UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2011-2012

THERAPEUTISCHE KANKERVACCINATIE BIJ HONDEN

Door

Jennifer DEFOOR

Promotor: Prof.dr.Niek Sanders Literatuurstudie in het kader

van de Masterproef

De auteur en de promotor(en) geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen

voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met

betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie.

Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor(en). Het auteursrecht

beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en

neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde

studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en de promotor(en) zijn niet

verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

VOORWOORD

In eerste instantie wil ik mijn promoter, Prof. dr. Niek Sanders, bedanken om mij de kans te geven

deze literatuurstudie uit te voeren. Hij heeft mij heel vlug op weg gezet en was er altijd direct om een

extra woordje uitleg te geven.

Heel veel dank gaat uit naar dierenarts Sofie Denies (doctoraatstudente) die zeker geen tijd noch

moeite heeft gespaard. Dankzij haar toewijding, kennis, gedrevenheid en de regelmatige contacten

doorheen het ganse jaar, is het werken aan deze scriptie nooit volledig stilgevallen.

Verder had ik graag alle professoren bedankt voor het ter beschikking stellen van bepaalde artikels.

Ik zie er ook ten zeerste naar uit volgend jaar mee te kunnen werken aan een onderzoek in het kader

van deze literatuurstudie.

Bedankt allemaal!

Jennifer Defoor

INHOUDSOPGAVE

VOORWOORD

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING……………………………………………………………………………………………......1

ABSTRACT………………………………………………………………………………………………………2

INLEIDING………………………………………………………………………………………………………..3

LITERATUURSTUDIE…………………………………………………………………………………………..5

1. Tumor immunotherapie………………………………………………………………………………………5

1.1. Kankervaccinatie………………………………………………………………………….…...…..5

1.1.1. Tumorcelvaccins……………………………………………………………………….5

1.1.2. Dendritische cel vaccins………………………………………………………………6

1.1.3. Peptide vaccins………………………………………………………………………...9

1.1.4. DNA vaccins…………………………………………………………………………..10

1.2. Adoptieve celtherapie…………………..………………………………………………………..14

1.3. Regulatorische T cellen………………………………………………………………………….18

2. Therapeutische kankervaccinatie bij honden……………………………………………………………..19

BESPREKING…………………………………………………………………………………………………..23

REFERENTIELIJST…………………………………………………………………………………………….25

1

SAMENVATTING

Kankervaccinatie is de laatste jaren een groeiend onderdeel geworden van de hedendaagse

oncologie en is in vergelijking met chemotherapie uitermate veilig door de weinige neveneffecten.

Kankervaccinatie heeft echter lang gekampt met een lage effectiviteit door het bestaan van een

immunosuppressief milieu. Door nieuwe inzichten hoe dit milieu kan gemoduleerd worden, met een

centrale rol voor regulatorische T cellen, heeft de ontwikkeling van kankervaccinatie een nieuwe boost

gekregen. Er bestaan verschillende types van tumorvaccins. Geïnactiveerde tumorcellen, hetzij

geïsoleerd uit de patiënt hetzij afgeleid van tumorcellijnen, hebben als grote voordeel dat een brede

immuunrespons wordt opgewekt zonder dat kennis van belangrijke tumorantigenen noodzakelijk is.

Dendritische cellen, geïsoleerd uit de patiënt en geactiveerd in vitro, hebben de potentie om een zeer

krachtige immuunrespons op te wekken, maar zijn duur en het productieproces van deze vaccins is

complex. Voor zowel DNA als peptide vaccins moeten belangrijke tumorantigen gekend zijn en beide

lokken een nauwe immuunrespons uit, wat ruimte laat voor de ontwikkeling van escape-mutanten. Ze

zijn echter door hun eigenschappen veel geschikter voor productie op grote schaal. Kanker is een

belangrijke doodsoorzaak zowel bij de hond als bij de mens. De hond vormt een heel goed model voor

het bestuderen van humane tumoren door de talrijke gelijkenissen in biologie en histopathologie.

Onderzoek naar tumorvaccinatie bij honden is dus van groot belang zowel voor de humane

geneeskunde als de diergeneeskunde. Binnen de diergeneeskunde is vooral onderzoek gedaan naar

lymfoma en melanoma, en zijn tumorcelvaccins oververtegenwoordigd. Voor vijf vaccins is een

significant overlevingsvoordeel aangetoond: drie tumorcelvaccins (melanoma, lymfoma,

hemangiosarcoma) en twee DNA vaccins (melanoma en lymfoma). Het DNA vaccin voor de

behandeling van melanoma is geregistreerd voor klinisch gebruik in de Verenigde Staten.

Sleutelwoorden: Honden - Immunotherapie - Regulatorische T cellen - Tumor - Vaccinatie

2

ABSTRACT

Cancer vaccination has become part of the current treatment options for cancer patients. In

comparison with chemotherapy cancer vaccination is much safer and only associated with minor side

effects. Still, because of the existence of an immunosuppressive environment in cancer patients,

immunotherapy struggled with low efficacy for a long time. New insights into the role of regulatory T

cells and the modulation of this immunosuppressive environment gave a new boost to

immunotherapeutic approaches for the treatment of cancer. There are different types of tumor

vaccines. Inactivated tumor cells, either isolated from the patient or derived from tumor cell lines, offer

the advantage to generate a broad immune response without the need to know the important tumor

antigens. Dendritic cells, isolated from the patient and activated in vitro, have the potential to elicit a

powerful immune response, but they are expensive and the production process of these vaccines is

complex. For DNA vaccines as well as peptide vaccines, important tumor antigens have to be known

and they both provoke a very narrow immune response, which leaves space for escape mutants.

Nevertheless their characteristics make a large-scale production more suitable. For both dogs and

humans, cancer is an important cause of death. Dogs are very good models for the study of human

tumors because there are many similarities in tumor biology and histopathology. Research on tumor

vaccination in dogs is important for human as well as for veterinary medicine. In veterinary medicine

lymphoma and melanoma have been the main targets for cancer vaccination and tumor cell vaccines

are overrepresented. A significant survival rate has been demonstrated with five vaccines: three tumor

cell vaccines (melanoma, lymphoma, hemangiosarcoma) en two DNA vaccines (melanoma,

lymphoma). The DNA vaccine for the treatment of melanoma is approved for clinical use in the United

States.

Key words: Dogs - Immunotherapy - Regulatory T cells - Tumor - Vaccination

3

INLEIDING

Kankervaccinatie is de laatste jaren een groeiend onderdeel geworden van de hedendaagse

oncologie. Hierbij probeert men, gewapend met de kracht en specificiteit van het eigen

immuunsysteem, kwaadaardige tumoren te onderdrukken of te vernietigen. Onderzoek heeft

uitgewezen dat immunodeficiënte individuen statistisch gezien vaker lijden aan kwaadaardige tumoren

in vergelijking met immunocompetente individuen (Bergman, 2010). Het immuunsysteem is zich in de

meeste gevallen wel degelijk bewust van de aanwezigheid van tumoren, hetgeen weerspiegeld wordt

door een accumulatie van immuuncellen op de plaats van de tumor (Bergman, 2010). Ook kunnen

tumorspecifieke T cellen in de tumor of in drainerende lymfeknopen gevonden worden (Bergman,

2010). Deze zaken vormen de theoretische basis voor de effectiviteit van kankervaccinatie.

FIGUUR 1: INTERACTIE TUSSEN TUMORCELLEN EN IMMUUNSYSTEEM (UIT CORTHAY ET AL., 2011)

Een tumor ontstaat wanneer het immuunsysteem er niet in slaagt om de tumorcellen te herkennen en

te verwijderen. De aanwezigheid van zwak immunogene tumorantigenen op tumorcellen is één van de

oorzaken van het falen van het immuunsysteem. Men onderscheidt tumorspecifieke (TSA) en

tumorgeassocieerde (TAA) antigenen. Tumorspecifieke antigenen worden enkel tot expressie

gebracht op neoplastische cellen, terwijl tumorgeassocieerde ook voorkomen op normale cellen.

Daarnaast creëert de tumor een immunosuppressief milieu door productie van immunosuppressieve

cytokines zoals vascular endothelial growth factor (VEGF), Fas ligand, interleukine 10 (IL-10) en

transforming growth factor β (TGF-β). Downregulatie en zelfs verlies van major histocompatibility

complex I (MHC I) expressie kan ervoor zorgen dat tumorcellen niet meer herkend worden door T

cellen. Ook hier geldt de regel “survival of the fittest”. Cellen die zich het best kunnen aanpassen om

een aanval van het immuunsysteem te ontwijken, kunnen verder prolifereren en zullen uiteindelijk

geselecteerd worden. Een heel belangrijk deel van immuno-evasie is toe te schrijven aan de werking

van regulatorische T cellen (Treg’s). Dit zijn CD4/CD25/cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA-

4

4)/glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor family-related gene (GITR)/Foxp3 positieve

cellen die de respons van CD4+ en CD8

+ T cellen kunnen onderdrukken (Bergman, 2010).

De enorme vooruitgang in cellulaire en moleculaire immunologie van de laatste decennia zorgde voor

nieuwe inzichten over de interacties tussen tumoren en immuuncellen (zie Fig. 1). Onder andere de

ontwikkeling van nieuwe adjuvantia en het beter begrijpen van de functie van dendritische cellen en

regulatorische T cellen hebben tot belangrijke recente doorbraken geleid. Een andere belangrijke

ontdekking is dat chemotherapie en immunotherapie een synergistisch effect kunnen hebben, en dus

niet incompatiebel zijn zoals lang werd aangenomen. Dit verhoogt sterk de toepasbaarheid van

tumorvaccins. De voordelen van kankervaccinatie in vergelijking met chemotherapie zijn de weinige

neveneffecten, de hoge specificiteit voor doelwitantigenen en het ontstaan van een immunologische

geheugen (Janikashvili et al., 2010). Hier wordt er voornamelijk ingegaan op de actieve specifieke en

adoptieve immunotherapie en niet zozeer op de niet specifieke en humorale immunotherapie (Pillay et

al., 2011). Belangrijk valt te benadrukken dat het gaat om een therapeutische vaccinatie waarbij de

dieren reeds lijden aan kanker, in tegenstelling tot vaccins voor infectieuze ziektes die voornamelijk

preventief gebruikt worden. Een ander verschil is het feit dat het doel ligt op het induceren van een

stevige cellulaire respons en niet zozeer op het produceren van antistoffen. Het belangrijkste nadeel

van tumorvaccins is dat het enig tijd duurt vooraleer er een sterke immuunreactie en klinisch effect

optreedt.

De hond vormt samen met de kat een heel goed model voor het bestuderen van humane tumoren.

