Van staal tot protocol: wat zegt het APD resultaat?

Liesbeth Ferdinande

Dienst Pathologische Anatomie Laboratorium voor kankerdiagnostiek en pathologie

• Stalen en klinische vraagstelling

• Verwerken van stalenRoutine

Vriescoupe

Cytologie

• Bijkomende analysesImmuunhistochemie

FISH

• Kwaliteitszorg

STALEN

• Biopsies

• Chirurgische resectiestukken

• Cytologische stalen

• Autopsies

• Consulten UZ Gent 201721766 biopten/resecties (incl. consulten)3093 cytologiestalen5538 cervixuitstrijkjes58 autopsies

KLINISCHE VRAAGSTELLING

• Diagnostiek• Oncologisch

• Diagnostiek, staging, prognostische en predictieve biomerkers

• Inflammatoir

• Functioneel

• Medicolegaal

• Kwaliteitscontrole

Biopten

• Oppervlakkige biopten• (Punch)biopten van huidafwijkingen• Wegname van kleine huidletsels

• Endoscopische biopten• Laryngoscopie, bronchoscopie, gastroscopie, coloscopie, colposcopie• Biopten van mucosale afwijkingen of tumoren• Wegname van kleine letsels, vb. darmpoliepen

• Naald-, cilinder- en truecutbiopten• Lever(tumoren), nier, longtumoren (transthoracaal), borsttumoren• Aanprikken van oppervlakkige letsels • Onder echo- of CT-geleide van diepere letsels

• Chirurgische biopten• Incisiebiopten, vb. open longbiopsie• Excisiebiopten, vb. wigresectie van longnodule

Chirurgische resectiestukken

• Macroscopie!

Cytologische stalen

• Cervixuitstrijkjes

• Urine

• Ascitesvocht, pleuravocht, cystevocht, cerebrospinaal vocht…

• Fine Needle Aspiration Cytology (FNAC): • Percutaan aanprikken van lymfeklieren of letsels

• Oppervlakkig

• Onder echo- of CT-geleide

• Transoesofagaal (EUS=esophageal ultrasound)/transrectaal/transbronchiaal(EBUS=endobronchial ultrasound) aanprikken van lymfeklieren of letsels (echo-endoscopie)

VERWERKEN VAN STALEN

• Staalontvangst en registratie in LIMS (Laboratory Information Management System)

• Fixatie in formol

• Macroscopie

• Dehydrateren en inbedden in paraffine

• Snijden en kleuren van paraffinecoupes

• Evaluatie van coupes door patholoog

• Eventueel bijkomende analyses

• Protocol maken in LIMS

• Export van protocol naar EPD

Staalontvangst en registratie

• Order met klinische informatie noodzakelijk!• Voor correcte registratie

• Voor correcte verwerking van staal

• Uniek registratienummer in LIMS per patiënt per ingreep

Fixatie in formol• ‘Time to fixation’ tot een minimum beperken

• Staal onmiddellijk in formol • Eventueel in frigo• Problemen met bijkomende analyses

• Voldoende formol (ideaal: verhouding 1/10)• Fixatiesnelheid formol: 1-2mm/uur• Fixatieduur van cruciaal belang:

• Ideaal: 6-72h (24h)• Niet lang genoeg = onderfixatie:

• Morfologie van weefsel niet goed bewaard• Problemen met technicering (weefsel moeilijk te snijden)• Problemen met bijkomende analyses

• Te lang = overfixatie: • Problemen met bijkomende analyses

impact van te lange ‘time to fixation’ op oestrogeenreceptor immuunhistochemie

in borsttumoren

Qiu et al. Am J Clin Pathol 2010

impact van fixatieduur op PD-L1 immuunhistochemie

Ilie et al. Virchows Arch 2016

3h 8h

48h24h

72h 96h

Macroscopie

• Beschrijven van het staal en in genummerde cassettes steken

• Grote biopten of stukken: versnijden en gericht nemen van prelevementenvoor microscopisch onderzoek

• Door patholoog en/of bevoegde macroscopie-assistent

• Volgens orgaan- en/of pathologiespecifieke richtlijnen

• Voor of na fixatie

• Gebruik van inkt voor snijvlakken

Gebruik van inkt voor snijvlakken

facies costalis = zwart

mediaal = rood

pericard = geel

diafragma = groen

- weeg en meet de resectie- inkt het parenchymale snijvlak- lamelleer loodrecht op dit snijvlak- meet en beschrijf de tumor(en), noteer de afstand tot het snijvlak en het kapsel-neem prelevementen van de tumor(en) :

•naar het parenchymaal snijvlak•naar het kapsel

- neem een prelevement van het niet-tumorale leverparenchym

Partiële hepatectomie

BlokkensleutelC1: tumor naar snijvlakC2: tumor naar kapselC3: lever at random

TNM classificatie

• T : tumor

• N : lymfeklieren

• M : metastase

• klinisch : cTNM

• pathologisch : pTNM

= bepalen van de uitgebreidheid van de ziekte : prognostisch en therapeutisch belang!

