Afdeling Organische Contaminanten/

Bestrijdingsmiddelen 1984-10-31

RAPPORT 84 . 107 Pr.nr . 505.0400

Ondeno~erp: K\o~antitatieve massaspectro­

metrie van stilbeenhormonen (als HFB

derivaat) met behulp van i sotoopver­

dunning

Verzendlijst: direkteur , sektorhoof de n, direktie VKA, afd . OCON (4x),

Projektleider (Tuinstra), Projektbeheer, circulatie.

84107

·'

Afdeling Organische Contaminanten/Bestrijdingsmidde len 1984-10-31

RAPPORT 84.107 Pr.nr. 505.0400

Projekt: Ontwikkeling methoden voor het aantonen en bepalen van bestrijdingsmiddelen en (organische) contaminanten

Onderwerp: K~o~antitatieve massaspectrometrie van stilbeenhormonen (als HFB derivaat) met behulp van isotoopverdunning.

Doel: Onderzoek naar de k1o~antitatieve toepassing van isotoopverdunnings­massaspectrometrie voor de analyse van stilbenen .

Samenvatting: Voor de kwantitatieve bepaling van stilbenen zijn voor zowel diethyl­stilbestrol (DES), dienestrol (DE) en hexestrol (HEX) gelabelde ver­bindingen beschikbaar resp. DES (D6), DE (D2) en HEX (D4) . Ten einde de mogelijkheden van k~o~antitatieve massaspectrometrie met behulp van isotoopverdunning na te gaan zijn een aantal experimenten uitgevoerd .

Conclusie: Voor de k~o~antitatieve bepaling van stilbenen met behulp van GC-HS zijn de onderzochte gelabelde verbindingen DE (D2) en HEX (D4) niet geschikt. De spectra voor DE en HEX welke verkregen worden bij gebruik van de gelabelde verbindingen zijn ten gevolge van interferentie niet één­duidig te interpreteren en leveren dus niet voldoende betrouwbare resultaten. In het algemeen kan gesteld worden dat voor een GC-HS bepaling met behulp van isotoopdilutie en gebruik make nd van een machine met laagoplossend vermogen aan één van de twee volgende voor­waarden moet worden voldaan . 1. De te bepalen verbinding dient gaschromatografisch basislijn

gescheiden te zijn van de gelabelde verbindingen. 2. Er dient om interferenties te voorkomen een verschil in AHU

(atomaire mass units) waarde te zijn van minimaal drie, voor zowel het molecuulion als één der structuur afhankelijke fragmenten, tussen gelabelde en ongelabelde verbinding.

Het toepassen van de DES (D6) verbinding bij de analyse van anabolica kan gebruikt worden ter controle van de analyse . Ten gevolge van de ~.;rissele nd e cis-trans verbinding is k1o~antificatie moeilijk. Er kan dan ook slechts gesproken worden over de orde grootte .

Verant~o~oordelijk: ir L .G .H. Th. Tuinstra ) ( Hede1o1erker/Samensteller: ing . P . Kienhuis/H.A. Traa,g;/o(!f Projektleider: ir L .G.H.Th. Tuinstra ~

84107 .0

Inleiding:

Voor het uitvoeren van kwantitatieve massaspectrometrie is de toepas­

sing van isotoopverdunning de geeigende methode (1,2,3). Gebruikt

wordt een stabiel gelabelde isotoop, van de te onderzoeken component,

welke als interne standaard bij de gehele analysegang wordt gebruikt.

De isotoop wordt aan het te onderzoeken monster toegevoegd alvorens de

opwerking \Wrdt gestart.

Aangenomen wordt, dat de isotoop zich chemisch en fysisch identiek

gedraagt aan de niet gelabelde verbinding. Gedurende de gehele

analysegang zal de verhouding van de engelabelde verbinding en de

gelabelde verbinding zich dan ook niet wijzigen.

Na op\>lerking kan massaspectrametrisch (b . v . met "multiple ion

detection") de verhouding van de intensiteiten van de massaspectra­

metrische pieken van de gelabelde verbinding ( I(l)) en de engelabelde

verbinding (I(u)) bepaald worden.

Uit deze verhouding kan, wanneer het verband tussen de massaspectra­

metrisch gemeten iu/il en de bekende concentratie verhouding Cu/Ci

bepaald is, het gehalte van de engelabelde verbinding in het monster

berekend worden .

