These Zinedine

8/19/2019 These Zinedine

1/162

UNIVERSITE SIDI MOHAMMED BEN ABDELLAH

F ACULTE DES

SCIENCES

DHAR

EL MAHREZ

FES

UFR DE BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE

A PPLIQUEE A L'ENVIRONNEMENT ET LA S ANTE

THESE DE DOCTORAT

Présentée par :

ABDELLAH ZINEDINE

Spécialité: Biologie

Option : Microbiologie

Le 30 Octobre 2004 devant le jury:

Pr MOHAMED BENLEMLIH Faculté des Sciences DEM Fès Président

DETERMINATION DES MYCOTOXINES DANS LES ALIMENTS ET ETUDE DELA REDUCTION DES AFLATOXINES PAR LES BACTERIES LACTIQUES

ISOLEES DES FERMENTS PANAIRES TRADITIONNELS


2/162

DEDICACES

A MES P ARENTS

A MA FEMME

A MES SŒURS ET FRERES

A TOUS MES AMIS.


3/162

REMERCIEMENTS

Au terme de ce travail je remercie:

Monsieur Mohammed EL KADIRI, Doyen de la Faculté des Sciences Dhar El-Mahrèz de Fès, pour avoir accepter de m'inscrire au sein la Faculté des Sciences DharEl-Mahrèz pour continuer mes études doctorales.

Madame Rajae ELAOUAD, Directrice de l'Institut National d'Hygiène, pour l'intérêtqu'elle donne à la coopération internationale et à la recherche scientifique au sein del'INH de Rabat.

Monsieur Mohamed BENLEMLIH, Professeur à la faculté des sciences DEM deFès. Quoique je dise, les mots ne sauraient exprimer ma profonde gratitude pour avoirdirigé cette thèse. Ses encouragements et sa patience m’ont beaucoup aidé à surmontertoutes les difficultés. Je le remercie vivement d’avoir suivi et orienter ce travail.

Monsieur Mohamed FAID, Professeur, Chef du Laboratoire de MicrobiologieAlimentaire et Biotechnologie de l’Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II,Rabat, pour son encadrement, sa disponibilité, ses conseils et ses encouragements.Quoique je dise, les mots ne sauraient exprimer ma profonde gratitude pour m'avoirencadré pendant toutes mes études supérieures.

Monsieur Larbi IDRISSI, Chef du Département de Toxicologie de l’Institut Nationald’Hygiène de Rabat pour ses encouragements et ses remarques précieuses. Qu’iltrouve ici l’expression de mes meilleures considérations.

Mr Mohammed El HASSOUNI, Professeur à la Faculté des Sciences DEM de Fès, pour sa disponibilité et pour avoir accepter de juger cette thèse.

Mme Rajae BELKHOU, Professeur à l’Ecole Supérieure de Technologie de Fès pour


4/162

Monsieur Edmond E. CREPPY, Directeur du Laboratoire de Toxicologie etd’Hygiène Appliquée Université Victor Segalen Bordeaux 2, France, pour son entière

collaboration et pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire.

Madame Anne-Marie BETBEDER, Mlle Isabelle BAUDRIMONT, Mr ArnaudCOURTOIS et toute l’équipe du Laboratoire de Toxicologie de l'Université Bordeaux2 pour leur gentillesse et leur soutien au cours de mon séjour à Bordeaux.

Monsieur Paolo AURELI, Directeur du "Laboratorio Alimenti" de l’"Istituto

Superiore di Sanità" (ISS) de Rome, Italie, pour son entière collaboration et pour avoiraccepter de m'accueillir au sein de son laboratoire.

Madame Marina MIRAGLIA, Directrice du Département de Chimie des Céréales del’ISS, Rome, Italie, pour m’avoir accueilli au sein de son équipe de recherche, sesencouragements et sa disponibilité.

Monsieur Carlo BRERA, Chercheur, Responsable de l’Unité des Mycotoxines à l'ISS pour avoir la gentillesse de diriger ma formation sur les mycotoxines, son entièrecollaboration, sa disponibilité et ses remarques précieuses.

Madame Roberta ONORI Chercheur à l'ISS, Carla CATANO, FrancescaDEBEGNAC, Simona ANGELINI et tout le personnel du Département de Chimiedes Céréales de l’ISS pour leur gentillesse et leur soutien au cours de mon séjour à

Rome.

Monsieur Jose-Miguel SORIANO, Chercheur au Laboratoire de Toxicologie etBromatologie de l'Université de Valence (Espagne) pour sa collaboration, sagentillesse, sa disponibilité et son amitié.

Tout mes collègues de l'Institut National d'Hygiène de Rabat, en particulier le

personnel du Département de Toxicologie et Hydrologie. Et mes collègueschercheurs du Laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Biotechnologie de l’IAVHassan II de Rabat.


5/162

RESUME

Dans ce travail nous avons étudié la contamination des aliments commercialisés

au Maroc par les mycotoxines. Pour cela, un total de 60 échantillons de céréales, 55

échantillons d'épices, 24 échantillons de fruits secs et 25 échantillons d'olives noires

ont été prélevés dans différents points de vente des villes de Rabat et Salé. La

détermination des mycotoxines a été faite par HPLC. Les résultats ont montré querespectivement 40%, 40% et 55% des échantillons analysés de maïs, de blé et d’orge

sont contaminés par l’ochratoxine A (OTA). Les échantillons de maïs ont été analysés

pour la co-occurrence naturelle des toxines de Fusarium. Les pourcentages de

contamination des échantillons de maïs par la fumonisine B1 (FB1) et la zéaralénone

(ZEN) sont respectivement de l’ordre de 50 et 15 %. Les résultats obtenus ont montré

que les taux de certaines mycotoxines notamment l'OTA et la FB1 ont dépassé les

limites maximales fixées par la réglementation européenne. Dans les épices, les

résultats ont montré que les taux des aflatoxines totales dans le piment et le gingembre

varient respectivement de 1,30 à 9,68 µg/kg et de 0,03 à 9,10 µg/kg. Dans les fruitssecs et les olives noires, l'analyse a montré que 66,6 % et 36% sont respectivement

contaminés par l'OTA. Dans le but de rechercher de nouvelles souches capables de

réduire ou dégrader les mycotoxines, quatre ferments panaires traditionnels collectés

de différentes régions du Maroc ont été essayés pour réduire les aflatoxines. Les

Résultats ont montré une réduction de 92% pour l'AFG1 et 79,16 % pour l'AFB1 parle ferment L1. La capacité des bactéries lactiques à réduire l'AFB1 in vitro a été

également étudiée. Les souches à tester ont été cultivées en présence de l’AFB1. Les

Résultats ont montré que les souches de Lactobacillus peuvent réduire plus d'AFB1


6/162

SUMMARY

In this work, the contamination of Moroccan foodstuffs with mycotoxins was

studied. A total of 60 samples of cereals, 55 samples of spices, 24 samples of dried

fruits and 25 samples of black olives were purchased from popular markets of Rabat

and Salé and analyzed for mycotoxins by HPLC with fluorimertic detection. Results

showed that 40, 40 and 55% of samples of corn, wheat and barley were respectively

contaminated with ochratoxin A (OTA). Samples of corn were assayed for the co-

occurrence of fuminisine B1 (FB1) and zearalenone (ZEN). The incidence of FB1 and

ZEN in corn samples were respectively 50 and 15 %. In spices, AF analysis showed

that total AF in paprika and ginger ranged respectively from 1.30 to 9.68 µg/kg and

from 0.03 to 9.10 µg/kg. This is the first report on the natural co-occurrence of OTA,

FB1and ZEN in cereals from Morocco. Concerning OTA analysis in samples of dried

fruits and black olives, results showed that 66.6% and 36% were respectively

contaminated by OTA. Black olives samples were more contaminated by OTA, theoverall median concentration was 1.43 µg/kg (range 0.62 to 4.8 µg/kg). In the 2nd part

of this study we were interested to a biological process to remove mycotoxins. 4

traditional sourdough ferments were assayed against aflatoxins. Results showed a

reduction of mycotoxins with percentages of 92 % for AFG1 and 79.16 % for AFB1

by the ferment L1. The ability of some strains of lactic acid bacteria isolated from

Moroccan traditional sourdough ferments to reduce AFB was also studied in vitro.

Results showed that Lactobacillus strains could remove more AFB1 than Pediococcus

and Leuconostoc strains and the reduction of the initial amount of AFB1 ranged from


7/162

PUBLICATIONS

ARTICLES

1- A. Zinedine, S. Elakhdari, A. Chaoui, M. Faid, R. Belhcen, et M. Benlemlih. Aflatoxins Reduction in Sourdough Bread Fermentation. Alimentaria (2004) N° 353:97-100.

2- A. Zinedine, M. Faid et M. Benlemlih. Activité anti-aflatoxinogénique des bactéries lactiques isolées des ferments panaires traditionnels marocains. Rev. Méd. Pharm. Afr (2004) . V 18: 77-83.

3- A. Zinedine, A.M. Betbeder, M. Faid and M. Benlemlih, L. Idrissi and E.E.Creppy. Ochratoxin A determination in dried fruits and black olives from Morocco.

Alimentaria (2004) N° 359: 73-76

4- A. Zinedine, M. Faid and M. Benlemlih. In vitro reduction of aflatoxin B1 bystrains of lactic acid bacteria isolated from sourdough bread. Int. J. Agr. Biol , (2005)Vol. 7, N°1: 67-70.

5- A. Zinedine, C. Brera, S. Elakhdari, C. Catano, F.R. Debegnac, S. Angelini, M.Faid, M. Benlemlih and M. Miraglia. The natural occurrence of mycotoxins in cerealsand spices commercialized in Morocco. Int. J. Food Control (2004) (Soumis)

COMMUNICATIONS ORALES

1- A. Zinedine, Faid M. et Benlemlih M. (2002): Mycotoxins reduction by acid lactic bacteria of sourdough bread. 1er Congrès National de Biochimie. Société Marocaine deBiochimie. 9-11 Mai 2002. Faculté des Sciences Aïn-Chock Casablanca. Maroc.


