor

groei

Selectie van tumorcellen met hoge

MDR1 expressie

Resistent tegen verschillende

chemotherapeutica

Secundair actief transport bij zoogdieren

Na+ gedreven secundair actief transport

240

Passief transport van Na+ drijft actief transport van X

Elektrochemische gradiënt van Na+: inwaarts afhankelijk van

Na+/K+ pomp

145 mM Na+ X

Figure 8-10

GNa -15 kJ mol-1

10 mM Na+

ATP

K+

GX > 0 kJ mol-1 GNa + GX < 0 kJ mol-1

Vm = -80 mV

Secundair actief transport bij zoogdieren

Types van gekoppelde transporters

241

Indeling ifv richting van transport

Symporter: Na+ en X in zelfde richting influx van X

Antiporter: Na+ en X in tegengestelde richting efflux van X

Na+ X

ATP Na+

K+

X

Na+

ATP Na+

K+

X

Antiporter Symporter

Na+-gekoppelde cotransporters

Voorbeelden

Symporters: inwaarts transport van Na+ en X Na+-glucose cotransporter: SGLT

Na+-K+- 2Cl- cotransporter: NKCC; Na+-Cl- cotransporter: NCC

Na+-fosfaat cotransporter: NaPi

Na+-aminozuur cotransporter

Na+-HCO3- : NBC

...

Antiporters: transport van Na+ en X in tegengestelde richting Na+-Ca2+ antiporter: NCX

Na+-H+ antiporter: NHE

....

Na+

K+ AT

P Na+-K+ pomp

Na+ glucose Na+ Pi Na+ AZ Na+ Cl- K+ Na+ HCO3-

Na+ H+ Na+ Ca2+

242

Voorbeeld primair actief: Na+/K+ pomp

Structuur en functie

243

Multimer eiwitcomplex in plasmamembraan a-subeenheid = transporteenheid

/g-subeenheden: regelende functie

a-subeenheid Cytoplasmatisch domein

ATP-bindend domein

Autofosforyleringsdomein: Asp

Transmembranair domein Bindingsplaatsen voor Na+ en K+

Extracellulair domein Bindingsplaats voor digitalis

Functie: actief transport van Na+ en K+ tegen elektrochem gradiënt GNa,efflux +15 kJ mol-1 en GK,influx +0,8 kJ mol-1

GATP-hydrolyse -30 tot -50 kJ mol-1

Figure 8-11

Na+/K+ pomp

E1 versus E2 conformaties

Bindingsplaatsen

voor ionen

Cytoplasmatisch

Affiniteit: Na+ >> K+

Extracellulair

Affiniteit: Na+ << K+

Binding van 3 Na+

Afgave van K+

Afgave van Na+

Binding van 2 K+

Fosforylering E1~P: hoog-energetische

binding

E2-P: laag-

energetische binding

Stoichiometrie van binding

- 3 Na+ (intracellulair)

- 2 K+ (extracellulair)

- 1 ATP hydrolyse

E1 E2 Figure 8-12

244

Na+/K+ pomp: E1 –E2 transportcyclus

iieei PADPKNaOHATPKNa 2323 2

Figure 8-12

245

Na+/K+ pomp

Functioneel belang

Creëren van transmembranaire Na+ en K+ gradiënt

Membraanpotentiaal

Prikkelbaarheid en actiepotentiaal

Gekoppelde transporters

Behoud van celvolume

Na+ = osmoliet

[Na+]cyto celvolume

ATP

3 Na+

2 K+

i=RTScs,i

Actiepotentiaal: depolarisering Gekoppeld transport

[Na+]=10 mM

[Na+]=145 mM

[K+]=5 mM [K+]=140 mM

Actiepotentiaal: repolarisering

246

Na+/K+ pomp: farmacologie

Digitalis

Digitalis: extract van blad van D. purpurea Bevat 2 glycosiden: digoxine en digitoxine

Sterol ringstructuur

Oligosaccharidestaart

Inhibitor van Na+/K+ pomp

Bindt aan extracellulaire plaats op a-subeenheid

Effecten

Accumulatie van Na+ in cel, verlies van K+

Stop gekoppelde transporters, celzwelling, verlies van prikkelbaarheid

Geneesmiddel gif

CH3

O

OH

OH

CO

O

CH3

(digitoxose) 3

digoxine

Digitalis purpurea

(vingerhoedskruid)

247

Voorbeeld secundair actief transport

Na+/glucose cotransporter (SGLT)

SGLT = Plasmamembraan eiwit

Bindingsplaatsen voor

2 Na+ ionen

1 glucosemolecule

2 conformaties

Bindingsplaatsen extracellulair

Hoge affiniteit voor glucose

Bindingsplaatsen intracellulair

Lage affiniteit voor glucose

Functie: opname van glucose in cel tegen concentratiegradiënt

Transportcyclus

Binding van 2 Na+ EN glucose

aan extracellulaire zijde:

coöperatieve binding

Conformatiewijziging:

bindingsplaatsen extracellulair

intracellulair

Intracellulaire afgave van Na+

EN glucose: coöperatieve

dissociatie

Conformatiewijziging:

bindingsplaatsen intracellulair

extracellulair

248

SGLT: transportcyclus

249

Figure 8-13

Toepassing: opname van

glucose in dundarm

250

Transepitheliaal transport

Transcellulair: doorheen apicale en basolaterale membraan

Paracellulair: tussen de cellen door

In functie van type van tight junctions

Niet doorlaatbaar voor glucose

Transepitheliaal transport van glucose

Transcellulair

Epitheel = gepolariseerd

Apicale zijde lumen

Basolaterale zijde lichaam

Gescheiden door tight junctions = diffusiebarrière

Toepassing: transepitheliale opname van

glucose in dundarm

H2O

251

Model for glucose and galactose transport across enterocytes.

Wright E M et al. Physiol Rev 2011;91:733-794

©2011 by American Physiological Society

Toepassing

253

Endomembranen (BWC12)

11. Endoplasmatisch reticulum en Golgi apparaat

254

Het endomembraansysteem in eukaryote

cellen

255

Membraan- omgeven compartimenten

Endoplasma-tisch reticulum

Golgi apparaat

Endosomen

Lysosomen

Peroxisomen

Figure 12-1

Secretorische en endocytotische route

256

Figure 12-8

Secretorische route: ER Golgi SV PM

Endocytotische route: PM EV endosoom lysosoom

Endoplasmatisch reticulum

Continu netwerk van membraanomgeven cisternen Verspreid in ganse cytoplasma

Ruw versus glad ER

ER lumen

Functies Aanmaak van eiwitten voor

secretorische route

Aanmaak van lipiden

Metabole reacties

Ca2+ opslag signaaltransductie

Figure 12-2

257

lumen

Ruw versus glad endoplasmatisch reticulum

Ribosomen vastgehecht aan cytosolische zijde ruw

Synthese van eiwitten voor secretorische route

ER Golgi PM

Geen ribosomen glad

Sarcoplasmatisch reticulum

Gespecialiseerde structuur in spiercellen

Ca2+ opslag

Figure 12-2

258

Ruw endoplasmatisch reticulum

biosynthese en modificering van eiwitten

Cotranslationele translokatie

Import van eiwitten tijdens translatie

Glycosylering: initiële stappen

Vorming van disulfidebruggen

Vouwing van peptideketen

Multimerisatie

Knippen door proteasen

Kwaliteitscontrole

ERAD: ER associated degradation

S-S

N

S-S

N

259

Glad endoplasmatisch reticulum

Detoxificatie van geneesmiddelen en toxines

260

Cytochroom P-450 superfamilie: +/- 60 genen

Enzymes aanwezig in glad ER vooral in lever

Oxidering van organische moleculen

Endogene moleculen: intermediairen in steroid en lipidensynthese

Xenobiotica: geneesmiddelen, toxines

Frequente P450 reactie: mono-oxygenase reactie

RH + NADPH + H+ + O2 ROH + NADP+ + H2O

Hydroxylering hydrofieler bevordert excretie via urine

Voorbeeld: eliminatie van geneesmiddelen (fenobarbital,… )

Problemen

Inductie van mono-oxygenase tolerantie tav geneesmiddel

Interactie met andere geneesmiddelen

261

Wikipedia

RH + NADPH + H+ + O2 ROH + NADP+ + H2O

262

Wikipedia

CYP17A1

CY

P19

Interactie tussen geneesmiddelen

Inhibitie van cytochrome P450 enzymes

263

The Scientist 2010

antihistaminicum antibioticum

Interactie met voedingsstoffen

Inhibitie van cytochrome P450 enzymes

264

bergamottin

Wikipedia

265

http://goo.gl/uiykU

266

http://scienceblog.com/community/older/archives/M/1/fda0462.htm

1998

Glad endoplasmatisch reticulum

Koolhydratenmetabolisme

267

Glucose-6-fosfatase

Aanwezig in ER van lever, nier, darm

G-6-P + H2O G + Pi

Vrijstelling van glucose uit de cel via GLUT

Figure 12-3

Glad endoplasmatisch reticulum

Ca2+ opslagplaats

268

Ca2+ concentratie in lumen: +/- 1 mM

Vrijstelling in cytosol na stimulering

Gespecialiseerde eiwitten

SERCA pomp opname van Ca2+

Ca2+ vrijstellingskanalen vrijstelling van Ca2+

Ca2+ bindende eiwitten in lumen bufferfunctie

Sarcoplasmatisch reticulum: gespecialiseerde Ca2+

opslagplaats in spiercellen

Figure 14-12

Glad endoplasmatisch reticulum

Biosynthese van steroiden

269

HMG CoA reductase

Catalyseert cruciale stap in cholesterolsynthese

Statines

Inhibitoren van HMG CoA reductase remt biosynthese van C

Wordt gebruikt bij hypercholesterolemie

Cytochroom P450 mono-oxygenase

Biosynthese van cholesterol

Conversie van cholesterol

steroid hormonen

Figure 3-30

270

Wikipedia

atorvastatine

Endoplasmatisch reticulum

Biosynthese van membranen

271

Biosynthese van fosfoglyceriden

Cytosolisch blad van ER

Vereiste enzymes voor aanmaak van verschillende fosfoglyceriden

Vetzuren: synthese in cytosol incorporatie in lipiden via cytosolisch blad van ER

Verdeling tussen 2 bladen van membraan

Vereist tussenkomst van flippasen (ATP-afhankelijk)

Biosynthese van cholesterol

Nadien verspreiding naar andere membranen

Vesiculair transport: ER Golgi PM

Fosfolipiden transfereiwitten: ER mitochondria, peroxisoom

Figure 7-10

Golgi apparaat

Tussenstation in de secretorische route: ER Golgi PM

Opgebouwd uit cisternae die samen een stack vormen Cisterna: afgeplatte membraanomgeven structuur met holte (lumen)

Perinucleaire locatie

Figure 12-4

272

Golgi apparaat

Gepolariseerde structuur van stack

Figure 12-4 Cis-Golgi netwerk (CGN) = ingang

- Ontvangt vesikels van ER

fusie met CGN cisternae

- Aanvoer van eiwitten en lipiden

die in ER aangemaakt zijn

Trans-Golgi netwerk (TGN) = uitgang

- Afsplitsing van vesikels sortering

naar eindbestemming

- Verdeling van eiwitten en lipiden naar

PM, endosomen, lysosomen

Mediale cisternae = transit zone

- Modificering van eiwitten en lipiden

- Synthese van sfingolipiden (lumen)

Secretorische route

ER Golgi PM / lysosoom / endosoom

273

Golgi apparaat

Gecompartimentaliseerde structuur

274

CGN, mediale cisternae

en TGN

Verschillende samenstelling

qua enzymes, receptoren,…

verschillende functies

Voorbeeld: modificering

van suikerketens op

eiwitten en lipiden

Specifieke verdeling van

enzymes

Figure 12-5

Kleuring voor N-acetylglucosamine transferase I

mediale cisternae

Golgi apparaat

Transport doorheen Golgi apparaaat

275

Bidirectioneel transport van eiwitten en lipiden

Anterograad: CGN TGN

Transport van eiwitten en lipiden in secretorische route

Retrograad: TGN CGN (en ER)

Terugbrengen van „ontsnapte‟ ER- en Golgi-specifieke eiwitten

Mechanisme

Stationaire cisterna model (NOT)

Anterograad transport dmv vesikels die afsnoeren van cisternae

Cisternal maturation model (YES)

Antergraad transport dmv cisterna die in haar geheel opschuift in

Golgi stack

Cisternal maturation model

276

anterograad retrograad

CGN: nieuwvorming van

cisterna door fusie van

inkomende vesikels uit ER

maturatie van cisternae

- cisterna schuift in zijn

geheel op

- Verwerft progressief

enzymes en eiwitten nodig

TGN: cisterna splitst op in

vesikels voor verschillende

eindbestemmingen Via vesiculair transport

Splitsen af van distale

cisterne en versmelten

met proximale cisterne

Terugbrengen van

„ontsnapte‟ eiwitten naar

proximale cisterne

Golgi apparaat: maturatie van eiwitten in

secretorische route

Verdere maturatie van eiwitten in Golgi Bijwerken van suikerketen

Trimmen

Toevoegen van suikers

Klieving van eiwitten Proteasen, ...

Gecompartimentaliseerde maturatie van eiwitten Spatiële verdeling van maturatie-

enzymes tussen cis/mediale/trans cisternen

Progressieve maturatie van eiwitten tijdens anterograad transport doorheen Golgi apparaat

Figure 12-6

277

Ruw endoplasmatisch reticulum

biosynthese en modificering van eiwitten

Cotranslationele import

Import van eiwitten tijdens translatie

Glycosylering: initiële stappen

Vorming van disulfidebruggen

Vouwing van peptideketen

Multimerisatie

Knippen door proteasen

Kwaliteitscontrole

ERAD: ER associated degradation

S-S

N

S-S

N

278

Sortering van eiwitten (hoofdstuk 22!!!)

Probleemstelling

Sortering = aanvoer van

eiwit naar correcte

bestemming

Default bestemming is

cytosol

Translatie in cytosol

op vrije ribosomen

Afwijking van default lokatie vergt sorteersysteem

Cotranslationeel versus posttranslationeel

Figure 12-1

279

Sortering van eiwitten

Cotranslationeel versus posttranslationeel

Cotranslationeel

Ribosomen in ruw ER

Tijdens translatie

secretorische route

Postranslationeel

Vrije ribosomen in cytosol

Na translatie

Cytosol, kern, mitochondria

Figure 22-13

280

Sorteersignalen = adreslabel voor eiwit

Sorteersignaal

Aminozuursequentie in peptideketen

Bevat informatie voor correcte sortering van eiwit naar

eindbestemming

Vereist herkenning door receptor

Voorbeelden van sorteersignalen (zie ook verder)

Signaalpeptide = hydrofobe sequentie aan NH2-terminus van

peptide cotranslationele import in ER

Mannose-6-fosfaat sorteersignaal voor lysosomale enzymes

KDEL sequentie sorteersignaal voor luminale ER eiwitten

281

Cotranslationele import van eiwitten in

endoplasmatisch reticulum

Sortering van

Secretorische eiwitten

extracellulair

Eiwitten in lumen van ER,

Golgi en lysosoom

Membraaneiwitten

Mechanisme: cotranslationele import in ER

Sorteersignaal = signaalpeptide aan NH2-terminus

Receptor: Signaal Recognitie Partikel (SRP)

Translocon: eiwitkanaal in membraan van ER

Figure 12-2

282

Cotranslationele import: overzicht

Start: translatie

in cytosol

Einde:

gevouwen eiwit

in lumen ER

Cotranslationele

translocatie

283

Figure 22-16

Cotranslationele translocatie

Binding van SRP-ribosoom aan ER

Start translatie in cytosol

NH2-ter: hydrofoob signaalpeptide

Binding van SRP aan signaalpeptide en ribosoom

Onderbreken van translatie

Binding van SRP/ribosoom/peptide complex aan SRP receptor in ER membraan

Overdracht van ribosoom naar translocon

Openen van translocon

Invoegen van peptideketen in translocon

Dissociatie van SRP en receptor hervatten van translatie

284

Figure 22-16

Cotranslationele translocatie

Binding van SRP-ribosoom aan ER

Start import van groeiende peptideketen in lumen van ER NH2-ter beweegt door

translocon en verschijnt in lumen

Signaalpeptidase: klieft signaalpeptide in lumen ER

Verdere import van peptide

Stoppen cotranslationele translocatie

Stop translatie aan stop codon in mRNA

Ribosoom dissocieert van ER

Sluiten van translocon zodra peptideketen door translocon

Resultaat: peptideketen in lumen van ER

285

Figure 22-16

Signaal Recognitie Partikel

SRP = Eiwit-RNA complex

Lokatie

Vrij SRP: cytoplasmatisch

SRP/ribosoom complex

ER

Bindingsplaatsen voor

Hydrofoob signaalpeptide

Ribosoom: stop translatie

SRP receptor in ER

GTPase activiteit

Controle van translatie

SRP receptor Membraaneiwit in ER

Deel van translocon

Binding van SRP/Ribosoom/ peptide complex Hervatten van translatie

GTPase activiteit Controle van translatie

Figure 22-16

286

Translocon

Complex van membraaneiwitten in rER

SRP receptor

Ribosoomreceptor

Kanaal met transmembranaire porie

Signaalpeptidase

Klieving van signaalpeptide

Schakeling van translocon

Vrij translocon = gesloten

Binding van ribosoom/peptide complex

open

Figure 22-16

287

Insertie van eiwitten in membraan van

endoplasmatisch reticulum

Topologie van membraaneiwit: aantal en oriëntatie transmembranaire segmenten

Aantal TM 1 1 1 2 of meer

NH2-ter Exoplasma Cytoplasma Exoplasma Exo- of cytoplasma

COOH-ter Cytoplasma Exoplasma Cytoplasma Cyto- of exoplasma

Mechanisme Signaalpept

Stop-trans Start-

transfer Start-

transfer Start-transfer stop-transfer 288

Insertie van membraaneiwitten via stop-

transfersequentie

Start cotranslationele import: NH2-terminaal signaalpeptide

Signaalpeptide SRP binding aan ER openen translocon

Klieving van signaalpeptide NH2-ter vrij in lumen van ER

Stop cotranslationele translocatie: stop-transfersequentie

Hydrofobe sequentie bindt in translocon stop translocatie

289

Insertie van membraaneiwitten via stop-

transfersequentie

Verankering van stop-transfersequentie in membraan

Translocon: laterale opening stop-transfersequentie schuift in membraan vormt transmembranair segment van eiwit

Verdere translatie: peptideketen aan cytoplasmasmatische zijde

COOH-ter van eiwit blijft in cytosol

290

Insertie van membraaneiwitten via start-

transfer sequentie

Start translatie in cytosol Geen NH2-ter signaalpeptide!

