Taak 1: opdrachten (docx)

47
Algemene instructies Draag de laboratoriumjas altijd in het lab. Eten en drinken in het lab is strikt verboden. Vraag een lab- assistent als u wilt drinken of naar het toilet gaan. Het is zeer raadzaam om wegwerphandschoenen te dragen en een beschermende bril bij het omgaan met chemicaliën. Defecte en gebroken apparatuur zal worden vervangen door een lab-assistent, als je het vraagt. Niettemin wordt van jou verwacht dat je zelf gemorste vloeistoffen schoonmaakt. Werk tijdens de experimenten milieuvriendelijk! Hieronder vind je voor het geproduceerde afval bakken geschikt voor verwijdering van papier, plastic, metaal, glas of nat afval! Alle gebruikt papier met inbegrip van het ruwe werkpapier, moet achterblijven op het bureau aan het einde van het experiment. Alle resultaten moeten uiteindelijk worden ingevoerd op uw antwoord blad. Gelieve alle bestanden met uw experimentele gegevens op te slaan op het bureaublad van uw team laptop! Alleen het gele antwoord blad en de Excel-bestanden worden genoteerd voor punten. Het experiment bestaat uit drie taken en kan worden afgerond, individueel of als team. 1

Transcript of Taak 1: opdrachten (docx)

Page 1: Taak 1: opdrachten (docx)

Algemene instructies Draag de laboratoriumjas altijd in het lab.

Eten en drinken in het lab is strikt verboden. Vraag een lab-assistent als u wilt drinken of naar het toilet gaan.

Het is zeer raadzaam om wegwerphandschoenen te dragen en een beschermende bril bij het omgaan met chemicaliën.

Defecte en gebroken apparatuur zal worden vervangen door een lab-assistent, als je het vraagt. Niettemin wordt van jou verwacht dat je zelf gemorste vloeistoffen schoonmaakt.

Werk tijdens de experimenten milieuvriendelijk! Hieronder vind je voor het geproduceerde afval bakken geschikt voor verwijdering van papier, plastic, metaal, glas of nat afval!

Alle gebruikt papier met inbegrip van het ruwe werkpapier, moet achterblijven op het bureau aan het einde van het experiment.

Alle resultaten moeten uiteindelijk worden ingevoerd op uw antwoord blad.

Gelieve alle bestanden met uw experimentele gegevens op te slaan op het bureaublad van uw team laptop!

Alleen het gele antwoord blad en de Excel-bestanden worden genoteerd voor punten.

Het experiment bestaat uit drie taken en kan worden afgerond, individueel of als team.

1

Page 2: Taak 1: opdrachten (docx)

MelkdagOPDRACHT A.1 Vet in melk

Melk is een natuurlijk systeem dat kan worden omschreven als een colloid met eiwitten, lipiden en koolhydraten (hoofdzakelijk lactose). Vandaag is het jouw taak die onderdelen van melk in een zuivellaboratorium te onderzoeken met behulp van natuurkundige, chemische en biologische methoden. Jouw werk wordt gefinancierd door een zuivelbedrijf genaamd cowBOOM. cowBOOM wil het initiatief nemen om een aantal gespecialiseerde zuivelproducten te produceren. Jouw onderzoek zal de bepaling van verscheidene eigenschappen van de melkmonsters en hun geschiktheid voor de markt mogelijk maken.

Algemene materialen:● laptop● pennen● 2 watervaste stiften● 2 potloden (het mechanische potlood is voor Opdracht Opdracht A.1)● meetlat● schaar● een lange en korte pincet● Post-it papiertjes● klok● rekenmachine● gedestilleerd water (500 mL fles)● veiligheidsbrillen● papieren handdoeken● afvalbak voor papier(blauw label)● afvalbak voor glas (groen label)● gele plastic kan voor nat afval

2

Page 3: Taak 1: opdrachten (docx)

OPDRACHT A.1 Vet in melk

Melk is een colloïdale oplossing van vetdruppeltjes, evenals een hydrocolloïde suspensie van caseïne micellen, gedispergeerd in een water-gebaseerde oplossing (Figuur 1.1). Elk vetdruppeltje is omgeven door een membraan, waardoor de individuele druppeltjes gescheiden blijven. De volumefractie, de inhoud en omvang van die deeltjes beïnvloeden aanzienlijk de eigenschappen van zuivelproducten.

Figuur 1.1. Vetdruppeltjes (a) encaseïne micellen (b) in melk.

De grootte van de vetdruppeltjes in melk (de kleine dikke druppels) varieert van 1 tot 15 μm afhankelijk van de koe en het seizoen. Commerciële melk is meestal gehomogeniseerd – de vetdruppeltjes van natuurlijke melk zijn mechanisch opgebroken tot kleinere druppeltjes, zodat ze niet zouden kunnen opstijgen naar de oppervlakte om een laag van room te vormen.

Wanneer licht door melk gaat wordt het verstrooid door de vetdruppeltjes en de caseïne micellen via reflectie en diffractie. De verstrooiing vermindert de doorzichtigheid van de melk en verzwakt het licht dat door een melklaag gaat.

In deze opdracht worden verschillende lichtverstrooiingseffecten gebruikt voor het bestuderen van de grootte en de concentratie van de microscopische deeltjes.

3

Page 4: Taak 1: opdrachten (docx)

Monsters● standaard glazen microbolletjes in een buisje, gemarkeerd met “Glass”● melkmonsters in buisjes gemarkeerd met “K”, “L”, “M” en “N”.

De buisjes bevatten met met verschillende eigenschappen (in willekeurige volgorde): natuurlijke (niet-gehomogeniseerde) melk met een vetgehalte van 3,7 %,gehomogeniseerde melk met een vetgehalte van 3,7 % natuurlijke (niet-gehomogeniseerde) melk met een vetgehalte van 2,0 %gehomogeniseerde melk met een vetgehalte van 2,0 %

Benodigdheden:● optische rail met een groene laser (golflengte λ= 532 nm), een monsterhouder en

een scherm ● 14 dekglaasjes ● een automatische pipet en pipetpunten● 4 paperclips● papierleggers (een blad papier om leggers te snijden)● test object (een papier met gedrukte tekst)

Opdracht A.1.1 Bepalen van de deeltjesgrootte met lichtdiffractieA.1.1.1 Bepalen van de dikte van de glazen bolletjes

In deze opdracht ga je een inschatting van de grootte van de standaard glazen bolletjes maken door het bestuderen van hun diffractiepatroon op een scherm. Wanneer laserlicht door een stof met kleine deeltjes gaat en op een scherm valt, ontstaat een afbeelding van een heldere centrale vlek omgeven door meerdere concentrische cirkels (figuur 1.2).

4

Page 5: Taak 1: opdrachten (docx)

Figuur 1.2. Diffractie van licht van 'monodispersed' (even grote, uniforme) bollen. Afstanden van het centrum naar de eerste en tweede minima zijn gemarkeerd als respectievelijk x1 en x2.

De hoekverdeling van het verstrooide licht op het scherm is afhankelijk van de grootte van de deeltjesin het monster. Voor kleine diffractiehoekenkan de diameter Dvan de bolvormige deeltjes worden geschat uit hun diffractiepatroon met behulp van de formule

D=k i λL /x i (Formule 1.1)

waarbij λ de golflengte van het laserlicht, L de afstand van het object tot het diffractiepatroon op het scherm en x i de afstand(op het scherm) van het centrum van het diffractiepatroon tot het diffractieminimum. De coëfficiënt k i is verschillend voor elk diffractieminimum: k1 is gelijk aan 1,22 voor het eerste diffractieminimum (eerste donkere cirkel vanaf het centrum) en k 2 is gelijk aan 2,23 voor het tweede diffractieminimum.

Werkwijze:

1. Breng de groene laser, de monsterhouder en scherm op één lijn op de optische rail. Volgens de indicatie op de optische railmoet de positie van de laseropening (waar het laserlicht uit de laser komt) op ongeveer 40 cm, het monster op 48 cm en het scherm op 80 cm worden ingesteld

2. Prepareer een monster door poeder van glazen bolletjes uit het buisje gelabeld “Glass” op het midden van een dekglaasje aan te brengen. Plaats een tweede dekglaasje bovenop het eerste glaasje en druk de glaasje samen met twee paperclips.

