Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de

juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze

masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van

derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of

verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de

masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de

masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2015-2016

KWANTIFICERING VAN COLLAGEEN CROSS-LINKS IN URINE ALS MOGELIJKE METHODE

VOOR HET ONTDEKKEN VAN AFWIJKEND COLLAGEEN METABOLIMSE BIJ HET FRIESE

PAARD

Door

Liesbeth HAEGEMAN

Promotoren: Prof. Dr. Richard Ducatelle Literatuurstudie in het

Drs. Veronique Saey kader van de Masterproef

VOORWOORD

Graag zou ik mijn promotor Prof. Dr. Richard Ducatelle en copromotor Drs. Veronique Saey willen

bedanken voor de mogelijkheid om mee te werken aan dit enorm interessante onderwerp. Ook zou ik

Drs. Veronique Saey speciaal willen bedanken voor de vlotte communicatie en de goede begeleiding

bij het schrijven van mijn masterproef.

INHOUDSOPGAVE

Samenvatting ......................................................................................................................................... 1

Inleiding .................................................................................................................................................. 2

1. Aorta ruptuur en aortico-pulmonale fistulatie ............................................................................ 4

2. Andere aandoeningen binne het Friese ras ................................................................................ 5

2.1. Oesophagus dysfunctie ........................................................................................................... 5

2.2. HYdrocephalus ........................................................................................................................ 6

2.3. Dwerggroei .............................................................................................................................. 6

2.4. Laxiteit van de pezen ............................................................................................................... 7

2.5. Retentio secundinarum ............................................................................................................ 7

3. Collageen ........................................................................................................................................ 8

3.1. Betekenis en types .................................................................................................................. 8

3.2. Opbouw en synthese ............................................................................................................... 8

3.3. Collageen crosslinks ................................................................................................................ 9

3.4. De rol van collageen in aorta ruptuur. ................................................................................... 10

3.5. Genetische bindweefsel aandoeningen ................................................................................ 12

3.5.1. Ehler danlos ................................................................................................................. 12

3.5.2. Marfan .......................................................................................................................... 12

4. Bepaling van crosslinks in de urine .......................................................................................... 13

4.1. Beïnvloeding van de uitscheiding van cross-links ................................................................. 13

4.1.1. Leeftijd en geslacht ...................................................................................................... 13

4.1.2. Tijdstip .......................................................................................................................... 14

4.1.3. Activiteit ........................................................................................................................ 14

4.1.4. Aantasting van het gewricht ......................................................................................... 14

4.2. Bewaring van urine voor bepaling van Cross-links ............................................................... 15

4.3. Methodes voor het bepalen van cross-links in de urine ........................................................ 15

4.3.1. HPLC fluorometrie ....................................................................................................... 15

4.3.2. Enzyme-linked immunoassay ...................................................................................... 15

4.3.3. LC-MS/MS ................................................................................................................... 16

Bespreking ........................................................................................................................................... 17

Referenties ........................................................................................................................................... 19

1

SAMENVATTING

Gezien de zeer hoge inteeltgraad binnen het Fries paarden ras, lijdt dit ras onder een frequenter

voorkomen van bepaalde aandoeningen, waaronder aorta ruptuur, dwerggroei, waterhoofd, retentie

van de placenta en megaoesophagus. De ver doorgedreven selectie op de typische uiterlijke

kenmerken en de typische ‘elastische’ gang heeft mogelijks geleid tot het ontstaan van bindweefsel

aandoeningen binnen dit ras. Meerdere recente onderzoeken wijzen in de richting van een mogelijks

systemische collageen aandoening bij de friezen. Een mogelijke afwijking in het aantal of type

collageen cross-links zouden gepaard kunnen gaan met verlies van weefsel sterkte en zou de laxiteit

van de pezen en afwijkingen ter hoogte van de aorta en slokdarm kunnen verklaren.

Om dit te kunnen aantonen zou het nuttig kunnen zijn het aantal pyridinium cross-links

hydroxypryridinoline (=HP=PYD) en pyridinoline (=LP=DPD) te bepalen in de urine van warmbloeden

en Friese paarden. Dit zijn cross-links in collageen die na afbraak van collageen vrijkomen in het

bloed en via de urine uitgescheiden worden. Men verwacht dat er bij het Friese paard een mogelijks

hogere afbraak en dus ook urinaire uitscheiding aanwezig is. De crosslinks kunnen worden gemeten

aan de hand van LC-MS/MS. De urinaire concentratie van de pyridinium cross-links bij Friese paarden

zou dan kunnen worden vergeleken met deze bij warmbloeden.

2

INLEIDING

De precieze oorzaak van meerdere van deze erfelijke aandoeningen binnen het Friese paardenras is

nog niet gekend. Trek-rek testen konden geen significante verschillen aantonen tussen aangetaste,

niet aangetaste Friezen en warmbloeden wat betreft de biomechanische eigenschappen. (Saey et al,

2015). Ook wat betreft het elastine en collageen percentage werd geen significant verschil

teruggevonden (referentie pas hierna plaatsen). Ploeg et al. (unpublished results) konden wel

aantonen dat pezen van Friezen een verhoogde pyrrole crossink concentratie bevatten, hetgeen de

verschillende biomechanische karakteristieken van de pezen van Friese paarden zou kunnen

verklaren in vergelijking met warmbloeden (Gussekloo et al, 2011). Vermoedelijk zou een probleem in

de cross-linking van het collageen aan de basis van meerdere problemen binnen het ras kunnen

liggen. Collageen cross-links spelen een rol in de mechanische sterkte van het collageen. Door een

defect in de cross-linking zouden Friezen mogelijks gepredisponeerd zijn voor een aantal erfelijke

aandoeningen. Mogelijks is er een verhoogde turnover met een verhoogde urinaire excretie van de

crosslinks. Een studie naar de urinaire excretie van hydroxylysylpyridinoline en lysylpyridinoline bij

warmbloeden en Friese paarden met vergelijking zou dit kunnen aantonen.

Deze literatuurstudie geeft een overzicht over de verschillende frequent voorkomende aandoeningen

binnen het Friese paardenras, met nadruk op de aortaruptuur. Ook het nut van onderzoek naar de

collageen cross-links binnen deze problematiek wordt aangehaald. Tot slot worden de bestaande

onderzoeksmethoden van cross-links in de urine weergegeven.

3

DE HISTORIE VAN HET FRIESE PAARD

Het Friese paard is het oudste en enigste inlandse paardenras van Nederland. Het is een Barok paard

dat reeds bekend is sinds de 13de

eeuw. De historie van het Friese paard gaat dus zeer ver terug.

Tijdens de middeleeuwen werd de Fries gekruist met de Spaanse Andalusiër met als doel het paard

fijner, eleganter en sneller te maken. Het werd in die periode frequent ingezet tijdens de krijgstochten.

Tijdens de 17de

eeuw was de Fries populair onder de rijkere boeren en de adel. Het paard werd daar

voornamelijk gebruikt als pronkdier, voor het trekken van de koets en af en toe ook voor het lichtere

werk op de boerderijen.

In de 19de

eeuw was de Fries een uiting van welstand. In die periode waren de draverijen erg in trek.

Het Friese paard werd gebruikt als vermaak in de vorm van kortebaan-draverijen onder het zadel. Er

werd geprobeerd het ras in te kruisen met lichtere paarden om zo een snellere draf te verkrijgen. Het

paard werd hierbij ingezet in de Russische Orlov-fokkerij en in de fokkerij van de Amerikaanse draver.

De invloed van het Friese paard is soms nog terug te zien bij deze dravers.