Start-transfersequentie Fungeert als ER signaalpeptide binding aan SRP en rkrutering naar ER

Hydrofobe sequentie schuift uit translocon vorming van transmembranair segment

Geen klieving door signaal-peptidase

291

Endomembranen (BWC12)

12. Secretorische route

292

Secretorische route

ER Golgi SV PM

293

Figure 12-8

• Modificering van eiwitten

• Sortering van eiwitten

Ruw endoplasmatisch reticulum

biosynthese en modificering van eiwitten

Cotranslationele translokatie

Import van eiwitten tijdens translatie

Glycosylering: initiële stappen

Vorming van disulfidebruggen

Vouwing van peptideketen

Multimerisatie

Knippen door proteasen

Kwaliteitscontrole

ERAD: ER associated degradation

S-S

N

S-S

N

294

Correcte vouwing van eiwitten in ER

Verwerven van correcte

tertiaire structuur

Gebeurt in lumen van ER:

co- en posttranslationeel

“spontane” vouwing

AZ sequentie bevat

voldoende informatie voor

correcte structuur

Maar: spontane vouwing

verloopt traag (uren)

Gefaciliteerd door eiwitten

in lumen van ER

Assistentie door

Chaperone eiwitten: binden

aan groeiende keten en

beletten verkeerde vouwing

en aggregatie

BiP (Binding Protein)

Calreticuline en calnexine:

lectines

“Vouwenzymes”

Proteïne disulfide isomerase

Peptidyl-prolylisomerase:

cis/trans isomerisatie van

peptidyl-prolylbinding

295

Figure 3-5 Labeled

Vorming van disulfidebruggen in luminale

peptideketens

Vorming van –S-S- brug

Oxidering van –SH groepen

Vereist oxiderende

omgeving

ER bevat oxiderende

factoren in lumen

Cytosol: reducerende

omgeving!

PDI: proteïne disulfide

isomerase

Oxidoreductase in lumen

van ER

Vorming van

disulfidebruggen

Aanleggen van nieuwe –S-S-

bruggen

Herschikking van reeds

gevormde –S-S- bruggen

Cotranslationele activiteit

297

N-Glycosylering van eiwitten in ER en Golgi

Covalente vasthechting van suikergroep op Asn residu Secretorische eiwitten

Membraaneiwitten: exoplasmatische zijde

Suikergroep Eerst aanhechten van kerngroep

van 14 residu‟s in ER

Glc3Man9(GlcNAc)2

Daarna modificering in ER en Golgi

Knippen en bijvoegen van suikers

Diversifiering van suikergroep

Via oligosaccharyl transferase Membraaneiwit in ER: associeert

met translocon complex

Cotranslationele werking

298

Synthese van oligosaccharide precursor

Precursor = glycolipide in

membraan van ER

Dolichol pyrofosforyl

oligosaccharide

Biosynthese in ER

Sequentiële reacties...

Start in cytosolisch blad van

ER

Flipflop van precursor

Afwerking in lumen van ER

Figure 12-7

299

300

Figure 12-7

N-Glycosylering en initiële modificering van

suikergroep in ER

N-glycosylering door transfer

Cotranslationele aanhechting van kerngroep

Donor: dolichol precursor

Acceptor: Asn residu in luminaal deel van peptideketen

Modificering

Verwijderen van terminale glucose residu‟s

Belangrijk voor kwaliteitscontrole

Verwijderen van 1 terminale mannose

Figure 12-7

301

Rol van suikergroep in kwaliteitscontrole

van eiwitten in ER

302

Calnexine, calreticuline

- Binden aan terminale monoglucose van suikergroep

- Bevorderen correcte vouwing van eiwitten

Rol van suikergroep in kwaliteitscontrole

van eiwitten in ER

303

Glucosidase II

- Verwijdert terminale glucose

- Eiwit dissocieert van calnexine, calreticuline

Rol van suikergroep in kwaliteitscontrole

van eiwitten in ER

304

Indien eiwit correct gevouwen export naar Golgi

Indien eiwit verkeerd gevouwen retentie in ER

- UGGT herkent verkeerde vouwing glycosylering van eiwit

- Calnexine en calreticuline binden eiwit via glucose herstel vouwing

Rol van suikergroep in kwaliteitscontrole

van eiwitten in ER

305

Indien eiwit onherstelbaar verkeerd gevouwen afbraak

- Export naar cytosol

- Afbraak door proteasoom

Kwaliteits-controle

in ER

Golgi

Ubi

Pro

teas

oom

Kwaliteitscontrole in ER

• Chaperones binden eiwit

• Assistentie bij vouwing

• Dissociatie van chaperones

• Cargo in transportvesikel

• Exit uit ER

• Transport naar Golgi

Retentie in ER en poging tot hervouwing

Bij mislukking: translocatie naar cytosol

• Via translocon: retrograde beweging!

• Poly-ubiquitinylering in cytosol afbraak door

proteasoom

Correcte vouwing Verkeerde vouwing

ERAD

Glycosylering van eiwitten: modificering van

suikergroep in Golgi apparaat

Progressieve modificering van suikergroep in Golgi apparaat Compartimentalisering in lumen van

enzymes voor toevoegen/verwijderen van suikerresidu‟s

Cis Golgi Trimmen van mannose residu‟s

Mediaal Golgi Verdere trimming

Toevoegen van andere suikers

Trans Golgi Verder toevoegen

van suikers

Diversifiëring van suikergroep Eiwitspecifieke modificering

Figure 12-6

307

Glycosylering van membraaneiwitten

voorbeeld: glycoforine

308

Singlepass membraan eiwit in RBC

Extracellulaire N-terminus

16 suiker-groepen

1 N-linked

15 O-linked

Negatieve lading afstoting van RBC Figure 7-26

Figure 7-21

Glycocalixlaag

309

Extracellulaire suikerlaag

aan celoppervlak

Glycolipiden en glycoproteïnen

Moleculaire diversiteit ifv

samenstelling van suikers

Functie

Celadhesie

Celrecognitie

ABO bloedgroepensysteem

Binding van antilichamen

Signaaltransductie: binding van

signaalmoleculen

Figure 7-27

Congenital Disorders

of Glycosylation

Human diseases

caused by genetic defects

in N-glycosylation pathways

Freeze HH (2006). Nature Reviews Genetics 7: 537-51. Aebi M and Hennet T (2001). Trends in Cell Biology 11: 136-41

310

Transport van eiwitten in ER en Golgi

apparaat

311

Figure 12-8

Transport van eiwitten in ER en Golgi

apparaat: probleemstelling

312

Stroom van eiwitten doorheen endomembraansysteem

Anterograde stroom: ER Golgi eindbestemming

Onderdeel van de secretorische route

ER: aanmaak + modificiering van eiwitten

Golgi: modificering van eiwitten

TGN: finale sortering van eiwitten

Eindbestemming: plasmamembraan, endosoom, lysosoom

Retrograde stroom:

Trans Golgi mediaal Golgi cis Golgi

Golgi ER

Transport van eiwitten in ER en Golgi

apparaat: probleemstelling

313

Hoe bereikt eiwit de juiste bestemming?

Tag = adreslabel die eiwit naar eindbestemming stuurt

Korte aminozuursequentie in eiwit

Oligosaccharideketen

Hydrofoob domein: lengte van transmembranaire helix

Vereist herkenning van tag door sorteersysteem

Hoe behouden ER en Golgi een constante

eiwitsamenstelling?

Retentie van specifieke eiwitten: belet ontsnappen uit ER, Golgi

Terugbrengen van ontsnapte eiwitten via retrograad transport

Retentie en terugbrengen van eiwitten in ER

314

Retentie

Tag: RXR

Regelbaar door maskering

Multimere complexen

Belet inclusie van eiwit in

transportvesikels naar CGN

Terugbrengen: CGN ER

Tag: -KDEL

in CGN: -KDEL eiwitten

ingesloten in

transportvesikels naar ER

Figure 12-8

Retentie en terugbrengen van eiwitten in

Golgi apparaat

315

Tags

Retentie van Golgi eiwitten?

Terugbrengen van Golgi eiwitten

Multimere complexen

Lengte van transmembranaire helix van membraaneiwitten

Dikte van membraan neemt progressief toe: cis trans

Lengte van helix neemt progressief toe: cis trans

Match tussen dikte lengte

Figure 12-8

Eiwit sortering in TGN: sortering van

solubele lysosomale eiwitten

316

Solubele lysosomale eiwitten

Zure hydrolasen afbraak van lysosomale inhoud

Volgen secretorische route

ER: aanmaak + modificering

Golgi: modificering suikergroep!

TGN: sortering naar endosomen lysosomen

Cruciale tag: mannose-6-fosfaat

Tag voor sortering in TGN opname in transportvesikels voor endosomen

Figure 12-8

Eiwit sortering in TGN: sortering van zure

hydrolasen via mannose-6-fosfaat tag

ER

Aanmaak van zure hydrolase

N-glycosylering van zure hydrolase

Golgi

Modificering van kernsuikergroep

Trimmen

Toevoegen van mannose-6-fosfaat tag

Specifiek voor ZH

Figure 12-9

317

Eiwit sortering in TGN: sortering van zure

hydrolasen via mannose-6-fosfaat tag

TGN

M6P tag wordt herkend door specieke receptor

Inclusie in transport-vesikel naar endosoom

Endosoom

M6P tag dissocieert van receptor door lage pH

ZH stromen door naar lysosoom

Receptor terug naar TGN

Figure 12-9

318

Eiwit sortering naar de plasmamembraan

Geregelde versus constitutieve secretie

319

TGN secretorische vesikel plasmamembraan

Afgave van eiwitten bestemd voor extracellulaire ruimte

Collageen, elastine,…

Stollingsfactoren, albumine..

Aanvoer van eiwitten en lipiden naar plasmamembraan

Exocytose = fusie van vesikel met plasmamembraan

2 routes

Constitutieve route

Geregelde route

Figure 12-8

Constitutieve secretie

320

TGN vesikel PM

Continu proces

Vereist geen bijkomend

signaal

Default pathway

Voorbeeld

Afgave van collageen, elastine,

mucus voor extracellulaire

matrix

Aanvoer van eiwitten en

lipiden naar plasmamembraan

Figure 12-8

Geregelde secretie

321

TGN vesikel PM

Geregeld proces

Fusie van vesikel met PM vereist bijkomend signaal

Voorbeeld

Secretie van insuline door -cellen van pancreas

Signaal = glucoseconcentratie in bloed

Secretie van zymogen granulen door pancreas

Signaal = hormoon, NT,

Figure 12-8

Geregelde secretie: sortering van eiwitten in

zymogen granulen

322

Zymogen granule

Secretorische vesikel in exocriene cellen

Pancreas, dundarm

Geregelde secretie

Sortering van eiwitten in ZG

TGN: condensatie van eiwitten

Aggregatie van ZG eiwitten door lage pH in TGN

Aggregaat inclusie in ZG

Modificering in ZG

Proteolyse

Figure 12-11

Exocytose

Sluitstuk van de secretorische route

323

Figure 12-8

Secretorische route: ER Golgi SV PM

Exocytose = fusie van SV met plasmamembaan

Figure 12-12

Mechanisme van exocytose

324

SV: transport van TGN naar

PM

Actief transport via

microtubuli

en moleculaire motor

Aanmeren aan

plasmamembraan

Contact tussen SV en PM

Vergt herkenning van PM

Eiwit-eiwitinteracties tussen SV

en PM

Figure 12-12

Mechanisme van exocytose

325

Fusie van membranen van SV en PM

Vergt signaal in geregelde secretie

Ca2+ signaal start fusie

Behoud van topologie

Lumen vesikel extracellulaire ruimte

Afgave van inhoud van vesikel

Solubele eiwitten extracellulair

Membraaneiwitten plasmamembraan

Figure 12-12

Gepolariseerde secretie in epitheelcel

Gepolariseerde epitheelcel

Apicale membraan

Basolaterale membraan

Differentiële sortering van

eiwitten en lipiden in TGN

TGN apicale membraan

TGN basolaterale

membraan

Belang

Verschillende eiwitsamenstelling van apicale en basolaterale membraan

Functionele diversiteit van apicale en basolaterale membraan

Nature Cell Biology 2003

326

Endomembranen (BWC12)

13. Endocytotische route

327

Secretorische en endocytotische route

328

Figure 12-8

Secretorische route: ER Golgi SV PM

Endocytotische route: PM EV endosoom lysosoom

Exocytose en endocytose

Transport doorheen plasmamembraan

329

Figure 12-12 Figure 12-13

Exocytose

Afgave van intracellulair materiaal

Endocytose

Opname van extracellulair materiaal

Ca2+

Endocytose

Startpunt van de endocytotische route

330

Endocytotische route: PM endocytotische vesikel

endosoom lysosoom

Endocytose = vorming van endocytotische vesikel thv PM

Figure 12-13

Verschillende vormen van opname van

extracellulair materiaal

• Fagocytose: opname van grote

partikels (> 0,5 mm)

• Endocytose: opname via kleine

vesikels

• Pinocytose: opname van

vloeistof en opgeloste stoffen

• Receptor-gemedieerde

endocytose: opname van ligand

Fagocytose: opname van grote partikels

331

Voorkomen

Gespecialiseerde cellen: macrofagen, neutrofielen (WBC)

Opruimen van bacteriën, parasieten, dode en apoptotische cellen…

Mechanisme

Binding van bacterie aan PM van

Vorming van pseudopodia

Membraanuitsteeksels die bacterie insluiten

Afsnoering en vorming van fagosoom

Fusie met endosoom/lysosoom

Afbraak van bacterie in lysosoom

Figure 12-14

Figure 6 The Three Steps of Apoptotic Cell Removal (A) The dying cell releases soluble find-me signals in order to attract professional

phagocytes. (B) Once at its site of action, having close contact to the apoptotic cell, the phagocyte is abl...

Molecular Cell Volume 14, Issue 3 2004 277 - 287

http://www.tumblr.com/tagged/digit-formation

333

http://goo.gl/LaUvh

Nature Reviews Immunology 1, 20-30 (October 2001)

Fagocytose van mycobacterium tuberculosis

Blok van fagocytoseproces

Receptor-gemedieerde endocytose

Opname van extracellulaire moleculen

Eiwitten

Vitaminen, Fe2+

Lipiden (cholesterol)

Virussen, toxines…

Mechanisme

Binding aan receptor in PM

Instulping van PM

Afsnoering en vorming van endocytotische vesikel

Figure 12-15

334

Receptor-gemedieerde endocytose

Mechanisme

1. Binding van extracellulaire ligand (L) aan receptor (R)

Receptor = PM eiwit

Selectieve binding

2. Rekrutering van manteleiwitten aan cytosolische zijde polymerisering tot mantel

Concentratie van LR complexen in coated pits

Figure 12-15

335

336

Figure 12-15

Receptor-gemedieerde endocytose

Mechanisme

3. Instulping van PM

Assemblage van

manteleiwitten aan cyto-

solische zijde membraan

curvatuur

4. Afsnoering en vorming

van endocytotische

vesikel

Omgeven met mantel aan

cytosolische zijde

Behoud van topologie!

Figure 12-15

337

Receptor-gemedieerde endocytose

Mechanisme

5. Ontmanteling van vesikel

Depolymerisering van

manteleiwitten

Vorming van „naakte vesikel‟

Recyclage van

manteleiwitten naar PM

voor volgende cyclus

Naakte vesikel transport

langs microtubuli

Figure 12-15

338

Receptor-gemedieerde endocytose

Mechanisme

6. Fusie van vesikel met vroeg endosoom (uit TGN)

Dissociatie van LR complex door zure pH in endosoom

Scheiding van L en R in verschillende domeinen van endosom

7. Transport

Receptor PM

Ligand laat endosoom en lysosoom afbraak

Figure 12-15

339

Receptor-gemedieerde endocytose

Voorbeeld

Figure 12-16

340

Receptor-gemedieerde endocytose

Voorbeeld: opname van virus

16-341

Receptor-gemedieerde endocytose van

Low Density Lipoprotein partikels

LDL partikel ≈ vetbol Samenstelling

Fosfolipiden monolaag

Cholesterolesters: in centrum van partikel

1 eiwit: ApoB-100

Transportvehikel voor cholesterol in bloed Opname door cellen via RME

LDL-receptor

Integraal plasmamembraaneiwit

Extracellulair deel

Binding van LDL partikel via ApoB100

Intracellulair deel

Binding van manteleiwitten

Figure 12-B1

342

Receptor-gemedieerde endocytose van

Low Density Lipoprotein partikels

343

Opname van LDL partikel via LDL-receptor

Differentiële sortering

LDL-receptor: recycling naar PM

LDL partikel lysosoom

Afbraak van LDL partikel in lysosoom

Vrijstelling van cholesterol

Cholesterol transport naar cytosol

Figure 12-B2

Familiale hypercholesterolemie

Erfelijke aandoening Normaal [cholesterol]bloed < 190 mg/dl

Vooral LDL –cholesterol telt: < 130 mg/dl

Indien cholesterol stijgt slaat neer in vaatwand atheromatosis

Hoge morbiditeit en mortaliteit Hartinfarct

Cerebrovasculair accident: hersenthrombose

Genetica Mutaties in gen voor LDL receptor

Defect cytosolisch domein

Mutaties in gen voor AP2 subeenheid

344

345

Nature 2008

Lysosomen en cellulaire vertering

Lysosoom = terminaal‟ organel

Eindpunt voor endocytotische route

Samenstelling van lysosoom

Zure luminale pH: ~5

ATP-gedreven protonpomp

Zure hydrolasen: afbraak van eiwitten, DNA, suikers, lipiden, ....

pH optimum ~5

Membraantransporters: vrijstelling van afbraakproducten

Functie

Opruimen van moleculen aangevoerd via endocytose, (auto)fagocytose vrijstellen van afgebroken moleculen

346

Sortering van zure hydrolasen naar

lysosoom

ER: aanmaak van zure hydrolase

N-glycosylering

Golgi: modificering van kernsuikergroep

Vorming van mannose-6-fosfaat tag

TGN: sortering naar endosoom via M6P-R

Clathrine vesikels

Endosoom: verdere sortering naar lysosoom

Figure 12-9

347

Vorming van lysosomen

Aanvoer van materiaal naar lysosomen

348

Endocytose

Aanvoer van

extracellulaire

moleculen

Fagocytose

Aanvoer van

extracellulaire

partikels

Autofagocytose

Aanvoer van

intracellulaire

componenten

Figure 12-21

Vorming van lysosomen

Endosoom heterofaag lysosoom

349

Vroege endosomen

Ontstaan door fusie van endocytotische vesikels

Fusie van TGN transport vesikels

pH = 6

Maturatie tot laat endosoom

pH = 5.5

Fusie met lysosoom

pH < 5 activering van hydrolasen

Figure 12-21

Vorming van lysosomen

Fagocytose heterofaag lysosoom

350

Fagosoom

Ontstaat door omsluiting van extracellulair materiaal

Fusie met vroeg endosoom

Maturatie tot laat endosoom

pH = 5.5

Fusie met lysosoom

pH < 5 activering van hydrolasen

Figure 12-21

Vorming van lysosomen

Autofagocytose autofaag lysosoom

351

Autofagosoom

Ontstaat door omsluiting van intracellulair materiaal

Fusie met vroeg endosoom

Maturatie tot laat endosoom

pH = 5.5

Fusie met lysosoom

pH < 5 activering van hydrolasen

Figure 12-21

Autofagie

352

Opruimen van oude/beschadigde

organellen

Vorming van autofagosoom

Vorming van membraanfragment

dat organel omsluit

Identificatie van beschadigde

organellen?