Het verband tussen iu/il en Cu/Cl wordt verkregen door het maken van

een ijklijn.

De bekende concentratieverhouding ,.,ordt verkregen door standaarden te

maken met een vaste hoeveelheid gelabelde verbinding en een variabele

hoeveelheid van de engelabelde verbinding .

Aansluitend \olordt de verhouding van de massaspectrametrische signalen

iu/il grafisch uitgzet tegen de concentratie verhouding Cu/Cl.

Wanneer er een rechte lijn verkregen wordt welke door de oorsprong

gaat (lineaire functie: y = ax) kan geconcludeerd worden dat er geen

interferentie is (4 , 5).

In het algemeen dient er rekening mee gehouden te worden , dat er wel

interferenties optreden b . v. doordat de gelabelde verbinding nog wat

ongelabeld materiaal bevat. Bovendien kan er een massaspectrametrische

interferentie ontstaan b.v. van de 13c natuurlijke isotoop van de

engelabelde verbinding met een enkelvoudige deuterium label van de

gelabelde verbinding .

84107.1 - 2 -

- 2 -

Van belang is het dan ook om te weten of de gelabelde verbindingen

vrij zijn van ongelabeld materiaal en '~elke fragmentionen van de gela­

belde verbinding de fragmentionen van de engelabelde verbinding inter­

fereren en/of welke fragmentionen van de engelabelde verbinding de

fragmentionen van de gelabelde verbinding interfereren. Voorbeelden

van ijklijnen bij verschillende interferenties zijn gegeven in bijlage

1.

Voor de kwantitatieve bepaling van de stilbenen zijn voor zowel

diethylstilbestrol (DES), dienestrol (DE), hexestrol (HEX) gelabelde

verbindingen beschikbaar . Ter beschikking gesteld door RIVM resp .

Endoprep nr. H 145661, H 143275 en H 143274 (voor structuren zie bij­

lage 2).

Teneinde de mogelijkheden van kwantitatieve massaspectrometrie met

behulp van isotoopverdunning na te gaan alsmede het kwantitatief bepa­

len van het gehalte aan DES, DE en HEX in urine ten behoeve van een

ringonderzoek zijn een aantal experimenten uitgevoerd.

Experimenten

1. An2.lzs~ ~t~n5!_a2.r5!_eE_

Van de drie stilbenen alsmede van de overeenkomstige gelabelde verbin­

dingen zijn volgens (6) HFB derivaten bereid welke massaspectrame trisch

onderzocht zijn .

De EI (Electron Impact) spectra zijn gegeven in figuur 1 t/m 6, ter­

wijl het veronderstelde fragmentatiepatroon gegeven is in bijlage 3 .

2 . .!.J~l.!J.!! In tabel 1 zijn de concentraties van de voor de ijklijn geprepareerde

standaarden weergegeven.

Tabel 1 In bewerking genomen standaarden

St . no. Hoeveelheid Hoeveelheid Eindvolume ongelabeld gelabeld

ng ng JÜ

1 0 100 100 2 25 100 100 3 50 100 100 4 100 100 100 5 150 100 100 6 250 100 100 7 500 100 100

84107.2 - 3 -

100.9

lUC

"10 RIC OOTA: l..t<IA 11 191'29/64 13:38:99 ~1: IITI 11 sm>LE: STOES DES06 I€X IEX04 DE OE02 RAI«:Et C 1.2197 LABELt H 9, 4. 9 QI.Wl: A e. 1.8 Bf&: U 29. 3

1848

DE + DE (D2) DES + DES (D6)

1760 14:40

3 17 4

1700 14:50

1794 1801

1800 15:0'3

IS20 15:10

1840 15:20

Figuur 1: Chromatagram stilbenen

~I~ TO 1868

SI484Q (HEX + HEX (D4;

1860 SCAN 15:30 Tlt1E

- 3 -

In bijlage 4 zijn de drie met de hand getekende ijklijnen weergegeven .

Aansluitend is met behulp van de kleinste kwadraten methode via het

"upp software pakket" (7) en de DEC PDP 11/44 computer het verband

tussen de geanalyseerde concentratie verhoudingen en de gemeten in­

tensiteiten berekend (aangenomen is het volgende verband Y = A X + B)

(zie bijlage 5).

3. ~n~lzs~~~t~r.!!.

Aan de hand van de resultaten verkregen bij punt 1 is een descriptor*

voor de bepaling van stilbenen plus gelabelde verbindingen gemaakt

(zie bijlage 6).