Aan het einde van de 19de

eeuw en begin van de 20e eeuw kwam het ras meer en meer in

moeilijkheden. De boeren waren niet rijk genoeg meer om de friezen alleen voor het vermaak aan te

houden en het Friese paard was niet sterk genoeg voor het zware werk op het land. Hierdoor

schakelden de boeren over naar de aankoop van zwaardere rassen of werd de Fries gekruist met

deze rassen. Het postuur van de Fries werd zwaarder en kleiner. Door de industrialisering nam de

interesse in het Friese paard verder af. De Fries verloor sterk aan populariteit en stierf bijna uit. In

1879 werd het Koninklijk Friesch paardenstamboek (KFPS) opgericht. In 1913 waren er nog slechts

drie goedgekeurde Friese denkhengsten beschikbaar. Door een actief aankoop en fokbeleid werd het

ras van de ondergang behoed. 1

De populatie Friezen werd dus gesticht met een zeer beperkt aanbod hengsten. Er was een zeer

kritische periode tussen 1900 en 1910 waarbij er een jaarlijkse registratie was van slechts gemiddeld

16 veulens. Na het jaar 1936 groeide de populatie snel uit, met 400 registraties in 1976 en 1000 in

1986.2 In het jaar 2012 waren er meer dan 60000 paarden geregistreerd bij het KFPS en dit in meer

dan 50 landen. Hoewel de huidige populatie uit 100 dekhengsten en 800 fokmerries bestaat is de

volledige populatie Friezen ontstaan uit een beperkt aantal stichters. De Friese populatie wordt

hierdoor gekenmerkt door een zeer hoge inteeltgraad en een lage genetisch variatie.3 Door deze

opvallend hoge inteelt vertonen de Friezen onderling een sterk verwantschap. Dit komt duidelijk tot

uiting in meerdere genetische afwijkingen binnen dit ras zoals de aortaruptuur, dwerggroei, laxiteit van

de pezen, retentio secundinarum en hydrocephalus die een opvallend hoge frequentie kennen in

vergelijking met andere rassen.

4

1. AORTA RUPTUUR EN AORTICO-PULMONALE FISTULATIE

Aorta rupturen zijn bij zoogdieren zeer zeldzaam. Bij de mens echter is het een levensbedreigende

aandoening die van multifactoriële aard is. Predisponerende factoren zijn inflammatie en genetische

aanleg. Bij de mens, scheur is voornamelijk gelokaliseerd ter hoogte van de aorta abdominalis en is

vaak geassocieerd met atherosclerose3. In een klein deel gevallen is er een scheur ter hoogte van de

thoracale aorta (23%)4.

Bij niet-Friese paarden komt de aandoening ook zelden voor en is deze vermoedelijk erfelijk5. De

scheur bevindt zich in de meeste gevallen aan de basis van het hart, ter hoogte van de sinussen van

Valsalva6. Bij het niet-Friese paard treedt de aorta ruptuur vooral op bij dekhengsten na het dekken of

soms ook na zware arbeid7. Bij deze paarden leidt dit doorgaans tot acute sterfte.

8 De etiologie

hiervan is nog niet goed gekend.

Bij het Friese paard zien we echter een ander patroon. De aandoening komt relatief frequent voor,

namelijk bij 2% van de populatie4. De ruptuur is typisch gelokaliseerd ter hoogte van de thoracale

aorta. Het is een dwarse ruptuur die zich juist proximaal (1-2 cm) van het litteken van de voormalige

ductus arteriosus van Botalli bevindt.9 (figuur1) De reden waarom de aortaruptuur bij friezen zich

specifiek op deze plaats bevindt is nog niet goed gekend. Gezien de hoge inteeltgraad en de

consistente locatie van de ruptuur, wordt er aangenomen dat deze aandoening erfelijk is bij de Fries.

Figuur 1: ruptuur in de aorta bij een Fries paard. Foto: Koen Chiers.

Bij het Friese ras kunnen drie klinische vormen onderscheiden worden: de acute, de subacute en de

chronische vorm. Bij de acute vorm zien we dat de paarden plots sterven en dit gebeurt meestal

tijdens activiteit. Hierbij vertonen de paarden geen voorafgaande symptomen. Bij de subacute vorm

leidt de scheur tot acute bloeding met vorming van een hemopericard met tekenen van acuut hartfalen

waarna de dood snel intreedt. Uniek bij het Friese paard is de chronische vorm. Hierbij blijven de

paarden nog weken tot zelfs maanden na de scheur overleven. De chronische vorm vertegenwoordigt

5

een groot deel van de gevallen van aortarupturen. In een onderzoek van ploeg et al. (2012) werd de

anamnese van 24 Friezen met aorta ruptuur onderzocht. Hieruit is gebleken dat meer dan 1/3 van de

gevallen typische symptomen vertoonden ongeveer één tot twee weken tot zelf maanden voor het

hartfalen en sterfte. Deze symptomen bestaan voornamelijk uit koliek zonder abnormale rectale

bevindingen, anorexie, herhaaldelijk lateraal liggen, hoesten als gevolg van pulmonair oedeem, daling

van het prestatie vermogen, depressie en af en toe epistaxis.7 Na autopsie werden bij deze paarden

typisch para-aorticale bloedingen en aortopulmonaire fistels teruggevonden.9 bij aortopulmonale fistel

is naast de thoracale aorta ook de truncus pulmonalis gescheurd. De beide bloedvaten staan met

mekaar in verbinding door middel van een pseudoaneurysme dat typisch gevormd wordt. Door de

hoge druk in de aorta wordt het bloed uit de aorta in de truncus pulmonalis geduwd. Dit leidt tot een

links-recht shunt. Deze situatie kan dus gedurende enige tijd stabiel blijven doordat de paarden niet

meteen intrathoracaal verbloeden waarschijnlijk doordat de tunica adventitia van da aorta de bloeding

gedeeltelijk tegenhoudt, maar zal uiteindelijk steeds leiden tot ernstig hartfalen met sterfte. Dit

verklaart waarom deze paarden niet acuut sterven na de aortaruptuur.7

2. ANDERE AANDOENINGEN BINNE HET FRIESE RAS

Bepaalde aandoening komen opvallend frequent voor bij het Friese ras. Doordat de populatie Friezen

ontstaan is uit een beperkt aantal stichters wordt de populatie gekenmerkt door een lage genetische

variabiliteit. Alle Friezen zijn steeds op één of andere manier genetisch verwant met elkaar.2 Dit zou

kunnen verklaren waarom bepaalde aandoeningen zo talrijk zijn binnen het Friese ras in vergelijking

met warmbloeden.

2.1. OESOPHAGUS DYSFUNCTIE

Megaoesophagus is een aandoening die net zoals de aorta ruptuur een duidelijk frequenter

voorkomen heeft bij het Friese paard dan bij andere paardenrassen. De aandoening bestaat uit

een chronische dilatatie van de slokdarm. Deze dilatatie kan veroorzaakt worden door een

dysfunctie van de oesophagus of door een mechanische obstructie. Bij warmbloedpaarden wordt

de megaoesophagus voornamelijk gezien na een langdurige obstructie. Hierbij zien we een

dilatatie net craniaal van de obstructie.10

Bij het Friese paard is de obstructie van de slokdarm

eerder een gevolg van de dilatatie dan een oorzaak. Klinische symptomen bij aangetaste

paarden bestaan uit recidiverende slokdarm obstructie, hoesten, bilaterale neusvloei, ptyalisme,

dysfagie, regurgitatie, zwelling van de slokdarm, anorexie en lethargie.11

Een studie van Ploeg et

al. uit 2014 toonde aan dat niet alle Friese paarden die een klinische dysfunctie van de

oesophagus vertoonden, ook een macroscopische megaoesophagus hadden. Deze paarden

waren tussen de 14 dagen en 1 jaar oud. Bij alle klinische gevallen werd er wel een verhoogde

collageen afzetting gevonden rond de spiervezels van de tunica muscularis en in de lamina

propria, en dit op plaatsen gelokaliseerd caudaal en craniaal van de dilatatie. Het collageen bij

deze paarden was ook morfologisch afwijkend: het was minder gecondenseerd dan bij niet