Herkomst van membraan: ER?

Fusie van autofagosoom met

endosoom lysosoom

Figure 12-22

Eindproducten van lysosomale vertering

353

Vrijstelling van

individuele

moleculen naar

cytoplasma

Transmembranair

transport

Residual bodies

Opstapeling in

cytosol

Afgave aan

extracellulaire ruimte

Figure 12-21

Lysosomale

stapelingsziekten

Endomembranen (BWC12)

14. Vesiculair transport

355

14-356 Donorcompartiment Doelwitcompartiment

Vesiculair transport: overzicht

1. Vorming van vesikel

2. Anterograad transport

3. Fusie van vesikel

4. Retrograad transport

Figure 12-8

Vesiculair transport via coated vesikels

Transport van een „vracht‟

(cargo) via een

membraanomgeven vesikel

Cargo

Solubele eiwitten in lumen

Membraaneiwitten

Membraanlipiden

Tussen membraanomgeven

celorganellen en

plasmamembraan

Secretorische route: ER

Golgi plasmamembraan

Endocytotische route: PM

endosoom lysosoom

357

Coated vesikels

358

Transportvesikel in secretorische en endocytotische route

Aan cytosolische zijde bekleed met mantel

Gepolymeriseerde eiwitten

Functie van mantel(eiwitten)

Selectie van cargo van vesikel

Inductie van curvatuur van membraan vorming van vesikel

Interactie met microtubuli transport Clathrin coat Coated

vesicle Figure 12-16

Functie van manteleiwitten

Opladen van vesikel met cargo-eiwitten

2011-12

Selectieve inclusie van cargo door

interactie met manteleiwitten

Sorteersignalen in cargo bepalen

interactie met mantel

Cargo-membraaneiwitten: bevatten

sorteersignaal in cytoplasmatisch deel

Rechtstreekse binding aan mantel

Cargo luminale eiwitten: binden aan

cargoreceptor in membraan

Cargoreceptor bindt aan mantel

Niet-selectieve inclusie van cargo

Bulk flow of massatransport Cargo

Cargoreceptor

Indeling van coated vesikels op basis van

manteleiwitten

Indeling van vesikels in functie van eiwitsamenstelling van

mantel

Clathrine, COPI, COPII

Type van mantel verschilt naargelang transportstap

Specifieke vorming van coated vesikels in verschillende routes

360

Indeling van vesikels op basis van

manteleiwitten

Manteleiwitten: evenwicht tussen

Vrije vorm in cytosol

Gepolymeriseerde vorm aan cytoplasmatische zijde van uitstulpende vesikel

Indeling van vesikels in functie van eiwitsamenstelling van mantel COPII, COPI, clathrine

Verschillend naargelang transportstap

361

Clathrine vesikel

Transportvesikel met clathrinemantel aan cytosolische zijde

Betrokken in

TGN endosoom transport

Vorming van endocytotische vesikel

TGN PM?

Samenstelling van clathrinemantel

Clathrine triskelia buitenzijde van mantel

Polymeriseren tot korfstructuur

Adaptoreiwit (AP): binnenzijde van mantel

Tussenstuk tussen clathrine en membraan

Clathrin coat Coated

vesicle

Figure 12-16

362

Clathrine triskelion

363

Multimere samenstelling van eiwit triskelion

Polymerisering van triskelia hexagon of pentagon

Figure 12-17

Vorming van clathrine netwerk

364

Assemblage van hexagonen vlakke structuur

Assemblage van mix van hexagonen en pentagonen korfstructuur

Figure 12-18

365

Adaptoreiwitten

366

Verschillende types AP

naargelang transportroute

AP1: TGN endosoom

AP2: PM endosoom

AP3

GGA

Binden aan membraan-

eiwitten (receptoren)

Concentratie van vesikelcargo

Platform voor vasthechting

van clathrine triskelia

Vorming van een clathrine vesikel

Opladen van cargo en afsnoering

367

Opladen van cargo: Selectieve inclusie door

interactie met AP eiwitten

Inductie van membraancurvatuur Vorming van clathrinekorf

trekt membraan mee

Afsnoering van hals van instulping door dynamine

Ontstaan van een clathrinevesikel in cytosol

Ontmanteling van vesikel Naakte vesikel fusie met

doelwitmembraan

Vorming van een COPII vesikel

368

Vorming van coated vesikel

GTPasen als timers voor (de)polymerisering

Vesikelvorming: gecontroleerd door monomere GTPasen

Sar1: COPII vesikels

ARF: COPI en clathrine vesikels

Sar1-GDP = uit Sar1-GTP = aan

Pi H2O GAP

•Associatie met membraan •Start polymerisering van manteleiwitten

GDP GTP

GEF

•Dissociatie van membraan •Depolymerisering van mantel

369

COP II vesikels: anterograad ER Golgi

transport

370

ER: vorming van COPII vesikels

Vorming van mantel door

polymerisering van COPII

Opladen van cargo door

interactie met COPII mantel

COPII mantel

Multimere samenstelling

Sar1 = trigger voor

polymerisering

Figure 12-8

COP I vesikels: retrograad Golgi

ERtransport

371

Golgi: vorming van COPI vesikels

Vorming van mantel door

polymerisering van COPI

Opladen van cargo door

interactie met COPI mantel

Vb KDEL receptor

COPI mantel

Multimere samenstelling

ARF = trigger voor

polymerisering

Figure 12-8

14-372 Donorcompartiment Doelwitcompartiment

Vesiculair transport: overzicht

1. Vorming van vesikel

2. Anterograad transport

3. Fusie van vesikel

4. Retrograad transport

Aanmeren van vesikel en fusie met

doelwitmembraan

Aanmeren

Herkenning van doelwitmembraan

Binding aan membraan

Fusie

Versmelting van membranen

Afgave van cargo

Figure 12-19

373

Aanmering en fusie van transportvesikel

Rab

Rab GTPase: moleculaire schakelaar voor aanmering Rab-GTP: bindt aan

cytoplasmatische zijde van transportvesikel

Rab-GDP: dissocieert van membraan (na fusie)

Rab-GTP bindt aan tethering eiwitten in doelwitmembraan

Aanmering-stap 1: specifiek contact tussen vesikel en doelwitmembraan door Rab interactie Specifieke binding van Rab-GTP in vesikel aan tethering eiwit in doelwit

Specifiek Rab/Rab-effector paar voor elke transportstap Voorbeeld: Rab5/EEA1: fusie van endocytotische vesikels

Figure 12-19

374

375

Aanmering en fusie van transportvesikel

v-SNARE/t-SNARE interactie

SNARE eiwitten: membraaneiwitten met cytoplasmatische a-helix

v-SNARE: vesikel

t-SNARE: doelwitmembraan

Complementaire eiwitten vorming van v/t SNARE complex

Aanmering-stap 2: specifiek contact tussen vesikel en doelwitmembraan door SNARE interactie

Vorming van specifieke v/t SNARE complexen

Specifiek v-/t-SNARE paar voor elke transportstap

Figure 12-19

376

v/t SNARE complex

SNARE eiwitten in presynaps

v-SNARE = VAMP en t-SNARE = SNAP-25 en syntaxin

Verstrengeling van 4 cytoplasmatische a-helices

Stabiel complex: Smelttemperatuur > 70 °C Opheffing vergt energie!!!

377

Aanmering en fusie van transportvesikel

Versmelting van membraan

Fusie van membranen van vesikel en doelwitcompartiment Versmelten van

lipidendubbellaag

Afgave van cargo aan acceptor

Koppeling aanmering-fusie Automatisch bij vesiculair

transport tussen organellen

Ca2+ afhankelijk in presynaps, endo/exocriene secretie

Mechanisme van fusie:

Bijeenbrengen van membranen door v/t-SNARE complexen Versmelting van cytoplasmatische bladen en exoplasmatische bladen

Incorporatie van vesikel in doelwitmembraan

Figure 12-19

378

Aanmering en fusie van transportvesikel

Dissociatie van SNARE complex

Ontrafelen van v/t-SNARE complex Vergt cytoplasmatische

eiwitten NSF: ATPase

a-SNAP: bindt aan SNARE complex

Vergt energie wegens stabiliteit van SNARE-complex

Mechanisme van ontrafeling NSF bindt aan SNARE complex via a-SNAP

NSF: hydrolyse van ATP vrijgekomen energie benut voor ontrafeling van SNARE‟s

Figure 12-19

379

14-380

Botulisme &

BOTOX

Peroxisomen

381

Organel met enkele membraan

Samenstelling

Catalase: afbraak van H2O2

Oxidase: aanmaak van H2O2

Uraatoxidase kristalkern

….

Functie

H2O2 metabolisme

Vetzuur oxidering

Detoxificatie

Figure 12-23

Functie van peroxisomen

H2O2 metabolisme

382

Afbraak van H2O2 in lumen van peroxisoom

H2O2 = oxidans schadelijk voor cel

Aanmaak en afbraak in lumen van peroxisoom bescherming

van rest van cel tegen H2O2

2 RH2 + 2 O2 2 R + 2 H2O2 oxidase catalase

O2 + 2 H2O

R‟ + 2 H2O R‟H2

peroxidase

383

www.kennislink.nl

Wikipedia

H2O

H2O2

Niet-reactief goed oplosmiddel omwille van polariteit

Zeer reactieve stof zeer schadelijk

- Oxidans

- Vorming van hydroxyl radicaal Waterstofperoxide

Nedeljkovic Z S et al. Postgrad Med J 2003;79:195-200

Copyright © The Fellowship of Postgraduate Medicine. All rights reserved.

ROS = Reactive Oxygen Species

- O-bevattende moleculen: superoxide anion, waterstofperoxide, hydroxyl radicaal

- Zeer reactief celbeschadiging ziekteprocessen, verouderingsproces

- Oxidantia

- Vrije radicalen

- Nevenproduct van metabolisme

- Nood aan eliminatie van ROS: superoxide dismutase, catalase, anti-oxidantia

ROS: vriend of vijand?

385

PNAS 2008

Nature 2008

Gelocaliseerde aanmaak Veralgemeende afbraak

Functie van peroxisomen

Detoxificatie

386

Peroxidase reactie

Oxidering van R‟H2 tot onschadelijk eindproduct

Afbraak van methanol, ethanol … in lever en nier

Eliminatie van Reactive Oxygen Species (ROS)

ROS = O2- , OH°

Ongepaard elektron heel reactief oxidatieve stress voor cel

Eliminatie door catalase, superoxide dismutase, ..

2 RH2 + 2 O2 2 R + 2 H2O2 oxidase

R‟ + 2 H2O

R‟H2

peroxidase

Functie van peroxisomen

Vetzuuroxidering

387

Peroxisomen

Oxidering van

Long chain vetzuren: C16 tot C22

Very long chain vetzuren: C22 tot C24

Vertakte vetzuren

Eindproducten

Acetyl-CoA Krebs cyclys

C16-CoA verdere oxidering in mitochondria

Mitochondria

Oxidering van korte vetzuren (<C16)

Figure 10-11

15. De cel als electrisch circuit

388

Signaaltransductie: prikkelbaarheid

(BWC8)

389

Signaaltransductie: prikkelbaarheid

390

Componenten en eigenschappen van elektrische circuits Weerstand, capaciteit, spanningsbron

Wetten van Kirchhoff, wet van Ohm

De cel als elektrisch circuit Membraanstroom en het begrip drijvende kracht

Het begrip membraanpotentiaal

Passieve voortgeleiding van elektrische signalen

Ionenkanalen

Meten en beschrijven van ionenkanalen

Selectiviteit en schakelmechanismen

Ontstaan en voortgeleiding van actiepotentialen

Componenten van elektrische circuits

1) (constante) spanningsbron

391

( )

( )

Grootheid: Elektrische spanning (V, E)

Eenheid van elektrische spanning: Volt (V)

Componenten van elektrische circuits

2) (constante) stroombron

392

Grootheid: Elektrische stroom(I,i)

Eenheid van elektrische stroom: Ampere (A)

Componenten van elektrische circuits

3) weerstand

393

Grootheid: Weerstand (R,r)

Eenheid van weerstand: Ohm ()

Grootheid: Conductantie (G,g,g) = /R

Eenheid van conductantie: Siemens (S) of soms ook mhO

Eigenschappen van elektrische circuits

394

Georg Simon Ohm (1787-1854) Gustav Robert Kirchhoff (1824-1887)

Eigenschappen van elektrische circuits

395

Georg Simon Ohm (1787-1854)

1 R

Wet van Ohm:

V = IR = I/G

Eigenschappen van elektrische circuits

396

Gustav Robert Kirchhoff (1824-1887)

De eerste wet van Kirchhoff

In elk punt in een elektrisch circuit is de

som van de stromen die in dat punt

samenkomen gelijk aan de som van de

stromen die vanuit dat punt vertrekken.

iI 0

Elektrische stroom in een gesloten circuit

397

CPN D-2

Elektrische stroom in een gesloten circuit

398

R V

10 V 100

I=V/R = 0.1 A

I I

I I

Eigenschappen van elektrische circuits

399

Gustav Robert Kirchhoff (1824-1887)

De tweede wet van Kirchhoff

De som van de elektrische

potentiaalverschillen (rekening houdend

met de richting) in elke gesloten lus in

een circuit is gelijk aan nul.

iV 0

Elektrische stroom in een gesloten circuit

400

V

10 V

100

Ia = Ib = V/R = 0.1 A

Ia Ib

Itot=Ia+ Ib = 0.2 A

Elektrische stroom in een gesloten circuit

401

CPN BOX D-1

Vb = 10 V

RA = RB= 10

RC = 20

Weerstanden in parallel of in serie

402

Gtot = G1 + G2

Rtot = 1/(1/R1+ 1/R2)

G1 G2

G1

G2

Rtot = R1 + R2

Gtot = 1/(1/G1+ 1/G2)

Componenten van elektrische circuits

4) condensator

403

Grootheid: Capaciteit (C)

Eenheid van capaciteit: Farad (F)

Componenten van elektrische circuits

4) condensator

404

Q V C dV

I Cdt

Capaciteit en weerstand in parallel

405

CPN D-4

Capaciteit en weerstand in parallel

406

CPN D-4

T R C

T

I I I

V dVI C

R dt

t

RCTV I R (1 e )

t

RCR TI I (1 e )

t

RCC TI I e

Wate

rneveau

in tank

Analogie uit de hydraulica

407

CPN D-3 Str

om

ing d

oor

dunne b

uis

CPN D-5

Capaciteit en weerstand in parallel

408

CPN D-4

Signaaltransductie: prikkelbaarheid

(BWC8)

16. Selectiviteit en schakeling van ionenkanalen

409

Elektrische stroom doorheen

plasmamembraan: directionaliteit

410

+

+

Flux (J) Elektrische

stroom (I)

Inwaarts

J>0

Inwaarts

I<0

Uitwaarts

J<0

Uitwaarts

I>0

Inwaarts

J>0

Uitwaarts

I>0

Uitwaarts

J<0

Inwaarts

I<0

Effect op Vm

Depolarisatie

Vm

Depolarisatie

Vm

Repolarisatie

Vm

Repolarisatie

Vm

Equivalent circuit voor een ionenkanaal

411

Een ionenkanaal is een weerstand met een

welbepaalde ionenselectiviteit!

Het begrip “drijvende kracht”

412

De drijvende kracht voor een ion wordt bepaald door de concentratie-gradiënt

(vervat in EX) en door de spanning over de membraan (Vm).

IX = gX•(Vm- EX)

IX (iX) = 0 wanneer Vm = EX !!

(gx : membraanconductantie voor ion X)

iX = gX•(Vm- EX)

De stroom gemedieerd door ion X doorheen een enkel kanaaltje is dan

(gX : single-channelconductantie)

Drijvende kracht voor ion X : Vm - EX

De macroscopische stroom gemedieerd door ion X is dan

Elektrische stroom doorheen ionenkanalen

413

WotC 13-7

X EX

Equivalent circuit voor een ionenkanaal

414

Vm

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

Vm = -120 mV

i (p

A)

tijd (ms)

Vm = -60 mV

i (p

A)

Vm = 0 mV

i (p

A)

i (p

A) V

m = +60 mV

Equivalent circuit voor een ionenkanaal

415

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

Vm = -120 mV

i (p

A)

tijd (ms)

Vm = -60 mV

i (p

A)

Vm = 0 mV

i (p

A)

i (p

A) V

m = +60 mV

-120 -80 -40 0 40 80

-2

-1

0

1

2

3

4

i (p

A)

Vm (mV)

Stroom-spanningsdiagramma

Equivalent circuit voor een ionenkanaal

416

[Na+]i = 15 mM

[Na+]o = 150 mM

[K+]i = 150 mM

[K+]o = 15 mM

-120 -80 -40 0 40 80

-2

-1

0

1

2

3

4

i (p

A)

Vm (mV)

EK ENa

Selectief voor K+-ionen!