3. Plaats het geprepareerde monster in de monsterhouder.

5

Page 6: Taak 1: opdrachten (docx)

4. Zet de groene laser aan. Zorgt ervoor dat het licht door het monster gaat en op het scherm valt.

5. Verplaats de laser en het scherm ten opzichte van elkaar om zo duidelijk mogelijke diffractiemaxima en –minima te krijgen. Gebruik zonodig een stuk papier als een schaduw om de meetomstandigheden te verbeteren!

6. Als het laserlicht te zwak is om enig patroon op het scherm waar te nemen kan een zaalassistent een nieuwe batterij of een andere laser geven (in dat geval zullen geen punten afgetrokken worden).

A.1.1.1.1 Bestudeer het diffractiepatroon op het scherm. Schets een grafiek van de lichtintensiteit Ials functie van de afstand x gemeten vanaf het centrum van het patroon. Markeer bovendien de posities van de waargenomen minima x1 en x2 (te meten bij A.1.1.1.2) in de grafiek.

A.1.1.1.2 Meet (3 keer) de afstand van de het centrum van het diffractiepatroon tot het eerste en tot het tweede minimum. Voor een nauwkeurigere bepaling, meet de diameter van de ringen horend bij de eerste en tweede minima en deel door twee. Meet ook de afstand L van het monster tot het scherm. (Elke keer kun je de posities van laser, monster en scherm veranderen om het beste diffractiepatroon te krijgen. Je kunt zelf kiezen aan welke kant van het scherm je de posities van de diffractie maxima en minima meet). Schrijf de resultaten in de tabel!

SCHAKEL DE LASER UIT als je hem niet gebruikt!

A.1.1.1.3 Bereken de diameter van de glazen bolletjes (gebruik formule 1.1) telkens voor alle drie metingen aan het eerste en tweede diffractieminimum.

A.1.1.1.4 Bereken de gemiddelde diameter van de glazen bolletjes.

A.1.1.2 Schatting van de gemiddelde grootte van melkdeeltjes

In tegenstelling tot glazen bolletjes verstrooit een dun laagje melk licht niet op een wijze die leidt tot duidelijke diffractieringen, omdat niet alle melkvetdruppeltjes van gelijke grootte zijn. De intensiteit van het verstrooide licht op het scherm zal gelijkmatig afnemen als functie van de afstand vanaf het centrum van het diffractiepatroon.

6

Page 7: Taak 1: opdrachten (docx)

Figuur 1.3.Voorbeeld van de hoekverdeling van de intensiteit van verstrooid licht voor deeltjes van verschillende diameter D.

Ook nu zal de breedte van het belichte gebied en de hoekafhankelijkheid van de lichtintensiteit afhangen van de diameter van de vetdruppeltjes in de melk (zie Figuur 1.3 voor een gesimuleerde verdeling).

Werkwijze:

1. Prepareer een melkmonster van melk uit buisje “K”, hetgeen een niet-gehomogeniseerde melk is met een vetgehalte van 3,7 % door stappen 2 t/m 5 te volgen.

2. Draai het buisje “K” voorzichtig een aantal keer om, om de melk te mengen voordat je het in de pipet overbrengt. Gebruik de automatische pipet om een druppel van 10 µL melk van buisje “K” op het midden van een dekglaasje gemarkeerd met “K” te plaatsen.

3. Gebruik papiertjes om de dikte van de melklaag tussen de dekglaasjes vast te leggen. Knip geschikte papiertjes van een papieren velletje en leg ze aan beide zijden van het melkdruppeltje. Dek het glaasje af met een tweede dekglaasje gemarkeerd met “K”.

4. Druk de dekglaasjes voorzichtig samen met twee paperclips.5. Herschik de experimentele opstelling: zet de monsterhouder en het scherm zo dicht

mogelijk bij elkaar op de optische rail.6. Plaats het geprepareerde melkmonster in de monsterhouder.7. Zet de groene laser aan. Zorg ervoor dat het licht door het monster gaat en op het

scherm valt. Verplaats de laser en de monsterhouder om een goed waarneembaar verlicht vlak van verstrooid licht op het scherm te krijgen. (Je mag zelf kiezen aan welke zijde van het scherm je het verlichte gebied bekijkt en meet. Gebruik, indien nodig, een papieren vel als schaduw).

7

Page 8: Taak 1: opdrachten (docx)

A.1.1.2.1 Bekijk het verlichte gebied op het scherm. Schets een grafiek van de lichtintensiteit Ials functie van de afstand xgemeten vanaf het centrum van het patroon. Markeer de afstand xmelk(te meten bij A.1.1.2.2) in de grafiek.

A.1.1.2.2 Bepaal de benaderde afstand xmelk van de optische as (midden) tot aan de rand van het verlichte gebied. Meet hiertoe de breedte van het verlichte gebied en deel dat door twee. Meet ook de afstand Lmelk van het monster tot het scherm. ZET DE LASER UIT!

A.1.1.2.3 Schat de benaderde grootte van de melkvetdruppeltjes. Gebruik de parameters gemeten in opdracht A.1.1.2.2 om de diameter van de melkvetdruppeltjes Dmelk met formule 1.1 te berekenen. Gebruik k 2=2,23 en x2=xmelk.

A.1.2 Melk karakteriseren met waarnemingen van de doorzichtigheidIn deze opdracht ga je vier melkmonsters vergelijken (K, L, M, en N zoals beschreven aan het begin van opdracht A.1) om hun specifieke eigenschappen te identificeren.

Als je naar een object (zoals gedrukte tekst) kijkt door een dun laagje melk dan lijkt het object minder scherp en minder zichtbaar. Het licht afkomstig van het object wordt verstrooid door melkvetdruppeltje op zijn weg door de melk. Het verstrooide licht lijkt op een nevel waardoor het geobserveerde object wordt verdoezeld, waardoor de zichtbaarheid afneemt. De doorzichtigheid van de melk vermindert als de verstrooiing toeneemt.

Een lichtkwantum wordt verstrooid als het een vetdruppeltje met doorsnede S=π D2/4 raakt, waarbij D de diameter van het vetdruppeltje is. De mate van verstrooiing in een dun laagje melk met dikte z hangt zowel af van het melkvetgehalte γ (volumefractie van vetdruppeltjes) als de gemiddelde grootte (diameter D) van de vetdruppeltjes. Als een dun laagje melk wordt beschenen met licht met intensiteit I 0, dan kan de intensiteit I van het verstrooide licht worden beschreven met de formule

I∼ I 0 γz /D (formule 1.2)

A.1.2.1 Zoek uit welke van de vier melkmonsters uit tabel 1.1 theoretisch de sterkste en welke de zwakste verstrooiing zal vertonen. De monsters bevatten gehomogeniseerde en natuurlijke (niet-gehomogeniseerde) melk (waarbij Dhom<Dnat) met twee verschillende vetgehaltes (waarbij γ1<γ 2).

Tabel 1.1.Eigenschappen van melkmonsters 1–4.

Monster druppelgrootte vetgehalte

1 Dhom γ1

8

Page 9: Taak 1: opdrachten (docx)

2 Dhom γ2

3 Dnat γ1

4 Dnat γ2

Werkwijze:

1. Neem 8 dekglaasjes en label paren van glaasjes met letters K, L, M, en N. 2. Plaats vier glaasjes dicht bij elkaar op het papiervel met gedrukte tekst (testobject).3. Prepareer melkmonsters K, L, M, en N zoals beschreven voor buisje K in stap 1–4 in

de werkwijze van opdracht A.1.1.2.4. Vergelijk zichtbaarheid van de gedrukte tekst door monsters K, L, M, en N.

A.1.2.2 Bekijk de tekst door de melklaagjes en bepaal de twee monsters die de sterkste en zwakste verstrooiing vertonen (de slechtste en beste zichtbaarheid, respectievelijk). Identificeer de eigenschappen van de twee geselecteerde monsters, rekening houdend met de beschrijving van de monsters aan het begin van opdracht A.1 en de resultaten van opdracht A.1.2.1.

A.1.2.3 Vat de identificatie van de melkmonsters samen in de tabel. Concludeer hoe elk van de monsters K, L, M, and N is behandeld en wat zijn vetgehalte is. Houd rekening met je voorgaande antwoorden en behulpzame informatie in de tekst.