6

aangetaste paarden en de vezels waren kleiner en georganiseerd in klompen.12

Deze afwijkingen

werden ook gevonden bij veulens, waardoor er vermoed wordt dat de aandoening een

genetische basis heeft. Doordat de meeste jonge paarden nog geen macroscopische afwijkingen

vertonen maar wel reeds afwijkend collageen hebben zou de afwijking traag progressief zijn en

mogelijks veroorzaakt worden door een genetische afwijking in het collageen.12

2.2. HYDROCEPHALUS

Hydrocephalus is een zeldzame congenitale aandoening die gezien wordt bij verschillende

diersoorten zoals de muis, de rat, de hond en het paard, en ook bij de mens. De prevalentie

wordt geschat op 0.06%.13

Bij de Fries echter zien we een hoger voorkomen dan bij andere

paardenrassen en diersoorten. Vermoedelijk is deze hoge prevalentie te wijten aan de hoge

inteeltgraad bij het Friese ras. Hydrocephalus wordt gekenmerkt door een uitzetting van de

ventrikels in de hersenen, waarbij ook de arachnoidale ruimte betrokken kan zijn. Deze uitzetting

kan veroorzaakt worden door een obstructie van de afvoer van het cerebrospinaalvocht, een

verhoogde productie door de choroidale plexus of door een gewijzigde absorptie ter hoogte van

de arachnoidale villi in de veneuze sinussen van de hersenen. Bij de Fries lijkt de oorzaak te

liggen bij een stenose van het foramen jugulare aan de basis van de schedel, en is waarschijnlijk

veroorzaakt door een genetische mutatie. Dit defect in het foramen jugulare is gelinkt aan

chondrodysplasie en werd ook reeds gezien bij Friese veulens met dwerggroei. Een gelijkaardige

pathogenese werd gezien bij een hondenpopulatie met een beperkte genetische pool.13

2.3. DWERGGROEI

Dwerggroei is een aandoening die amper gezien wordt bij paarden. Het is enkel beschreven bij

miniatuur paarden, maar is sinds meerdere jaren ook gekend binnen het Friese paardenras.

(Backt et al. 2008) Ook deze aandoening zou het gevolg zijn van de hoge graad van inteelt en is

erfelijk. Dwerggroei wordt gekenmerkt door een groeiachterstand van de groeiplaten. Bij

aangetaste veulens zijn de voor- en achterbenen 25% korter dan normale dieren en hebben 50%

minder lichaamsgewicht. De aandoening tast ook de ribben aan. Na de geboorte groeien deze

dieren trager dan normaal. De groei is disproportioneel: het hoofd en de rug groeien sneller dan

de ledematen en de ribben. Dit leidt tot een relatief gezien abnormaal groot hoofd, een te lange

rug en een bredere borstkast met een versmalling ter hoogt van de costochondrale junctie.

Doordat de ledematen relatief gezien te kort zijn tegenover de pezen zien we een hypertensie

van de kogels. De aandoening wordt veroorzaakt door een metaplasie van de metafyse in de

groeiplaat ter hoogte van de distale metacarpus en metatarsus.14

7

2.4. LAXITEIT VAN DE PEZEN

Onderzoek W.S.Gussekloo et al. (2011) toonde aan dat de pezen van Friese paarden significant

langer waren in vergelijking met andere rassen (pony’s). Hierdoor wordt een lichte hyperflexie

van de kogel veroorzaakt. De pezen bij Friese paarden zijn ook meer elastisch en gaan verder

uitrekken bij rektesten. Dit defect is algemeen aanwezig in de Friese populatie maar is meer

uitgesproken bij Friezen met dwerggroei.15

Door de grotere laxiteit en de hyperextensie van de

kogel is het Friese paard gevoeliger aan peesblessures en dit voornamelijk in het ligamentum

palmare en ter hoogte van de oppervlakkige buiger.

De sterkte en laxiteit van pezen wordt bepaald door de oriëntatie van de collageen vezels en door

de mate van crosslinking.16

Vooral de pyrrole crosslinks hebben een grote invloed op de sterkte

van collageen, alhoewel deze in veel lagere concentratie aanwezig zijn dan de pyridinium

crosslinks hydroxypyridinoline (HP) en pyridinoline (LP). Dit kan verklaard worden doordat pyrrole

drie fibrillen kan crosslinken, en hydroxypyridinoline en pyridinoline maar in staat zijn om twee

fibrillen te cross-linken. Bij de fries wordt een verhoogde pyrrole concentratie terug gevonden ter

hoogte van de pezen.17

Dit staat in contrast met de hogere flexibiliteit van de pezen. Vermoedelijk

zou een defect in de oriëntatie van de pyrrole crosslinks aanwezig zijn waardoor de mechanische

sterkte ervan zou afnemen.

2.5. RETENTIO SECUNDINARUM

De partus van de merrie bestaat uit drie fasen: in eerste fase gaat de activiteit van het

myometrium toenemen, daarna zal de vrucht uitgedreven worden en tot slot worden de foetale

membranen uitgescheiden. Retentio secundinarum, ook wel het ophouden van de placenta

genoemd, wordt gedefinieerd als het niet uitscheiden van de foetale membranen (placenta)

binnen de drie uur na de geboorte van het veulen.18

Deze aandoening is goed gekend in de

paardenwereld (2-10%), maar heeft een uitzonderlijk hoog voorkomen bij de Fries (35%).19

De

uitscheiding van de placenta zou in gang gezet worden door het afscheuren van de navelstreng

waardoor er een collaps ontstaat van de foetale placenta met inkrimping van de chorionale villi.

De uterine contracties na de partus, die van de top van de baarmoederhoorn richting de cervix

lopen, zorgen voor een verkleining van de baarmoeder en een daling van het bloedvolume in de

baarmoeder. Dit zorgt voor een loslating van de placenta. De allantochorion inverteert en wordt

naar buiten geduwd. Een verstoring van dit mechanisme zou kunnen leiden tot placenta retentie,

maar de precieze etiologie van deze aandoening is nog niet gekend.18

8

3. COLLAGEEN

3.1. BETEKENIS EN TYPES

Collageen is het meest voorkomende proteïne bij zoogdieren. Het zorgt voor stabiliteit, sterkte en

stevigheid van verschillende weefsels gaande van pezen en ligamenten tot huid, cornea,

bloedvaten, kraakbeen bot en dentine. Het is terug te vinden in elk bindweefsel.21

Reeds 28 types collageen werden terug gevonden bij de vertebraten. Het collageen kan

opgedeeld worden in fibrillair en non-fibrillair collageen. Binnen het fibrillair collageen kunnen

verschillende types onderscheiden worden. Collageen type 1 is het meest voorkomende proteïne.

Het bevindt zich in nagenoeg elk extracellulair weefsel met een mechanische functie. In pezen en

ligamenten draagt dit collageen de kracht over van de spier op het bot, en slaat elastische

energie op. Collageen type 1 is ook aanwezig in de meeste organische matrices van bot en

dentine. Het is voornamelijk dit type collageen dat deze weefsels zo stevig maakt. Het is ook

aanwezig in de huid en bloedvaten, en bevindt zich als matrix rond de contractiele spiervezels in

de spier. Collageen type 2 is zeer weefselspecifiek en bevindt zich voornamelijk in het

gewrichtskraakbeen. De collageentypes hebben elk een licht verschillende structuur. Collageen

type 2 bestaat uit dikkere collageenvezels dan type 1.20

Collageen type 3 bevindt zich in relatief

elastische weefsels zoals de embryonale huid, de long en bloedvaten. Het type 5 collageen wordt

in kleine hoeveelheden terug gevonden in associatie met collageen type 1, en dit voornamelijk ter

hoogte van de cornea. Tot slot is het collageen type 9 terug gevonden in associatie met type 2 in

kraakbeen.22

De fibrillaire collageen molecule bestaat steeds uit drie alfa-ketens. Deze drie

ketens kunnen ofwel uit drie dezelfde ketens bestaan (homotrimerisch) zoals in type 2 en 3

collageen, of ze kunnen uit drie verschillende ketens bestaan (heterotrimerisch).