Equivalent circuit voor een ionenkanaal

417

-120 -80 -40 0 40 80

-2

-1

0

1

2

3

4

i (p

A)

Vm (mV)

iK = gK•(Vm- EK)

yrico

x

g

gK = 33 pS

Ladingsverplaatsing door elektrische stroom

418

0 20 40 60 80 100 120 140

-100

-80

-60

-40

-20

0

I (p

A)

time (ms)

Q=I•t

Q I dt

Ladingsverplaatsing door elektrische stroom

419

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

Vm = -120 mV

i (p

A)

tijd (ms)

Vm = -60 mV

i (p

A)

Vm = 0 mV

i (p

A)

i (p

A) V

m = +60 mV

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

Vm = -120 mV

i (p

A)

tijd (ms)

Vm = -60 mV

i (p

A)

Vm = 0 mV

i (p

A)

i (p

A) V

m = +60 mV

Q = it

Q = 4 pA 60 ms

Q = 240 fC

~1500000 K+ ionen

Open probabiliteit (Popen)

420

closedopen

open

totaal

open

opentt

t

t

tP

Fractie van de tijd dat het kanaal ionen doorlaat (open is).

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

0 200 400 600 800 1000

-2

0

2

4

Vm = -120 mV

i (p

A)

tijd (ms)

Vm = -60 mV

i (p

A)

Vm = 0 mV

i (p

A)

i (p

A) V

m = +60 mV

tijd (ms)

60 ms 40 ms 15 ms

Popen=115ms/1000 ms = 0.115

Van gX naar gX

421

Van gX naar gX

422

IX = N Popen iX IX = gX•(Vm- EX)

gx= N Popen gX

Aantal kanalen

De rustpotentiaal

423

In rust is de som van alle stroomcomponenten 0:

IK + INa + ICa + ICl (+ …) =0

Dan geldt dat

...

...

K K Na Na Ca Ca Cl Clm

K Na Ca Cl

g E g E g E g EV

g g g g

Vm benadert Ex van het ion met de

hoogste conductantie!

Rustpotentiaal en stroom-spanningsdiagramma

424

Een zenuwcel bevat 2000 K+-kanalen met een conductantie van 80 pS (gK) en een

open probabiliteit van 0.05, en 1000 Na+ kanaaltjes met een conductantie (gNa) van 20

pS en een open probabiliteit van 0.2. De volgende condities gelden:

Temperatuur: 37 °C

Intracellulaire concentraties: [Na+]i = 15 mM; [K+]i = 150 mM

Extracellulaire concentraties: [Na+]o = 150 mM; [K+]o = 1.5 mM

(Andere ionen mogen buiten beschouwing gelaten worden)

Wat is de rustpotentiaal van deze cel?

Teken een stroom-spanningsdiagramma voor de macroscopische Na+ en K+ stroom en

de totale membraanstroom.

Elektrische stroom doorheen ionenkanalen

425

Patch-clamp techniek

426

“Single-channel” metingen

- Openen en sluiten van 1 of enkele kanalen

- pA grootteorde (10-12 Ampère)

427

“Whole-cell” metingen

- Stroom doorheen de gehele membraan

- nA grootteorde (10-9 Ampère)

Patch-clamp techniek

Erwin NEHER Bert SAKMANN

Nobelprijs in Geneeskunde en Fysiologie (1991)

Patch-clamp techniek

428

Selectiviteit en schakeling

429

X EX

Selectiviteit: welke ionen kunnen

doorheen de kanaalporie diffunderen?

Schakeling: welke signalen regelen het

openen/sluiten (schakeling, “gating”)

van de kanaalporie?

Selectiviteit en schakeling

430

X EX

WotC 13-8

Selectiviteit van ionenkanalen

431

• Selectieve kanalen voor K+, Na+, Ca2+, Cl-

• Niet-selectieve kationenkanalen permeabel voor K+, Na+, Ca2+, …

Mechanismen:

1. Op basis van grootte ~zeef

2. Op basis van lading

3. Op basis van binding

Deze drie factoren bepalen samen de kanaalselectiviteit

Selectiviteit op basis van zeefwerking

432

K+-kanaal

Silhouetten van

permeante

kationen

Niet-selectief

kanaal

Selectiviteit op basis van lading

433

Cl- kanaal K+ kanaal

CLC KcsA

Positief

Negatief

Selectiviteit op basis van binding

434

Nobelprijs chemie

2003

Roderick MacKinnon

435

Bindingsplaatsen voor K+ in K+-kanaal

436

Basis voor K+-selectiviteit

437

Na+-ionen zijn 100x minder permeabel dan K+-ionen

K+-flux doorheen K+-kanaal

438

Gevolgen van het openen van ionenkanalen

439

1. Effect op de membraanpotentiaal (« Electrogenese ») • Openen van K+-kanalen: K+-efflux Vm

Repolarisatie

• Openen van Na+- of Ca2+-kanalen: Na+-(Ca2+-)influx Vm

Depolarisatie/excitatie

2. Effect op ionenconcentratie • Openen van Ca2+-kanalen: [Ca2+]i

Cellulaire response (spiercontractie, secretie…)

• Gelijktijdig openen van K+- en Cl--kanalen :

Efflux van KCl daling van celvolume

Verschillende functies vereisen verschillende schakelmechanismen!

Schakelsignalen voor ionenkanalen

440

• Geen signaal nodig: achtergrond- of lekkanalen

(background/leak channels)

• Warmte of koude: temperatuurgeschakelde kanalen

(heat-, cold-sensitive channels)

• Intra- of extracellulaire liganden: ligandgeschakelde kanalen

(ligand-gated channels)

• Mechanische stress: mechanogevoelige kanalen

(mechanosensitive channels)

• Vm: spanningsgeschakelde kanalen

(voltage-gated channels)

• Kanalen geschakeld door [Ca2+] in het ER

(store-operated channels)

Achtergrond- of lekkanalen

441

Voorbeeld: K+-lekkanalen

-permanent open gK >0

-zorgen ervoor dat in rust Vm EK

...

...

K K Na Na Ca Ca Cl Clm

K Na Ca Cl

g E g E g E g EV

g g g g

Meeste dierlijke cellen hebben een negatieve

rustpotentiaal (-60 mV)

Temperatuurgeschakelde ionenkanalen

442

Hoge temperatuur opent TRP-kanalen in zenuwuiteinde depolarisatie

(TRP = Transient Receptor Potential)

443

140

100

60

20

0

40

80

120

°C

60

50

40

30

20

10

0

10

TR

PA

1

TR

PM

8

TR

PV

4

TR

PM

3

TR

PV

1

TR

PV

3

°F

Temperatuurgeschakelde ionenkanalen

Leven zonder koude-gegeschakeld kanaal

444

Leven zonder hitte-geschakeld kanaal

445

Sommige TRP-kanalen zijn ook ligand-geschakeld!

446

TRPM8: geactiveerd door

koude en menthol

TRPV1: geactiveerd door

hitte en capsaicine

Mechanogevoelige kanalen

447

Beweging van de haartjes opent een kationenkanaal.

Voorbeeld: transductiekanaal in het slakkenhuis

448

Spanningsgeschakelde kanalen

WotC 13-9

Activatie – inactivatie - deactivatie

449

deactivatie inactivatie

Deactivatie: repolarisatie voltage sensor terug naar rusttoestand (OC)

Inactivatie: depolarisatie « ball » blokkeert de open porie (OI)

activatie

Signaaltransductie: prikkelbaarheid

(BWC8)

17. Spanningsgeschakelde ionenkanalen en actiepotentiaal

450

451

Neuronen (zenuwcellen): enkele termen

452

Afferent neuron: informatie vanuit PZS (huid, mond, organen, …) naar CZS

Interneuron: informatie binnen CZS

Efferent neuron: informatie vanuit CZS naar PZS

Effectorcel: zet input van efferente neuronen om in “actie” (vb. Spiercel, kliercel…)

Centraal zenuwstelsel (CZS):

Hersenen + ruggenmerg

Perifeer zenuwstelsel (PZS):

Neuronen buiten CZS

Algemene structuur van een typisch neuron

453

Motorneuron

PNS spier

WotC 13-1

Algemene structuur van een typisch neuron

454

Input van multipele neuronen!

455

http://www.youtube.com/watch?v=omXS1bjYLMI

Squid giant axon – reuzeneuron van de pijlinktvis

456

WotC 13-2

Vm metingen in de squid giant axon

457

WotC 13-3

Elektrische stimulatie van squid giant axon

458

WotC 13-3

Elektrische stimulatie van squid giant axon

459

~ WotC 13-3 CPN D-4

Elektrische stimulatie van squid giant axon

460

gK

EK

gK

EK

Vm EK

1

m

t

RCm

K

IV ( e )

g

CPN 6-3 CPN 6-5

Elektrische stimulatie actiepotentiaal

461

“Subthreshold”

“Suprathreshold”

CPN 7-1

De actiepotentiaal

462

0 mV

-70 mV

1 ms

« Een snelle, transiente depolarisatie van de plasmamembraan»

De actiepotentiaal: alles-of-niks!

463

Na+- en K+-kanalen bepalen AP

464

WotC 13-10

Na+- en K+-kanalen bepalen AP

465

Alan Lloyd

HODGKIN

Andrew Fielding

HUXLEY

Nobelprijs in Geneeskunde en

Fysiologie (1963)

WotC 13-10

Activatie – inactivatie - deactivatie

466

deactivatie inactivatie

Deactivatie: repolarisatie voltage sensor terug naar rusttoestand (OC)

Inactivatie: depolarisatie « ball » blokkeert de open porie (OI)

activatie

Structuur van spanningsgeschakelde kanalen

467

bovenaanzicht

Cluster van positieve

ladingen in S4 vormt

spanningsensor

Activatie: beweging van spanningssensor

468

uit

in ---------

---------

+++++

+++++ ---

---

++

++

closed open

a-helix (S4) beweegt o.i.v. transmembranair elektrisch veld

Positie van S4 is gekoppeld aan opening/sluiting van centrale porie

Spanningsafhankelijke activatie

469

Mem

bra

an

Spanningsafhankelijke activatie

470

Zicht vanuit

exoplasmatische

zijde

471

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Po

pe

n

Vm (mV)

Spanningsafhankelijke activatie: Popen ~Vm

1 2

1

1

m /

s

open V V

V

P

e

V1/2 : potentiaal waarbij Popen=0.5

Vs: maat voor steilheid van curve

EK

Oorsprong van de actiepotentiaal

Achtergrond gK (vb. Lekkanalen)

-100 -50 50 100

I

Vm (mV)

IK=gK•(Vm-EK)

-100 -50 50 100

ENa

INa=gNa•(Vm-ENa)

gNa= N Popen gNa

Oorsprong van de actiepotentiaal

Spanningsgeschakelde Na+-kanalen

I

Vm (mV)

-100 -50 50 100

Itotaal = IK+ INa

I

Em (mV)

Oorsprong van de actiepotentiaal

-100 -50 50 100

I

Em (mV)

Oorsprong van de actiepotentiaal

drempelpotentiaal

piek van

actiepotentiaal

rustpotentiaal

Na+-kanalen inactiveren tijdens AP

476

-100 -50 50 100

Oorsprong van de actiepotentiaal

Inactivatie

Signaaltransductie: prikkelbaarheid

(BWC8)

18. Voortgeleiding en modulatie van de actiepotentiaal

478

Voortgeleiding en modulatie van de

actiepotentiaal

479

Voortgeleiding van de actiepotentiaal

Passieve voortgeleiding – kabelmodel

Actieve voorgeleiding

Belang van myeline

Modulatie van de actiepotentiaal

Toxines

Lokale anesthetica

GABA-agonisten

Hoe halen we de drempel?

480

• Stroominjectie (=artificieel)

• Activatie van depolariserende stromen (gNa en/of gCa)

vb. thermoTRP in sensorisch zenuwuiteinde

• Passieve verspreiding van depolarisatie (kabelmodel!)

Voortgeleiding van actiepotentiaal

481

Passieve voortgeleiding van elektrische signalen

482

483

Passieve voortgeleiding: het kabelmodel

484

Passieve voortgeleiding: het kabelmodel

De lengteconstante

485

0

x

V V e

=2 mm

Op afstand van

stroominjectie is V nog

1/e (37%) van V op

plaats van stroominjectie.

Grote waarde voor

depolarisatie verspreidt

zich over grotere afstand.

Soortelijke weerstand ()

486

RA

487

Factoren die bepalen

2

m

i

a

m

a: straal van axon

ρ : stijgt bij betere isolatie / minder actieve ionenkanalen

Actieve voortgeleiding van actiepotentiaal

488

Actieve voortgeleiding van actiepotentiaal

489

Actieve voortgeleiding van actiepotentiaal

490

Effecten van veranderende geometrie

491

1 3

2

d

0.5 mm

Myelineschede

492

Myelineschede – knoop van Ranvier

493

Louis-Antoine Ranvier

(1835-1922)

Saltatorische voortgeleiding

494

: afstand tussen 2 knopen

ΔV: depolarisatie tijdens AP

int ernode

rust threshold

int ernode

V V e V

Voorwaarde:

Saltatorische voortgeleiding

495

Niet -gemyeliniseerd

axon

Voortgeleidingssnelheden in axonen

496

Type Myeline? Diameter Snelheid

Motorneuron + 15 mm 120 m/sec

C-vezel

(pijnzenuw)

- 0.5 mm 1 m/sec

Squid giant

axon

- 500 mm 25 m/sec

Multiple Sclerose

497

Multiple Sclerose: daling van

498

Voortgeleiding en modulatie van de

actiepotentiaal

499

Voortgeleiding van de actiepotentiaal

Passieve voortgeleiding – kabelmodel

Actieve voorgeleiding

Belang van myeline

Modulatie van de actiepotentiaal

Toxines

Lokale anesthetica

GABA-agonisten

Toxines

500

Dagelijkse kost - Japan

http://www.youtube.com/watch?v=hBxdsv9THH8

Dood na sushi

501

Elk jaar sterven ~50 Japanners na het eten van sushi van de fugu vis

(puffer fish/blowfish; kogelvis) bereid door een slechte kok.

Symptomen:

• Gevoelloosheid

• Zwakte, “een licht hoofd”

• Verlamming der ledematen

• hartritmestoornissen

• dood (~50 % der gevallen)

$200/maal

Tetrodotoxin (TTX)

502

TTX is aanwezig in geslachtsdelen, lever,

ingewanden en huid van fugu

TTX is een zeer efficiente (Kd ~1 nM) blokker

van spanningsgeschakelde Na+-kanalen

0.5 mg volstaat om een volwassene te doden

Blokkade van actiepotentialen in neuronen en hart

Geen effect in hersenen => “Zombie”

Beroemde haiku van Yosa Buson (1716-1783):

“I cannot see her tonight

I have to give her up

So I will eat fugu.”

Tetrodotoxin (TTX)

503

Locale anesthetica

504

Locale anesthetica

505

Lidocaine

Cocaine Procaine

Locale anesthetica blokkeren

spanningsgeschakelde Na+-kanalen

506

Aconitine

507

Monnikskap

Aconitine vertraagt inactivatie van Na+-kanalen

508

Schorpioen-toxines inhiberen

509

Modulatie van actiepotentiaal

510

A: lokale anesthetica

B: TTX

C: Aconitine

D: KTX

50 m

V

5 ms

GABA-receptor: een ligand-gestuurd Cl--kanaal

511

g-aminoboterzuur (GABA)

Voor activatie van GABA-Receptor

512

-100 -50 50 100

IK

INa

Itotaal

ECl EK

513

-100 -50 50 100

IK

INa

ICl

Itotaal

Itotaal zonder Cl

gCl = 3gK

ECl EK

Na activatie van GABA-Receptor

Na activatie van GABA-Receptor

514

-100 -50 50 100

IK

INa

ICl

Itotaal

Itotaal zonder Cl

gCl = 7gK

ECl EK

Barbituraten activeren de GABA-receptor

515

Nembutal

Secobarbital

Benzodiazepines activeren de GABA-

receptor

516

Rohypnol (flunitrazepam) Valium(diazepam)

Signaaltransductie: prikkelbaarheid

(BWC13)

19. Synaptische communicatie

517

Synaptische communicatie

518

Synaps: plaats van communicatie van presynaptisch neuron met postsynaptische cel:

Neuron synapsen in centraal zenuwstelsel

Spiercel neuromusculaire junctie in skeletspier

Kliercel

2 verschillende types

Elektrische synaps

Actiepotentiaal loopt rechtstreeks door van pre- naar postsynaps

Voordeel: snelle communicatie

Chemische synaps

Presynaptische actiepotentiaal neurotransmitter postsynaptische respons

Elektrische synaps

Continuïteit tussen pre- en postsynaptisch neuron Via gap junctions =

intercellulaire ionenkanalen

Elektrische koppeling

AP in presynaps

Depolarisering verspreidt zich via gap junction

AP in postsynaps

Figure 13-15

519

Figure 17-12 Labeled

Chemische synaps

Geen continuïteit tussen pre- en

postsynaps

Figure 13-16

521

Chemische synaps: actiepotentiaal

neurotransmitter actiepotentiaal

Binding van NT ionenstroom

Depolarisering Ontstaan van AP

Hyperpolarisering inhibitie

Dendriet/Cellichaam

Receptoren voor NT Postsynaps

Diffusie van NT Extracellulaire ruimte

(20 à 50 nm) Synaptische speet

Actiepotentiaal Ca2+ influx

Exocytose Vrijstelling van NT

Axoneinde

vesikels met NT Presynaps

Figure 13-16

522

Receptoren voor neurotransmitters

Ligand-gestuurde

ionenkanalen

NT ionenstroom

verandering Vm

Metabotrope receptoren

NT signaaltransductie

(second messengers)

ionenstroom Vm

Figure 13-17

523

Gevolgen van het openen van ionenkanalen

524

1. Effect op de membraanpotentiaal (« Electrogenese ») • Openen van K+-kanalen: K+-efflux Vm

Repolarisatie

• Openen van Na+- of Ca2+-kanalen: Na+-(Ca2+-)influx Vm

Depolarisatie/excitatie

2. Effect op ionenconcentratie • Openen van Ca2+-kanalen: [Ca2+]i

Cellulaire response (spiercontractie, secretie…)

• Gelijktijdig openen van K+- en Cl--kanalen :

Efflux van KCl daling van celvolume

Verschillende functies vereisen verschillende schakelmechanismen!