8/162

LISTE DES TABLEAUX

Tableaux Titres12

345

67

8910

1112

13

14151617

18

19

20

Effets mutagènes, tératogènes et cancérigènes des mycotoxinesActivité de l’eau (aw) nécessaire pour le développement de quelques

moisissuresPropriétés physico-chimiques des aflatoxinesPrincipales mycotoxines produites par les espèces de Fusarium Limites maximales pour les mycotoxines dans les aliments dans certains

pays européens et les USAEstimation du dégât économique des aflatoxines.Principales différences entre le pain au levain et le pain à la levure

Coefficients molaires et longueurs d’ondes de l’AFB1 et l’AFG1Analyse statistique des méthodes analytiques des mycotoxinesCooccurrence naturelle de l’OTA, la FB1 et la ZEN dans leséchantillons du maïs analysésConcentrations de l’OTA dans les échantillons de blé et d’orge analysésOccurrence des aflatoxines dans les échantillons du piment et degingembre analysés

Occurrence des aflatoxines dans les échantillons du poivre et du cuminanalysésConcentrations de l'OTA dans les olives noires analysésConcentrations de l'OTA dans les fruits secs analysésCaractéristiques physico-chimiques des ferments panairesDénombrement des levures et des bactéries lactiques dans les ferments

panaires traditionnels en ufc 106/g

Pourcentage des genres de bactéries lactiques dans les ferments panairestraditionnels analysésDistribution des espèces de bactéries lactiques dans les fermentstraditionnels panaires étudiés

pH et nombre des bactéries lactiques en culture mixte avec A. parasiticusNRRL2999


9/162

LISTE DES FIGURES

Figure Titre12

345678

9

10

1112

1314

15

1617

18

19

2021

Biosynthèse de quelques mycotoxines dans les aliments.Structures chimiques des aflatoxines

Principales voies de biotransformation de l'AFB1 dans l’organismeStructure de l'ochratoxine AStructure de la ZEN et de ses dérivésStructure de la FB1Structure de la patulineSchéma montrant les principales étapes utilisées pour l’analyse desmycotoxines par HPLC

Pourcentage de réduction des aflatoxines par les ferments panairestraditionnelsEffet de la température sur la réduction de l'AFB1 par les bactérieslactiquesEffet du pH sur la réduction de l'AFB1 par les bactéries lactiquesChromatogramme montrant les quatre pics des standards desaflatoxines

Chromatogramme des aflatoxines dans les échantillons d'épicesChromatogrammes des aflatoxines dans les échantillons des épices(suite)Chromatogrammes de l'OTA dans les échantillons des céréalesanalyséesChromatogrammes de la ZEN dans un échantillon de maïs analyséChromatogrammes de trois injections différentes du standard de la FB1

Chromatogrammes de la FB1 dans trois échantillons de maïs (4, 5 et20)Chromatogrammes de la FB1 dans deux échantillons de maïs (M1 etM2)Chromatogramme de la FB1 dans un échantillon de maïs (M4)Chromatogramme de la FB1 dans un échantillon de maïs (M20)


10/162

ABREVIATIONS

- A: Aspergillus

- AF: Aflatoxine

- AFB1: Aflatoxine B1

- AFB2: Aflatoxine B2

- AFG1: Aflatoxine G1

- AFG2: Aflatoxine G2

- AFM1: Aflatoxine M1

- AFM2: Aflatoxine M2

- AFT: Aflatoxines totales- Aw : Activité de l’eau

- DON : Déoxynivalénol

- F: Fusarium

- FB1 : Fumonisine B1

- Hr : Humidité relative

- L : Lactobacillus

- Lc : Lactococcus

- Ln : Leuconostoc

- OTA : Ochratoxine A

- P: Penicillium

- ppm: Partie par million

- ppb: Partie par billion


11/162

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE


12/162


13/162

CHAPITRE I : MYCOTOXINES DANS LES PRODUITS ALIMENTAIRES

I- INTRODUCTION

Les champignons toxiques produisent un certain nombre de métabolites

secondaires nocifs en se développant sur les aliments. Ces produits qualifiés

mycotoxines sont très toxiques pour l'homme et les animaux. Leur présence estfortement dépendante de nombreux facteurs.

Les mycotoxines (du grec mykês signifiant moisissure) sont des métabolites

toxiques dont l’ingestion provoque une intoxication chez le consommateur à condition

que leur concentration soit suffisamment élevée pour produire un effet. Ce sont des

produits contaminant les denrées alimentaires d’origine animale ou végétale,

notamment les aliments de base : céréales et oléagineux, elles sont répandues à tous les

stades de la chaîne alimentaire.

Les troubles causées par ces substances se manifestent par des syndromes

variés, il peut y avoir un effet spécifique toxique sur un organe bien déterminé,

cependant la plupart provoquent des lésions graves d'un seul tissu ou de plusieurs

tissus, mais c'est surtout le foie qui est le plus touché. D'autres effets peuvent

apparaître tels les gastro-entérites, les hémorragies et les paralysies etc. Lesmycotoxines sont généralement classées en trois groupes selon leurs effets toxiques

(voir tableau 1) :


14/162

Tableau 1 : Effets mutagènes, tératogènes et cancérigènes des mycotoxines

(Dérache, 1989)

Champignons Mycotoxines

produites

Mutagénicité Tératogénicité Cancérogénicité

A. flavus

A. parasiticus

P. urticae

P. rubrum

Penicillium sp

A.

versicolor

P. poae

P. veridicatum

A. ochraceus

P. islandicum

Aflatoxines

Patuline

Rubratoxine

Acide pénicillique

Ac. mycophénolique

Stérigmatocystine

Trichothécènes

Ochratoxine A

Ochratoxine A

Lutéoskirine

+

+

+

+

+

+

+

?

+

+

+

+

+

+

?

+

+


15/162

II- DECOUVERTE DES MYCOTOXINES

Dès le moyen âge, les chroniques décrivent les effets mortels de l'ergot du

seigle dont l'agent causal Claviceps purpurea est responsable de l'élaboration d'une

toxine mortelle : l'ergotamine. Ensuite des études permettaient d'isoler du maïs

contaminé par Penicillium l'acide pénicillique première mycotoxine identifiée.

En Angleterre (1960), l'ingestion d’une farine d'arachide importée du Brésil et

contaminée par Aspergillus flavus a entraîné la mort brutale d'une centaine de milliers

de dindonneaux après l’apparition des premiers symptômes : perte de l’appétit,

faiblesse des ailes et léthargie. Cet événement dénommé autrefois tout simplement

« Turkey-X- Disease » a donné le départ d'une série d'études et de recherches physico-

chimiques et toxicologiques sur les substances actives élaborées par les moisissures.

Ainsi en 1960, le nom d’aflatoxine est attribué à cette nouvelle matière toxique.

Au Maroc, bien que l’on signale dès 1945 une intoxication de porcs par unealimentation moisie d’après Ninard et Hinterman, cité par Lafont (1970), les premières

recherches scientifiques faisant mention de la contamination des denrées alimentaires

par des champignons toxinogènes n'ont vu le jour qu'au milieu des années 70 où un

nombre de produits incluant des céréales, des légumineuses et des épices se sont

révélées susceptibles d’héberger des spores d’ Aspergillus toxinogènes (Tantaoui-

Elaraki, 1977).

D' t t t t é l t i ti d li A ill fl


16/162

Tantaoui-Elaraki et Bartine (1994) ont ensuite isolé des souches d’ A. flavus

productrices d’ochratoxine A sur diverses épices distribuées au Maroc.

III- CONDITIONS DE PRODUCTION DES MYCOTOXINES DANS LES

ALIMENTS

Toutes les récoltes poussant à des climats chauds et humides et exposées aux

moisissures toxinogènes peuvent être contaminées par les mycotoxines. C'est le cas

notamment du maïs, des fruits à coque, des arachides, des graines de coton, des noix,

des pistaches, des épices, du soja, du riz, des amandes, des fruits secs, du lait et ses

dérivés et des céréales et leurs dérivés etc.

Certaines cultures sont moins favorables par rapport à d’autres pour la production

d’une ou plusieurs mycotoxines par les champignons. Ceci est probablement dû à des

facteurs génétiques. D'autres cultures comme les céréales offrent aux champignons de

très bonnes conditions de développement vu leur richesse en glucides reconnus comme

principales sources d’énergie. Le blé, l’orge, le seigle, l’avoine, le sorgho, le millet et

le riz, apparaissent être moins susceptibles à la contamination fongique et la

production d'aflatoxine par rapport au maïs.

Les moisissures responsables de l’altération des graines sont réparties en deux

groupes écologiques :

- Les moisissures du champ : Alternaria et Fusarium


17/162

facteurs qui peuvent être intrinsèques (nature de la souche) ou bien extrinsèques

(conditions de l’environnement).

- Facteurs intrinsèques : Concernant la nature de la souche, certaines

moisissures sont toxinogènes mais d’autres ne le sont pas. De plus au sein d’une même

espèce toxinogène, certaines souches sont fortement productrices de toxines alors que

d’autres le sont mais à des degrés moindres. La toxinogénèse d’une moisissure peutdépendre du stade de développement de la souche productrice.

- Facteurs extrinsèques : Les facteurs de l’environnement qui contrôlent le

développement de la toxinogénèse des moisissures sont nombreux à savoir la teneur en

eau, l’humidité relative, le pH, la température ambiante, la composition du substrat en

éléments nutritifs et sa richesse en graisses ou en azote et la compétition entre les

différents micro-organismes :

● Substrat

Les moisissures sont des organismes hétérotrophes, se développant

exclusivement sur des substrats organiques contenus dans les produits alimentaires de

base (oléagineux, céréales, produits laitiers etc.). Les glucides sont des sources de

carbone les plus utilisés par les moisissures. La présence de quelques substances dans

les aliments stimule la croissance des moisissures et la production des mycotoxinescomme le saccharose et les acides aminés. La contamination d’une denrée alimentaire

par les moisissures dépend de la nature du substrat en particulier de la nature des

glucides disponibles


18/162

- Les espèces hygrophiles dont les spores germent à plus de 90% et leur

croissance optimale se situe à 100 % d’humidité relative ( Mucor sp.).

- Les espèces mésophiles dont les spores germent entre 80 et 90% et leur

croissance optimale se situe entre 95 et 100% d’humidité relative ( Alternaria

sp., Penicillium sp.).

- Les espèces xérophiles dont les spores germent à moins de 80% et leur

croissance optimale se situe entre 95 et 100% d’humidité relative ( Aspergillussp., Penicillium sp.).

