Scheiding en analyse van glycoproteïnen
Transcript of Scheiding en analyse van glycoproteïnen
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2014 – 2015
Scheiding en analyse van glycoproteïnen
Sarah De Saeger Promotor: Prof. Dr. Yves Briers Co-Promotor: Dr. Ingeborg Stals
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de industriële wetenschappen: biochemie
Auteursrechtelijke bescherming
“De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt
onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
21 augustus 2015
Promotor Auteur
Prof. Dr. Yves Briers Sarah De Saeger
Woord vooraf
Deze masterproef draag ik voor als afsluiter van mijn studie aan de Universiteit Gent, namelijk Master
of Science in de industriële wetenschappen: biochemie, optie biotechnologie.
Ongeveer een jaar geleden werden de mogelijke thesisonderwerpen beschikbaar gesteld. Een keuze
maken uit deze lange lijst met veel interessante projecten, was voor mij geen eenvoudige opdracht.
Na wat wikken en wegen heb ik de stap gezet om bij Dr. Ingeborg Stals navraag te doen naar enkele
onderwerpen. Uit de extra informatie die ik kreeg, bleek dat dit project mij het meeste interesseerde,
dus stelde ik mij kandidaat. Al snel kreeg ik de bevestiging dat het onderwerp aan mij werd
toegewezen.
Gedurende het afgelopen jaar ben ik meer te weten kwam over de verschillende aspecten die in deze
masterproef aan bod komen. Dit is een proces geweest met veel vallen en opstaan, maar het traject
dat ik doorlopen heb om deze thesis waar te maken, was een leerrijke ervaring en is voor mij een
absolute meerwaarde.
Deze thesis heeft mij veel bijgebracht en zou niet tot stand zijn gekomen zonder hulp van
verschillende personen. Langs deze weg wil ik deze mensen hiervoor graag bedanken.
Eerst en vooral wil ik een woord van dank richten aan Dr. Ingeborg Stals om mij dit onderwerp aan te
reiken. Wanneer ik ergens meer uitleg over wou kon ik hiervoor ook steeds bij haar terecht. Voor het
praktische werk heeft Ir. Natalie Bouly mij goed op weg geholpen met onder andere SDS-PAGE. Later
kreeg ik ook hulp van Sylvie Vandoorne voor de IEF. Drs. Ir. Maria Fonseca stond ook steeds klaar
voor mij wanneer ik haar hulp of advies nodig had. Sinds mei heeft Prof. Dr. Yves Briers mij zeer goed
begeleid en met een kritisch oog mijn werk gelezen en bijgestuurd, waarvoor ik hem zeer dankbaar
ben. In tussentijd kon ik terecht bij Prof. Dr. Anita Van Landschoot.
De boog kon natuurlijk niet altijd gespannen staan, daaraan hebben de andere studenten die in het
labo aan hun thesis werkten zeker hun steentje bijgedragen. Bij deze een woord van dank aan Ann
Lefere, Jeroen Feys en Arne Dumarey. Ook de bachelorstudenten met een onderwerp gelijkaardig
aan dat van mijn thesis zorgden voor een leuke sfeer in het labo. Bedankt Jelle Christiaens, Kevin
Sabbe, Warre Schauwvliege en Lieselot Van Cauter voor de toffe samenwerking.
Tenslotte richt ik graag een woord van dank aan mijn familie, studiegenoten en vrienden, voor de
steun die zij mij gaven.
Sarah De Saeger
Samenvatting
Glycoproteïnen zijn eiwitten met één of meerdere suikergroepen aan gebonden. Aan de hand van
scheiding en detectie van deze glycoproteïnen, is het mogelijk om het gehalte van glycoproteïnen ten
opzichte van het totale proteïnegehalte te bepalen in bloedplasma. Er werden stalen varkensplasma, -
concentraat en –poeder verzameld van Veos (Zwevezele) en stalen kippen-, runds-, varken- en
humaan plasma van Sigma-Aldrich. Het eiwitgehalte werd bepaald aan de hand van de Biorad DC
eiwitanalyse. Voor de scheiding en detectie zijn meerdere technieken voorhanden. Voor de analyse
van de eiwitprofielen werd gekozen om gebruik te maken van SDS-PAGE en IEF. Voor het kleuren
van de eiwitgels werden zowel colorimetrische als fluorescente kleuringen uitgetest, inclusief
specifieke kleuringen voor de detectie van de glycoproteïnen. Hierbij werden telkens eerst enkel de
glycoproteïnen gekleurd. Dit gebeurde met de PAS-kleuring of met de fluorescente Pro-Q Emerald
kleuring. Vervolgens werden alle proteïnen gekleurd met Coomassie briljant blauw R-250 of met de
fluorescente SYPRO Ruby-kleuring. Uit de resultaten bleek dat er bij de specifieke kleuringen
meerdere problemen voorkwamen. Vervolgens werd er een poging gedaan om de glycoproteïnen te
scheiden van de niet-geglycosyleerde eiwitten met behulp van affiniteitschromatografie. Hiervoor werd
een lectinekolom aangemaakt van geïmmobiliseerd Concanavaline A, een α-mannose/α-glucose-
bindend lectine dat bindt aan N-glycanen. Voor het opstellen van de chromatogrammen werden de
eiwitconcentraties van de opgevangen fracties bepaald aan de hand van de absorbantie bij een
golflengte van 280 nm.
Kernwoorden
Glycoproteïnen - SDS-PAGE – IEF - SYPRO Ruby - Pro Q Emerald 300 - lectinen – Concanavaline A
Abstract
Glycoproteins are proteins with one or more sugar moieties bound to it. After separation and detection
of these glycoproteins, it is possible to determine the fraction of glycoproteins compared to the total
protein content in blood plasma. Samples porcine plasma, concentrate and powder were obtained
from Veos (Zwevezele) and samples of chicken, beef, pork and human plasma from Sigma-Aldrich
were ordered. The protein content was determined using the Biorad DC protein analysis. For the
separation and detection several techniques are available. For the analysis of the protein profiles was
decided to use SDS-PAGE and IEF. For the staining of the protein gels both colorimetric and
fluorescent stains were tested, including specific staining for the detection of the glycoproteins. The
glycoproteins were stained first. This was done by the PAS stain or by the Pro-Q Emerald fluorescent
staining. Afterwards, all proteins were stained by Coomassie brilliant blue R-250 or by the fluorescent
SYPRO Ruby staining. The results showed that at the specific stains several problems occurred.
Subsequently, an effort was made to separate the glycoproteins of the non-glycosylated proteins by
affinity chromatography. Therefore, a lectin column was prepared with immobilized Concanavalin A,
an α-mannose/α-glucose-binding lectin that binds to N-glycans. For the chromatograms the protein
concentrations of the collected fractions were determined based on the absorbance at a wavelength of
280 nm.