Neurotransmitters

525

Signaalmoleculen: prikkeloverdracht

van presynaps naar postsynaps

Presynaps

Aanmaak en opslag in synaptische

vesikels

Vrijstelling door exocytose

Diffusie door synaptische spleet

Postsynaps

Binding aan receptor respons

Afbraak of heropname in presynaps

Figure 13-16

Indeling van neurotransmitters

Excitatorische NT

Postsynaptische

depolarisering

AP

Ach, glutamaat

Inhibitorische NT

Postsynaptische

hyperpolarisering

inhibitie van AP

GABA, glycine

526

Neurotransmitter

Presynaptische aanmaak en opslag

H+

ATP ADP + Pi

NT H+

H+

pH ≈ 5

Presynaptische aanmaak in cytosol

Enzymatisch gecatalyseerd

Neuron-specifiek

Indeling van neuronen ifv NT

Ach Cholinerg

GABA GABA-erg

(Nor)adrenaline adrenerg

Opslag van NT in synaptische vesikel

Actief transport accumulatie in lumen

Via H+-antiporter

Vesikel: V-type H+ pomp

H+-gradiënt drijft opname van NT

527

Organisatie van presynaps

Actieve zone

„docking‟ of aanmeren van synaptische vesikels

Binding aan plasmamembraan via eiwitcomplexen

Klaar voor fusie met plasmamembraan

Vergt Ca2+ stimulus

Actieve zone = complex thv presynaptische membraan

Dubbele rij van aangemeerde vesikels

In nabijheid van Ca2+ kanalen

Figure 13-19

528

Presynaps: vrijstelling van

NT door exocytose

AP komt aan in presynaps depolarisering

Activering van spanningsafhankelijke Ca2+ kanalen

Influx van Ca2+ locaal Ca2+ signaal

Fusie van vesikel met PM = exocytose

v/t-SNARE gemedieerd

Ca2+-afhankelijk synaptotagmine

Afgave van NT in synaptische spleet

Recyclering van vesikel

Endocytose: clathrine-gemedieerd

Figure 13-18 529

14-530

Botulisme &

BOTOX

Tetanus & tetanus toxine

531

Source: Korean Medical Library Engine (http://www.kmle.co.kr)

Tetanus toxine

• Inhibeert vrijstelling van NT (vgl BOTOX)

• Werkt in op inhibitorische interneuronen

Stopzetten van neurotransmitter signaal

Acetylcholine: afbraak en opname Afbraak door acetylcholine-

esterase

Presynaptische opname van choline Na+ gekoppelde symporter

Glutamaat, glycine, GABA, noradrenaline... : opname Opname in presynaps

Na+ gekoppelde symporter

Opslag in synaptische vesikel

Ach acetaat + choline

Na+

choline

acetylCoA

Ach

AchE

NT Na+

NT

NT Ach

Serotonine

Prozac Zenuwgassen

532

Postsynaps: activering van

receptoren

Binding van NT aan receptor in

postsynaptische membraan

Ligand-gestuurde ionenkanalen

Binding van NT openen van kanaal

ionenstroom Vm

Excitatorische synaps

NT depolarisering AP

Inhibitorische synaps

NT hyperpolarisering geen AP

Figure 13-18 533

Nicotine acetylcholinereceptor (nAchR)

Heteropentamer plasmamembraaneiwit

Opgebouwd uit 5 subeenheden

a2g: volwassenen isovorm in skeletspier

a-subeenheid: bindingsplaats voor acetylcholine

Transmembranaire porie

Niet-selectief voor cationen

PNa PK

Niet-permeabel voor anionen

Ring van negatieve ladingen in porie afstoting van anionen

Schakeling door acetylcholine

Binding aan extracellulaire zijde conformatieverandering open

534

Figure 13-20

Nicotine-acetylcholine receptor

Farmacologie

Curare: pijlgif van indianen uit Amazone oerwoud

Bereid uit schors van lianen in Amazonewoud

Zeer toxisch: dood binnen enkele minuten

Titratie: prikken van kikker en tellen van aantal sprongen

Actief bestanddeel: tubocurarine

Blokkeert nAch receptor

Verlamming ademhalingsstilstand

The usual method of preparation was to combine young-bark

scrapings of Strychnos and the menisperms with other cleaned plant

fragments and sometimes snake venom or venomous ants. This

mixture was boiled in water for about two days and then strained

and evaporated to become a dark, heavy, viscid paste with a very

bitter taste.

Chondrodendron tomentosum Liaan in tropisch regenwoud

535

Copyright ©2006 American Society for Clinical Investigation

Conti-Fine, B. M. et al. J. Clin. Invest. 2006;116:2843-2854

Nicotine-acetylcholine receptor

Pathologie: myasthenia gravis

536

GABA receptor

Heteropentamer plasmamembraaneiwit

Opgebouwd uit 5 subeenheden

Extracellulaire bindingsplaats voor GABA

Transmembranaire porie

Niet-selectief voor anionen: Cl-

Niet-permeabel voor kationen

Schakeling door GABA

Binding aan extracellulaire zijde open Cl- stroom

Influx van Cl- hyperpolarisering belet ontstaan van

actiepotentiaal

537

GABA-receptor: een ligand-gestuurd Cl--kanaal

538

g-aminoboterzuur (GABA)

Voor activatie van GABA-Receptor

539

-100 -50 50 100

IK

INa

Itotaal

ECl EK

540

-100 -50 50 100

IK

INa

ICl

Itotaal

Itotaal zonder Cl

gCl = 3gK

ECl EK

Na activatie van GABA-Receptor

Na activatie van GABA-Receptor

541

-100 -50 50 100

IK

INa

ICl

Itotaal

Itotaal zonder Cl

gCl = 7gK

ECl EK

Excitatorische en inhibitorische synapsen

Vm

drempel

Vm

drempel

epsp: excitatorische postsynaptische potentiaal - postsynaptische depolarisering door neurotransmitter - indien epsp > drempel AP

ipsp: inhibitorische postsynaptische potentiaal - postsynaptische hyperpolarisering door neurotransmitter - belet bereiken van drempel geen AP

epsp

ipsp

542

Neuron

Integratie van synaptische input

Centraal zenuwstelsel

Neuronen: multipele synaptische contacten

Excitatorische synapsen en inhibitorische synapsen

Summatie van excitatorische en inhibitorische input integrator

543

Neuron

Integratie van synaptische input

Indien epsp > ipsp

Depolarisering

AP indien drempelpotentiaal overschreden

Indien ipsp > epsp

Hyperpolarisering

Geen actiepotentiaal

544

Signaaltransductie (BWC14)

20. Signaalmoleculen en receptoren

545

Cellulaire communicatie

Informatie-uitwisseling in multicellulair organisme Cel-cel

Zenuwstelsel

Hormonaal stelsel

....

Cel-buitenwereld Zintuigelijke waarneming: visus, gehoor, smaak, reuk, tast

Cel-interne omgeving Bloeddruk, glycemie, pO2, pCO2, ...

Doel Ontwikkeling en embryogenese, groei

Functionele integratie van organen

Homeostase: constant houden van intern milieu, metabolisme

Interactie met omgeving

546

Intercellulaire communicatie

Overzicht

Signaalcel

Aanmaak en opslag van signaalmolecule

Afgave van signaal molecule door stimulus

Transport van signaalmolecule

Doelwitcel

Binding van signaalmolecule aan receptor

Activeren van signaaltransductie

Cellulaire respons: korte termijn versus lange termijn

Beëindigen van signaal

Figure 14-1

547

Chemische identiteit van signaalmoleculen

= primary messengers

Eiwitten en peptiden

Insuline, groeifactoren

Aminozuren of derivaten

Glutamaat, GABA, glycine

Biogene amines

Acetylcholine

Adrenaline, noradrenaline

Dopamine

Serotonine

Histamine ...

Nucleotiden: ATP, ADP

Nucleosiden: adenosine

Steroïden (< cholesterol)

Glucocorticoïden

Estrogeen, testosterone,

progesterone

Eicosanoïden (<

arachidonzuur)

Prostaglandines,

leukotriënen

Gassen: NO, CO

548

Endocriene interactie

Signaalcel Endocriene cel endocriene

organen (klieren)

-cel

pancreas Bijnier

Signaalmolecule Hormoon

Transport op afstand: bloedbaan insuline Adrenaline

Doelwitcel Bevindt zich op afstand van

endocriene cel

Spiercel,

vetcel, … Hart

Figure 14-1

549

Paracriene en autocriene

interactie

Figure 14-1

Signaalcel Paracriene cel Vasculaire endotheelcel

Signaalmolecule Paracriene factor

Lokaal transport via diffusie

NO, prostaglandines,

endotheline

Doelwitcel In nabijheid van paracriene cel Gladde spier in vaatwand

Opmerking: autocriene interactie

signaalcel = doelwitcel

autostimulatie, auto-inhibitie

Vb. tumorcel: secretie van groeifactor

ongecontroleerde groei van tumor

550

Juxtacriene interactie

Signaalcel Neuron, epitheelcel… Neuron

Signaalmolecule Membraaneiwit

Direct contact met doelwitcel Delta

Doelwitcel Naburige cel Neuron met Notch

receptor

551

Membraanreceptoren versus intracellulaire

receptoren

552

Hydrofiel signaalmolecule

Extracellulaire binding aan

receptor in plasmamembraan

Nood aan intracellulaire

signalen second messenger

Hydrofobe signaalmoleculen

Diffusie doorheen

plasmamembraan

Binding aan intracellulaire

receptor

Figure 14-24 Figure 14-2

Steroïdhormonen en intracellulaire

receptoren

553

Steroid hormonen Afgeleid van cholesterol

Hydrofoob karakter

Diffusie door plasmamembraan

Binding aan intracellulaire receptor

Translocatie naar kern

Activering/inhibitie van genexpressie

Figure 14-24

Figure 3-30

554

Wikipedia

CYP17A1

CY

P19

Overzicht van informatiestroom in doelwitcel

Membraanreceptoren

555

Binding aan membraanreceptor

Signaalmolecule = first messenger

Aan extracellulaire zijde

Signaaltransductie: omzetting van extracellulair signaal in intracellulair signaal

Via second messengers

Via eiwitten: G proteïnen, kinasen en fosfatasen

Cellulaire respons

Verandering in functie en/of identiteit van de cel

Korte termijn versus lange termijn respons

Figure 14-2

Overzicht van informatiestroom in doelwitcel

Second messengers

556

Kleine intracellulaire moleculen die aangemaakt of vrijgesteld worden na binding van primary messenger aan receptor

Ca2+, cAMP, cGMP, IP3, DAG,…

Brengen informatie over van plasmamembraan naar interne deel van cel

Cytosol verandering van activiteit van enzymes

ER vrijstelling van Ca2+

Kern verandering in genexpressie

Figure 14-2

Membraanreceptoren voor signaalmoleculen

557

Bindingsplaats in extracellulaire domein van receptor

Complementaire vorm tov signaalmolecule

AZ in bindingsplaats interageren met signaalmolecule

H-bruggen, ionische interactie…

Eigenschappen van binding

Reversibel ifv concentratie

Selectief discriminatie tussen structureel verwante liganden

Affiniteit en saturatie van binding

Vgl met Michael-Menten kinetica

Figure 14-2

Betekenis van dissociatieconstante KD

558

𝑅 ∙ 𝐿 ⟺ 𝑅 + 𝐿

𝐾𝐷 =𝑅 × 𝐿

𝑅 ∙ 𝐿

𝐿 = 𝐾𝐷

𝑅 = 𝑅 ∙ 𝐿

KD = evenwichtsconstante van de

dissociatiereactie

met R = vrije receptor

RL = gebonden receptor

Er is evenveel

vrije receptor als

gebonden receptor

Binding aan membraanreceptor

Affiniteit

KD = maat voor de affiniteit van receptor voor ligand KD affiniteit van receptor voor ligand

Grootte-orde: 10-7 tot 10-10 M

0 2 4 0,0

0,5

1,0

1,5

[Ligand] (relatief)

[RL] (rel)

controle

KD = 0,5 Kd,controle

Kd Kd

KD = [ligand] waarvoor 50% van receptoren bezet zijn

559

Binding aan membraanreceptor

Saturatie

Bezettingsgraad van receptor: bepaald door concentratie van ligand

Indien alle receptoren bezet saturatie van receptor

Maximaal aantal bezette receptoren

Bepaald door aantal receptoren in de plasmamembraan kan varieren

0 2 4 0,0

0,5

1,0

1,5

[Ligand] (relatief)

[RL] (rel)

controle

RT = 2 RT,controle

L

K

RRL

D

T

1

Kd

560

RT = R + RL

Indien [L] >>> KD

[RL][RT]

Binding aan membraanreceptor

Gevoeligheid van doelwitcel

Gevoeligheid van cel bepaald door Affiniteit van receptor voor ligand: Kd gevoeligheid

Aantal receptoren in de plasmamembraan: RT gevoeligheid

Drempel voor cellulaire respons: minimum aantal geactiveerde R

0 2 4 0,0

0,5

1,0

1,5

[Ligand] (relatief)

[RL] (rel)

controle

Kd = 0,5 Kd,controle

RT = 2 RT,controle

Drempel

cellulaire

respons

Respons

561

Verlies van gevoeligheid van doelwitcel

562

Verminderde gevoeligheid van doelwitcel voor signaalmolecule

Onderbreking van signaaltransductie

Desensitisering = structurele veranderingen in receptor

Fosforylering van receptor

Gefosforyleerde receptor

Minder affiniteit voor ligand geringere binding

Minder stroomafwaartse effecten minder second messengers…

Internalisering van receptor

Internalisering van receptor via endocytose (clathrine)

563

Figure 12-15

Binding aan membraanreceptor

Agonist versus antagonist

Moleculen met structurele gelijkenis tov endogeen signaalmolecule Binden aan de receptor met vergelijkbare of grotere affiniteit

Indeling ifv effect op doelwitcel: agonist versus antagonist

Kd

Hormoon ≈ 5 10-5 M

Agonist ≈ 5 10-6 M

Antagonist ≈ 3 10-9 M

564

Binding aan membraanreceptor

Agonist versus antagonist

Agonist Antagonist

Activeert receptor zoals

endogeen signaalmolecule

Resulteert in cellulaire

respons

Toepassing: farmaca die

werking van endogene

signaalmoleculen

nabootsen

Bindt zonder de receptor

te activeren

Geen cellulaire respons

Bezet de bindingsplaats van

de receptor

Toepassing: inhibitoren van

endogene signaalmoleculen

Competitieve inhibitie

565

Agonist versus antagonist

Voorbeeld

2 agonist astma

Farmaca die 2 receptoren

activeren

2 receptor = GPCR; zie

verder

Toepassing

Activering van 2 receptoren

relaxatie van gladde spier

in luchtwegen verwijden

van luchtwegen

2 agonist behandeling

van astma

1 antagonist hypertensie

Farmaca die 1 receptoren

inhiberen

1 receptor = GPCR; zie

verder

Toepassing

Inhibitie van 1 receptoren

hart klopt minder krachtig en

trager daling van bloeddruk

1 antagonist behandeling

van hypertensie

566

Integratie van signaaltransductie

567

Cel staat bloot aan

verschillende types

signaalmoleculen

Integratie van deze

signalen door

Activering van verschillende

transductiecascades

Convergentie op één

transductiecascade

Cross talk: ene transductie-

cascade beïnvloedt andere

Figure 14-2

Amplificatie van extracellulair signaal

568

Signaaltransductiecascade

Amplificatie van signaal door opeenvolgende reacties

Voorbeeld

1 molecule adrenaline

104 moleculen cAMP

106 moleculen actief fosforylase

Figure 14-2

Signaaltransductie (BWC14)

21. GPCR & signaaltransductie via cAMP/PKA

569

Signaaltransductie via G proteïne

gekoppelde receptoren: overzicht

G proteïne gekoppelde receptor Binding van extracellulair

signaalmolecule

Activeert G proteïne

G proteïne Moleculaire schakelaar

Aan/uit in functie van GPCR

Activeert effector

Effectoren Enzymes: vorming/afbraak van second

messengers

Ionenkanalen

570

G proteïne gekoppelde receptor

Structuur

Integraal membraaneiwit

Extracellulair deel Binding van

signaalmolecule

7 transmembranaire a-helices Inbedding in membraan

Binding van signaalmolecule

Intracellulair deel Interactie met trimeer

G proteïne Lus C3 en COOH-ter

staart

Figure 14-4

571

G proteïne gekoppelde receptor

Functie: activering

Start van

signaaltransductie

Binding van

extracellulair

signaalmolecule

conformatie van

receptor

Activering van

trimeer G proteïne

Figure 14-4

572

G proteïne gekoppelde receptor

Functie: desensitisering

GRK GPCR kinase

Fosforyleert C-terminus van GPCR alleen ACTIEVE

GPCR

-arrestine Cytosolisch eiwit

Bindt aan gefosforyleerde C-terminus

Geen interactie met G proteïne Onderbreken van

signaaltransductie Figure 14-4

573

arrestine

GPCR activering: moleculair mechanisme

574

Binding van adrenaline aan 2-AR

575

Activering van GPCR door binding van

ligand

576

G-proteïne gekoppelde receptoren

Structurele en functionele diversiteit

>1000 verschillende receptoren

1000 genen (3% van genoom)

Alternatieve splitsing

Verschillen in

Aminozuursequentie eiwitstructuur

Expressiepatroon: cel- en orgaanspecifiek voorkomen

Ligand

Signaaltransductie

577

Voorbeelden van GPCR

578

Ligand Receptor Opmerking

Noradrenaline, adrenaline Adrenerge receptoren Subtypes:

- a1, a2

- 1, 2, 3

Acetylcholine Muscarine receptoren Subtypes: M1 M5

Dopamine Dopaminerge receptoren

ATP, ADP Purinerge receptoren Subtypes: P2X, P2Y

Reukmoleculen Odorantreceptoren +/- 1000 subtypes

TSH TSH receptor

Endorfines Opioid receptoren Subtypes: m, k,

Anandamide Cannabinoid receptor Subtypes : CB1, CB2

… … …

579

AGONIST

ANTAGONIST

Nicotine receptor Muscarine receptor

nicotine muscarine

tubocurarine atropine

Receptor diversiteit verschillend farmacologisch profiel!!!

acetylcholine

Diversiteit membraanreceptoren

Receptoren voor acetylcholine

Receptor Type Expressie Respons

Nicotine AchR Ionenkanaal Neuromusculaire junctie

Centrale synaps

Postsynaptische

depolarisering

Muscarine R

5 subtypes: M1

M5

GPCR Hart, gladde spier, klieren,

neuronen...