Honden zijn gevoelig voor het ontwikkelen van een ganse reeks spontane tumoren die sterke

gelijkenissen vertonen in biologie en histopathologie met humane tumoren (Bergman, 2010). Deze

dieren leven in hetzelfde milieu als de mens en zijn zo onderhevig aan ongeveer dezelfde factoren die

een mogelijke rol kunnen spelen in de etiologie van kanker. Daarnaast gebruiken ze analoge

metabolisatiestrategieën voor geneesmiddelen als mensen zodat klinische responsen vergeleken

kunnen worden (Starkey et al., 2005). De tumoren met de grootste relevantie zijn osteosarcomen,

mammatumoren, orale melanomen, squameuze cel carcinomen, nasale tumoren, long carcinomen,

weke delen sarcomen en maligne lymfoma’s (MacEwen, 1990). Door de steeds beter wordende en

toegewijde diergeneeskundige zorgen zoals vaccinaties, nauwe opvolging van de gezondheidsstatus

en dieetmaatregelen werd een daling gezien van het aantal infectieuze ziektes maar dit zorgde zo

voor een relatieve stijging van het aantal sterftegevallen door kanker. Onderzoek naar tumorvaccinatie

bij honden is dus van groot belang voor zowel de humane als de diergeneeskunde. Tot op heden zijn

er 2 therapeutische kankervaccins geregistreerd. Provenge® is het humane dendritische cel vaccin

gericht tegen prostaatkanker (Harzstark et al., 2007). Voor diergeneeskundig gebruik werd Oncept™

ontwikkeld, een xenogeen DNA vaccin voor de bestrijding van orale melanoma’s bij honden (Elvidge,

2010).

5

LITERATUURSTUDIE

1. TUMOR IMMUNOTHERAPIE

1.1. KANKERVACCINATIE

1.1.1. TUMORCELVACCINS

Een tumorcelvaccin kan bestaan uit tumorcellen geïsoleerd uit de patiënt of kan afgeleid zijn van

tumorcellijnen. Deze vaccins hebben als grote voordeel dat een brede immuunrespons wordt

opgewekt zonder dat kennis van belangrijke tumorantigenen noodzakelijk is. Met autologe tumorcellen

is een therapie volledig op maat van de patiënt. Soms is het gebruik van autologe tumorcellen niet

mogelijk door een tekort aan materiaal. Anderzijds kan men gebruik maken van allogene tumorcellen.

Allogene tumorcelvaccins hebben, in vergelijking met autologe tumorcelvaccins, als voordeel dat hun

productie minder arbeidsintensief en economisch beter haalbaar is. Bovendien kunnen ze op een

gestandaardiseerde manier en op grote schaal worden geproduceerd. Door de standaardisatie is er

minder variabiliteit waardoor resultaten beter vergeleken kunnen worden (de Gruijl et al., 2008). Het

voornaamste nadeel is het feit dat de allogene cellen soms te weinig antigenische gelijkenissen

vertonen met de tumor van de patiënt.

Omdat levende tumorcellen weinig immunogeen zijn en om tumorgroei vanuit het vaccin te

voorkomen, worden de geïsoleerde tumorcellen geïnactiveerd. Afhankelijk van de gebruikte methode

zullen geïnactiveerde cellen aanleiding geven tot een effectieve immuunrespons of in het slechte

geval tot tolerantie. Er bestaan verschillende manieren om tumorcellen te inactiveren, maar

opeenvolgende vries-dooi cycli en γ-bestraling zijn veruit de meest gebruikte (Chiang et al., 2010). Om

een immunologische celdood te verwezenlijken is het belangrijk dat de methode gebruikt om de cellen

te doden de expressie van immunogene signalen kan induceren en immunogene eiwitten zichtbaar

kan maken voor het immuunsysteem. Calreticuline is een Ca-bindend chaperone eiwit dat zich bevindt

in het endoplasmatisch reticulum. Expressie op de celmembraan zorgt ervoor dat dergelijke cellen

sneller kunnen opgenomen worden via de binding met CD91 op fagocyterende cellen. Heat shock

proteïnen (HSP) die geïnduceerd worden door tal van stressoren, worden herkend via toll-like receptor

4 (TLR4) waardoor intracellulaire processing en presentatie vergemakkelijkt wordt. Het vrijgesteld

high-mobility group box 1 (HMGB1) van stervende cellen zorgt voor activatie van antigen

presenterende cellen via receptor for age (RAGE), TLR2 en TLR4. Ten slotte zullen ook vrijgekomen

nucleotiden via metabolisatie tot urinezuur en pro-inflammatoire cytokines een immuunrespons

6

veroorzaken (Kepp, 2009; Chiang et al., 2010). Vervolgens worden deze cellen terug geïnjecteerd bij

de patiënt eventueel in combinatie met adjuvantia (Dubensky et al., 2010).

Een andere manier om de immuunrespons te verhogen is genetische modificatie van autologe of

allogene tumorcellen met costimulatorische moleculen en/of cytokines zoals granulocyte-macrophage

colony stimulating factor (GM-CSF), tumor necrosis factor α (TNF-α) of interferon γ (INF-γ) ( Hogge et

al., 1998). Daarnaast kan men ook een sterk tumorantigen tot overexpressie brengen in de

tumorcellen (Dow et al., 1998). De transfectie van de tumorcellen kan gebeuren met onder andere

plasmide DNA of replicatiedefecte virussen die een costimulatorsche molecule of tumorantigen tot

expressie brengen.

1.1.2. DENDRITISCHE CEL VACCINS

Dendritische cellen (DC’s) zijn essentieel voor de opbouw van een stevige cellulaire en humorale

immuunrespons door antigenpresentatie aan naïeve T cellen (priming) wat leidt tot proliferatie en

differentiatie in T helper cellen en effector cellen. Immature dendritische cellen spelen een rol in de

regulatie van het immuunsysteem door het opwekken van tolerantie. Dendritische celvaccins bestaan

uit dendritische cellen van de patiënt die in vitro worden opgeladen met een of meerdere antigenen.

Terwijl men vroeger vooral gebruik maakte van dendritische cellen afkomstig van monocyten, heeft

men nu ingezien dat DC’s afkomstig van CD34+ precursor cellen uit het beenmerg effectiever zijn in

het induceren van antitumor T cellen. Dit zou te wijten zijn aan de aanwezigheid van voorlopers van

de Langerhans cellen in het preparaat (de Gruijl et al., 2008). Het is enorm moeilijk voldoende CD34+

DC’s in vitro te verkrijgen. De technieken zijn arbeidsintensief en er bestaat een grote fenotypische

variatie in de verkregen DC’s. Allogene DC’s (alloDC’s) kunnen gemakkelijker en in grote

hoeveelheden geproduceerd worden waardoor ze goedkoper zijn. Daarnaast zorgen ze voor een

standaardisatie zodat resultaten van klinische responsen vergeleken kunnen worden. Theoretisch

zouden ze ook leiden tot een betere immuunrespons door de aanwezige allo-antigenen van hun MHC.

Onderzoek heeft uitgewezen dat door het niet overeenstemmen van MHC I moleculen alloDC’s niet in

staat zijn een adequate antigenpresentatie en lymfocytenactivatie te bewerkstelligen (de Gruijl et al.,

2008). Wel zouden alloDC’s via cross-presentatie antigenen kunnen doorgeven aan autologe DC’s die

vervolgens zorgen voor een effectieve priming (Bird et al., 2008). Voorlopig wordt er weinig gebruik

gemaakt van allogene DC’s. Als altenatief voor DC’s worden soms B cellen gebruikt. Daar deze na

CD40 stimulatie een heel sterke proliferatie kennen, heeft men minder grote volumes bloed nodig om

een voldoende hoeveelheid antigen presenterende cellen (APC’s) te verkrijgen. Wanneer ze geladen

zijn met antigen beschikken ze in vergelijking met DC’s over een vergelijkbaar vermogen om

cytotoxische T lymfocyten (CTL’s) te activeren (Mason et al., 2008; Sorenmo et al., 2011).

7

In de meeste studies wordt een combinatie van GM-CSF en IL-4 gebruikt voor het genereren van

DC’s uit hun voorlopers, maar men heeft vastgesteld dat deze cytokines niet tussenkomen in de

maturatie. Immature DC’s zijn niet in staat om op een adequate manier T cellen te stimuleren. IL-12

kan hierbij helpen door een voldoende maturatie en activatie te voorzien (Sugiura et al., 2010).

Onderzoek naar andere cytokines die DC’s helpen matureren is lopende.

Na het bekomen van mature DC’s gaat men deze vervolgens opladen met tumor antigenen die door

de DC’s verwerkt en uiteindelijk gepresenteerd worden op het celoppervlak via MHC I en II (zie Fig. 2).

Men kan gebruik maken van één welbepaald peptide/proteïne of DNA coderend voor dat

peptide/proteïne om DC’s te laden. Bij de cruciale keuze van het doelwitantigen moet een onderscheid

gemaakt worden tussen unieke (gemuteerde of tumorspecifieke) en gemeenschappelijke (niet-

gemuteerde of tumorgeassocieerde) antigenen. Hierbij wordt hetzij immuniteit geïnduceerd hetzij

tolerantie doorbroken. Het voordeel van gemuteerde t.o.v. gemeenschappelijke antigenen is het feit

dat ze meer immunogeen zijn en het geringer risico op autoreactiviteit. Auto-immuniteit blijkt echter in

de praktijk geen problemen op te leveren en blijft dus eerder een theoretisch gegeven. Het nadeel van

tumorspecifieke antigenen is dat vele tot op heden en zeker in de diergeneeskunde niet gekend en

bijgevolg niet gekarakteriseerd zijn. Wanneer slechts één tumorantigen wordt gebruikt, kunnen

tumorcelvarianten die dit antigen via selectie niet meer tot expressie brengen, ontsnappen aan een

eliminatie door het immuunsysteem (Buonaguro et al., 2011). De noodzaak om immunodominante

epitopen in een bepaalde tumor te kennen, verdwijnt wanneer men DC’s in contact brengt met

tumorcellysaat. Hierdoor wordt het ganse repertoire van zowel intra- als extracellulaire antigenen ter

beschikking gesteld en ontstaat een brede immuunrespons (Chiang et al., 2010). Tevens is het

mogelijk een DC en een autologe of allogene tumorcel te fusioneren waardoor een cel bekomen wordt

die én het nodige mechanisme voor antigenpresentatie bezit én tumor specifieke antigenen tot

expressie brengt. Fusie wordt bekomen via electroporatie of door toedienen van het

membraandestabiliserend agens polyethyleenglycol (Chiang et al., 2010). Zowel bij het gebruik van

tumorcellysaat als bij fusie is immuno-evasie minder waarschijnlijk maar het (theoretische) risico op

inductie van auto-immuniteit neemt toe aangezien veel tumoren antigenen delen die ook op normale

cellen voorkomen. De anti-tumorrespons is een stuk hoger in vergelijking met het gebruik van één

welbepaald peptide of proteïne omdat naast CD8+ ook CD4

+ T cellen geactiveerd worden die

bijkomende hulp bieden (Chiang et al., 2010).