Opdracht A.1.3 De grootte van melkdruppeltjes schatten door licht-verzwakking te metenIn opdracht A.1.2 heb je de verstrooiing van licht door een dun laagje melk onderzocht. Hier ga je de fractie van licht meten die passeert door een dikke laag water met een kleine hoeveelheid melk. In zuiver water bewegen lichtstralen vrij langs een rechte lijn. Als melk wordt toegevoegd aan het water zitten vetdruppeltjes in de weg en verhinderen dat de lichtstralen zich langs de oorspronkelijke rechte lijn bewegen. Hoe langer de weg is die het licht moet afleggen door een medium met deeltjes, hoe groter de waarschijnlijkheid is dat de lichtstraal een deeltje zal raken. De fractie van vrij doorgelaten licht kan worden beschreven met de wet van Lambert-Beer:

I=I 0 e−NSz, (formule 1.3)

9

Page 10: Taak 1: opdrachten (docx)

waarbij I de intensiteit van doorgelaten licht, I 0 de intensiteit van invallend licht, N het aantal deeltjes per volume-eenheid, z de dikte van de laag en S het doorsnede oppervlak van een enkel deeltje is. Aangenomen dat alle vetdeeltjes in melk van gelijke diameter D zijn, zal elk van hen zich gedragen als een bolvormig object met een doorsnede

S=π D2/4 (formule 1.4)

geplaatst in het pad van de lichtstraal.

In dit experiment ga je lichtverzwakking meten door melk toe te voegen aan zuiver water in een bakje met vaste afmetingen. Door melk toe te voegen neemt het aantal deeltjes toe (vetdruppeltjes), wat leidt tot afname van de doorgelaten lichtintensiteit. Het doel van het experiment is om de afhankelijkheid van de lichtverzwakking als functie van de melkconcentratie in water te meten en om de parameters te vinden voor de berekening van de grootte van de vetdruppeltjes.

Je gaat een luxmeter gebruiken om de intensiteit te meten van een laserstraal die door een medium met vetdruppels is gegaan. Echter, wat achtergrondlicht van de omgeving (zoals zonlicht door de ramen en ruimteverlichting) beïnvloedt de uitslag van de luxmeter. Om de intensiteit van de laserstraal alleen te krijgen, moet je de uitslag afkomstig van het achtergrondlicht aftrekken. Gedetailleerde instructies van de procedure vind je hieronder.

Apparatuur en materialen: ● rode laser op een houder● waterbakje (50 mL flesje met maatstrepen en blauwe dop)● luxmeter op een houder● automatische pipet en pipetpuntjes● melkmonster in een buisje gelabeld K● Excelbestand “Milk A.1.3 Country Team A B.xslx” op de laptop van jullie team

Werkwijze:1. Plaats de rode laser, het waterbakje en de luxmeter zó op je tafel dat de laserstraal

door het waterbakje gaat op weg naar de sensor van de luxmeter. Belangrijk: Plaats het waterbakje zo, dat de laserstraal de zijkant van het bakje loodrecht treft.

2. Plaats het waterbakje ongeveer 20–40 cm vanaf de luxmeter. 3. Steek de rode laser in een USB-poort van de computer. Zet de computer aan. Pas de

positie van de laser zo aan, dat de lichtstraal ruwweg horizontaal loopt. 4. Zorg ervoor dat de laserstraal is gefocusseerd (de laserspot is zo klein mogelijk) op

de sensor van de luxmeter en dat hij de sensor binnenkomt door het gaatje vóór de sensor. Indien nodig, pas de lens voor de laser aan door aan het dopje te draaien .

5. Zet de luxmeter aan. Doe metingen in de passende range van de luxmeter (bijvoorbeeld “2000” of “20000”).

10

Page 11: Taak 1: opdrachten (docx)

6. Vul het waterbakje met gedestilleerd water tot aan het 50 mL streepje. Merk op dat de dikte van de waterlaag z = 25 mm is.

7. Belangrijk: Het is essentieel dat na het plaatsen van de lichtsensor en de laser dat hun posities ongewijzigd blijven voor de rest van het experiment. Als je per ongeluk de laser of sensor verplaatst, dan wordt geadviseerd om opnieuw met de metingen te beginnen (beginnend met zuiver water).

A.1.3.1 Meet en noteer in het Excelbestand de lichtintensiteiten en het totale volume melk in het water bij elke stap van je experiment zoals beschreven in stap 8–12. Noteer ook het

watervolume V 0.

8. Bepaal de uitslag I 0 van de luxmeter corresponderend met de intensiteit van doorgelaten laserlicht door zuiver water. (Deze uitslag bevat ook een bijdrage van het achtergrondlicht). Noteer de gemeten waarde I 0in je Excelbestand. In geval van computerproblemen (problemen met software, files not found, etc), vraag een zaalassistent voor hulp (geen punten worden hiervoor afgetrokken).

9. Bepaal de uitslag B0 corresponderend met lichtintensiteit afkomstig van het achtergrondlicht. Om dit te doen, blokkeer de laser met je hand, lees de uitslag af van de luxmeter en noteer de waarde van B0 in je Excelbestand.

10. Maak gebruik van een automatische pipet met een pipetpuntje enneem een hoeveelheid melk met volume V 1=20μL van het buisje gelabeld met K. Voeg de melk toe aan het bakje met water en meng de oplossing door het bakje af te sluiten en een aantal maal om te keren.

11. Plaats het bakje terug op zijn oorspronkelijke plek. Meet en noteer (in het Excelbestand) de uitslag I 1 van de luxmeter terwijl de laser door het bakje gaat. Blokkeer de laserstraal en noteer (in het Excelbestand) de uitslag B1 corresponderend met het achtergrondlicht.

12. Herhaal de procedure door telkens 20 μL melk aan het bakje toe te voegen. Na het toevoegen van elke portie vermeng je de oplossing, noteer je de uitslag I i van de luxmeter en de uitslag Bi van de luxmeter in het Excelbestand. Herhaal de procedure totdat 10 porties van 20 μL melk zijn toegevoegd, of totdat de uitslag I i dichtbij de uitslag Bi van het achtergrondlicht ligt.

A.1.3.2 Bereken voor elke datapunt de volumeconcentratie V /V=C i van melk in water en de relatieve transmissiecoëfficiënt α i=(I¿¿ i−Bi)/(I ¿¿0−B0)¿¿. Verricht de berekeningen in het Excelbestand.

A.1.3.3 Maak een grafiek van de natuurlijke logaritme van de relatieve transmissiecoëfficiënt ln (αi) als functie van de melkconcentratie in water C i (in het Excelbestand).

11

Page 12: Taak 1: opdrachten (docx)

A.1.3.4 Maak een grafiek van de lineaire trendlijn van je data passend bij een lineair verband ln (α )=−βC in het Excelbestand. Bepaal de numerieke waarde van parameter β. Noteer de absolute waarde van βop het antwoordblad.

A.1.3.5 Het melkmonster gelabeld als K bevat een volumefractie van vetdruppeltjes (totaal vetgehalte per volume-eenheid melk) γ=0,037. Leid een formule af voor de dichtheid N0 van vetdruppeltjes in melk (het aantal vetdeeltjes per volume-eenheid melk, in SI eenheden m−3 in termen van de vetdruppel-diameter D en γ.

A.1.3.6 Leid een formule af voor de dichtheid N van de vetdruppeltjes in het mengsel van melk en water in termen van C (melkconcentratie in water), D (diameter van een enkel vetdruppeltje) en γ.

A.1.3.7 Leid een formule af voor het berekenen van de diameter D van de vetdruppeltjes in je melkmonster en bereken de numerieke waarde van D. Hint:Merk op dat door de logaritme te nemen van de wet van Lambert-Beer I=I 0 e

−NSz (behandeld in de introductie van opdracht A.1.3), we een lineair verband krijgen ln (α )=ln( I /I 0)=−NSz tussen de logaritme van de tranmissiecoëfficiënt en de dichtheid van vetdruppeltjes. Gebruik je experimentele resultaten om de numerieke waarde van de diameter van de vetdruppeltjes te berekenen.

12

Page 13: Taak 1: opdrachten (docx)

Melkdag

Melk is een colloïdaal systeem, waarin eiwitten, lipiden en koolhydraten (vooral lactose) voorkomen. Vandaag bestaat je taak erin de melkcomponenten in een zuivellab te bepalen met behulp van fysische, chemische en biologische methodes. Je werk wordt gefinancierd door het zuivelbedrijf cowBOOM. Dit bedrijf wil wil een reeks melkproducten lanceren. Je werk moet toelaten de verschillende eigenschappen van de melkmonsters te bepalen en hun geschiktheid om ze op de markt te brengen

Materiaal● laptop● balpennen● 2 markers● 2 potloden (het mechanisch potlood is voor Opdracht A.1● meetlat● schaar● lange en korte tang● Post-it blaadjes● uurwerk● calculator● gedestilleerd water (500 mL fles)● veiligheidsbrillen● keukenpapier● papierbak (blauw label)● plasticbak (geel label)● glasbak (groen label)● gele container voor vloeibaar afval

13

Page 14: Taak 1: opdrachten (docx)

OPDRACHT A.2 Bereiden van kaas en eiwitInhoud

Om kaas te bereiden vertrekt men van melk die in aanwezigheid van Ca2+ behandeld wordt met speciale bacteriën en met ‘stremsel’. Tijdens de bereiding van kaas ondergaat de melk verschillende behandelingen, waaronder aanzuren, coaguleren, ontwateren en rijpen. Vandaag zal je de basisprincipes leren van de kaasbereiding en inzicht verwerven in de onderliggende biochemische en biofysische processen.