Aansluitend zijn een drietal urinemonsters (afkomstig van een experi­

ment met dieren) in duplo geanalyseerd conform (6,7) waarbij aan de

monsters 100 ng van de gelabelde verbinding l~as toegevoegd.

Gelet op de resultaten verkregen met radio- immuno-assay (RIA) kon

uitgegaan worden van 1 ml urine en het eindextract volume kon gesteld

worden op 100 ~1.

Na derivatisering zijn de monsters me t behulp van de GC- MS geanaly­

seerd.

Discussie

Het chromatagram van de analyse van he t standaardenmengsel is gegeven

in figuur 1. Hieruit blijkt dat e r geen scheiding wordt verkregen

tussen de gelabelde en de engelabe lde verbindingen. De interpretatie

van de resultaten wordt hieronde r per component besproken .

~E~/QE~iD~ (figuur 2,3)

De belangrijkste fragmentionen 341; 417; 447; 631 en he t M+ 660 van

DES worden niet geinterfereerd door de overéénkomstige fragmentionen

van de gelabelde verbinding (figuur 2). Me t andere woorden fragmenten,

uit de gelabelde verbinding, met slechts één deuterium worden nie t

gevormd ( a lthans niet in het gemeten massabereik) .

Ook bevat de gelabelde verbinding geen ongelabeld materiaal zodat het

eventueel in het monster aanwezige DES niet heinvloed wordt.

* Descriptor programma voor het meten van een aantal geselecteerde

massa 's (MlD = multiple ion detection).

84107.3 - 4 -

MSS SPECTRU!I 11/91/84 1~:39:00 + 15 :~3

OATA1 STILB 11179 CAL I: PKI 13

lt:'IJ.(l

50.0

~LE: ST DES OE fEX HF8 ~'\.l lH ISOOCTAAN 341.1

303.1

331.1

3:r

417.1

281.1 j 351' I 377.0 401: I ~~

~1/ E. lila 350 4Óo

100.1'1

6f.0.2

631.1

5:: .2 ~ 44 .t> 571.2 593. I 613. I 645.0 ~ r.- . . ) -t _ , _ ,.

r: E 550 600 65\1

Figuur 2 : Fragmentatiepat roon DES

~~7.2

~31,- I J ~63.1

45'3

700

MSS SPECTRUM DATA: STILA 11178

1ee.0

50.0

11/E

199.0

50.0

541.5

11/01/ 84 13: 51100 + 15142 ~11 PKI 13 ~: ST I:B06 IEJ2 HEX04 tF8 SH::/ll. lH ISOOCT M'i

344.1

666.2

634.1

563.3 582.1 603. 1 lt. 648.2 l - ~-·· .. .... "'--- -...... -. ~ -

11/E sse 600 650

Figuur 3: Fragmentatiepatroon DES (D6)

BASE MI 3~1 RIC1 ?2960.

487 e 508.8 .. :!'' 500

BASE 1'1/E: 333 RICI 56704.

514.3

75(l

13760

13760

8249

8240

- 4 -

Geconcludeerd kan worden dat voor een kwantitatieve analyse elk der

fragmentionen gekozen kan worden .

Gezien de specificiteit en de respons lmrdt gekozen voor het M+ 660

resp . M+ 666.

De ijklijn welke verkregen is, zie bijlage 4 en 5, vertoont een zeer

goed lineair verband, de laagste hoeveelheid DES welke is geinjecteerd

bedraagt 1 , 25 ng (dit komt overeen bij het volgen van de standaard­

procedure met 0,3 ppb) de hoogste hoeveelheid bedraagt 25 ng

( 6,5 ppb) .

Een probleem bij de kwantificatie van DES is de wisselende (niet

bekende) cis-trans verhouding (2).

Kristallijn standaard DES bevindt zich in de transvorm . Na oplossen en

uitvoeren van o.a . allerlei chemische en physische stappen treedt er

o.a. afhankelijk van het oplosmiddel een isomerisatie naar de cisvorm

op . Dit betekent dat de met de GC-MS aangetoonde hoeveelheid trans-DES

slechts een deel is van het oorspronkelijke aamo~ezige DES.

QE.f_D!f. j_Dll_ (figuur 4 , 5)

Daar bij de gelabelde verbinding slechts tlo~ee deuterium atomen inge­

bouwd zijn lijkt de kans op het optreden van interferentie ten gevolge

van fragmenten met een enkelvoudige deuterium zeer wel mogelijk.

