Vaccinatie tegen Hepatitis B

ColofonDocumenttitel:

Leerlinghandleiding Practicum “Vaccinatie tegen Hepatitis B”

Auteurs:

Bastiaan Kikkert, biologie docent Veenlanden College Edwin Tijhaar, Leerstoelgroep Celbiologie en Immunologie Wageningen University

Met input van:

Huub Savelkoul, Leerstoelgroep Celbiologie en Immunologie Wageningen UniversityJonna Koper, Kristian Zadelhof en Jeroen Sijbers, Wageningen University Agnes Legierse, EUSO Nederland Deelnemers van het DOT biologie 2013/2014 van Bètasteunpunt Wageningen

Redactie en vormgeving:

Bètasteunpunt Wageningen

©2015. Versie 1.1

Deze module vormt de basis voor het gebruik van de ELISA-kit in de klas. Het auteursrecht op de module berust bij Wageningen University. Wageningen University is derhalve de rechthebbende zoals bedoeld in de hieronder vermelde Creative Commons licentie. De auteurs hebben bij de ontwikkeling van de module gebruik gemaakt van materiaal van derden en daarvoor toestemming verkregen. Bij het achterhalen en voldoen van de rechten op teksten, illustraties, enz. is de grootst mogelijke zorgvuldigheid betracht. Verantwoording van de figuren is in de docentenhandleiding te vinden. Mochten er desondanks personen of instanties zijn die rechten menen te kunnen doen gelden op tekstgedeeltes, illustraties enz. van een module, dan worden zij verzocht contact op te nemen met Wageningen University. De module en ELISA-kit is met zorg samengesteld en getest. Wageningen University en Bètasteunpunt Wageningen aanvaarden geen enkele aansprakelijkheid voor onjuistheden en/of onvolledigheden in de module. Ook aanvaarden Wageningen University en Bètasteunpunt Wageningen geen enkele aansprakelijkheid voor enige schade, voortkomend uit het gebruik van deze module en het gebruik van de ELISA-kit. Het gebruik van de ELISA-kit is op eigen risico.

Dit werk is gelicenseerd onder een Creative Commons Naamsvermelding-NietCommercieel-GelijkDelen 3.0 Nederland licentie.

Introductie

In dit practicum zal je de werking van het immuunsysteem (=afweersysteem) van de mens leren kennen. Je gaat namelijk de ontwikkeling van specifieke antistoffen meten na vaccinatie tegen het Hepatitis B virus.

De test die je straks gaat uitvoeren heet een ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Deze techniek wordt gebruikt voor het kwantificeren van antigenen en antistoffen. De ELISA-techniek is een uitermate gevoelige techniek en heeft zeer veel toepassingen. In de ELISA wordt de binding tussen antigeen en antistof aangetoond met een enzymatische reactie. Tijdens dit practicum ga je een ELISA uitvoeren om aan te tonen dat vaccinatie van een individu tegen het Hepatitis B virus effectief is geweest.

Hepatitis B

Hepatitis B virus (HBV) is een virus van de familie Hepadnaviridae en kan worden overgebracht door bloed-bloedcontact of via seksueel contact met iemand die het virus bij zich draagt. De meest voorkomende symptomen zijn vermoeidheid, misselijkheid, geelzucht en uiteindelijk leverfalen of leverkanker. Het HBV komt met name voor in Afrika, Azië, Oost-Europa en Latijns-Amerika.

Bescherming: Actieve immunisatie

Sinds 1981 is het HBV vaccin in gebruikt. Het vaccin is een recombinant vaccin, geproduceerd in gistcellen die zo veranderd dat ze het “Hepatitis B surface antigeen” (HBsAg) namaken. Het HBsAg is een eiwit op het oppervlakte van het Hepatitis B virus dat door binding aan levercellen zorgt dat het virus deze cellen kan infecteren. Antistoffen tegen HBsAg kunnen HBV infectie blokkeren. Het HBsAg gezuiverd uit de gistcellen vormt daarom de basis van het HBV vaccin. Om bescherming tegen HBV te verkrijgen zijn er ten minste 2 vaccinaties nodig, waarvan de 2de vaccinatie 1 – 2 maanden na de eerste gegeven wordt. In Nederland wordt het vaccin met name gebruikt voor mensen die op reis gaan naar risicolanden en mensen die werken in de gezondheidssector.