Tijdens deze opdracht zal je kaas bereiden. Naast melk heb je hiervoor drie andere ingrediënten nodig: CaCl2, een mengsel van eiwitsplitsende enzymen (=stremsel; Engels = rennin/rennet) en een specifieke bacteriecultuur, die we de ‘bacterie-starter noemen. De bacteriën produceren melkzuur, waardoor de pH verlaagt tot ongeveer 5,0 à 6,0. Bij een lagere pH beginnen sommige melkeiwitten – de caseïnen – samen te klonteren. Deze lagere pH is bovendien optimaal voor de eerste reacties gekatalyseerd door stremsel, waarbij caseïne gehydrolyseerd wordt en verdere coagulatie optreedt, waardoor de vorming van zogenaamde ‘wrongel’ wordt bevorderd.

Op de labotafel vind je alle nodige ingrediënten om kaas te maken, gelabeld ‘substance A’, ‘substance B’ en ‘substance C’.

Jouw taak zal erin bestaan om te bepalen welke van deze substanties CaCl2 is, welke stremsel en welke de bacterie-starter.

Opdracht A.2.1 Het bereiden van kaas

Benodigdheden● melk in een 300 mL plastic flas (labelled MILK)● substantie A (20 mg in microcentrifuge tube; 3 tubes) ● substantie B (3 mg in microcentrifuge tube; 3 tubes) ● substantie C (20 μL in microcentrifuge tube; 3 tubes)● 8 centrifuge tubes (50 mL)● reageerbuisrek● 12 Pasteurpipetten● 4 plastic Petri schaaltjes● 250 mL beker● plastic trechter (wit)

14

Page 15: Taak 1: opdrachten (docx)

● 4 filterdoekjes (in mini-grip)● warmwaterbad: dit vraag je aan de assitent(e) nadat je de stappen 1 – 4 hebt

uitgevoerd.

Werkwijze:1. Schud zacht de melkfles zodat de verschillende lagen goed mengen. Niet te hard

schudden, want er mag zich geen schuim vormen!2. Doe ongeveer 50 mL melk in 4 centrifugeerbuisjes (van 50 mL). Markeer ze

respectievelijk als I, II, III, en IV.3. Los de vooraf afgewogen substantie A (20 mg) op in 1 mL gedestilleerd water (meet

deze 1 mL af met een pasteurpipet)), en voeg dit toe aan de vloeistof in centrifugeerbuis I. Je kan de 250 mL beker als watercontainer gebruiken.

a. Herhaal dit voor de centrifugeerbuisjes II en III (neem telkens nieuwe monsters van de substantie A)

4. Breng met een nieuwe pasteurpipet 1 mL van het mengsel uit centrifugeerbuisje I over in het microcentrifugeerbuisje met substantie B (3 mg). Meng grondig en breng terug over in centrifugeerbuis I

a. Herhaal dit voor de centrifugeerbuisjes II en IV (neem telkens nieuwe monsters van de substantie B)

5. Sluit alle centrifugeerbuisjes en meng grondig hun inhoud door ze herhaaldelijk om te keren. Vraag aan een assistent(e) een warmwaterbad en laat de mengsels hierin 30 minuten incuberen. Ondertussen kan je de volgende theoretische vragen beantwoorden.

A.2.1.1 Welke melkfractie heeft de kleinste dichtheid: room of afgeroomde melk? Waarom?1. Room, wegens het grotere vetgehalte2. Afgeroomde melk, door het kleinere vetgehalte3. Room, door de grotere eiwitconcentratie4. Afgeroomde melk, door de kleinere eiwitconcentratie5. Room, door de grotere suikerconcentratie 6. Afgeroomde melk, door de kleinere suikerconcentratie

A.2.1.2 In In kaasfabrieken wordt rauwe melk door centrifugeren gescheiden in twee fracties, elk met verschillende dichtheid (room en afgeroomde melk). Het lipidengehalte van deze fracties en van gestandaardiseerde melk kan bepaald worden met nabij-infraroodspectroscopie, of via andere methodes. Wil men gestandaardiseerde melk produceren, dan dient men een geschikte hoeveelheid afgeroomde melk bij de rauwe (onbewerkte) melk te voegen.

15

Page 16: Taak 1: opdrachten (docx)

Een cowBOOM bedrijf ontving 200.0 L rauwe melk met een vetgehalte van 4.1%. Voor het bereiden van kaas is melk met een vetgehalte van 2.9% vereist. Het kaasbedrijf beschikt over een toestel dat rauwe melk kan scheiden in room met een vetgehalte van 20%) en in gestandaardiseerde melk. Vertrekkend van 200.0 L rauwe melk, hoeveel liter room en hoeveel liter gestandaardiseerde melk kan men bereiden? Voor je berekeningen dien je geen rekening te houden met de minieme verschillen in dichtheid van de melk en van de afgescheiden producten.

Ga nu verder met de kaasbereiding!

6. Gebruik een nieuwe pasteurpipet om substantie C (20 μL monster in het microcentrifugeerbuisje; analoog met het toevoegen van substantie A) toe te voegen aan de 50 mL centrifugeerbuis I. Je kan de 250 mL beker als watercontainer gebruiken

a. Herhaal deze werkwijze voor centrifugeerbuizen III en IV (gebruik nieuwe monsters van substantie C)

7. Sluit de buisjes en meng grondig door herhaaldelijk omkeren. Incubeer al de buisjes gedurende 30 minuten in hetzelfde waterbad.

8. Scheid via filtratie de vloeibare fractie (de ‘wei’) van de vaste (de ‘wrongel’) (whey and curd, respectively) in de centrifugeerbuisjes I–IV. Doe het filtreerdoek in de plastic trechter en plaats de trechter op een proper 50 mL centrifugeerbuisje en giet de inhoud van dhet geïncubeerde buisje op het filtreerdoek. Om de filtratie vlotter te laten verlopen kan je de inhoud van elk van de centrifugeerbuisjes I-IV telkens mengen met een spatula. Gebruik voor de inhoud van elk centrifugeerbuisje nieuw filtreerdoek en een nieuw centrifugeerbuisje om het filtraat op te vangen. Je kan dezelfde plastic trechter gebruiken, maar je dient hem wel (net als de spatula) te wassen en te drogen voor elke nieuwe filtratie. Label de 50 mL centrifugeerbuizen waarin het filtraat (= de wei; Engels = whey) wordt opgevangen respectievelijk met WHEY I, WHEY II, WHEY III, en WHEY IV, en bewaar ze voor de Opdracht A.2.2. Na elke filtratie breng je de wrongel (Engels = curd) uit het filtreerdoek over in een petrischaaltje. Label de schaaltjes respectievelijk met CURD I, CURD II, CURD III, en CURD IV, en bewaar deze eveneens voor Taak A.2.2.

A.2.1.3.1 Vul op je antwoordblad de tabel in over de vorming van de wrongel in de verschillende monsters.

A.2.1.3.2 Welke petrischaal bevat het zachtste (minst consistente) neerslag? Houd hierbij geen rekening met de petrischaal (of schalen) zonder neerslag. Noteer het correcte Romeinse cijfer op het antwoordblad.