Keywords
Glycoproteins - SDS-PAGE - IEF - SYPRO Ruby - Pro Q Emerald 300 - lectins - Concanavalin A
5
Inhoudsopgave
Auteursrechtelijke bescherming .............................................................................................................. 2
Woord vooraf ........................................................................................................................................... 3
Samenvatting ........................................................................................................................................... 4
Abstract .................................................................................................................................................... 5
Inhoudsopgave ........................................................................................................................................ 5
Lijst met figuren ....................................................................................................................................... 7
Lijst met tabellen ...................................................................................................................................... 9
Lijst met gebruikte afkortingen............................................................................................................... 10
Inleiding ................................................................................................................................................. 12
1. Literatuurstudie .............................................................................................................................. 13
1.1 Post-translationele modificaties (PTM’s) en eiwitdiversiteit .................................................. 13
1.2 Glycoproteïnen ...................................................................................................................... 13
1.2.1 Soorten glycosylatie en mechanismen .......................................................................... 14
1.2.2 Glycoproteïnen in relatie tot diabetes, kanker en andere ziekten ................................. 18
1.3 Bloed ...................................................................................................................................... 19
1.3.1 Bloedcellen .................................................................................................................... 20
1.3.2 Plasma ........................................................................................................................... 21
1.3.3 Eiwitsamenstelling bloedplasma .................................................................................... 22
1.3.4 Staalname en bewaring ................................................................................................. 26
1.3.5 Anti-coagulantia ............................................................................................................. 26
1.4 Eigenschappen en toepassingen plasmapoeder afkomstig van varkensbloed .................... 27
1.5 SDS-PAGE ............................................................................................................................ 29
1.6 IEF ......................................................................................................................................... 30
1.7 2D elektroforese .................................................................................................................... 31
1.8 Kleuren van de gel ................................................................................................................. 31
1.9 Detectie en kleuring van alle proteïnen ................................................................................. 31
1.9.1 Colorimetrische kleuring: coomassie brilliant blauw (CBB) ........................................... 31
1.9.2 Fluorescente kleuring: SYPRO Ruby ............................................................................ 33
1.10 Specifieke detectie en kleuring van glycoproteïnen .............................................................. 34
6
1.10.1 Colorimetrische kleuring: Periodic acid-Schiff (PAS) .................................................... 34
1.10.2 Fluorescente kleuring: Pro-Q Emerald 300 ................................................................... 35
1.11 Affiniteitschromatografie ........................................................................................................ 36
2. Materiaal en methoden .................................................................................................................. 38
2.1 Staalname en –bewaring ....................................................................................................... 38
2.2 Bepaling eiwitgehalte ............................................................................................................. 38
2.2.1 BIO-RAD DC eiwitanalyse ............................................................................................. 38
2.2.2 Wet van Lambert-Beer................................................................................................... 40
2.3 Scheiding van de plasmaproteïnen ....................................................................................... 40
2.3.1 SDS-PAGE .................................................................................................................... 40
2.3.2 IEF ................................................................................................................................. 45
2.3.3 Lectinekolom ConA........................................................................................................ 47
2.4 Detectie glycoproteïnen ......................................................................................................... 49
2.4.1 Colorimetrische kleuring: PAS-methode........................................................................ 49
2.4.2 Fluorescente kleuring: Pro-Q Emerald 300 ................................................................... 50
2.5 Detectie proteïnen ................................................................................................................. 52
2.5.1 Colorimetrische kleuring: Coomassie Briljant Blauw ..................................................... 52
2.5.2 Fluorescente kleuring: Sypro Ruby ............................................................................... 53
3. Resultaten en discussie ................................................................................................................. 55
3.1 Bepaling eiwitgehalte ............................................................................................................. 55
3.1.1 Varkensplasma – stalen Veos ....................................................................................... 55
3.1.2 Plasmastalen Sigma-Aldrich .......................................................................................... 56
3.2 Vergelijking eiwitprofielen ...................................................................................................... 57
3.2.1 SDS-PAGE met coomassiekleuring .............................................................................. 57
3.2.2 SDS-PAGE met SYPRO-Ruby kleuring ........................................................................ 60
3.2.3 IEF ................................................................................................................................. 62
3.3 Lectinekolom ConA ............................................................................................................... 68
Conclusie ............................................................................................................................................... 73
Referenties ............................................................................................................................................ 75
7
Lijst met figuren
Figuur 1: Visualisatie van de impact van de verschillende oorzaken van toename in eiwitdiversiteit .. 13
Figuur 2: Vereenvoudigde voorstelling van de mechanismes van de verschillende soorten glycosylatie:
............................................................................................................................................................... 14
Figuur 3: Structuur en samenstelling van het precursorglycaan Glc3Man9GlcNAc2-PP-dolichol ........ 16
Figuur 4: Voorstelling van het mechanisme van N-glycosylatie; na de aanmaak van de
precursormolecule wordt dit getransloceerd naar het ER-lumen en kan dit aan het proteïne gekoppeld
worden ................................................................................................................................................... 16
Figuur 5: Maturatie van N-geglycosyleerde proteïnen in het Golgi-aparaat ......................................... 17
Figuur 6:Samenstelling bloed (Dean, 2005) .......................................................................................... 20
Figuur 7: Schematische weergave van het productieproces van plasmapoeder met de verschillende
processtappen, vertrekkende vanuit varkensbloed en afbeelding van het uiteindelijke plasmapoeder
(Veos) .................................................................................................................................................... 28
Figuur 8: Moleculaire structuren, formule en moleculair gewicht .......................................................... 32
Figuur 9: Het absorptiespectrum van Coomassie Brilliant Blauw ongebonden (rode lijn) en
eiwitgebonden (groene lijn). Na binding verschuift het absorptiemaximum van 465 nm naar 595 nm
(Bradford, 1976). ................................................................................................................................... 33
Figuur 10: Structuur van SYPRO Ruby kleuring; een ruthenium-bevattend organisch complex
