Screening & exploratie :

sommige technieken zijn specifiek gericht op genoombanken, andere op

cDNA banken, of andere kunnen op beide van toepassing zijn.

- isoleren van een gen, op basis van gekende activiteit (eiwit gecodeerd door het gen) (kan via een bank, maar ook gerichter)

- vergelijking van toestanden (vooral bij cDNA banken)

(welke en hoeveel mRNA's zijn ergens bij betrokken?)

- exploratie van genoombanken : uniforme representatie binnen een organisme, maar ook onderlinge vergelijking tussen organismen mogelijk

Activiteit aminozuursequentie

CEL Antisera (polyclonaal, monoclonaal)

reverse translatie proteine extract

Sonde(s)

Tumorlijn

Inductie

Natuurlijkeconditie

mRNA

in vitro translatie

Activiteit

ChemischeDNA

synthesis

TEST

oligo-dT chromatografie

polyA+ mRNA

cDNA klonering kloons

Hybridisatie

DNA sequencing

Expressie / productie

EST banken

HARTHST

cDNA klonering : overzicht van werktuigen / strategieën / procedures / samenspel

Screening van DNA banken

uitplaten van een kloonbank : als cfu/ml of pfu/ml (cellen of fagen in suspensie)

lage densiteit (individuele kloons) of hoge densiteit (tot een confluente laag)

(9 cm platen, 13 cm platen, 21 x 21 cm vierkante platen, microtiterplaten (96 - 384 - 1536)

- directe selectie : slechts zeer exceptioneel

- bvb. klonering van een antibioticum resistentiegen

- bvb. auxotrofe merkers : ‘marker rescue’ benadering : een mutante stam of

een speciaal medium/conditie is vereist (vb. isolering van het trpA gen)

- bvb. ‘complementation cloning’ : met genomische DNA fragmenten van

gist kan het defect in een E. coli leuB mutant gecomplementeerd

worden => isolering van het gist LEU2 gen

- daarnaast is ook directe identificatie mogelijk : elk gen nodig voor een

biochemische conversie van een verbinding in het groeimedium tot

een visualiseerbaar product (kleur, fluorescentie, …) (vb. LacZ)

Rechtstreekse selectie van eenkloon die het R6-5 kanamycine-resistentiegen (kanR) bevat.

Zwakke benadering als men niet voorafweet dat geen EcoRI knipplaats in het kanR gen aanwezig is. => vandaar : via partiële splitsing zoals voorheen gezien (hoofdstuk 8).

Directe selectie van een trpA gen met behulp van een trpA-

stam van E. coli

Een geschikte mutante stam moet beschikbaar zijn.

(Zelfde opmerking als hiervoor omtrent de EcoRI splitsing.)

Functionele complementatiemet DNA uit BAC kloons in transgene muizen.

=> gen-gericht versus vergelijking-gericht

gen-gericht

- detectie van de gezochte kloon is gebaseerd op ‘informatie’ : dit kan

proteïne of nucleïnezuur (sequentie) zijn

- hybridisatie : sonde (probe) vereist

kolonie hybridisatie, kolonie ‘lifting’

plaque hybridisatie, plaque ‘lifting’

probes : (in volgorde van dalende hoeveelheid informatie)

- sequentie is bekend

- homologe sequentie beschikbaar : (een fragment volstaat)

- heterologe sequentie beschikbaar : welke temperatuur? => ZOO blots

- aminozuursequentie van een proteïne (geheel of deels) gekend- synthetische/gedegenereerde sondes (oligonucleotiden)

set van individuele oligonucleotiden of mengsel of ‘guessmer’ gebruik van deoxy-inosine, enz.

- screening met PCR : DNA uit kloon pools, bij positief signaal dilueren totuiteindelijk een homogene kloon bekomen wordt

(de sequenties waar de primers moeten aanhechten moeten uiteraard gekend zijn ; maar ook hier kunnen mixed primers

of degenereerde primers gebruikt worden)

Screening door hybridisatie

DNA sondes

RNA sondes

oligonucleotide sondes

"mixed probes" en guessmers

"mismatch probes“(gedegenereerde sondes)

homologe sondes

heterologe sondes

=> "ZOO blots"

polyclonale antisera

monoclonale antilichamen

Kolonie hybridisatie.

De sonde ("probe") is radioactief

gemerkt of enzymatisch, fluorescent

of immunologisch geëtiketteerd ("tag").