16

Page 17: Taak 1: opdrachten (docx)

A.2.1.4 Steun op jouw waarnemingen en op de resultaten van Opdracht A.3 (uitgevoerd door je ploegmaat) om de functie van elke substantie te bepalen bij de kaasbereiding. Op je antwoordblad maak je de keuze tussen volgende mogelijkheden:

1. Veroorzaakt de vorming van wrongel (Engels = ‘curd’)2. Vergemakkelijkt de vorming van wrongel3. Verbruikt lactose

A.2.1.5 Bepaal de biologische/chemische identiteit van de substanties A, B en C. Steun hiervoor op de inleidende tekst en op de antwoorden 1 – 3 van Opdracht A.2.1.4. Je hebt de keuze tussen volgende opties:

1. CaCl2

2. Stremsel3. Bacterie-starter

Opdracht A.2.2. Bradford analyse voor de bepaling van het totale eiwitgehalteTijdens de kaasbereiding heb je de vorming van twee fasen waargenomen: de wrongel en de wei. De wrongel ontstaat door de coagulatie van van het melkeiwit caseïne. Dit samenklonteren wordt veroorzaakt door het toevoegen van stremsel, dat eiwitsplitsende enzymen bevat, die specifieke biochemische wijzigingen veroorzaken. Deze wijzigingen worden verder besproken. Alternatief kan het neerslaan van caseïne (en klontervorming) ook veroorzaakt worden door het aanzuren van melk.

Coagulatie van melk in zuur midden

Benodigdheden:● melk, WHEY I en CURD I (gebruikt of geproduceerd in Opdracht A.2.1)● 1 M HCl (0.5 mL in microcentrifugeerbuisje)● 2 Pasteurpipetten● 3 centrifugeerbuisjes (15 mL)● schijfjes filtreerpapier (in mini-grip)● plastic petrischaaltjes● Excel file “Milk A.2.2 country Team A/B.xlsx” op het bureelblad (desktop) van de

computer

Werkwijze:1. Draag een labojas, handschoenen en veiligheidsbril.2. Doe met een pasteurpipet 10 mL melk in een nieuw 15 mL centrifugeerbuisje en

label dit ‘Acid coagulation’.

17

Page 18: Taak 1: opdrachten (docx)

3. Doe voorzichtig met een zuivere pasteurpipet 0,5 mL van 1 M HCl van het microcentrifugeerbuisje in het centrifugeerbuisje met melk. Sluit dit buisje en meng de inhoud door herhaaldelijk om te keren.

4. Scheid de vloeibare en vaste fracties met behulp van het filtreerpapier en vang het filtraat op in een verse 15 mL centrifugeerbuis. Daar het filtreren een tijdje duurt raden we je aan ondertussen theoretische vragen te beantwoorden. Als het grootste deel gefiltreerd is mag je stoppen en je labelt het buisje met het filtraat ‘LIQ’

5. De substantie op het filtreerpapier breng je over op een verse petrischaal en je labelt deze ‘SOL’.

De Bradford eiwitbepaling is een analytische spectroscopische methode waarbij het totale proteïnegehalte van een monster bepaald wordt. De analyse steunt op het meten van de absorbantie van zichtbaar licht (VIS) door een oplossing waaraan het Bradford reagens (Coomassie Brilliant Blue G-250) werd toegevoegd. Afhankelijk van de pH van de oplossing, kan de kleurstof volgende kleuren aanemen : kationisch (rood), neutraal (groen), en anionisch (blauw). Bij een vaste lage pH is de kleurstof hoofdzakelijk in rode geprotoneerde vorm (λmax = 470 nm). In aanwezigheid van eiwitten ontstaat echter de gedeprotoneerde blauwe vorm (λmax = 595 nm). Dit eiwit-kleurstofcomplex kan gedetecteerd worden bij een golflengte van 595 nm met behulp van een spectrofotometer of microplaatlezer.

Gewoonlijk wordt een ijklijn opgesteld om een nauwkeurige analyse te kunnen uitvoeren. Hiervoor maakt men gebruik van gekende hoeveelheden van goedkope proteïnen (zoals serumalbumine van runderen = BSA). Na het opstellen van de ijklijnkan men makkelijk de totale hoeveelheid eiwitten in een monster bepalen door de absorbantiewaarden op de BSA-ijklijn te vergelijken met de gemeten absorbantie van het te onderzoeken monster.

A.2.2.1 In de figuur 2.1 hieronder zijn de absorbanties weergegevenn van een blanco monster zonder eiwitten; van een monster met een lage concentratie aan eiwitten en van een monster met een grotere concentratie aan eiwitten. Geef voor elk monster de corresponderende datareeks, die gebruikt in figuur 2.1 gebruikt werd voor de absorbantieweergave.

18

Page 19: Taak 1: opdrachten (docx)

Figuur 2.1. Aborbantie van drie stalen (in AU, arbitrary units) bij verschillende UV-VIS

golflengtes (in nanometers, nm). ( ) data reeks 1, ( ) data reeks 2, ( ) data reeks 3.

Bereiding van de verdunningsreeks. Spectrofotometrie.

Benodigdheden:● melk (zelfde als in Opdracht A.2.1)● Bradford reagens (5 mL in centrifugeerbuis)● Serumalbumine van runderen = BSA (1.5 mg in microcentrifugeerbuisje)● Buffer (fosfaatbuffer = PBS; 20 mL in centrifugeerbuis)● 1% solution van Triton X (3 mL in centrifugeerbuis)● 15 Pasteurpipettes● 10 microcentrifugeerbuisjes (2 mL volume)● microcentrifugeerbuisrek● microspatula● vortex (elektrische schudder)● automatische pipet + tipjes● microtiterplaat (transparant 96-kuiltjes met doorzichtige platte bodem)

Experimentele procedure :1. Voeg in een epje zo precies mogelijk 1.5 mL van de fosfaatbuffer (PBS) toe aan de

1.5 BSA (Bovine serum albumin). Meng het buisje en vortex het totdat al het BSA opgelost is (dit duurt 3-5 minuten). Gebruik een pasteurpipet of een automatische pipet. Deze laatste kost je veel tijd.

19

Page 20: Taak 1: opdrachten (docx)

NB! Je kunt gedurende alle stappen dezelfde pasteurpipet gebruiken bij het toevoegen van PBS als je er zeker van bent dat deze niet verontreinigd is geraakt. Als je niet zeker bent, gebruik een schone.2. Maak een 1% melk-oplossing in een epje: Doe 1 ml PBS in een epje (gebruik

hiervoor een pasteurpipet) en voeg daarna 10 μL melk aan hetzelfde epje met een automatische pipet. Vortex de oplossing en label het epje met MILK#1.

NB! Gooi bij iedere handeling je pipetpunt weg!3. Maak een 0.02% melk-oplossing in een epje: Doe met een Pasteurpipet 1 mL PBS

in een epje en voeg met een automatische pipet 20 μL van MILK#1 toe aan hetzelfde buisje. Vortex de oplossing en label het epje met MILK#2.

4. Maak een 1% oplossing van de vloeistof fractie verkregen uit de aangezuurde melk. Doe met een pasteurpipet 1 mL PBS in een epje en voeg hier 10 μL van het sample LIQ aan toe. Vortex de oplossing en label het epje met LIQ#1.

5. Maak een 0.2% oplossing van de vloeistof fractie verkregen uit de aangezuurde melk. Doe met een automatische pipet eerst 160 μL PBS ine en epje en voeg hierbij 40 μL van oplossing LIQ#1. Vortex de oplossing en label het epje met LIQ#2.

6. Doe met een lepeltje een kleine hoeveelheid van de vaste fractie verkregen uit de aangezuurde melk in een epje (uit de petrischaal SOL). Label dit buisje met SOL#1. Voeg hierbij 1 ml van de 1% oplossing van Triton X door gebruik te maken van een Pasteurpipet (Triton X is een detergent die er voor zorgt dat de eiwitten uit het pellet oplossen). Vortext dit epje voor 3-5 minuten tot het pellet volledig is afgebroken tot kleiner stukjes.

In het geval dat je geen vaste fractie uit het vorige onderdeel hebt verkregen, vraag de lab-assistant voor hulp (je krijgt een ready-to-use sample, maar 2 punten zullen worden afgetrokken).7. Maak een 2% oplossing uit het supernatant verkregen in de vorige stap (het

sample op basis van de vast fractie). Doe met een pasteurpipet eerst 1 ml PBS in een epje en voeg daarna 20 μL van de oplossing SOL#1 aan het buisje toe. Zorg er voor dat je alleen vloeistof overbrengt naar dit buisje en er geen vaste stukjes mee gaan. Vortex dit epje en label het met SOL#2.

8. Maak een 1% oplossing van WHEY I. Doe met een pasteurpipet eerst 1 ml PBS in een epje en voeg daarna met een automatische pipet 10 μL wei toe aan dit buisje. Vortex de oplossing en label het met WHEY#1.

9. Maak een 0.2% oplossing van de wei (whey). Gebruik een automatische pipet. Doe eerst 160 μL PBS in een epje en voeg daarna 40 μL uit de oplossing WHEY#1 toe aan hetzelfde epje. Vortex de oplossing en label het met WHEY#2.