Bepaald door

subtype,

transductie...

M2 GPCR Hartspier: SA knoopcellen Vertraging van

hartritme

M3 GPCR Gladde spier: luchtweg Contractie

Exocriene klier: pancreas Secretie

10-580

Respons op signaalmolecule bepaald door:

• Receptortype voor signaalmolecule en signaaltransductiecascade

• Celtype: neuron, spier, kliercel...

Ziekten door disfunctie van GPCR

loss-of-function gain-of-function

inactief

ligand

Altijd actief

geen ligand

581

Loss of function

Gain of function

G-proteïne gekoppelde receptoren

Farmacologie/Toxicologie

Farmacologie: agonisten/antagonisten 2 agonisten astma

Farmaca die 2 receptoren in gladde spier activeren relaxatie van gladde spier (dilatatie van luchtwegen)

1 antagonisten hypertensie

Receptor voor (nor)adrenaline in hart

Farmaca die 1 receptoren in hart blokkeren hart klopt trager en minder krachtig

Toxicologie: receptoren voor drugs Heroïne opioid receptoren

Receptoren voor endorfines

CZS: pijnbeleving, ....

Probleem: desensitizering afhankelijkheid

Cannabis cannabinoid receptor

Receptor voor endocannabinoiden: anandamide, 2-arachidonylglycerol

CZS: rol in geheugen, pijnbeleving

582

Trimeer G proteïne

Structuur

Subeenheid Ga G Gg

Aantal genen 27 5 13

Eiwit Gsa, Gia,… Gg: stabiel dimer

Vetanker in membraan + + (Gg subeenheid)

Interactie met GPCR + -

GTPase activiteit + -

Interactie met effector + +

of

Figure 14-5

583

Trimeer G proteïne

Moleculaire schakelaar

L + R

L*R

GTP GDP

H2O Pi

Effector Effector Kanalen, enzymes, ....

Spontane

GTPase

activiteit

GEF = Guanine nucleotide Exchange Factor

L*R = Ligand-receptor complex

RGS = Regulator of G protein signaling

L*R = GEF

RGS

Rust = Uit

• Gag trimeer

• Ga: GDP binding

+Stimulus = Aan

• Ga + Gg dimer

• Ga: GTP binding

Figure 14-5

584

GTPase cyclus van trimeer G proteïne

585

Figure 14-5

Signaaltransductie via G proteïne

gekoppelde receptoren: overzicht

G proteïne gekoppelde receptor Binding van extracellulair

signaalmolecule

Activeert G proteïne

G proteïne Moleculaire schakelaar

Aan/uit in functie van GPCR

Activeert effector

Effectoren Enzymes: vorming/afbraak van second

messengers

Ionenkanalen

586

Signaaltransductie via GPCR

Activering van ionenkanalen

587

Sino-atriale knoopcel in

hart

Muscarinereceptor (M2)

voor Ach

Binding Ach

Activering Gi eiwit

Gg activeert K+ kanaal

Uitwaartse K+stroom

Figure 14-15

Signaaltransductie via GPCR

cAMP als second messenger

cAMP = second messenger

Aanmaak door adenylaatcyclase in plasmamembraan

Regeling door trimeer G proteïne: Ga

Gsa stimulering

Gia inhibitie

Cholera toxine

Permanente activering van Gs

Continue stimulering van AC

Figure 14-6

588

Signaaltransductie via cAMP

Afbraak van cAMP

Afbraak door fosfodiesterase

Cytoplasmatisch enzyme

Basale activiteit continue afbraak

Inhibitie door methylxanthines

[cAMP]cyto

Balans aanmaak/afbraak

Snelle veranderingen

Figure 14-6

589

Cellulaire effecten van cAMP

590

Proteïnekinase A (PKA)

Structuur

Ser/Thr kinase

Fosforyleert meerdere eiwitten in

Cytosol

Plasmamembraan, ER, …

Kern

Structuur: heterotetramer

2 Catalytische subeenheden Kinase

Binding en hydrolyse van ATP

2 Regulatorische subeenheden

Inhiberen kinase activiteit

2 bindingsplaatsen voor cAMP

591

Figure 14-8

Proteïnekinase A (PKA)

Werking

In afwezigheid van cAMP

Heterotetramere configuratie

Inactief

Inhibitie van kinase door

regulatorische eenheid

Bij stijging van cAMP

cAMP bindt aan Reg eenheid

Dissociatie van Reg en Cat

Kinase actief

Activering door de-inhibitie

592

Figure 14-8

STOP

cAMP/PKA signaaltransductie

Cellulaire respons

AMP

cAMP PDE

Diffusie

Afbraak

Extracellulair signaalmolecule

cAMP

Proteïne Kinase A

Fosforylering

van eiwitten

Adenylaatcyclase

Gsa-GTP

GPCR

Gsa -GDP

Caffeïne

Fosfatase

Defosforylering van eiwitten

Figure 14-7

593

Desensi-

tisering

Cholera toxine

Toepassing

Effecten van (nor)adrenaline

(Nor)adrenaline fight or flight reactie

Adrenerge boodschappers

Reactie bij stress

Adrenaline = hormoon

Vrijstelling door bijniermerg

Noradrenaline = NT

Vrijstelling door orthosympathisch zenuwstelsel

Inwerking op doelwitorganen

Hart, lever, luchtwegen, …

Figure 14-21 Labeled

594

GPCR G proteïne Effector

Adrenerge receptoren

Ligand GPCR G proteïne Effector Second messenger

(Nor)adrenaline

(Nor)epinefrine a1 Gq PLC

IP3 Ca2+

DAG PKC

a2 Gi Adenylaatcyclase cAMP

Ca2+ kanaal (g)

1, 2, 3 Gs Adenylaatcyclase cAMP

Adrenaline Noradrenaline

595

Toepassing

Effecten van (nor)adrenaline

Respons van doelwitorgaan: bepaald door

Type receptor signaaltransductiecascade

Functie van doelwitcel

Hart

1receptoren cAMP/PKA

Versnelling van hartritme

Krachtiger contractie

Lever

2 receptoren cAMP/PKA

Vrijstelling van glucose

Figure 14-21 Labeled

596

Activering van glycogeenafbraak in de lever Figure 14-22 Labeled

Figure 14-21 Labeled

597

Toepassing

Cholera

598

Field, M. J. Clin. Invest. 2003;111:931-943

L*R

GTP GDP

H2O Pi

Spontane GTPase activiteit

Cholera toxine: ADP-ribosylering van Gsa inhibitie van GTPase activiteit

Signaaltransductie (BWC14)

22. GPCR: signaaltransductie via IP3 en DAG

599

Signaaltransductie via G proteïne

gekoppelde receptoren: overzicht

G proteïne gekoppelde receptor Binding van extracellulair

signaalmolecule

Activeert G proteïne

G proteïne Moleculaire schakelaar

Aan/uit in functie van GPCR

Activeert effector

Effectoren Enzymes: vorming/afbraak van second

messengers

Ionenkanalen

600

Signaaltransductie via PLC

Binding van ligand aan GPCR

Activering van trimeer G proteïne = Gq

Activering van effector = PLC

Vorming van second messengers

IP3 Ca2+ vrijstelling uit ER

DAG activering van PKC

Figure 14-10 601

Voorbeelden van signaaltransductie via

PLC

602

Cel/weefsel Ligand GPCR Respons

Bloedplaatjes Thromboxane A2 TP receptor Aggregatie van plaatjes

Bronchiale gladde

spier

Acetylcholine M3 Contractie

Vasculaire gladde

spier

Noradrenaline a1 contractie

Vasculaire gladde

spier

Endotheline ET1 Contractie

Lever ADH V1 Glycogeen afbraak

Exocriene pancreas Acetylcholine M3 Secretie van enzymes

Speekselklier Acetylcholine M3 Speekselsecretie

Maag Acetylcholine M3 HCl secretie

… … … …

Fosfolipase C: splitsing van PIP2

603

PLC = plasma-

membraan enzyme

Activering door GPCR

via Gqa

Splitst PIP2 IP3 + DAG

PIP2: PI(4,5)bisfosfaat

Membraanlipide in

cytoplasmatisch blad

van PM

Aanmaak door PI-kinasen

(lipidekinasen)

Figure 14-9

Second messengers IP3 en DAG

604

IP3:

inositol(1,4,5)trisfosfaat

Hydrofiel: diffundeert in

cytosol

Bindt aan receptor in ER

DAG: diacylglycerol

Hydrofoob: blijft in

membraan

Activering van Proteïne

Kinase C (PKC)

Activering van

ionenkanalen Figure 14-9

IP3 receptor in endoplasmatisch reticulum

IP3 receptor

Membraaneiwit in endoplasmatisch reticulum

Ligand-gestuurd Ca2+ kanaal

Binding van IP3

Kanaal opent Ca2+ vrijstelling uit ER

Ontstaan van intracellulair Ca2+ signaal [Ca2+]cyto stijgt

Figure 14-12 Figure 14-11

605

IP3 en DAG: activering van multipele

transductiecascades: Ca2+, kinasen, Vm

Ionen

kanalen

Ca2+ signaal

Ca2+ vrijstelling

uit ER

Na+, Ca2+ PKC

Depolarisering Fosforylering

Figure 14-9

Figure 14-12

606

Kalzium macht alles

(L.V. Heilbrunn)

607

Ontstaan van een intracellulair Ca2+ signaal

Figure 14-12

608

Cellulaire Ca2+ transportsystemen

Terminologie

[Ca2+]cyto=10-7 M

endoplasmatisch reticulum

[Ca2+]ER

=

10-3 M

Rustsituatie

609

[Ca2+]e= 10-3 M

influx vrijstelling

efflux opname

Cellulaire Ca2+ transportsystemen

Actieve transportsystemen Ca2+ ↓

[Ca2+]cyto=10-7 M

[Ca2+]e= 10-3 M

3 Na+

1 Ca2+

Na+-Ca2+ uitwisselaar

Na+

K+

ATP

Na+-K+ pomp

endoplasmatisch reticulum

[Ca2+]ER= 10-3 M

ATP

2 Ca2+

SERCA

1 Ca2+

PMCA

ATP Rustsituatie

610

Cellulaire Ca2+ transportsystemen

Ca2+ kanalen Ca2+ ↑

[Ca2+]cyto=10-7 M

Ca2+

[Ca2+]e= 10-3 M

endoplasmatisch reticulum

[Ca2+]ER= 10-3 M

Ca2+

Ca2+ Ca2+ Ca2+

[Ca2+]cyto> 10-7 M

Plasmamembraan: Ca2+

influxkanalen

Spanningsafhankelijk

Ligand-gestuurd

Receptor-geactiveerd

Mechano-gevoelig

Endoplasmatisch reticulum: Ca2+ vrijstellingskanalen

IP3 receptor

Ryanodine receptor

611

Ca2+ signaal in prikkelbare cel

Actiepotentiaal [Ca2+]cyt

Neuron: AP Ca2+ influx

Depolarisering

Activering van spannings-afhankelijke Ca2+ kanalen

Influx van Ca2+

Skeletspier en hartspier: AP Ca2+ vrijstelling

Depolarisering

Activering van Ryanodine receptor

Vrijstelling van Ca2+

ATP

2 Ca2+

SERCA

3 Na+

1 Ca2+

NCX

1 Ca2+

PMCA

ATP

Ca2+

Ca2+

Ca2+

DHPR

RyR

612

Ca2+ signaal in niet-prikkelbare cel

Ligand [Ca2+]cyt

Ligand Ca2+ vrijstelling Ca2+ influx

Binding aan GPCR PLC

Vorming van IP3 en DAG

Vrijstelling van Ca2+ uit ER

Initiële respons

Beperkt in tijd: depletie van ER

Influx van Ca2+ via TRP en SOC kanalen

Langdurige respons

Activering van

TRP: DAG en

SOC: leeg ER

ATP

2 Ca2+

SERCA

3 Na+

1 Ca2+

NCX

1 Ca2+

PMCA

ATP

Ca2+

Ca2+

G PLC PIP2

IP3

Ca2+

IP3R

613

Ca2+ als second messenger

Signaaltransductie via Ca2+

Ca2+ geactiveerde

ionenkanalen

Calmoduline Ca2+ sensoren ... Synaptotagmine

Ionenkanalen

Ionenpompen

Transporters

Enzymes:

eNOS

...

Kinasen:

CaM kinase

MLC kinase

...

Fosfatasen:

Calcineurine

[Ca2+]cyt > 10-7 M

Cel in rust: [Ca2+]cyt < 10-7 M

Stimulus Ca2+ vrijstelling/influx

Gentranscriptie 614

Ca2+ als second messenger

Intracellulaire Ca2+ sensoren

Ca2+ bindende eiwitten in

cel

Binding van Ca2+ in functie

van cytoplasmatische Ca2+

concentratie

10-7 M Ca2+ apo-eiwit

Vrije vorm

Inactief

> 10-7 M Ca2+ : binding van

Ca2+

Ca-eiwit complex

cellulaire respons

Reversibele binding

Aan/uitschakelen van

signaaltransductie in functie

van cytoplasmatische Ca2+

concentratie

Voorbeelden

Calmoduline

.....

615

Ca2+ als second messenger

Calmoduline

Calmoduline Cytoplasmatisch eiwit

4 bindingsplaatsen voor Ca2+ KD: 5 10-7 5 10-6 M

Leeg bij [Ca2+]cyt 10-7 M

Progressieve opvulling indien [Ca2+]cyt

Ca-Calmoduline Conformatieverandering

Blootstelling van hydrofobe residu‟s

Binding aan doelwiteiwitten Via hydrofobe interactie

Ca2+ bindingsplaatsen

apo-CaM Figure 14-14

616

Figure 14-14

Calmoduline: Ca2+ afhankelijke

binding aan doelwiteiwitten

Ca-CaM geactiveerde

enzymes

NO synthase: eNOS en nNOS

NO productie in endotheel en

neuronen

Myosine lichte keten kinase:

MLCK

Contractie van gladde spier

CaM kinases: CaMKinase II

Geheugen

PMCA

Extrusie van Ca2+

Calcineurine = fosfatase

Ca-CaM

Bindt aan doelwiteiwitten via hydrofobe interacties

Activering/inhibitie van doelwiteitwit

617

Figure 14-14

Addendum: selectiviteit van interacties

GPCR G proteïne Effector

Ligand GPCR G

proteïne Effector Second messenger

(Nor)adrenaline

(Nor)epinefrine a1 Gq PLC

IP3 Ca2+

DAG PKC

a2 Gi AC cAMP

Ca2+ kanaal (g)

1, 2, 3 Gs AC cAMP

Acetylcholine M1, M3, M5 Gq PLC IP3 Ca2+

DAG PKC

M2, M4 Gi AC cAMP

K+ kanaal (g)

Adenylaatcyclase: ATP cAMP

Fosfolipase C: PIP2 IP3 + DAG / IP3 vrijstelling van Ca2+ uit ER

Adrenerge

receptoren

Muscarine

receptoren

618

Addendum: Celspecifieke respons

GPCR G proteïne Effector

619

Adrenaline

Noradrenaline

a1 receptor Ca2+ signaal Spier

contractie Vasoconstrictie

2 receptor cAMP signaal Spier

relaxatie

Broncho

dilatatie

Vasculaire

gladde spier

Bronchiale

gladde spier

Signaaltransductie via NO/cGMP

620

Vaatwand

Endotheelcel

In direct contact

met bloed

Reageert op

chemische en

mechanische stimuli

Gladde spierlaag

Contractie/relaxatie

Bepaalt diameter

van lumen van

bloedvat

Figure 14-A1

Aanmaak van NO in endotheelcel

621

Stimuli

Ach GPCR

Muscarine receptor

Shear stress

Signaaltransductie

Activering PLC

IP3 Ca2+signaal CaCaM

Activering van NO synthase (eNOS)

Aanmaak van NO

L-Arg NO + citrulline

NO = klein, apolair gas

Verlaat cel door eenvoudige diffusie

Lokale verspreiding

Korte levensduur

Vrij radicaal

Figure 14-A1

NO: signaaltransductie via cGMP in gladde

spiercel

622

NO diffundeert in gladde spiercel

Signaaltransductie

Receptor voor NO = guanylaatcyclase

Cytosolisch enzyme

GTP cGMP

cGMP activering van PKG

Ser/Thr kinase

Fosforylering

Respons: relaxatie van vaatwand

Figure 14-A1

623

STOP

Signaaltransductie via NO/cGMP

Aan- en uitschakelen van cascade

NO

Solubel guanylaatcyclase

cGMP

Proteïne Kinase G

Fosforylering

van eiwitten

Cellulaire respons

GMP

cGMP fosfodiësterase

Fosfatase

Defosforylering van eiwitten

Afbraak

Sildenafil

•Inhibitor van cGMP

fosfodiesterase

•Remt afbraak van cGMP

•Bevordert vasodilatatie

Sildenafil

Signaaltransductie (BWC14)

23. Receptor proteïnekinasen

624

Groeifactoren

Signaalmoleculen Structuur: peptiden of eiwitten

Hormonale, paracriene, autocriene werking

Binden aan receptor proteïnekinasen

Cellulaire respons: celgroei en celdeling gecontroleerd! Embryonale groei, wondheling, weefselhomestase,…