(Demchenko, 2011). .............................................................................................................................. 33
Figuur 11: Excitatie- (stippellijn) en emissie- (volle lijn) spectra van SYPRO Ruby proteïne kleuring .. 34
Figuur 12: Reactiemechanisme PAS-kleuring (Wako Pure Chemical Industries, 2013). ..................... 35
Figuur 13: Excitatie- (A) en emissie- (B) spectra van Pro-Q Emerald 300 glycoproteïnekleuring (volle
lijnen) en SYPRO Ruby proteïne kleuring (stippellijnen) met aanduiding van de pieken. .................... 35
Figuur 14: Voorbeeld chromatogram (Blaber, 1998) ............................................................................. 36
Figuur 15: Structuur van het lectine Con-canavaline A (ConA) met een resolutie van 2,4 Å (Hardman &
Ainsworth, 1972) .................................................................................................................................... 37
Figuur 16: Voorbeeld BSA-standaardcurve via de BIO-RAD DC eiwitanalyse ..................................... 39
Figuur 17: Apparatuur voor SDS-PAGE; glasplaten, kammetjes, houders (A en B), elektroforesecel
met houder, hulpstukken voor laden van de stalen en rechts het elektroforeseapparaat (BIO-RAD) .. 41
Figuur 18: “Phastsystem Separation and control unit” (Pharmacia); toestel voor uitvoering van IEF .. 45
Figuur 19: Phastgel Staal applicator (GE lifesciences) voor laden van de stalen ................................. 45
Figuur 20: Overbrengen van stalen van de “sample well stamp” naar de staal applicator. .................. 46
Figuur 21: Samenvatting protocol PAS-kleuring (Lifetechnologies, bewerkt) ....................................... 50
Figuur 22: UV transiluminator met verschillende filters (BIO-RAD); toestel waarmee fluorescente
kleuringen op SDS-PAGE gels kunnen gevisualiseerd worden en vervolgens verwerkt met de
bijhorende software; Imagelab. ............................................................................................................. 52
8
Figuur 23: SDS-PAGE gel gekleurd met CBB; bovenaan de figuur zijn de laantjes genummerd
overeenkomend met tabel 11; links en rechts van de gel zijn de moleculaire gewichten aangeduid van
de geladen standaarden in laantje 1 en 10. .......................................................................................... 58
Figuur 24: Iklijn SDS-PAGE gel aan de hand van moleculaire ladders waarbij het verband is
weergegeven tussen de afgelegde afstand van de gescheiden eiwitten en de log van hun moleculaire
gewichten, met vermelding van de bekomen vergelijking en de waarde van R2. ................................. 59
Figuur 25: Bandenpatroon plasmapoeder Veos bekomen met SDS-PAGE, 1 mg/ml geladen en
gekleurd met CBB ................................................................................................................................. 60
Figuur 26: Resultaat SYPRO-Ruby kleuring op SDS-PAGE gel ........................................................... 61
Figuur 27: Vergelijking bandenpatroon plasmapoeder Veos op twee verschillende gels na SDS-PAGE;
links 1 mg/ml geladen en gekleurd met CBB; rechts 1000 x verdund en gekleurd met SYPRO-Ruby 62
Figuur 28: IEF-gels met pH 3-9, beiden gekleurd met CBB R-250. De rechtergel werd vooraf gekleurd
met PAS-kleuring. De volgorde en concentraties van stalen en standaarden zijn weer te vinden in
tabel 13 .................................................................................................................................................. 63
Figuur 29: Resultaat IEF met pH-gradiënt van pH 3 tot 9, gekleurd met CBB R-250, met links van de
figuur aanduiding van de pH-gradiënt en rechts de aanduiding van de standaarden met vermelding
van de bijhorende pI-waarden. De volgorde en concentratie van de geladen stalen en standaarden is
weergegeven in tabel 13. ...................................................................................................................... 64
Figuur 30: Resultaat IEF met pH-gradiënt van pH 5 tot 8, gekleurd met CBB R-250, met links van de
figuur aanduiding van de pH-gradiënt en rechts de aanduiding van de standaarden met vermelding
van de bijhorende pI-waarden. De volgorde en concentratie van de geladen stalen en standaarden is
weergegeven in tabel 14. ...................................................................................................................... 65
Figuur 31: SDS-PAGE gel gekleurd met Pro-Q Emerald 300 (links) en vervolgens met SYPRO Ruby
(rechts) Zie tabel 12 voor de volgorde en geladen concentraties van de stalen en standaarden. ....... 67
Figuur 32: SDS-PAGE gel gekleurd met Pro-Q Emerald 300 en sterk gecontamineerd na contact met
handschoenen. ...................................................................................................................................... 67
Figuur 33: Chromatogram van ConA-kolom na lading van 5 mg BSA en 5 mg ovalbumine. Per fractie
werd ongeveer 1 ml opgevangen. De eerste twee fracties zijn flow-through (FT); fractie 3 tot 13 zijn
het wassen (W) van de kolom en de overige fracties zijn de elutie (E). ............................................... 69
Figuur 34: SDS-PAGE gel gekleurd met CBB, ...................................................................................... 70
Figuur 35: Chromatogram van ConA-kolom na lading van 0,5 mg ovalbumine. Per fractie werd
ongeveer 1 ml opgevangen. De eerste vijf fracties zijn flow-through (FT); fractie 6 tot 16 zijn het
wassen (W) van de kolom en de overige fracties zijn de elutie (E)....................................................... 71
Figuur 36: Chromatogram van ConA-kolom na lading van 2 mg ovalbumine. Per fractie werd ongeveer
1 ml opgevangen. De eerste twee fracties zijn flow-through (FT); fractie 3 tot 13 zijn het wassen (W)
van de kolom en de overige fracties zijn de elutie (E). .......................................................................... 72
9
Lijst met tabellen
Tabel 1: Eigenschappen plasmaproteïnen varken (Lampreave & Pineiro, 1992; Uniprot & Protparam)
............................................................................................................................................................... 22
Tabel 2: Eigenschappen plasmaproteïnen mens (Lundblad, 2003; Uniprot & Protparam) .................. 23
Tabel 3: Karakteristieken plasmapoeder, bron: Veos ........................................................................... 28
Tabel 4: Keuze polymeer voor gelelektroforese naargelang de toepassing. ........................................ 29
Tabel 5: Relatie % AA tot grootte van te scheiden moleculen .............................................................. 29
Tabel 6: Samenstelling scheidings- en stapelgel voor SDS-PAGE, gel met 7,5 % AA en dikte 0,75 mm.
............................................................................................................................................................... 42
Tabel 7: Eiwitten aanwezig in de Candycane standaard met vermelding van de moleculaire gewichten
en de glycosylatie, waarbij “X” wijst op een geglycosyleerd eiwit ......................................................... 43
Tabel 8: Eiwitten aanwezig in LMW en HMW standaarden, met vermelding van MM.......................... 44
Tabel 9: Standaarden aanwezig in Broad Range pl 4.45-9.6 (BIO-RAD), met vermelding van de pI-
waarden ................................................................................................................................................. 45
Tabel 10: Condities van de verschillende stappen tijdens de IEF......................................................... 47
Tabel 11: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor SDS-PAGE ................................ 57
Tabel 12: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor SDS-PAGE ................................ 61
Tabel 13: Volgorde van de stalen en standaarden IEF-gel met vermelding van de concentratie. ....... 62
Tabel 14: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor IEF met vermelding van de
verdunning/concentratie ........................................................................................................................ 65
Tabel 15: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor SDS-PAGE ................................ 69
10
Lijst met gebruikte afkortingen
AA: Acrylamide
AAG: α1-zuur glycoproteïne
ABS: Absorbantie
APS: Ammonium persulfaat
Asn: Asparagine
AZ: Aminozuur
BSA: Bovine Serum Albumine
CAS: Chemical Abstracts Service
ConA: Concanavaline A
dH2O: gedestilleerd water
EDTA: Ethyleendiaminetetra-azijnzuur
ER: Endoplasmatisch reticulum
GDP: Guanosinedifosfaat
Glc: Glucose
GlcNAc: N-acetylglucosamine
GTF: Glycosyltransferase
HMWS: Hoog moleculair gewicht standaard
IE: Internationale eenheid
IEF: Iso-elektrische focusering
LMWS: Laag moleculair gewicht standaard
Man: Mannose
PAS: Periodic-Acid-Schiff reagent
PTM: Post-translationele modificatie
pI: Iso-elektrisch punt
11
RBC: Rode bloedcel
SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfaat – polyacrylamide gelelektroforese
Ser: Serine
TCA: Trichloorazijnzuur
TEMED: N,N,N’,N’-Tetramethylethyleendiamine
Thr: Threonine
UDP: Uridinedifosfaat
WBC: Witte bloedcel
WGA: Tarwekiem agglutinine
JAC: Jacaline
12
Inleiding
Het doel van deze thesis is om enkele beschikbare methodes voor scheiding en detectie van
glycoproteïnen uit te testen en te combineren, en dit toegepast op bloedplasma. Met behulp van de
meest geschikte methodes zou er vervolgens een methode op punt gesteld kunnen worden voor de
verhouding van het gehalte aan glycoproteïnen ten opzichte van het totaal proteïnegehalte te kunnen
bepalen.
Glycoproteïnen zijn eiwitten met één of meerdere suikergroepen aan gebonden. De glycosylatie is een
post-translationele modificatie (PTM) en vindt plaats in het endoplasmatisch reticulum (ER) en het
Golgi-apparaat, wat verklaart waarom deze modificatie enkel voorkomt bij eukaryoten, eubacteriën en
archeabacteriën.