Detectie door autoradiografie, kleur,

fluorescentie, enz.

Gelijkaardige procedures voor plaque hybridisatie.

Heterologe hybridisatie

Analyse van een tarwe-genoombank met een cDNA kloon (voor gliadine) als sonde.

*

Gebruik van synthetischeoligonucleotiden.

Terugkoppeling naar de degeneratie van de genetische code.

De aminozuursequentie van gist cytochrome c.

Het hexapeptide dat geel ingekleurd is, is een voorbeeld van hoe een nucleotidesequentie kan voorspeld worden vanuit een aminozuursequentie.

-trp-asp-glu-asn-asn-met-

-TGG-GAY-GAR-AAY-AAY-ATG- 18-meer

2 x 2 x 2 x 216 oligonucleotiden vertegenwoordigen alle mogelijkheden.

Gebruik van een synthetisch,

gemerkt of geëtiketteerd

oligonucleotide (of mengsel

van alle mogelijke sequenties) om

een kloon van het cytochroom c

gen van gist te identificeren.

=> twee hybridisatierondes :

van waarschijnlijk tot definitief.

UUU 22.2 (35846) UCU 8.7 (14013) UAU 16.5 (26648) UGU 5.2 ( 8458)UUC 15.9 (25565) UCC 8.9 (14420) UAC 12.3 (19766) UGC 6.4 (10285)UUA 13.8 (22316) UCA 8.1 (13117) UAA 2.0 ( 3163) UGA 1.1 ( 1751)UUG 13.0 (20904) UCG 8.8 (14220) UAG 0.3 ( 435) UGG 15.3 (24656)

CUU 11.4 (18366) CCU 7.2 (11657) CAU 12.8 (20631) CGU 20.2 (32590)CUC 10.5 (16869) CCC 5.6 ( 8961) CAC 9.4 (15116) CGC 20.8 (33547)CUA 3.9 ( 6257) CCA 8.4 (13507) CAA 14.7 (23703) CGA 3.8 ( 6166)CUG 51.1 (82300) CCG 22.4 (36178) CAG 29.4 (47324) CGG 6.2 ( 9955)

AUU 29.7 (47838) ACU 9.1 (14639) AAU 19.2 (30864) AGU 9.4 (15123)AUC 23.9 (38504) ACC 22.8 (36724) AAC 21.7 (34907) AGC 16.0 (25800)AUA 5.5 ( 8835) ACA 8.1 (13030) AAA 34.0 (54723) AGA 2.9 ( 4656)AUG 27.2 (43846) ACG 15.0 (24122) AAG 11.0 (17729) AGG 1.8 ( 2915)

GUU 18.1 (29200) GCU 15.4 (24855) GAU 32.8 (52914) GGU 24.2 (38983)GUC 14.8 (23870) GCC 25.2 (40571) GAC 19.2 (30953) GGC 28.1 (45226)GUA 10.9 (17561) GCA 20.7 (33343) GAA 39.3 (63339) GGA 8.9 (14286)GUG 26.2 (42261) GCG 32.3 (52091) GAG 18.7 (30158) GGG 11.8 (18947)

Kodewoordgebruik frequenties per duizend (absoluut aantal)

(hulpmiddel bij uittekenen van een guessmer ; uiteraard de tabel nemen van het organisme waarvan de insert-DNAs afkomstig zijn.)

in E. coli O157:H7 EDL933

5347 CDS's (1611503 codons)

in E. coli K12

14 CDS's (5122 codons)

UUU 19.7 (101) UCU 5.7 ( 29) UAU 16.8 ( 86) UGU 5.9 ( 30)UUC 15.0 ( 77) UCC 5.5 ( 28) UAC 14.6 ( 75) UGC 8.0 ( 41)UUA 15.2 ( 78) UCA 7.8 ( 40) UAA 1.8 ( 9) UGA 1.0 ( 5)UUG 11.9 ( 61) UCG 8.0 ( 41) UAG 0.0 ( 0) UGG 10.7 ( 55)

CUU 11.9 ( 61) CCU 8.4 ( 43) CAU 15.8 ( 81) CGU 21.1 (108)CUC 10.5 ( 54) CCC 6.4 ( 33) CAC 13.1 ( 67) CGC 26.0 (133)CUA 5.3 ( 27) CCA 6.6 ( 34) CAA 12.1 ( 62) CGA 4.3 ( 22)CUG 46.9 (240) CCG 26.7 (137) CAG 27.7 (142) CGG 4.1 ( 21)