Het non-fibrillair collageen wordt ook opgedeeld in verschillende subtypes en komt vooral voor in

de basaalmembranen, ter hoogte van verschillende weefsels, of in associatie met andere types.21

3.2. OPBOUW EN SYNTHESE

Collageen wordt gekenmerkt door een typische hiërarchische structuur. Op het kleinste niveau

bestaat het uit drie linksdraaiende polypetide ketens die gevormd worden ter hoogte van het

endoplasmatisch reticulum (RER) van collageen produceerde cellen. Deze polypeptideketens

gaan op hun beurt samen een rechtsdraaiende tripple helix vormen dat het procollageen

genoemd wordt (figuur 1). De drie ketens worden samen gehouden door waterstofbindingen. Er

zijn telkens 2 waterstofbindingen per triplet.20

Kenmerkend aan deze polypeptiden in collageen is

dat ze bestaan uit een herhaling van 3 aminozuren waarvan de derde steeds glycine is

(XaaYaaGly). De aminozuren op positie Xaa en Yaa zijn voornamelijk proline (Pro) en

hydroxiproline (Hyp), maar kunnen in principe elk aminozuur voorstellen. De triplet ProHypGly is

het meest voorkomende triplet in collageen (10.5%).23

9

Figuur 2: structuur en opbouw collageen fibril.

Ter hoogte van het RER gebeurt er een hydroxylatie van lysine en proline aminozuren. Verder

vindt er glycosylatie van specifiek hydroxylysine plaats.

Het procollageen wordt verder vervoerd via het Golgi apparaat waar het verpakt wordt in vesikels

en verder getransporteerd wordt naar de extracellulaire ruimte. Ter hoogte van de extracellulaire

ruimte wordt het procollageen enzymatisch ontdaan van zijn niet helicale amino en carboxyl

uiteinden door middel van peptidasen om zo een collageenmolecule te vormen. Na het afsplitsen

van deze uiteinden kunnen de collageenmoleculen spontaan met elkaar interageren met de

vorming van microfibrillen. Een microfibril bestaat steeds uit 5 collageenmoleculen. Ter hoogte

van de collageenmolecule zorgt het lysyl oxidase voor de vorming van crosslinks tussen de

verschillende microfibrillen met vorming van collageen vezels.22

Binnen de collageen fibril kunnen 2 types onderscheiden worden namelijk het T-type en het C-

type. Het T-type bestaat uit grote heterogene fibrillen die grote trekkrachten kunnen weerstaan.

Het is voornamelijk terug te vinden in peesweefsel, ligamenten en botweefsel. Het C-type bestaat

uit kleinere homogene fibrillen georganiseerd in een helische structuur en is terug te vinden in

meer elastische weefsels zoals bloedvaten, huid en zenuwweefsel.24

Door de hiërarchische structuur kan collageen op vele niveaus modificaties ondergaan waardoor

het verschillende eigenschappen kan hebben. Het collageen ter hoogte van de cornea is

bijvoorbeeld doorzichtig, terwijl het collageen ter hoogte van de pezen een grote weerstand kent

tegen mechanische krachten.21

3.3. COLLAGEEN CROSSLINKS

Collageen cross-links zijn noodzakelijk voor de sterkte en de stabiliteit van het collageen. Ze

spelen ook een grote rol in het metabolisme. Zo nemen ze onder andere deel aan het

verouderingsproces van collageen. De crosslinks worden gevormd tussen de afzonderlijke

fibrillen. Dit neemt plaats ter hoogte van de extracellulaire ruimte. De crosslinking gebeurt

enzymatisch door middel van het lysyl oxidase. Het is het enige gekende enzyme betrokken bij

de cross-linking, met als cofactor koper.25

Het is voornamelijk het lysyl oxidase dat instaat voor de

10

kwaliteit van de cross-link. De cross-links worden gevormd aan het uiteinde van de collageen

moleculen ter hoogte van de telopetptide regio’s. Ter hoogte van deze regio zorgt het lysyl

oxidase voor de omzetting van lysine en hydroxylysine in aldehyden door middel van

deaminering. De lysine aldehydes en hydroxylysine aldehydes gaan spontaan reageren met

lysine of hydroxylysine residuen in de helicale regio’s van aangrenzende collageenmoleculen. Dit

leidt tot de vorming van immature bivalente cross-links. Deze immature cross-links ondergaan

verder spontane, niet-enzymatische reacties met vorming van mature trivalente crosslinks,

namelijk pyridinoline crosslinks (lysylpyridinoline en hydroxylysylpyridinoline) (fig 1) en pyrrole

crosslinks (lysyl-pyrrole en hydroxylysyl-pyrrole).17

Figuur 3: chemische structuur hydroxylysylpyridinoline (HP) en lysylpiridinoline (LP) referentie artikel 25

HP en LP vertegenwoordigen het grootste aantal crosslinks in collageen. Pyrrole cross-links zijn

minder uitgesproken aanwezig maar hebben wel een groter effect op de sterkte van het

collageen.17

De mate van cross-linking is voornamelijk afhankelijk van het type weefsel.26

3.4. DE ROL VAN COLLAGEEN IN AORTA RUPTUUR.

De wand van de aorta is opgebouwd uit verschillende lagen. De binnenste laag, de tunica intima

genaamd, bestaat uit endotheliale cellen en een basaalmembraan met daaronder een dunne laag

bindweefsel die voornamelijk uit collageen bestaat. De middelste laag is de tunica media en is de

voornaamste laag van de aortawand. Ze bestaat uit glad spierweefsel ondersteund door

collageen en elastine vezels. De buitenste wand, de tunica externa of tunica adventitia genaamd,

bestaat in hoofdzaak uit dikke bundels collagene vezels en elastine vezels. Tussen deze vezels

dringen bloedvaten naar binnen welke zorgen voor de voeding van de buitenste lagen.27

De hoofd functie van de wand is het opvangen van de pulserende bloedstroom veroorzaakt door

de hoge druk in het hart, in functie van de systemische circulatie. Elastine vangt voornamelijk bij

11

lage druk de pulsaties op. Bij hoge druk zal het collageen er voor zorgen dat de wand niet te sterk

zal uitrekken om zo scheuren te voorkomen.28

Aorta ruptuur is een frequent voorkomende aandoening bij Friese paarden.7 Mogelijks ligt een

genetische afwijking van het collageen metabolimse in de aortawand aan de basis van dit

probleem. Door afwijkende cross-links verliest het collageen een deel van zijn functie waardoor

het spontaan kan scheuren. Bij de mens is reeds gekend dat het collageen in de aorta wand

voornamelijk uit collageen type 1 en type 3 bestaat.29

Bij een studie naar de concentratie van pyridinium cross-links in verschillende boviene weefsels

is gebleken dat de aorta een hoge concentratie hydroxypyridinoline bevat in zowel collageen type

1 en collageen type 3.26

De rekbaarheid van de wand wordt bepaald door het collageen type 3.

Bij een afname van de rekbaarheid zal dit sneller leiden tot aneurysme van de wand en ruptuur.29

Figuur 4: tabel concentratie cross-links in verschillende bovine weefsels. referentie artikel 29

In een muis model werd reeds de rol van cross links aangetoond bij aorta rupturen.30

In een

studie van A. Daugherty en L.A. Cassis (2004) werden muizen geproduceerd met een genetische

mutatie waardoor er een abnormale koper absorptie was. Koper is een belangrijke cofactor van

het lyslyl oxidase, het enzym dat zorgt voor de vorming van crosslinks. Hierdoor werd de

collageen en elastine crosslinking verstoord. Bij deze muizen werden aorta aneurysmen

aangetoond met een hoge prevalentie in rupturen, en dit ter hoogte van de thoracale aorta. Een

andere groep muizen werd ontwikkeld met een genetische deficiëntie van het lysyl oxidase. Deze

muizen waren niet leefbaar door aorta rupturen in de thoracale aorta, die reeds bij de foetale

stadia aanwezig waren.