Bloed is een complexe matrix die veel verschillende componenten bevat, wat bij analyses voor
problemen kan zorgen. Om de analyseresultaten zo min mogelijk te beïnvloeden dienen de
procedures voor staalname, behandeling en bewaring zo veel mogelijk gestandaardiseerd te zijn. Het
bloedplasma bestaat voornamelijk uit water, maar ook uit eiwitten, suikers, vetdeeltjes en andere
organische en anorganische stoffen. Plasma bevat ook nog fibrinogeen, een stollingseiwit. Om stolling
te vermijden worden hier dus vaak anti-coagulantia aan toegevoegd, welke kunnen interfereren met
analysetechnieken. Serum daarentegen bezit geen fibrinogeen meer aangezien dit wordt bekomen
door het bloed eerst te laten stollen alvorens de cellen worden afgescheiden met behulp van
centrifugatie.
Varkensplasma wordt verwerkt tot poeder en vindt in deze vorm verschillende toepassingen in de
voedingsindustrie. Het gehalte aan glycoproteïnen heeft mogelijks een invloed op bepaalde
toepassingen, maar om dit te achterhalen dient het plasma eerst getest te kunnen worden op het
gehalte aan glycoproteïnen. Dit laatste is dan ook het uiteindelijke doel van deze thesis.
Er werden stalen varkensplasma, -concentraat en –poeder gecollecteerd van Veos (Zwevezele),
daarnaast werd er ook varkens-, runds-, kippen- en humaan plasma besteld bij Sigma-Aldrich.
De eiwitprofielen van de verschillende plasmastalen werden geanalyseerd met SDS-PAGE en IEF,
waarbij deze gels gekleurd werden met colorimetrische of fluorescente kleuringen. Hierbij werden
eerst de glycoproteïnen specifiek gekleurd met de PAS-kleuring of de fluorescente Pro-Q Emerald
300-kleuring en vervolgens werden alle eiwitten gekleurd met coomassie briljant blauw R-250 of de
fluorescente SYPRO Ruby-kleuring.
13
1. Literatuurstudie
1.1 Post-translationele modificaties (PTM’s) en eiwitdiversiteit
Het humaan genoom bestaat uit 20 000 à 25 000 genen, het proteoom is nog veel groter, het bestaat
naar schatting uit meer dan 1 miljoen verschillende eiwitten. Dit grote verschil wijst er op dat genen
coderen voor meerdere eiwitten. Dit fenomeen wordt weergegeven in figuur 1.
Mechanismen zoals genomische recombinatie, alternatieve promotors en alternatieve splicing zorgen
voor verschillende mRNA-transcripten van een enkel gen (Ayoubi & Van De Ven, 1996). Vervolgens
zorgen ook post-translationele modificaties (PTM’s) voor een toename in functionele diversiteit van het
proteoom. Deze modificaties beïnvloeden vele aspecten van de celbiologie en pathogenese. Hierdoor
is het bestuderen van deze PTM’s dan ook cruciaal om inzicht te krijgen in de celbiologie en
behandeling en preventie van ziekten.
Figuur 1: Visualisatie van de impact van de verschillende oorzaken van toename in eiwitdiversiteit
Voorbeelden van post-translationele modificaties zijn glycosylatie (aanhechting van suikereenheid),
fosforylatie (aanhechting van een fosfaatgroep), ubiquitinatie (aanhechting van ubiquitine), nitrosylatie
(aanhechting van stikstofoxide), methylatie (aanhechting van methylgroep), acetylatie (aanhechting
van acetylgroep), lipidatie (aanhechting van vetzuur), en proteolyse (afbraak van eiwitten tot kleinere
peptide-eenheden). In dit eindwerk wordt dieper ingegaan op glycoproteïnen en de verschillende
types glycosylatie.
1.2 Glycoproteïnen
Glycoproteïnen zijn eiwitten waaraan één of meerdere suikergroepen gebonden zijn. Ongeveer de
helft van de eiwitten die tot expressie komen in de cel, zijn geglycosyleerd. De glycosylatie of
aanhechting van de suikereenheden aan de proteïnen is een post-translationele modificatie (PTM).
14
Dit proces vindt plaats in het endoplasmatisch reticulum (ER) en in het Golgi-apparaat. Glycosylatie
komt dus enkel voor bij eiwitten van eukaryoten, eubacteriën en archaebacteriën.
De glycosylatie van eiwitten heeft geen eenduidige functie maar kan verschillende redenen hebben.
Zo kan de aanhechting van suikers invloed hebben op de oplosbaarheid, op de structuur van
allergene domeinen, bescherming bieden tegen proteolyse, invloed hebben op de positie ten opzichte
van het membraan… (Wormald et al., 2002).
Er zijn verschillende methodes voor de scheiding en detectie van glycoproteïnen voorhanden. De
gebruikte methoden worden besproken in deel 2 van dit eindwerk.
1.2.1 Soorten glycosylatie en mechanismen
Glycoproteïnen verschillen op basis van glycosidische binding, lengte, samenstelling, structuur en
aantal vertakkingen van de suikerketen. Glycopeptidische bindingen worden vervolgens ingedeeld op
basis van het type suiker-peptidebinding, namelijk N-gebonden glycosylatie (de suikergroepen worden
aan de aminogroep van asparagine gebonden), O-gebonden glycosylatie (monosachariden worden
één voor één gebonden aan de hydroxylgroep van serine of threonine), glypiatie (glycaanketen
verbindt een fosfolipide en een proteïne), C-gebonden glycosylatie (mannose bindt aan de
tryptofaanring) en fosfoglycosylatie (glycaan bindt aan serine via een fosfodiesterbinding). Deze
indeling wordt voorgesteld in figuur 2. De twee belangrijkste soorten peptideglycosylatie zijn N-
glycosylatie, waarbij het oligosaccharide wordt gekoppeld aan asparagine, en O-glycosylatie, waarbij
het oligosacharide wordt gekoppeld aan serine of threonine (Dell & Morris, 2001; Thermo Fisher
Scientific, 2015).
Figuur 2: Vereenvoudigde voorstelling van de mechanismes van de verschillende soorten glycosylatie: N-glycosylatie, O-glycosylatie, glypiatie, C-glycosylatie en fosfoglycosylatie
15
In tegenstelling tot de eiwitsynthese, welke genetisch vastgelegd is, wordt de glycosylatie van deze
eiwitten enzymatisch geregeld (Rudd & Dwek, 1997). Vanwege het groot aantal enzymen dat
betrokken is bij deze reacties, wordt glycosylatie gezien als één van de meest complexe post-
translationele modificaties.
Glycosylatie vindt plaats in het ER en Golgi-apparaat en bestaat uit een complexe reeks van reacties
die gekatalyseerd worden door membraangebonden glycosyltransferases en glycosidases. Dit omvat
de aaneenhechting van monosachariden, transport van suikereenheden van de ene molecule naar de
andere en verwijdering van suikereenheden van de glycaanstructuur. Deze processen gebeuren
stapsgewijs en in een welbepaalde volgorde. Glycosyltransferases zijn enzymen die zorgen voor de
overdracht van de suikereenheden van de donormoleculen naar de groeiende suikerketens aan de
proteïnen. De hydrolyse van de glycosidische bindingen voor de afsplitsing van suikereenheden wordt
gekatalyseerd door glycosidasen die specifiek bepaalde suikereenheden verwijderen. Veel van deze
enzymen zijn zeer gevoelig aan andere activiteiten in de cel waarin het glycoproteïne tot expressie
komt. Hierdoor is de suikerketen die aan het proteïne gehecht wordt afhankelijk van het celtype en de
fysiologische toestand van de betreffende cel, en dus gelinkt aan de ontwikkeling van de cel en
ziekteregulatie (Dell & Morris, 2001).
