UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · 2010-09-14 · în suc gastric ....
58
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII Ing. DAN CRISTIAN VODNAR OPTIMIZAREA UNOR FERMENTAŢII LACTICE INDUSE DE DIFERITE TIPURI DE MICROORGANISME PE SUBSTRATURI VEGETALE REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC Prof. Dr. CARMEN SOCACIU Cluj-Napoca 2010
Transcript of UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ · 2010-09-14 · în suc gastric ....
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ
FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI
BIOTEHNOLOGII
Ing. DAN CRISTIAN VODNAR
OPTIMIZAREA UNOR FERMENTAŢII LACTICE
INDUSE DE DIFERITE TIPURI DE MICROORGANISME PE SUBSTRATURI
VEGETALE
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC Prof. Dr. CARMEN SOCACIU
Cluj-Napoca 2010
CUPRINS CUPRINS............................................................................................................................ II INTRODUCERE: SCOP ŞI OBIECTIVE ....................................................................... IV REZULTATE EXPERIMENTALE ................................................................................ VII I. SELECŢIA BACTERIILOR ŞI CARACTERIZAREA SUCULUI DE LUCERNĂ UTILIZATE ÎN FERMENTAŢIA LACTICĂ ...............................................................VIII
MATERIALE ŞI METODE........................................................................................VIII Selecţia bacteriană. ..................................................................................................VIII Obţinerea sucului verde de lucernă. ........................................................................VIII Metode analitice. .....................................................................................................VIII
REZULTATE ŞI DISCUŢII ......................................................................................... IX Selecţia bacteriană ..................................................................................................... IX Cultivarea bacteriilor Lactobacillus paracasei 168, 169, 172 .................................. IX Caracterizarea sucului verde de lucernă ......................................................................X
CONCUZII................................................................................................................... XII II. OPTIMIZAREA FERMENTAŢIEI LACTICE UTILIZÂND SUC VERDE DE LUCERNĂ ŞI HIDROLIZAT DE ORZ CA SUBSTITUIENŢI DE NUTRIŢIE .........XIII
MATERIALE ŞI METODE........................................................................................XIII Preparare inocul.......................................................................................................XIII Condiţii de fermentaţie ............................................................................................XIII Metode analitice. .....................................................................................................XIII Obţinerea glucozei din orz...................................................................................... XIV Cultivarea lui Lactobacillus paracasei 168 pe hidrolizat de orz ........................... XIV
REZULTATE ŞI DISCUŢII ........................................................................................XV Producţia de acid lactic indusă de Lactobacillus paracasei 168 utilizând suc de lucernă ca substituient de nutriţie .............................................................................XV Caracterizare chimică ...........................................................................................XVIII Viabilitatea şi producţia de biomasă a bacteriei Lactobacillus paracasei 168 ........XX Glucoza din orz...................................................................................................... XXII Fermentaţia lactică indusă de Lactobacillus paracasei 168 pe substrat de hidrolizat de orz ..................................................................................................................... XXII
CONCLUZII ............................................................................................................XXIV III. CARACTERIZAREA CAPACITĂŢII DE BIOCONVERSIE A BACTERIILOR PROBIOTICE PE DURATA FERMENTAŢIEI LACTICE .......................................XXV
MATERIALE ŞI METODE......................................................................................XXV Pregătirea microorganismelor ...............................................................................XXV Caracterizarea HPLC.............................................................................................XXV Analiza FTIR. ........................................................................................................XXV Numărarea bacteriilor ............................................................................................XXV
REZULTATE ŞI DISCUŢII ....................................................................................XXVI Cuantificarea HPLC .............................................................................................XXVI Spectroscopia FTIR ...............................................................................................XXX Viabilitatea bacteriană .......................................................................................XXXIII
II
CONCLUZII ..........................................................................................................XXXV IV. CARACTERIZAREA DIFERITELOR TIPURI DE CAPSULE CARE CONŢIN BACTERII PROBIOTICE .......................................................................................XXXVI
MATERIALE ŞI METODE..................................................................................XXXVI Pregătirea microorganismelor ...........................................................................XXXVI Microîncapsularea bacteriilor. ...........................................................................XXXVI Caracterizarea morfologică a capsulelor ...........................................................XXXVI Analiza FTIR .....................................................................................................XXXVI Analiza statistică.............................................................................................. XXXVII
REZULTATE ŞI DISCUŢII ............................................................................... XXXVII Caracterizarea capsulelor................................................................................. XXXVII Analiza FTIR .....................................................................................................XXXIX
CONCLUZII ...............................................................................................................XLI V. SUPRAVIEŢUIREA BACTERIILOR PROBIOTICE- ÎNCAPSULATE ÎN DIFERITE MATRICI-ÎN SUCUL GASTO-INTESTINAL.........................................XLII
MATERIALE ŞI METODE.......................................................................................XLII Viabilitatea bacteriilor încapsulate în suc gastic simulat .......................................XLII Supravieţuirea bacteriilor încapsulate în suc intestinal simulat după o incubare preliminară în suc gastic simulat ............................................................................XLII Numãrarea bacteriilor încapsulate........................................................................ XLIII Analiza statisticã................................................................................................... XLIII
REZULTATE ŞI DISCUŢII .................................................................................... XLIII Supravieţuirea bacteriilor încapsulate în suc gastric simulat ............................... XLIII Supravieţuirea bacteriilor încapsulate în suc intestinal simulat după o incubare preliminară în suc gastic simulat .......................................................................... XLIX
CONCLUZII ...............................................................................................................LIV CONCLUZII GENERALE.............................................................................................. LV BIBLIOGRAFIE ............................................................................................................LVI
III
INTRODUCERE: SCOP ŞI OBIECTIVE
Acidul lactic, pe lângă aplicaţiile din industia alimentară, farmaceutică, textilă,
chimică, se poate utiliza ca materie primă la fabricarea plasticului biodegradabil. Această
aplicaţie face ca acidul lactic să fie un produs valoros. Astfel, cercetările la nivel mondial
au ca obiectiv reducerea costurilor de producţie, iar fermnataţia lactică indusă de diferite
tipuri de bacterii a fost gasită ca fiind cea mai atractivă cale de a produce acid lactic.
Deoarece costul mediului de fermentaţie este datorat sursei de nutrienţi, se doreşte a se
găsi noi surse ieftine de nutrienţi cu potenţial industrial şi izolarea de noi bacterii care au
capacitate mare de bioconversie a nutrienţilor în acid lactic.
Bacteriile probiotice fac parte, în principal, din categoria bacteriilor lactice şi sunt
caracterizate de efectul benefic pe care îl aduc organismului uman. Produc cantităţii mici
de acid lactic, însă au aplicaţii largi în industria alimentară. Pentru a le proteja viabilitatea
pe durata expunerii condiţiilor sucului gastro-intestinal, bacteriile se pot încapsula în
diferite matrici. Principalul motiv al încapsulării este de a îmbunătăţii supravieţuirea
bacteriilor pe perioada producţiei şi depozitării produselor alimentare, precum şi de a le
proteja faţă de factorii fizici şi chimici ai tractului digestiv.
Scopul acestei teze de doctorat a fost de a evalua fermentaţiile lactice pe
substraturi vegetale, utilizând diferite tipuri de microorganisme şi de a evalua
viabilitatea şi supravieţuirea bacteriilor lactice (libere vs. încapsulate) în suc gastric
şi intestinal simulat.
Principalele obiective au fost:
1. Optimizarea fermentaţiei lactice utilizând suc de lucernă cu adaos de nutrienţi
(glucoză, extract de drojdie) şi diferite tipuri de Lactobacillus paracasei.
2. Evaluarea comparativă a capacităţii de bioconversie a nutrienţilor în acid lactic a
bacteriilor lactice (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis,
Lactobacillus casei, Bifidobacterim breve) şi a mixului de Streptococcus
thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) prin cromatografie
lichidă de înaltă performanţă (HPLC).
IV
3. Utilizarea spectoscopiei infraroşii cu transformantă Fourier în vederea
caracterizării bacteriilor lactice libere şi pe durata fermentaţiei, ca metodă
complementarã caracterizării microbiologice şi microscopice a bacteriilor.
4. Încapsularea bacteriilor Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis,
Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, a mixului belgian (Lactobacillus
plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve)
şi a mixului românesc (Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus) în matrici de alginat, chitosan, alginat- gumă xanthan, alginat-
gumă guar).
5. Caracterizarea morfologică şi spectoscopică a diferitelor tipuri de capsule cu şi
fară bacterii.
6. Evaluarea viabilităţii şi supravieţuirea bacteriilor încapsulate pe durata expunerii
condiţiilor sucului gasto-intestinal simulat.
Structura tezei: teza este structurată în două părţi, studiul de literatură şi contribuţii
originale (cu rezultate şi discuţii precum şi o prezentare a metodelor de lucru).
Prima parte-Studiul bibliographic- include trei capitole (1-3):
Capitolul 1 prezintă caracterizarea bacteriilor lactice în funcţie de clasificare,
metabolism şi efectele benefice ale baceriilor probiotice.
Capitolul 2 caracterizează procesele fermentative pe substrat vegetal şi prezintă
condiţiile necesare fermentaţiilor în bioreactor precum şi aplicaţiile acidului lactic.
Capitolul 3 rezumă tehnologiile de microîncapsulare ale bacteriilor probiotice
utilizând matrici de alginat, chitosan şi k-carragenan.
Partea a doua a tezei-Cercetări proprii- cuprinde cinci capitole (4-8):
Capitolul 4: prezintă selecţia bacteriilor, caracterizate de capacitatea mare de a
produce acid lactic şi caracterizarea sucului verde de lucernă, utilizate în
fermentaţia lactică.
Capitolul 5: prezintă modele experimentale effectuate în vederea optimizării
fermentaţiei lactice pe substrat de suc de lucernă şi hidrolizat de orz, utilizate
ca substituienţi nutritivi cu adaos de glucoză şi extract de drojdie.
V
Capitolul 6: cuprinde studii care caracterizează capacitatea de bioonversie a
bacteriilor probiotice în timpul fermentaţiei lactice.
Capitolul 7: conţine caracterizarea diferitelor tipuri de capsule formate din
matrici în care au fost încapsulate bacterii probiotice
Capitolul 8: prezintă supravieţuirea bacteriilor probiotice- încapsulate în difrite
matrici- în suc gastric şi intestinal simulat.
Originalitatea tezei:
Optimizarea producţiei de acid lactic induse de către Lactobacillus paracasei 168,
pe substrat de suc verde de lucernă şi hidrolizat de orz, utilizaţi ca substituienţi de
nutriţie.
Caracterizarea FTIR a bacteriilor probiotice, libere şi încapsulate, şi supravieţuirea
lor în timpul expunerii condiţiilor tractului gastro-intestinal.
Încapsularea mixului de bacterii (Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus) şi conservarea capacităţii de probiotic pe timpul
expunerii mediului gastro-intestinal.
Perspective:
Ca planuri de viitor, ar putea fi extrem de util sa găsim materii prime ieftine, care
sunt potrivite pentru fermentaţia lactică in vitro şi izolarea de bacterii noi cu o capacitate
mare de formare a acidului lactic, orientate spre o producţie mai mare de L (+) -acid
lactic.
Această teză este rezultatul colaborării dintre Departamentul de Chimie şi
Biochimie al Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară, Cluj Napoca,
România şi a Departamentului de Bioinginerie-Bioconversie a Institutului Agrartehnic
din Potsdam-Bornim e.V.ATB, Germania. Suportul financiar a fost alocat de către
Deutsche Bundesstiftung Umwelt şi BD CNCSIS (2007-2010).
VI
REZULTATE EXPERIMENTALE
Acidul lactic este unul dintre cei mai importanţi acizi organici, produs de către
bacteriile lactice (LAB), descoperit de către cercetătorul suedez C.W. Scheele în anul
1780 în lapte acru. Acidul lactic are doi stereoizomeri L(+) şi D(−) (Fig.1). Acidul lactic
are o gamă largă de utilizări în industia alimentară, cosmetică, textilă, aromelor, etc. Dacă
cantităţile mari de acid lactic D(−) sunt daunătoare pentru oameni, forma L(+) a acidului
lactic este izomerul preferat al industiilor alimentare şi farmaceutice fiind tolerat de către
organismele umane deoarece omul are L-lactat dehidrogenază, şi metabolizează forma
L(+) a acidului lactic (Åkerberg şi colab., 1998; Hofvendahl şi colab., 2000).
3CH
OHCH COOH
M
M
−−
3CH
CHO
COOH
M
M
−− H
D(-) lactic acid L(+) lactic acid
Fig.1. Chemical structure of D(-) and L(+)-lactic acid
Fig.1. Structura chimică a stereoizomerilor acidului lactic D(-) şi L(+)
Bacteriile lactice sunt homofermentative şi heterofermentative şi pot produce atât
stereoizomerul L(+) cât şi D(−) sau mixul racemic al acidului lactic. Avantajul
semnificativ, dicolo de cel al sintezei chimice, îl reprezintă posibilitatea de a produce acid
lactic prin metode biologice şi posibilitatea utilizării de substraturi ieftine ca: zer, melasă,
reziduu de amidon, sfeclă, trestie de zahăr, suc de lucernă sau alte surese bogate în
carbohidraţi şi nutrienţi esenţiali pentru dezvoltarea bacteriilor (Anuradha şi colab., 1999;
Ritcher şi Berthold, 1998; Tsao şi colab., 1999; Vishnu şi colab., 1998, 2000; Vodnar şi
colab., 2010).
VII
I. SELECŢIA BACTERIILOR ŞI CARACTERIZAREA SUCULUI DE LUCERNĂ UTILIZATE ÎN FERMENTAŢIA LACTICĂ
MATERIALE ŞI METODE Selecţia bacteriană. Au fost testate bacterii din genurile Bacillus, Lactobacillus şi
Pediococcus, (Colecţia Germană de Microorganisme şi Braunschweig Culuri Celulare.
Culturile sunt parţial alese din colecţia ATB Potsdam). Bacteriile au fost cultivate în mod
discontinuu în mediu special, fără control al pH-ului, iar valoarea pH-ului a fost măsurată
după 24 şi 48h. Temperatura a variat între 28°C şi 40°C. Aceste investigaţii au fost
realizate cu ajutorul bioreactorului BIOSTAT MD (B. Braun Biotech International
GmbH, Germany) echipat cu unitate digitală de control A fost utilizat NaOH ca şi agent
de corecţie a acidităţii. Mediul utilizat a fost MRS cu conţinut de glucoză de (40 gL-1 şi
100 gL-1) şi extract de carne şi peptonă (10 gL-1) ca sursă de azot.