R status: volledigheid van resectie

• R2 = macroscopisch onvolledige resectie

• R1 = macroscopisch volledige resectie, maar microscopisch onvolledige resectie

• R0 = macroscopisch en microscopisch volledige resectie

Dehydrateren en inbedden in paraffine

• Cassettes in tissue processor

• Overnacht dehydratie en impregneren met paraffine

• Maken van paraffineblokken

Snijden en kleuren van paraffinecoupes

• Dikte van paraffinecoupes: 1,5 – 4 µm dik

• Op glaasjes met uniek registratienummer: 1-6 coupes op 1 draagglaasje per paraffineblok

• Standaardkleuring voor routinediagnostiek: hematoxyline-eosine kleuring

Evaluatie van coupes door patholoog

Eventueel bijkomende analyses

• Aanvraag via LIMS

• Status te volgen via LIMS

Protocol maken in LIMS

• Klinische informatie

(EPD order)

• Macroscopie

• Microscopie

• Conclusie

Oncologisch protocol• Procedure• Type tumor• Differentiatiegraad• Grootte / diepte-invasie• Snijvlakken• Aan/afwezigheid van lymfovasculaire invasie• Aan/afwezigheid van perineurale invasie• Therapie-effect • Resultaten bijkomende analyses voor prognostische/predictieve merkers• Lymfeklieren• pTNM• R status

Voorbeeld: Coloncarcinoom

Tumortype

• Adenocarcinoma

• Mucineus adenocarcinoom

• Zegelringcelcarcinoom

• Medullair carcinoom

• Serrated adenocarcinoma

• …

Differentiatiegraad

• goed gedifferentieerd: >95% klierbuizen

• matig gedifferentieerd: 50-95% klierbuizen

• weinig gedifferentieerd: 0-49% klierbuizen

laaggradig

hooggradig

Diepte-invasie

Diepte-invasie

Snijvlakken

Lymfovasculaire invasie

immuunhistochemische kleuring voor podoplanine = D2-40: merker voor lymfevaten

Perineurale invasie

immuunhistochemische kleuring voor S100: merker voor zenuwen

Therapie-effect: regressiegraad

Lymfeklieren

VRIESCOUPE

• Dringende evaluatie nodig (+/- 30min na ontvangst staal):• Peroperatoir:

vraag naar evaluatie van snijvlakken of diagnostiek die verder verloop van operatie zullen beïnvloeden

• Transplantatiepathologie:

vraag naar geschiktheid van donororgaan voor transplantatie

vraag naar rejectie van transplantorgaan

• Weefsel wordt niet gefixeerd, maar onmiddellijk ingevroren

• Snijden van vriescoupes met manueel uitvoeren van hematoxyline-eosinekleuring

VERWERKEN VAN CYTOLOGIESTALEN• Uitstrijkje

• Dunnelaagcytologie (liquid based cytology)

• Celblokje

Uitstrijkje

Dunnelaagcytologie

Celblokje

BIJKOMENDE ANALYSES

• Histochemische kleuringen

• Immuunhistochemische kleuringen

• Immuunfluorescentie

• Elektronenmicroscopie

• Fluorescente In Situ Hybridisatie (FISH)

• Chromogene In Situ Hybridisatie (CISH)

• Mutatie-analysemoleculaire pathologie

Histochemische kleuringen

• Op basis van chemische reacties tussen kleurstoffen en weefsel- of celcomponenten

• (Beperkte) rol in diagnostiek:• Opsporen van gisten/schimmels/zuurvaste staven (PAS kleuring, Grocott

kleuring, Ziehl-Neelsen kleuring)

• Mucus aantonen in cellen (PAS kleuring)

• Aantonen van amyloïddeposities (Kongorood)

• Aantonen van elastine in bloedvaten, pleura (orceïnekleuring)

• …

Grocott kleuring: schimmelorganismen

Ziehl-Neelsen: zuurvaste staven

Immuunhistochemische kleuringen

muis IgG

anti-humaan A

DAB

DAB

antigen A

gebiotinyleerd

schaap IgG

anti-muis IgG

avidine-

horse radish peroxidase

complex

HRP

• Aanwezigheid van eiwitten in het weefsel aantonen door middel van specifieke antilichamen

• Belangrijke rol in dagelijkse diagnostiek

• Rol in farmacodiagnostiek

nucleaire aankleuringmembranaire aankleuring

cytoplasmatische aankleuring

Immuunhistochemische kleuringen

Diagnostiek:

• Bevestigen van morfologische diagnose

vb. S100, melan A, HMB45, SOX10 in melanomen

• Typeren van morfologisch moeilijk herkenbare cellen of weefsel

vb. gecrushte cellen in kleine biopsie: tumor of immuuncellen?