8

FIGUUR 2: DENDRITISCHE CELLEN VAN PATIËNT TOT VACCIN (UIT BERZOFSKY ET AL., 2004)

De geladen DC’s kunnen zowel intraveneus, intradermaal, subcutaan, intratumoraal als intranodaal

toegediend worden. Om een effectieve anti-tumor respons teweeg te brengen, moeten voldoende

geactiveerde DC’s de drainerende lymfeknopen bereiken en daar specifieke T cellen activeren (zie

Fig. 3). Daarvoor moeten ze bepaalde chemokine receptoren op de juiste plaats en tijd tot expressie

brengen en dit leidt vaak tot teleurstellende resultaten aangezien in de meeste gevallen minder dan

1% de lymfeknopen bereikt (de Gruijl et al., 2008).

FIGUUR 3: INTERACTIE TUSSEN GELADEN DC’S EN T CELLEN IN DE LYMFEKNOPEN (UIT KEAR , 2011)

9

1.1.3. PEPTIDE VACCINS

Peptide vaccins op basis van peptiden afkomstig van tumorspecifieke antigenen zorgen voor een

specifieke en sterke immuunrespons. Daar de tumorspecifieke antigenen van een bepaalde tumor in

vele gevallen niet gekend zijn, worden in de praktijk vaak tumorgeassocieerde antigenen gebruikt. In

het verleden werden voornamelijk korte peptiden gebruikt die slechts één epitoop omvatten dat door

CD8+ T cellen werd herkend. (Jain, 2010). Recente studies tonen echter aan dat rekrutering van zowel

CD8+ als CD4

+ T cellen wenselijk is aangezien T helper (Th) cel stimulatie essentieel is om een goede

en blijvende CTL respons te verwezenlijken (Perez et al., 2010).

Men kan enerzijds gebruik maken van synthetische peptiden die een exacte kopie zijn van het epitoop

dat herkend wordt door CTL’s wanneer gepresenteerd door MHC. Het te synthetiseren peptide is

afhankelijk van het MHC en door het enorme polymorfisme in allelen is deze techniek praktisch niet

haalbaar (Speiser et al., 2010). Ook kan men peptidevarianten ontwikkelen met gewijzigde

aminozuursamenstelling t.h.v. de MHC ankerplaats. De verhoogde immunogeniciteit van deze

varianten is te wijten aan een verlaagde dissociatiesnelheid waardoor er een betere stabiliteit van het

peptide/MHC complex verkregen wordt (Borbulevych et al., 2005). Belangrijk is ervoor te zorgen dat er

geen veranderingen zijn in de peptidenconformatie daar dit een verschillend T cel repertoire zou

rekruteren dat geen kruisreactiviteit vertoont met het oorspronkelijke peptide.

Anderzijds kan men zich toeleggen op het gebruik van recombinante peptiden. Om de potentie van

epitopen gepresenteerd via MHC II te verhogen, kan men het N-terminaal aminozuurresidu van het

antigenisch peptide door middel van polymethyleenmolecules koppelen aan het Ii-Key peptide dat

zorgt voor de binding met het MHC II molecule (Humphreys et al., 2000). Andere mogelijkheden

bestaan uit het fusioneren van een peptide aan GM-CSF (Speiser et al.,2010) of het gebruik van

chimere eiwitten welke samengesteld zijn uit een antilichaam gericht tegen een DC receptor

(bijvoorbeeld CD40) en een geselecteerd antigen. Bepaalde lectines (inclusief Dectine-1) en andere

oppervlakte molecules van DC’s (CD40) kunnen zowel gebruikt worden om een antigen aan te

brengen alsook om activatiesignalen teweeg te brengen (Palucka et al., 2011).

Zowel synthetische als recombinante peptiden zijn vaak te weinig immunogeen zodat ze moeten

toegediend worden in combinatie met adjuvantia. Deze stoffen moeten een langdurige blootstelling

van het peptide aan het immuunsysteem bewerstelligen zodat een immuunrespons kan geïnitieerd

worden en daarnaast ook zorgen voor activatie- en maturatiesignalen voor DC’s (Speiser et al., 2010).

De immunogeniciteit kan verhoogd worden door gebruik te maken van peptiden die meerdere

epitopen omvatten. Hiertoe gaat men verschillende immunogene antigen epitopen verbinden tot

grotere complexen. Alvorens gepresenteerd te kunnen worden, moeten deze langere peptiden

opgenomen en verwerkt worden door DC’s, dit in tegenstelling tot de kortere varianten (8 tot 10

aminozuren) die direct kunnen binden aan MHC I. Op eenzelfde cel worden in dit geval dus zowel CTL

10

als Th epitopen tot expressie gebracht respectievelijk via MHC I en MHC II. Het voordeel van deze

techniek is de efficiëntere presentatie van antigenen aan CTL’s door inwerking van Th cellen op DC’s.

Ook is er een betere transmissie van lymfokines tussen Th cellen en CTL’s en een verlengde

presentatie van epitopen in drainerende lymfeknopen. Er is een verminderde mogelijkheid voor

tumorcellen om te ontsnappen via de ontwikkeling van escape-mutanten (Perez et al., 2010).

Complexatie van de uiterst immunogene heat shock proteïnen (gp96, HSP70, HSP90) met

immunogene peptiden afkomstig van tumoren is veelbelovend. Deze HSP’s doen dienst als

chaperone voor eiwitten tijdens het opvouwingsproces. HSP-peptide complexen worden opgenomen

door APC’s via receptor gemedieerde mechanismen (See et al., 2011). De peptiden zijn 8-26

aminozuren lang en zijn bijgevolg geschikt voor MHC presentatie na voorafgaande verwerking

(Binder, 2006). Onderzoek heeft uitgewezen dat de associatie van eender welke peptide aan een HSP

leidt tot een effectieve immuunrespons tegen dit peptide (Binder, 2006). Een belangrijke meerwaarde

is dat het gechaperonneerde peptide zowel via de MHC I als de MHC II pathway verwerkt en

gepresenteerd wordt (Binder, 2006). Daarnaast zorgen HSP’s voor de nodige maturatie van de APC’s

door het opreguleren van costimulatorische moleculen en het vrijstellen van cytokines/chemokines en

zullen ze in vivo hun migratie naar de lymfeknopen stimuleren (Binder, 2006). Een beperking op het

gebruik van HSP’s is het feit dat niet van ieder individu voldoende kwalitatieve tumorcellen bekomen

kunnen worden voor de productie van voldoende vaccin. De vaccins dienen ook sterk

gepersonaliseerd te zijn met een hoge kostprijs en arbeidsintensiviteit tot gevolg (See et al., 2011).

1.1.4. DNA VACCINS

DNA vaccinatie bestaat uit het immuniseren van individuen door middel van DNA coderend voor een

bepaald eiwit of epitoop (Redding et al., 2009). De voordelen van DNA vaccins zijn de lagere kostprijs

door de snelle en eenvoudige productie via bacteriën, de stabiliteit bij kamertemperatuur, de

mogelijkheid om verschillende genen te combineren en de opbouw van zowel een cellulaire als een

humorale immuunrespons (Redding et al., 2009). Doordat het DNA meestal slechts één tumorantigen

tot expressie brengt, is de immuunrespons heel specifiek en is er kans op ontwikkeling van escape-

mutanten.

Men kan gebruik maken van allogeen of xenogeen DNA. Xenogeen materiaal is afkomstig van een

diersoort die verschillend is van de diersoort waarvoor het bestemd is. Het bijzondere aan xenogeen

DNA is dat men door de kleine verschillen in aminozuursequentie tolerantie kan opheffen. Door

kruisreactiviteit wordt een immuunrespons opgewekt tegenover het eigen antigen (Yu et al., 2010).

Eventueel kunnen genen coderend voor cytokines, chemokines, costimulatorische moleculen of

bacteriële antigenen toegevoegd worden om het geheel een betere immunogeniciteit te geven

(Stevenson et al., 2011; Signori et al., 2010). Belangrijk valt op te merken dat het pDNA met zijn CpG-

rijke sequenties zorgt voor een bijkomende stimulatie van het immuunsysteem via stimulatie van TLR9

en bijgevolg ook dienst doet als adjuvans (Stevenson et al., 2011).

11

Transfectie van cellen met DNA is een cruciale stap waarbij de celmembraan en voornamelijk de

kernmembraan moeilijke barrières vormen om te overwinnen (Shaheen et al., 2011). Nucleaire

decondensatie is meestal noodzakelijk om een effectieve transfer te bekomen waardoor voornamelijk

delende cellen getransfecteerd worden (Shaheen et al., 2011). Injectie van naakt DNA in een patiënt

resulteert in een snelle degradatie en onvoldoende opname van het DNA door de cellen. Diverse

virale en niet virale afgiftesystemen kunnen gebruikt worden om de opname te verbeteren. Van de

virale vectoren zijn adenovirussen en meer specifiek serotype 5 hooguit de meest gebruikte (zie Fig.

4). Ze zijn onafhankelijk van celproliferatie voor transductie en het capsied eiwit zorgt voor een sterke

CTL respons (Thacker et al., 2009). Aangezien adenovirussen aanleiding kunnen geven tot

levensgevaarlijke hepatotoxiciteit is het belangrijk gebruik te maken van virussen die hun specificiteit

voor levercellen verloren hebben (detargeting). Dit kan verkregen worden door deletie van genen

coderend voor bepaalde receptoren of door het coaten van de virussen waardoor bepaalde interacties

niet meer mogelijk zijn (Coughlan et al., 2010). Daarnaast kan er ook voor gezorgd worden dat de

specificiteit van de virussen gericht wordt naar DC’s (retargeting). Dit kan door middel van incorporatie

van liganden of van monoclonale antistoffen (Coughlan et al., 2010 en Thacker et al., 2009).

FIGUUR 4: TRANSFECTIE VAN CELLEN DOOR MIDDEL VAN ADENOVIRUSSEN (UIT COUGHLAN ET AL., 2010)

Niet virale afgiftesystemen omvatten zowel fysische als chemische systemen om DNA in cellen te

krijgen. De fysische systemen omvatten o.a. elektroporatie (EP) en transdermale

toedieningstechnieken zoals de “gene gun” en micronaalden. EP is een techniek die bestaat uit het

toedienen van een elektrische puls waardoor gedurende een heel korte tijd poriën ontstaan in de

celmembraan waarlangs macromoleculen zoals nucleïnezuren vlot de cel kunnen binnentreden (zie

Fig. 5). Dit kan zowel in vitro als in vivo gebeuren. Door middel van EP kan men het aantal

getransfecteerde cellen na injectie van naakt DNA 100 tot 1000 maal verhogen (Sardesai et al., 2011).