Obţinerea sucului verde de lucernă. Lucerna a fost recoltată cu ajutorul unui cuţit
industrial (lungimea fibrelor 10 cm) şi imediat transportată la o distanţă de 15km, unde a
avut loc presarea cu ajutorul presei Cv (VETTER Maschinenfabrik GmbH & Co.KG,
Kassel/Germany) cu o capacitate de 500-800 kg masă verde/oră. Sucul obţinut a fost
repartizat în containere de 5l şi menţinut în condiţii de congelare la temperatura de -21
ºC. Experimentele au fost realizate pe suc de lucernă obţinut în 2005 şi 2008.
Metode analitice. Probe din sucul de lucernă au fost supuse procesului de deshidratate,
obţinându-se conţinutul în substanţă uscată (DM105). Conţinutul de cenuşă a fost obţinut
în urma uscării probelor timp de 2 ore la 550°C într-un calcinator preîncălzit.
Concentraţia de azot total (Ntot) a fost analizată prin metoda standard Vapodest
(Gherhardt) prin digestie, utilizând catalizator de seleniu. Tehnica colorimetrică a fost
utilizată pentru a măsura conţinutul total de fosfor cu ajutorul metodei albastru-molibden.
Anionii şi cationii au fost determinaţi utilizând ion chromatograful DX-120 (Dionex,
Idstein); cu IonPac AS14 (4mm) coloană (anioni) şi IonPac CS12A (4mm) coloană
(cationi). Faza mobilă a fost Na2CO3 3.5mM, 1mM NaHCO3 (anioni) şi 22mM H2SO4
(cationi) cu debit de 1.12 ml min-1 (anioni) şi 1.1 ml min-1 (cationi). Detecţia utilizată a
fost conductivitatea cu auto-supresie, supresor ASRS în mod reciclabil (anion1), CSRS în
VIII
mod reciclabil (cationi). Volumul injectat a fost de 25µl. Concentraţia de ioni de Ca- şi
Mg- s-a determinat cu ASS (Vario 6).
REZULTATE ŞI DISCUŢII
Selecţia bacteriană
Valoarea pH-ului scade pe perioada fermentaţiei, odată cu formarea acidului
lactic. Astfel, scăderea pH-ului poate fi considerată o metodă de evaluare a producţiei de
acid lactic; cu cât scade mai mult pH-ul în mediu cu atât producţia de acid lactic este mai
mare. Scaderea semnificativă a pH-ului sub valoarea de 4, conferă informaţii asupra
stabilităţii bacteriei testate. Cele mai bune rezultate au fost obţinute de către
Lactobacillus paracasei 168, Lactobacillus paracasei 169, Lactobacillus paracasei 172.
Cultivarea bacteriilor Lactobacillus paracasei 168, 169, 172
Fig.2 arată că cele trei bacterii sunt capabile să consume în întregime substratul de
fermentaţie la concentraţie de glucoză de 100 gl-1. Randamentul lactat a fost cuprins între
88 % şi 90 % în aceste cazuri. Comparând cele trei curbe de acumulare a acidului lactic,
se poate menţiona faptul că Lactobacillus paracasei 168 are cea mai mare şi mai
dinamicã pantă de formare a acidului lactic. Astfel, această bacterie este cea mai
eficientă. Acest lucru este confirmat şi de faptul că L. paracasei 168 cultivat pe mediu cu
conţinut iniţial de glucoză de 100 gl-1 consumă substratul în cel mai scurt timp în
comparaţie cu celelalte bacterii.
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25 30
time[hours]
Lact
ic a
cid
[gL
-1]
40g/L100 g/L
168
IX
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50
time[hours]
Lact
ic a
cid
[g/L
]
40 g/L
100 g/L
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50
time[hours]
Lact
ic a
cid
[g/L
]
40 g/L
100 g/L
Fig.2. Durata de formare a acidului lactic în cultivarea discontinuã a lui Lactobacillus
paracasei 168, 169, 172 pe mediul de culturã model, conţinând glucozã în cantitate de 40
gl-1 şi 100 gl-1
Fig.2. Time course of lactic acid formation in discontinuous cultivation of the strain
Lactobacillus paracasei 168, 169, 172 on model media containing glucose in quantities
of 40 gl-1 and 100 gl-1
Caracterizarea sucului verde de lucernă
Tabel 1
Valorile medii ale parametrilor determinati în sucul de lucernã obţinut in 2005 şi 2008
Table 1
Mean values of LGJ parameters determined in samples from 2005 and 2008
LGJ 2005 LGJ 2008 T test P<0.05
Sugar [gl-1] 12.5±0.1 8.28±0.1 *** Lactic acid [gl-1] 0 6.56±0.14 *** Acetic acid [gl-1] 0 4.12±0.16 ***
N tot [gl-1] 3.7±0.1 4.2±0.2 *** P tot [gl-1] 2.47±0.17 4.2±0.2 *** DM [%] 5.42±0.17 7.98±0.22 ***
ODM [%DM] 76.17±1.47 76.96±0.62 ns pH 6.02±0.11 5.32±0.14 *
NO2- [mgl-1] 14.45±1.3 <0.05 ** NO3- [mgl-1] 8.40±0.81 8.44±0.67 ns Cl- [mgl-1] 1760±40 1686.3±40.62 ns
SO42- [mgl-1] 739±32 638.6±27.75 **
PO43- [mgl-1] 539.3±23.86 260.6±22.50 ***
172169
X
LGJ 2005 LGJ 2008 T test P<0.05
Na+ [mgl-1] 84.7±1.41 98.66±1.52 ns K+ [mgl-1] 5373.3±47.25 4639±16 **
Mg2+ [mgl-1] 370±4.58 441.6±5.5 ** Ca2+ [mgl-1] 1475±5 2555.3±9 ***
Valorile sunt prezentate ca media a trei determinari ± SD/The values given above
are means of three determinations ± SD. Suc de lucernã/LGJ- lucerne green juice;
Conţinutul total de proteine/P tot- total protein content; Conţinutul total de azot/Ntot –total
nitrogen content; Substanţa uscatã/DM- dry matter; Substanţă uscatã organică/ODM-
organic dry matter. ***extrem de semnificativ/extremely significant; ** foarte
semnificativ/very significant; * semnificativ/significant; ns nesemnificativ/not significant/
Tabelul 1 ilustrează diferenţele dintre parametrii sucului de lucernă obţinut în
2005 şi 2008. Aceste diferenţe sunt influenţate de către factorii climatici şi condiţiile de
presare. Prezenţa acidului acetic (4.12 gl-1) şi acidului lactic (6.56 gl-1) în sucul din 2008
indică pre-fermentarea care a avut loc de la recoltare până la presare. Sucul de lucernă din
2008 a avut conţinutul în zaharoză de 8.28 gl-1 în timp ce sucul de lucernă din 2005, 12.5
gl-1. Partea organică din substanţa uscată organică (ODM) a fost de 76.17% în sucul din
2005 repectiv 76.96% în sucul din 2008. Componentele sărurilor (PO43-, Mg2+, K+, Na+)
sunt necesare microorganismelor pentru creştere. Analiza statistică, utilizând testul T
când P<0.05, arată diferenţe extrem de semnificative dintre sucul din 2005 şi sucul din
2008 pentru : zahăr (12.5 gl-1 vs. 8.28 gl-1), acid lactic (sub limita de detecţie vs. 6.56 gl-
1), acid acetic (sub limita de detecţie vs. 4.12 gl-1), Ptot (2.47gl-1 vs. 4.2 gl-1), Ntot (3.8 gl-1
vs. 4.2 gl-1), substanţă uscată (5.42% vs. 7.98%), PO43- (539.3 mgl-1 vs. 260.6 mgl-1) şi
Ca2+(1475 mgl-1 vs. 2555.3 mgl-1); diferenţe foarte semnificative pentru: NO2- (14.45
mgl-1 vs. <0.05 mgl-1), SO42- (739 mgl-1 vs. 638.6 mgl-1), K+ (5373.3 mgl-1 vs. 4639 mgl-
1), Mg2+ (370 mgl-1 vs. 441.6 mgl-1) şi diferenţe semnificative pentru: pH (6.02 vs. 5.32).
Prezenţa Cl-, 1760 mgl-1 în sucul din 2005 şi 1686 mgl-1 în sucul din 2008, poate ridica
probleme la purificarea acidului lactic atunci când se urmăreşte obţinerea unei purităţi
mari.
XI
CONCUZII
• Lactobacillus paracasei 168, a fost selectată ca fiind bacteria cu cea mai bună
capacitate şi randament de fermentaţie cu parametrii optimi de fermentaţie la
40.5°C, şi la pH 6.0.
• Lactobacillus paracasei 168 a fost cea mai eficientă bacterie utilizată. L.
paracasei 168 cultivat pe mediu cu conţinut iniţial de glucoză de 100 gl-1 consumă
substratul în cel mai scurt timp în comparaţie cu celelalte bacterii utilizate
(Lactobacillus paracasei 169 şi Lactobacillus paracasei 172).
• Sucul de lucernă conţine puţine zaharuri cel din 2008 8.28 gl-1 în timp de sucul de
lucernă din 2005, 12.5 gl-1; astfel sucul de lucernă nu poate servi ca unică sursă de
carbon în fermentaţia lactică. În fermentaţiile care utilizează suc de lucernă (bogat
de azot şi săruri, esenţiale creşterii bacteriene) sursa de carbon trebuie sa fie una
externă (glucoză sau hidrolizat de orz).
XII
II. OPTIMIZAREA FERMENTAŢIEI LACTICE UTILIZÂND SUC VERDE
DE LUCERNĂ ŞI HIDROLIZAT DE ORZ CA SUBSTITUIENŢI DE
NUTRIŢIE
MATERIALE ŞI METODE Preparare inocul. Lactobacillus paracasei168, a fost utilizat în acest studiu (Venus şi
Richter, 2006). Bateria a fost păstrată pe mediu agar înclinat cu compoziţia: 10 gl-1
extract de drojdie, 20 gl-1 peptonă, 20 gl-1 agar şi 20 gl-1 glucoză (Olofsson şi colab.,
2008). Inoculul a fost cultivat 20 de ore într-un vas Erlenmeyer de 400ml cu volum de
lucru de 180ml, cu agitare continuă 100 rpm, la 30ºC. Mediul de cultură utilizat a fost
MRS (creat de Man, Rogosa şi Sharpe 1960) bulion (Merck, Darmstadt, Germania).
Condiţii de fermentaţie. Fermentaţiile au avut loc la temperatura de 40.5°C, cu agitare
de 200 rpm, în condiţii anaerobe, în bioreactor (volum de 5L) BIOSTAT MD (B. Braun
Biotech International GmbH, Germania) echipat cu unitate digitală de control. Valoarea
pH (6.0) a fost menţinută cu ajutorul soluţiei de NaOH (20%) ca agent de corecţie.
Ingredientele şi codificarea experimentelor sunt prezentate în Tabelul 2. Vasul
bioreactorului a fost sterilizat la 121ºC pentru 30 minute.
Tabel 2
Ingredientele mediului de fermentaţie şi codificarea experimentelor
Table 2
Ingredients of the fermentations media and codification trails
Experiment/ Trials
Suc de lucernã 2005/ LGJ
(l)
Suc de lucernã 2008/ LGJ
(l)
Glucozã/ Glucose
(gl-1)
Extract de drojdie/Yeast extract
(gl-1)
A - 1.5 55 - B 1.5 - 55 - C 1.5 55 15 D 1.5 - 55 15
Suc de lucernã /LGJ-lucerne green juice
Metode analitice. Probe din masa fermentată au fost prelevate la fiecare 2 ore, pentru
determinarea acidului lactic, acidului acetic şi a glucozei, după diluţia de 1:10, cu ajutorul
XIII
HPLC (Dionex) coloană Eurokat H (300 x 8 mm, 10 µm) şi detector RI-71 cu limită de
detecţie de 0.01 gl-1. Faza mobilă utilizată 0.01 N H2SO4, sistem isocratic, cu debit de 0.8
ml min-1. Raportul stereoizomerilor acidului lactic a fost determinat cu ajutorul HPLC
(Knauer) cuplat cu detector UV şi coloană Chiralpak® MA (+) (50 x 4.6 mm, 3 µm).
Faza mobilă a fost 2 mM CuSO4, cu debit de 0.8 ml min-1. Detecţia a fost stabilită la
λ=254nm. Randamentul lactat reprezintă cantitatea totală de glucoză şi productivitatea de
acid lactic în funcţie de durata de formare.
Obţinerea glucozei din orz. Hidrolizarea are loc în două etape. Mai întâi amidonul
insolubil trebuie lichefiat la temperaturi de 80-110°C prin intermediul amilazei iar apoi
amidonul lichefiat este degradat până la glucoză cu ajutorul glucoamilazei la temperatura
de 40-60°C. Pentru lichefierea amidonului s-a utilizat preparat de enzime Termamyl
120L din Novo Nordisk (OK). α-amilaza produsă de Bacillus licheniformis rupe
amidonul în oligozaharide (5-7 unităţi de glucoză). Experimentele au fost realizate în
bioreactor cu capacitate de 2L echipat cu dispozitive de control a temperaturii şi a pH-
ului. 250 g de orz măcinat (mărimea particulelor <1, 4 mm) au fost suspendate (500 rpm)
intr-un litu de apă caldă (45°C). Amestecul a fost încalzit şi pH-ul ajustat. Apoi, 10mL de
enzime au fost adăugate iar amestecul a fost supus agitării timp de 4 ore.
Pentru zaharificarea amidonului au fost utilizate enzime AMG 300L din Novo
Nordisk (OK). Glucoamilaza (Aspergillus niger) a rupt oligozaharidele in unităţi de
glucoză. Experimentele au fost realizate în bioreactor cu capacitate de 2L echipat cu
dispozitive de control a temperaturii şi a pH-ului, acelasi bioreactor utilizat la lichefierea
amidonului. Amidonul lichefiat obţinut a fost porţionat in volume de 1L şi păstrat la
temperatura de - 21°C. 1 litru de soluţie de amidon congelată a fost încălzită sub agitare
continuă (500 rpm). După ajustarea pH-ului, 10 mL de enzime au fost adăugate AMG
300 L iar amestecul a fost incubat pentru 4 ore cu recoltare de probe la fiecare oră.
Probele au fost imediat inactivate prin fierbere iar apoi supuse determinării conţinutului
de glucoză.