Uit het spectrum van de DE (D2) component blijkt echter dat de belang­

rijkste fragmentionen van DE te weten M/z 341; 445; 461; 629 en 618

nauwelijks door fragmenten van de gelabelde verbinding worden geinter­

fereerd.

Wel interfereren de natuurlijke aanwezige isotopen van (DE met name 18o) de fragmenten van de gelabelde verbinding, waardoor in een

mengsel de intensiteit van een aantal fragmenten van de gelabelde ver­

binding te hoog was.

De intensiteit van het molecuulion van de gelabelde verbinding M/z 660

wordt, wanneer een gelijke hoeveelheid ongelabeld materiaal wordt

geanalyseerd, met ca. 1 , 5% verhoogd.

Overigens bevat de gelabelde verbinding, blijkens het verkregen

spectrum, nauwelijks ongelabeld materiaal .

84107 .4 - 5 -

IIASS SPECTIMI ll / 91/84 14s39dl0 + 15: 3~ SIW>Lfs ST DES DE 10 HFB :ING/l.l. IN ISOOCTAAN

100.9

58.8

39 .I 341.1

317.1

355.1

H/ E 300 350 40J

100.0

658.2

50.0

629. 1 529.2 54 . 7 57ü.S 5t4.8

rvE

Figuur 4: Fragmentatiepatroon DE

100.8

se.0

H/E

100.0

50.0

11/E

IIASS SPECTM ll / 91 / 84 13:51s96 + 15s3~ 54W'l.Es ST DE.S06 DED2 HEX04 lf'B ~l.l. lH ISOOCTM'l

342.1

318.1 394 ,8

333.1

660.2

52S. 2 553.9 57:1.2 59:1.:1

680 650

Figuur 5: Fragmentatiepatroon DE (D2)

OAHu STILB 11167 CAL I 1 PI< I 13

445.2

461.1

429.1

6?~.1)

70ü

DATA: STILA 11168 CAL.Is PKI 13

447.1

463. 1

431.1

700

BHSE H/Es 445 RICs 61376.

75u

BASE H/E: 447 RICs 630413.

513. 1

750

7936

7936

8912

8912

- 5 -

Uit de grafische t11eergave van de ijklijn (bijlage 4) blijkt ook dat de

ongelabelde verbinding de gelabelde verbinding interfereert. Dit

blijkt uit het afwijken van de meetpunten, waarbij een relatief hogere

concentratie aan ongelabeld materiaal is geanalyseerd, ten opzichte

van detectie.

Een ander probleem bij de analyse van dienestrol in aanwezigheid van

de gelabelde verbinding is de kt~Talitatieve interpretatie van het

spectrum.

De twee verbindingen hebben dezelfde retentietijd, waardoor het

spectrum van DE verstoord wordt door DE (D2). Immers bij aanwezigheid

van relatief hoge concentratie aan de gelabelde verbinding zal het

spectrum meer op de gelabelde verbinding lijken dan op dienestrol

zelf.

In dit geval zal de "base peak" niet H/z 445 maar N/z 4l•7 zijn, ll1aar­

door de onderlinge verhouding van de fragmenten van dienestrol via een

rekenkundige correctie berekend moeten l-Torden. Ten gevolge van de

noodzaak van een dergelijke correctie zal de kans, bij aanwezigheid

van dienestrol (D2), op vals negatieve uitslagen toenemen.

!!_E~/.!:!.E~ lP~ De problemen welke te verwachten zijn bij de analyse van hexestrol ten

aanzien van hexestrol (D4) blijken direct uit het spectrum. De gela­

belde verbinding geeft naast een signaal voor M/z 333 ook een signaal

voor H/z 331 (ca. 10%). Belangrijker is echter de vorming van het

fragmention met M/z 303 uit de gelabelde verbinding.

Naast het fragmentatiepatroon van HEX en !lEX (D4) in bijlage 3C wordt

hier de vorming van H/z 303 en H/z 304 schematisch weergegeven (alleen

het belangrijkste deel van het molecuul is getekend).