De minimale weefselschade die EP teweegbrengt, veroorzaakt een inflammatoire reactie met

12

productie van pro-inflammatoire cytokines en influx van APC’s waardoor de antigenpresentatie en

opbouw van een immuunrespons efficiënter kan verlopen. Elektroporatie kan op dit vlak beschouwd

worden als zijnde een potent adjuvans (Yu et al., 2010). De beste resultaten worden bekomen met

elektroden die pulsen op verschillende dieptes van huid en spier produceren om zo een divers

repertoire aan getransfecteerde immuuncellen te verkrijgen (Sardesai et al., 2011). Electroporatie zou

gepaard gaan met een onaangenaam gevoel dat van korte duur is waardoor, in tegenstelling tot bij de

humane geneeskunde, anesthesie vereist is bij diergeneeskundig gebruik. Er is een toestel

geregistreerd voor klinisch gebruik en gekend onder de naam Cliniporator®.

Naast elektroporatie winnen transdermale toedieningstechnieken aan interesse wegens hun minimaal

invasief en veelal pijnloos karakter (Escobar-Chàvez et al., 2010). De huid vormt een ideale plaats om

vaccins toe te dienen wegens de goede bereikbaarheid en de aanwezigheid van Langerhans cellen

(Arora et al., 2008). Het gebruik van micronaalden is een veelbelovende techniek die zoals de naam

het aangeeft micro-openingen maakt doorheen het stratum corneum om zo de passage van

macromoleculen zoals DNA mogelijk te maken. De “gene gun” is een ander voorbeeld van een

transdermaal afgiftesysteem voor DNA waarbij kleine met DNA beladen goudpartikels doorheen het

stratum corneum geschoten worden. Deze methode is echter duur en er kan slechts een kleine

hoeveelheid DNA aangebracht worden (Redding et al., 2009). Passieve methoden om DNA doorheen

het stratum corneum te krijgen, maken o.a. gebruik van chemische enhancers, emulsies, lipiden of

peptiden. Daar deze methoden momenteel niet zo succesvol zijn als de actieve afgiftesystemen, zoals

de micronaalden en de “gene gun”, is het gebruik hiervan eerder beperkt (Arora et al., 2008).

FIGUUR 5: MECHANISME VAN ELECTROPORATIE (UIT SARDESAI ET AL., 2011)

13

Chemische afgiftesystemen gaan het DNA vaccin formuleren in nano- of micropartikels die vlot door

DC’s worden opgenomen. Zowel (kationische) polymeren als liposomen worden gebruikt om DNA

vaccins te verpakken in partikels (Van den Berg et al., 2010). Enkele voorbeelden van chemische

afgiftessystemen zijn: polylactide-co-glycolide (PLG) (Denis-Mize et al., 2000), lineair

polyethyleenimine (Verminnen et al., 2010), chitosan (Bivas-Benita et al., 2004) en liposomen

(Carstens et al., 2011). Na intramusculaire of intradermale injectie worden deze geformuleerde DNA

vaccins opgenomen door DC’s. Daarnaast kunnen DC’s het antigen geproduceerd door het DNA

vaccin ook verkrijgen via getransfecteerde keratinocyten/myocyten na cross-presentatie. Transcriptie,

translatie, processing en presentatie van het DNA wordt door de getransfecteerde cellen gedaan. Zo

zullen de post-translationele veranderingen (glycosylatie, opvouwing) correct verlopen (Shaheen et al.,

2011).

14

1.2. ADOPTIEVE CELTHERAPIE

Adoptieve celtherapie bestaat uit het toedienen van autologe of allogene T cellen die specifiek gericht

zijn tegen een bepaald antigen.

Men isoleert geactiveerde T cellen uit het bloed door gebruik te maken van anti-CD3 en anti-CD28

monoclonale antistoffen. Deze worden verder in cultuur gehouden met IL-2 ,IL-7 en IL-15 tot

voldoende aantallen zijn bereikt (Ramos et al., 2011). Het anti-tumoreffect is het hoogst bij cellen die

minder lang in cultuur gehouden worden en afkomstig zijn van naïeve T cellen (Westwood et al.,

2011).

Om tot een effectieve en specifieke respons te komen, is het nodig de T cellen te modificeren. T cel

receptor (TCR) gen therapie bestaat uit het toedienen van genen coderend voor de α- en β-keten van

een TCR specifiek gericht tegen een bepaald antigen. Er moet een zekere concentratie van TCR’s

bereikt worden op het celoppervlak om effectieve antigen specifieke T cellen te bekomen. Aangezien

T cel receptoren afhankelijk zijn van CD3 moleculen om tot expressie te worden gebracht en deze

slechts in beperkte mate beschikbaar zijn, zullen ze in competitie gaan met de endogene TCR’s.

Daarom moet men ervoor zorgen dat de geïntroduceerde TCR’s in het voordeel zijn door bepaalde

modificaties aan te brengen zoals codon veranderingen, murinizatie (vorming van hybride muis

TCRs), N-glycosylatie en bijkomende disulfide bruggen (zie Fig. 6) (Kieback et al., 2010).

FIGUUR 6: MODIFICATIE VAN EEN TCR (UIT KIEBACK ET AL., 2010)

Een alternatieve methode is de incorporatie van een chimere antigen receptor (CAR), hierbij wordt

een antigen bindingsdomein gecombineerd met een signaaltransductiedomein (zie Fig. 7). Voor de

antigenbinding wordt gebruik gemaakt van het Fab gedeelte van een monoclonale antistof gericht

tegen het antigen. Het signaaldomein bevat de intracellulaire ketting van het TCR/CD3 complex.

Dergelijke CAR zijn niet MHC gerestricteerd en kunnen ook niet-eiwit antigenen herkennen. Dit is

belangrijk omdat veel tumoren ontsnappen via MHC downregulatie en bepaalde tumorgeassocieerde

antigenen bestaan uit koolhydraten of glycolipiden (Ramos et al., 2011).

15

FIGUUR 7: ONTWIKKELING VAN EEN CAR (UIT RAMOS ET AL., 2011)

De introductie van het DNA dat codeert voor een antigen specifieke TCR of CAR kan op verschillende

manieren gebeuren. Voornamelijk de virale vectoren en meer bepaald retrovirussen zijn heel efficiënt,

maar de techniek is nogal duur en er bestaat een risico op insertiemutagenese en het induceren van

immunogeniciteit tegenover virale antigenen (Ramos et al., 2011). Transposon systemen lijken

veelbelovend. Deze bestaan uit een dubbele transfectie: het plasmide dat codeert voor de TCR of

CAR wordt samen met een plasmide dat codeert voor een transposase in de T cellen gebracht. Het

transposase zorgt voor een stabiele incorporatie van het transgen dat codeert voor de TCR of CAR

(Westwood et al., 2011). In vergelijking met virale vectoren is er een verminderd risico op

insertiemutagenese omdat transposons de genen niet preferentieel bij promotor regio’s integreren en

is de techniek goedkoper (Kieback et al., 2010).

Door het incorporeren van costimulatorische domeinen (vb. CD28) in de CAR bekomt men betere

activatie, proliferatie en overleving van de T cellen (Ramos et al., 2011). Daarnaast kunnen

costimulatorische liganden geïntegreerd worden op het T cel oppervlak om zo te resulteren in

autoligatie of stimulatie van nabijgelegen T cellen (Westwood et al., 2011). Om een meer fysiologische

costimulatie te bekomen, kan men gebruik maken van bispecifieke cellen. Hiervoor wordt de

CAR/TCR geïntegreerd in CTL’s met een natieve receptor specifiek voor een bepaald persisterend

virus (humaan: Epstein-Barr virus of cytomegalovirus). Dergelijke cellen zullen voldoende

costimulatorische signalen verkrijgen om daarna een effectieve anti-tumor respons teweeg te brengen

(Ramos et al., 2011). Lymfocyten zijn onderhevig aan bepaalde homeostase mechanismen waardoor

een zekere mate van lymfopenie voor de injectie van T cellen de expansie van adoptieve T cellen zal

vergemakkelijken. Dit effect is het resultaat van een verminderde secretie van TGF-β en IL-10 door

Treg’s en een verhoogde productie van IL-7 en IL-15 door lymfopoïetische stromale cellen (Ramos et

al., 2011). Deze techniek verhoogt echter het risico op infectie. Een langere overlevingstijd van de T

cellen kan verkregen worden door het toedienen van IL-2, IL-7 of IL-15 (Ramos et al., 2011). Een

alternatief bestaat eruit een IL-gen te incorporeren in het genoom van de T cel waardoor autocriene

stimulatie mogelijk wordt (Westwood et al., 2011). Door deletie van receptoren voor inhibitorische

16

cytokines, opregulatie van receptoren voor activerende cytokines en autocriene stimulatie zijn de T

cellen beter gewapend tegen het door de tumor gecreëerd immunosuppressief milieu (Ramos et al.,

2011). Er dient opgemerkt te worden dat naast CD8+ ook CD4

+ en natural killer (NK) cellen geïsoleerd,

geactiveerd en getransfecteerd kunnen worden om zo bijkomende voordelen te bieden (Ramos et al.,

2011).

Daar een TCR uit twee ketens bestaat, de α- en de β-keten, worden tijdens een TCR gentransfer de

twee genen die coderen voor deze ketens ingebracht. Bijgevolg bestaat de kans dat de ingebrachte α-

of β-keten met een endogene α- of β-keten een zogenaamde “mispaired” TCR gaat vormen (zie Fig.

8). Deze “mispaired” TCR’s kunnen aanleiding geven tot autoreactiviteit daar ze geen negatieve

selectie hebben ondergaan in de thymus (Ochi et al., 2011). Dit kan deels voorkomen worden door

gebruik te maken van TCR transgenen die de correcte versmelting promoten of door selectie van γδ-T

cellen. Deze cellen hebben geen endogene αβ-ketens waardoor geen “mispaired” TCR’s kunnen

gevormd worden (Turtle et al., 2011).

FIGUUR 8: TCR EN CAR GEN TRANSFER (UIT TURTLE ET AL., 2011)

Aangezien niet alle antigenen tumorspecifiek zijn, zal een hogere affiniteit van de CAR/TCR niet

steeds leiden tot betere resultaten. In tegendeel, door een lagere affiniteit zorgt men ervoor dat

voornamelijk weefsels herkend worden die het antigen in grote mate tot expressie brengen en

bijgevolg worden normale weefsels gespaard. Er dient gezocht te worden naar de optimale

therapeutische interactie waarbij de affiniteit hoog genoeg is om tolerantie tegen te gaan en laag

genoeg is om het normale weefsel intact te laten (Ochi et al. 2011 en Ramos et al., 2011)). Een

systemische inflammatoire reactie, cytokine storm en tumor lysis syndroom waarbij grote

hoeveelheden intracellulaire ionen en nucleïnezuren vrijkomen, kunnen levensbedreigend zijn en

daarom moeten patiënten goed gemonitord worden (Ramos et al., 2011).