Cultivarea lui Lactobacillus paracasei 168 pe hidrolizat de orz. Mediul de fermentaţie
utilizat ca mediu control a fost MRS: extract de drojdie 5 gl-1 peptonă 10 gl-1; extract de
carne 10 gl-1; tween 80 1 gl-1 acetat de sodiu 5 gl-1; citrat de amoniu 2 gl-1; K2HP04 2 gl-1;
MgS04·7H20 0.2 gl-1; MnS04·H20 0.05 gl-1; glucoză 120 gl-1.
XIV
REZULTATE ŞI DISCUŢII
Producţia de acid lactic indusă de Lactobacillus paracasei 168 utilizând suc de
lucernă ca substituient de nutriţie
Fig.3 prezintã timpul necesar pentru producţia de acid lactic de către Lactobacillus
paracasei 168 în mediu control (55 gl-1glucoză, 15 gl-1extract de drojdie, 8 gl-1extract de
carne, 10 gl-1peptonă, 2 gl-1K2HPO4, 0.1 gl-1 MgSO4 7H2O, 0.05 gl-1 MnSO4·H2O). La
finalul fermentaţiei (după 26 de ore), cantitatea de acid lactic a fost de 41.99 gl-1.
Randamentul lactat poate fi mai mare de 77% şi durata de fermentaţie este de 26 de ore.
Rezultatele corespund cu cele din literatură pentru aceleaşi condiţii de fermentaţie a altor
lactobacilli (Berry şi colab., 1999).
0
10
20
30
40
50
60
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26time [h]
gluc
ose,
lact
ic a
cid
[g l-1
h-1]
Lactic acid
Glucose
Fig.3. Durata de formare a acidului lactic pe mdiu de culturã control (55 gl-1glucozã/15
gl-1extract de drojdie/8 gl-1extract de carne/10 gl-1peptonã/2 gl-1K2HPO4/0.1 gl-1 MgSO4
7H2O/0.05 gl-1 MnSO4·H2O) de cãtre Lactobacillus paracasei 168. Fermentaţia a fost
realizatã în bioreactor cu capacitate de 5l dar cu volum de fermentaţie de 3l, la 40.5°C,
pH 6, şi 200rpm.
Fig.3. Time course of lactic acid fermentation on control medium (55 gl-1glucose/15 gl-
1yeast extract/8 gl-1meat extract/10 gl-1peptone/2 gl-1K2HPO4/0.1 gl-1 MgSO4 7H2O/0.05
gl-1 MnSO4·H2O) by Lactobacillus paracasei 168. The fermentation was conducted in a
5l fermenter with 3l working volume at 40.5°C, pH 6, and 200rpm
Timpul necesar formării acidului lactic şi consumul de glucoză în timpul
fermentaţiei în experimentul A (LGJ 2008/glucoză) în comparaţie cu cel B (LGJ
XV
2005/glucoză) şi experimentul C (LGJ 2008 /glucoză/extract de drojdie) cu cel D (LGJ
2005/glucoză/extract de drojdie ) sunt reprezentate în Fig.4a, respectiv Fig.4b. Processele
s-au finalizat după aproape 23 de ore pentru experimentele A şi B şi după 18 ore pentru
experimentul C şi D. Producţia de acid lactic a fost mai lentă, când a fost utilizat suc de
lucernă şi glucoză.
0
10
20
30
40
50
60
0 2 4 6 8 10 14 16 18 20 23
time[h]
Glu
cose
[g l-1
h-1]
0
10
20
30
40
50
60
Lact
ic a
cid
[g l-1
h-1]
B GlucoseA Lactic acidB Lactic acidA Glucose
Fig.4a. Producţia de acid lactic şi consumul de glucozã obţinute în experimentul A (Suc
de lucernã 2008/glucozã) şi B (Suc de lucernã 2005/glucozã). Fermentaţia a fost realizatã
în bioreactor cu capacitate de 5l dar cu volum de fermentaţie de 3l, la 40.5°C, pH 6, şi
200rpm.
Fig.4a. Lactic acid production and glucose consumption obtained on trails A (LGJ 2008
/glucose) and B (LGJ 2005/glucose). The fermentations were conducted in a 5l fermenter
with 3l working volume at 40.5°C, pH 6, and 200 rpm.
0
10
20
30
40
50
60
0 2 4 6 8 10 14 16 18 20time [h]
Glu
cose
[g l-1
h-1]
05
1015
202530
3540
4550
Lact
ic a
cid
[g l-1
h-1]
C GlucoseD GlucoseD Lactic acidC Lactic acid
Fig.4b. Producţia de acid lactic şi consumul de glucozã obţinute în experimentul C (Suc
XVI
de lucernã 2008/glucozã/extract de grojdie) şi D (Suc de lucernã 2005/glucozã/extract de
drojdie). Fermentaţia a fost realizatã în bioreactor cu capacitate de 5l dar cu volum de
fermentaţie de 3l, la 40.5°C, pH 6, şi 200rpm.
Fig.4b. Lactic acid production and glucose consumption obtained on trails C (LGJ 2008
/glucose/yeast extract) and D (LGJ 2005/glucose/yeast extract). The fermentation was
conducted in a 5l fermenter with 3 l working volume at 40.5°C, pH 6, and 200rpm.
Productivitatea maximă de lactat (Fig.5) în experimentele A (2.56 gl-1) şi B (2.19
gl-1) (LGJ/glucoză) este mai micã în comparaţie cu experimentele C (2.93 gl-1) şi D (2.68
gl-1) (LGJ/glucoză/extract de drojdie). Potrivit lui Oh şi colab, (2005) extrctul de drojdie
este considerat ca fiind cel mai bun nutrient pentru fermentaţia lactică. Efectul extractului
de drojdie în experimentele C şi D a dus la o productivitate rapidă, dar nu a avut efect
semnificativ asupra concentraţiei finale de acid lactic. L.paracasei 168 necesită un timp
scurt de adaptare la mediul variantelor experimentale A, C, D şi mai lung pentru
variantele B şi mediul control.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 2 4 6 8 10 14 16 18 20 23 26
time [h]
Lact
ic a
cid
Prod
uctiv
ity [g
l-1 h
-1 ]
A BC DControl
Fig.5. Productivitatea acidului lactic obţinut de cãtre Lactobacillus paracasei 168 pe
mediul control şi în experimentele A (Suc de lucernã 2008 /glucozã); B (Suc de lucernã
2005 /glucozã); C (Suc de lucernã 2008/glucozã/extract de grojdie) şi D (Suc de lucernã
2005/glucozã/extract de drojdie).
Fig.5. Productivity of lactic acid obtained by Lactobacillus paracasei 168 on Control
medium, and trails A (LGJ 2008 /glucose); B (LGJ 2005/glucose); C (LGJ 2008
XVII
/glucose/yeast extract ) and D (LGJ 2005/glucose/yeast extract).
Cantitatea de acid lactic formată în variantele experimentale care utilizează suc de
lucernă din 2008 a fost de 45.97 gl-1 (varianta A) respectiv 42.27 gl-1 (varianta C), ceea ce
înseamnă că adăugarea extractului de drojdie a accelerat metabolismul bacterian însă
cantitatea de acid formată a rămas aproape neschimbată.
În fermentaţiile care au utilizat ca mediu sucul de lucrnă din 2005, rezultatele
indică cantităţi de acid lactic aproximativ identice; astfel în varianta B s-a obţinut 47.23
gl-1 iar în varianta D, 47.33 gl-1. Adaosul de extract de drojdie în varianta D induce
creşterea accelerată a lui Lactobacillus paracasei 168. Randamentul lactat (concentraţia
lactatã formatã în relaţie cu concentraţia de substrat consumat) prezintã valori uşor mai
mari pentru experimentele care utilizează suc de lucernă din 2005 (varianta B şi D). În
experimentele care au utilizat Lactobacillus paracasei 168, concentraţia de acid lactic şi
randamentul lactat a fost de 42-47 gl-1, şi respectiv 81-91%. Analiza Pearson arată
corelarea semnificativă a cantităţii de acid lactic obţinută in mediul control vs. variantele
A (r2= 0.9899), B (r2= 0.9582), C (r2= 0.9901), D (r2= 0.9938), când P<0.0001.
Caracterizare chimică
În toate variantele experimentale s-a înregistrat o foarte bună corelaţie între
rezultatele obţinute pe HPLC Knauer cu privire la cuantificarea izomerilor acidului lactic
L(+) şi D(-) după cum se poate observa în Fig.6 şi Tabelul 3. Separarea glucozei, acidului
lactic şi a acidului acetic realizate cu ajutorul HPLC Dionex sunt prezentate în Fig.7.
Concentraţia lactică a fost între 42.07 gl-1 varianta C şi 47.33 gl-1 varianta D (Tabel 3).
Cantitatea de acid acetic în variantele A şi C a fost aproape neschimbate de la începutul
fermentaţiei (2.16 gl-1 varianta A şi 2.37 gl-1 varianta C) până la finalul ei (2.3 gl-1varianta
A, şi 2.51 gl-1 varianta C) după cum se poate observa în Fig.8. Tabelul 3 ilustrează faptul
că izomerul L(+) al acidului lactic se află în cantitate mai mare în varianta B, 46.09 gl-1
reprezentând 97.6% din cantitatea totală de acid lactic, iar puritatea cea mai mică este
întâlnită in varinata C, 38.12 gl-1 reprezentând 90.18%.
XVIII
Fig.6. Cromatograma HPLC (Knauer) de identificare a stereoizomerilor acidului lactic
L(+) şi D(-) în timpul fermentaţiei lactice. L(+)- acid lactic: tR= 6.25min; D(-)-acid lactic:
tR= 5.3min.
Fig.6. HPLC (Knauer) Chromatogram to identified optical isomers L(+) and D(-) of
lactic acid during the process. L(+)- lactic acid: tR= 6.25min; D(-)-lactic acid: tR= 5.3min.
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 15,0-5,0
0,0
10,0
20,0
min
1 - Glucose -7,78
2 - Milchsäure -10,97
3 - Essigsäure
Fig.7. Cromatograma HPLC (Dionex) de identificare a glucozei (1), tR= 7.78 min, acid
lactic (2), tR= 10.97 min, şi acid acetic (3), tR= 13.14 min, în timpul procesului de
fermentaţie.
Fig.7 HPLC (Dionex) Chromatogram to identified total amount of glucose (1), tR= 7.78
min, lactic acid (2), tR= 10.97 min, and acetic acid (3), tR= 13.14 min, during the
fermentation processes.
XIX
2
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
0 2 4 6 8 10 14 16 18 20time[h]
Ace
tic a
cid[
g l-1
h-1]
AC
Fig.8. Evidence of acetic acid in trails A (LGJ 2008/glucose) and C (LGJ
2008/glucose/yeast extract).
Fig.8. Monitorizarea acidului acetic în timpul fermentaţiei in experimentele: A (Suc de
lucernã 2008/glucozã) şi C (Suc de lucernã 2008/glucozã/extract de drojdie).
Tabel 3
Cantitatea de acid lactic L(+) şi D(-) în experimente
Table 3
Quantity of L(+) and D(-) lactic acid in all trails
Experiment/ Run Trail
L(+) acid lactic L(+) -Lactic acid
[gl-1]
D(-) acid lactic D(-) -Lactic acid/
[gl-1] A 42.07 91.520 % 3.9 8.480% B 46.09 97.605% 1.13 2.395% C 38.12 90.189% 4.14 9.811% D 43.48 91.873% 3.84 8.127%
Control Medium
41.56 98.987% 0.42 1.013%
Viabilitatea şi producţia de biomasă a bacteriei Lactobacillus paracasei 168
Celulele au fost bine adaptate mediului de fermentaţie şi metabolizarea nutrienţilor
a început imediat după adãugarea inoculului (180 ml bulion MRS inoculat cu bacterii de
pe 3 eprubete cu mediu agar înclinat la 30°C pentru 20h). La finalul procesului (după 31
XX
de ore) producţia de biomasă a fost de 7.76 gl-1 (Fig.9) cu valoarea cea mai mare de 7.69
gl-1la 23h. Viabilitatea lui Lactobacillus paracasei 168 în inocul a fost de 150%, după 2h
de fermentaţie valoarea a fost de 175% după care a scăzut la 110% la finalul fermentaţiei
(Fig.10).Vitalitatea lui Lactobacillus paracasei 168 (Fig.10) în toate variantele
experimentale influenţează începutul fermentaţiei astfel la varianta A, 1326% în inocul
iar după 8h de fermentaţie ajunge la 121%, la varianta B, 626% după 6h - 280%, la
varianta C, 194%, după 8h - 352%,la varianta D, după 4h - 395%.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 2 4 6 8 10 12 14 16 26 30 32time [h]
Bio
mas
s [g
l-1]
ABCDControl
Fig.9. Monitorizarea biomasei produsã de cãtre Lb. paracasei 168 in procesele
fermentative
Fig.9. Time function of biomass concentration in batchs cultivation of L. paracasei 168
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 2 4 6 8 10 12 14 16 26 30 32time [h]
Vita
lity
[%]
ABCDControl
Fig.10. Viabilitatea lui Lb. paracasei 168 în experimente
Fig.10.Viability of Lb. paracasei 168 in all trials
XXI
Glucoza din orz
Primele două fracţiuni (mărimea>1.4 mm) care conţin în principal pieliţe şi
material celulozic au fost separate şi îndepãrtate. Materialul rămas, 93.9 % din masa
totală a fost utilizat pentru hidroliza enzimatică. 96 % din conţinutul iniţial de amidon din
orz a fost utilizat pentru hidroliză. Menţionăm cã după adăugarea a 10 mL de enzime şi
amestecarea timp de 4 ore rezultă amidon lichefiat în procent de 98-99%. Parametrii
variabili sunt temperatura şi pH-ul. Intervalul de variaţie a fost 70°C T ≤ 90°C şi 5.0≤ pH
≤ 7.0. Cantitatea minimă de amidon în reziduuri solide a fost de 6.9%. Aceasta
corespunde unui grad de lichefiere de 95.3%. Şirul de parametrii variabili a fost 40°C
≤T°C≤60°C şi 3.0≤pH≤5.0. Cantitatea minimă de amidon rezidual în probe în condiţii
diferite este de 3.45 g. Aceasta corespunde unui grad de lichefiere de 80%.
În vederea preparării unui mediu bogat în surse de carbon pentru fermentaţia
lactică, cel mai important parametru a fost controlul glucozei la finalul procesului de
hidrolizare.