Le tableau n° 2 résume les valeurs limites nécessaires pour le développement de

quelques types de moisissures. Concernant les Aspergillus, l’aw optimale de leur

croissance se situe entre 0,72 et 0,80 selon les espèces. Cependant la plupart des

Penicillium pousse mieux à des aw comprises entre 0,8 et 0,90. Les espèces du genre

Fusarium se développent à des aw entre 0,80 et 0,92.

Il est à noter que l’aw requise pour la production de mycotoxines est généralement

plus faible que celle nécessaire pour la croissance des moisissures et la germination

des spores. En effet, la formation des aflatoxines par A. flavus nécessite une valeur

d’aw comprise entre 0,83 et 0,87 mais la croissance du micro-organisme producteur

peut avoir lieu à des valeurs d’aw plus basses (Troller, 1980).

● Température (T°) et pH

La température agit sur la croissance des moisissures et la production des

mycotoxines La température optimale pour la croissance des moisissures se situe entre


19/162

moisissures et la production des mycotoxines. La plupart des moisissures croissent

dans des pH acides et peuvent tolérer des valeurs de pH très basses.

● Endommagement des graines

Les graines cassées ou fissurées constituent des foyers favorables pour le

développement des moisissures qui après leur envahissement libèrent les toxines. Leur

altération par les insectes et les acariens fournit également les conditions favorables pour la croissance et le développement des moisissures.

IV- BIOSYNTHESE DES MYCOTOXINES

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires synthétisés pendant la phase

stationnaire après les stades de multiplication et de croissance. Elles sont classées en

polyacétoacides, terpènes et métabolites azotés selon leur origine biologique. D'après

Steyn (1998), les aflatoxines sont formées à partir des polyacétoacides selon un

processus complexe, l'ergotamine est formée à partir des peptides et des acides aminés.

L'ochratoxine A est biosynthétisé à partir de la phénylalanine et le

dihydroisocoumarine. Les thrichothécènes sont produites à partir du mévalonate

(Figure 1).


20/162

Tableau 2: Activité de l’eau (aw) nécessaire pour le développement dequelques moisissures (OMS, 1990)

Moisissures Aw

A. ochraceus

A. flavus

A. niger

P. cyclopium

Fusarium sp

0,83-0.87

0,78

0,88

0,87 - 0,90

0,80 - 0,92

Figure 1 : Biosynthèse de quelques mycotoxines dans les aliments(Leyral et vierling, 2001)

Acides aminés aromatiques Métabolites II aires

(Ergotamine)

Glucose Triose Pyruvate Acétate Acides gras

Polycétoacides Métabolites II aires


21/162

V- LES MYCOTOXINES EN ALIMENTATION HUMAINE ET ANIMALE

La production des mycotoxines peut avoir lieu dans les champs avant, au

moment ou bien après récolte (stockage). Les espèces du genre Fusarium (F.

moniliforme, F. roseus, F. tricinctum et F. nivale) constituent les principales

moisissures productrices de toxines avant la récolte. Tandis que les espèces des genres

Aspergillus et Penicillium telles que A. flavus et A. parasiticus sont des contaminants

au moment du stockage. Alors que les espèces d' A. clavatus et d' A. fumigatus sontdeux espèces qui n’attaquent que les graines endommagées et nécessitent une grande

rétention des graines en humidité.

L’alimentation animale est essentiellement constituée de tourteaux oléagineux,

de céréales, de fourrages ensilés, etc., tous substrats particulièrement propices au

développement des moisissures. En élevages industriels, les animaux reçoivent une

ration équilibrée et relativement identique chaque jour, ce qui favoriserait chez des

animaux, génétiquement très proches, des intoxications chroniques si l’alimentation

renferme des mycotoxines.

En alimentation humaine, le problème se pose différemment. Les habitudes

alimentaires varient d’un point à l’autre du globe mais, à part quelques pays où sévie la

famine, la grande diversification de notre alimentation nous empêche l’absorption

régulière de doses suffisantes de mycotoxines pour être réellement dangereuses à courtterme, mais qui peuvent l’être à long terme.


22/162

l'écologie des moisissures productrices des aflatoxines est très complexe. En effet, A.

parasiticus est un champignon mieux adapté au sol et proéminent chez l'arachide, alors

que A.flavus est adapté à la vie aérienne des plantes (fleures) et il est dominant en

particulier dans les cultures de maïs. Une distinction biochimique entre les souches

productrices d'aflatoxines est que A. flavus produit seulement les aflatoxines B, alors

que A. nomius et A. parasiticus produisent les aflatoxines B et G (Creppy, 2002).

L'aflatoxine B1 (AFB1) est la mycotoxine la plus étudiée. Cependant d'autres

aflatoxines sont produites par les moisissures toxinogènes notamment B2, G1 et G2 et

les aflatoxines M. Les aflatoxines M1 et M2, dérivés respectifs des aflatoxines B1 et

B2, apparaissent dans le lait et ses dérivés. Ces toxines ont tenu leur appellation du fait

de leur détection dans le lait "Milk" des vaches laitières nourries par une alimentation

contaminée (Jaquet et al., 1982). Certaines souches de moisissures sont capables de

synthétiser les aflatoxines M directement dans une alimentation moisie (Bullerman,

1978). Il a été démontré que l'aflatoxine M1 peut contaminer le lait maternel humain

(El-nezami et al., 1995; Galvano et al., 1996).

1- Propriétés physico-chimiques et biologiques des aflatoxines

1- 1 Structures des aflatoxines

Les aflatoxines sont des composés organiques de nature non protéique (figure

2). Leurs propriétés physico-chimiques (PM, Point de fusion, et rapport de front: Rf)


23/162

Tableau 3 : Propriétés physico-chimiques des aflatoxines, Le Rf est calculésur gel de silice 60 (0.25 mm)

Aflatoxines PM Point de fusion (°C) Rf Chloroforme/méthanol (97/3)

AFB1AFB2AFG1AFG2

AFM1AFM2

312314328330

328330

267303- 306257-259237-240

299293

0.560.530.480.46

0.400.30

Figure 2 : Structures chimiques de quelques aflatoxines


24/162

1-2 Toxicité des aflatoxines

La découverte des aflatoxines a excité l’intérêt des scientifiques à l’égard de la

toxicité de ces substances. Les premières observations ont révélé qu’à fortes

concentrations, les aflatoxines sont des poisons violents, et qu’administrées à petites

doses à des animaux du laboratoire, elles produisent un cancer du foie. Selon l’Agence

Internationale de Recherche sur le Cancer, l’AFB1 est un cancérogène probable classédans le groupe 1 (IARC, 1993a).

- Toxicité aiguë

La toxicité aiguë se caractérise par la dose létale DL50 qui correspond à la

concentration capable d’entraîner la mort de la moitié de la population testée.

Concernant les aflatoxines, ce type de toxicité est moins fréquent chez l’homme que

chez les animaux. Chez le caneton, la DL50 des AFB1, AFB2, AFG1 et AFG2 est

respectivement de l'ordre de 0,36, 0,78, 1,70 et 3,44 mg/kg (Hussein et Brasel, 2001).

- Toxicité chronique

La toxicité chronique des aflatoxines survient après l’ingestion répétée de doses

très faibles. Ce type de toxicité peut apparaître aussi bien chez l’homme que chez

l’animal. Des études épidémiologiques menées dans le Sud-est asiatique et en Afrique

ont démontré que les cancers hépatiques sont beaucoup plus fréquents chez certainsgroupes de la population humaine dont le régime alimentaire est élevé en aflatoxines.

D'après Hussein et Brasel (2001), plus de 250 milles décès annuels sont recensés en

Chine et en Afrique subsaharienne et qui sont causés par des carcinomes


25/162

1-3 Effets antibactériens

L’ AFB1 est considérée par plusieurs auteurs comme un antibiotique vu ses

propriétés d’inhibition de la croissance bactérienne. L’ AFB1 bloque la multiplication

cellulaire chez les espèces sensibles à des concentrations létales. Alors qu’à des

concentrations sublétales, elle produit des aberrations morphologique et physiologique.

Les aflatoxines inhibent la croissance des bactéries par inhibition de la synthèse ou

blocage de la réplication de l’ADN et par blocage de la synthèse protéique.

Chez Escherchia coli, l’arrêt de la synthèse de l'ADN et de la synthèse

protéique sous l’effet de l’AFB1 ont été mis en évidence. Alors que chez Bacillus

megaterium des déformations cellulaires se manifestent sous l’action des aflatoxines,

ces modifications résultent de l’arrêt de la division cellulaire (Zuckerman et al., 1968,

cité par Khaddor, 1992).

1-4 Effets mutagènes

L’effet mutagène de l’AFB1 sur les bactéries a été démontré par plusieurs

auteurs. La molécule de l’AFB1 peut s’intercaler entre les bases azotées de la molécule

de l’ADN et se stabiliser à la suite d’une liaison covalente à l’ADN. Ce processus s’est

manifesté in vitro chez Bacillus subtilis (Maher et Summers, 1970). D’autres auteurs

ont suggéré que l’effet mutagène de l’AFB1 provoque un changement des paires de

base chez Salmonella typhimurium (Garner et Wright, 1973). Aufray et Boutibonnes(1985) ont noté la formation de formes filamenteuses chez Bacillus thuringiensis après

un traitement par l’AFB1.


26/162

2- Métabolisme des aflatoxines dans l’organisme

Une fois dans l’organisme, l’AFB1 subit plusieurs réactions d’élimination à

plusieurs niveaux. Ainsi dans la cellule hépatique l’aflatoxine est métabolisée par un

arsenal enzymatique qui facilite son élimination par augmentation de ses propriétés

hydrophiles (Fremy, 1982).

Il existe deux méthodes d’élimination de l'AFB1. Le processus d’hydroxylationconstitue la voie principale qui conduit à la formation du dérivé hydroxylé de

l’aflatoxine B1 qui est l’aflatoxine M1 (Jaquet et al., 1982). Alors que par

oxydoréduction, il y a formation de l’aflatoxicol qui est moins toxique et de pouvoir

mutagène faible (Fremy, 1982). D’autres aflatoxines peuvent être formées à partir de

B1, il s’agit notamment des aflatoxines B2a, H1, P1 et Q1.