De immuunrespons

Wanneer een ziekteverwekker het lichaam binnendringt, zal het afweersysteem hierop reageren door antistoffen te produceren tegen de ziekteverwekker (bijvoorbeeld het Hepatitis B virus). De delen van de ziekteverwekker waartegen het afweersysteem specifieke antistoffen maakt (bijvoorbeeld het HBsAg) worden de antigenen genoemd. Je lichaam volgt een vast patroon wanneer het reageert op een antigeen. De specifieke B cellen die voor de eerste keer aan het antigeen binden reageren hier op door het uitscheiden van specifieke antistoffen van het immunoglobine M (IgM) type. Deze specifieke IgM antistoffen kunnen al binnen een week voor het eerst in je bloed worden aangetoond en bereiken hun hoogste niveau na ca. 2 weken. Door hulp van T cellen aan de antigeen specifieke B cellen gaan deze een ander type antistoffen maken, immunoglobuline G (IgG), dat ongeveer een week na de IgM piek het hoogste niveau bereikt. Wanneer je hierna niet meer in aanraking komt met dit specifieke antigeen, zullen de concentraties specifiek IgM en IgG weer snel dalen (primaire immuunrespons).

Wanneer je voor de tweede keer aan hetzelfde antigeen wordt blootgesteld, zal je afweersysteem sterker en sneller reageren dan de eerste keer (secundaire immuunrespons). Dit komt doordat het afweersysteem een soort “geheugen” heeft: een deel van de specifiek IgG producerende B cellen uit de primaire immuunrespons ontwikkeld zich namelijk tot “geheugen-cellen” die na hernieuwd contact met het antigeen weer antistoffen van het IgG type gaan maken. Er zijn daardoor al veel meer antigeen specifieke B cellen aanwezig dan voor het eerste contact met dit antigeen. Bovendien kunnen deze geheugen-cellen veel sneller antistoffen gaan maken dan B cellen die voor het eerst met het antigeen in aanraking komen. Vaccinatie tegen een bepaalde ziekteverwekker is ook op dit principe gebaseerd. Door iemand eerst te vaccineren met een onschadelijke ziekteverwekker (bijvoorbeeld een geïnactiveerd of verzwakt virus of een gezuiverd viruseiwit, zoals HBsAg) zal je afweersysteem veel sneller en sterker reageren als je daarna met het echte virus in aanraking komt. Hierdoor kan de ziekteverwekker uitgeschakeld worden voordat deze de kans krijgt je ziek te maken.

De ELISA test

We maken in dit practicum gebruik van een ELISAtest. Een voorbeeld van een veel gehanteerde ELISA is het aantonen van specifieke antistoffen in bloed. Jullie gaan met een ELISA de ontwikkeling van HBsAg-specifieke antistoffen na vaccinatie met een HBV vaccin onderzoeken. Men heeft iemand gevaccineerd met het HBV vaccin en op verschillende dagen bloed afgenomen. Het bloed is gecentrifugeerd om de rode en witte bloedcellen te verwijderen en het bovenstaande heldere serum met antistoffen is verzameld. Door de HBsAg-specifieke antistoffen in deze sera met een ELISA te meten ga je bepalen of vaccinatie tegen het Hepatitis B virus effectief is geweest.

De ELISA bestaat uit een aantal stappen (zie afbeelding 1):

Stap 1 (Coaten met antigeen): Een aantal putjes (vaak “welletjes” genoemd) van een microtiterplaat (96 putjes: 8 rijen van 12 putjes) wordt gevuld met antigenen (het HBsAg). De eiwitten hechten zich spontaan zeer sterk aan het plastic van deze platen.