Timpul optim pentru zaharificare este de 1.3 ore. Cea mai mare concentraţie de
glucoză, în condiţiile utilizate este de 142.3 gl-1, dacă temperatura este mare (60°C) şi
valoarea pH-ului este moderată (4.0). Aproximativ aceleaşi rezultate sunt obţinute la o
temperatură joasă (40°C) dar o valoare mare a pH-ului (5.0).
pH = 3.95; T = 60°C; t = 1.3 hours; Cmax. = 142.3 gl-1
pH = 5.00; T = 40°C; t = 1.3 hours; Cmax. = 141.8 gl-1.
Un alt maxim se înregistrează la un pH mic (3.0) şi o temperatură înaltă (60°C).
Dar pentru aceasta este necesară o perioadă de 4 ore de zaharificare:pH = 3.0; T = 60°C; t
= 4.0 hours; Cmax = 133.1 gl-1, astfel pentru a conserva energia şi costurile, cele mai bune
rezultate sunt obţinute în cazul al doilea.
Fermentaţia lactică indusă de Lactobacillus paracasei 168 pe substrat de hidrolizat de orz
Celulele sunt adaptate bine la mediul de fermentaţie şi producţia de acid lactic
începe imediat după adăugarea inoculului. Procesul a fost finalizat după aproximativ 20
de ore. În comparaţie cu această caracteristică, producţia de acid lactic a scăzut în cazul
utilizîrii mediului MRS conţinând 50% (v/v) hidrolizat de orz. Fermentaţia a fost
XXII
finalizată după 36 de ore. Concentraţia finală de acid lactic este în acelaşi interval pentru
toate variantele (Fig.11). Randamentul lactat (concentraţia lacticã în funcţie de
concentraţia substratului utilizat) arată valori mai mari în cazul variantelor experimentale
în care s-au utilizat hidrolizat de orz şi suc de lucernă. Utilizarea de hidrolizat de orz şi
suc de lucernă poate substitui cea mai importantă parte a nutrienţilor mediului pentru
fermentaţia lactică.
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3
Yield [%] 87.6 97.4 89.5
Lactic acid [g/l] 103.3 114.2 104.5
Glu/MRS MRS/Hidro Glu/Lucern
Fig.11. Productivitatea obţinutã în fermentaţia discontinuã a lui Lactobacillus paracasei
168 pe mediu MRS complet şi mediu MRS-hidrolizat din orz la temperatura de 40.5°C şi
pH de 6.0
Fig.11. Productivity obtained in discontinuous cultivation of Lactobacillus paracasei 168
on a complete MRS medium and a barley hydrolysate MRS medium at temperature of
40.5°C and pH value of 6.0
XXIII
CONCLUZII
• Lactobacillus paracasei 168 a fost utilizatã în fermentaţiile lactice. Am
demonstrat că bacteria poate acumula mai mult de 100 gl-1 acid lactic şi
randamentul lactat poate fi mai mare de 90%. Parametrii procesului: pH-ul şi
temperatura au fost stabilite a fi 6.0 şi respectiv 40.5°C.
• În vederea pregătirii unui mediu nutritiv pentru fermentaţia lactică, unul dintre cei
mai importanţi parametrii a fost concentraţia de glucoză din orz. Potrivit intenţiei
de a substituii nutrienţii scumpi cu material ieftin din resurse regenerabile am
testat sucul de lucernă în fermentaţia lactică. Sucul verde de lucernă conţine
compuşi şi săruri anorganice care sunt esenţiale pentru creşterea celulară.
• Putem rezuma că utilizarea hidrolizatului de orz şi a sucului de lucernă poate
substitui cea mai importantă parte a mediului de fermentaţie. Substituţia parţială a
nutrienţilor costisitori ( extract de carne, peptonă) este posibilă cu ajutorul sucului
de lucernă din 2005 şi 2008. Sucul de lucernă în combinaţie cu hidrolizatul din
orz, constituie un mediu de cultură complex pentru producţia de acid lactic.
XXIV
III. CARACTERIZAREA CAPACITĂŢII DE BIOCONVERSIE A
BACTERIILOR PROBIOTICE PE DURATA FERMENTAŢIEI LACTICE
MATERIALE ŞI METODE Pregătirea microorganismelor. Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus au fost achiziţionate de la MTC, Romania ca mix de bacterii,
Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterim
breve, mixul lor, au fost achiziţionate de la THT SA Science Park de la Universitatea
Gembloux, Belgia. Un vial de bacterii liofilizate a fost, separat, inoculat în 5 ml bulion
MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) (Merck, Germany) şi incubate la 37°C pentru 24h iar
apoi sub-cultivate în 95 mL bulion MRS şi incubate în aceleaşi condiţii. Durata de
fermentaţie a fost de 76 de ore.
Caracterizarea HPLC. Probe din materialul de fermentat au fost prelevate la fiecare 2
ore în vederea determinării cantităţii de acid lactic şi acid acetic. Probele au fost tratate
termic la 950C pentru 20 minute, şi păstrate la -180C. A fost utilizat HPLC (Agilent
Technologies 1200 Series) cuplat cu detector coupled with UV-VIS coloană column OA
5μm, 4 X 250 mm. Faza mobilă a fost sulfat de sodiu (100mM) soluţie (pH 2.65 ajustat
cu MSA), sistem isocratic, cu debit de 0.6 ml/min. Detecţia acidului lactic şi a acidului
acetic a fost setată la λ=210 nm. Cuantificarea acidului lactic şi a acidului acetic a fost
realizată pe baza ariei peak-ului cu ajutorul curbei de regresie.
Analiza FTIR. Spectele FTIR cu transmisie atenuantă (HATR) au fost obţinute cu
ajutorul spectrometrului Schimatzu IR Prestige- 21. Fiecare spectru a fost înregistrat între
4000 şi 500 cm-1. Toate spectrele au fost înregistrate pe seturi de probe în pararel cu
probe control. Pentru fiecare bacterie s-au înregistrat trei spectre la temperatura camerei.
Fiecare spectu a fost compus din 128 de scanări. Durata a fost de aproximativ 9 minute
per probă (n=3).
Numărarea bacteriilor. Bacteriile au fost numărate din 10µl de probă cu ajutorul
camerei Thoma cuplată la microscopul Zeiss Axio 5.0. Rezultatele au fost exprimate ca
ufc/ml. Viabilitatea bacteriană a fost determinată pe mediu agar MRS (50μl*3), iar
plăcile au fost incubate 48 ore la 37°C. Bacteriile au fost numărate în triplicat.
XXV
REZULTATE ŞI DISCUŢII
Cuantificarea HPLC
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 3 6 23 48 52 72 78time[h]
Lact
ic a
cid
[g/L
-1
L.plantarumB.infantisL.caseiB. breveBelgian MixRomanian Mix
Fig.12. Durata de formare a acidului lactic de cãtre bacteriile probiotice pe mdiul de
culturã MRS. Fermentaţia a fost realizatã în vas conic de 250 ml cu un volum de
fermentaţie de 100 ml, la 37°C, şi 200rpm
Fig.12. Time course of lactic acid formation in discontinuous fermentation of the
Probiotic Strains on model MRS media. The fermentations were conducted in a 250 ml
flask with 100 ml working volume at 37°C, and 200 rpm
Fig.12, reprezintă timpul necesar formării acidului lactic de către Lactobacillus
plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, mixul
belgian (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei,
Bifidobacterium breve) şi mixul românesc (Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus) pe mediu model MRS.
Bacteriile s-au adaptat la mediul de fermentaţie (MRS) imediat după adăugarea
inoculului, moment în care a început producţia de acid lactic. La finalul fermentaţiei
(după 78 ore) concentraţia de acid lactic a fost 6.08 g/L pentru Lactobacillus plantarum,
7.92 g/L pentru Bifidobacterium infantis, 6.16 g/L pentru Lactobacillus casei, 6.17 g/L
pentru Bifidobacterium breve, 7.12 g/L pentru mixul belgian (Lactobacillus plantarum,
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve) şi 6.97 g/L pentru
XXVI
mixul românesc (Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus). Producţia maximă de lactat a fost înregistrată după trei ore de fermentaţie şi
înainte de 6 ore de fermentaţie.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
48 52 72 78Time [h]
Acet
ic a
cid
[g/L
-1]
L.plantarumL.caseiB.breveBelgian MixRomanian Mix
Fig.13. Durata de formare a acidului acetic de cãtre bacteriile probiotice pe mdiu de
culturã MRS. Fermentaţia a fost realizatã în vas conic de 250 ml cu un volum de
fermentaţie de 100 ml, la 37°C, şi 200rpm
Fig.13. Time course of acetic acid formation in discontinuous fermentation of the
Probiotic Strains on model MRS media. The fermentations were conducted in a 250 ml
flask with 100 ml working volume at 37°C, and 200 rpm
Cea mai mare cantitate de acid acetic (0.691 g/L) a fost înregistratã de cãtre mixul
belgian de bacterii (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus
casei, Bifidobacterium breve), iar minimul acetic a fost înregistrat de către fermentaţia
care a utilizat Lactobacillus plantarum ca bacterie şi a fost de 0.263 g/L. Lactobacillus
casei şi Bifidobacterium breve produc cantităţi de acid acetic aproape de 0.51 g/L. Mixul
românesc acumulează 0.56 g/L acid acetic (Fig.13). Menţionãm că Bifidobacterim
infantis produce numai acid lactic iar producţia de acid acetic începe în toate
fermentaţiile după 48 de ore.
XXVII
2 4 6 8 10 12 14
50
100
150
200
250
300
350
400
450
78 h 72 h 52 h 48 h23 h
6 h 3 h
Abs
orba
nce
(A.U
)
Time (min)
Lactobacillus plantarum
2 4 6 8 10 12 14
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Abso
rban
ce (A
.U)
Time (min)
78 h 72 h 52 h
48 h23 h 6 h 3 h
Bifidobacterium infantins
2 4 6 8 10 12 14
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
78 h 72 h 52 h
48 h23 h 6 h 3 h
Abso
rban
ce (A
.U)
Time (min)
Lactobacillus casei
2 4 6 8 10 12 14
50
100
150
200
250
300
350
400
450
78 h 72 h 52 h
48 h23 h 6 h 3 h
Abso
rban
ce (A
.U)
Time (min )
Bifidobacterium breve
2 4 6 8 10 12 140
100
200
300
400
78 h 72 h 52 h
48 h23 h 6 h 3 h
Abso
rban
ce (A
.U)
Time (min)
Belgian Mix
4 6 8 10 12 14 16
0
100
200
300
400
78 h 72 h 52 h
48 h23 h 6 h 3 h
Abso
rban
ce (A
.U)
Time (min)
Romanian Mix
Fig.14.Cromatogramele HPLC ale mediilor fermentate de cãtre Lactobacillus plantarum
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, mixul belgian
(Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium
breve), mixul românesc (Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus) la diferite intervale de fermentaţie.
Fig.14. HPLC Chromatograms of fermented samples by Lactobacillus plantarum
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve Belgian Mix of
bacteria (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei,
Bifidobacterium breve) Romanian Mix of bacteria (Streptococcus thermophilus and
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) at different fermentation time
XXVIII
2 4 6 8 10 12 140
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Romanian Mix
Belgian Mix
B. breveL. caseiB. infantisL.plantarum
Abso
rban
ce (A
.U)
Time (min)
Fig.15. Cromatogramele HPLC ale mediilor fermentate de cãtre Lactobacillus plantarum
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, mixul belgian
(Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium
breve), mixul românesc (Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus) dupã 78 de ore de fermentaţie la 37ºC şi 200rpm
Fig.15. HPLC Chromatograms of fermented samples by Lactobacillus plantarum,
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve Belgian Mix of
bacteria (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei,
Bifidobacterium breve) and Romanian Mix of bacteria (Streptococcus thermophilus and
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) after 78 hours of fermentation at 37ºC,
200rpm
Fig.14, prezintă cromatogramele HPLC pentru fiecare probă recoltată din fiecare
fermentaţie după 3, 6, 23, 48, 52, 72, 78 ore. Notăm că în crmatogramele probelor
fermentaţiei carea a utilizat bacteria Bifidobacterium infantins este prezent numai peak-ul
specific acidului lactic, localizat la tR= 5.077 min, în timp ce în cazul celorlalte
fermentaţii apare atât peak-ul specific pentru acid lactic cât şi cel specific acidului acetic,
localizat la 5.25 min.
În Fig.15 sunt reprezentate cromatogramele pentru fiecare fermentaţie la finalul
procesului (după 78 de ore) şi pune în evidenţă faptul că fermentaţia produsă de către
mixul belgian (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei,
XXIX
Bifidobacterium breve) acumulează cea mai mare cantitate de acid lactic (7.12 g/L).