Les aflatoxines ingérées sont rapidement absorbées par le tractus gastro-

intestinal où elles vont commencer à être métabolisées ou détoxifiées au début dans les

cellules mucosales. L’AFB1 subit une bioconversion spécifique (figure 3) donnant

formation à un métabolite majeur résultant d’une époxidation par le Cytochrome

P450-dependant : c’est l’AFB1- 8,9-époxyde. Ce produit interagit avec l’ADN formant

des adduits (AFB-N7-Guanine) présumés impliqués dans l’activité carcinogène des

aflatoxines. La fixation de cet époxyde sur les protéines joue probablement un rôle

important dans la toxicité des aflatoxines (Richard, 1998).

Le complexe « aflatoxine – époxyde » formé peut réagir spontanément avec le

glutathion par une glutathion-S-tranférase Cette conjugaison est généralement


27/162

Figure 3 : Principales voies de biotransformation de l'AFB1 dans l’organisme(Richard, 1998)


28/162

VII- AUTRES MYCOTOXINES

A- LES OCHRATOXINES

1- Microorganismes producteurs

Les ochratoxines sont produites aussi bien par A. ochraceus et certainesespèces voisines que par des espèces du genre Penicillium. Elles ont été détectées dans

le maïs, l’orge, le blé, l’avoine, les haricots, les pois moisis et les fruits secs. On les

retrouve également sur les graines mal stockées, elles contaminent entre autres les

céréales, les boissons (vins, jus de fruits, bière etc.) et par le biais de la chaîne

alimentaire la viande de porc et de la volaille (Haumann, 1995).

La production des ochratoxines par les espèces d’ Aspergillus ne parait possible

que dans des conditions de forte humidité et de température élevée (varga et al.,1996),

alors que certaines espèces de Penicillium sont capables de produire des ochratoxines

même à des températures n’excédant pas 5°C (OMS, 1980).

2- Ochratoxine A

L’ochratoxine A (OTA, figure 4) est une mycotoxine découverte par Van derMerve et al., (1965), elle est la principale toxine dangereuse dans son groupe. Elle est

produite par P. verrucosum et par A. ochraceus. Elle peut être produite aussi par A.

niger Ces trois espèces diffèrent dans leurs niches écologiques dans les denrées


29/162

COOH

CO

H

Figure 4: Structure de l'ochratoxine A

L'OTA est absorbée par le tractus gastro-intestinal. Sa distribution chez de

nombreuses espèces se fait à travers la circulation sanguine vers les reins ; des petites

concentrations se sont trouvées également dans le foie, le muscle et le tissu adipeux.

Le transfert de l'OTA dans le lait a été démontré chez le rat, le lapin et l'Homme.

Cependant chez les ruminants, grâce au métabolisme de l'OTA par la microflore

digestive, une faible quantité d'OTA est transférée dans le lait (Creppy, 2002).

3- Toxicité de l'OTA

L' IARC (1993 b) a classé l'OTA dans le groupe 2B comme un carcinogène

humain probable La génotoxicité de l'OTA a été démontrée par Creppy et al (1985)

O

OH

C6H5 -CH2- CH - NH- CO

CH3

Cl


30/162

sérums de patients néphropathes en Afrique du Nord notamment en Tunisie et en

Algérie (Creppy, 1992 ; Maaroufi et al., 1995).

Dans le but d’établir une association géographique avec la néphropathie

endémique, Puntaric et al. (2001), ont montré que respectivement 75.8% et 33.3% des

échantillons du blé et du maïs en Croatie étaient contaminés par de l’OTA. Les

concentrations étaient variables d’un échantillon à l’autre et atteignent des taux élevésallant de 0.02 à 160 g/kg dans le blé et 0.02 à 40 g/kg dans le maïs.

4- Occurrence de l'OTA dans les aliments au Maroc

Au Maroc, les investigations relatives aux mycotoxines en général et à l'OTA

en particulier restent assez limitées. Selon Le Tutour et al. (1983), l'analyse de 70

échantillons de blé prélevés dans différents points de vente par chromatographie sur

couche mince (CCM), a montré qu'un seul échantillon s’est révélé contaminé par

l’OTA à une concentration de 50µg/kg. Plutard, dans un travail soutenu par la

Direction de la Répression des Fraudes et la Protection des Végétaux, 3 échantillons

d’orge sur 75 échantillons analysés contenaient de l’OTA (Tantaoui-Elaraki et al.,

1994).

Récemment, des études préliminaires menées par Filali et al. (2001) ont montréla contamination du vin rouge par de l’OTA avec des concentrations allant de 0,028 à

3,24 µg/l et la contamination d’un jus de fruit par une concentration de 1,16 µg/l

d’OTA L'analyse de l'OTA dans le sérum a montré que la population marocaine est


31/162

OH

B - LA ZEARALENONE (ZEN)

1- Microorganismes producteurs et aliments contaminés

La ZEN [6-(hydroxy-6-oxo-trans-1-undecenyl)-β-acide résorcylique µ-lactone,

(figure 5)] est une mycotoxine produite principalement par les espèces du genre

Fusarium (tableau 4). C’est un contaminant naturel de certaines céréales, en particulierdu maïs dans de nombreux pays d’Afrique et d’Europe, ainsi qu’aux Etats-Unis.

Quoique les Fusarium infectant les céréales produisent la ZEN avant la récolte,

des études ont montré que cette toxine peut être produite à de hautes concentrations

dans les graines de maïs destinées à l'alimentation animale pendant le stockage. (Pittet,

1998).

OHO

Y

X

R

CH3


32/162

2- Toxicité de la ZEN

La ZEN et ses métabolites (α et β zéaralénols ; α et β zéaralanols) sont classés

par l'IARC dans le groupe 3 (IARC, 1999). Selon Creppy (2002), la ZEN et ses

métabolites ont montré une compétitivité pour fixer les récepteurs de l’œstrogène. A

de hautes concentrations, la ZEN produit plusieurs altérations du système immunitaire.

Elle produit également des altérations du tractus de reproduction chez des modelsexpérimentaux (souris, rat, lapin…). La ZEN a montré une action œstrogène

(Gonflement et rougissement de la vulve, prolapsus vaginal, accroissement de la taille

de l’utérus, chaleurs anormales…) chez divers animaux domestiques (Creppy, 2002).

Concernant sa génotoxicité, la ZEN n'induit pas de mutations chez S.

typhimurium, cependant elle provoque des aberrations chromosomiques dans les

cellules ovariennes chez le hamster et elle induit la réparation SOS chez les bactéries

(Ghédira-Chekir et al., 1999).

La ZEN a été récemment évaluée par le comité mixte d'experts FAO/OMS

(JECFA, 2000). Le comité a établi la consommation journalière provisoire maximale

tolérable (PMTDI) pour la ZEN et ses métabolites (incluant l' α-zéaralanol) à 0,5µg/kg

du poids corporel par jour.

C- LES FUMONISINES


33/162

O

CH3

OH OHO

Les fumonisines contaminent fréquemment le maïs et les produits à base de

maïs, mais elles contaminent aussi l'asperge, le riz, l'orge, le blé, la bière, le thé noir et

les plantes médicinales (Scott et Lawrence, 1995; Kim et al, 2002).

2- Fumonisine B1

La fumonisine B1 (FB1), ou "le diester du 1,2,3 acide tricarboxylique propane"est la principale toxine dans ce groupe (figure 6). La FB1 a été détectée dans le maïs et

ses produits de base à des concentrations élevées de l’ordre des mg/kg. Ces taux (ppm)

ont été également reportés dans des aliments destinés à la consommation humaine.

Selon Maragos et Richard (1994), la contamination du lait cru par la FB1 est possible,

cependant aucun résidu de ces substances n'a été détecté dans le lait après

administration orale ou intraveineuse.

CH3 CH3 OH

O C (COOH) CH CHCH COOH

NH2

O2C (COOH) CH2 CHCH2 COOH


34/162

porc, la FB1 est également hépatotoxique et néphrotoxique pour le porc, le rat, la

souris et le lapin (Dutton, 1996). L'IARC a déclaré les toxines produites par F.

moniliforme comme des cancérogènes potentiels chez l'homme et les a classées dans le

groupe 2B (IARC, 1993 c).

La FB1 est phytotoxique, elle endommage les membranes cellulaires et réduit la

synthèse de la chlorophylle. Elle perturbe la biosynthèse des sphingolipides chez les plantes (Creppy, 2002). Elle inhibe la croissance cellulaire et altère le métabolisme

lipidique chez Saccharomyces cerevisiae (OMS, 2000). Chez l’homme, il n’y a aucune

confirmation de la toxicité aiguë des fumonisines, cependant une corrélation entre

l’exposition aux fumonisines en Afrique du Sud et le cancer de l’œsophage a été

suggéré (Norred et Voss, 1994).

D- LA PATULINE

La patuline est une mycotoxine produite par de nombreuses moisissures

appartenant aux genres Aspergillus et Penicillium dont A. clavatus, moisissure de la

mycoflore des graines, Penicillium expansum, agent de pourriture des pommes

entreposées. Elle peut être produite également par Byssochlamys nivea et B. fulva,

champignons présents dans divers jus de fruits (Pittet, 1998). La patuline est un

contaminant naturel des pommes endommagées et de leur jus, mais elle a été produiteau laboratoire par d'autres variétés de moisissures sur les graines, sur des produits

réfrigérés comme la viande et les fromages (Scott, 1991).


35/162

O

O

OH

O

Figure 7 : Structure de la patuline

E- LES TRICHOTHECENES

C’est une famille composée d’environ 148 composés, tous produits par de

nombreuses espèces fongiques dont celles des genres Fusarium, Penicillium,

Cephalosporum, Myrothecium, Trichoderma et Stachybotrys (OMS, 1980). Les

mycotoxines les plus étudiées dans ce groupe sont le déoxynivalénol (DON), les

toxines T-2 et HT-2.

La toxine DON est une vomitoxine qui contamine les céréales en particulier le

blé, l'orge, le maïs, le seigle, l'avoine, et le riz (Creppy, 2002). L'occurrence de latoxine DON est associée principalement avec F. graminarum et F. culmorum

(Bottalico, 1998). La DON peut provoquer des effets adverses après administration.