A) D

0-f (f)

H

H H

O-f ®

H

I

B) c~t I 0 - 1 ~

_ H

_ D

H D

84107.5 - 6 -

100.&

58.9

1\1[

100.9

50.ü

IVE

IIASS SPE CT RLtt I 1/91184 14:39:00 • 1:1:58 SA"PLE: ST DES OE lEX tf'B 5NCIU.. lH ISOOCTAA/1

33 .I

3e .I

534. '5 554.7

600 650

DATA: STILB 11188 ~1: PKI 13

Figuur 6: Fragmentatiepatroon HEX

100. 9

5&. 9

11/E

100.0

58.9

MSS SI'ECTRl.tl DATA: STILA 11188 111&1184 13: 51 100 t 15::50 CALI : PKI 13 SAIIPLE1 ST OES06 OED2 HEXD4 tf'B :itfC/ll. lH ISOOCTAAII

333.1

394.1

284 .9 314. 1 l 346.8 373.8 353. 2 424. 1 453. 1 471.4 •"f - · ··- · • ·-·~ ~ t~·· ~ ..• ~ .... ~ 350 490 450

568. 2 591.9 662. 5

111 [ 550 600 650 70û

Figuur 7: Fragmentatiepatroon HEX (04)

BASE IVE: 331 RIC: 6630-4.

BASE 11/E: 333 RIC1 157440,

494.4

27360

27369

66432

66432

- 6 -

Voor wat betreft de ijklijn welke is geconstrueerd aan de hand van de

intensiteiten van M/z 331 en M/z 333 zou men een resultaat verwachten

conform bijlage 1 (figuur 2). Dit blijkt niet uit bijlage 4 (hierbij

is de lijn ten onrechte door de oorsprong getrokken, met andere woor­

den Y = AX) echter \'lel uit bijlage 5 (Y = A X + B \'laar in B = 0, 24) .

Voor wat betreft het kwantitatieve aspect zal systematisch, wanneer

er geen correcties \'lorden toegepast, een te hoog hexestrolgehalte

berekend \W rden .

De mate waarin het gehalte te hoog zal zijn is afhankelijk van de

relatieve concentratie.

De k1-1alitatieve interpretatie van het spectrum van hexestrol (in aan­

wezigheid van de gelabelde verbinding is zeer moeilijk en de verkregen

resultaten zullen discutabel zijn en dus van geen enkele waarde.

Immers het spectrum geeft slechts t1-1ee fragmentionen te zien H/z 331 en

M/z 303 waarbij de eerste, bij gelijke concentratie van HEX en HEX

(D4), ca. 10% te hoog is en de tweede ca. 50% te hoog is.

Resultaten monsteronderzoek

De hierboven genoemde discussie werd bevestigd door de resultaten van

een drietal onderzochte monsters afkomstig uit een dierproef en wel op

een voldoende hoog niveau nl. ca . 50 ppb. In het diethylstilbestrol

bevattende monster kon DES kwalitatief met de geldende criteria aange­

toond lwrden.

Voo1.· \'lat betreft het k1-1antitatieve aspect bleek niet het aanwezig zijn

van een gelabelde verbinding problemen te scheppen, maar de niet

constante cis-trans verhouding, zie ook (2).

In het dienestrol bevattende monster kon na het toepassen van een aan­

tal correcties dienestrol aangetoond worden echter het kwantitatieve

aspect werd bemoeilijkt door het niet lineair zijn van de ijklijn.

In het hexestrol bevattende monster kon ten gevolge van de interferen­

tie van de gelabelde verbinding geen hexestrol met de op dat moment

geldende criteria aangetoond worden.

Daar de ijklijn van hexestrol niet door de oorsprong gaat zal het

gehalte bij k1-1antificering (bij toepassing van de functie Y = AX) te

hoog zijn.

84107 . 6 - 7 -

- 7 -

Conclusie

Voor de k1o~antitatieve bepaling van stilbenen met behulp van GC- HS zijn

de onderzochte gelabelde verbindingen DE (D2) en HEX (D4) niet

geschikt.

De spectra voor DE en HEX 1o1elke verkregen worden bij gebruik van de

gelabelde verbindingen zijn ten gevolge van interferentie niet één­

duidig te interpreteren en leveren dus niet voldoende betrouwbare

resultaten. In het algemeen kan gesteld worden dat voor een GC-HS

bepaling met behulp van isotoopdilutie en gebruikmakend van een

machine met laagoplossend vermogen aan één van de twee volgende voor­

waarden moet worden voldaan.

1. De te bepalen verbinding dient gaschromatografisch basislijn

gescheiden te zijn van de gelabelde verbindingen.