Spectroscopia FTIR
500 1000 1500 2000 2500 3000
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
Belgian Mix
Romanian Mix
B.breve
L.caseiB.infantis
L.plantarum
Abso
rban
ce (A
.U)
W avelenght (nm)
Fig.16. Amprentele FTIR ale bacteriilor: Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium
infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, mixul belgian şi mixul românesc
(Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)
Fig.16. FTIR Fingerprint of Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis,
Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve Belgian mix, and Romanian mix of bacteria
(Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)
1000 1500 20000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
78h
BacteriaFingerprint
MRS Broth
Abs
orba
nce
(A.U
)
Wavelenght (nm)
Bifidobacterium infantis
Fig.17. Amprenta FTIR a Bifidobacterium infantins, bulion MRS, şi mediu fermentat la
finalul procesului de fermentaţie
Fig.17. FTIR Fingerprint of Bifidobacterium infantins, MRS broth, and fermented sample
at the end of the fermentation process
XXX
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
Abso
rban
ce (A
.U)
Wavelenght (cm-1)
MRS Broth 3h 6 h 23 h 48 h 52 h 72 h 78 h
Lactobacillus plantarum
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
MRS Broth 3h 6 h 23 h 48 h 52 h 72 h 78 h
Abso
rban
ce (A
.U)
Wavelenght (cm-1)
Bifidobacterium Infantis
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
MRS Broth 3h 6 h 23 h 48 h 52 h 72 h 78 h
Abso
rban
ce (A
.U)
Wavelenght (cm-1)
Lactobacillus casei
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
MRS Broth 3h 6 h 23 h 48 h 52 h 72 h 78 h
Abs
orba
nce
(A.U
)
Wavelenght (cm-1)
Bifidobacterium breve
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
MRS Broth 3h 6 h 23 h 48 h 52 h 72 h 78 h
Abso
rban
ce (A
.U)
Wavelenght (cm-1)
Belgian Mix
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
MRS Broth 3h 6 h 23 h 48 h 52 h 72 h 78 h
Abs
orba
nce
(A.U
)
Wavelenght (cm-1)
Romanian Mix
Fig.18. Amprentele FTIR ale mediilor fermentate de cãtre Lactobacillus plantarum
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, mixul belgian,
mixul românesc (Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus) la intervale diferite de fermentaţie
Fig.18. FTIR Fingerprint of fermented samples by Lactobacillus plantarum
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, Belgian Mix,
Romanian Mix of bacteria (Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus) at different fermentation time
XXXI
600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 17000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Abs
orba
nce
a.u
W avenum ber cm -1
Belgian Mix
B . breve
B . in fantis
L .p lantarum
L.casei
Fig.19 Amprentele FTIR ale probelor fermentate (la finalul procesului de fermentaţie-
dupã 78h) de cãtre Lactobacillus plantarum Bifidobacterium infantis, Lactobacillus
casei, Bifidobacterium breve, şi mixul belgian (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium
infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve)
Fig.19. FTIR Fingerprint of fermented samples (at the end of the processes-after 78h) by
Lactobacillus plantarum Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium
breve, Mix of bacteria (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus
casei, Bifidobacterium breve)
Au fost identificate două benzi specifice bacteriilor probiotice în zona 3000 cm-1
(~ 2845 şi ~ 2929 cm-1) (Fig.16).Aceste benzi sunt caracteristice grupării metil şi
drupului metilen (Kummerle et al., 1998; Kansiz et al., 1999). Acestea sunt caracteristice
acizilor graşi din peretele celular al bacteriilor (Schmitt and Flemming, 1998). Semnalul
de la 1730 cm-1este specific grupării C=O, caracteristic lipidelor şi acizilor graşi (Kansiz
et al., 1999). Zona 1790 - 1310 cm-1, specifică grupării C=O este caracteristică aminelor
legate de proteine (prima bandă aminică ~1620 cm -1), deformarea N-H a aminelor legate
de proteine (a doua bandă aminică ~1530 cm-1), şi CH3-, CH2- deformaţii asimetrice şi
simetrice ale proteinelor (~ 1430 and ~1372 cm-1). Zona de amprentă este localizată
(Fig.19) între 1300 - 900 cm-1 şi este caracteristică vibraţiilor proteinelor, acizilor
nucleici, membranei celulare şi compuşilor membranei celulare (Goodacre et al., 1996);
XXXII
şi pot fii legate între ele sau de alte grupări funcţionale. Benzile caracteristice bacteriilor
din zona de amprentă includ grupările P=O specifice acizilor nucleici de la ~1190 and ~
1030 cm-1, şi C-O-C vibraţiilor polizaharidelor (1200-900 cm-1) asociate cu
glicopeptidele şi lipopolizaharidele din peretele membranei celulare. Fig.18, prezintã
semnalul specific acidului lactic localizat la 1121 cm-1 şi un semnal pentru acidul acetic
localizat la 1655 cm-1. Fig. 17 ilustrează prezenţa acidului lactic la 1121 cm-1 şi absenţa
acidului acetic la 1655 cm-1 în ultima probã prelevată din fermentaţia indusă de cãtre
Bifidobacterium infantis.
Viabilitatea bacteriană
Fig.20. Evidenţierea coloniilor de bacterii probiotice pe agar MRS
Fig.20. Strains of Probiotic Bacteria on MRS Agar
Viabilitatea bacteriană în toate modelele experimentale influenţează începutul
procesului fermentativ. Vitalitatea bacteriilor indicã (Fig.21) perioada cea mai mare de
creştere la 23 ore când vitalitatea a fost de 272 % pentru Lactobacillus plantarum, 309%
pentru Bifidobacterium infantis, 287 % pentru Lactobacillus casei, 271% pentru
Bifidobacterium breve, 311% pentru mixul belgian (Lactobacillus plantarum,
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve) şi 316 % pentru
mixul românesc (Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus).
XXXIII
0
50
100
150
200
250
300
350
0 3 6 23 48 52 72 78time[h]
Vita
lity
[%]
L.plantarumB.infantisL.caseiB. breveBelgian MixRomanian Mix
Fig.21. Viabilitatea bacteriilor Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis,
Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve), mixul belgian (Lactobacillus plantarum,
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve) mixul românesc
(Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) pe durata
fermentaţiei
Fig.21. Viability of Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus
casei, Bifidobacterium breve, Belgian Mix of bacteria (Lactobacillus plantarum,
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve) Romanian Mix of
bacteria (Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)
during fermentation processes
După 78 de ore de fermentaţie (la finalul procesului) vitalitate bacteriană scade
pentru fiecare bacterie utilizată. Astfel, viabilitatea a fost de 56% pentru Lactobacillus
plantarum, 89% pentru Bifidobacterium infantis, 56% pentru Lactobacillus casei, 42%
pentru Bifidobacterium breve, 79% pentru mixul belgian (Lactobacillus plantarum,
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve ), şi 65% pentru
mixul românesc (Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus).
XXXIV
CONCLUZII
• Mixul belgian (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus
casei, Bifidobacterium breve) acumulează după 78 ore de fermentaţie 7.12g/L de
acid lactic urmat de Bifidobacterium infantis 7.92 g/L. Producţia de acid acetic
începe in toate experimentele după 48 de ore de fermentaţie, insã Bifidobacterium
infantis produce numai acid lactic.
• Mixul belgian (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus
casei, Bifidobacterium breve) acumulează cea mai mare cantitate de acid acetic,
aproximativ 0.69 g/L în timp ce Lactobacillus plantarum cea mai mică cantitate
0.263 g/L.
• Spectoscopia FTIR a identificat două benzi specifice bacteriilor probiotice
localizate în zona 3000 cm-1 (~ 2845 şi ~ 2929 cm-1). Au fost identificate semnale
specifice acidului lactic la 1121 cm-1 şi acidului acetic la 1655 cm-1.
• Vitalitatea bacteriană atinge valori maxime după 23 de ore de fermentaţie, când
procentul maxim de vitalitate înregistrat a fost de 316 % pentru mixul românesc de
bacterii (Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus).
XXXV
IV. CARACTERIZAREA DIFERITELOR TIPURI DE CAPSULE CARE CONŢIN BACTERII PROBIOTICE
MATERIALE ŞI METODE Pregătirea microorganismelor. Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus au fost achiziţionate de la MTC, Romania ca mix de bacterii,
Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterim
breve, mixul lor, au fost achiziţionate de la THT SA Science Park de la Universitatea
Gembloux, Belgia. Câte un vial de bacterii liofilizate a fost, separat, inoculat în 5 ml
bulion MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) (Merck, Germany) şi incubat la 37°C pentru 24h
iar apoi sub-cultivat în 95 mL bulion şi incubat în aceleaşi condiţii. Suspensia bacteriană
obţinutã a fost centrifugată la 3000 rpm pentru 5 min la 25°C, iar peletul a fost spălat de
două ori cu soluţie de peptonă sterilă 0.1% (Merck, Germany) şi re-suspendată în bulion
care a fost divizat pentru fiecare bacterie, în probe a câte 30 ml, având densitatea de
109ufc/ml.
Microîncapsularea bacteriilor. Pudra sterilă de alginat (AG) (Promova Biopolymer,
Norway) şi chitosan (CH) (Sigma Aldrich, Germany) a fost dizolvată în apă pură-sterilă,
şi respectiv 0.7% soluţie acid acetic pentru chitosan, utilizând trei concentraţii diferite de
matrici AG şi CH (2%, 1.5% şi 1% w/v). Volumul de 120 mL din fiecare soluţie de AG
şi CH a fost amestecat cu 30 mL suspensie bacteriană cu densitatea de 109cfu mL-1.
Emulsia a fost pipetată în baia de întărire sterilă formată din soluţie de CaCl2 2% (w/v)
(Sigma Aldrich, Germany) pentru AG şi baie sterilă de tripolifostat de sodiu (NaTPP 5%)
(w/v) (Sigma Aldrich, Germany) pentru CH, cu ajutorul unei seringi sterile (0.2 x 6 mm).
Capsulele obţinute au fost filtrate baie după 30 de minute şi spălate de două ori cu apă
distilată.
Caracterizarea morfologică a capsulelor. Aria, perimetrul, sfericitatea, diametrul şi
compactitatea fiecărei capsule a fost măsurată separat, cu ajutorul software-ului
UTHSCSA (University of Texas Health Science Center, San Antonio) Image Tool, după
colorarea lor cu albastu de metilen.
Analiza FTIR. Spectrele FTIR ale capsulelor de AG şi CH cu bacterii ( AG B, CH B) şi
fără bacterii (AG C, CH C) au fost realizate cu ajutorul spectrometrului Schimatzu IR
XXXVI
Prestige-21 cu transmisie atenuantă orizntală. Fiecare spectu a fost înregistrat de la 4000
la 900 cm-1. Au fost realizate câte trei spectre, medie a 128 de scanări, pentru fiecare
variantă de capsulă şi pentru suspensia bacteriană (BF) la temperatura camerei.
Analiza statistică. Analiza variantelor (ANOVA) şi testul multiplu Duncan a fost utilizat
la interpretarea rezultatelor. Semnificaţia diferenţei a fost stabilită la 5% (P<0.05). Datele
statistice au fost prelucrate cu ajutorul programului Graph Pad Version 4.0 (Graph Pad
Software Inc; San Diego, CA, USA).
REZULTATE ŞI DISCUŢII
Caracterizarea capsulelor
Fig.22 prezintă caracteristicile morfologice ale capsulelor de alginat (AG) şi
chitosan (CH) cu conţinut identic de bacterii (0.2% bacterii liofilizate) de diferite
concentraţii (2, 1.5, 1%). Prin analiza statistică utilizând testul Duncan când P<0.05,
menţionăm diferenţe între media valorilor ariei, perimetrului, sfericităţii, compactităţii în
funcţie de concentraţia matricei. Când media valorilor a fost semnificativ diferită la
(P<0.05) au fost atribuite diferite litere (a-b, a-bc, a-c, b-c, c-d).
S-au obţinut capsule aproape sferice prin pipetarea emulsiei AG- bacterie în baia
de întărire, mărimea capsuelor fiind dependentă de concentraţia matricii. În timp ce
concentraţia de alginat AG 1.5 şi 2% dau dimensiuni similare capsulelor, capsulele de
AG 1% au fost semnificativ mai mici (2.7 mm2 aria, 6.6 mm perimetrul şi 1 mm
diameterul, vs. 4.2 mm2 aria, 8.2 mm perimeterul şi 1.5 mm diameterul pentru capsulele
de AG2%). Comparând capsulele de AG şi CH (Fig.23) de concentraţii identice precizăm
că diametrul capsulelor de CH a fost semnificativ mai mic. În grupul capsulelor de CH,
deasemenea, concentraţiile de 2 şi 1.5% dau dimensiuni semnificativ mai mari faţă de
1%. Cu privire la compactitate şi sfericitate, capsulele au prezentat aceleaşi valori,
independent de tipul şi concentraţia matricei. Aceste rezultate corespund cu rezultatele
studiilor anterioare cu privire la morfoligia capsulelor cu conţinut de ulei (Trif şi colab.,
2008). Fig.24A incică faptul că bacteriile au fost încapsulate în matrici iar Fig 24B
prezintă învelisul exterior al capsulei de AG 2%.
XXXVII
Area Perimeter Roundness Diameter Compactness
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
abb
dcdcab aaa
aa
bbababaa
d
bc
bc
b
aa
dcc
b
aa
(%) (mm)(mm)(mm)(mm2)
AG 2% AG 1.5% AG 1% CH 2% CH 1.5% CH 1%
Fig.22. Reprezentarea comparativă a caracteristicilor capsulelor (exprimate ca valoare
medie a ariei, perimetrului, sfericitãţii, diametrului şi compactitãţii), formate din alginate
(AG) şi chitosan (CH) de diferite concentraţii (2, 1.5 şi 1%). Valorile semnificativ
diferite (P<0.05) sunt notate cu litere diferite (a-b, a-bc, a-c, b-c, c-d, bc-d)
Fig.22. Comparative representation of beads characteristics (expressed as mean values of
bead area, perimeter, roundness, diameter or compactness) when different concentrations
(2, 1.5 or 1%) of alginate (AG) and chitosan (CH) were used to encapsulate bacteria
(0.2% bacterial dry mass in the beads). When mean values were significantly different
(P<0.05) different letters were applied (a-b, a-bc, a-c, b-c, c-d, bc-d)
ALGINATE 2% CHITOSAN 2% AG:XA AG:GU
Fig.23. Capsule cu bacterii probiotice: AG 2%, CH 2%, AG: XA (0.75%:0.75%), AG:
GU (0.75%:0.75%). Scara este exprimatã in cm
Fig.23. Beads containing probiotic bacteria: AG 2%, CH 2%, AG: XA (0.75%:0.75%),
AG: GU (0.75%:0.75%) The scale of capsules measurement is exposed in cm
XXXVIII
A B
Fig.24A. Imagine microscopicã a capsulei de alginat2% cu bacterii probiotice (40*100
µm)
Fig.24A. Microscopic overlook of entrapped probiotic bacteria in alginate 2% matrix
(40*100 µm)
Fig.24B. Imagine microscopicã a exteriorului capsulei de alginat 2% (5*100 µm)
Fig.24B. Microscopic overlook of alginat 2% capsule (5*100 µm)
Analiza FTIR
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0.0
0.5
1.0
1.5
Abs
orba
nce
a.u
W avenumber cm-1
BF
AG B
CH B1
2
3
Fig.25. Amprente FTIR a capsulelor de alginat si chitosan cu conţinut de 0.2% bacterii
liofilizate şi suspensia de bacterii în apã (BF) din mixul românesc. Trei zone specifice
notate cu 1, 2, 3, sunt utile pentru a distinge prezenţa bacteriilor in capsule
XXXIX
Fig 25. Comparative FTIR fingerprint of alginate (AG B) and chitosan (CH B) beads
containing 0.2% dry bacterial mass and free bacteria suspension (BF). Three regions
marked 1, 2, 3, can be useful to discriminate the presence of bacteria in the beads.
.
2800 2820 2840 2860 2880 2900 2920 2940 2960 2980
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
Abso
rban
ce a
.u
Wavenumber (cm-1)
CH BAG B
CH C
AG C
B F
1500 1600 1700 1800 1900 20000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Abs
orba
nce
(a.u
)
Wavenumber (cm-1)
BF
AGC
CH C
A B
Fig.26.A. Amprente FTIR comparative (2800-2980 cm-1) ale capsulelor de alginat şi
chitosan cu bacterii (CH B, AG B) vs. capsule martor (CH C, AG C) vs. bacterii libere
(BF). Poate fii identificatã prezenţa bacteriilor incorporate în capsule prin semnalele
specifice la 2852 şi 2926 cm-1; semnale atribuite lipidelor din membrana celularã
B. Spectre comparative (1500-2000 cm-1) ale capsulelor martor de alginat şi chitosan (CH
C, AG C) şi spectrul bacteriilor libere din mixul românesc (BF). Sunt identificate
semnale specifice esterilor acizilor graşi din bacterii (1750 cm-1).