L'administration d'une dose aiguë est caractérisée par deux effets toxicologiques à


36/162

Tableau 4: Principales mycotoxines produites par les différentes espècesde Fusarium (Bottalico, 1998)

Espèces de Fusarium Mycotoxines produitesF. acuminatum

F. avenaceum

F. chlamydosporum

F. crookwllense

F. culmorum

F. equiseti

F. graminarum

F. heterosporum

F. moniliforme

F. oxysporum

F. poae

F. proliferatum

F. sambucinum

F. semitectum

F. sporotrichioides

F. suglutinans

F. tricinctum

F.venenotum

T-2, HT-2, DAS, MAS, MON, NEO

MON

MON

NIV, FUS, ZEN, ZOH

DON, ZEN, NIV, FUS, ZOH, AcDON

DAS, ZEN, ZOH, NIV, DAcNIV, MAS, FUS

DON, ZEN, NIV, FUS, AcDON, DAcDON, DAcNIV

ZEN, ZOHFB1

MON

DAS, MAS, NIV, FUS, T2, HT2, NEO

FB1, BEA, MON, FUP

DAS, T2, NEO, ZEN, MAS

ZEN

T-2, HT-2, NEO, MAS ,DAS

BEA, MON, FUP

MON

DAS

AcDON: Mono-acétyldéoxynivalénol; AcNIV: Mono-acétylnivalénol; BEA:B é i i DA DON Di ét ldé i lé l DA NIV Di ét l i lé l


37/162

VI- REGLEMENTATIONS DES MYCOTOXINES

a- A l’échelle nationale:

Actuellement au Maroc, il n’ya pas des normes ou des limites réglémentaires

fixant les teneures maximales des mycotoxines dans l’alimentation humaine et

animale. Un projet de normalisation de ces toxines a été préparé vers la fin des années90 par le comité interministériel pour le contrôle alimentaire et la répression des

fraudes (CIPCARF) mais il n’a pas encore été adopté. Ce projet prévoit la

normalisation des contaminants minéraux et organiques dans les aliments et fixe les

concentrations maximales admissibles des mycotoxines dans certaines denrées

destinées à l’alimentation humaine et animales :

• Matières premières : Pour les produits et matières servant à l’alimentation humaine,

en aucun cas la concentration maximale en mycotoxines ne doit dépasser les valeurs

suivantes :

- Céréales et produits assimilés :

- AFB1 : 5µg/kg dans les céréales

- Ochratoxines : 30µg/kg dans les céréales

- ZEN : 200 µg/kg dans les céréales

- Produits laitiers : - AFM1 : 0,05 µg/kg (lait de toute nature)

- AFM1 : 0,03 µg/kg (lait pour enfants de moins de 3 ans)

- Fruits et jus de fruits


38/162

• Produits concentrés

La concentration en aflatoxines des produits ayant subi une opération

d’élimination de leur eau de constitution, ou d’une partie de celle-ci, peut être

supérieure à celle de la matière première mise en œuvre, dans la limite de la quantité

d’eau éliminée :

- Lait en poudre : AFM1 : 0,5µg/kg

- LAIT EN POUDRE (ENFANTS) : AFM1 : 0,3µG/KG

• Dérivés des céréales

Les farines et sons qui proviennent directement des céréales peuvent contenir

des proportions en AFB1 différentes de celles des matières premières dont ils sont

issus :- Farine blanche de blé (farine fleur) : 3µg/kg d’AFB1

- Son du blé brut : 10 µg/kg d’AFB1

- Farine de blé complète : 5µg/kg

• Aliments de bétail

- AFB1 : 50 µg/kg : Aliments complets pour bovins, ovins et caprins (sauf

animaux laitiers, veaux et agneaux)

- AFB1 : 20 µg/kg : Aliments pour porcins et volailles (sauf porcelest, poussins,

cannetons et dindes)- AFB1 : 20 µg/kg : Aliments supléments pour animaux laitiers

- AFB1 : 10 µg/kg : Autres aliments complets pour animaux


39/162

la contamination des denrées alimentaires et des produits d’alimentation animale, et de

promouvoir l’harmonisation des réglementations et les procédures de contrôle et pour

recommander des stratégies permettant d’évaluer, de prévenir et de lutter contre la

contamination par les mycotoxines.

La nécessité de fixer des teneurs maximales en mycotoxines pour les aliments

destinés à la consommation humaine et animale est généralement reconnue. Les paysde l'Union européenne ont édité un règlement pour limiter la présence des aflatoxines

dans l’alimentation humaine (CEE, 1998). La limite maximale admissible en

aflatoxine B1 (ou des aflatoxines totales B et G) ne doit pas dépasser 2µg/Kg (ou

4µg/Kg pour les aflatoxines totales) dans les arachides, fruits à coque et fruits secs et

leur produits de transformation ainsi que dans les céréales et leur dérivés.

Selon ce même règlement, la limite maximale pour l’aflatoxine M1 dans le lait

est quant à elle fixée à 0,05 µg/l sachant que l’on estime qu'au plus 1 à 3 % de

l’aflatoxine B1 absorbée par une vache laitière est excrétée dans le lait sous forme

d aflatoxine M1 (Van Egmond, 1991).

En plus de ces limites communautaires, plusieurs pays du monde ont établi

leurs limites propres à eux concernant les mycotoxines dans les aliments. Le tableau

ci-dessous donne un aperçu sur les limites fixées par certains pays européens et lesUSA :


40/162

Tableau 5: Limites maximales pour les mycotoxines dans les aliments danscertains pays européens et les USA (Creppy, 2002).

Mycotoxine Pays LM (µg/kg ou µg/l) Aliments

AFB1

FinlandeAllemagnePays-basBelgiquePortugal

Autriche

Suisse

Espagne

LuxembourgIrlandeDanemarkGrèce

225525

52012125

5555

TousTousTousTousArachide

Aliments pour enfantsAutresTousCéréales, noixTousMaïs, céréalesTous

TousTousTousTous

AF totales:

(AFB1,AFB2,AFG1, et

AFG2)

Suède NorvègeFinlande

Allemagne

G. BretagneFranceItalieAutriche

Suisse

USABelgiqueBosnie

555

40,05410505 (B2+G1+G2)0,02 (M1+B1+B2+G1+G2)

5 (B2+G1+G2)0,012051 (B1+G1)

TousArachides, noix,Tous

TousEnzymes et formulations Noix, fruits secsTousArachidesTousAliments pour enfants

Tous Nourritures de bébésTousArachidesCéréales


41/162

Tableau 5 (Suite):

Mycotoxine Pays LM(µg/kg ou µg/l)

Aliments

AFM1

BelgiqueUSARép. Tchèque

France

Bulgarie

0,050,50,10,5

0,030,050,5

LaitLaitLait pour enfantsLait pour adultes

Lait pour enfantsLait pour adultes

Déoxynivalénol(DON)

USARussie

Autriche

10001000

750

BléCéréales

Blé

OchratoxineA(OTA)

RomaineRép.Tchèque

Danemark

AutricheSuisseGrèceFrancePays-bas

51205

25522050

TousAliments pour enfants

Céréales

PorcCéréalesCéréalesTousTousCéréales

Fumonisines(B1+B2)

Suisse 1000 Maïs

Roumanie 30 Céréales, huiles végétales


42/162

VII - IMPACT ECONOMIQUE DES MYCOTOXINES

Malgré les nombreuses recherches qui ont été faites sur l’aspect toxicologique

et pathologique des mycotoxines chez les populations humaines et animales, sur leur

implication directe ou indirecte dans l’apparition de certaines maladies telles les

cirrhoses, les cancers ou certaines maladies nutritionnelles comme le kwashiorkor

(Hendrickse, 1984) ou la maladie du kashin-Beck au Tibet en Inde (Jiambo et al.,1995), Peu de travaux ont été entrepris dans le but d’étudier l'impact financier et

économique des mycotoxines sur des populations spécifiques aussi bien dans les pays

industrialisés que les pays développés.

Les conséquences économiques engendrées par les mycotoxines sont lourdes.Dans les pays d’Amérique du Nord, la productivité des animaux a connu des pertes

énormes estimées à des billions de dollars par année (Miller, 1998). L’impact financier

des mycotoxines concerne non seulement les risques pour la santé de l’homme et les

animaux domestiques, mais aussi la dégradation de la qualité des produits agricoles

commercialisés tant pour le marché intérieur que pour l’exportation.

En s’appuyant sur des données recueillies en Indonésie, aux Philippines et en

Thaïlande, Lubulwa et Davis (1994) ont essayé de donner une estimation du dégât

économique annuel, réparti sur différents secteurs, provoqué par différentschampignons et les aflatoxines (tableau 6). Ces auteurs ont estimé que 20 à 29 % de la

production du maïs et même 22 à 45 % de la production d’arachide provenant de ces

trois pays dépassent une concentration en aflatoxines de 50 µg/ kg et sont de ce fait


43/162

Tableau 6: Estimation du dégât économique en Millions de $ Australiens, causépar différents champignons et les aflatoxines en Indonésie, aux Philippines et en

Thaïlande en 1991 (Lubulwa et Davis, 1994)

Secteur Nature des dégâts Maïs Arachide Maïs etArachide

Dégradation du produit commercialisé

Détérioration de l’aspectextérieur des graines.Rancissure, perte du

pouvoir germinatif.

70,9 36,8 107,7

Intoxication humaine Cancer du foie primairedû à l’aflatoxine 176,5 114,7 291,2

Intoxication desanimaux domestiques(volaille, porc, bétail)

Diminution decroissance, stérilité,effets mutagènes,tératogènes,carcinogènes

71,7 6,2 77,9

Total 319,1 157,7 476,9


44/162

CHAPITRE II : PROCEDES DE PREVENTION ET DE R EDUCTION DESMYCOTOXINES DANS LES PRODUITS ALIMENTAIRES

I- Généralités

Les dégâts économiques et les problèmes de santé humaine et animale

engendrés par les mycotoxines, à court ou à long terme, ont poussé les scientifiques à

chercher des méthodes efficaces pour réduire les taux de ces substances dans lesaliments ou bien empêcher leur production par les moisissures toxinogènes

Comme la présence des moisissures dans les récoltes est un phénomène naturel,

il serait impossible d’éliminer toute trace de mycotoxines des produits alimentaires.