Proteïnen zijn vaak geglycosyleerd op meerdere plaatsen, met verschillende soorten glycosidische
bindingen. Deze glycosylatie hangt af van volgende factoren: beschikbaarheid van enzymen,
aminozuursequentie en eiwitopvouwing.
De voornaamste glycosidische bindingen (N- en O-glycosylatie) worden hieronder kort toegelicht.
1.2.1.1 N-Glycosylatie
Dit type glycosylatie is een co-translationele modificatie, waarbij de suikergroepen aan de aminogroep
van asparagine (Asn) van het proteïne worden gebonden tijdens de translatie en het transport naar
het ER. Een potentiële positie voor N-glycosylatie bestaat uit Asn – X – Ser/Thr, waarbij X gelijk mag
zijn aan elk aminozuur behalve proline (Wormald et al., 2009).
Oligosachariden gebonden via een N-glycosylate zijn afgeleid van een precursor molecule bestaande
uit 14 suikereenheden, namelijk N-acetylglucosamine (GlcNAc), mannose (Man) en glucose (Glc).
Deze suikers worden gebonden aan dolicholpyrofosfaat, gekoppeld aan het ER-membraan (Burda &
Aebi, 1999; Dean, 1999). De structuur van deze precursormolecule is afgebeeld in figuur 3.
16
Figuur 3: Structuur en samenstelling van het precursorglycaan Glc3Man9GlcNAc2-PP-dolichol
De eerste 7 suikereenheden zijn afkomstig van suikernucleotiden (UDP- en GDP-suikers) in het
cytoplasma en worden gebonden aan dolichol via een pyrofosfaatbinding (-PP-). Na vorming van
Man5GlcNAc2-PP-dolichol, wordt dit complex getransloceerd naar het ER-lumen. Hieraan worden
vervolgens de overige 7 suikereenheden afkomstig van Man- en Glc-P-dolichol aangehecht met als
resultaat het Gcl3Man9GlcNAc2-PP-dolichol precursor glycaan. Dit proces wordt weergegeven in figuur
4.
Figuur 4: Voorstelling van het mechanisme van N-glycosylatie; na de aanmaak van de precursormolecule wordt dit getransloceerd naar het ER-lumen en kan dit aan het proteïne gekoppeld worden
Aanmaak precursorglycaan Aanhechting precursorglycaan
17
Alle N-gelinkte oligosachariden in zoogdieren hebben een gemeenschappelijke trimannosyl-
chitobiosekern, afkomstig van de biosynthetische precursor Glc3Man9GlcNAc2. Deze wordt
cotranslationeel gebonden aan polypeptiden in het ER. De drie glucosylresiduen (Glc) worden nadien
verwijderd door glucosidasen.
Tot hier gebeurt de glycosylatie identiek voor elk proteïne, de overige Man9GlcNAc2 wordt verder
verwerkt in het Golgi apparaat (Figuur 5). Dit proces bestaat uit stapsgewijze trimming door
exoglycosidasen en toevoeging van nieuwe suikereenheden door glycosyltransferases (Dell & Morris,
2001).
Figuur 5: Maturatie van N-geglycosyleerde proteïnen in het Golgi-aparaat
Na maturatie in het Golgi-apparaat kunnen de N-geglycosyleerde eiwitten worden ingedeeld in drie
types: hoog mannose, complex en hybride (Dell & Morris, 2001). Het hoog mannose type bevat vooral
mannose, het complex type bevat verschillende soorten suikereenheden en het hybride type bevat
zowel veel mannose als andere suikers en is dus een combinatie van de eerste twee types N-
glycosylatie.
18
1.2.1.2 O-Glycosylatie
Bij deze post-translationele modificatie worden monosachariden één voor één gebonden aan de
hydroxylgroep van serine of threonine. Dit gebeurt in het Golgi-apparaat. O-glycosylering kan ook
optreden op hydroxylysine en hydroxyproline, geoxideerde vormen van respectievelijk lysine en
proline, die worden aangetroffen in collageen (Gemmill & Trimble, 1999). O-gekoppelde glycanen
hebben gewoonlijk een veel eenvoudigere oligosaccharide structuur dan N-gekoppelde glycanen. Er
kan dus algemeen gesteld worden dat het mechanisme van O-glycosylatie minder complex is dan de
N-glycosylatie.
Wanneer eiwitten reeds N-geglycosyleerd zijn, sluit dit niet uit dat deze achteraf ook nog O-
glycosylaties ondergaan. Het is namelijk zeer gebruikelijk dat O-glycosylatie optreedt bij proteïnen die
eerder N-geglycosyleerd werden in het ER.
Eiwitten gemodificeerd in het Golgi-apparaat zijn meestal O-geglycosyleerd door N-
acetylgalactosamine (GalNAc) transferase, welke een enkele GalNAc residu overdraagt aan de β-OH
groep van serine of threonine. Afhankelijk van de cel en species worden sommige eiwitten O-
geglycosyleerd met GlcNAc, fucose, xylose, galactose en/of mannose (Spiro, 2002; Dell & Morris,
2001). Zoals bij N-glycosylering, worden suikernucleotiden gebruikt als donors van de
monosacchariden voor O-glycosylering. Na het eerste suiker worden achtereenvolgens een zeer
variabel aantal suikers (van slechts enkele tot meer dan 10) toegevoegd aan de groeiende
glycanketen. O-glycosylering kan ook voorkomen in het cytosol en de celkern om genexpressie en
signaaltransductie te reguleren via andere glycosyltransferasen (GTF’s) (Lamarre-Vincent & Hsieh-
Wilson, 2003).
O-glycoproteïnen spelen een sleutelrol in celbiologie (Gemmill & Trimble, 1999). Dit type glycosylering
is onder andere essentieel voor de biosynthese van mucinen, een familie van zware O-
geglycosyleerde, hoogmoleculaire eiwitten die slijmafscheidingen vormen, bv. in speeksel. O-
glycosylering kan ook voorkomen in het cytosol en de nucleus, voor regulatie van de genexpressie of
singaaltransductie (Lamarre-Vincent & Hsieh-Wilson, 2003). Daarnaast zijn ook antilichamen vaak
sterk O-geglycosyleerd.
1.2.2 Glycoproteïnen in relatie tot diabetes, kanker en andere ziekten
Algemeen
Vele ziekten blijken een afname te veroorzaken van de albuminebinding met geneesmiddelen, wat
een invloed heeft op de werking van de medicatie. Dit kan het gevolg zijn van hypoalbuminemie (een
verlaagd gehalte aan eiwitten in het bloed) of wijziging van de albuminestructuur (door bv.
glycosylatie). Anderzijds zijn er ook ziekten waarbij de binding van albumine met geneesmiddelen
toeneemt door een verhoogde concentratie aan AAG (α1-zuur glycoproteïne), zoals eerder vermeld bij
kanker, of aan lipoproteïnen (Zini et al., 1990). Er werd ook aangetoond dat het gehalte aan AAG in
19
serum van 17 patiënten met levercirrose was gedaald tot gemiddeld 73,4 % ten opzichte van 15
gezonde vrijwilligers als controle (Fraeyman et al., 1988).