Fig.26.A. Comparative FTIR fingerprint (2800- 2980 cm-1) of chitosan and alginate
beads which incorporated bacteria (CH B, AG B) vs. control beads (CH C, AG C) and vs.
free bacteria (BF). One can identify the presence of bacteria inside the beads at 2852 and
2926 cm-1, peaks which can be attributed to membrane lipids.
B. Comparative spectra (1500- 2000 cm-1) of chitosan and alginate control beads (CH C,
AG C) and free bacteria fingerprint (BF). One can identify a peak specific to bacterial
fatty esters (at 1750 cm-1).
Fig.25 prezintă spectrele comparative FTIR ale mixului românesc încapsulat în
alginat (AG B) şi chitosan (CH B) vs. bacterii libere (BF) pentru întreaga zonă (900-4000
cm-1). S-au identificat 3 zone specifice (marcate cu 1, 2 şi 3) specifice pentru capsule şi
XL
matrici (900-1300 cm-1) şi discriminarea prezenţei bacteriilor în capsule prin identificarea
benzilor specifice la 2840 şi 2950 cm-1, după cum se poate vedea în Fig.26 A şi B.
Regiunea de amprentă (marcată 1 în Fig.25) este localizată între 1300 şi 900 cm-1
şi caracterizează specificitatea matricei pentru AG şi CH (C-O-C ) dar şi vibraţii specifice
proteinelor bacteriene, acizilor nucleici, componenţilor membranei celulare (Goodacre şi
colab., 1996; Kansiz şi colab., 1999; Choo-Smith şi colab., 2001; Filip şi Hermann,
2001).
Bacteriile, încapsulate în CH şi AG prezintă două benzi specifice la 2852 şi la
2926 cm-1 (Fig.26A), atribuite gruparii metil şi metilen specifice lipidelor membranare
după cum a relatat şi Kummerle şi colab. (1998) şi Kansiz şi colab. (1999). Acestea sunt
caracteristice acizilor graşi din peretele celular (Schmitt şi Flemming, 1998).
Deasemenea, semnalul de la 1750 cm-1 (Fig.26B) este atribuit grupării C=O cu vibraţii de
întindere ale acizilor graşi şi ale lipidelor esterificate (Kansiz şi colab., 1999).
CONCLUZII
• Concentraţia de alginat, chitosan, alginat:gumă xanthan, alginat:gumă guar
influenţează diametrul capsulelor, crescând direct proporţional cu concentraţia
matricei (de la 1% la 2%) formându-se capsule mai mari cu diametrul mai mare.
Cei mai buni parametrii au fost înregistraţi de către capsula de AG 2%.
• Amprenta FTIR a bacteriilor încapsulate a fost identificată prin prezenţa celor
două semnale specifice la 2845 şi la 2929 cm-1. Această metodă reprezintă o
modalitate utilă în investigarea acestor tipuri de capsule.
• În capsulele de alginat:gumă guar au fost identificaţi markeri specifici pentru Lb.
plantarum şi B. infantis în timp ce pentru capsulele de alginat: gumă xanthan, a
fost identificat semnalul specific lui B. infantis. Nu s-au evidenţiat diferenţe
majore între amprentele capsulelor de AG şi CH cu şi fără bacterii.
XLI
V. SUPRAVIEŢUIREA BACTERIILOR PROBIOTICE- ÎNCAPSULATE ÎN DIFERITE MATRICI-ÎN SUCUL GASTO-INTESTINAL
MATERIALE ŞI METODE Viabilitatea bacteriilor încapsulate în suc gastic simulat. În vederea realizării
experimentelor s-a aplicat metoda descrisă de către Rao şi colab, (1989). 1g din fiecare
tip de capsulă a fost dispersat în 10 mL suc gastic simulat steril (0.08 M HCl conţinând
0.2% NaCl, pH 1.5) şi incubat la 37°C pentru 30, 60, 90, şi 120 min. După fiecare
interval de incubare, capsulele au fost separate, şi spălate cu soluţie peptonă 0.1%. Pentru
a verifica şi cuantifica viabilitatea bacteriană, capsulele au fost dezintegrate în soluţie de
citrat de sodiu şi numărate după incubarea plăcilor cu mediu agar MRS la 37°C pentru 48
h. Bacteriile viablie au fost numărate în triplicat şi exprimate ca medie în log cfu mL-1.
În paralel, 1 mL de bacterii libere (BF) au fost amestecate cu 10 mL suc gastric
simulat (pH 1.5), incubate la 37°C iar probele au fost prelevate la 30, 60, 90 şi 120 min.
Viabilitatea a fost realizată după cum am menţionat mai sus. Pentru a compara statistic
viabilitatea bacteriană din capsule, a fost calculată valoarea D (timpul de reducere
decimal) (DV) reprezentând timpul (min) necesar pentru a distruge 90% sau un ciclu
logaritic al bacteriilor.
Supravieţuirea bacteriilor încapsulate în suc intestinal simulat după o
incubare preliminară în suc gastic simulat. 1g din fiecare tip de capsulă a fost incubat
în 10 mL suc gastric simulat steril (0.08 M HCl conţinut 0.2% NaCl, pH 1.5) pentru 60
min la 37°C. După incubare, capsulele au fost spălate cu soluţie de NaOH 1N iar apoi
incubate la 37°C (pentru 30, 60, 90 şi 120 min) în 9 mL suc intestinal simulat steril (0.05
M KH2PO4, pH 7.25) conţin 0.6% săruri biliare sterile (ox gall; Sigma-Aldrich),
aplicând metoda descrisă de Krasaekoopt şi colab, (2004). După incubare rezultă o
suspensie din care 1 mL a fost inoculat pe mediu agar MRS şi incubat pentru 48 ore la
37°C, pentru determinarea viabilitãţii, dupã cum am menţionat mai sus. Pentru a calcula
statistic viabilitatea, a fost calculată valoarea D (timpul de reducere decimal) (DV)
reprezentând timpul (min) necesar pentru a distruge 90% sau un ciclu logaritic al
bacteriilor.
XLII
Numãrarea bacteriilor încapsulate. 1g de capsule au fost lichefiate în 99 ml soluţie
citrat de sodiu steril de concentrţie 1% (w/v) (Merck, Germany) la pH 6.0 prin agitare la
temperatura camerei pentru 20 min. Bacteriile au fost numãrate în triplicat.
Analiza statisticã. Analiza variantelor (ANOVA) şi testul multiplu Duncan a fost
utilizat la interpretarea rezultatelor. Semnificaţia diferenţei a fost stabilită la 5% (P<0.05).
Datele statistice au fost prelucrate cu ajutorul programului Graph Pad Version 4.0 (Graph
Pad Software Inc; San Diego, CA, USA).
REZULTATE ŞI DISCUŢII
Supravieţuirea bacteriilor încapsulate în suc gastric simulat
Densitatea de celule înainte de încapsulare a fost de 8.49-8.64 log cfu mL-1 pentru
Lactobacillus plantarum, 9.48-9.6 log cfu mL-1 pentru Bifidobacterium infantis, 9.24-
9.48 log cfu mL-1 pentru Lactobacillus casei, 8.11-8.39 log cfu mL-1 pentru
Bifidobacterium breve, 9.4-9.70 log cfu mL-1 pentru mixul blegian (Lactobacillus
plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve) şi 9.51-
9.61 log cfu mL-1 pentru mixul românesc Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus. În urma încapsulării bacteriilor densitatea celulară a fost
de 8.53-8.62 log cfu mL-1 pentru Lactobacillus plantarum, 9.59-9.49 log cfu mL-1 pentru
Bifidobacterium infantis, 9.25-9.49 log cfu mL-1 pentru Lactobacillus casei, 8.1-8.38 log
cfu mL-1 pentru Bifidobacterium breve, 9.39-9.69 log cfu mL-1 pentru mixul belgian
(Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium
breve) şi 9.49-9.60 log cfu mL-1 pentru mixul românesc Streptococcus thermophilus şi
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, pentru tpoate tipurile de capsule. Rezultatele
nu prezintã o reducere semnificativã a viabilitãţii, 99.8% dintre baceterii fiind încapsulate
(Fig.27 şi 30).
XLIII
0 30 60 90 1203.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
Free Cells
AG 1%AG 1.5%AG 2%
CH 1%CH 1.5%CH 2%
Lb.plantarum
0 30 60 90 120
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
Free Cells
AG 1%AG 1.5%AG 2%
CH 1%CH 1.5%CH 2%
B .infantis
Dv = 76.43 ± 7.15aDv = 88.23 ± 6.55a
Dv = 47.24 ± 6.21b
Dv = 39.21 ± 0.7c
Dv = 37.97 ± 0.9c
Dv = 38.21 ± 1.19c
Dv = 38.21 ± 0.7c
Dv = 20.97 ± 1.57d
AG : GUAG: XA
Dv = 53.57 ± 11.5b
Dv = 49.38 ± 2.6b
time(min)
log
ufc/
ml
Dv = 51.94 ± 3.4b
Dv = 40.13 ± 0.7c
Dv = 34.69 ± 1.49c
Dv = 39.34 ± 2.1c
Dv = 28.43 ± 3.7d
Dv = 23.62 ± 2.7e
AG : GUAG: XA
Dv = 55.29 ± 8.54b
Dv = 39.73 ± 6.89c
time(min)
log
ufc/
ml
0 30 60 90 1203.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
Free Cells
AG 1%AG 1.5%AG 2%
CH 1%CH 1.5%CH 2%
Lb.casei
0 30 60 90 120
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
Free Cells
AG 1%AG 1.5%AG 2%
CH 1%CH 1.5%CH 2%
B.breve
Dv = 61.53 ± 4.15a
Dv = 39.6 ± 9.16b
Dv = 30.16 ± 1.7c
Dv = 30.15 ± 6.4c
Dv = 29.05 ± 2.89c
Dv = 24.19 ± 2.13d
Dv = 19.6 ± 12.7e
AG : GUAG: XA
Dv = 55.55 ± 8.4a
Dv = 31.83 ± 1.8c
time(min)
log
ufc/
ml
Dv = 59.11 ± 5.5a
Dv = 42.55 ± 1.24b
Dv = 29.7 ± 2.9c
Dv = 24.84 ± 3.41cDv = 32.08 ± 6.7c
Dv = 32.34 ± 1.19c
Dv = 20.94 ± 1.7e
AG : GUAG: XA
Dv = 45.45 ± 3.6b
Dv = 32 ± 1.21c
time(min)
log
ufc/
ml
0 30 60 90 1203.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
Free Cells
AG 1%AG 1.5%AG 2%
CH 1%CH 1.5%CH 2%
Dv= 75.47 ± 4.5a
Dv= 51.72 ± 3.21b
Dv = 40.95 ± 1.13c
Dv= 54.79 ± 1.44b
Dv= 40.26 ± 1.9c
Dv = 41.37 ± 2.7c
Dv= 19.2 ± 2.2d
AG : GUAG: XA
Dv= 57.97 ± 6.5b
Dv= 40.54 ± 1.9c
time(min)
log
ufc/
ml
0 30 60 90 120
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
Free Cells
AG 1%AG 1.5%AG 2%
CH 1%CH 1.5%CH 2%
Belgian Mix Romanian Mix
Dv = 71.38 ± 9.5a
Dv= 63.89 ± 12.31b
Dv= 61.91 ± 9.42b
Dv= 54.97 ± 9.4c
Dv= 38.71 ± 4.2d
Dv= 38.60 ± 0.3d
Dv = 23.12 ± 2.47e
AG:GU
ufc/
ml
log
AG:XA
Dv = 38.09 ± 4.2d
Dv = 37.82 ± 4.2d
time(min) Fig.27. Dinamica de creştere pentru Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis,
Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, mix belgian şi mix românesc (log ufc/ml) la
intervale diferite (30, 60, 90, 120 min.) dupã incubarea capsulelor (AG, CH de concetraţii
2, 1.5 şi 1%, gumã guar: alginat 0.75:0.75, gumã xanthan: alginat 0.75:0.75) în sucul
XLIV
gastric simulat (pH 1.5). Valorile sunt exprimate ca medie ± eroarea standard (n=3),
comparativ cu celulele libere. Timpul de reducere decimal (DV-min) este prezentat pentru
fiecare variantã în parte. Valoarile Dv semnificativ diferite (P<0.05) sunt notate cu litere
diferite
Fig.27. Dynamic of Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus
casei, Bifidobacterium breve, Belgian mix and Romanian Mix (log ufc/ml) at different
periods (after 30, 60, 90, 120 min.) after incubation of beads containing bacteria cells
(AG or CH at 2, 1.5 or 1%, guar gum: alginate 0.75:0.75, xanthan gum: alginate
0.75:0.75) in simulated gastric juice (pH 1.5). Values are expressed as average ± standard
error of triplicate (n=3), comparatively with free cells. The decimal reduction time values
(DV-min) are represented for each variant. DV values which are significantly different
(P<0.05) are marked by different letters
Pentru a determina viabilitatea bacterianã pe timpul expunerii la pH scãzut,
mimând condiţiile din stomac, s-a utilizat soluţie de HCl pentru a determina matricea şi
concentraţia de capsule (AG, CH, şi AG: GU, AG: XA) care protejează supravieţuirea
bacterianã în acest mediu, similar cu sistemul digestiv. Supravieţuirea bacterianã a fost
exprimatã ca valoare destructivã D (timpul de reducere decimal) (DV) reprezentând
timpul (min) necesar pentru a distruge 90% sau un ciclu logaritic al bacteriilor (Fig.27 şi
30). Densitatea bacterianã iniţialã a fost de 3.2 ± 0.1 x 108- 4.3 ± 0.7 x 108 pentru
Lactobacillus plantarum 3.1 ± 0.1 x 109- 3.9 ± 0.8 x 109 pentru Bifidobacterium infantis,
1.8 ± 0.1 x 109- 3.1 ± 0.1 x 109 pentru Lactobacillus casei, 1.3 ± 0.3 x 108- 2.4 ± 0.2 x 108
pentru Bifidobacterium breve, 2.5 ± 0.4 x 109- 4.9 ± 0.1 x 109 pentu mixul belgian
(Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium
breve) şi 3.1 ± 0.3 x 109- 4.8 ± 0.2 x 109 pentru mixul românesc (Streptococcus
thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) iar supravieţuirea bacterianã
în toate variantele de capsule AG, CH, AG:GU, AG:XA a fost semnificativ (P<0.05),
superioarã bacteriilor libere.