Cependant il est possible de minimiser la contamination en prenant des précautions au

niveau de l’entreposage et la manutention des récoltes après la moisson et en

inspectant rigoureusement les produits avant la mise sur le marché. La réduction des

taux des mycotoxines relève à la fois du rôle des agriculteurs, des commerçants et des

industriels.

Plusieurs procédés ont été étudiés afin de prévenir la contamination des

matières premières par les mycotoxines. Chaque essai doit non seulement réduire la

concentration des toxines mais aussi éviter que les produits de dégradation ne soient

toxiques ou détériorent la qualité nutritionnelle des aliments traités. Selon Lopez-Garcia et Park (1999) un système de lutte intégré contre les mycotoxines doit se

concevoir à trois niveaux de production:


45/162

production ultérieure des mycotoxines. Cependant ces essais sont très difficiles à

mettre au point et restent peu concluants.

2-Lutte au moment de la récolte

Le moment de la récolte a une grande influence sur la production des

mycotoxines. Pendant cette période, deux facteurs sont à contrôler : le lavage et le

séchage. Ces deux pratiques jouent un rôle important dans la prolifération fongique

pendant l’entreposage.

3-Lutte et décontamination après récolte

Les procédures appliquées au cours de la période d'entreposage constituent une

barrière importante pour éviter l’exposition des consommateurs aux mycotoxines. Les procédés de décontamination doivent être efficaces sans rendre impropres à la

consommation les denrées traitées, elles doivent être simples à mettre en œuvre et peu

coûteux puisque le traitement peut concerner des tonnages importants.

Selon Park (1993), les trois procédés d’élimination des aflatoxines (physiques,

chimiques ou biologiques) constituent les stratégies de lutte les plus courantes après

récolte, les méthodes sont nombreuses et varient selon le type de mycotoxines, mais

selon Galvano et al, (2001), l'efficacité de chaque approche doit être évaluée selon des

critères spécifiques à savoir :

- Inactiver, détruire ou éliminer la toxine dans l'aliment,

- Ne générer aucun résidu toxique dans l’aliment


46/162

II- Procédés physiques

Les méthodes physiques sont nombreuses, elles sont basées en général sur le

lavage, le séchage, le broyage, le tri manuel, la séparation mécanique, le traitement par

un choc thermique et la torréfaction.

- Traitement thermique

Les mycotoxines sont en général thermostables et elles résistent à tous les procédés

utilisés pour l'élimination des micro-organismes (chauffage et stérilisation). Peers et

Linsell (1975) observaient que les aflatoxines restent stables dans les arachides ou

dans le maïs après un chauffage à 200°C pendant 30 minutes. Il est à noter que les

traitements thermiques dépendent en grande partie d'autres facteurs tels la teneur del'aliment contaminé en eau et de son pH (Rustom, 1997).

- Irradiation

L’irradiation a été considérée pour longtemps comme une solution possible de lutte

contre les microorganismes. Des méthodes satisfaisantes pour l'élimination des

mycotoxines ne sont pas encore mises au point. Cependant l’irradiation peut être

envisagée pour lutter contre les moisissures toxinogènes.

- Extraction

L'extraction des aflatoxines avec des solvants est un procédé qui a été étudié pour

leur élimination des arachides contaminées. Cependant le matériel traité par cette

méthode ne peut être destiné qu'aux animaux Le rapport solvant/aliment est un


47/162

Huwig et al. (2001), différents adsorbants ont été utilisés avec succès dans des

procédés de détoxification des aliments de bétail contaminés par les mycotoxines.

C'est le cas des argiles adsorbant les aflatoxines en particulier l'AFB1, le charbon actif

adsorbant la plupart des mycotoxines, et finalement certains polymères comme la

cholestyramine (résine échangeuse d'anions utilisée pour l'adsorption des acides

biliaires dans le tractus gastro-intestinal) adsorbant l'OTA.

III- Procédés chimiques

De nombreuses études ont évalué la capacité des substances chimiques à

inactiver ou réduire certaines mycotoxines, cependant la plupart des études ont été

axées sur les aflatoxines dans l’alimentation animale. D'autres recherches ont porté surles propriétés protectrices d'autres substances contre les effets des mycotoxines. Il est à

noter qu'actuellement le règlement européen interdit de décontaminer les aflatoxines

par des procédés chimiques ou de mélanger des produits contaminés avec d'autres

produits qui ne le sont pas dans l’intention d’abaisser la teneur jusqu’à la limite

maximale admissible.

- Traitement à l'ammoniaque

L’ammonisation (traitement des denrées contaminées par l'ammoniaque) est la

méthode chimique qui a fait l’objet des recherches les plus poussées. Selon Park

(1993), le traitement à l'ammoniaque est une solution pratique et efficace pour la

détoxication des aflatoxines dans les denrées alimentaires et l’alimentation du bétail.


48/162

- Bisulfites

Les bisulfites ont été ajoutés aux aliments pour inhiber les activités de certaines

enzymes mais aussi pour retarder la croissance des micro-organismes. Doyle et Marth

(1978) ont constaté que les bisulfites réduisent les taux des aflatoxines B1 et G1

d'environ 50 % après environ 5 jours de traitement et que cette durée peut être réduite

à une journée si la température atteint 55° C au cours du procédé de traitement.

- Les antioxydants

La recherche des propriétés protectrices des substances anti-oxydantes contre les

effets néfastes des mycotoxines a été largement étudiée. Les vitamines (A, D et E) et le

sélénium ont donné des résultats positifs en inhibant la complexation des mycotoxines

à l'ADN. Des résultats similaires ont été obtenus avec les riboflavines et descaroténoïdes (Galvano et al., 2001).

IV- Procédés biologiques

Contrairement aux procédés chimiques et physiques, les procédés biologiques

restent encore moins étudiés. Selon Lopez-Garcia et Park (1999), les méthodes

biologiques ayant des propriétés de décontamination efficaces sont en général le

résultat de composés spécifiques produits par des micro-organismes sélectionnés.

L'existence d'activité de dégradation des mycotoxines dans les graines de céréales

stockés pendant l'hiver a été rapportée par plusieurs chercheurs. La toxine DON, les

toxines T-2 et HT-2 peuvent être dégradées par les enzymes du blé et du maïs Une


49/162

l'OTA, l'AFB1, la DON et la ZEN par la flore du tractus digestif des ruminants (porc,

bovins).

Grâce aux informations recueillies dans le domaine de la biotechnologie sur les

microorganismes et à l'accumulation des connaissances sur les capacités illimitées du

catabolisme des populations microbiennes, plusieurs spécialistes se sont orientés

récemment vers une approche microbiologique pour la détoxification des aliments

contaminés par les mycotoxines. Cette approche consiste en une réduction ou une

dégradation des mycotoxines par des microorganismes spécialisés (Bata et Lastztity,

1999). Les procédés biologiques ont plusieurs avantages:

- La destruction des toxines, leur réduction ou leur inactivation,- L'inactivation des spores et du mycélium,

- La conservation de la valeur nutritionnelle de l'aliment,

- La conservation des propriétés physiques du matériel cru,

- Le coût faible du processus de décontamination.

Selon Bhatnagar (1991), la détoxification biologique des mycotoxines consiste en

une transformation ou une dégradation enzymatique des toxines en produits moins

toxiques. Une fois les microorganismes et les enzymes responsables de la

détoxification sont découverts, les études doivent être focalisées sur le développement

et l'optimisation des procédures sous diverses conditions.

1- Interactions entre les mycotoxines et les microorganismes


50/162

des souches d'A. fumigatus de dégrader l'OTA dans les milieux de cultures liquides.

Par ailleurs, des souches d'A. niger CBS120.49 se sont montrées capables de dégrader

l'OTA et l’ochratoxine α (OTα) dans les milieux liquides et solides en secrétant une

enzyme: la carboxypeptidase.

1-2 Dégradation de l’AFB1 par Flavobacterium aurantiacum

La première évidence de la capacité des bactéries à dégrader les molécules

d’aflatoxines a été démontrée par Ciegler et al. (1966 a et b). Ces auteurs ont étudié

l’effet d’un millier de micro-organismes comptant parmi elles des levures, des

moisissures et des bactéries. Une seule souche a montré un effet de dégradation

irréversible sur l’AFB1 dans des milieux solides et liquides. Il s’agit deFlavobacterium aurantiacum. Le pourcentage de dégradation totale était de 100%

après 88h d’incubation.

Lillehoj et al. (1967) ont montré que la température optimale de dégradation de

l’AFB1 par F. aurantiacum est de 35°C et le pH optimum de dégradation est de 6,75.

Lillehoj et al. (1971) ont rapporté que l’ajout d’une préculture de 2.1010 cellules /ml

d’une préculture de F. aurantiacum de 48 h dégrade 40% de l’AFM1 par simple

contact, alors que l’incubation pendant 4 h dégrade complètement la toxine.

La dégradation des aflatoxines dans certains aliments par les micro-organismes

et en particulier par F. aurantiacum a été rapportée également par Hao et Brackett

(1988) et Line et al (1994) Cependant le mécanisme de leur dégradation n’est pas bien


51/162

2- Interactions entre Les bactéries lactiques et l’aflatoxine.

2-1- Effets de l’aflatoxine sur les bactéries lactiques.

L’effet de l’AFB1 sur les bactéries lactiques au cours de la fermentation a été

étudié par plusieurs auteurs, en particulier l’effet d'inhibition des enzymes. Ce

dernier dépend de la concentration de la toxine, de la nature des souches étudiées, et de

la nature de l’enzyme en question. L’activité protéolytique chez Lactococcus lactis est

inhibée par l’AFB1, l’inhibition est proportionnelle à la concentration de la toxine

initiale utilisée (Mohran et al, 1984). Ces mêmes auteurs ont conclu qu’il n’ya aucun

effet inhibiteur chez Lactococcus diacetylactis, Streptococcus thermophilus,

Lactobacillus bulgaricus et Lactobacillus casei.

Sutic et Banina (1990) ont montré qu’en présence de l’AFB1, des souches de L.

casei, L. plantarum et S. thermophilus, à métabolisme homofermentaire, ont

commencé à produire énormément de gaz dans des milieux liquides à partir du

glucose, du lactose, du sucrose et du galactose. Ces résultats suggèrent que le

métabolisme hétérofermentaire survenu chez les espèces étudiées est essentiellement

dû à l’AFB1.