Diabetes
Het gehalte aan geglycosyleerde plasmaproteïnen is hoger bij diabetespatiënten dan bij personen die
niet lijden aan deze aandoening. De glycosylatie van serum albumine leidt tot een
conformatieverandering waardoor de ligandbindende eigenschappen worden beïnvloed vanwege
veranderingen ter hoogte van de bindingsplaats van de werkzame stof op het albumine. Hierdoor
neemt de bindingsaffiniteit van albumine met medicatie en polyfenolen af, waardoor de opname van
de werkzame stof daalt en er dus een grotere hoeveelheid zou toegediend moeten worden (Xu et al.,
2014).
Kanker
Het is bewezen dat glycosylatie betrokken is bij pathways geassocieerd met de transformatie van een
normale cel tot een kankercel. Glycosylatie is gerelateerd met kanker aangezien glycosylatie ook een
invloed heeft op interacties tussen tumorantigenen en receptoren, zoals vb. CA125 en galactine bij
eierstokkanker (Yang & Hancock, 2004). Er werd ook aangetoond dat het gehalte aan AAG in serum
van 14 patiënten met longkanker was toegenomen tot gemiddeld 180,7 % ten opzichte van 15
gezonde vrijwilligers als controle (Fraeyman et al., 1988).
1.3 Bloed
Bloed is een vloeibaar weefsel en bestaat uit cellen opgelost in een vloeistof. Deze vloeistof wordt
plasma genoemd. Een volwassen persoon bezit gemiddeld meer dan 5 liter bloed.
Bloed heeft tal van functies die zorgen voor het optimaal functioneren van het lichaam. Dit vloeibaar
weefsel transporteert zuurstof en nutriënten doorheen het lichaam naar de cellen en zorgt voor de
afvoer van hun afvalstoffen. Ook de immuuncellen voor bestrijding van infecties bevinden zich in deze
vloeistof.
Wanneer een proefbuis gevuld met bloed wordt gecentrifugeerd, ontstaan er drie te onderscheiden
lagen. Deze scheiding is weergegeven in figuur 6. De bovenste laag bestaat uit plasma, de middelste
laag uit witte bloedcellen en bloedplaatjes, de onderste laag bestaat uit rode bloedcellen (Dean, 2005).
De eigenschappen en functies van de verscheidene bloedcellen en het plasma worden besproken in
hoofdstuk 1.3.1 en 1.3.2.
20
Figuur 6:Samenstelling bloed (Dean, 2005)
De bloedsomloop en –samenstelling zijn dynamische systemen die zich aanpassen aan de noden van
het lichaam. Zo zal het hart sneller pompen tijdens fysieke inspanningen om zo meer zuurstof te
leveren aan de spieren en zullen er bij een infectie meer immuuncellen worden getransporteerd naar
de plaats van de infectie (Dean, 2005).
Hierdoor kunnen verschillende bloedwaarden (vb. hematocrietwaarde, 1.3.1) dienen als biomerker
aangezien ze sterk gerelateerd zijn aan verscheidene aandoeningen.
1.3.1 Bloedcellen
Er zijn drie typen bloedcellen aanwezig in bloed:
Rode bloedcellen (RBC) of erytrocyten
Deze cellen hebben als voornaamste functie zuurstoftransport tussen de longen en de andere
weefsels in het lichaam. Hemoglobine, een ijzerbevattend en zuurstofbindend eiwit speelt hier een
grote rol in. Dit eiwit zorgt ook voor de rode kleur van bloed. De ABO-bloedgroep wordt bepaald door
de antigenen die zich bevinden op het membraan van de RBC’s.
De RBC is het meest voorkomende celtype in bloed. Een kubieke millimeter bloed bevat gemiddeld 4
tot 6 miljoen RBC´s. Deze cellen hebben een diameter van amper 6 µm waardoor ze zelf in de
kleinste bloedvaatjes passen. Na ongeveer 120 dagen te circuleren in het lichaam, of na beschadiging,
worden ze afgebroken in de milt of lever door macrofagen.
In tegenstelling tot RBC´s van andere gewervelden (vissen, vogels, reptielen en amfibieën), bevatten
de RBC´s van zoogdieren geen celkern. Hierdoor beschikt de cel over meer ruimte voor hemoglobine
(zuurstofbindend eiwit) zodat er meer transport van zuurstof mogelijk is.
De hematocriet is het gehalte aan rode bloedcellen in het totale bloedvolume en wordt uitgedrukt in
procent. Bloedarmoede of anemie is een aandoening waarbij de patiënt een tekort heeft aan
hemoglobine. Symptomen zijn vermoeidheid en een bleke huid (Dean, 2005).
Plasma
Witte bloedcellen en bloedplaatjes
Rode bloedcellen
60 %
40 %
21
Witte bloedcellen (WBC) of leukocyten
Deze cellen spelen een grote rol in het immuunsysteem. Leukocyten spelen zowel een rol in de
aangeboren als in de adaptieve immuunrespons.
In vergelijking met rode bloedcellen zijn de witte bloedcellen veel groter, maar zijn ze in een kleinere
hoeveelheid aanwezig. Er zijn verschillende soorten WBC´s met verschillende groottes en vormen.
Deze worden verdeeld volgens de aan- of afwezigheid van granulen. Elk type leukocyt heeft een
specifieke functie. Er bestaan drie soorten granulebevattende leukocyten (ook wel granulocyten
genoemd), namelijk basofiele, neutrofiele en oesinofiele granulocyten. De agranulocyten bevatten
geen granulen en worden onderverdeeld in lymfocyten, monocyten en macrofagen.
Het gehalte aan witte bloedcellen neemt toe bij infecties en tumoren. Het type WBC geeft meer
informatie over de infectie. Zo zal het gehalte aan neutrofielen stijgen in het beginstadium van de
infectie, terwijl er in het verloop van de infectie meer lymfocyten zullen aangemaakt worden.
Worminfecties hebben dan weer een toename in oesinofielen als gevolg, terwijl allergische reacties
een toename van de basofielen veroorzaken (Dean, 2005).
Bloedplaatjes of trombocyten
Deze cellen helpen bij de bloedstolling door vorming van een zogenaamde bloedprop. Hierdoor wordt
het bloedverlies door een beschadigd bloedvat beperkt.
Bloedplaatjes zijn celfragmenten met een onregelmatige vorm die circuleren in het bloed tot ze ofwel
worden geactiveerd voor het vormen van een bloedprop of verwijderd door de milt. Een kubieke
millimeter bloed bevat gemiddeld tussen de 150.000 en 400.000 bloedplaatjes. Als het aantal
beneden dit bereik ligt, neemt het risico op ongecontroleerde bloedingen toe, deze aandoening wordt
trombocytopenie genoemd. Omgekeerd is trombocytemie een hoog gehalte bloedplaatjes, wat een
verhoogd risico geeft voor het vormen van bloedklonters. Deze kunnen essentiële organen, zoals het
hart en de hersenen, ontnemen van hun bloedtoevoer, met hartaanvallen en beroertes, respectievelijk
als gevolg (Dean, 2005).
1.3.2 Plasma
Plasma is de vloeibare fase van bloed en bestaat hoofdzakelijk uit water, maar bevat ook eiwitten (vb.
albumine, stollingsfactoren, antilichamen, enzymen…), suikers (glucose), vetdeeltjes en andere
organische en anorganische stoffen. Ongeveer 55 à 60 % van het bloedvolume bestaat uit plasma.