XLV
AG 1%CH 1%
AG 1.5%
CH 1.5%
AG 2%CH 2%
AG:G
UAG:XA
Free Cell
s0
2
4
6
8 ab b
cb
c
d
c c
Lactobacillus plantarumLo
g cf
u m
L-1
AG 1%
CH 1%
AG 1.5%
CH 1.5%
AG 2%CH 2%
AG:G
UAG:XA
Free Cell
s0
2
4
6
8
10a
b bc c
ed
c
Bifidobacterium infantis
c
Log
cfu
mL-1
AG 1%
CH 1%
AG 1.5%
CH 1.5%
AG 2%CH 2%
AG:G
UAG:XA
Free Cell
s0
2
4
6
8 aa
cc c
ed
c
Lactobacillus casei
b
Log
cfu
mL-1
AG 1%
CH 1%
AG 1.5%
CH 1.5%
AG 2%CH 2%
AG:G
UAG:XA
Free Cell
s0
2
4
6
8
ab b
c c
e
cd
Bifidobacterium breve
cLo
g cf
u m
L-1
AG 1%CH 1%
AG 1.5%
CH 1.5%
AG 2%CH 2%
AG:G
UAG:XA
Free Cells
0
2
4
6
8
10a
b bc c
d
c c
Belgian Mix
b
Log
cfu
mL-1
AG 1%
CH 1%
AG 1.5%
CH 1.5%
AG 2%CH 2%
AG:G
UAG:XA
Free Cells
0
2
4
6
8
10a
a abc c
d
c c
Romanian Mixa
Log
cfu
mL-1
Fig.28. Efectul concentraţiei matricei asupra supravieţuirii bacteriilor [Lactobacillus
plantarum Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, mixul
belgian (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei,
Bifidobacterium breve) mixul românesc (Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus)] dupã expunerea condiţiilor sucului gastric simulat.
XLVI
Valorile cu aceleaşi litere nu sunt semnificativ diferite (P>0.05)
Fig.28.Effect of beads type concentration on survival of strains [Lactobacillus plantarum
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, Belgian Mix of
bacteria (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei,
Bifidobacterium breve) Romanian Mix of bacteria (Streptococcus thermophilus and
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)] under simulated gastric conditions. Values
with the same letters are not significantly different (P>0.05)
Fig.28 prezintã difereţe semnificative (P<0.05) pentru supravieţuirea lui
Lactobacillus plantarum în capsula de AG 2% (7.00 log cfu mL-1) vs. celelalte capsule, şi
diferenţe nesemnificative (P>0.05) între supravieţuirea bacteriei în AG 1% (6.07 log cfu
mL-1) vs. AG 1.5% (6.17 log cfu mL-1), CH 2% (6.38 log cfu mL-1) şi CH 1 % (5.36 log
cfu mL-1) vs. CH 1.5% (5.47 log cfu mL-1) vs. AG:GU (5.57 log cfu mL-1) vs. AG: XA
(5.07 log cfu mL-1). Supravieţuirea lui Bifidobacterium infantis în capsulele de AG 2%
prezintã diferenţe semnificative (P<0.05) (8.23 log cfu mL-1) vs celelalte capsule, şi
diferenţe nesemnificative (P>0.05) între AG 1% (6.47 log cfu mL-1) vs. CH 1 % (6.51 log
cfu mL-1), CH 1.5% (6.07 log cfu mL-1), AG: XA (6.44 log cfu mL-1), and AG 1.5%
(7.25 log cfu mL-1) vs. CH 2% (7.38 log cfu mL-1).
Diferenţe semnificative au fost înregistrate între toate tipurile de capsule şi
supravieţuirea bacteriilor libere (4.49 log cfu mL-1). Capsulele cu Lactobacillus casei nu
prezintã diferenţe între protecţia capsulei de AG 1.5% (7.25 log cfu mL-1) vs. capsula de
AG 2% (7.54 log cfu mL-1), dar diferenţe semnificative faţã de resul matricilor. Capsulele
cu Bifidobacterium breve ilustreazã diferenţe semnificative între viabilitatea în capsulele
de AG 2% şi restul capsulelor. Mixul belgian încapsulat prezintã diferenţe semnificative
între viabilitatea bacteriană în capsulele de AG 2% vs. celelalte variante. Mixul românesc
încapsulat prezintã diferenţe semnificative (P<0.05) între protecţia capsulelor de AG 1%
(7.66 log cfu mL-1) vs CH 1% (6.3 log cfu mL-1), AG 1.5% (7.72 log cfu mL-1) vs CH
1.5% (6.4 log cfu mL-1) şi diferenţe nesemnificative (P>0.05) pentru capsula de AG 2%
(8 log cfu mL-1) şi CH (7.3 log cfu mL-1).Diferenţe semnificative s-au înregistrat între
toate variantele de capsule şi bacterii libere (4.7 log cfu mL-1) în timp ce diferenţe
nesemnificative s-au înregistrat între capsulele de AG: 1% vs 1.5% vs 2% vs CH 2% şi
XLVII
CH: 1% vs 1.5%.
Rezultatele noastre sugereazã cã bacteriile neîncapsulate sunt sensibile la mediul
acid (pH 1.5) şi ingerarea lor sub formã liberã duce la reducerea viabilităţii lor (reducere
cu 5 log dupã 2h). Potrivit acestui studiu capsulele de AG 2% asigurã cea mai bunã
protecţie în sucul gastric simulat deoarece compactitatea capsulelor a fost mare, difuzia în
sucul gastric a fost limitatã. Aceasta a protejat celulele de interacţiunra cu sucul gastric,
dupã cum a menţionat şi Murata şi colab., (1999).
L.plan
tarum
B.infan
tis
L.cas
ei
B.brev
e
Belgian
Mix
Roman
ian M
ix0
2
4
6
8
10
Alginate 2% beads
ba b
c
a a
Beads Type in SGJ
Log
cfu
mL-1
Fig.29. Efectul capsulei de alginate 2%, asupra supravieţuirii bacteriilor [Lactobacillus
plantarum Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, mixul
belgian (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei,
Bifidobacterium breve) mixul românesc (Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus)] dupã expunerea în condiţiile sucului gastric simulat.
Valorile cu aceleaşi litere nu sunt semnificativ diferite (P>0.05)
Fig.29. Effect of Alginate 2% on survival of strains [Lactobacillus plantarum
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, Belgian Mix of
bacteria (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei,
Bifidobacterium breve) Romanian Mix of bacteria (Streptococcus thermophilus and
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)] under simulated gastric conditions. Values
with the same letters are not significantly different (P>0.05)
Fig.29. prezintã diferenţele dintre supravieţuirea bacteriilor încapsulate în AG 2%
în condiţiile sucul gastric simulat. Astfel, indicam cã nu existã existã diferenţe
XLVIII
semnificative (P.>0.05) între Bifidobacerium infantis vs. mix belgian vs. mix românesc,
Lactobacillus plantarum vs. Lactobacillus casei dar diferenţe semnificative P<0.05) între
Bifidobacterium breve vs. celelalte bacterii, şi Lactobacillus plantarum şi Lactobacillus
casei vs. Bifidobacerium infantis vs. mix belgian vs. mix românesc.
Supravieţuirea bacteriilor încapsulate în suc intestinal simulat după o incubare preliminară în suc gastic simulat
Densitatea bacterianã înainte de încapsulare a fost de 3.2 ± 0.1 x 108- 4.3 ± 0.7 x
108 pentru Lactobacillus plantarum, 3.1 ± 0.1 x 109- 3.9 ± 0.8 x 109 pentru
Bifidobacterium infantis, 1.8 ± 0.1 x 109- 3.1 ± 0.1 x 109 pentru Lactobacillus casei, 1.3 ±
0.3 x 108- 2.4 ± 0.2 x 108 pentru Bifidobacterium breve, 2.5 ± 0.4 x 109- 4.9 ± 0.1 x 109
pentru mixul belgian (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus
casei, Bifidobacterium breve) şi 3.1 ± 0.3 x 109- 4.8 ± 0.2 x 109 pentru mixul românesc
(Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) iar
supravieţuirea bacteriilor în toate variantele de capsule AG, CH, AG:GU, AG:XA a fost
semnificativ mai mare (P<0.05), faţã de celulele libere. Valoarea D indicã o supravieţuire
mai bunã a bacteriilor încapsulate în alginat şi chitosan faţã de bacteriile libere Astfel
valoarile D ale mixului românesc încapsulat în matrici de AG 1.5% (26.01±1.2 min) vs.
CH 2% (27.05±2.1 min) şi AG 1% (21.86±5.3 min) vs. CH 1% (23.52±2.7 min) vs. CH
1.5 %( 24.06±1.5 min) nu au fost semnificativ diferite. Rezultatele indicã capsula de AG
2% (D-value 34.11±0.9 min) ca fiind cea mai rezistentã matrice la condiţiile mediului
intestinal. În general, valoarile D ale bacteriilor probiotice incubate în sucu gastro-
intestinal au fost mai mici în comparaţie cu valorile obţinute pe sucul gastric. Aceasta
poate fi explicatã prin faptul cã rezistenţa bacteriilor lactice faţã de mediu este influenţatã
de mai mulţi factori din mediu dar şi de cãtre compoziţia membranei citoplasmatice
(Begley şi colab., 2005). Kim şi colab, (2008) au demonstrat cã încapsularea bacteriilor
cu ajutorul matricei de alginat 2% mãreşte rata de supravieţuire a bacteriilor în sucul
intestinal simulat. Transferul secvenţial al bacteriilor libere şi încapsulate dupã 60 de
minute de incubare în sucul gastric simult a dus la reducerea viabilitãţii bacteriene după
prima orã de expunere condiţiilor sucului intestinal.
XLIX
0 30 60 90 1201.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
Lb.plantarum
0 30 60 90 1203.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
B .infantis
Dv = 34.09 ± 3.5a
Dv = 29.48 ± 5.2b
Dv = 23.9 ± 0.7cDv = 24 ± 11.3c
Dv = 23.8 ± 5.9cDv = 23.03 ± 6.7c
Dv = 16.8 ± 6.2d
Dv = 29.19 ± 12.1b
Dv = 25.1 ± 2.5c
AG 2%AG 1.5%
CH 2%CH 1.5%
AG 1%
CH 1%
Free Cells
AG : GUAG: XA
time(min)
log
ufc/
ml
Dv = 40 ± 7.8a
Free Cells
Dv = 27.77 ± 5.7b
Dv = 22.68 ± 4.3cDv = 22.77 ± 1.8c
Dv = 21.39 ± 2.3d
Dv = 18.51 ± 1.2efDv = 18.98 ± 11.2ef
Dv = 28.23 ± 6.5b
Dv = 23.66 ± 7.3c
AG 2%
AG 1%AG 1.5%
CH 1%CH 1.5%CH 2%AG : GUAG: XA
time(min)
log
ufc/
ml
0 30 60 90 1202.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
0 30 60 90 120
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
Lb.casei B.breve
Dv = 38.46 ± 17.1a
Dv = 29.19 ± 3.15b
Dv = 26.43 ± 4.13c
Dv = 25.15 ± 1.3c
Dv = 25.64 ± 1.13c
Dv = 18.12 ± 0.2d
Dv = 24± 1.9c
Dv = 33.99 ± 2.3b
Dv = 26.6 ± 2.12c
AG 2%
CH 2%
AG 1.5%
AG : GU
AG 1%
CH 1.5%CH 1%
Free Cells
AG: XA
time(min)
log
ufc/
ml
D = 72.28 ± 6.15av
Dv= 31.08 ± 1.3c
Dv= 24.89 ± 0.7dDv= 22.9 ± 1.9ef
Dv= 25.47 ± 1.7d
Dv= 21.5 ± 1.2ef
Dv= 29.12 ± 1.1c
Dv= 40.67 ± 3.12b
Dv= 39.34 ± 7.1b
AG 1.5%AG 1%
AG 2%CH 1%CH 1.5%CH 2%AG : GUAG: XAFree Cells
time(min)
log
ufc/
ml
0 30 60 90 1201.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
Free Cells
AG 1%
AG 1.5%
AG 2%
CH 1%
CH 1.5%
CH 2%
0 30 60 90 1202.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
Free Cells
AG 1%AG 1.5%AG 2%
CH 1%CH 1.5%CH 2%
Belgian Mix Romanian Mix
Dv= 40. ± 5.65a
Dv= 24.53 ± 3.23c
Dv= 22.22 ± 1.9d
Dv= 24.14± 5.7c
Dv= 23.12 ± 1.7c
Dv= 16.57 ± 2.2e
Dv= 24.14 ± 1.5c
AG : GU
AG: XA
Dv= 28.7 ± 3.1b
Dv= 27.27 ± 4.12b
time(min)
log
ufc/
ml
Dv = 34.11 ± 0.9a
Dv = 27.05 ± 2.1b
Dv= 26.01 ± 1.2b
Dv= 24.06 ± 1.5c
Dv = 23.52 ± 2.7c
Dv= 21.86 ± 5.3d
Dv = 16.5 ± 3.2e
AG:GUAG:XA
Dv = 23.34 ± 2.5cDv = 24.06 ± 1.5c
time(min)
log
ufc/
ml
Fig.30. Dinamica de creştere pentru Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis,
Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, mix belgian şi mix românesc (log ufc/ml) la
intervale diferite (30, 60, 90, 120 min.) dupã incubarea succesivã a capsulelor (AG, CH
de concetraţii 2, 1.5 şi 1%, gumã guar: alginat 0.75:0.75, gumã xanthan: alginat
0.75:0.75) în sucul gastric (pH 1.5) pentru 60 min în sucul intestinal simulat la 37°C,
L
pentru 2h. Valorile sunt exprimate ca medie ± eroarea standard (n=3), comparativ cu
celulele libere. Timpul de reducere decimal (DV-min) este prezentat pentru fiecare
variantã în parte. Valoarile Dv semnificativ diferite (P<0.05) sunt notate cu litere diferite
Fig.30. Dynamic of Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis,
Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, Belgian mix and Romanian Mix (log ufc/ml)
at different periods (30, 60, 90, 120 min.) after successive incubation of beads containing
bacteria cells (AG or CH at 2, 1.5 or 1%, guar gum: alginate 0.75:0.75, xanthan gum:
alginate0.75:0.75) in simulated gastric juice (pH 1.5) for 60 min and in simulated
intestinal juice at 37°C, for 2h. Values are expressed as average ± standard error of
triplicate (n=3), comparatively with free cells. The decimal reduction time values (DV-
min) are represented for each variant. DV values which are significantly different
(P<0.05) are marked by different letters
În urma expunerii condiţiilor sucului gastric simulat (60 min) şi intestinal simulat
(2h), bacteriile mixului românesc au supravieţuit mai bine în capsulele de AG 2% (1.7 ±
0.1 x 106 cfu mL-1) faţã de celulele libere (2.2 ± 0.4 x 102 cfu mL-1) şi faţã de bacteriile
încapsulate în matrici de AG 1% (1.2 ± 0.1 x 104 cfu mL-1), AG 1.5% (1.1 ± 0.6 x 105 cfu
mL-1), CH 1% (2.3 ± 0.3 x 104 cfu mL-1), CH 1.5% (3.5 ± 0.2 x 104 cfu mL-1) CH
2%,(1.5 ± 0.1 x 105 cfu mL-1).