12

3.5. GENETISCHE BINDWEEFSEL AANDOENINGEN

3.5.1. Ehler danlos

Het Ehler danlos sydroom is een erfelijke aandoening die voorkomt bij zowel de mens als

bij verschillende dierensoorten. Het werd eerst beschreven bij het rund, later ook bij het

schaap, de kat en de hond. Het wordt gekenmerkt door verschillende gemeenschappelijke

symptomen zoals gewrichtslaxiteit, hyperuitrekbaarheid van de huid en broze huid en

wordt veroorzaakt door een abnormale structuur van het collageen.31

Bij de mens wordt de ziekte geclassificeerd in verschillende subtypes. Het Ehlers-Danlos

syndroom type IV, ook wel het vasculaire type genoemd, wordt gekenmerkt door het

gemakkelijk ontwikkelen van blauwe plekken, een dunne huid met zichtbare venen, ruptuur

van arteriën, uterus of ingewanden.32

Bij dit subtype wordt gezien dat de fibroblasten een

afwijkend collageen type 3 produceren. Collageen type 3 wordt in grote hoeveelheden

terug gevonden in de bloedvat wand waardoor deze broos is. De typische symptomen van

Ehler-Danlos zoals hyperlaxiteit van de pezen en rekbaarheid van de huid, worden bij dit

type niet gezien. 32

Dermatosparaxie wordt bij dieren vaak gelinkt aan het Ehler-Danlos sydroom type VIIc bij

de mens. De aandoening werd reeds vastgesteld bij het rund, het schaap, de kat en de

hond. Het is een erfelijke aangeboren afwijking van het bindweefsel dat veroorzaakt wordt

door een defect in het type 1 procollageen N-proteinase. Dit enzym zorgt normaal gezien

voor de afsplitsing van de amino-uiteinden van het procollgeen van het collageen type 1.

De afsplitsing van de uiteinden is noodzakelijk voor de vorming van de microfibrillen. De

procollageen moleculen waarvan de uiteinden niet afgesplitst werden gaan zich opstapelen

ter hoogte van de weefsels met vorming van afwijkende fibrillen. Hierdoor hebben de

weefsels een afwijkende weerstand tegenover mechanische stress. Dieren met dit defect

vertonen een broze huid, hypermobiele gewrichten en sterven meestal vroegtijdig ten

gevolge van sepsis veroorzaakt door avulsie van delen van de huid.33

3.5.2. Marfan

Het Marfan’s syndroom is een erfelijke aandoening van het bindweefsel dat vooral het

cardiovasculair, oftalmologisch en musculoskeletaal systeem aantast. Het wordt

gekenmerkt door progressieve dilatatie van de ascenderende aorta, een dorsale kanteling

van de lens en meerdere skeletale afwijkingen zoals arachnodactylie, scoliose en

gewrichtslaxiteit. Sterfte wordt veroorzaakt door hartfalen of door het optreden van een

aortaruptuur ter hoogte van de ascenderende aorta. Bij de mens wordt de ziekte

veroorzaakt door een afwijkend metabolisme van fibrilline, een component van de

microfibrillen in elastine. Bij het rund werd een verlaagde expressie gevonden van het

fibrilline ter hoogte van de dermale fibroblasten, de gladde spiercellen van de aortawand

en de extracellulaire matrix. Door dit defect is er een verminderde functie van het

elastine.34

13

4. BEPALING VAN CROSSLINKS IN DE URINE

4.1. BEÏNVLOEDING VAN DE UITSCHEIDING VAN CROSS-LINKS

Collageen crosslinks worden uitgescheiden in de urine wanneer er afbraak of turnover van

collageen aanwezig is. Bij volwassen dieren vinden we turnover vooral terug ter hoogte van

botweefsel of op plaatsen met schade waar heling aan de gang is. Ter hoogte van andere

weefsels zoals de huid en pezen is er een trage turnover die bijna onbestaand is.22

Het grootste

aandeel van de crosslinks in de urine zijn in normale omstandigheden dus afkomstig uit het bot.

Studies hebben echter aangetoond dat bij bepaalde fysiologische en pathologische

omstandigheden een groot deel van de fractie LP en HP afkomstig is uit andere weefsels.35

Dit

zou ook het geval kunnen zijn bij de aorta ruptuur bij Friezen.

LP is voor het grootste gedeelte terug te vinden in het botweefsel en dentine, maar in andere

weefsels zoals bijvoorbeeld vasculair weefsel bevat het collageen een zelfde concentratie aan LP

(in moles LP/ mole collageen) als in bot. Ook in de cornea en de huid is LP vertegenwoordigd.26,35

HP is voornamelijk terug te vinden in botweefsel en kraakbeen, maar wordt ook in aanzienlijke

hoeveelheden terug gevonden in andere weefsels zoals ligamenten, pezen, longe, darmen en de

aorta, maar is niet terug te vinden ter hoogte van de huid en de cornea. HP is vooral terug te

vinden in collageen types 1,2,3 en 5.26

De urinaire excretie van HP en LP wordt beïnvloed door de leeftijd, het tijdstip van de dag en de

activiteit. Ze verhoogt ook bij sommige aandoeningen zoals osteoartritis en reumatoïde artritis.36

4.1.1. Leeftijd en geslacht

Studies bij de mens hebben aangetoond dat bij een stijgende leeftijd het collageen in de

beenderen afneemt, terwijl de mineralisatie toeneemt. Er is echter geen verschil in urinaire

concentratie van HP en LP tussen de verschillende leeftijden bij volwassen (18 tot 96

jaar).37

Er werd wel een significant verschil aangetoond in de urinaire concentraties van

zowel HP als LP tussen kinderen (2 tot 15 jaar) en volwassenen (21 tot 70 jaar).38

Een

studie bij paarden (Black at al.) toonde ook aan dat er een significant verhoogde

uitscheiding is van LP tijdens de groeiperiode en puberteit in vergelijking met volwassen

paarden.39

Bij veulens (4 tot 5 maand) was de concentratie van LP 10-14 keer hoger dan

bij volwassen dieren (12 tot 21 jaar). De groei bij jonge dieren wordt gekenmerkt door een

hoge snelheid van bot turnover waardoor er ook een hogere urinaire uitscheiding aanwezig

is. Er was geen significant verschil tussen geslachten.37

14

4.1.2. Tijdstip

Pyridinoline concentraties in de urine variëren bij de mens niet significant in functie van het

dag en nacht ritme of het seizoen.39

Er werd wel een diurnaal ritme aangetoond in de

uitscheiding van HP en LP. Bij de mens zijn er hogere concentraties aanwezig in de

ochtend in vergelijking met de middag en avond.40

De urinaire concentratie bij kinderen

volgt een zelfde tendens41

, terwijl er bij baby’s tussen de 4 en 12 maanden oud geen

duidelijk patroon aanwezig is.42

Bij adulte paarden werden er piekconcentraties tussen

02u00 en 08u00 aangetoond. De laagste concentraties zijn aanwezig tussen 11u00 en

17u00, en 20u00 en 02u00. (A. Black et al. 1997) Bij veulens is er geen significant verschil

aangetoond gedurende de dag en nacht.39

4.1.3. Activiteit

Verschillende studies bij mensen tonen aan dat de uitscheiding van HP en LP significant

verhoogt onder invloed van fysieke activiteit. Zo werd een duidelijke toename in

uitscheiding gevonden bij een onderzoek naar HP en LP in de urine bij lopers. Bij

onderzoek naar de uitscheiding bij andere sport disciplines (turners, gewichtheffen,

wandelen) werden verschillende resultaten bekomen, met zowel dalingen als geen

veranering.43

Bij paarden werd een gelijkaardig onderzoek gedaan naar de uitscheiding

van het pyridinoline cross-linked telopetide domein van type 1 collageen. Bij de getrainde

paarden (drie keer per week in de stapmolen) werd eerst een stijging gevonden, waarna de

uitscheiding na ongeveer 4 maand terug daalde.44

Doordat de leeftijd van de onderzochte

paarden echter 2 jaar was, zou hier een interferentie aanwezig kunnen zijn met de leeftijd

gerelateerde daling. Verder onderzoek is nodig om het effect van training aan te tonen.