Plasma wordt bekomen uit bloed door de bloedcellen af te scheiden met behulp van centrifugatie. Om
stolling te vermijden kan een anticoagulant (antistollingsmiddel) toegevoegd worden meteen na de
staalname. In 1.3.4 worden de voornaamste anticoagulanten besproken.
Serum wordt bekomen door het bloed te laten stollen alvorens te centrifugeren. Aangezien het
fibrinogeen zich in de gestolde fase bevindt is het serum zelf vrij van dit stollingseiwit. In plasma
daarentegen is er wel nog fibrinogeen aanwezig (Lundblad, 2003).
22
Fibrinogeen, ook wel stollingsfactor I genoemd, zorgt voor de bloedstolling. Dit eiwit wordt
aangemaakt in de lever en wordt bij een bloeding door het enzym trombine omgezet in fibrine.
Voor bepaalde biochemische analysetechnieken wordt de voorkeur gegeven aan serum aangezien
hier geen stollingsproducten aan zijn toegevoegd, welke de resultaten zouden kunnen beïnvloeden.
Plasma heeft dan weer het voordeel dat dit stabieler blijkt.
Er werd aangetoond dat eiwitprofielen van plasma en serum sterk verschillend zijn (Hsieh et al., 2006).
1.3.3 Eiwitsamenstelling bloedplasma
In onderstaande tabel zijn de voornaamste plasma-eiwitten bij varkens weergegeven met vermelding
van enkele belangrijke parameters. Deze eiwitsamenstelling varieert in functie van de ouderdom, en
aangezien biggen geslacht worden wanneer ze ongeveer 6 maand oud zijn, werd er gekeken naar de
samenstelling op deze leeftijd.
Tabel 1: Eigenschappen plasmaproteïnen varken (Lampreave & Pineiro, 1992; Uniprot & Protparam)
Eiwit Accession
number
(AC)
Sequence
identifier
(ID)
pI MM
(g/mol)
MM
(kDa)
Aantal
amino
-zuren
% in
plasma
GP?
Type
glyco-
sylatie
Serum albumine P08835 ALBU_PIG 5,84 66797,7 66,8 583 40 /
Albumine 1 5,52 22363,4 22,4
Albumine 2 6,12 22116,3 22,1
Albumine 3 7,07 22372,9 22,4
Lage affiniteit
immunoglobuline
gamma Fc regio
receptor III
(=IgG)
Q28942
FCGR3_PIG
9,01 27040,7 27,0 238 26 64: N
134:N
162: N
181: N
Serotransferrine P09571 TRFE_PIG 6,93 76967,9 77,0 696 4 25: N
497: N
Alfa-2-HS-
glycoproteïne
P29700
FETUA_PIG 5,40 36688,5 36,7 347 1,3 96: N
153: N
23
(= fetuïne A) 173: N
Alfa-1-antitrypsine P50447 A1AT_PIG 5,54 44792,1 44,8 397 0,25
73: N
110: N
Wanneer er gekeken wordt naar de eiwitsamenstelling in humaan plasma, zijn hier veel gelijkenissen.
In onderstaande tabel worden de voornaamste plasma-eiwitten bij de mens weergegeven, met
vermelding van enkele eigenschappen, analoog aan bovenstaande tabel.
Tabel 2: Eigenschappen plasmaproteïnen mens (Lundblad, 2003; Uniprot & Protparam)
Eiwit Accession
number
(AC)
Sequence
identifier (ID)
pI MM
(g/mol)
MM
(kDa)
Aantal
amino
-zuren
Conc.
in pla-
sma
(mg/ml)
GP?
Type
glyco-
sylatie
Serum albumine P02768 ALBU_HUMAN 5,67 66472,2 66,5 585 50
Albumine 1 5,69 22269,4 22,3 192
Albumine 2 5,35 21791,8 21,8 193
Albumine 3 7,59 22507,0 22,5 198
Immunoglobuline G 15
Fibrinogeen 3
Alfa-keten P02671 FIBA_HUMAN 5,79 91358,8 91,4 831
Beta-keten P02675 FIBB_HUMAN 7,95 50762,9 50,8 447
Gamma-keten P02679 FIBG_HUMAN 5,24 48483,0 48,5 427
Serotransferrine P02787 TRFE_HUMAN 6,70 75195,4 75,2 679 51:O
432:N
491:N
630:N
Haptoglobine P00738 HPT_HUMAN 6,13 43349,0 43,3 388 2,0 184:N
24
207:N
211:N
241:N
Alfa-keten 5,57 15945,7 15,9 142
Beta-keten 6,32 27265,0 27,3 245
Alfa-2-HS-
glycoproteïne
(= fetuïne A)
P02765 FETUA_HUMA
N
156:N
176:N
256:O
270:O
339:O
346:O
Keten A 4,53 30221,9 30,2 282
Keten B 10,8
6
2740,2 2,7 27
Immunoglobuline A 2,6
Alfa-1-antitrypsine P01009 A1AT_HUMAN 5,37 44324,4 44,3 394 2,7 70:N
107:N
271:N
Alfa-2-
macroglobuline
P01023 A2MG_HUMA
N
5,98 160809,
8
160,8 1451 2,7 55:N
70:N
247:N
396:N
410:N
869:N
991:N
1424:
N
25
Zoals eerder vermeld werd kunnen ook de plasma-eiwitten, net als de bloedcellen fungeren als
biomerkers. Niet enkel het gehalte aan een bepaald eiwit, maar ook de PTM’s dat dit eiwit heeft
ondergaan zoals glycosylatie, kan wijzen op een aandoening.
De voornaamste eiwitten worden hieronder algemeen besproken.
Serum albumine
Het hoofdeiwit van bloedplasma is serum albumine. Dit eiwit heeft een grote bindingscapaciteit voor
water, Ca2+
, Na+, K
+, vetzuren, hormonen, bilirubine (afbraakproduct van hemoglobine) en medicatie.
De voornaamste functie van albumine is de regulatie van de osmotische druk van het bloed. Albumine
zorgt ook voor het transport van zink en bindt ongeveer 80 % van het zink aanwezig in plasma
(Uniprot).
Transferrine
Transferrinen zijn ijzerbindende transporteiwitten die twee Fe3+
ionen kunnen binden in combinatie
met de binding van een anion, meestal bicarbonaat. Dit eiwit is verantwoordelijk voor het transport van
ijzer van absorptielocaties en degradatie van het ijzer naar plaatsen waar dit wordt opgeslagen en/of
gebruikt. Serumtransferrine kan ook een rol spelen bij het stimuleren van celproliferatie (Uniprot).
α2-HS-glycoproteïne
Dit eiwit bevordert endocytose, bezit opsonische eigenschappen en beïnvloedt de minerale fase van
het bot. Dit glycoproteïne toont affiniteit voor calcium en barium-ionen. (Uniprot)
α1-antitrypsine
Dit eiwit is een inhibitor van serine proteasen. α1-antitrypsine bindt hoofdzakelijk aan elastase, maar
heeft ook een matige affiniteit voor plasmine en trombine (Uniprot).