10. Voeg met een spateltje een kleine hoeveelheid van de wrongel CURD I toe (kaas) en label dit met CURD#1. Doe met een pasteurpipet 1 ml van de 1% oplossing

20

Page 21: Taak 1: opdrachten (docx)

van Tritin X in dit epje. Vortext dit epje voor 3-5 minuten tot het pellet volledig is afgebroken tot kleiner stukjes.

In het geval dat je geen wrongel uit het vorige onderdeel hebt verkregen, vraag de lab-assistant voor hulp (je krijgt een ready-to-use sample, maar 2 punten zullen worden afgetrokken).11. Maak een 2% oplossing van de vloeistof fractie van het epje CURD#1. Doe met

een pasteurpipet 1 ml PBS in een epje en voeg daarna met een automatische pipet 10 μL van CURD#1 toe aan hetzelfde epje. Zorg er voor dat je alleen vloeistof overbrengt naar dit buisje en er geen vaste stukjes mee gaan. Vortex dit epje en label het met CURD#2.

12. In totaal heb je nu 10 samples en een BSA standaard sample in epjes. Je kunt gaan beginnen met deze te pipetteren in de microtiter plaat door de onderstaande stappen te volgen. Wees voorzichtig met pipetteren omdat eiwitbevattende oplossingen gasbellen kunnen vormen die de metingen kunnen beïnvloeden. Als er gasbellen gevormd worden kun je die weghalen met de scherpe kant van een pipetpunt.

13. Controleer of je teamnaam om de deksel van de plaat staat en haal de deksel van de plaat. Zorg ervoor dat de deksel niet kan verschillen met andere teams.

14. Eerst ga je een verdunningsreeks maken van de BSA oplossing door gebruik te maken van een automatische pipet. a. Pipetteer 140 μL PBS in welletje (putje) H1. Vervolgens pipetter je 75 μL in

A1-G1).b. Voeg 10 μL van de BSA oplossing in welletje H1 en meng dit goed met behulp

van de pipet (haal de vloeistof een paar keer op en neer met je pipetpunt). c. Haal met je pipet 75 μL uit welletje H1 en doe dit in welletje G1. Mix dit

opnieuw zoals hierboven beschreven. Neem uit vervolgens uit dit welletje opnieuw 75 μL en doe dit in welletje F1. Herhaal deze stappen totdat je bij welletje B1 beland.

d. Uit B1 haal je wel oplossing, maar deze breng je niet over naar A1. In plaats daarvan gooi je deze weg samen met de pipetpunt. Nu heb je als je het goed gedaan hebt in alle welletjes in kolom 1 75 μL aan vloeistof zitten.

e. Herhaal de stappen hierboven met kolom 2.15. Nu ga je 75 μL van hierboven gemaakte 10 samples in de welletje van de

microtiterplaat pipetteren volgens het overzicht van tabel 2. Bij de samples SOL#1 and CURD#1, let op dat je alleen vloeistof overbrengt en geen vaste stof. Zorg dat de inhoud van de welletjes goed gemixt is door op en neer te pipetteren.

21

Page 22: Taak 1: opdrachten (docx)

Tabel 2.1. Overzicht van de samples in de microtiterplaat voor het uitvoeren van de Bradford analyse

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A PBS PBS MILK

#1

MILK

#1

CURD

#1

CURD

#1

BB

S

A

v

e

r

d

u

n

n

i

n

g

B

S

A

v

e

r

d

u

n

n

i

n

g

MILK

#2

MILK

#2

CURD

#2

CURD

#2

C LIQ#1 LIQ#1

D LIQ#2 LIQ#2

E SOL#1 SOL#1

F SOL#2 SOL#2

G WHEY#1

WHEY#1

H WHEY#2

WHEY#2

16. Tot slot voeg je aan alle gevulde welletjes 75 μL van het verdunde Bradford reagent toe. Ook wanneer je dit reagent toevoegt mix je het door de vloeistof in de pipet heen en weer te halen. De welletjes die eiwitten bevatten zullen blauw kleuren. Doe de deksel met je teamnaam weer op de plaat en geef deze aan de lab-assistent. Hij/zij zal de adsorptie van alle welletjes meten.

22

Page 23: Taak 1: opdrachten (docx)

A.2.2.2 Bereken de concentraties (in mg/ml) van de verdunningen van BSA in de welletjes A1-H1 van de microtiterplaat. Bereken voor iedere BSA concentratie en de controle met alleen PBS uit de reeks, de gemiddelde van de adsorptie-waarden die je intussen van de labassistent hebt terug gekregen (bijvoorbeeld het gemiddelde van het welletje H1 and H2). Vul de tabel uit de excel-file in.

A.2.2.3 Plot de data uit A.2.2.2 in de Excel file (BSA concentratie op de x-as en de gemiddelde absorptie waarden op de y-as).

A.2.2.4 Bereken voor ieder van de bij elkaar horende samples uit de kolommen 4-7 de gemiddelde adsorptie-waardes (bijvoorbeeld welletjes A4 and A5). Vul de tabel die je vindt in de excel-file vindt.

A.2.2.5

Je kunt de ijklijn die je gemaakt hebt in opdracht A.2.2.3 gebruiken om uit de gemiddelde adsorptie waarden van de samples uit de kolommen 4-7, de totale eiwit concentratie in die samples te bepalen (in mg/mL). Als de adsorptie waarden die gemeten zijn voor deze samples buiten de range van de ijklijn vallen, gebruiken dan in de tabel het teken < als de totale eiwitconcentratie lager is dan het minimum of > als deze groter is dan het maximum. Als je geen ijklijn hebt kunnen maken in 2.2.3 kun je er een krijgen van de lab-assistant (je verliest hier wel 4 punten mee). Vul je gevonden waarden in in de tabel in de excel-file.

A.2.2.6 Gebruik de gemiddelden van de bij elkaar horende samples, om de totale eiwit-concentratie terug te rekenen naar de oorspronkelijke samples (in mg/mL).Using the most precise averaged results, calculate the total protein concentration (in mg/mL) in the samples. Vul de tabel in. Deze vind je in de excel-file.

Opdracht A.2.3 de verandering in eiwitsamenstelling door middel van SDS-page In tabel 2.2 vind je de globale eiwitsamenstelling van rauwe melk.

Tabel 2.2. De relatieve eiwitsamenstelling van rauwe melk en de moleculaire massa van de betreffende eiwitten gemeten door middel van gel-elektroforese.

Eiwit-familie Aanwezigheid in Rauwe melk, %

Moleculaire Massa, g/mol (Da)

α-caseine 45–55 32 000

β-caseine 25–35 29 000

κ-caseine 8–15 25 000

β-lactoglobuline 7–12 17 00023

Page 24: Taak 1: opdrachten (docx)

α-lactalbumine 2–4 12 000

Gedurende hittebehandeling kunnen melkeiwitten een reactie met elkaar aangaan waardoor grotere complexen met een hogere moleculaire massa ontstaan (groter dan 50 000 Da).

In de melk van een koe is ongeveer 90% kan de caseine aanwezig als moleculaire complexen genaamd micellen. In deze melk wordt samenklontering voorkomen door water-oplosbare staarten (glycopeptiden) gebonden aan caseine. Zodra het stremsel wordt bijgevoegd hydrolyseren de enzymen in het stremsel specifiek de stabiliserende buitenste laag van de micellen waardoor para-caseine met een lagere moleculaire massa en een grotere hydrofobiciteit. Hierdoor ontstaat er een samenklontering van de hydrofobe delen, waardoor de caseine-klusters groter worden totdat de wrongel is ontstaan. Wrongel bestaat uit water, vet en bacteriën.

SDS-Page (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) is een techniek die gebruikt wordt om eiwitten te zuiveren op basis van hun moleculaire massa. De eiwitten in het sample worden hierbij gedenatureerd door gebruik te maken van een detergent (sodium dodecyl sulfate, SDS) en hitte. SDS bindt aan de residuen van de aminozuren waardoor deze een negatieve lading krijgen. Vervolgens worden de samples aangebracht op een poreuze gel. Op deze gel wordt elektrische spanning aangebracht waardoor de negatief geladen moleculen zich verplaatsen richting de positieve electrode. De polyacrylamide gel zorgt ervoor dat de grotere moleculen minder snel door de gel migreren in vergelijking tot de kleinere moleculen waardoor de eiwitten worden gescheiden op basis van hun moleculaire massa. Een mix van eiwitten, waarvan de moleculaire massa bekend is, wordt opgebracht als een standaard in een aparte baan op dezelfde gel om de analyse van de samples in de andere banen te kunnen doen. Na de elektroforese kunnen de eiwitten op de gel zichtbaar worden gemaakt met een kleurstof zoals Coomassie Brillian Blue.