17

T cellen die voorzien worden van een TCR of CAR krijgen meestal ook extra genen die de

mogelijkheid bieden om de gemodificeerde T cellen uit te schakkelen indien er ernstige neveneffecten

ontstaan. Dergelijke “veiligheidsschakelaars” worden verkregen door incorporatie van genen die

coderen voor bepaalde eiwitten (vb.CD20) waartegen antistoffen kunnen toegediend worden of voor

eiwitten die een apoptotische reactie op gang zetten indien ze gestimuleerd worden (Kieback et al.,

2010). Ook via integratie van herpes simplex virus thymidine kinase (Tk) worden goede resultaten

bekomen. Tk zal acyclovir of ganciclovir fosforyleren tot de actieve metaboliet die interfereert met de

DNA synthese en bijgevolg resulteert in celdood (Brenner et al., 2010).

18

1.3. REGULATORISCHE T CELLEN

Regulatorische T cellen (Treg’s) zijn CD4/CD25/CTLA-4/GITR/Foxp3 positieve cellen die de activatie,

proliferatie en effectorfuncties van andere lymfocyten kunnen onderdrukken (Bergman, 2010). Deze

cellen voorkomen in eerste plaats het ontstaan van auto-immuunaandoeningen door het

onderdrukken van autoreactieve T cellen, maar zijn daarnaast ook de oorzaak van tolerantie

tegenover tumoren (Sistigu et al., 2011). Dit tumorsparend effect wordt bekomen door een combinatie

van inhibitorische cytokines, cytolysis van immuuncellen en IL-2 consumptie (Feng Li et al., 2010).

Een deel van de regulatorische T cellen ontstaan in de thymus, een ander deel kan geïnduceerd

worden uit naïeve CD4+ T cellen door onder andere TGF-β, IL-10 en IFNα (Feng Li et al., 2010; Fort et

al., 2010).

Een stijging van het aantal regulatorische T cellen zowel in de omgeving van de tumor als in het

perifere bloed bij kankerpatiënten wordt gecorreleerd met een slechte prognose en bijgevolg geringe

kans op overleving (Feng Li et al., 2010; Elkord et al., 2010).

Depletie van regulatorische T cellen kan verkregen worden door middel van metronomische

chemotherapie. Hierbij gaat men chemotherapeutica in lage dosissen toedienen om zo tot een

immunostimulatorisch effect te komen (Fort et al., 2010; Sistigu et al., 2011).). Het meest gebruikte

agens voor Treg depletie is cyclofosfamide. Hoge dosissen cyclofosfamide zijn cytotoxisch voor alle

lymfocyten, terwijl lage dosissen specifiek op de Treg’s gaan inwerken (Fort et al., 2010). Studies

hebben aangetoond dat een lage dosis van cyclofosfamide resulteerde in een tijdelijke en sterke

daling van regulatorische T cellen, gevolgd door een infiltratie van CD8+ T cellen (Fort et al., 2010;

Sistigu et al., 2011). Het mechanisme van verhoogde infiltratie zou mogelijks te wijten zijn aan een

normalisatie van de vascularisatie (Li et al., 2010). Naast cyclofosfamide kan men ook gebruik maken

van temozolomide en paclitaxel. Anti-CD25 monoklonale antistoffen zijn een alternatief om Treg’s te

verwijderen (Eiji et al., 2010). Daarbij kunnen ook CD25+ effector T cellen aangevallen worden

(Ohkura et al., 2011). Andere geneesmiddelen met een effect op Treg’s zijn niet-steroïdale anti-

inflammatoire drugs (NSAID’s), tyrosinase kinase inhibitoren en denileukin diftitox (Morse et al., 2008).

Kankervaccinatie na depletie van regulatorische T cellen resulteert zowel bij muizen als mensen in

opmerkelijk betere resultaten (Klages et al., 2010). Deze resultaten gaan van een duidelijke reductie in

tumorgroei tot zelfs complete regressie van tumoren.

19

2. THERAPEUTISCHE KANKERVACCINATIE BIJ HONDEN

Onderstaande tabellen geven een chronologisch beeld van de verschillende studies die gepubliceerd

werden omtrent kankervaccinatie bij proefhonden en patiënten.

Studies bij proefhonden (zie Tabel 1) hebben meermaals bewezen dat kankervaccinatie veilig is en

dat het mogelijk is een immuunrespons op te wekken. Bovendien kan bij “transmissible venereal

tumor” of Sticker’s sarcoma een klinische respons waargenomen worden.

Tumortype Vaccintype Antigen Referentie

Melanoma Tumorcel Hogge et al., 1999

Melanoma Peptide Disialoganglioside GD3 Milner et al., 2006

Maligne cellen Dendritische cel Cellysaat Tamura et al., 2007

Melanoma Dendritische cel Humaan gp100 Tamura et al., 2008

Melanoma DNA Humaan tyrosinase Goubier et al., 2008

Mammatumoren Dendritische cel Celfusie Bird et al., 2008

Tumoren Dendritische cel Cellysaat Mito et al., 2010 (in

vitro studie)

Tumoren DNA Telomerase en HER-

2/neu

Peruzzi et al., 2010

Transmissiebel

venereaal tumor

Dendritische cel Celfusie Pai et al., 2011

Transmissiebel

venereaal tumor

DNA Chicken HSP70 Yu et al., 2011

Mammatumoren Dendritische cel Celfusie Bird et al., 2011

TABEL 1: VACCINATIE STUDIES BIJ PROEFHONDEN

Uit de studies bij patiënten (zie Tabel 2) blijkt dat de meeste vaccins gericht zijn tegen lymfoma en

melanoma. Over het algemeen, dus zowel vroeger als meer recent, zijn tumorcelvaccins

oververtegenwoordigd. Opvallend is dat veel studies gebaseerd zijn op een beperkt aantal dieren en

dat er geen of zeer weinig controledieren gebruikt worden. In bepaalde gevallen berusten resultaten

op historische controles. Het gebruik van adjuvantia blijft redelijk beperkt. In het merendeel van de

studies worden zeer uiteenlopende resultaten bereikt. Bepaalde patiënten vertonen een spectaculaire

verbetering, terwijl andere nauwelijks of zelfs niet reageren. Uit deze studies is duidelijk gebleken dat

tumorvaccinatie veilig is. Een heel belangrijke vaststelling was ook dat chemotherapie niet interfereert

met de opbouw van een effectieve immuunrespons. Voor vijf vaccins is een significant

overlevingsvoordeel aangetoond: drie tumorcelvaccins (lymfoma, melanoma, hemangiosarcoma) en

20

twee DNA vaccins (melanoma en lymfoma) (zie Tabel 3). Het tumorcelvaccin voor hemangiosarcoma

(U’Ren et al., 2007) bestaat uit een lysaat van allogene cellijnen samen met een adjuvans. Het vaccin

wordt intraperitoneaal toegediend, 5 maal met 2 weken interval en daarna nog eens 3 maal met 1

maand interval. De studie bestaat uit 28 honden en een historische controlegroep. De meeste honden

krijgen chemotherapie. Er wordt een sterke humorale immuunrespons tegen hemangiosarcomacellen

waargenomen, leidend tot een significant overlevingsvoordeel. Het tumorcelvaccin voor lymfoma

(Lawman et al., 2008) is een autoloog vaccin dat geproduceerd wordt uitgaande van biopsies van

perifere lymfeknopen. De tumorcellen worden getransfecteerd met een gen coderend voor

Streptococcus pyogenes serotyperend antigen (Emm55) en vervolgens bestraald met γ-stralen. Het

tijdsinterval tussen de biopsie en eerste vaccinatie bedraagt 14 dagen. De vaccinatie gebeurt

intraveneus 4 maal met 1 week interval en daarna om de maand. De studie bestaat uit 7 honden en er

worden geen controledieren gebruikt. Tijdens de studie ondergaan 2 honden chemotherapie, 2 andere

honden hebben voor het begin van de studie reeds chemoterapie gekregen. Alle dieren vertonen een

klinische respons. Een sterke humorale immuniteit wordt verkregen tegen meerdere autologe en

allogene tumorcelantigenen. Ook wordt er een stevige cellulaire immuniteit waargenomen tegen eigen

tumorcellen. De klinische resultaten suggereren een 2 tot 3 maal hogere overlevingstijd. Het vaccin

induceert geen neveneffecten. Het tumorcelvaccin voor melanoma (Finocchiaro et al., 2008) bestaat

uit autologe of allogene tumorcellysaten en bestraalde xenogene cellen die IL-2 en GM-CSF tot

expressie brengen. Het vaccin wordt 5 maal met 1 week interval subcutaan toegediend. 51 dieren

ondergaan een gecombineerde therapie van chirurgie en vaccinatie, 100 controledieren krijgen alleen

chirurgie als behandeling. Toxiciteit is minimaal tot afwezig: necrose, tumor depigmentatie, oedeem,

induratie, jeuk en zwelling t.h.v. injectieplaats worden waargenomen. In de controlegroep vertonen

94% van de honden progressieve ziekte, na gecombineerde therapie is dit slechts 11%. 3 Jaar na de

gecombineerde therapie zijn 42% van de patiënten nog in leven. Van de gestorven patiënten na

combinatietherapie stierven 53% t.g.v. melanoma terwijl dit aantal oploopt tot 98% in de

controlegroep. Het DNA vaccin voor lymfoma (Peruzzi et al., 2010) is gericht tegen telomerase

reverse transcriptase (TERT), wat voornamelijk in tumoren tot expressie wordt gebracht. Het DNA

vaccin wordt met behulp van zowel elektroporatie als een adenovirale vector (serotype 6) aan de

honden toegediend. De hond vormt een beter model voor de studie van humane tumoren dan de

muis. Het humaan TERT vertoont namelijk een betere homologie met het canien dan met het murien

TERT. Telomerase activatie heeft maar een beperkt effect op muriene tumorigenese en de

telomerenlengte van de hond is gelijkaardig aan de telemorenlengte van de mens. Initieel was het de

bedoeling de vaccinatie te beginnen na complete remissie door inductiechemotherapie zonder een

onderhoudsbehandeling te voorzien. Door de snelle recidieven was dit echter niet mogelijk. De

vaccinatie gebeurt intramusculair en bestaat uit 2 injecties d.m.v. de adenovirale vector met 2 weken

interval, gevolgd door 5 injecties d.m.v. DNA-elektroporatie met 2 weken interval. Er wordt gebruik

gemaakt van 14 patiënten en een historische controlegroep. Alle honden krijgen chemotherapie. Er

worden geen neveneffecten waargenomen. Zoals vaak gezien wordt bij self-antigenen is de

immuunrespons niet langdurig, de T cel reactiviteit valt namelijk weg 6-14 weken na een eerste

21

vaccinatiecyclus, maar kan volledig hersteld en behouden worden door het herhalen van de DNA-

elektroporatiecyclus. De behandeling induceert een specifieke immuunrespons en een langere

overleving. Het DNA vaccin voor melanoma (Manley et al., 2011) is een xenogeen vaccin op basis van

muis tyrosinase. Melanoma’s maken 4% van alle tumoren bij de hond uit. Het vaccin wordt 4 maal om

de 14 dagen intramusculair toegediend met een naaldvrij apparaat. Elke 6 maand wordt een booster

voorzien. De studie bestaat uit 58 honden en een historische controlegroep. 57 honden ondergaan

een teenamputatie, 2 honden bestralingstherapie en 3 honden chemotherapie voor presentatie. Er

worden geen systemische bijwerkingen waargenomen, eventueel enkel wat lokale pijn. Er is een

duidelijk verschil in overlevingstijd en –percentage na 1 en 2 jaar.