Selon Khaddor (1992), l’AFM1 utilisée à une concentration de 1 µg/l n’a causé

aucun effet sur la croissance des bactéries lactiques de la fermentation du "leben" et du

yaourt. Cependant à une concentration de 5 µg/l, il y a inhibition de la croissance et de

la production d’acide lactique chez S thermophilus Alors que chez L bulgaricus il y a

2 2 Réd ti d fl t i l b té i l ti


52/162

2-2- Réduction des aflatoxines par les bactéries lactiques.

Au cours de la fermentation lactique, plusieurs espèces bactériennes ont montré des

capacités dégradatives des aflatoxines (Blanco Jose et al., 1988). Rasic et al. (1991)

ont observé une diminution des taux d’AFB1 dans le yaourt et le lait acidifié. Les taux

de L’AFB1 ajouté au lait avant fermentation à des concentrations allant de 600, 1000

et 1400 µg/kg ont été réduit respectivement de 97, 91 et 90 % dans le yaourt à pH 4.

Khaddor (1992), en étudiant la fermentation lactique du yaourt et du "leben" a

montré que les bactéries lactiques dégradent l’AFM1 mais à des pourcentages

variables et il a conclue que les bactéries mésophiles sont plus efficaces que les

bactéries thermophiles. Les souches acidifiantes ( Lc. lactis et L. bulgaricus) se sontmontrées capables de dégrader l’AFM1 beaucoup plus que les souches aromatisantes.

Selon ce même auteur, la nisine produite par les souches de Lc. Lactis ne semble

pas avoir un effet sur la dégradation de l’AFM1 et il a suggéré que l’effet des bactéries

lactiques sur les aflatoxines est probablement dû à une dégradation enzymatique plutôt

qu’à une élimination par acidification ou par une action des bactériocines telle la

nisine.

CHAPITRE III FERMENTATION PANAIRE TRADITIONNELLE


53/162

CHAPITRE III : FERMENTATION PANAIRE TRADITIONNELLE

I- Introduction

Le pain, aliment de base aussi bien en ville qu’à la campagne, est obtenu par

une technologie alimentaire des plus anciennes inventées par l’homme. Ce sont les

Egyptiens qui furent les premiers à observer accidentellement la fermentation panaire

après la levée de la pâte abandonnée au repos. Le pain a subi au cours de l’histoire desmodifications quant à ses qualités organoleptiques que nutritionnelles grâce au progrès

scientifique.

Au Maroc, la préparation du pain est essentiellement quotidienne et se fait

d’une manière traditionnelle en milieu rural. La fermentation de la pâte est le résultat

de l’association des levures et des bactéries lactiques. Par contre en ville la

fermentation est devenue moderne, elle se base uniquement sur l’utilisation de la

levure boulangère : Saccharomyces cerevisiae.

II – Les agents de la fermentation

1- Les levures

Les levures, micro-organismes eucaryotiques unicellulaires largement répandus

dans l’environnement sont utilisés par l’homme depuis des millénaires. Le mot levure

dérive du mot latin «levare » qui se définit par le principe qui fait lever le pain. C’est

avec les travaux de Pasteur que le rôle des levures dans la fermentation alcoolique a

La libération de substances aromatiques outre le CO et l’éthanol ce qui développe la


54/162

- La libération de substances aromatiques outre le CO2 et l éthanol, ce qui développe la

flaveur caractéristique du pain.

L’espèce la plus connue dans la fermentation du pain industriel moderne est S.

cerevisiae. Cependant d’autres espèces peuvent jouer des rôles plus ou moins

importants notamment Cryptococcus albidus, Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces

marxianus, Zygosaccharomyces baillii et des souches du genre Candida.

2- Les bactéries lactiques

Les bactéries lactiques sont largement utilisées en industrie agroalimentaire,

leur métabolisme est toujours fermentaire, elles présentent souvent plusieursauxotrophies pour les acides aminés, les acides nucléiques, les vitamines et certains

acides gras et elles possèdent tous les atouts technologiques essentiels pour l’obtention

d’une bio-conservation optimale, d’un arôme et d’une caractéristique des produits

alimentaires fermentés (Coffey et Daly, 1994). De plus les bactéries lactiques sont

capables d’hydrolyser les phytates et augmenter la biodisponibilité de certains

minéraux comme le fer dans le pain fermenté (Faid et Tahiri-Hassani, 1994).

Les travaux de Faid et al. (1993) sur la fermentation panaire traditionnelle

marocaine ont permis d’isoler plusieurs espèces des genres Lactobacillus, Leuconostoc

et Pediococcus. Des espèces du genre Lactobacillus ont été isolées lors de la

fermentation acide du seigle en Allemagne par Spicher et Schröder (1978) et et par

Baber et Beuguena (1988) en Espagne

Les bactéries lactiques jouent plusieurs rôles au cours de la fermentation dont le


55/162

Les bactéries lactiques jouent plusieurs rôles au cours de la fermentation dont le

principal est l’acidification de la pâte qui contribue au développement d’un goût

typique du pain au levain. Les acides organiques (acide lactique ou acide acétique)

produits lors du métabolisme homofermentaire ou hétérofermentaire peuvent atteindre

des concentrations maximales respectives de l’ordre de 0.97 % et 0.30 % (Spicher,

1983). Au cours du métabolisme hétérofermentaire il y a production de gaz sous forme

de CO2 en quantité plus ou moins importante mais qui restent inférieures à celles

produites au cours de la fermentation de la levure.

Les bactéries lactiques sont douées d’activités protéolytiques variées et

complexes incluant des protéases et des peptidases intracellulaires et extracellulaires

(Exterkate, 1983). Les protéines et les acides aminés libérés dans la pâte au cours de lafermentation panaire jouent un rôle dans l’apparition d’arômes caractéristiques. La

protéolyse dépend du temps de la fermentation, de la température, des espèces

bactériennes et de la richesse de la farine en protéines (Spicher et Nierle, 1984).

III- Technologie panaire et levains traditionnels

1-Technologie panaire

La panification a pour objectif principal l’obtention d’une pâte levée qui après

cuisson donne un produit appelé : pain. Selon (Testard, 1985), la panification se

déroule en plusieurs phases successives :

- Pétrissage : Cette étape débute par un mélange de la farine l’eau le sel et les

- La division et le façonnage : La pâte est ensuite divisée en pâtons façonnée et


56/162

La division et le façonnage : La pâte est ensuite divisée en pâtons façonnée et

laissée pour subir une deuxième fermentation ou Apprêt.

- L'apprêt : il dure 1 à 3 heures, il dépend de plusieurs paramètres à savoir la

quantité de levain, la température, l’hydratation de la pâte et le mode de pétrissage.

-La cuisson : Elle se fait entre 250 °C et 300°C, elle dure entre 10 et 45 minutes,

la durée varie en fonction du volume des pâtons.

- Le Ressuage : Cette dernière étape consiste en un refroidissement du pain pour

avoir une humidité bien équilibrée et une bonne conservation.

2-Levains traditionnels

La préparation des levains traditionnels est pratiquée au Maroc en milieu ruraldepuis des siècles et elle l’est toujours dans certains pays occidentaux (Italie, USA,

Allemagne...) ainsi que dans les pays arabes. Même si les méthodes de préparation

varient d’une région à l’autre ou d’un pays à l’autre, elles consistent en une culture

mixte de levures et de bactéries lactiques. Plusieurs méthodes de préparation des

ferments traditionnels sont utilisées, elles consistent en un mélange d'un matériel

étranger ("leben", jus de citron, eau de rinçage du thé, ail…) avec de l'eau et de la

farine à fermenter. Il est à noter que tous les pains obtenus ont tous un même goût

acide.

Selon Tahri-Hassani (1996), la fermentation par les levains traditionnels

préparés à partir du leben et du citron offre une meilleure biodisponibilité des

minéraux et une amélioration des caractéristiques organoleptiques ce qui permettrait

3- Caractéristiques du pain au levain


57/162

3 Caractéristiques du pain au levain

Le tableau 7 résume les différentes caractéristiques physico-chimiques du pain

au levain. Quant aux caractéristiques aromatiques, l’acide lactique et l’acide acétique

jouent un rôle important dans le développement des caractéristiques organoleptiques

du pain. L’acide acétique est le composé responsable de l’arôme typique du pain au

levain alors que l’acide lactique est responsable de la saveur acide.

De nombreux facteurs interviennent dans le goût et l’arôme du pain en

particulier le type de la farine et les espèces microbiennes constituant le levain (Onno

et Roussel, 1994). Selon Spicher et Stephan (1982), plusieurs groupes de substances

jouent un rôle dans l’arôme du pain au levain et dont les origines sont les matières

premières, le métabolisme fermentaire et les réactions de cuisson. Ces substancessont : les acides organiques, les esters éthyliques des acides organiques, les alcools, les

aldéhydes, les cétones, les composés sulfurés, etc.

4 - Interactions levures - bactéries lactiques

La fermentation panaire traditionnelle est toujours due à l’interaction des

levures et des bactéries lactiques. La levure boulangère S. cerevisiae est toujours

contaminée par une flore de bactéries lactiques, celle-ci joue un rôle acidifiant de la

pâte si la fermentation est maintenue à des températures relativement élevées par

rapport à celles des levures.

Les interactions éventuelles entre ces deux populations ont trois origines

acétique lors de la combinaison des quelques espèces de bactéries lactiques ( L. brevis


58/162

q q q p q (

et L. plantarum DC400) avec d’autres espèces de levures notamment S. cerevisiae et S.

exiguus.

Meignen et al. (2001) ont caractérisé un pain obtenu par une combinaison mixte

de L. brevis et S. cerevisiae. La fermentation combinée a entraîné une réduction de la

production de l’éthanol mais une augmentation de la production du glycérol, de l’acide

acétique et de 15 substances d’arômes dont de forts pourcentages du 3-méthyle 1-

buthanal, du 3-méthyle 1-buthanol, du 2-méthyle 1-buthanol, d’éthyle lactate et du 2-

phényle éthyle alcool. La forte production de ces composés aromatiques est

probablement liée à l’activité protéolytique des bactéries lactiques. Les acides aminés

libérés sont utilisés par S. cerevisiae pour la production des alcools, une corrélationentre les concentrations des acides aminés et les composés aromatiques a été établie

(Spicher et Nierle, 1988).