• Metastasen van tumoren van ongekende oorsprong

vb. cytokeratine 7 / cytokeratine 20 profiel in epitheliale tumoren

• Aantonen van specifieke bacteriële of virale infecties

vb. Helicobacter pylori, CMV, …

Metastasen van carcinomen van ongekende oorsprong

antilichaam primaire origine

CDX2 gastrointestinaal

cytokeratine 7 / cytokeratine 20 TABEL

ER / PR borst, gynaecologisch

GATA-3 borst, blaas

PAX8 nier, schildklier, gynaecologisch

PSA / PSAP prostaat

SATB2 colorectaal, appendix

TTF-1 long, schildklier

WT-1 mesotheel, ovarium

Conner et al. Adv Anat Pathol 2015

Immuunhistochemische kleuringen

Farmacodiagnostiek:

Selectie van kankerpatiënten die in aanmerking komen voor ‘targeted therapy’

• Oestrogeen- en progesteronreceptor (ER/PR) in borsttumoren

→ tamoxifen (Nolvadex)

• HER2Neu prescreening in borst- en maagtumoren

→ trastuzumab (Herceptine)

• EGFR in longtumoren

→ erlotinib (Tarceva) in tweede lijn

• PD-L1 in longtumoren

→ pembrolizumab (Keytruda)

• ALK en ROS1 prescreening in longtumoren

→ crizotinib (Xalkori)

In situ hybridisatie

• Chromogeen (CISH): • Chromogeen gelabelde probes binden op specifieke DNA sequenties van

viraal (humaan papillomavirus, Epstein-Barr virus) DNA

• Aflezen met gewone lichtmicroscoop: positief of negatief

• Aankleuring = aanwezigheid van viraal DNA

• Fluorescent (FISH): • Met rode of groene fluoroforen gelabelde probes binden op specifieke DNA

sequenties

• Aflezen met fluorescentiemicroscoop: signalen en/of signaalpatronen tellen

• Verschillende signaalpatronen en/of cut-offs voor verschillende testen

HPV CISH

FISH

Aantonen van amplificaties of rearrangements van bepaalde genen

normaal

amplificatie

normaal

fusie

normaal

split

vb. Her2Neu amplificatie vb. BCL2 rearrangement vb. ALK rearrangement

FISH

Her2Neu FISH: amplificatie ALK FISH: rearrangement (split)

FISHDiagnostiek van sarcomen en lymfomen:

bevestigen van diagnose gesteld dmv morfologie en immuunhistochemie

vb. MDM2 amplificatie in liposarcomenvb. EWS rearrangement in Ewing sarcomenvb. BCL2 rearrangement in folliculaire lymfomen

Farmacodiagnostiek• HER2Neu amplificatie in borst- of maagtumoren

→ trastuzumab (Herceptine)• ALK rearrangement in longtumoren

→ crizotinib (Xalkori) • ROS1 rearrangement in longtumoren

→ crizotinib (Xalkori)

prescreening met immuunhistochemie

(sneller en goedkoper)

Mutatie-analyse

• Technieken: • PCR-gebaseerde technieken

• Next Generation Sequencing (NGS): multiplex assay (MDG platform)

• DNA isolatie uit paraffinemateriaal

• Macrodissectie voor aanrijking van tumorcelpercentage

Mutatie-analyse

Farmacodiagnostiek: • EGFR mutatie-analyse in longtumoren

→ erlotinib (Tarceva) en gefitinib (Iressa)

• KRAS en NRAS mutatie-analyse in colorectale tumoren

→ GEEN cetuximab (Erbitux)

• BRAF mutatie-analyse in melanomen

→ vemurafinib (Zelboraf)

• c-kit en PDGFRα mutatie-analyse in Gastro-Intestinale Stromale Tumoren (GIST)

→ imatinib (Gleevec)

KWALITEITSZORG

• Accreditatie volgens ISO15189

• Via BELAC op basis van externe audits van het labo

www.apd-uzg.be