Stap 2 (Blokken): Eventuele overgebleven bindingsplaatsen op het plastic waar nog geen antigeen aan gebonden zit, worden geblokkeerd met een overmaat van een irrelevant eiwit waartegen gewoonlijk geen antistoffen in je bloed zitten (vaak wordt hiervoor boviene (=runder) serum albumine, BSA, gebruikt). Hiermee wordt voorkomen dat de antistoffen uit de sera (stap 3) rechtstreeks aan nog onbezette plaatsen op het plastic binden. Antistoffen zijn immers όόk eiwitten en kunnen dus ook goed hechten aan het plastic. Nadat de eiwitten gehecht zijn worden de putjes gewassen om alle niet gebonden eiwitten te verwijderen.

Stap 3 (Binding antigeen specifieke antistoffen): Vervolgens wordt een verdunning van de te onderzoeken sera in de putjes gedaan zodat de specifieke antistoffen de kans krijgen aan het antigeen (HBsAg) en dus de plaat te binden.

Stap 4 (Secundaire antistoffen): Daarna worden antistoffen specifiek voor humaan IgM of humaan IgG toegevoegd. Deze “secundaire” antistoffen zijn gekoppeld aan een enzym waarmee in de volgende stap binding van de antistoffen aangetoond kan worden. Meestal wordt hier het “Horseradish” Peroxidase (HRP) voor gebruikt. Na enige tijd worden de putjes goed gewassen om alle niet gebonden antistoffen te verwijderen.

Stap 5 (Kleurreactie): Ten slotte wordt het aan de plaat gebonden peroxidase aangetoond door een kleurreagens (substraat) voor dit enzym toe te voegen. Het kleurreagens (ABTS) is vrijwel kleurloos, maar wordt door het peroxidase in een blauwgroen gekleurd reactieproduct omgezet. De kleuring is evenredig met de hoeveelheid peroxidase, dus met de hoeveelheid gebonden antistof tegen humaan IgM of IgG en dus met de hoeveelheid specifiek IgM of IgG tegen het HBsAg in de serummonsters.

Afbeelding 1

kleurloos

blauwgroen

Secundaire antistof

(anti-IgM of anti-IgG met HRP)

Primaire antistof

(serummonsters)

Materialenlijst

Elke werkplek biedt materialen voor twee leerlingen.

Item

Omschrijving

Aantal

☐

Micro-reageerbuisjes (epjes) 1 t/m 12

Sera van 0 t/m 11 weken na vaccinatie

12

☐

Microtiterplaat (96-wells); gecoat; geblocked

1

☐

Epje Anti-IgM-HRP

Anti-IgM-HRP

1

☐

Epje Anti-IgG-HRP

Anti-IgG-HRP

1

☐

Reageerbuis ABTS reagens

ABTS Kleurreagens

1

☐

50 μL fixed-volume pipetten of 20-200 μL micropipetten

1

☐

Doosje gele pipetpuntjes

1

☐

Wasbuffer in bekerglas

PBS / 0.05% Tween-20

1

☐

Plastic wegwerppipetten

2

☐

Keukenpapier

Het protocol

Je ontvangt sera van een met Hepatitis B-vaccin geïmmuniseerd individu. Deze sera zijn verzameld gedurende 11 weken na de start van het vaccinatieschema (zie tabel 2). Direct voorafgaande aan de eerste vaccinatie is ook nog een serummonster (=monster 1) genomen. De tweede vaccinatie werd 6 weken na de eerste immunisatie gegeven.

Tabel 2

Serummonster

Weken na 1e immunisatie

1

0 (1e immunisatie)

2

1

3

2

4

3

5

4

6

5

7

6 (2e immunisatie, booster)

8

7

9

8

10

9

11

10

12

11

Stappenplan ELISA

1. Vul alle welletjes (putjes) van rij A en B van de microtiterplaat met de wasbuffer (LET OP: ALLEEN RIJ A EN B ZIJN MET VIRUSEIWIT GECOAT! Alleen hierop zal de ELISA werken. Let er dus op dat je plaat goed ligt: rij A bovenaan!). Gooi de plaat vervolgens leeg in de wasbak en sla de plaat dan een paar keer droog op een stapel tissues. Voer deze handeling 3 maal uit.