2. Er dient om interferenties te voorkomen een verschil in Al1U

(at oma i re ma ss units) 1o1aarde te zijn van minimaal drie, voor zowel

het molecuulion als één der structuur afhankelijke fragmenten,

tussen gelabelde en ongelabelde verbinding.

Het toepassen van de DES (D6) verbinding bij de analyse van anabolica

kan gebruikt worden ter controle van de analyse. Ten gevolge van de

wisselende cis-trans verhouding is k1o~antificatie moeilijk. Er kan dan

ook slechts gesproken worden over de orde grootte.

Literatuur

1. B.J. Hillard, 1979. Quantitative mass spectrometry. Heyden and Sons

London (UK) ISBN 0- 85501-156-4.

2. J. Freudenthal: Chemisch Weekblad oktober 1979, 657-660.

3. J.A.A. Jonckheer, A.P. de Leenheer: Para Hedica (1981) 1, 2-5.

4. J.F. Pickup, K. HcPherson: Anal. Chem. 48 (1976) 1885-1890.

5. D. Picart, F. Jacolot, F. Berthon, H.H. Floch: Quantltative mass

speetrometry in life sciences II June 13-16, 1978, Ghant Belgium.

6. L.G.M.Th. Tuinstra, W.A. Traag, H.J. Keukens, R.J. van Mazijk:

Journal of Chromatography 279 (1983) 533-542.

7. R.A. Hilhorst: Uniform program package (UPP); Sprenger Instituut

lvageningen.

8. L.G.M .Th. Tuinstra, W.A. Traag. RIKILT-rapport 81.92: Interpretatie

van GC- HS resultaten van de bepaling van diethylstilbestrol in run­

derurine.

9. Intern voorschrift F 74.

84107.7 Tr/W

Bijlage 1 : Verband tussen de verhouding van gemeten intensiteiten en de concentratie verhouding

Iu/ll Iu/ll

3,0 3,0

2,0 2,0

1,0 1,0

Cu/Cl Cu/ Cl

1,0 2,0 3,0 1,0 2,0 3~ 1: geen wederzijdse interferentie

Iu/Il

3,0

2,0

1,0

Cu/Cl

1,0 2, 3,

3: interferentie van de ongelabelde verbinding op de gelabelde

3,0

2,0

1,0

2: interferentie van de gelabelde verbinding op de ongelabelde verbinding

lu/ll

Cu / Cl

i,o 2' 0 , 4: wederzijdse interferentie

Iu = intensiteit fragmention van de angelsbelde verbinding 11 = intensiteit fragmention van de gelabelde verbinding Cu = concentratie van de angelsbelde verbinding Cl = concentra tie van de gelabelde verbinding

Bijlage 2 Structuur DES, DE, HEX

Diethylstilbestrol

CH:\

Dienestrol

Hexestrol

Diethylstilbestrol (D6)

CHz I

CD

uo-Q-M - "-Oo" co I

CH3

Dienestrol ( D .z)

c H!.

I

HO-o-1~,-oOij co1... I c HJ

Hexestrol (D4)

Bijlage 3A Fragmentatiepatroon diethylstilbestrol en diethylstilbestrol (D6) als HFB der i vaten

* deuteriumlabel bij de M+ zijn 6 D atomen aanwezig

0 11

lt - C - C Ft. - C i'"t..- C F3

CH3 I

g>Q t T {}o- ~-c,f) ~H~ M~ :: 4b3 (11bg >f) CH.\

I>

-0

Bijlage 38 Fragmentatiepatroon Diens trol en Dienestrol dideutero (D2) als HFB derivaten

... C Hz OF - C HI-/"11

* Deuterium label plaats (maximaal 2 D-atomen aanwezig)

-~-·

11/T EIUI EOiiiÎr:

)t - c ,_ H~

Bijlage 3C: Fragmentatiepatroon hexestrol en hexestrol tetradeutero {D4) als HFB derivaten

__ _"G)

H ~- ~ l ~o -c- cr-t - c r'f.-c~."

c tit. I

C HJ

-C ii.z.=C I-/ z

* Deuteriumlabel plaats (max . 4 D atomen aanwezig)

Opmerking : 1) t~ol ecuulion wordt in de "Elektron Impact Mode" niet waargenomen. 2) Zowel afsplitsing D al s H mogelijk (1 x D meest waarschijnlijk M/z = 304

echter ook D-H uitwisseling M/z = 303).