AUU 30.5 (156) ACU 8.0 ( 41) AAU 21.9 (112) AGU 7.2 ( 37)AUC 18.2 ( 93) ACC 22.8 (117) AAC 24.4 (125) AGC 16.6 ( 85)AUA 3.7 ( 19) ACA 6.4 ( 33) AAA 33.2 (170) AGA 1.4 ( 7)AUG 24.8 (127) ACG 11.5 ( 59) AAG 12.1 ( 62) AGG 1.6 ( 8)

GUU 16.8 ( 86) GCU 10.7 ( 55) GAU 37.9 (194) GGU 21.3 (109)GUC 11.7 ( 60) GCC 31.6 (162) GAC 20.5 (105) GGC 33.4 (171)GUA 11.5 ( 59) GCA 21.1 (108) GAA 43.7 (224) GGA 9.2 ( 47)GUG 26.4 (135) GCG 38.5 (197) GAG 18.4 ( 94) GGG 8.6 ( 44)

Vergelijking van kodewoordgebruik in E. coli genen met hoog of laag expressieniveau

"strong" : 24 genen (5253 triplets), waaronder 12 voor ribosomale eiwitten, 7 voor buitenmembraaneiwitten en een aantal voor RNA polymerase en translatie-initiatie- en terminatiefactoren.

"weak" : 18 genen (5231 triplets), voor o.a. verschillende repressoreiwitten, lac-permease (LacY), e.a.

*

Antibodies :

(a) Antilichamen binden aan

"vreemde" moleculen en

helpen bij hun afbraak.

(b) Gezuiverde antilichamen

("antisera") kunnen bekomen

worden (o.a.) uit een kleine

hoeveelheid bloed van een

konijn dat geïnjecteerd was

met het "vreemde" proteïne.

*

- immunochemische methoden : rechtstreeks op expressie product (epitoop)

(dit kan matuur proteïne of fusieconstruct zijn)

=> binding aan polyvinylplaten (kolonies)

of aan cellulosenitraat membranen (-plaques)

=> oorspronkelijk met 125I-gemerkte IgG als sondeook met gemerkt proteïne A (een Staphylococcus aureus eiwit dat bindt aan

IgG’s van heel wat zoogdieren)

=> nu, vaker enzymatische merking van het antilichaam (vb. alkalische fosfatase)

primair antilichaam tegen het doelwit, secundair (gemerkt) antilichaam

om het gebonden primair antilichaam te detecteren

=> gebruik van ofwel polyklonale antilichamen of monoclonaal antilichaam

Immunoscreening

Detectie door :

- het gemerkte antilichaam zelf

of

- gemerkt proteïne A (zoals in deze figuur)

of

- gebruik van een tweede

antilichaam dat specifiek bindt

aan het primaire antilichaam.

Plaque screening van kloons

van fusieproteïnen (aan LacZ)

met behulp van antilichamen.

"Sandwich"-benadering bij analyse

met antilichamen als sonde.

Activiteit aminozuursequentie

CEL Antisera (polyclonaal, monoclonaal)

reverse translatie proteine extract

Sonde(s)

Tumorlijn

Inductie

Natuurlijkeconditie

mRNA

in vitro translatie

Activiteit

ChemischeDNA

synthesis

TEST

oligo-dT chromatografie

polyA+ mRNA

cDNA klonering kloons

Hybridisatie

DNA sequencing

Expressie / productie

EST banken

HARTHST

- indirecte benaderingen : louter gebaseerd op “activiteit”

(translatie in vitro tot actief eiwit)

- HArT (‘hybrid arrested translation’)

- in vitro translatie van mRNA extract

=> selectieve inhibitie van translatie door complementair DNA

- HST (HRT) (‘hybrid-selected translation’, ‘hybrid-released translation’)

- affiniteitsselectie en her-elutie van de ‘positieve’ activiteit

=> pools van clones, stapsgewijs reduceren tot enkelvoudige kloons

Wat indien geen (enkele) informatie beschikbaar is?