625

Receptor tyrosinekinase

Structuur

Integraal membraaneiwit in plasma-

membraan

1 transmembranaire a-helix

Extracellulair domein

Bindingsplaats voor ligand

Cytoplasmatisch domein

Tyrosinekinase domein

Fosforylering van Tyr residu‟s

Inactief door auto-inhibitie

Staart met Tyr residu‟s autofosforylering

Figure 14-16 626

627

Receptor tyrosinekinase

Activering

Vrij monomer: auto-

inhibitie van

kinasedomein

Binding van ligand

dimerisering van

receptor

Dimer opheffen van

auto-inhibitie

Kinase actief

Figure 14-16 628

Receptor tyrosinekinase

Activering

Actief receptordimer

Autofosforylering

Kruisfosforylering van Tyr

residu‟s in cytoplasmatische

staart

Tyr-P staart

Platform voor binding van

signaaltransductie-eiwitten

Binding verloopt via SH2

domein herkent Tyr-P

Figure 14-16

629

SH2 domain

630

Binding van fosfotyrosine door SH2 domein

Signaaltransductie via RTK

Rekrutering van signaaleiwitten

door Tyr-P staart

Binding via SH2 domein

Activering van verschillende

transductiecascades

Grb/Sos Ras MAP kinase

Celgroei en -proliferatie

PLCg

Ca2+ signaal respons

PI3Kinase

Cell survival Figure 14-17

631

Signaaltransductie via MAP kinase cascade

Activering van Ras

GRB2 = adaptoreiwit

SH2 domein: binding aan Tyr-P in geactiveerde RTK

SH3 domeinen: recrutering en activeringvan Sos

Sos = Ras GEF

GRB2-Sos: interactie met Ras

Induceert GDP/GTP wissel in Ras

Ras = monomeer G proteïne

Membraangebonden: vetanker

Moleculaire schakelaar

Ras-GDP = inactief

Ras-GTP = actief

Ras-GTP: dissocieert van Sos Figure 14-17

632

Ras als moleculaire schakelaar

Ras-GDP = uit Ras-GTP = aan

Pi H2O

GAP MAP Kinase

GDP GTP

Sos = GEF

Celproliferatie

GAP = GTPase Activating Protein

- vereist voor GTP hydrolyse door Ras

GEF = guanine-nucleotide

exchange factor

- Induceert GDP/GTP wissel

Figure 14-17

633

Ras: activering van

MAP kinase cascade

Raf kinase: cytosolair Recrutering en activering door Ras-GTP

Fosforyleert en activeert MEK

MEK Fosforyleert en activeert MAP kinase

MAP kinase = effector kinase Actief MAP kinase

Translocatie naar nucleus

Fosforylering van transcriptiefactoren: Ets, Jun

Activering van gentranscriptie

Expressie van genen vereist voor opstarten van celcyclus

Resultaat: start celproliferatie Kerndeling celdeling

Figure 14-17 634

Figure 19-42 Labeled

Figure 19-39 Labeled

Algemene principes: MAP kinase cascade

Diversiteit aan signaaltransductiecascades

Extracellulaire stimulus

Kinase cascade

Verandering in gen-expressie

Respons

MEK

MAPK

637

Algemene principes: scaffold eiwitten

in signaaltransductie

638

Organisatie van functioneel complex

Rekrutering en binding van meerdere eiwitten

Facilitering interactie tussen eiwitten

Mogelijkheid tot regeling

Voorbeelden

KSR / STE5

Arrestine

Cellular Signalling 2012 vol 24

Signaaltransductie via PLCg Ca2+ signaal

Rekrutering van PLCg door RTK

PLCg: bindt aan Tyr-P via SH2 domein

Activering van PLCg door RTK

PLCg splitst PIP2

Vorming van IP3 en DAG

Ontstaan van Ca2+ signaal

Vrijstelling van Ca2+ uit ER

Initiële respons

Beperkt in tijd: depletie van ER

Influx van Ca2+ via kanalen in PM

ATP

2 Ca2+

SERCA

3 Na+

1 Ca2+

NCX

1 Ca2+

PMCA

ATP

Ca2+

Ca2+

PIP2

IP3

Ca2+

IP3R

P P PLCg

639

Signaaltransductie via PI 3-kinase

RTK

PI 3-kinase

Akt kinase

Respons

Cell

survival

Figure 14-23

640

Signaaltransductie via PI 3-kinase

PI 3-kinase

Lipidekinase

Fosforylering van PI op positie 3 van inositolring

PIP2 PIP3

PIP3 = membraanlipide

Rekruteert Akt kinase activering

Akt kinase = PKB

Ser/Thr kinase

Multisubstraat kinase

Cellulaire respons

Cell survival pathway

Figure 14-23

641

Figure 19-43 Labeled

Serine/threone kinase receptoren

TGF signaaltransductie: activering van receptor

643

TGF = groeifactor

Belangrijke rol in embryogenese

Differentiatie, celdood, …

TGF receptor

Plasmamembraaneiwit

Multimeer complex

Type I fosfodomein

Type II kinase domein

Binding van TGF

Multimerisering van receptor

Autofosforylering: type II type I

Figure 14-20

Serine/threone kinase receptoren

TGF signaaltransductie: inductie van genexpressie

644

Signaaltransductie via SMAD

eiwitten

Fosforylering van R-SMAD door

TGF receptor

Vorming van multimeer SMAD

complex

Translocatie naar nucleus

Associatie met

transcriptiefactoren

Inductie van genexpressie

Figure 14-20

Toepassing: RTK signaaltransductie en

tumoren

645

RTK signaaltransductie en tumoren

Overexpressie of HER2 in borsttumoren

646

HER2 (ERBB2) = RTK

Dimer met andere HER receptoren

Overexpressie van HER2 in 25% van borsttumoren

Snellere groei

Meer agressieve vorm van kanker

Therapie: trastuzumab (Herceptine™)

Monoclonaal antilichaam inhibitie van HER2

RTK signaaltransductie en tumoren

Oncogene mutaties: voorbeeld Ras

Wild-type Ras GDP/GTP uitwisseling aan

GTPase uit

Mutant Ras GDP/GTP uitwisseling aan

GTPase uitgeschakeld door mutatie Geen binding van GAP

Permanent actief gain of function

Klinisch belang Mutaties in Ras: 20 tot 30% van

humane tumoren

Ras-GDP = uit Ras-GTP = aan

GDP GTP

Mutatie in Ras

Ongecontroleerde celproliferatie

647

RTK signaaltransductie en tumoren

Drug targets voor chemotherapie - 1

649

FT = farnesyltransferase enzyme dat farnesylvetanker aan Ras bindt

FTI = farnesyltransferase inhibitor remt tumorgroei

RTK signaaltransductie en tumoren

Drug targets voor chemotherapie - 2

650

Cytoskelet

(BWC15)

24. Microtubuli en intermediaire filamenten

651

652 statisch

Tabel 15-2

dynamisch

Indeling van microtubuli

653

Cytoplasmatische MT

Dynamisch netwerk

doorheen cytosol

Diverse functies

Cellulaire architectuur

Axonen

Vorming van delingsspoel

tijdens mitose & meiose

Beweging van chromosomen

Kabel voor transport van

vesikels en organellen

Axonemale MT

Stabiele en geordende

subcellulaire structuren

Functies

Cellulaire beweging

Cilia, flagella, basale lichamen

Figure 16-6

Tabel 15-2

Basiseigenschappen van MT: structuur

Holle structuur

Diameter: 25 nm (extern)

Variabele lengte: nm mm

Gepolariseerd: + en – einde

Singlet/doublet/triplet

Figure 15-2 Labeled

654

Opbouw van microtubulus

Bouwsteen = tubuline-eiwit Heterodimer: a-

Gemeenschappelijke eigenschappen a en Bindingsplaats voor GTP (of GDP) + GTP hydrolyse

Bindingsplaats voor taxol, colchicine

Vorming van protofilament Longitudinale associatie van a- dimeren

Asymmetrische structuur a--a--a--a-

13 parallelle protofilamenten microtubulus Gepolariseerde structuur

a-einde = min einde: stabiele pool

-einde = plus einde: dynamische pool

Figure 15-2

Figure 15-1

655

Vorming van MT door reversibele

polymerisering van tubuline dimeren

656

Polymerisering van tubuline dimer vereist

GTP bindt aan tubuline dimer

Voldoende tubuline dimeren kritische concentratie

Indien [tubuline] < kritische concentratie vrij dimer

Indien [tubuline] > kritische concentratie polymerisering

Stapsgewijs proces

Dimer oligomer groeiende MT stop van groei

Nucleatie : dimer oligomer

Elongatie: groei van MT door polymerisering

Plateaufase: stoppen van groei (polymerisering = depolymerisering)

Figure 15-3

657

Asymmetrische groei van MT aan plus einde

MT groeit vooral aan plus einde

Plus einde: lagere kritische concentratie

dan min einde

Indien [kritische]min einde > [tubuline] >

[kritische]plus einde

Polymerisering aan plus einde groei

Depolymerisering aan min einde krimp

Min einde: indien verankerd in

centrosoom geen MT dynamiek

Figure 15-4 658

Figure 15-5

Treadmilling van MT

659

Dynamische instabiliteit van MT

660

http://youtu.be/9ICqcZ99qGk http://youtu.be/E1XczyCkN20

Dynamische instabiliteit van MT

661

Continue groei en krimp van microtubuli

In hoofdzaak via plus einde

Weinig of niet via min einde

Polymerisering treedt op indien voldoende GTP-tubuline

Vorming van GTP-cap aan plus einde

GTP-cap stabiliseert MT structuur groei

Indien hydrolyse van GTP GDP-tubuline

MT met eindstandige GDP-tubuline

Instabiel plus einde uit elkaar vallen van MT

Figure 15-6

Dynamische instabiliteit van MT

662

Afwisselende fasen van

groei en krimp van MT

Vooral aan (+) pool

Groei door

polymerisering

Catastrofe

Indien GTP-cap te klein

Hernemen van groei

Figure 15-6

Microtubule Organizing Centre MTOC

663

Plaats waar MT assemblage van start gaat in de cel

Verankering van min einde van MT en nucleatie van MT

Bij interfase cellen: perinucleaire ligging centrosoom

Opbouw

2 centriolen + pericentriolair materiaal

g-tubuline nucleatieplaats voor MT

Figure 15-8

g-tubuline in centrosoom

664

g-TuRC = g-Tubuline Ring Complex

Onderdeel van centrosoom

Opgebouw uit g-tubuline en GRiPs

Nucleatieplaats voor MT

Polymerisering van tubuline a- dimer aan plus einde van g-tubuline

indien geen g-tubuline geen vorming van MT in cel

Figure 15-9

Cellulaire organisatie van MT

665 Figure 15-10

Cellulaire organisatie van MT

Interfase cel

666

Radiaal netwerk van MT in

cytoplasma

Verspreiding vanuit centrale

structuur = centrosoom (MTOC)

Inplanting met min einde in MTOC

Plus einde celperiferie

Dynamische instabiliteit van MT

Centraal min einde in MTOC: stabiel

Perifeer plus einde: ctu groei en

krimp

Figure 15-10

Microtubule Associated Proteins (MAPs)

667

MAP

Binden aan MT stabilisering van MT

Tau = MAP in neuronen

Stabilisering van MT in axonen

hoge densiteit aan MT in axonen

MAP2 = MAP in dendrieten

Tauopathie

Aggregatie van tau eiwit verstoring

van neuron afsterven van neuron

Figure 15-10

Tauopathie neurodegeneratie

Neurofibrillar tangles in ziekte van

Alzheimer Tau aggregaten

Eiwitten die MT (de)stabiliseren

670

+-TIP eiwitten

Binden aan plus einde

Verhinderen MT catastrofe

Destabilisering door

catastrofins

Binden aan plus einde

Uit elkaar vallen van

protofilamenten aan plus

einde

Figure 15-11

Geneesmiddelen die ingrijpen op MT

671

Onderdrukken van MT

vorming

Colchicine

Verhindert polymerisering

van tubuline

Vinblastine, vincristine

Aggregatie van dimer

geen polymerisering

Stabiliseren van MT

Taxol

Toepassing: chemotherapie

• Te weinig/te veel MT

• Delingsspoel vormt niet

• Verstoring van mitose

Delingsspoel

672

Figure 19-22

Intermediaire filamenten

673 Toepassing : profiling van tumorcellen op basis van IF

Structuur en functie van intermediaire

filamenten

Structuur

Stabiel zonder

polariteit

Dimer tetramer

protofilament

IF

Functie

Mechanische

sterkte van cel

Figure 15-23 Labeled 674

675

Bron: Olympus

vimentine cytokeratine

Figure 15-24 Labeled

676

Cytoskelet

(BWC15)

25. Microfilamenten

677

678 statisch

Tabel 15-2

dynamisch

Bouwsteen van microfilamenten: actine

G-actine = monomer

42 kDa eiwit

Bindingsplaats voor ATP/ADP

ATP hydrolyse

Isovormen

a-actine spier

- en g-actine niet-

spiercellen

Figure 15-12 Labeled

679

G-actine-ATP

680

Microfilamenten = F-actine

F-actine = polymer van G-actine 7 nm diameter

dubbelhelix

+/- 14 monomeren/winding

Polymerisatie van G-actine Inbouw van G-actine-ATP

Reversibel proces

Stapsgewijs proces Nucleatie elongatie

Figure 15-12

681

F-actine: gepolariseerde structuur

682

G-actine: asymmetrische structuur

Minus einde (pointed) Stabiele pool

Plus einde (barbed) Dynamische pool: groei en

krimp

Groei door toevoeging van G-actine-ATP Nadien ATP hydrolyse

Figure 15-12

Figure 15-13

Toxines die ingrijpen op microfilamenten

683

Toxines die ingrijpen op microfilamenten

684 Cytochalasine D Phalloidine Bron: Invitrogen

Architectuur van microfilamenten

Stress fibers

685

Bundels van microfilamenten die als parallelle kabels doorheen cytosol lopen

Kunnen associëren met plasmamembraan focale adhesies

Vasthechting aan extracellulaire matrix

Bevatten myosine contractie

Stevigheid van de cel

Figure 15-14

Bron: Invitrogen

Architectuur van microfilamenten

Celcortex

686

3-dimensioneel netwerk

van F-actine onder de

plasmamembraan

Verleent vorm en stevigheid

aan plasmamembraan

http://drosophila-images.org/2009.shtml

Figure 15-14

Architectuur van microfilamenten

Lamellipodium en filopodium

687

„leading edge‟ van bewegende cel

Dynamische actinestructuur beweging

Lamellipodium

Brede zone van 3D-actinenetwerk

Filopodium = dynamische structuur

Vingervormige actine-uitstulping vanuit lamellipodium

Plus einde georienteerd naar plasmamembraan groei

Figure 15-14

http://youtu.be/LjXSHn4g3GI

688

http://youtu.be/WWGObUUD8Y4

http://youtu.be/HhdiGIkr7RI

Figure 15-15

Regeling van microfilamenten door

actinebindende eiwitten

689

Regeling op

verschillende niveau‟s

Nucleatie van nieuwe

filamenten

Elongatie/inkorting

van bestaande

filamenten

Associatie van

microfilamenten

Figure 15-16

Regeling van microfilamenten door

actinebindende eiwitten

690

Polymerisering vereist

Voldoende vrij G-actine-ATP

Vrije plus einden

Thymosine 4

Bindt G-actine

Remt polymerisering door sequestratie van G-actine

Profiline

Bindt G-actine en bevordert ATP binding door G-actine

Bevordert polymerisering door aanbieden van G-actine-ATP aan plus einde van F-actine

Figure 15-16

Regeling van microfilamenten door

actinebindende eiwitten

691

Opbreken van filamenten (severing)

Gelsoline

Bindt aan F-actine waardoor filament opbreekt

Heeft ook capping activiteit

Verstoren van actinenetwerk

Bedekken van filamenten (capping)

CapZ

Bindt aan plus einde van F-actine

Verhindert verdere elongatie van microfilament

Figure 15-16

Regeling van microfilamenten door

actinebindende eiwitten

692

Bundelen van F-actine

a-actinine focale adhesies

Fascin filopodia

Fimbrine en villine microvillus

„crosslinken‟ van F-actine

Filamine

Vorming van driedimensioneel F-actine

netwerk

Figure 15-16

Structuur van microvillus

693

Uitsteeksels aan apicale pool

van epitheelcel

Tot >1000/cel

Oppervlaktevergroting

Centrale as van gebundelde

microfilamenten

Plus pool aan uiteinde

Crosslinking eiwitten

Fimbrine en villine

Ingeplant op

terminaal web

Figure 15-17

Eiwitten die actine met membraan

verbinden

694 Figure 7-20 Figure 15-19

Verbinding actine met plasmamembraan

Indirect via linkereiwitten

Functie

Overdracht van kracht cytoskelet PM

Connectie cytoskelet extracellulair

Voorbeeld: spectrine-ankyrine-actine

netwerk in rode bloedcellen

Sferocytose: fragiele RBC door mutaties in

spectrine/ankyrine netwerk anemie

695 http://goo.gl/l67JW

Eiwitten die actine met membraan

verbinden: integrines

696

Integrines = integrale membraaneiwitten

Cytosolisch: bindt F-actine via linkereiwitten

Exoplasmatisch: bindt aan extracellulaire matrix

eiwitten

Fibronectine, laminine

Collageen…

Focale adhesies

Complex van integrines

Functie

Vasthechting van cel aan ECM

Signaaltransductie (inside out)

Figure 17-23

Figure 17-22

Groei van actine netwerken door

vertakkingen van F-actine

697

Groei door vertakkingen lamellipodia/filopodia

WASP en WAVE Arp2/3: nucleatie op zijkant van F-actine

Profiline: elongatie van vertakte keten Plus pool duwt tegen membraan beweging van membraan

Capping eiwitten: bedekken plus pool stop van elongatie

Figure 15-20

Groei van actine netwerken door verlenging

van F-actine

698

Binding van formine aan plus pool van F-actine

Rekrutering van profiline

Aanleveren van G-actine-ATP

Polymerisering van G-actine op plus pool

Ketenverlenging

Figure 15-20

Modulering van F-actine

door Rho GTPasen

699

Rho GTPasen = monomere G proteïnen Moleculaire schakelaren

Geregeld door GEF/GAP via signaaltransductie

Rho stress vezels Activering van formine vorming van

lange actinefilamenten

Rac lamellipodia Activering van WAVE Arp2/3

Cdc42 filopodia Activering van WASP Arp2/3

Regeling van WASP Arp2/3

700

Wiskott–Aldrich syndrome

deficientie in WASP

Integrin regulation of Rho-GTPases during early and late stages of cell spreading.