4.1.4. Aantasting van het gewricht

Osteoartritis is een veel voorkomende aandoening bij oudere paarden, maar kan elke

leeftijd aantasten. De aandoening kan primair ontstaan bij afwijkend kraakbeen, of

secundair door ontsteking van een gewricht of bij overbelasting. Bij osteoartritis wordt het

kraakbeen aangetast waardoor er meer druk op het onderliggende bot komt te staan.

Hierdoor ontstaan veranderingen in het onderliggend botweefsel en de omgevende weke

delen. Bij aangetaste dieren is de urinaire uitscheiding van HP en LP verhoogd. De mate

van stijging is afhankelijk van de graad van aantasting van het botweefsel en het

kraakbeenweefsel.45

Ook bij de mens werd aangetoond dat patiënten met osteoartritis en

reumatoïde artritis een verhoogde uitscheiding hebben.46

15

4.2. BEWARING VAN URINE VOOR BEPALING VAN CROSS-LINKS

HP en LP kunnen langer dan een jaar bewaard worden bij een temperatuur van -20°C. Er werd

ook geen afbraak gezien gedurende 9 maanden bij bewaring tussen de 20°C en -70°C. Minder

dan 5 vries-dooicycli zullen de concentraties aan HP en LP niet beïnvloeden.47

HP en LP opgelost in water zijn zeer gevoelig aan UV-licht. De gevoeligheid aan UV is echter

afhankelijk van de pH van de oplossing. De crosslinks zijn zo bijvoorbeeld in urine (licht alkalisch

bij het paard) veel minder gevoelig aan UV-licht. Ook de vorm van de cross-links is bepalend voor

de gevoeligheid. De vrije vorm zal sneller afgebroken worden door UV dan de aan eiwit

gebonden vorm. Gehydrolyseerde urine zal dus gevoeliger zijn. Kunstlicht heeft geen invloed op

de degradatie van cross-links in urine.47

4.3. METHODES VOOR HET BEPALEN VAN CROSS-LINKS IN DE URINE

4.3.1. HPLC fluorometrie

HPLC fluometrie is een van de oudere technieken die beschreven werd voor het meten

van de cross-links in urine. De aanwezige stoffen in de urine worden hierbij gescheiden

door middel van reversed-phase HPLC. Na de scheiding kunnen HP en LP gedetecteerd

worden door middel van een fluorometer, aangezien ze auto-fluorescent zijn. De techniek

heeft een redelijke sensitiviteit en selectiviteit.

In de urine zijn HP en LP onder verschillende vormen aanwezig 40% bevindt zich in de vrij

vorm en 60% is gebonden aan ewitten.48

De urine van paarden moet eerst gehydrolyseerd

worden vooraleer het kan geïnjecteerd worden in de HPLC kolom aangezien vooral de vrije

fractie aan HP en LP gedetecteerd wordt. Hydrolyse gebeurt door middel van HCl en zorgt

ervoor dat de gebonden cross-links loslaten van de eiwitten. Verder moet de urine ook

opgezuiverd worden voor analyse. HP en LP worden hierbij geëlueerd door middel van

water en acetonitrile. Na centrifuge zijn HP en LP aanwezig in de onderstaande fractie.

Hierna wordt de urine geïnjecteerd in een CF1 cellulose kolom. Deze kolom zorgt voor het

scheiden van de stoffen waarna deze één voor één gedetecteerd kunnen worden door

fluorometrie.48

De HPLC fluorometrie is een goede techniek voor het meten van HP en LP in de urine. Het

grote nadeel is dat deze techniek zeer tijdrovend is doordat de urine niet zomaar

geïnjecteerd kan worden en er ook een voorbereiding nodig is voor het prepareren van de

cellulose kolommen.

4.3.2. Enzyme-linked immunoassay

De ELISA methode is gebaseerd op de binding van antistoffen op HP en LP. Er wordt

gebruik gemaakt van polyklonale antipyridinoline antistoffen die gevormd werden in muizen

door inspuiting van pyridinolines. Hierbij wordt eerst urine samen gevoegd met verdund

16

antiserum. Na incubatie wordt hierna Anti-ratten IgG geproduceerd in geiten toegevoegd

die gelabeld is door middel van een enzym (alkaline fosfatase). Als laatste stap wordt een

stof toegevoegd die een kleurreactie ondergaat met het enzym. Hiervan wordt de optische

densiteit gemeten. Er werd een hoge correlatie vastgesteld tussen de HPLC fluorometrie

en de ELISA. Het voordeel van de ELISA is dat de methode zeer gemakkelijk uit te voeren

valt en er geen hydrolyse stap nodig is. Er kunnen tevens veel stalen tegelijk kunnen

bemonsterd worden. De ELISA techniek heeft echter een lagere sensitiviteit dan de HPLC

fluorometrie welke te laag is voor een goede analyse van de stalen.48

4.3.3. LC-MS/MS

Voor de bepaling van de concentratie crosslinks in de urine kan ook gebruik gemaakt

worden van LC-MS/MS. Dit is een techniek beschreven door Tang J. et al. (2014). Hierbij

wordt 0,5 ml urine samen gevoegd met HCl, I.S. en een cellulosesuspensie. In het

chromatografie toestel worden de verschillende stoffen gescheiden op basis van hun

retentietijd. LC zorgt voor het scheiden van de stoffen waarna deze gedetecteerd en

gekwantificeerd kunnen worden in het MS toestel.49

Het grote voordeel van deze techniek is dat meerdere stalen tegelijk kunnen geanalyseerd

worden en dat LC-MS/MS een heel hoge specificiteit heeft. Er kunnen door middel van LC-

MS/MS ook lagere concentraties gemeten worden dan bij de andere methodes. Er zijn wel

nog steeds arbeidsintensieve voorbereidende stappen nodig.

17

BESPREKING

Verder onderzoek is nodig naar de pathogenese van aorta ruptuur en andere aandoeningen bij het

Friese paard. Een genetische afwijking van het collageen metabolisme werd in meerdere

onderzoeken bij het Friese paard geopperd.

In functie van het aantonen van een collageen defect bij de fries wordt best gefocust op de pyridinium

cross-links HP en LP, aangezien een vorige studie reeds een verschil aantoonde tussen warmbloeden

en Friese paarden wat betreft de pyridinium cross-links in peesweefsel (ongepubliceerde resultaten).

Het voordeel van deze cross-links is dat deze in het bloed vrijkomen na afbraak van collageen en

direct in de urine worden uitgescheiden zonder voorafgaande metabolisatie door de lever. De urinaire

uitscheiding van HP en LP worden ook niet beïnvloed door het dieet, aangezien deze stoffen niet

worden geabsorbeerd via de darm.36

Onderzoek naar de uitscheiding van crosslinks bij de Fries zou

dus een grote meerwaarde kunnen betekenen, hoewel toch nog een aantal obstakels overwonnen

moeten worden.