Hybrid arrested translation (HArT)

mRNA extract analyse voeg gedenatureerd plasmide DNA analyse

activiteit toe van 1 of meer cDNA kloons activiteit

in vitro translatie

proteïne biochemische in vitro translation

test proteïne test

Het plasmide DNA van de cDNA kloon die de biologische activiteit inhibeert in de

biochemische test is een goede kandidaat-positieve kloon.

Pools van DNAs worden simultaan getest, en vervolgens opgesplitst in kleinere

aantallen, totdat individuele kloon DNAs kunnen getest en geanalyseerd worden.

=> Het negatieve signaal (door inhibitie) wijst op een positieve kloon.

Wat indien geen (enkele) informatie beschikbaar is?

Hybrid selection translation (HST)

mRNA wordt geselecteerd uit een totaal

mRNA extract door hybridisatie op een

geïmmobiliseerd cDNA plasmide kloon

DNA.

In vitro translatie van het geselecteerde

mRNA (na elutie) geeft proteïneproduct

dat in de biochemische test geanalyseerd

wordt.

Een positief signaal wijst naar de

gewenste kloon.

=> gen-gericht versus vergelijking-gericht

vergelijking-gericht

- ‘abundance screening’ : bij klonering zal grosso modo de hoeveelheid DNA van elk insert geëgaliseerd, zelf al was het mRNA in de oorspronkellijke cel slechts minimaal aanwezig ;

maar : het aantal kloons van een mRNA komt nu overeen met de relatieve concentratie van een mRNA in de populatie

- in genoombanken : genfamilies- in cDNA banken : hoge versus lage abundantie van mRNA’s

- differentiële expressie en ‘difference screening’ : enkele voorbeelden

- Xenopus laevis gastrula versus egg mRNA

- vergelijking tussen blad – wortel – stam – enz. bij planten

- planten in licht of in ‘t donker

- + / - inductie

- substractieve technieken (screening/klonering)

- mRNA en cDNA zijn steeds complementair : er is dus geen complementariteit tussen mRNA's van verschillende oorspronger is dus geen complementariteit tussen cDNA's van verschillende oorsprong

- sondes met positieve (na substractie) of negatieve (vergelijking) identificatie

"Difference screening"&"differential expression analysis"

Meerdere DNA-filters worden in parallel gemaakt en vergeleken na hybridisatie met verschillende sondes. Gemerkte of geëtiketteerde cDNA copies van mRNA populaties van verschillende soorten cellen of celtypes, of na groei onder diverse condities, of na inductie of andere behandelingen.

“Abundance screening” : Hybridisatie met sondes uit een cDNA bank om

de abundante genen (of mRNAs) te identificeren.

*

mRNA bereid uit celtype A.mRNA bereid uit celtype B.

cDNA bereid op mRNA van celtype A, enkelstrengig na alkalische behandeling.

Het cDNA is complementair aan het mRNA, ook deze van celtype B voorzover deze in celtype B tot expressiekomen. => renaturatie van cDNA(A) met mRNA(B) geeft hybriden, maar sequenties die beide celtypes niet gemeenschappelijk hebben blijven enkelstrengig.

mRNA en RNA-DNA hybriden binden aan hydroxyapatiet (d.i. Ca5(PO4)3(OH)). Celtype A-specifiek cDNA kan wordengeïsoleerd en gebruikt hetzij om een A-specifieke cDNA bank aan te maken, hetzij om als sonde gebruik te wordenom een volledige cDNA bank van celtype A te screenen.

Substractieve technieken : vergelijking van celtypes

Vergelijking van cellen voor en na inductie.Stappen in differentiële hybridisatie screening procedures.

+/- strategie : vergelijking vansignalen bekomen met replica filters, na hybridisatie met materiaal afgeleid van cellen in respectievelijk een geïnduceerd en niet-geïnduceerd stadium.

Stippellijnen : strategie met "gesubstracteerde" sondes, aangerijkt in sequenties die specifiek onder inductie-omstandigheden aanwezig zijn. Directe identificatie van de "positieve" kloons.

vergelijking-gericht (vervolg)

- ‘differential display’ (PCR benadering)

- cDNA-synthese start met een oligonucleotide zoals

5’-TTTTTTTTVN-3’ (1 van 12)

- terugpriming met nonameren (of hexameren or decameren)

- amplicatie door “toeval” :

=> uitfiltering tot detecteerbaar aantal signalen na gelfractionatie

=> verschillen vereisen nauwkeurige bevestiging

- ESTs : random DNA sequencing van kloons uit de bank : 300-600 nt als etiket

(‘expressed sequence tag’)