Rezultatele corespund cu cele raportate de cãtre Anal şi Singh (2007) şi indică
faptul că formarea barierei de hidrogel de cãtre alginat încetineşte penetrarea capsulei de
către sucul gastric şi contactul cu celulele încapsulate. Truelstrup şi colab., (2002) a
raportat cã microcapsulele de diametru mic (mai mici de 100µm) nu protejeazã
semnificativ bacteriile în fluidul gastric simulat în comparaţie cu celulele libere.
Rezultatele indică supravieţuirea unui numãr mare de bacterii în capsulele de AG
2% dupã incubare în suc gastric simulat şi dupã trecerea secvenţialã pe suc intestinal
simulat. Astfel, matricea de alginat 2% a avut cele mai bune efecte protective ale
bacteriilor, indicând valori de supravieţuire de 6.2 log cfu mL-1 în comparaţie cu valoarea
înregistratã pentru celulele libere 2.3 log cfu mL-1, dupã douã ore de expunere condiţiilor
sucului intestinal.
LI
AG 1%CH 1%
AG 1.5%
CH 1.5%
AG 2%CH 2%
AG:G
U
AG:XA
Free C
ells
0
2
4
6ab b
c c
d
c c
Lactobacillus plantarum
c
Log
cfu
mL-1
AG 1%
CH 1%
AG 1.5%
CH 1.5%
AG 2%CH 2%
AG:G
UAG:XA
Free Cell
s0
2
4
6
8a
b bc d
efef
c
Bifidobacterium infantis
c
Log
cfu
mL-1
AG 1%CH 1%
AG 1.5%
CH 1.5%
AG 2%CH 2%
AG:G
UAG:XA
Free Cell
s0
2
4
6
8
ab b
c c
d
c c
Lactobacillus casei
c
Log
cfu
mL-1
AG 1%
CH 1%
AG 1.5%
CH 1.5%
AG 2%CH 2%
AG:G
UAG:XA
Free Cell
s0
2
4
6
8a
b b
dc
efd
ef
Bifidobacterium breve
c
Log
cfu
mL-1
AG 1%CH 1%
AG 1.5%
CH 1.5%
AG 2%CH 2%
AG:G
UAG:XA
Free Cell
s0
2
4
6
8a
b bc d
e
c c
Belgian Mix
c
Log
cfu
mL-1
AG 1%CH 1%
AG 1.5%
CH 1.5%
AG 2%CH 2%
AG:G
UAG:XA
Free Cell
s0
2
4
6
8a
b bc c
d
c c
Romanian Mix
c
Log
cfu
mL-1
Fig.31. Efectul concentraţiei matricei asupra supravieţuirii bacteriilor [Lactobacillus
plantarum Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, mixul
belgian (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei,
LII
Bifidobacterium breve) mixul românesc (Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus)] dupã expunerea condiţiilor sucului gastric şi intestinal
simulat. Valorile cu aceleaşi litere nu sunt semnificativ diferite (P>0.05)
Fig.31. Effect of beads type concentration on survival of strains [Lactobacillus plantarum
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, Belgian Mix of
bacteria (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei,
Bifidobacterium breve) Romanian Mix of bacteria (Streptococcus thermophilus and
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)] after incubation in simulated gastric and
intestinal juice. Values with the same letters are not significantly different (P>0.05)
L.plan
taru
m
B.infant
is
L.ca
sei
B.bre
ve
Belgian
Mix
Roman
ian M
ix0
2
4
6
8
Alginate 2% beads
ba a
a a a
Beads Type in SIJ
Log
cfu
mL-1
Fig.32. Efectul capsulei de alginate 2%, asupra supravieţuirii bacteriilor [Lactobacillus
plantarum Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, mixul
belgian (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei,
Bifidobacterium breve) mixul românesc (Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus)] dupã expunerea condiţiilor sucului gastric şi intestinal
simulat. Valorile cu aceleaşi litere nu sunt semnificativ diferite (P>0.05)
Fig.32. Effect of Alginate 2% on survival of strains [Lactobacillus plantarum
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, Belgian Mix of
bacteria (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei,
Bifidobacterium breve) Romanian Mix of bacteria (Streptococcus thermophilus and
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)] after incubation in simulated gastric and
intestinal juice. Values with the same letters are not significantly different (P>0.05)
LIII
Fig.32. prezintã diferenţe între supravieţuirea bacteriilor încapsulate în matrici de
AG 2% dupã incubarea în suc gastro-intestinal simulat. Astfel, diferenţe semnificative
(P<0.05) au fost între Lactobacillus plantarum vs. Bifidobacerium infantis mixul belgian,
mixul românesc, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, Bifidobacerium infantis.
CONCLUZII
• Rezultatele noastre sugereazã cã bacteriile neîncapsulate sunt sensibile la mediul
acid (pH 1.5) şi ingerarea lor sub formã liberã le reduce viabilitatea (reducere cu 5
log dupã 2h).
• Potrivit acestui studiu capsulele de AG 2% asigurã cea mai bunã protecţie în sucul
gastric simulat deoarece compactitatea capsulelor a fost mare, difuzia în sucul
gastric a fost limitatã.
• În general, valoarile D ale bacteriilor probiotice incubate în sucul gastro-intestinal
au fost mai mici faţã de valorile obţinute pe sucul gastric. Aceasta poate fi
explicatã prin faptul cã rezistenţa bacteriilor lactice faţã de mediu este influenţatã
de mai mulţi factori din mediu dar şi de cãtre compoziţia membranei
citoplasmatice.
• În urma expunerii condiţiilor sucului gastric simulat (60 min) şi intestinal simulat
(2h), bacteriile mixului românesc au supravieţuit mai bine în capsulele de AG 2%.
• Menţionăm supravieţuirea unui numãr mare de bacterii încapsulate în matricea de
AG 2% dupã incubare în suc gastric simulat şi dupã trecerea secvenţialã pe suc
intestinal simulat. Astfel, matricea de alginat 2% a avut cele mai bune efecte
protective ale bacteriilor, indicând valori de supravieţuire de 6.2 log cfu mL-1 în
comparaţie cu valoarea înregistratã pentru celulele libere 2.3 log cfu mL-1, dupã
douã ore de expunere condiţiilor sucului intestinal.
LIV
CONCLUZII GENERALE Experimentele efectuate în cadrul acestei teze de doctorat au demonstrat cã randamentul
lactat este dependent de tipul de bacterie şi de calitatea substratului. În urma
eperimentelor efectuate, concludem:
• Optimizarea fermentaţiei lactice pe substraturi de suc verde de lucernã şi hidrolizat
de orz în combinaţie cu alte surse nutritive (glucozã, extract de drojdie) cu ajutorul
diferitelor tipuri de Lactobacillus paracasei. Lactobacillus paracasei 168 a avut
cel mai bun randament de fermentaţie la 40.5°C, pH 6.
• Evaluarea capacităţii de bioconversie a nutrienţilor în acid latic a bacteriilor
probiotice (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus
casei, Bifidobacterim breve) şi a mixului Streptococcus thermophilus şi
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) cu ajutorul cromatografiei lichide de
înaltã performanţã.
• Carcterizarea cu ajutorul spetroscopiei IR cu transformantã Fourier (FTIR)
amprentelor specifice bacteriilor lactice, libere şi pe perioada fermentaţiei, ca
metodã complementarã metodelor microbiologice.
Cu privire la experimentele legate de microîncapsularea bacteriilor utilizată în vederea
conservãrii viabilitãţii bacteriilor lactice cu capacitate probioticã pe durata expunerii
condiţiilor mediului gastro-intestinal, concludem:
• Încapsularea bacteriilor cu potenţial probiotic Lactobacillus plantarum,
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei, Bifidobacterium breve, a mixului
belgian (Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus casei,
Bifidobacterium breve ) a mixului românesc (Streptococcus thermophilus şi
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) în capsule formate din diferite
matrici (alginat, chitosan, alginat- gumã xanthan, alginate- gumã guar).
• Caracterizarea morfolologică şi spectroscopică a capsulelor cu şi fãrã conţinut de
bacterii.
• Demonstrarea caracterului probiotic al bacteriilor lactice încapsulate prin
monitorizarea viabilitãţii pe durata expunerii lor în sucul gastric şi intestinal
simulat.
LV
BIBLIOGRAFIE
1. ÅKERBERG, C., HOFVENDAHL, K., ZACCHI, G., HAHN-HÄGERDAL, B.,
1998. Modelling the influence of pH, temperature, glucose and lactic acid concentrations
on the kinetics of lactic acid production by Lactococcus lactis sp. lactis ATCC 19435 in
whole wheat flour, Appl Microbiol Biotechnol, 49:682–690.
2. ANAL, A.K., SINGH, H., 2007. Recent advances in microencapsulation of
probiotic for industrial applications and targeted delivery, Trends Food Sci Technol,
18:240-251.
3. ANURADHA, R., SURESH, A.K., VENKATESH, K.V., 1999. Simultaneous
saccharification and fermentation of starch to lactic acid, Process Biochem, 35:367-75.
4. BEGLEY, M., GAHAN, G.M., HILL, C., 2005. The interaction between bacteria
and bile, FEMS Microbiol Rev, 29:625–651.
5. BERRY, A.R., FRANCO, C. M.M., ZHANG, W., MIDDELBERG, A.P.J., 1999.
Growth and lactic acid production in batch culture of Lactobacillus rhamnosus in a
defined medium, Biotechnol Lett, 21:163-167.
6. GOODACRE, R., TIMMINS, E.M., ROONEY, P.J., ROWLAND, J.J., KELL,
D.B., 1996. Rapid identification of Streptococcus and Enterococcus species using diffuse
reflectance-absorbance Fourier transform infrared spectroscopy and artificial neural
networks, FEMS Microbiol Lett, 140:233–239.
7. HOFVENDAHL, K., HAHN-HÄGERDAL, B., 2000. Factors affecting the
fermentative lactic acid production from renewable resources, Enzyme Microb Technol,
86:87-107.
8. KANSIZ, M., HERAUD, P., WOOD, B., BURDEN, F., BEARDALL, J.,
LVI
MCNAUGHTON, D., 1999. Fourier Transform Infrared microspectroscopy and
chemometrics as a tool for the discrimination of cyanobacterial strains, Phytochem,
52:407–417.
9. KIM, S.J.S.Y., CHO, S.H., KIM, O.J., SONG, II, SHIK, SHIN., 2008. Effect of
micro encapsulation on viability and other characteristics in Lactobacillus acidophilus
ATCC 43121, LWT- Food Sci Technol, 3:493-500.
10. KRASAEKOOPT, W., BHANDARI, B., DEETH, H., 2004. The influence of
coating materials on some properties of alginate beads and survivability of
microencapsulated probiotic bacteria, Internat Dairy Jour, 14:737–743.
11. KUMMERLE, M., SCHERER, S., SEILER, H., 1998. Rapid and reliable
identification of food-borne yeasts by Fourier-transform infrared spectroscopy, Appl
Environ Microbiol, 64, 2207–2214.
12. OH, H., WEE, Y.J., YUN, J.S., HAN, S.H., JUNG, S., RYU, H.W., 2005. Lactic
acid production from agricultural resources as cheap raw materials, Biores Technol,
96:1492-1498.
13. OLOFSSON, K., RUDOLF, A., LINDEN, G., 2008. Designing simultaneous
saccharification and fermentation for improved xylose conversion by a recombinant
strain of Saccharomyces cerevisiae, J Biotechnol, 134:112-120.
14. RAO, A.V., SHIWNARAIN, N., MAHARAJ, I., 1989. Survival of
microencapsulated Bifidobacterium pseudolongum in simulated gastric and intestinal
juices, Canad Instit Food Sci Tech J, 22:345-349.
15. RICHTER, K., BERTHOLD, C., 1998. Biotechnological conversion of sugar and
starchy crops into lactic acid, J Agric Eng Res, 71:181–191.
LVII
16. SCHMITT, J., FLEMMING, H.C., 1998. FTIR-spectroscopy in microbial and
material analysis, Int Biodet Biod, 41:1–11.
17. TRIF, M., ANSORGE-SCHUMACHER, M., SOCACIU, C., 2008. Application of
FTIR Spectroscopy for determination of oxidation of encapsulated sea buckthorn oil,
Proc.XV Int workshop on Bioencap and COST865 Meeting, Wien, Austria.
18. TRUELSTRUP, H.L., ALLAN-WOJTAS, P.M., JIN, Y.L., PAULSON, A.T., 2002.
Survival of Ca-alginate microencapsulated Bifidobacterium spp. in milk and simulated
gastrointestinal conditions, Food Microbiol, 19:35–45.
19. TSAO, G.T., CAO, N.J., CONG, C,S., 1999. Production of multifunctional organic
acids from renewable sources, Adv Bioeng Biotechnol, 65:245–277.
20. VENUS, J., RICHTER, K., 2006. Production of lactic acid from barley: Strain
Selection, Phenotypic and Medium Optimization, Eng Life Sci, 6:492-500.
21. VISHNU, C., SEENAYYA, G., REDDY, G., 2000. Direct fermentation of starch to
L(+) lactic acid by amylase producing Lactobacillus amylophilus GV6, Bioprocess Eng,
23:155–158.
22. VODNAR, D.C., VENUS, J., SCHNEIDER, R., SOCACIU, C., 2010. Lactic acid
production by Lactobacillus paracasei 168 in discontinuous fermentation using lucerne
green juice as nutrient substitute, Chem Engin Technol, 33:468–474.
23. VODNAR, D.C., SOCACIU, C., ROTAR, A.M., STANILA, A., 2010.
Morphology, FTIR fingerprint and survivability of encapsulated lactic bacteria
(Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) in
simulated gastric juice and intestinal juice, Intl J. of Food Sci. Techn., IN PRESS.
LVIII