Enerzijds kan de specificeit van de pyridinium cross-links HP en LP in twijfel getrokken worden

aangezien zij vooral worden uitgescheiden na turnover van bot, en het bindweefsel maar een klein

aandeel omvat van de totale uitscheiding. Toch zou een algemene verhoging van de uitscheiding

binnen het Friese ras ten opzichte van andere paarden al een indicatie kunnen geven over de oorzaak

van de aandoening. Hierbij moet er nauwkeurig rekening gehouden worden met de toestand/training

van de onderzochte dieren, de leeftijd en de mogelijke toegediende medicatie. Deze kunnen namelijk

een invloed hebben op de uitscheiding van de cross-links en hiervoor moet gecorrigeerd worden. Zo

zullen paarden met osteoartritis, een veel voorkomende aandoening bij oudere paarden, een sterk

verhoogde uitscheiding hebben wat kan leiden tot een foutieve interpretatie van de resultaten. Ook

osteochondrose is een veel voorkomende aandoening bij jonge paarden welke een invloed zou

kunnen hebben op de uitscheiding van HP en LP. Bij aangetaste paarden werd reeds een verhoogde

concentratie aan HP en LP gevonden ter hoogte van het gewricht.50

Onderzoek van de urine naar de

uitscheiding van de cross-links bij osteochondrose zou dus nuttig zijn.

Het zou bijzonder interessant zijn om een aantal Friezen met aorta ruptuur in het onderzoek te kunnen

betrekken. Doch aangezien het aantal Friese paarden in België beperkt is en een groot aantal

aangetaste paarden vermoedelijk de kliniek niet bereikt, is dit moeilijk haalbaar.

Opvangen van urine bij paarden kan op verschillende manieren gebeuren. Men kan gewoon

midstream urine opvangen in een potje. Dit vergt zeer veel tijd en geduld. Sommige paarden weigeren

ook te urineren in het bijzijn van de mens. Een andere methode is de 24 uur collectie. Hierbij wordt

een speciaal ontworpen harnas aangebracht bij het paard, welke de urine automatisch opvangt

telkens het paard urineert.39

Dit harnas kan ook na een gewenste tijd geleegd worden (voorbeeld om

de 3 uur). Deze harnassen zijn helaas niet overal beschikbaar. Een derde mogelijkheid is opvangen

van urine doormiddel van blaas katheterisatie. Dit is een tijdrovend werk waarbij de paarden telkens

gesedeerd worden. Het nadeel hiervan is dat de sedatie een invloed zou kunnen hebben op de

18

urinaire concentraties. Onderzoek naar de invloed van sedatie op uitscheiding van cross-links werd

nog niet beschreven.

Verder zijn de technieken voor het bepalen van cross-links in de urine vooral ontwikkeld voor de

detectie bij mensen. De urine van paarden is troebel en bevat veel mucus afkomstig uit de accessoire

geslachtklieren wat moeilijkheden kan geven bij de analyse. Voor paarden werden ook nog geen

standaarden opgesteld voor HP en LP in de urine.

Genetische testen zijn essentieel in het verdere onderzoek naar aortaruptuur en andere

aandoeningen binnen het Friese paarden ras. Er werd vastgesteld dat Friese paarden met aorta

ruptuur een grote verwantschap onderling hebben in vergelijking met de verwantschap met de rest

van de populatie. Dit doet de aanwezigheid van een recessief overdraagbare aandoening vermoeden.

Het ontwikkelen van een DNA test, zou het opsporen van dragers en zo een aanpassing van de

selectie binnen het Friese ras mogelijk maken. Gezien de hoge inteelt binnen dit Friese ras is het

echter mogelijk dat alsnog andere, mogelijks nog ongekende erfelijke ziekten de kop opsteken.

19

REFERENTIES

1. https://www.kfps.nl/, Historie van paard

2. Ducro B.J., Bovenhuis H., Neuteboom M., Hellinga I. (2006). GENETIC DIVERSITY IN THE

DUTCH FRIESIAN HORSE. 8th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production,

Brazil.

3. Saey V., Famaey N., Smoljkic M., Claeys E., van Loon G., Ducatella R., Ploeg M., Delesalle C.,

Gröne A., Duchateau L., Chiers K. (2015). Biomechanical and biochemical properties of the

thoracic aorta in warmblood horses, Friesian horses, and Friesians with aortic rupture. BMC

Veterinary Research 11:285.

4. Ploeg M., Saey V., de Bruijn C.M., Gröne A., Chiers K., van Loon G., Ducatelle R., van Weeren

P.R., Back W., Delesalle C. (2011). Aortic rupture and aorto-pulmonary fistulation in the Friesian

horse: Characterisation of the clinical and gross post mortem findings in 24 cases. Equine

Veterinary Journal. Equine Veterinary Journal 45(1), 101-106.

5. Sijsling A.M. (2015). Pyrrole cross-links and glycosaminoglycans and their role in aortic rupture in

the Friesian horse. Research Project University of Utrecht.

6. Sleeper M.M., Durando M.M., Miller M., Habecker P.L., Reef V.B. (2001). Aoric root disease in

four horses. Journal of the American Veterinary Medical Association 219(4), 491-496.

7. Ploeg M., Saey V., Delesalle C., Gröne A., Ducatelle R., de Bruijn M., Back W., van Weeren P. R.,

van Loon G., Chiers K. (2014). Thoracic Aortic Rupture and Aortopulmonary Fistulation in the

Friesian Horse: Histomorphologic Characterization. Veterinary Pathology 2015 52(1), 152-159.

8. Rooney J.R., Prickett M.E., Crowe M.W. (1967). Aortic Ring Rupture in Stallions. Veterinary

Pathology 4(3), 268-274.

9. van der Linde-Sipman J.S., Kroneman J., Meulenaar H., Vos J.H. (1985). Necrosis and Rupture of

the Aorta and Pulmonary Trunk in Four Horses. Veterinary Pathology 22, 51-53.

10. Broekman L.E.M., Kuiper D. (2002). Megaesophagus in the horse. A short review of the literature

and 18 own cases. Veterinary Quarterly 24(4), 199-202.

11. Sutton G.G.M. (2015). Diagnosing disorders of the equine oesophagus. Equine Veterinary

Education 27(6), 291-294.

12. Ploeg M., Gröne A., Saey V., de Bruijn C.M., Back W., van Weeren P.R., Scheideman W., Picavet

T., Ducro B.J., Wijnberg I., Delesalle C. (2014). Esophageal Dysfunction in Friesian Horses:

Morphological Features. Veterinary Pathology 1-6.

13. Sipma K.D., Cornillie P., Saulez M.N., Stout T.A.E., Voorhout G., Back W. (2013). Phenotypic

Characteristics of Hydrocephalus in stillborn Friesian Foals. Veterinary pathology 00(0), 1-6.

14. Back W., Van Der Lugt J.J., Nikkels P.G.J., Van Den Belt A.J.M., Van Der Kolk J.H., Stout T.A.E.

(2008). Case Report. Phenotypic diagnosis of dwarfism in six Friesian horses. Equine Veterinary

Journal 40 (3), 282-287.

15. Gussekloo S.W.S., Lankester J., Kersten W., Back W. (2011). Effect of differences in tendon

properties on functionality of the passive stay apparatus in horses. American Journal of Veterinary

Research 72(4), 474-483.

16. Thorpe C.T., Stark R.J.F., Goodship A.E., Birch H.L. (2010). Mechanical properties of the equine

superficial digital flexor tendon relate to specific collagen cross-link levels. Equine Veterinary

Journal 42, 583-543.

20

17. Hazeleger E. (2013) The biochemical differences of the superficial digital flexor tendon and the

common digital extensor tendon between Warmbloods, Friesians and Thoroughbreds. Utrecht

University, Department of Equine Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht.

18. Sevinga M., Hesselink J.W., Barkema H.W. (2002). Reproductive performance of Friesian mares

after retained placenta and manual removal of the placenta. Theriogenology 57, 923-930.