24

Page 25: Taak 1: opdrachten (docx)

A.2.3.1 In figuur 2.2 is een voorbeeld van een SDS-PAGE gel die gekleurd is met Coomassie Brilliant Blue. Ieder sample is aangebracht in een eigen baan. Laat zien in het blok op het antwoordblad op welke afstand op de je de banden kunt zien die overeenkomen met (*) α-caseine, (**) β-caseine, (***) κ-caseine, (#) β-lactoglobuline, (‡) α-lactalbumine.

Figuur 2.2. Een SDS-PAGE gekleurd met Coomassie Brilliant Blue. De meest linkerbaan (L) bestaat uit een mix van eiwitten waarvan de moleculaire massa (Mw) bekend is, weergegeven in kilodaltons (kDa). Baan 1 en 2 bevatten melk; baan 3 bevat de vloeibare fractie uit aangezuurde melk; baan 4 en 5 bevatten het supernatant uit de vaste fractie uit de aangezuurde melk (niet hetzelfde als wei); baan 6 bevat wei; baan 7 en 8 bevatten het supernatant uit de kaaswrongel I (CURD1).

A.2.3.2 Door gebruik te maken van software kun je de intensiteiten in de gel kwantificeren. Voor de verschillende banen is gekeken naar de eiwitten in de range van 35–25 kDa, 17 kDa and 12 kDa. De resultaten worden weergegeven als het percentage van de totale intensiteit in de corresponderende baan (relatieve hoeveelheid, zie figuur 2.3). Geef in de tabel op het antwoordenblad aan welke van de stellingen betreffende deze grafiek waar (schrijf +) en welke onwaar zijn (schrijf 0).

25

Page 26: Taak 1: opdrachten (docx)

Figuur 2.3. Relatieve hoeveelheid (%) van de eiwitten met verschillende moleculaire massa in de verschillende aangemerkte banen van de gel. De nummering van de banen correspondeert met die uit figuur 2.2.

Nummer Stelling

1 De relatieve hoeveelheid van eiwitten met een moleculaire massa van 32-25 kDa (zoals weergegeven in figuur 2.3) geeft zegt niks over in de physisch-chemische processen die plaatsvinden tijdens het aanzuren van de melk of de kaasproductie.

2 De relatieve hoeveelheid van caseine wordt lager in de vloeistof-fractie uit de aangezuurde melk en in de wei, omdat caseine gedurende het proces (van zowel het aanzuren van melk als het maken van kaas) slecht oplosbaar wordt.

3 De relatieve hoeveelheid van caseine wordt lager in de vloeistof-fractie uit de aangezuurde melk, omdat de caseine tijdens het aanzuren worden afgebroken.

4 De relatieve hoeveelheid van caseine wordt lager in de supernatant van de de kaaswrongel omdat caseine wordt afgebroken tijdens de kaasproductie.

5 De relatieve hoeveelheid van β-lactoglobuline en α-lactalbumine neemt toe in de wei, omdat deze eiwitten worden geproduceerd door de bacteriën gedurende de kaasproductie.

6 De relatieve hoeveelheid van β-lactoglobuline en α-lactalbumine in de vloeibare fractie uit de aangezuurde melk en in wei neemt toe, omdat de relatieve hoeveelheid van caseine afneemt.

26

Page 27: Taak 1: opdrachten (docx)

7 De relatieve hoeveelheid van de eiwitten met een moleculaire massa van 17 kDa en 12 kDa in het supernatant uit de wrongel neem toe door de producten die ontstaan uit de enzymatische afbraak van caseine.

8 De eiwitsamenstelling van melk en het supernatant uit de vaste fractie van de aangezuurde melk is drastisch verandert omdat het zuur de eiwitten afbreekt.

27

Page 28: Taak 1: opdrachten (docx)

MelkdagOpdracht A.3 Jodometrische titratie van lactose

Melk is een natuurproduct dat beschouwd kan worden als een colloïdale oplossing die proteïnen, vetten en koolhydraten (voornamelijk lactose) bevat. De opdracht is om deze melkbestanddelen verder te onderzoeken met behulp van fysische, chemische en biologische technieken. Het onderzoek wordt gefinancierd door het zuivelbedrijf cowBoom. Het is de bedoeling van cowBOOM om een serie van gespecialiseerde melkproducten op de markt te brengen. Jullie onderzoek maakt het mogelijk verschillende eigenschappen van de melkmonsters te bepalen en de geschiktheid voor de markt.

Opmerking: pagina's 2, 12 en 24 zijn identiek

Benodigdheden:● laptop● pennen● 2 watervaste stiften● 2 potloden (het vulpotlood is voor opdracht A.1)● liniaal● schaar● lange - en korte tang● Post-it papiertjes● klok● rekenmachine● gedestilleerd water (500 mL fles)● veiligheidsbril● tissue● afvalvat voor papier (blauw label)● afvalvat voor plastic (geel label)● afvalvat voor glas (groen label)● gele plastic (maat)beker voor vloeistofresten ('nat'-afval)

28

Page 29: Taak 1: opdrachten (docx)

29

Page 30: Taak 1: opdrachten (docx)

OPDRACHT A.3 Jodometrische titratie van lactoseLactose is een disaccharide dat bestaat uit een galactose- en een glucose-eenheid. Het lactosegehalte van een oplossing kan gemeten worden door middel van een jodometrische titratie. Hierin treedt jood op als de oxidator en lactose als de reductor. Een bekende hoeveelheid jood, die in overmaat is ten opzichte van lactose, wordt toegevoegd aan een melkmonster met een onbekend lactosegehalte. Een deel van het jood reageert met de lactose in het monster. In de volgende stap wordt de overmaat I2 getitreerd met een Na2S2O3 oplossing van bekende concentratie. Een "blanco" (gedestilleerd water) wordt op dezelfde manier getitreerd als de melk om te corrigeren voor het verlies van jood als gevolg van het proces (niet door het analyt). Uit het verschil tussen de hoeveelheid jood in de blanco en de hoeveelheid jood in het monster kun je bepalen hoeveel jood met lactose heeft gereageerd. Uit deze gegevens kan het lactosegehalte van het melkmonster worden berekend.

Je krijgt óók een gefermenteerd melkmonster. Dit monster is gemaakt van dezelfde melk als die je titreert, maar substantie B (dezelfde als die in opdracht A.2.1 wordt gebruikt) is hier gisteren aan toegevoegd. Jij moet bepalen hoe de lactoseconcentratie sindsdien is veranderd (hetzelfde gebleven, gestegen of gedaald).

A.3.1 Op het antwoordblad vind je zowel de (gesloten) structuurformule van lactose (bestaande uit twee ringen) en vier mogelijke open (keten-) structuurformules. Geef van elke mogelijke ketenstructuur aan of het wel of niet een correcte structuur van lactose is.

A.3.2 Schrijf je antwoorden op het antwoordblad. Hieronder staan de vergelijkingen van de

reacties die plaatsvinden in de jodometrische titratie van lactose. Maak deze vergelijkingen

kloppend door een getal (coëfficiënt) voor elk deeltje te zetten, behalve als dit een 1 is.

C12H22O11(lactose) + I2 + NaOH → C12H21O12Na + NaI + H2O

Na2S2O3 + I2 → NaI + Na2S4O6

In deze opdracht ga je het massapercentage lactose van melk en gefermenteerde melk bepalen. Hiervoor wordt een jodometrische titratie gebruikt.