Huveneers S , Danen E H J J Cell Sci 2009;122:1059-1069 ©2009 by The Company of Biologists Ltd

Intracellulaire beweging van Listeria

bacterie infectie van naburige cel

703

Beweging en contractie

(BWC16)

26. Microtubuli-gebaseerde beweging: kinesine en dyneïne

704

Axonaal transport Beweging van cilia en flagella

Scheiding van chromosomen

Kinesine/dyneïne-gedreven beweging langs microtubuli

Transport van organellen

705

Microtubuli als transportsporen

706

Radiaal netwerk in cytoplasma: polariteit!

Min einde: verankerd in perinucleair centrosoom (MTOC)

Plus einde celperiferie

Polariteit directioneel transport

Min plus: naar celperiferie

Plus min: naar centrum

Vereist motoreiwitten genereren kracht en verplaatsing = mechanische arbeid

Kinesine en dyneïne

Figure 15-10

Overzicht van motorproteïnen in functie van

gebruikte transportsporen

707

Gemeenschappelijke kenmerken

• ATPase: ATP ADP + Pi + energie

• Mechanische arbeid: kracht + verplaatsing

Onderscheid

• Moleculaire identiteit

• Cargo

• Welk spoor en directionaliteit

Snel axonaal transport

in neuronen

708

Anterograad transport: eiwitten

voor presynaps, neurotransmitter

Aanmaak in cellichaam: rER

Golgi TGN

Vesiculair transport door axon tot

in presynaps

Retrograad transport: endosoom,

autofagosoom,

Vorming in presynaps

Vesiculair transport door axon tot

cellichaam

Figure 16-1

Figure 15-10

http://youtu.be/-QZJrshalh4

Axonaal transport van

vesikels langsheen MT

709

Vesikel = cargo

Associeert met MT via motoreiwit

Anterograad transport

Kinesine motor: beweegt - +

Retrograad transport

Dyneïne motor: beweegt + -

Afwisseling antero/retrograad transport

Ifv dominante motor

Figure 16-2

Toepassing axonaal transport

Rabies virus - hondsdolheid

710

Microtubuli motoreiwitten

Kinesine en dyneïne

ATPasen: ATP ADP + Pi + energie

Energie mechanische arbeid (verplaatsing, kracht)

Binden aan MT directionele beweging langs MT

Binden cargo verplaatsing van cargo

Multigen familie: indeling op basis van „heavy chains‟

Vesikels, organellen, chromosomen, RNA,

intermediaire filamenten (+) (-)

Cytosolische dyneïnes

(1 gen)

Vesikels, organellen, chromosomen,

mRNA, intermediaire filamenten

(-) (+)

(+) (-)

Kinesines

(45 genen)

Cargo Richting Motor

711

Cilia en flagella (+) (-) Axonemale dyneïnes

(13 genen)

Kinesine motoreiwitten

Voorbeeld: kinesine 1

712

2 hoofdjes = motordomeinen

Bindingsplaats voor MT

Bindingsplaats voor ATP

ATP hydrolyse beweging

2 linkers tussen hoofd en staart

Beweging in functie van ATPase cyclus van hoofd

Bepaalt directionaliteit van beweging

1 steel dimerisering van kinesine door coiled a-helix

Staart binding van cargo

Figure 16-3

Kinesine motoreiwitten: isovormen

713

Gelijke opbouw

Hoofd – linker - staart

Verschillen in

Identiteit van zware

en lichte ketens

Beweging

Min plus

Plus min

Cargo

Cytosolische kinesines: vesikels, organellen

Mitotische kinesines: chromosomen

Figure 16-3

Kinesine1: mechanisme van beweging

714

“Hand-over-hand” beweging Alternerende hoofdjes

in voorste positie

Energie: ATP binding en hydrolyse

Stapsgewijs: 8 nm stappen

Directionele beweging Min naar plus

Transport naar plus einde van MT anterograad axonaal transport

Processieve beweging Doorlopen van meerdere cycli zonder dissociatie van MT

Steeds 1 hoofdje gebonden aan MT

Vereist coördinatie tussen hoofdjes: werken in tegenfaze!

Figure 16-3

Dyneïne motoreiwitten: isovormen

715

Cytoplasmatisch dyneïne

Plus min

Transport van organellen,

vesikels

Axonemaal dyneïne

Plus min

In cilia en flagella

beweging van cel

Cytoplasmatisch dyneïne

716

2 hoofdjes:

motordomein

Zware ketens

Binding en hydrolyse ATP

Binding aan MT

1 stam

Intermediaire en lichte

ketens

Onrechtstreekse binding

van cargo

Via dynactine complex

http://youtu.be/z2yFlNn2dZc

Figure 16-4

Beweging van endomembranen en

organellen via kinesine/dyneïne motoren

717

ER: bindt aan MT via kinesine

Verspreiding naar periferie

ER Golgi vesikels

Dyneïne motor

TGN PM vesikels

Kinesine motor

Endosoom

Dyneïne motor

Figure 16-5

Beweging via cilia en flagella

718

Cilia en flagella = beweeglijke uitstulpingen van de plasmamembraan Axonema structuur: centrale as van stabiele microtubuli (zie verder)

Motoreiwit: axonemaal dyneïne

Ritmische en gecoördineerde beweging Beweging van cel of van extracellulair materiaal

Figure 16-6

Cilia

719

Voorkomen Korte uitsteeksels omgeven door PM

Meestal in groep: tot >1000/cel

Functie Individuele slagbeweging: heen en weer

Gecoördineerde golfbeweging van alle cilia

Zorgt voor beweging van Cellen unicellulaire organismen

Extracellulaire componenten

Voorbeelden: trilhaarepitheel Eileider: transport van eicel van ovarium baarmoeder

Luchtweg: transport van mucus keelholte

Figure 16-6

Beweging van cilia: trilhaarepitheel

720

bovenzicht zijzicht

Flagella

721

Voorkomen

Lange uitsteeksels omgeven door PM

Beperkt aantal per cel: 1, evt 2

Functie

Beweegt volgens golfpatroon

Cellulaire beweging

Voorbeelden

Voortbeweging van spermatozoön

Figure 16-6

http://youtu.be/IEdb3wTMSBo

Axonema structuur van cilia en flagella

722

Microtubulus structuur

Bundel van MT

Basaal lichaam: 9x3

Inplanting van axonema

Axonema: 9x2

Tip omgeven door PM

Basaal lichaam

723

Basis van cilium/flagellum

Opbouw: 9x3

9 triplets van microtubuli

Afkomstig van centriool

Functie

Verankering van axonema

Bindt min einde van axonema MT

Figure 15-10

Figure 16-7

Axonema: structuur

724

Tip van cilium/flagellum

Opbouw: 9x2 MT

9 perifere doublets

2 centrale MT

Connecties

Nexines: tussen doublets

Radiale spaken: tussen

centrale MT en doublet

Figure 16-8

725

Axonema: beweging

726

Dyneïne: hoofdje beweegt over B-ring

van naburig duplet

Richting: plus einde min einde

Tractie op naburig doublet

Axonemale

dyneïnes = motor

Ingeplant op A-ring

van duplet

Inner arm dyneïnes

Outer arm dyneïnes

Figure 16-8

Axonema: beweging buigen van

cilium/flagellum

727

Tractie op doublet buigen van axonema

Gefixeerde doublets geen verschuiving tov elkaar

Tractie op doublet buigen

Doublets gefixeerd tov elkaar

Nexines, spaken

Inplanting in basaal lichaam

Figure 16-8

Toepassing

728

http://youtu.be/vQ3CdSiVzUk

http://www.nhlbi.nih.gov/health/health-topics/topics/pcd/

Toepassing

729

Situs inversus

R R L L

Primaire ciliaire dyskinesie

Kartagener syndroom

Erfelijke aandoeningen

Mutaties in gen voor axonemaal dyneïne (intermediate chain)

Resulteert in ciliaire disfunctie

Klinische symptomen

Luchtweginfecties

Situs inversus

Infertiliteit

730

Beweging en contractie

(BWC16)

27. Actine-gebaseerde beweging: myosine

731

732

Cytokinese

http://celldynamics.org/celldynamics/research/cytokinesis/index.html

Vesiculair transport

http://wiki.pingry.org/u/ap-biology/index.php/Cytoskeleton

Spiercontractie

Figure 16-10

Celbeweging

Myosine motoreiwitten

733

ATPase: ATP ADP + Pi + energie

Energie mechanische arbeid (verplaatsing, kracht)

Bindt aan actine directionele beweging langs actinefilament (+ einde)

Bindt cargo verplaatsing van cargo

Verschillende isovormen

Celspecifiek expressiepatroon

Betrokken in verschillende soorten van beweging

Spiercontractie: myosine II

Vesiculair transport: myosine V, I

Fagocytose: myosine VI

Myosine isovormen: gemeenschappelijke

kenmerken

734

Samenstelling

Zware keten

Lichte ketens

Domeinopbouw

Hoofd = motordomein

ATP binding en hydrolyse

Binding aan actine

Nek = hefboom

Variabele lengte

Staart

Binding aan cargo

Structuur van myosine II

735

Myosine II = hexamer Aanwezig in skelet- en

hartspier

Domeinstructuur: hoofd, nek, staart

2 zware ketens Hoofd = motordomein

ATP binding en hydrolyse

Binding aan actine

Nek = bindingsplaats voor lichte ketens Hefboomfunctie

Staart: dimerisering via „coiled coil‟ structuur

4 lichte ketens binden aan nek van zware keten 2 Regulatory light chains

2 Essential light chains

Functie Stabilisering van nek

Regeling van myosine ATPase

Figure 16-9

Hiërarchische opbouw van skeletspier

736

spier

spierbundel

spiervezel = cel

myofibril

sarcomeer

Figure 16-10

Multinucleair

Tot verschillende cm lang

Gestreept patroon

Myofibril

737

Kabels in lengterichting van spiervezel

Tot meerdere cm‟s lang

Seriële aaneenschakeling van sarcomeren

Begrensd door Z schijf

Gestreept patroon

Opgebouwd uit

Dikke filamenten

Dunne filamenten

Figure 16-11

Sarcomeer als structurele en functionele

eenheid van skeletspier

738

Gestreept patroon van myofibril: afwisseling van A-banden: donker

Lengte van dikke filamenten

I-banden: licht Niet-overlappend deel van dunne

filamenten

In 2 gedeeld door Z-schijf

Sarcomeer: structuur begrensd door 2 Z-schijven Centrale A-band

Centrale H-zone met M-schijf

2 perifere halve I-banden Begrensd door Z-schijf

Figure 16-12

Dik filament: polymer van myosine II

739

Aggregatie van 300 tot 400 myosine II eiwitten Associatie via myosinestaarten

Bipolaire vorm

Centrale zone = overlappende staarten Deels parallel, deels antiparallel

Perifere zones Uitstekende myosinehoofdjes

Overlappen met dunne filamenten in perifere deel van A-band

Hoofdje bindt aan actine

Figure 16-13

Dun filament

F-actine, tropomyosine en troponine

740

F-actine microfilament Plus einde ingeplant op Z-schijf via

Cap Z

Min einde in centrum van sarcomeer: bekleed door tropomoduline

G- actine monomer Bindingsplaats voor myosine

Tropomyosine: staafvormig eiwit Ligt in groeve van F-actine over

ganse verloop van filament

Bedekt bindingsplaats voor myosine

Troponine: heterotrimeer complex TN-T: bindt aan tropomyosine

TN-C: Ca2+ bindend eiwit ( CaM)

TN-I: inhibeert actomyosine

Figure 16-14

Organisatie van dikke en dunne filamenten

in sarcomeer

741

Dikke filamenten

1,6 mm lang

Parallelle schikking in centrum van

sarcomeer

Vastgehecht op M-schijf

Dunne filamenten

1 mm lang

Plus einde: vastgehecht op Z-schijf

Min einde: overlapping met dikke

filamenten

Figure 16-12

Structurele eiwitten in sarcomeer

742

CapZ

Bindt plus einde van F-actine

Verankering aan Z-schijf

Myomesin

Bindt dikke filamenten

Verankering aan M-schijf

Titine = reuzefilament

Loopt van Z- tot M-schijf

Belet uiteenrekken van

dikke en dunne filamenten Figure 16-15

Table 16-2 Labeled

Mechanisme van spiercontractie

Sliding filament model

744

Tijdens contractie

Inkorting van sarcomeer

I-band wordt korter

Dunne en dikke filamenten blijven even lang

Verklaring

Dunne en dikke filamenten schuiven over elkaar

Inkorting sarcomeer inkorting spier contractie

Figure 16-16

Actomyosine

dwarsbrug

745

Dwarsbrug = moleculaire

interactie tussen

Myosine hoofdje

F-actine

In perifere deel van A-band

Overlapping van dunne en

dikke filameten

Dwarsbrugcyclus: sequentie

van interacties tussen A en

M contractie

Figure 16-17

Figure 16-16

Potential actin-binding amino acid residues on the myosin head and conjugate residues on

actin.

Onishi H et al. PNAS 2006;103:6136-6141

©2006 by National Academy of Sciences

747

Figure 16-18

Dwarsbrugcyclus = ATPase cyclus

ATP ADP + Pi

748

Figure 16-18

Dwarsbrugcyclus = contractiecyclus

Verschuiving van dun filament

749

Figure 16-18

Dwarsbrugcyclus = koppeling van

ATPase aan contractiecyclus

1 ATP dl = 10 nm F = 5 pN

W = F*dl = 5 10-20 J Rendement = 60%

Conformaties van myosinehoofdje

750

Hoge-energie configuratie

“opgespannen” stand Hoofdje naar achter geklapt

Richting Z-schijf

Vergt energie: ATP hydrolyse door hoofdje

Lage-energieconfiguratie

Ontspannen” stand Hoofdje naar voor geklapt

Richting M-schijf

Na afgave van ADP en Pi

slagbeweging

Dwarsbrugcyclus

751

Stap 1 = vorming van dwarsbrug (vrijstelling van Pi)

Myosinehoofdje (hoge energieconfiguratie) bindt aan actine

Stap 2 = slagbeweging (vrijstelling van ADP)

M klapt naar centrum van sarcomeer lage energieconfiguratie

M oefent kracht uit op A verplaatsing van dun filament

Stap 3 = dissociatie van dwarsbrug (binding van ATP)

Binding van ATP aan myosine M lagere affiniteit voor actine

Myosine dissocieert van actine

Stap 4= opspannen van myosinehoofdje (ATP hydrolyse)

ATP hydrolyse M kantelt terug hoge energieconfiguratie

752

Figure 16-18

1 ATP dl = 10 nm F = 5 pN

W = F*dl = 5 10-20 J Rendement = 60%

753

Figure 16-18

Rigor mortis tgv ATP depletie

1 ATP dl = 10 nm F = 5 pN

W = F*dl = 5 10-20 J Rendement = 60%

Regeling van spiercontractie door Ca2+

Relaxatie

754

Rust: [Ca2+]cyt 10-7 M

Sterische hinder voor

dwarsbrugvorming

TM bedekt bindingsplaats

voor myosine op actine

Geen interactie tussen

myosine en actine

Ontkoppeling van dunne

en dikke filamenten

Relaxatie van spier

Figure 16-19

Regeling van spiercontractie door Ca2+

Contractie

755

Stimulus: [Ca2+]cyt > 10-6 M

Opheffen van sterische hinder

Ca2+ bindt aan TnC

verschuiving van TM

bindingsplaats voor myosine vrij

Myosine bindt aan actine

Vorming van dwarsbrug

doorlopen van

dwarsbrugcyclus

Contractie Figure 16-19

Reversibele regeling van dwarsbrugcyclus in

functie van [Ca2+]cyt

756

Figure 16-19

Excitatie-contractiekoppeling in skeletspier:

zenuwprikkel AP in spiervezel

spiervezel

T-tubulus

axon

5. Depolarisering = eindplaatpotentiaal

1. AP

2. Ca2+ influx

eindplaat

4. Openen van nAchR Na+ influx

drempel

AP

EPP

Vm

0 mV t

3. Exocytose van Ach Binding aan nAchR

6. Actiepotentiaal

AP toename [Ca2+]cyt in spiervezel

T-tubulus

Ca2+ Ca2+

triade

terminale cisterne

Ca2+

2. Ca2+ vrijstelling uit terminale cisterne

Ca2+

3. Toename van [Ca2+] in cytosol

Ca2+ = 10-3 M

Ca2+ = 10-3 M

1. Actiepotentiaal

T-tubulus drempel

AP

EPP

Vm

0 mV t

[Ca2+]cyto

[Ca2+]cyt contractie van spiervezel

T-tubulus

Ca2+ Ca2+

Ca2+

Ca2+

Ca2+

Ca2+

ATP

ADP + Pi contractie

1. Binding van Ca2+ aan TnC 2. Verschuiven

van TM

3. Actomyosine

interactie

ADP

Pi

drempel

AP

EPP

Vm

0 mV t

[Ca2+]cyto

kracht

Beweging van cellen

760

Voorbeelden

Macrofagen en WBC

Groeiconus van neuron

Embryonale cellen

Kankercellen

Gebaseerd op F-actine

dynamiek: vorming van

Lamellipodia

Filopodia

Stap 1: vorming van uitsteeksels aan

leading edge

761

Leading edge: vorming van

uitsteeksels

Lamellipodia = brede zone

Filopodia = vingervormige uitstulping

Vergt herschikking van F-actine

Rac WAVE lamellipodium

Cdc42 WASP filopodium

Polymerisering van actine duwt

plasmamembraan vooruit

Stap 2: herschikking van

celadhesie

762

Leading edge: vorming van nieuwe

adhesies

Verankering van protrusie

Trailing edge: verbreken van

adhesies

Focale adhesie

Integrine membraaneiwit

Extracellulair: binding aan matrixeiwitten

Intracellulair: binding aan F-actine

Verankering van cel aan extracellulaire

matrix

Stap 3: bijtrekken van

staart

763

Trailing edge: bijtrekken van staart

Vergt herschikking van F-actine

Contractie van stress fibers

Activering van Rho activering van

myosine contractie van stress

fibers

Chemotaxis: directionele celbeweging

gestuurd door signaalmoleculen

764

Beweging in specifieke richting

Vorming van lamellipodia/filopodia in richting van doel

Wordt gestuurd door extracellulaire moleculen

binding aan receptor

Chemo-attractants = aantrekken van cel

Chemorepellants = afstoten van cel

Toepassing

Groeiconus van neuron axon groeit naar doel

Witte bloedcel: beweging naar bacterie