59/162

Tableau 7: Principales différences entre le pain au levain et le pain à la levure

selon Onno et Roussel (1994)

Caractéristiques Pain au levain Pain à la levure

pH 3.8 - 4.6 5.3 - 5.8

Acide acétique (seigle)

Acide acétique (blé)

0.25 - 0.30 %

0.10 - 0.40 %

-

0.005- 0.04 %

Acide lactique (seigle)

Acide lactique (blé)

0.8 - 0.9 %

0.4 – 0.8 %

-

0.005 - 0.04 %Conservation

microbiologique

Bonne protection contre les

bactéries et les fongiques

Sensible à l’action des

bactéries et des moisissures

Aspects nutritionnels

Hydrolyse enzymatique assez

forte. Activité optimale des

phytates dégradant l’acide

phytique

Hydrolyse enzymatique

faible.

Activité réduite des phytates

OBJECTIFS DU TRAVAIL :


60/162

Les principaux objectifs du présent travail sont :

- Etude de la contamination de certaines denrées alimentaires par les toxines de

Penicillium (aflatoxines et OTA), et les toxines de Fusarium (ZEN et FB1).

- Etude de la réduction des aflatoxines par voie microbiologique (cas des

bactéries lactiques)


61/162

M ATERIEL ET METHODES

CHAPITRE I : DETERMINATION DES MYCOTOXINES DANS LES DENREES


62/162

ALIMENTAIRES

I- Détermination des mycotoxines dans les céréales et les épices

-Principe

Le principe de la détermination des mycotoxines est basé sur leur extraction desaliments par des solvants organiques convenables et leur purification sur une colonne

d’immuno-affinité (figure 8).

Les colonnes d’immuno-affinité contiennent chacune un anticorps très

spécifique pour chaque mycotoxine recherchée et la purification de la mycotoxine

dépend de son affinité à l’anticorps en question. Il est important de noter que

l’anticorps peut être dénaturé par une température élevée et des changements de pH.

Le tampon doit être toujours au dessus du gel et la colonne doit être conservée entre 2

et 8°C.

L’élution de la toxine est effectué par un éluant (solvant organique) dénaturant

la liaison anticops-antigène. L’identification et la quantification de la toxine dans

l’éluât se fait finalement par chromatographie liquide de haute performance (HPLC)

couplé à un fluorimètre.

- Echantillonnage

Soixante (60) échantillons de céréales dont le blé (n=20), l’orge (n=20) et le

maїs (n=20) et 55 échantillons d’épices dont le piment rouge (n=14), le poivre (n=15),

le cumin (n=14) et le gingembre (n=12) commercialisées au Maroc ont été prélevés

Figure 8 : Schéma montrant les principales étapes utilisées pour l’analyse desm coto ines par HPLC


63/162

mycotoxines par HPLC.

EXTRACTION Blinder à grande vitesse

Papier wattman

DLUTION / FILTRATION Erlenmeyer

Seringue

ADSORPTION / ELUTION

Gel (tampon)

Colonne d’immuno-affinitécontenant un anticorps spécifique

Selon les recommandations européennes récentes reportées par Miraglia et Brera


64/162

(2000), l’analyse des mycotoxines dans les denrées alimentaires doit être ciblée par les

investigateurs vu l’écologie des moisissures qui diffère d’une moisissure à une autre etla nature chimique propre de chaque aliment, ainsi selon ces recommandations nous

avons procédé aux analyses suivantes :

- Détermination de l’OTA dans le maïs, le blé et l’orge.

- Détermination des aflatoxines dans le blé.

- Détermination de la ZEN et de la FB1 dans le maïs.

- Détermination des aflatoxines dans les épices

- Détermination de l’OTA dans les fruits secs et les olives noires.

I-1 Mycotoxines dans les céréales

a- Préparation des standards des mycotoxines

La préparation des standards des mycotoxines a été effectuée selon les procédures

décrites dans le journal officiel AOAC international (2000). Les solutions diluées des

mycotoxines sont peu stables, se dégradent à la lumière et doivent être renouvelées

régulièrement. Les mycotoxines sont des substances potentiellement toxiques pour

l’homme, la manipulation des standards doit être effectuée dans un laboratoire

spécialisé équipé du matériel de protection adéquat (gants, hottes d’aspiration,

masques etc.).

b- Détermination des mycotoxines dans les céréales

contenant un anticorps spécifique de l’OTA. La colonne a été lavée par 10 ml d’eau


65/162

bidistillée et l’air a été éliminé par une seringue jusqu’au sec. L’OTA a été éluée par

application en premier de 1,5 ml de méthanol à 2% acidifié avec l’acide acétiqueglacial. L’éluât a été dilué avec 1,5 ml d’eau bidistillée et mélangé au vortex. 200 µl de

l’éluât dilué ont été injectés à un HPLC équipé d’un injecteur automatique et un

détecteur de fluorescence. La colonne C18 Kromasil KR100 (150 x 4.6 mm, 5µm) a

été utilisée. La phase mobile utilisée était le mélange acétonitrile-eau (2%) acidifié

avec l’acide acétique glacial (50 : 50, v/v). Le flux a été fixé à 1 ml.min-1. Le

fluorimètre a été opéré à des longueurs d’ondes d’excitation et d’émission

respectivement de 333 et 460 nm. Le temps de rétention de l'OTA dans les conditions

décrites ci-dessus est 5 min.

- Analyse de la ZEN

Les échantillons ont été analysés suivant une méthode validée au laboratoire

(ISS, Rome). 25g d’échantillon broyés ont été extraits par 125ml d’acétonitrile à 75 %

dans l’eau bidistillée en utilisant un blinder à grande vitesse pendant 2 minutes. Après

filtration sur papier wattman n°4, 20 ml du filtrat ont été dilués par 80 ml d’eau

bidistillée. 25 ml du filtrat dilué ont été appliqués à une colonne d’immuno-affinité

(Easi-Extract® Zéaralenone, R-Biopharm Rhône LTD, Glasgow, Royaume-Uni)

contenant un anticorps monoclonal spécifique de la ZEN. La colonne a été lavée par

10 ml d’eau bidistillée et l’air a été éliminé par une seringue jusqu’au sec. La ZEN a

été éluée par application de 1,5 ml de méthanol. L’éluât a été dilué avec 1,5 ml d’eau

bidistillée et mélangé au vortex. 100 µl de l’éluât dilué ont été injectés à un HPLC

(même équipement que dans l’OTA) La phase mobile utilisée était le mélange

- Analyse de la FB1

’ i d l 1 é é f i l é h d AOAC dé i


66/162

L’extraction de la FB1 a été faite selon une méthode AOAC décrite par

Visconti et al. (2001). 25 g d’échantillon broyés ont été extraits par un mélangeméthanol- acétonitrile-eau (25:25:50, v/v/v) en utilisant un blinder à grande vitesse

pendant 4 minutes. Après filtration sur papier wattman n°4, 10 ml du filtrat ont été

dilués avec 40 ml du PBS. Une colonne d’immuno-affinité (Fumoniprep, R-Biopharm

Rhône LTD, Glasgow, Royaume-Uni) contenant un anticorps monoclonal spécifique

des fumonisines (FB1, FB2 et FB3) a été conditionnée par 5 ml du PBS. 10 ml du

filtrat dilué ont été appliqués à la colonne. La colonne a été lavée par 10 ml d’eau

bidistillée et l’air a été éliminé par une seringue jusqu’au sec. La FB1 a été éluée par

application en premier de 1,5 ml du méthanol. L’éluât a été dilué avec 1,5 ml d‘eau

bidistillée et mixé au vortex. La dérivatisation pré-colonne des extraits a été faite avecle mélange Ortho-Phtaldialdéhyde (OPA) / 2-mercaptoéthanol (MCE). Le réactif

OPA/MCE est préparé chaque semaine en dissolvant 120 mg de l’OPA dans 3 ml du

méthanol auquel on ajoute 15 ml du tétraborate de sodium (0.1M) et 150 ml du MCE.

Le réactif est photosensible et doit être conservé à l’abri de la lumière. 450 µl du

réactif OPA/MCE sont additionnés de 50 µl de l’extrait à analyser, mixés au vortex.Après 3 min, 100 µl sont injectés à un HPLC. Le système HPLC consiste en un

injecteur automatique, un détecteur de fluorescence et une colonne C18 (150 x 4 mm,

5µm). La phase mobile utilisée était le mélange méthanol- dihydrogénophosphate de

sodium à 0,1M (77 : 23, v/v) ajusté à un pH 3,35 avec 85% d’acide phosphorique. Le

flux a été fixé à 1 ml.min-1. Le fluorimètre a été opéré à des longueurs d’ondes

d’excitation et d’émission respectivement de 335 nm et 440 nm. Le temps de rétention

de la FB1 dans les conditions décrites ci-dessus est 6 min

Rhône LTD, Glasgow, Royaume-Uni) contenant un anticorps spécifique des

fl t i (AFB1 AFB2 AFG1 t AFG2) t diti é 10 l d t


67/162

aflatoxines (AFB1, AFB2, AFG1 et AFG2) est conditionnée par 10 ml du tampon

PBS. 50 ml du filtrat dilué ont été appliqués à la colonne à un flux de 3 ml.min -1, lacolonne a été lavée par 20 ml d’eau bidistillée et l’air dans la colonne a été éliminé par

une seringue jusqu’au sec. Les aflatoxines ont été éluées par application en premier de

500 µl du méthanol. Ensuite, 1250 µl du méthanol ont été appliqués à la colonne et

collectés par pression de l’air à travers la colonne. Après élution, l’éluât a été dilué

avec 3250 µl d'eau bidistillée et mélangé au vortex. 100 µl de l’éluât dilué a été

injecté à un HPLC (même équipement que dans le cas de l’OTA et la ZEN). La

dérivatisation post-colonne a été effectuée avec la pyridine hydrobromide perbromide

(PBPB) à 0.005 % dans l’eau bidistillée à un flux de 0.4 ml.min-1. La colonne C18

Phenomenex (250 x 4.6 mm, 5µm) a été utilisée. La phase mobile utilisée était lemélange acétonitrile-eau-méthanol (17:54:29, v/v/v) à un flux de 1 ml.min-1. Le

fluorimè

These Zinedine

Documents

Transcript of These Zinedine