Tumortype Vaccintype Antigen Referentie

Lymfoma Tumorcel Jeglum et al., 1986;

Jeglum et al., 1988

Spontane tumoren Tumorcel Hogge et al., 1998

Fibrosarcoma Tumorcel Chauvet et al., 1999

Melanoma DNA Humaan tyrosinase Bergman et al., 2003;

Bergman et al. 2006;

Liao et al., 2006;

Bergman et al., 2008

Melanoma Dendritische cel Humaan gp100 Gyorffy et al., 2005

Melanoma Tumorcel Humaan gp100 Alexander et al., 2006

Hemangiosarcoma Tumorcel U’Ren et al., 2007

Lymfoma Tumorcel Turek et al., 2007

Weke delen sarcoma Peptide VEGF Kamstock et al., 2007

Lymfoma B cel Canien Distemper virus

hemagglutinine (CDV-

HA)

Mason et al., 2008

Lymfoma Tumorcel Lawman et al., 2008

Melanoma Tumorcel Finocchiaro et al., 2008

Astrocytoma Tumorcel Pluhar et al., 2010

Tumoren Dendritische cel Cellysaat Mito et al., 2010

(klinische studie)

Lymfoma DNA Telomerase Peruzzi et al., 2010

Lymfoma Peptide Celmembraanmateriaal Henson et al., 2010

Weke delen en

osteosarcoma

Tumorcel Finocchiaro et al., 2011

Lymfoma B cel CDV-HA Sorenmo et al., 2011

Melanoma DNA Muis tyrosinase Manley et al., 2011

TABEL 2: VACCINATIE STUDIES BIJ PATIËNTEN

22

Tumortype Vaccintype Effect Referentie

Hemangiosarcoma Tumorcel Langere overleving U’Ren et al., 2007

Lymfoma Tumorcel Langere overleving Lawman et al., 2008

Melanoma Tumorcel Langere overleving Finocchiaro et al., 2008

Lymfoma DNA Langere overleving Peruzzi et al., 2010

Melanoma DNA Langere overleving Manley et al., 2011

TABEL 3: VACCINS MET SIGNIFICANT OVERLEVINGSVOORDEEL

Momenteel is Oncept™ het enige kankervaccin dat geregistreerd is voor diergeneeskundig gebruik.

De indicatie van Oncept™ is orale melanoma’s bij de hond. Het gaat om een xenogeen DNA vaccin

dat gebaseerd is op het gen voor humaan tyrosinase en transdermaal wordt toegediend. Het vaccin,

Oncept™, werd ontwikkeld door Merial (Elvidge, 2010) en is sinds juni 2007 commercieel beschikbaar

in de Verenigde Staten. Aangezien het de overlevingstijd van de patiënten helpt verlengen, wordt dit

beschouwd als een belangrijke doorbraak in de behandeling van caniene maligne melanomen

(Bergman et al., 2011; Grosenbaugh et al., 2011). De goede resultaten die met dit vaccin bereikt

worden bij honden hebben geleid tot het gebruik van een analoog vaccin in klinische studies bij

mensen.

23

BESPREKING

De steeds beter wordende en toegewijde diergeneeskundige zorgen hebben een daling veroorzaakt in

het aantal infectieuze ziektes. Dit fenomeen heeft echter gezorgd voor een relatieve stijging van het

aantal sterftegevallen door kanker. Drastische therapieën zoals chemotherapie en radiotherapie

kunnen ons in bepaalde gevallen helpen de levensduur van kankerpatiënten te verlengen, maar vaak

staan we machteloos en een genezing treedt dan ook zelden op. Kankervaccinatie is de laatste jaren

een groeiend onderdeel geworden van de hedendaagse oncologie en is in vergelijking met

chemotherapie uitermate veilig door de weinige neveneffecten. Een tweede belangrijk uniek voordeel

is dat er een immunologisch geheugen ontstaan zodat de patiënt voor de rest van zijn leven

beschermd is tegen recidieven. Het grootste nadeel is dat het lang duurt vooraleer er een klinisch

effect wordt waargenomen. Een vaccin-geïnduceerde tumorrespons is te traag en niet efficiënt

genoeg om een uitgesproken tumorgroei tegen te houden (Perez et al., 2010). Een combinatie met

een behandeling die op korte termijn de tumorgroei onder controle houdt, is vaak aangewezen.

Vandaar dat de ontdekking dat chemotherapie en vaccinatie niet gecontraindiceerd zijn en zelf

synergistisch kunnen werken, van zeer groot belang is. Dit wordt onder andere veklaard doordat

chemotherapie een immunogene celdood veroorzaakt waardoor een immuunrespons opgewekt wordt

(Nowak et al., 2003). Nieuwe inzichten met betrekking tot de modulatie van het door de tumor

gecreëerde immunosuppressieve milieu zal leiden tot een sterke vooruitgang in de ontwikkeling van

tumorvaccins.

Geïnactiveerde tumorcellen, hetzij geïsoleerd uit de patiënt hetzij afgeleid van tumorcellijnen, hebben

als grote voordeel dat een brede immuunrespons wordt opgewekt zonder dat kennis van belangrijke

tumorantigenen noodzakelijk is. Dendritische cellen, geïsoleerd uit de patiënt en geactiveerd in vitro,

hebben de potentie om een zeer krachtige immuunrespons op te wekken, maar zijn duur en het

productieproces van deze vaccins is complex. Voor zowel DNA als peptide/proteïne vaccins moeten

belangrijke tumorantigen gekend zijn en beide lokken een nauwe immuunrespons uit, wat ruimte laat

voor de ontwikkeling van escape-mutanten. Ze zijn echter door hun eigenschappen veel geschikter

voor productie op grote schaal.

De humane oncologie staat reeds enkele stappen voor op vlak van immunotherapie in vergelijking met

de diergeneeskundige oncologie. In de humane geneeskunde wordt onderzoek verricht naar ongeveer

elk tumortype en werkt men vaak met DNA en DC vaccins. De diergeneeskunde volgt trager en spitst

het onderzoek voornamelijk op lymfoma en melanoma. Ook in de humane oncologie werden die als

eerste en meest uitgebreid bestudeerd omdat het sterk immunogene tumoren zijn. In de

diergeneeskunde worden vooral tumorcelvaccins aangewend. Het gebruik van DNA of peptide vaccins

is beperkt omdat er nog niet veel tumorantigenen gekend zijn bij honden. DC vaccins worden omwille

24

van hun hoge kostprijs zelden gebruikt in klinische studies bij honden met kanker. De prijs van het

humane DC vaccin Provenge® bedraagt €23.500 per behandeling en gewoonlijk zijn 3 behandelingen

nodig (Chambers et al., 2011). Opvallend in de diergeneeskunde is dat veel studies gebaseerd zijn op

een beperkt aantal dieren en dat er geen of zeer weinig controledieren gebruikt worden.

Verschillende factoren hinderen, ondanks de steeds beter wordende inzichten in anti-tumor

immuunresponsen, de efficiënte ontwikkeling van kankervaccinatie. Er is meer onderzoek nodig wat

betreft dosis, interval en manier van toedienen. Opvallend is het feit dat bepaalde patiënten zorgen

voor spectaculaire resultaten, terwijl andere nauwelijks of zelfs niet reageren. Dit duidt erop dat er

waarschijnlijk geen optimale patiëntenselectie is toegepast. Tot op heden is er geen

gestandaardiseerde methode om de immuunrespons te meten waardoor het vergelijken van trials

onmogelijk is. Verschillende methodes berusten op het bepalen van de tumor antigen-specifieke T cel

responsen en sommige correleren inderdaad met de klinische respons maar er is een gebrek aan

consistentie in de resultaten (Lesterhuis et al., 2011). Er moet beslist meer aandacht besteed worden

aan het meten van de immuunrespons op de effectorplaats, aangezien T cel responsen in perifeer

bloed sterk kunnen verschillen van deze op de plaats van de tumor (Lesterhuis et al., 2011). Klinische

respons criteria die gebruikt worden bij chemotherapie berusten op tumorregressie. Een toename van

de grootte en het ontstaan van nieuwe lesies wordt aanzien als een therapeutisch falen. Bij

immunotherapie neemt de klinische respons nogal wat tijd in beslag en initieel kan er een periode van

voorbijgaande progressie waargenomen worden, eventueel met het ontstaan van nieuwe

tumorhaarden. Daarom dat deze evaluatiecriteria niet geschikt zijn voor tumorvaccins. Deze

problematiek bestaat zowel in de humane geneeskunde als in de diergeneeskunde. In de vermelde

studies bij honden worden dezelfde vaccintypes op heel uiteenlopende manieren toegediend, worden

er zeer uiteenlopende resultaten binnen één studie bereikt en wordt nog vaak gebruik gemaakt van de

niet optimale evaluatiecriteria.

Hoewel tumorvaccinatie vele mislukkingen heeft gekend, is er recent toch sterke vooruitgang geboekt,

geïllustreerd door de registratie van twee therapeutische kankervaccins. Er bestaan verschillende

types tumorvaccins met elk hun voor- en nadelen. Onderzoek bij de hond heeft aangetoond dat deze

behandeling haalbaar en veilig is binnen de diergeneeskundige oncologie en dat de hond een

waardevol model kan zijn voor de mens. Door de relatief hoge kostprijs, zeker omdat het vaak

gecombineerd moet worden met andere behandelingen, zal het op zijn minst in de nabije toekomst

alleen weggelegd zijn voor de gemotiveerde eigenaar.

25

REFERENTIELIJST

Abrams V., Hwang B., Lesnikova M., Gass M., Wayner E., Castilla-Llorente C., Georges G.,

Nash R. (2010). A novel monoclonal antibody specific for canine CD25 (P4A10) : selection

and evaluation of canine Tregs. Veterinary Immunology and Immunopathology 135, 257-265.

Alexander A., Huelsmeyer M., Mitzey A., Dubielzig R., Kurzman I., MacEwen E., Vail D.

(2006). Development of an allogeneic whole-cell tumor vaccine expressing xenogeneic gp100

and its implementation in a phase II clinical trial in canine patients with malignant melanoma.

Cancer Immunology and Immunotherapy 55, 433-442.