7

6

5

4

3

2

1

Bijlage 4: Grafische ~eergave van de verhouding van de geanalyseerde concen­traties versus de verhouding van de gemeten intensiteiten

Iu/Il

0

I I

I I

I /

J I

1 2 3

Cu/Cl

4

660 DES = 666

~

658 DE = 660

----~ 331

HEX = 333

5

' .

I S D SU BSETS! DES

*** LIN EAR RE GR ESSION *** *** Y=A+B * X *** 1J A!UA BLES: X= X Y= . y

INF'UT DATAt SUBS, I OBS, x

2 I 1 0 ' ) "- I 2 . 2 5 2 I 3 "'" • .J

2 I 4 1 2 I 1:"

.J 1 • 5 2 I 6 ') 1:"

- • .J

2 I 7 1:" .J

N a n a l ~se d! 7 N "'i s si n sl : 0

~lE (-l N X AN D Y : . 1, 5 357 1

S T [I , [I E l,) , : 1. 7 46 6

REGR ESSI ON COEFFICIENTS! A -,0325712 B 1.54884

RE S. ST.ERR.: ·,152045 CORR •. COEFF! .998686 D . F,: 5

TAB LE OF RE SI DUALS! X · Y 0

1:" • .J

1 1 a:.-

.~·

SUl~ EF:F: I '"·2 : E X F' L , F' t-r R T :

.01 6

. 373

.681 1 t 4 5 2 .15 4 . 12 7.6 3 2

.11 5 5 89

. 997374

Bijlage 5

y WEIGHT .016 1 . 373 1 .681 1 1. 4 5 1 2 .15 1 4.12 1 7 .63 2 1

2 t 346 .

2.7087 5

S TD, ERRORS! T- VALUES ! .0792544 - .4 10 9 71 .0355389 43.5814

Y<C AL ) -.032 5712

.354638

.741847 1. 5 16 2 7 2 . 2 9 06 8 3. 8395 2 7 .7 1161

E (I) .0 4857 12 . 0 183 62

--.0 60 84 73 - . 0 6 62659 -- . 14 0 6 8 I}

+ 2804 ï'9 -- • 0 7 <j' 6 1 .t1 i

y

8.80

8.00

7.2o l b . ~o l ~ ' 0 1 ._ •• o . I

I I ,EO t

i 4.00 1

3.20

1.60

0~01 " v oO' l

(

l • . 11'. I .... l f .n • \ I

t

t

t. .

. *

t I

-u.ov + · +;------t- ------t;-- - - --t-------t;--- ---t--- - --;+~------+-- ---- -+~~-----t-------t;~-----t------~+~

-O ~ JO 01JO l1JO , ,JO 3.J0 4. J0 J1JO

x

I S D

ISD SUBSETS! HEX

ttt LINEAR REGRESSION *** *** Y~A+BtX *** 1JNUABLES! X= X Y= . y

I t·~ F'U T DAH1 t SUBS,/OBS,

~· / 1 3 /

,..., :..:.:.

' ~· I I 3

' ~· I 4 3 I !::"

.J

-:2 / t.. ·-· 3 / 7

x 0 . ·25

!::" t .J

1 1 t 5 2.5 5

N a nz:d~:sed! "/ i ·~ n; is. s. ins : 0

MEA N X AND Yl 1.53571

s T [I t [I E I) t : 1 t 7 4 6 6

REGRESSION COEFFICIENTS: A .0236102 B . 391417

F:ES, ST,ERF:.: CO RR, COEFF! D.F.!

.02 52476

. 999432 !::" .J

TABLE OF RESIDUALS! x 0

,..., c­+..:... ._1

c: · t ·-'

1 .

y

.021

. 114

.215

.391 I ,.} 7

t Q,;...,

1t-045 1 ' 7' t..