19. Sevinga M. Barkema H.W., Stryhn H., Hesselink J.W. (2004). Retained placenta in Friesian

mares: incidence, and potential risk factors with special emphasis on gestational lenght.

Theriogenology 61, 851-859.

20. Shoulders M.D., Raines R.T. (2009). Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem 78, 989-

958.

21. Wess T.J., Avery N.C., Bailey A.J. (2008). Collagen, Structure and Mechanics. Fratzl P. Chapter

3, p51-53, Chapter 4, p83-91.

22. Nimni M.E. (1983) Collagen: Structure, Function, and Metabolism in Normal and Fibrotic Tissues.

Seminars in Arthritis and Rheumatism 13(1), 1-66.

23. Ramshaw J.A.M., Shah N.K., Brodsky B. (1998). Gly-X-Y Tripeptide Frequencies in Collagen: A

Context for Host-Guest Triple-Helical Peptides. Journal of Structural Biology 122, 86-91.

24. Ottani V., Raspanti M., Ruggeri A. (2001). Collagen structure and functional implications. Micron

32, 251-260.

25. Ricard-Blum S., Ville G. (1989). Minireview. Collagen cross-linking. Int. J. Biochem. 21(11), 1158-

1189.

26. Wu J., Eyre D.R. (1985) Studies on the Distribution of Hyrdroxypyridinium Cross-Links in Different

Collagen Types. The children’s Hospital and Harvard Medical School Bosten, Massachusetts.

27. Sijsling A.M. (2015). Pyrrole cross-links and glycosaminoglycans and their role in aortic rupture in

the Friesian horse. Research Project University of Utrecht.

28. Saey V., Famaey N., Smoljkic M., Claeys E., van Loon G., Ducatelle R., Ploeg M., Delesalle C.,

Gröne A., Duchateau L., Chiers K. (2015). Biomechanical and biochemical properties of the

thoracic aorta in warmblood hroses, Friesian horses, and Friesians with aortic rupture. BMC

Veterinary Research 11, 285

29. Menashi S., Campa J.S., Greenhalgh R.M., Powell J.T. (1987). Collagen in abdominal aortic

aneurysm: Typing, content, and degradation. Journal of Vascular Surgery 6, 578-582.

30. Daugherty A., Cassis L.A., (2004). Mouse Models of Abdominal Aortic Aneurysms. Journal of the

American Heart Association 24, 429-434.

31. Sinke J.D., van Dijk J.E., Willemse T. (1997). A case of Ehlers-Danlos-like syndrome in a rabbit

with a review of the disease in other species. Veterinary Quarterly, 19(4); 182-185.

32. Pepin M, Schwarze U., Superti-Furga A., Byers P.H. (2000). CLINICAL AND GENETIC

FEATURES OF EHLERS-DANLOS SYNDROME TYPE IV, THE VASCULAR TYPE. Journal of

Medicine, 342(10, 673-680.

33. Smith L.T., Wertelecki W., Milstone L.M., Petty E.M., Seashore M.R., Braverman I.M., Jenkins

T.G., Byers P.H. (1992). Human Dermatosparaxis: A Form of Ehlers-Danlos Syndrome That

Results from Failure to Remove the Amino-terminal Propeptide of Type I Procollagen. Am.J.Hum

51, 235-244.

34. Potter K.A., Besser T.E. (1994). Cardiovascular Lesions in Bovine Marfan Syndorme. Veterinay

Pathologie 31(5), 501-509.

21

35. Eyre D.R. (1995). The specificity of collagen cross-links as markers of bone and connective tissue

degradation. Acta Orthopaedica Scandinavica 66, 166-170.

36. Kamel S., Brazier M., Desmet G., Picard C., Mennecier I., Sebert Jl. (1992). High Performance

liquid chromatographic determination of 3-hydrocypyridinium derivatives as new markers of bone

resorption. Journal of Chromatography 574, 255-260.

37. Bailey A.J., Sims T.J., Ebbesen E.N., Mansell J.P., Thomsen J.S., Mosekilde Li. (1999). Age-

Related Changes in the Biochemical Properties of Human Cancellous Bone Collagen:

Relationship to bone strength. Calcif. Tissue Int 65, 203-210.

38. Beardsworth L.J., Eyre D.R., Dickson I.R. (1990). Changes with age in urinary excretion of lysyl-

and hydroxylysylpyridinoline, two new markers of bone collagen turnover. Journal of bone and

mineral research 5(7), 671-676.

39. Black A., Schoknecht P.A., Ralston S.L., Shapses S. (1998). Diurnal Variation and Age

Differences in the Biochemical Markers of Bone Turnover in Horses. Journal of Animal Science

77(1), 75-83.

40. Schlemmer A., Hasseger C., Jensen S.B., Christiansen C. (2009). Marked diurnal variation in

urinary excretion of pyridinium cross-links in premenopausal women. The Journal of Clinical

Endocrinology & Metabolism 74(3), 476-480.

41. Fujimoto S., Kubo T., Tanaka H., Miura M., Seino Y. (2009). Urinary pyridinoline an

deoxypyridinoline in healthy children and in children with growth hormone deficiency. The Journal

of Clinical Endocrinology & Metabolism 80(6), 1922-1928.

42. Lutchman E.C., Hardwick T.A., Biener R., Chowdhury H.A., trout J.R., Shapses S.A. (1998).

Longitudinal study of urinary hydroy-pyridinium cross-links and growth in healthy infants: higher

values with breastfeeding and after daytime sleep. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 106(1), 51-56.

43. 46 Vesper H.W., Demers L.M., Eastell R., Garnero P., Kleerekoper M., Robins S.P., Srivastava

A.K., Warnick G.R., Watss N.B., Myers G. (2002). Assessment and Recommendations on Factors

Contributing to Preanalytical Variability of Urinary Pyridinoline en deoxypyridinoline. Clinical

chemistry 48(2), 220-2235.

44. Price J.S., Jackson B., Eastell R., Wilson A.M., Russell R.G.G., Lanyon L.E., Goodship A.E.

(1995). The Response of the Skeleton to Physical Training: A Biochemical study in Horses.

Elsevier 17(3), 221-227.

45. Arican M., Köylü Ö., Uyaroglu A., Erol M., Calim K.N. (2004). Diagnostic Importance of

Deoxypyridinoline and Osteocalcine in Equine Osteoarthritis. Acta Vet. BRNO 73, 491- 496.

46. Takashashi M., Kushida K., Hoshino H., Suzuki M., Sano M., Miyamoto S., Inoue T. (1996).

Concentrations of pyridinoline and deoxypyridinoline in joint tissues from patients with

osteoarthritis or rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases 55, 324-327.

47. Vesper H.W., Demers L.M., Eastell R., Gernero P., Kleerekoper M., Robins S.P., Srivastava A.K.,

Warnick G.R., Watts N.B., Myers G.L. (2002). Assessment and Recommendations on Factors

Contributing to Preanalytical Variability of Urinary Pyridinoline and Deoxypyridinoline. Clinical

Chemistry 48(2), 220-235.

48. Kamel S., Brazier M., Picard C., Boitte F., Samson L., Desmet G., Sebert J.L. (1994). Urinary

excretion of pyridinolines crosslinks measured by immunoassay and HPLC techniques in normal

subjects and in elderly patients with vitamin D deficiency. Bone and Mineral 26, 197-208

49. Tang J.C.Y., Dutton J.J., Piec I., Green D., Fisher E., Washbourne C.J., Fraser W.D. (2014). LC-

MS/MS Measurement of Urine Free Collagen Crosslinks Pyridinoline and Deoxypyridinolin: Urine

Markers of Bone Resorption. University of East Anglia, Norwich Medical School.

22

50. van de Lest C.H.A., Brame P.A.J., van El B., DeGroot J., van Weeren P.R. (2004). Extracellular

matrix changes in early osteochondrotic defects in foals: a key role for collagen? Elsevier 1690(1),

54-62.