Arora A., Prausnitz M., Mitragotri S. (2008). Micro-scale devices for transdermal drug delivery.

International Journal of Pharmaceutics 364, 227-236.

Bergman P. (2010). Cancer immunotherapy. Veterinary Clinics of North America: Small

Animal Practice 40, 507-518.

Bergman P., Camps-Palau M., McKnight J., Leibman N., Craft D., Leung C., Liao J., Riviere I.,

Sadelain M., Hohenhaus A., Gregor P., Houghton A., Perales M., Wolchok J. (2006).

Development of a xenogeneic DNA vaccine program for canine malignant melanoma at the

animal medical center. Vaccine 24, 4582-4585.

Bergman P., McKnight J., Novosad A., Charney S., Farrelly J., Craft D., Wulderk M., Jeffers

Y., Sadelain M., Hohenhaus A., Segal N., Gregor P., Engelhorn M., Riviere I., Houghton A.,

Wolchok J.(2003). Long-term survival of dogs with advanced malignant melanoma after DNA

vaccination xenogeneic human tyrosinase: a phase I trial. Clinical Cancer Research 9, 1284-

1290.

Bergman P., Wolchok J. (2008). Of mice and men (and dogs): development of a xenogeneic

DNA vaccine for canine oral malignant melanoma. Cancer Therapy 6, 817-826.

Bergman P., Wolchok J. (2011). Of mice and men (and dogs!): the first approved cancer

therapy vaccine. Cancer Vaccines 1, 78-86.

Berzofsky J., Terabe M., Oh S., Belyakov I., Ahlers J., Janik J., Morris J. (2004). Progress of

new vaccine strategies for the immunotherapy and prevention of cancer. The Journal of

Clinical Investigation 113 (11), 1515-1525.

Binder R. (2006). Heat shock protein vaccines: from bench to bedside. Internation Reviews of

Immunology 25, 353-375.

Bird R., DeInnocentes P., Bird A., Ginkel F., Lindquist J., Smith B. (2011). An autologous

dendritic cell canine mammary tumor hybrid-cell fusion vaccine. Cancer Immunology and

Immunotherapy 60, 87-97.

26

Bird R., DeInnocentes P., Lenz S., Thacker E., Curiel D., Smith B. (2008). An allogeneic

hybrid-cell fusion vaccine against canine mammary cancer. Veterinary Immunology and

Immunopathology 123, 289-304.

Bivas-Benita M., van Meijgaarden K., Franken K., Junginger H., Borchard G., Ottenhoff T.,

Geluk A. (2004). Pulmonary delivery of chitosan-DNA nanoparticles enhances the

immunogenicity of a DNA vaccine encoding HLA-A*0201-restricted T-cell epitopes of

Mycobacterium tuberculosis. Vaccine 22, 1609-1615.

Blattman J., Greenberg P. (2004). Cancer immunotherapy: a treatment for the masses.

Science 305, 200-205.

Borbulevych O., Baxter T., Yu Z., Restifo N., Baker B. (2005). Increased immunogenicity of an

anchor-modified tumor-associated antigen is due to the enhanched stability of the

peptide/MHC complex: implications for vaccine design. Journal of Immunology 174, 4812-

4820.

Brenner M., Heslop H. (2010). Adoptive T cell therapy of cancer. Current Opinion in

Immunology 22, 251-257.

Buonaguro L., Petrizzo A., Tornesello M., Buonaguro F. (2011). Translating tumor antigens

into cancer vaccines. Clinical and Vaccine Immunology 18, 23-34.

Carstens M., Camps M., Henriksen-Lacey M., Franken K., Ottenhoff T., Perrie Y., Bouwstra J.,

Ossendorp F., Jiskoot W. (2011). Effect of vesicle size on tissue localization and

immunogenicity of liposomal DNA vaccines. Vaccine 29, 4761-4770.

Chambers J., Neumann P. (2011). Listening to Provenge – What a costly cancer treatment

says about future medicare policy. The New England Journal of Medicine 364, 1687-1689.

Chauvet A., Hogge G., Sandin J., Lipsitz D. (1999). Vertebrectomy, bone allograft fusion, and

antitumor vaccination for the treatment of vertebral fibrosarcoma in a dog. Veterinary Surgery

28, 480-488.

Chiang C., Benencia F., Coukos G. (2010). Whole tumor antigen vaccines. Seminars in

Immunology 22, 132-143.

Corthay A., Lorvik K., Bogen B. (2011). Is secretion of tumour-specific antigen important for

cancer eradication by CD4+ T cells? Implications for cancer immunotherapy by adoptive T cell

transfer. Scandinavian Journal of Immunology 73, 527-530.

Coughlan L., Alba R., Parker A., Bradshaw A., McNeish I., Nicklin S., Baker A. (2010).

Tropism-modification strategies for targeted gene delivery using adenoviral vectors. Viruses 2,

2290-2355.

De Gruijl T., Van den Eertwegh A., Pinedo H., Scheper R. (2008). Whole-cell cancer

vaccination: from autologous to allogeneic tumor- and dendritic cell-based vaccines. Cancer

Immunology and Immunotherapy 57, 1569-1577.

Denis-Mize K., Dupuis M., MacKichan M., Singh M., Doe B., O’Hagan D., Ulmer J., Donnelly

J., McDonald D., Ott G (2000). Plasmid DNA adsorbed onto cationic microparticles mediates

27

target gene expression and antigen presentation by dendritic cells. Gene Therapy 7, 2105-

2112.

Dow S., Elmslie R., Willson A., Roche L., Gorman C., Potter T. (1998). In vivo tumor

transfection with superantigen plus cytokine gene induces tumor regression and prolongs

survival in dogs with malignant melanoma. Journal of Clinical Investigation 101, 2406-2414.

Dubensky T., Reed S. (2010). Adjuvants for cancer vaccines. Seminars in Immunology 22,

155-161.

Elkord E., Alcantar-Orozco E., Dovedi S., Tran D., Hawkins R., Gilham D. (2010). T regulatory

cells in cancer : recent advances and therapeutic potential. Expert Opinion on Biological

Therapy 10, 1573-1586.

Elvidge S. (2010). Melanoma vaccine for dogs. Nature Biotechnology 28, 189.

Escobar-Chàvez J., Bonilla-Martínez D., Villegaz-Gonzàlez M., Molina-Trinidad E., Casas-

Alancaster N., Revilla-Vázquez A. (2011). Microneedles : a valuable physical enhancer tot

increase transdermal drug delivery. Journal of Clinical Pharmacology 51, 964-977.

Feng Li L., Wang X. (2010). Targeting Foxp3+ regulatory T cells-related immunosuppression

for cancer immunotherapy. Chinese Medical Journal 123, 3334-3342.

Finocchiaro L., Glikin G. (2008). Cytokine-enhanced vaccine and suicide gene therapy as

surgery adjuvant treatments for spontaneous canine melanoma. Gene Therapy 15, 267-276.

Finocchiaro L., Villaverde M., Gil-Cardeza M., Riveros M., Glikin G. (2011). Cytokine-

enhanced vaccine and interferon-β plus suicide gene combined therapy for spontaneous

canine sarcomas. Research in Veterinary Science 91, 230-234.

Fort M., Naranayan P. (2010). Manipulation of regulatory T-cell function by

immunomodulators : a boon or a curse ? Toxicological Sciences 117, 253-262.

Goubier A., Fuhrmann L., Forest L., Cachet N., Evrad-Blanchard M., Juillard V., Fischer L.

(2008). Superiority of needle-free transdermal plasmid delivery for the induction of antigen-

specific IFNγ T cell responses in the dog. Vaccine 26, 2186-2190.

Grosenbaugh D., Leard T., Bergman P., Klein M., Meleo K., Susaneck S., Hess P., Jankowski

M., Jones P., Leibman N., Johnson M., Kurzman I., Wolchok J. (2011). Safety and efficacy of

a xenogeneic DNA vaccine encoding for human tyrosinase as adjunctive treatment for oral

malignant melanoma in dogs following surgical excision for the primary tumor. American

Journal of Veterinary Research 72, 1631-1638.

Gyorffy S., Rodriguez-Lecompte J., Woods J., Foley R., Kruth S., Liaw P., Gauldie J. (2005).

Bone marrow-derived dendritic cell vaccination of dogs with naturally occurring melanoma by

using human gp100 antigen. Journal of Veterinary Internal Medicine 19, 56-63.

Harzstark A., Small E. (2007). Immunotherapy for prostate cancer using antigen-loaded

antigen-presenting cells: APC8015 (Provenge®). Expert Opinion on Biological Therapy 7,

1275-1280.

Henson M., Curtsinger J., Larson V., Klausner J., Modiano J., Mescher M., Miller J. (2010).

Immunotherapy with autologous tumour antigen-coated microbeads (large multivalent

28

immunogen), IL-2 and GM-CSF in dogs with spontaneous B-cell lymphoma. Veterinary and

Comparative Oncology 9, 95-105.

Hogge G., Burkholder J., Culp J., Albertini M., Dubielzig R., Keller E., Yang N., MacEwen E.

(1998). Development of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transfected

tumor cell vaccines for the treatment of spontaneous canine cancer. Human Gene Therapy 9,

1851-1861.

Hogge G., Burkholder J., Culp J., Albertini M., Dubielzig R., Yang N., MacEwen E. (1999).

Preclinical development of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-

transfected melanoma cell vaccine using established canine cell lines and normal dogs.

Cancer Gene Therapy 6, 26-36.

Humphreys R., Adams S., Koldzic G., Nedelescu B., Hofe E., Xu M. (2000). Increasing the

potency of MHC class II-presented epitopes by linkage to Ii-Key peptide. Vaccine 18, 2693-

2697.

Jain K. (2010). Personalized cancer vaccines. Expert Opinion on Biological Therapy 10, 1637-

1647.

Jeglum K., Young K., Barnsley K., Whereat A. (1988). Chemotherapy versus chemotherapy

with intralymphatic tumor cell vaccine in canine lymphoma. Cancer 61, 2042-2050.

Jeglum K., Young K., Barnsley K., Whereat A., McGrath D., Hutson C. (1986). Intralymphatic

autochthonous tumor cell vaccine in canine lymphoma. Journal of Biological Response

Modifiers 5, 168-175.

Kamstock D., Elmslie R., Thamm D., Dow S. (2007). Evaluation of a xenogeneic VEGF

vaccine in dogs with soft tissue sarcoma. Cancer Immunology and Immunotherapy 56, 1299-

1309.

Kear S. (2011). Immunotherapies: avoiding collisions once the break is released.

Internetreferentie: http://www.onclive.com/conference-coverage/ipcc-2011/Immunotherapies-

Avoiding-collisions-once-the-brake-is-released (geconsulteerd op 23 februari 2012).

Kepp O., Tesniere A., Schlemmer F., Michaud M., Senovilla L., Zitvogel L., Kroemer G.