- systematische sequentieanalyse van cDNA kloons (inserts)

- oriëntatie-"probleem"

- uitsortering (contig-vorming)

- voordeel : routinematig karakter ; relatieve eenvoud

- nadeel : werkintensief en duur door de grootschaligheidenigszins overmatig t.o.v. van de gewonnen informatie

- EST-banken eerder globaal per organisme dan per conditie

N

N

"Differential display" analyse

*

vergelijking-gericht (vervolg)

- RDA (‘representational difference analysis’)

- genoom vergelijking

- cDNA vergelijking => selectieve amplificeerbaarheid verwezenlijken van hetgeen niet

gemeenschappelijk is door manipulatie van de fragmentuiteinden. => 'tester' (doelwit) en 'driver' (het selecterende agens : in overmaat) => alleen de unieke testerfragmenten hebben een PCR-primersequentie aan beide uiteinden

- SAGE : aaneenschakelen van korte etiketten (9-20 bp), één etiket per mRNA(“serial analysis of gene expression”)

representatie van de mRNA-moleculen door een kort etiket ('tag') => er zijn meer dan 260.000 nonameer-etiketten

> < er zijn maximaal slechts een paar tienduizend mRNA's - etiket => moet voldoende lang zijn om selectief (en informatief) te zijn

=> moet voldoende kort zijn om aantal sequentieanalyses te beperken door concatenatie van de etiketten

- nadeel : heel wat manipulaties om een 'tag library' aan te maken- voordeel : zeer kwantitatieve analyses zijn mogelijk

(tienduizenden tags zijn haalbaar ; frequentiemeting door telling)

- initëel : op basis van FokI : etiket 9 + 4- verdere ontwikkeling naar grotere etiketten => long-SAGE - balans tussen (meer) informatie en (meer) sequentieanalyses

RDA

uit : Primrose & Twyman

Restrictiesplitsing van cDNA staal (gemiddelde grootte van fragmenten >200 bp)

"Anneal " en ligeer een 12/24 linker cassette (bovenste streng alleen aan linkerzijde onderste streng alleen aan rechterzijde)

Verwijder het 12-meer en vul in tot even uiteinden

PCR amplificatie geeft een grote hoeveelheid aan tester en driver DNA

RDA : aanmaak van tester en driver DNA

(synthetische) linkers zijn niet gefosforyleerd

RDA

Verwijder de eerste adaptor door restrictiesplitsing

Koppel een tweede adaptor (zoals de eerste) maar alleen aan het tester DNA

Meng tester en driver in a 1/100 verhouding. Denatureer en re-associeer.

Invulreactie met DNA polymerase

Tester / Driverlineaire amplificatie

Tester / Testerexponentiële amplificatie

Driver / Drivergeen amplificatie

PCR amplificatie met de primers die overeenkomen met de tweede adaptor (of gedeelte ervan)

Karakteriseer de amplificatieproducten

Tester Driver

Tel voor elke taghet aantal keer dat hij voorkomtin de sequenties.

Schematische voorstelling

van de SAGE methode :

1) specifieke tag voor elk mRNA

2) concatenatie voor identificatie

door sequentieanalyse

3) optellen van frequentie van

voorkomen

Algemene basis van SAGE.

'Anchoring' enzym : NlaIII

'Tagging' enzym : FokI

(zie details op volgende slide)

Elk mRNA is vertegenwoordigddoor één tag : deze ligt, kijkend vanaf de poly(A) staart, bij het eerste voorkomen van een NlaIII knipplaats.

FokI splitst op posities 9/13 : het 4-nt uiteinde wordt ingevuld door DNA polymerase. (het 14/18 fragment komt los van de parels en wordt nu ingevuld tot 18-bp even fragmenten ; exclusief de primersequentie voor de FokI plaats)

Ligatie (van even uiteinden) koppelt twee 18-bp fragmenten tot 36-bp en splitsing met NlaIII reduceert deze tot 18-bp met extra 3'-CATG-uiteinden aan beide zijden.

De tags worden paarsgewijs geligeerd in de vector. De paren zijn bijgevolg gescheidendoor een CATG (en kunnenaldus geïdentificeerd worden).

Voorbeeld van een SAGE tag analyse in gist (S. cerevisiae)

*