.00 3 187 2

y WEIGHT .021 1 t 1 1 4 1 .215 1 .391 1 .627 1 1.045 1 1.96 1

.t:-24714

.684035

STD. ERRORS! T-VALUES! . 0 1316 04 1.79403 .00590135 66.3266

Y<CAL) . 0236102 .121464 . 219319 t 4150:.~7 . 610 735 1.00215 1.9 8 069

E<I> -.00261024 -.00746439 -- , 0 0 4 3 1 8 !S 4 -.0240268

.01626 119 '0 •1 2 84 83

'(

2.20 t

2.00

I,BO l I ,60 j

1.40 I

1.20 l 1. 00 l· :f I

o.eo 1

* I I 0160

o. 40

IS D

ISD SUBSETS ! DE

** ~ LINEAR REGRESSION *** *** Y=A+B* X *** IJARIABLE S ! X= X Y= y

INF'UT DATA! SUBS,/OBS, x

1 I I 1 0

1 I 2 ,.·) C" t,:..~

1 I I

"1 ..., t:' . ...., 1 / 4 1 1 I

I 1::" .J 1.5

1 I L u

'l t:" .... .... J

1 I 7 c ... ,J

H a në: l -:;-=:.ed: 7 N rn i -::. -::. i r1 s : 0

MEAN X AND Y! · 1.53571

ST D, DE 'J.: 1.7466

REG~ ESSION COEFFICIENTS ! A .0950932 B ,685056

RES. ST.ERR.: .1 01172 CORR , COEFF I .99 7034 [I.F .! 5

TA BLE OF RESIDUALS! x · y

0 ,..... c::·

tO::. --)

"' t ,._1

1

S U I·~ C: F: F: • ~. 2 : E. X F' L , F' A R T ~

.012

.3 '7'8

. 816 1.223 1. 945 ~~. 42 1

.05 11 79

.994077

y WEIGHT .012 1 .215 1 • 3<!8 1 .8l6 1 1. ~?23 1 1.945 1 3.421 1

1.1471'4

1. 20007

STD, ERRORS: T-VALUES : .0527365 1.8031 7 . 0236479 28 . 9689

Y<CAL) • o<.f50?32 . 266357 .437621 . 7 801.49 1.12268 1. 80773 3. 52037

E < I ) -. OB2. 09~. 2

- . 0513571 --. 03?é. 21

.0 3585 1 2

.1 00323 ~:!.3 7 268

.... t (: '7'7'3 7 1:-:

y

3.60

( , .-,0 t '-'' l. (

'i r.,, j\ .:..1 C•-...:

l 2.40 t

I .

I j

'l , , , . l ... vJ (

I C '"1 ._, L•

.. . *

*

* . ..

Bijlage 6: Descriptor voor de bepaling van stilbenen + gelabelde verbindingen

MlD DESC: A7

""' INST: 4521 CALI: WTl ' "\., ' ' \

MASS DEFECT AT 100 AMU 30 1'1MU " Mf-\STER RATE ' · 256 TOT AL ACGU TIME 0. 210 SECS TOT AL SCAN TIME 0. 300 SECS CENT SAMP INT 0 . 200 1'1S MASS RANGE 1 TO 1024 AMU 16. 302. 590 666. 699 0. 009 0. 300 1 80 0 INT BEGIN END • TIME <SECS) MPW MFW MA

# MASS MASS REQUEST ACT UAL

1. 302. 590 303. 591. 0.015 0. 013 3 80 25 .., <:.. . 303. 591 304. 591 0 . 015 0. 013 3 80 25 3. 330. 599 331. 599 0 . 015 0. 013 3 80 25 4 . 332. 599 333. 600 0.015 0. 013 3 80 25 5 . 340. 602 341. 602 0. 015 0. 013 3 80 25 6 . 342. 602 343. 603 0. 015 0. 013 3 80 25 7 . 343. 6()3 344. ·603 0. 015 0 . 013 3 80 25 8. 444 . 633 445 . 633 0 . 015 0 . 013 3 80 25 9 . 446 . 633 447 . 634 0. 015 0. 013 3 80 25

10. 452 . 635 453 . 635 0 . 015 0. 013 3 80 25 11 . 628. 688 629 . 688 0. 015 0 . 013 3 80 25 12. 630. 688 631 . 689 0 . 015 0 . 013 3 80 25 13. 633. 689 634. 6 90 0 . 015 0.013 3 80 25 14. 657. 697 658. 697 0 . 015 0. 013 3 80 25 15. 659 . 697 660. 698 0.015 0.013 3 80 25 16. 665. 699 666. 699 0 . 015 0.013 3 80 25

'·

1 0 POS TH BL ION

1 0 POS 1 0 POS 1 0 POS 1 0 POS

. 1 0 POS 1 0 POS 1 0 POS 1 0 POS 1 0 POS 1 0 POS 1 0 POS 1 0 POS 1 0 POS 1 0 POS 1 0 POS 1 0 POS