(2009). Immunogenic cell death modalities and their impact on cancer treatment. Apoptosis

14, 364-375.

Kieback E., Uckert W. (2010). Enhanced T cell receptor gene therapy for cancer. Expert

Opinio non Biological Therapy 10, 749-762.

Klages K., Mayer C., Lahl K., Loddenkemper C., Teng M., Ngiow S., Smyth M., Hamann A.,

Huehn J., Sparwasser T. (2010). Selective depletion of Foxp3(+) regulatory T cells improves

effective therapeutic vaccination against established melanoma. Cancer research 70, 7788-

7799.

Lawman M., Eidizadeh S., Selmon C., Kane C., Xigacos L., Kaufman L., Shaw N., Lawman P.

(2008). Anti-tumor respons induced by autologous cancer vaccine in canine lymphoma.

Cancer Therapy 6, 827-840.

29

Lesterhuis W., Haanen J., Punt C. (2011). Cancer immunotherapy – revisited. Nature Reviews

Drug Discovery 10, 591-600.

Li X., Kostareli E., Suffner J., Garbi N., Hämmerling G. (2010). Efficient Treg depletion induces

T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology 40, 3325-

3335.

Liao J., Gregor P., Wolchok J., Orlandi F., Craft D., Leung C., Houghton A., Bergman P.

(2006). Vaccination with human tyrosinase DNA induces antibody responses in dogs with

advanced melanoma. Cancer Immunity 21, 6-8.

MacEwen E. (1990). Spontaneous tumors in dogs and cats: models for the study of cancer

biology and treatment. Cancer and Metastasis Reviews 9, 125-136.

Manley C., Leibman N., Wolchok J., Rivière I., Bartido S., Craft D., Bergman P. (2011).

Xenogeneic murine tyrosinase DNA vaccine for malignant melanoma of the digit of dogs.

Journal of Veterinary Internal medicine 25, 94-99.

Mason N., Coughlin C., Overley B., Cohen J., Mitchell E., Colligon T., Clifford C., Zurbriggen

A., Sorenmo K., Vonderheide R. (2008). RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate

antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Therapy 15,

955-965.

Milner R., Salute M., Crawford C., Abbot J., Farese J. (2006). The immune respons to

disialoganglioside GD3 in normal dogs: a melanoma surface antigen vaccine. Veterinary

Immunology and Immunopathology 114, 273-284.

Mito K., Sugiura K., Ueda K., Hori T., Akazawa T., Yamate J., Nakagawa H., Hatoya S., Inaba

M., Inoue N., Ikehara S., Inaba S. (2010). IFNγ markedly cooperates with intratumoral

dendritic cell vaccine in dog tumor models. Cancer Research 70, 7093-7101.

Morse M., Hobeika A., Osada T., Serra D., Niedzwiecki D., Lyerly K., Clay T. (2008).

Depletion of human regulatory T cells specifically enhances antigen-specific immune

responses tot cancer vaccines. Blood 112, 610-618.

Nowak A., Robinson B., Lake R. (2003). Synergy between chemotherapy and immunotherapy

in the treatment of established murine solid tumors. Cancer Research 63, 4490-4496.

Ochi T., Fujiwara H., Yasukawa M. (2011). Requisite considerations for successful adoptive

immunotherapy with engineered T-lymphocytes using tumor antigen-specific T-cell receptor

gene transfer. Expert Opinion on Biological Therapy 11, 699-713.

Ohkura N., Hamaguchi M., Sakaguchi S. (2011). FOXP3+ regulatory T cells : control of

FOXP3 expression by pharmacological agents. Trends in Pharmacological Sciences 32, 158-

166.

Pai C., Kuo T., Mao S., Chuang T., Lin C., Chu R. (2011). Immunopathogenic behaviors of

canine transmissible venereal tumor in dogs following an immunotherapy using

dendritic/tumor cell hybrid. Veterinary Immunology and Immunopathology 139, 187-199.

Palucka K., Ueno H., Banchereau J. (2011). Recent developments in cancer vaccines. The

Journal of Immunology 186, 1325-1331.

30

Perez S., Hofe E., Kallinteris N., Gritzapis A., Peoples G., Papamichail M., Baxevanis C.

(2010). A new era in anticancer peptide peptide vaccines. Cancer 116, 2071-2080.

Peruzzi D., Gavazza A., Mesiti G., Lubas G., Scarselli E., Conforti A., Bendtsen C., Ciliberto

G., La Monica N., Aurisicchio L. (2010). A vaccine targeting telomerase enhances survival of

dogs affected by B-cell lymphoma. Molecular Therapy 18, 1559-1567.

Peruzzi D., Mesiti G., Ciliberto G., Monica N., Aurisicchio L. (2010). Telomerase and HER-

2/neu as targets of genetic cancer vaccines in dogs. Vaccine 28, 1201-1208.

Pillay V., Gan H., Scott A. (2011). Antibodies in oncology. New Biotechnology 28, 519-526.

Pluhar E., Grogan P., Seiler C., Goulart M., SantaCruz K., Carlson C., Chen W., Olin M.,

Lowenstein P., Castro M., Haines S., Ohlfest J. (2010). Anti-tumor immune response

correlates with neurological symptoms in a dog with spontaneous astrocytoma treated by

gene and vaccine therapy. Vaccine 28, 3371-3378.

Ramos C., Dotti G. (2011). Chimeric antigen receptor (CAR)-engineered lymfocytes for cancer

therapy. Expert Opinion on Biological Therapy 11, 855-873.

Redding L., Weiner D. (2009). DNA vaccines in veterinary use. Expert review of vaccines 8,

1251-1276.

Sardesai N., Weiner D. (2011). Electroporation delivery of DNA vaccines : prospects for

success. Current Opinion in Immunology 23, 421-429.

See A., Pradilla G., Yang I., Han S., Parsa A., Lim M. (2011). Heat shock protein-peptide

complex in the treatment of glioblastoma. Expert Review of Vaccines 10, 721-731.

Sersa G., Miklavcic D., Cemazar M., Rudolf Z., Pucihar G., Snoj M. (2008).

Electrochemotherapy in treatment of tumours. European Journal of Surgical Oncology 34,

232-240.

Shaheen S., Akita H., Nakamura T., Takayama S., Futaki S., Yamashita A., Katoono R., Yui

N., Harashima H. (2011). KALA-modified multi-layered nanoparticles as gene carriers for MHC

class-I mediated antigen presentation for a DNA vaccine. Biomaterials 32, 6342-6350.

Signori E., Iurescia S., Massi E., Fioretti D., Chiarella P., De Robertis M., Rinaldi M., Tonon

G., Fazio V. (2010). DNA vaccination strategies for anti-tumour effective gene therapy

protocols. Cancer Immunology and Immunotherapy 59, 1583-1591.

Sistigu A., Viaud S., Chaput N., Bracci L., Proietti E., Zitvogel L. (2011). Immunomodulatory

effects of cyclophosphamide and implementations for vaccine design. Seminars in

Immunopathology 33, 369-383.

Slingluff C., Engelhard V., Ferrone S. (2006). Peptide and dendritic cell vaccines. Clinical

Cancer Research 12, 2342-2345.

Sorenmo K., Krick E., Coughlin C., Overley B., Gregor T., Vonderheide R., Mason N. (2011).

CD40-activated B cell cancer vaccine improves second clinical remission and survival in

privately owned dogs with non-Hodgkin’s lymphoma. Plos One 6, e24167.

Speiser D., Romero P. (2010). Molecularly defined vaccines for cancer immunotherapy, and

protective T cell immunity. Seminars in Immunology 22, 144-154.

31

Starkey M., Scase T., Mellersh C., Murphy S. (2005). Dogs really are man’s best friend –

Canine genomics has applications in veterinary and human medicine. Briefings in Function

Genomics and Proteomics 4, 112-128.

Stevenson F., Mander A., Chudley L., Ottensmeier C. (2011). DNA fusion vaccines enter the

clinic. Cancer Immunology and Immunotherapy 60, 1147-1151.

Sugiura K., Wijewardana V., Fujimoto M., Akazawa T., Yahata M., Mito K., Hatoya S., Inoue

N., Inaba T. (2010). Effect of IL-12 on canine dendritic cell maturation following differentiation

induced by granulocyte-macrophage CSF and IL-4. Veterinary Immunology and

Immunopathology 137, 322-326.

Tamura K., Arai H., Ueno E., Saito C., Yagihara H., Isotani M., Ono K., Washizu T.,

Bonkobara M. (2007). Comparison of dendritic cell-mediated immune response among canine

malignant cells. Journal of Veterinary Medical Science 69, 925-930.

Tamura K., Yamada M., Isotani M., Arai H., Yagihara H., Ono K., Washizu T., Bonkobara M.

(2008). Induction of dendritic cell-mediated immune responses against canine malignant

melanoma cells. Veterinary Journal 175, 126-129.

Thacker E., Nakayama M., Smith B., Bird R., Muminova Z., Strong T., Timares L., Korokhov

N., O’Neill A., de Gruijl T., Glasgow J., Tani K., Curiel D. (2009). A genetically engineered

adenovirus vector targeted to CD40 mediates transduction of canine dendritic cells and

promotes antigen-specific immune responses in vivo. Vaccine 27, 7116-7124.

Turek M., Thamm D., Mitzey A., Kurzman I., Huelsmeyer M., Dubielzig R., Vail D. (2007).

Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor DNA cationic-lipid complexed

autologous tumour cell vaccination in the treatment of canine B-cell multicentric lymphoma.

Veterinary and Comparative Oncology 5, 219-231.

Turtle C., Riddell S. (2011). Genetically retargeting CD8+ lymphocyte subsets for cancer

immunotherapy. Current Opinion in Immunology 23, 299-305.

U’Ren L., Biller B., Elmslie R., Thamm D., Dow S. (2007). Evaluation of a novel tumor vaccine

in dogs with hemangiosarcoma. Journal of Veterinary Internal Medicine 21, 113-120.

Van den Berg J., Nuijen B., Schumacher T., Haanen J., Storm G., Beijnen J., Hennink W.

(2010). Synthetic vehicles for DNA vaccination. Journal of Drug Targeting 18, 1-14.

Verminnen K., Beeckman D., Sanders N., De Smedt S., Vanrompay D. (2010). Vaccination of

turkeys against Chlamydophila psittaci through optimised DNA formulation and administration.

Vaccine 28, 3095-3105.

Westwood J., Kershaw M. (2010). Genetic redirection of T cells for cancer therapy. Journal of

Leukocyte Biology 87, 791-803.

Yu W., Chuang T., Guichard C., El-Garch H., Tierny D., Laio A., Lin C., Chiou K., Tsai C., Liu

C., Li W., Fischer L., Chu R. (2011). Chicken HSP70 DNA vaccine inhibits tumor growth in a

canine cancer model. Vaccine 29, 3489-3500.