Lijst van benodigdheden:● melk in een 300 mL plastic fles (gelabeld MILK)

● gefermenteerde melk (in een plastic potje van 50 mL)

● oplossing van CuSO4 (in een plastic potje van 50 mL)

● 0,5 M NaOH oplossing (in een plastic potje van 50 mL)30

Page 31: Taak 1: opdrachten (docx)

● 1 M HCl oplossing (in een plastic potje van 50 mL)

● 0,5% zetmeeloplossing (in een druppelflesje)

● 0,0500 M I2 (in een 100 mL erlenmeyer die bedekt is met aluminiumfolie)

● 2 maatkolven van 250 mL met plastic stoppen

● 4 erlenmeyers van 200 mL met glazen stoppen

● 2 bekerglazen van 250 mL

● een 100 mL bekerglas (voor gedestilleerd water)

● een volumepipet van 10 mL

● een volumepipet van 25 mL

● een glasstaaf

● een buret gevuld met 0,100 M Na2S2O3

● een bekerglas van 100 mL onder de buret

● ronde papieren filters

● een blauwe plastic trechter

● 7 pasteurpipetten

● 3 plastic centrifugebuizen van 15 mL

● een weegschaal

● 3 vellen aluminiumfolie

● twee pipetvullers

Als je meer chemicaliën, filterpapier of tissues nodig hebt, vraag dat dan aan een

zaalassistent. Vraag de zaalassistent ook om de Na2S2O3 oplossing in de buret aan te vullen

Voor al deze dingen worden geen punten afgetrokken.

Werkwijze:

N.B. Naast de blanco moet je twee monsters bereiden en titreren: melk en gefermenteerde

melk. Kijk daarom eerst goed naar stap 13 voor een goede tijdsindeling!

1. Telkens vóórdat je een monster neemt moet je de fles met melk of het potje met gefermenteerde melk grondig, maar niet te hard schudden. Te hard schudden leidt tot ongewenste schuimvorming!

2. Weeg ongeveer 10 g melk af in een maatkolf van 250 mL. Gebruik hiervoor een

pasteurpipet. Noteer de exacte massa van de melk in tabel 3.1 op het

antwoordblad. Voeg gedestilleerd water toe tot de maatkolf ongeveer halfvol is en

meng goed door de maatkolf te zwenken.

31

Page 32: Taak 1: opdrachten (docx)

3. Voeg ongeveer 5 mL van de CuSO4 oplossing toe om de melkeiwitten te laten

neerslaan. Je mag een pasteurpipet en/of een centrifugebuis gebruiken voor de

volumemetingen. Meng de inhoud van de maatkolf door te zwenken. Voeg

vervolgens ongeveer 4 mL van de 0,5 M NaOH oplossing toe aan de inhoud van de

maatkolf en meng deze opnieuw door te zwenken. Je mag weer een pasteurpipet

en/of een centrifugebuis gebruiken voor de volumemetingen.

4. Vul de maatkolf aan met gedestilleerd water tot het maatstreepje, doe een plastic

stop op de maatkolf en meng de inhoud grondig. Laat de maatkolf 20 minuten staan

om de reacties plaats te laten vinden. Plak eventueel een Post-it met de starttijd op

de maatkolf!

5. Gebruik de trechter, een droog filterpapier en eventueel de glasstaaf om na 20

minuten het mengsel te filtreren. Vang het filtraat op in het bekerglas van 250 mL.

6. Doe 25,00 mL van het filtraat in een 200 mL erlenmeyer.

7. Voeg 10,00 mL van de 0,0500 M I2 oplossing toe aan het mengsel en meng

voorzichtig door te zwenken.

8. Voeg ongeveer 7,5 mL van de 0,5 M NaOH oplossing toe. Je mag weer een

pasteurpipet en/of een centrifugebuis gebruiken. Meng de oplossing.

9. Doe een stop op de erlenmeyer en wikkel aluminiumfolie om de erlenmeyer heen,

zodat geen licht bij de oplossing kan. Laat de oplossing 20 minuten staan.

10. Voeg nu ongeveer 4 mL van de 1 M HCl oplossing toe, met een pasteurpipet en/of

een centrifugebuis, en noteer het beginvolume in tabel 3.2 op het antwoordblad

van de vloeistof in de buret. Begin dan met de titratie van het overgebleven jood

met de 0,1 M Na2S2O3 oplossing. Als je oplossing lichtgeel is, voeg dan een paar

druppels zetmeeloplossing toe, totdat de oplossing in de erlenmeyer donkerblauw

gekleurd is. Titreer totdat de blauwe kleur verdwenen is en de oplossing gedurende

30 seconden niet meer blauw wordt. Noteer je resultaten in tabel 3.2 op het

antwoordblad.

11. Herhaal stap 6 t/m 10 zo vaak als je denkt dat nodig is om het lactosegehalte van het

monster nauwkeurig te kunnen berekenen.

12. Herhaal het experiment met een blanco (gedestilleerd water). Voer hiervoor alleen

stap 6 t/m 11 uit, waarbij je in stap 6 gedestilleerd water gebruikt in plaats van het

filtraat. Noteer de resultaten in Tabel 3.2 op het antwoordblad. Indien nodig moet je

de volumepipet, het bekerglas en de trechter spoelen met gedestilleerd water en de

32

Page 33: Taak 1: opdrachten (docx)

trechter drogen met tissues. Je kunt voor het spoelen de gootsteen aan het uiteinde

van je labtafel gebruiken.

13. Herhaal stap 1 t/m 11 voor de gefermenteerde melk in plaats van 'gewone' melk.

Deze titratie hoeft niet erg precies te worden uitgevoerd (twee titraties zijn méér

dan genoeg). Het is alleen belangrijk om te kunnen bepalen of het lactosegehalte in

gefermenteerde melk groter is dan, kleiner is dan of gelijk is aan dat van 'gewone'

melk. Noteer de resultaten in tabel 3.1 en 3.3 op het antwoordblad. Indien nodig

moet je de 25 mL volumepipet spoelen met het filtraat van de gefermenteerde melk

en de 250 mL maatkolf met gedestilleerd water.

A.3.3 Controleer of je tabel 3.1, 3.2 en 3.3 op het antwoordblad hebt ingevuld.

A.3.4 Bereken het massapercentage lactose in melk op basis van de 'geaccepteerde volumes' uit Tabel 3.2 and 3.3 op het antwoordblad. De molaire massa van lactose is 342 g/mol.

33

Page 34: Taak 1: opdrachten (docx)

OPDRACHT A.4 Melkproductie – Integratie van resultatenIn deze opdracht ga je beslissen in hoeverre de onderzochte melk in de voorgaande opdrachten (opdrachten A.1–A.3) bruikbaar is voor verschillende marketing ideeën van het start-up bedrijf cowBOOM.

A.4.1 cowBOOM wilvoordelige melk verkopen waaraan vitamine D is toegevoegd. In figuur 3.1 is weergegeven hoe de oplosbaarheid van vitamine D afhangt van het vetgehalte. Op grond van de resultaten van opdracht A.1, welke melk zou je dan kiezen voor dit doel (K, L, M, of N)? Vanwege standarisatie en kwaliteitsredenen is het belangrijk dat er geen roomvorming op de melk plaats heeft.

Figuur 4.1. Oplosbaarheid (g/L) van vitamine D afhankelijk van het vetgehalte (%) in melk. De pijl geeft de richting aan waarin waarin de oplosbaarheid toeneemt.

A.4.2 cowBOOM heeft de intentie allergie-vrije melk te produceren voor mensen die allergisch zijn voor gentamicine, een bepaald type antibioticum. Figuur 3.2 geeft weer het lactosegehalte van melk die behandeld is met substantie B (zoals gebeurd is in opdracht A.2.1), afhankelijk van de incubatietijd in de aanwezigheid, respectievelijk afwezigheid, van het antibioticum. Denk je dat de melk die je gebruikt hebt bij opdracht A.2 en A.3 geschikt is als gentamicine allergie-vrije melk voor de markt? Ja of Nee?

34

Page 35: Taak 1: opdrachten (docx)

Figure 4.2. Relatief lactosegehalte (%) afhankelijk van de incubatie tijd (h) van melk

behandeld met substantie B in afwezigheid van gentamicine ( ) , respectievelijk in

aanwezigheid van (sporen van) gentamicine ( ). De pijlen geven de richting van toenemende waardes aan.

A.4.3 Ongeveer 65% van de mensen in de wereld hebben een lactose intolerantie. cowBOOM wil dit te gelde maken door voor deze doelgroep geschikte melk te verkopen. Deze melk moet dan minder dan 0,01 massaprocent lactose bevatten. Denk je dat de melk die je gebruikt hebt in oopdracht A.2 en A.3 geschikt is als lactose vrije melk voor deze doelgroep? Ja of Nee?

A.4.4 Tenslotte, cowBoom heeft de intentie om allergie-vrije melk te verkopen voor mensen die allergisch zijn voor casiëne. Melk die hiervoor geschikt is moet minder dan 0,005 massaprocent caseïne (totaal van α, β en κ). Denk je dat de melk die je gebruikt hebt in opdrachten A.2 en A.3 geschikt zijn voor dit (marketing) doel? Ja of Nee?

35