Gebruik hiervoor een wegwerp pipet of giet de wasbuffer rechtstreeks vanuit het bekerglas.

wasbuffer

2. Pipetteer 50 μL serum van monster 1 in welletje A1 en B1, 50 μL serum van monster 2 in welletje A2 en B2, enz. Gebruik hiervoor de fixed-volume pipet of de 20-200 micropipet.

serum

3. Pipetteer direct 50 μL anti-IgG-HRP in elk welletje van rij A en 50 μL anti-IgM-HRP in elke well van rij B (voeg dit toe aan de 50 μL serum die al in de welletjes aanwezig is). Zorg ervoor dat er geen contaminatie optreedt, gebruik dus voor rij A en rij B elk een ander geel puntje.

anti-Ig-HRP

4. Laat gedurende 15 minuten staan bij kamertemperatuur (incuberen). Beantwoord intussen de vragen op de pagina 9.

5. Was de microtiterplaat 4x met de wasbuffer uit het bekerglas zoals bij stap 1.

wasbuffer

6. Pipetteer 100 μL van het ABTS kleurreagens (substraat) in elke well van rij A en rij B en incubeer gedurende 10-20 minuten bij kamertemperatuur. Bekijk de kleurontwikkeling (groen) en maak een foto met je Smartphone na precies 10 en 20 minuten. Ga verder met je vragen als je deze nog niet af hebt en beantwoord de vragen op pagina 10, 11 en 12.

ABTS reagens

Vragen te beantwoorden TIJDENS de incubatie van stap 4 en 6

1) Wat wordt in dit experiment als negatieve controle gebruikt?

2) Maak een schets van de verwachte IgM- en de IgG-respons bij deze vaccinatie. Laat in deze schets zien wanneer je pieken voor IgM en IgG verwacht.

3) Wat wil men immunologisch gezien bereiken met vaccinatie?

Vragen te beantwoorden NA voltooien van de ELISA

4) Beschrijf het verschil tussen de IgM en de IgG respons na de eerste immunisatie (van week 0 t/m week 6) en geef hier een verklaring voor.

5) Beschrijf het verschil tussen de IgM en de IgG respons na de tweede immunisatie (van week 6 t/m week 11) in vergelijking met deze responsen na de eerste immunisatie en geef hier een verklaring voor de gevonden verschillen.

6) De ELISA is eerder uitgevoerd waarna de kleuring (=OD405-waarde) gemeten is. Van de onderstaande grafieken geeft 1 grafiek deze kleuring precies weer.

Kleuring

Kleuring

Weken na 1e immunisatie

Weken na 1e immunisatie

a) Welke lijn (X of Y) in de bovenstaande grafieken geeft de IgG reactie weer en welke de IgM respons? Gebruik hiervoor de resultaten van je eigen experiment en licht je antwoord toe.

b) Welke van de bovenstaande grafieken (A, B, C of D) geeft het best het resultaat van jullie ELISA weer? Beargumenteer je antwoord.

Verdiepingsvragen:

7) Worden bij een vaccinatie antistoffen ingespoten of antigenen?

8) Wat wordt bedoeld met een primaire immuunrespons, wat met een secundaire?

9) Waarom denk je dat het immuunsysteem zoveel verschillende B cellen maakt die allemaal hun eigen unieke (antigeen specifieke) B cel receptor hebben?

10) Het “Human Immunodeficiency Virus” (HIV) dat AIDS veroorzaakt kan heel snel muteren (veranderen). Binnen een geïnfecteerd individu ontstaan daardoor voortdurend nieuwe virusvarianten. Wat betekent dit voor de afweer tegen dit virus? Licht je antwoord toe.

Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum, 20151