Fibrinogeen
Fibrinogeen (stollingsfactor I) is een eiwit dat verantwoordelijk is voor de bloedstolling. Dit eiwit wordt
gevormd uit drie monomeren, namelijk fibrinogeen α, β en γ. Deze polymerisatie gebeurt met behulp
van thrombine. Het resulataat is een onoplosbare fibrinematrix. Dit fibrine heeft een belangrijke
functies bij de hemostase en wondheling. Fibrinogeen draagt bijvoorbeeld bij tot aggregatie van de
bloedplaatjes. Tenslotte is maternaal fibrinogeen essentieel voor een succesvolle zwangerschap
(Uniprot).
α1-zuur glycoproteïne (AAG)
AAG functioneert als transporteiwit in de bloedstroom. Dit door binding met verschillende liganden,
ook synthetische drugs en zo hun distributie en beschikbaarheid in het lichaam beïnvloedt. Dit eiwit
blijkt ook te functioneren bij het moduleren van de activiteit van het immuunsysteem gedurende de
acute-fase reactie (Uniprot).
26
1.3.4 Staalname en bewaring
Er werd aangetoond dat de procedures voor de monstername de grootste invloed hebben op de
profilering van het proteoom, terwijl procedures voor de staalbehandeling en de bewaarcondities een
relatief kleinere invloed hebben (Hsieh et al., 2006; Luque-Garcia & Neubert, 2007).
Tuck M. et al. (2009) vermelden volgende factoren die een invloed kunnen hebben op resultaten van
analysen op plasma en serum: (1) het type additief aanwezig in de collectietubes; (2) tijd en
temperatuur bij staalname ; (3) hemolyse van het staal; (4) staalbewaring ; en (5) het aantal vries-dooi
cycli. Deze factoren hebben namelijk een invloed op de stabiliteit van eiwitten en andere stoffen
aanwezig in de serum- en plasmastalen.
Eiwitprofielen van plasmastalen veranderen naargelang de tijd tussen staalname en de scheiding van
het plasma en de bloedcellen varieert. Bij serumstalen werden er veranderingen in eiwitprofielen
waargenomen naargelang de stollingstijd varieert (Hsieh et al., 2006).Ondanks dat serum voor vele
analysen de voorkeur geniet omdat bij plasma de anti-coagulantia de resultaten zouden kunnen
beïnvloeden, blijkt plasma stabieler te zijn dan serum. De eiwitprofielen van plasma en serum blijken
zeer verschillend te zijn (Hsieh et al., 2006; Banks et al., 2005).
Voor langdurige bewaring van zowel plasma als serum, werden er geen grote verschillen
waargenomen bij -20 en -80°C (Rai et al., 2005; West-Nielsen et al., 2005). Herhaaldelijk dooien en
ontdooien heeft wel een verandering van de samenstelling van het serum/plasma als gevolg. Dit is
hoofdzakelijk te wijten aan aggregeren, neerslaan en de vasthechting aan oppervlakken van de
eiwitten (Villanueva et al., 2005; Baumann et al., 2005).
1.3.5 Anti-coagulantia
Anti-coagulatia of anti-stollingsmiddelen zijn additieven die de stolling van het bloed of plasma
inhiberen. Zoals eerder werd vermeld, worden er aan plasma antistollingsmiddelen toegevoegd. Dit
gebeurt meestal meteen na de staalname aan het gecollecteerde bloed, voor het centrifugeren. Vaak
zijn de anti-coagulantia reeds aanwezig in de collectietubes. Er dient rekening mee geworden te
houden dat wanneer deze in vloeibare vorm aanwezig zijn in de collectietubes, ze de
plasmaconcentratie zullen verlagen.
De werking van de anti-coagulantia is gebaseerd op het binden van calciumionen (EDTA en citraat) of
op de inhibitie van de activiteit van thrombine (heparinaten en hirudine) (WHO, 2002).
De meest gebruikte antistollingsmiddelen worden hieronder kort toegelicht.
Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)
Zouten van ethyleendiaminetetra-azijnzuur, namelijk dipotassium- (K2), trikalium- (K3) en dinatrium-
(Na2) zouten worden gebruikt in concentraties van 1,2 tot 2,0 mg/ml bloed (4,1-6,8 mmol/l bloed),
gebaseerd op watervrij EDTA (WHO, 2002).
27
Citraat
Trinatriumcitraat met 0,100-0,136 mol/l citroenzuur of gebufferd citraat met pH 5,5-5,6 (84 mmol/l
trinatriumcitraat met 21 mmol/l citroenzuur). Voor coagulatietesten wordt een mengsel van 1 deel
citraat met 9 delen bloed aanbevolen, voor bepaling van de bezinkingssnelheid van het bloed is dit 1
deel citraat met 4 delen bloed (WHO, 2002).
Heparinaten
12 tot 30 IE/ml ongefractioneerd natrium-, lithium- of ammoniumzout van heparine met een moleculair
gewicht van 3-30 kD wordt aanbevolen voor het verkrijgen van gestandaardiseerd gehepariniseerd
plasma. Calcium-getitreerd heparine in een concentratie van 40 tot 60 IE/ml bloed (droog heparinisaat)
en 8-12 IE/ml bloed (vloeibaar heparinisaat) wordt aanbevolen voor het bepalen van geïoniseerd
calcium (WHO, 2002).
Hirudine
Hirudine is een antitrombine dat gewonnen wordt uit bloedzuigers of bereid wordt met behulp van
genetische manipulatie. Hirudine inhibeert trombine door vorming van een 1:1 hirudine-trombine
complex. Hirudine wordt toegepast in een concentratie van 10 mg/l (WHO, 2002).
1.4 Eigenschappen en toepassingen plasmapoeder afkomstig van
varkensbloed
Varkensbloed is een reststroom van het slachtingproces, en kan gevaloriseerd worden door dit te
verwerken tot plasmapoeder. In deze vorm vindt het plasma verscheidene toepassingen in de
vleesverwerkende industrie (gekookte vleeswaren en visproducten).
Het albumine aanwezig in plasma zal namelijk een driedimensionaal netwerk vormen bij een
temperatuur boven 65 °C. Dankzij de hoge waterbindende capaciteit van de plasma-eiwitten is dit
product bovendien goed oplosbaar in pekel, waardoor het bijvoorbeeld geïnjecteerd kan worden in
gekookte ham. Andere vleeswaren waaraan dit product kan worden toegevoegd zijn gekookte worst,
samengestelde ham, gefermenteerde worst, leverpastei, paté, bloedworst en vleeswaren in blik.
Vanwege de sterk emulgerende en gelvormende eigenschappen welke zorgen voor stabilisatie van
water en vet wordt de samenhang van deze verwerkte vleesproducten verhoogd waardoor deze
vleeswaren snijdbaarder zijn en een stevigere beet (bijvoorbeeld bij ‘knack’-worsten) wordt bekomen.
Dankzij de stijging van het eiwitgehalte, met een groot gehalte aan essentiële aminozuren, wordt ook
de voedingswaarde verbeterd. De oorspronkelijke reststroom werd dus gevaloriseerd waardoor het
zelfs een meerwaarde kan zijn voor de vleesindustrie. Plasmapoeder kan ook worden toegevoegd aan
diervoeder voor huisdieren, veevoeder en visvoer (Actipro).
Behalve plasmapoeder zijn er ook andere producten verkrijgbaar die afkomstig zijn van varkensbloed.
Zo worden bijvoorbeeld rode bloedcellen vanwege hun hoog gehalte aan hemoglobine, een natuurlijke
rode kleurstof, opgezuiverd om toe te voegen aan vleesproducten. Hierdoor kan bij gebruik van PSE-
vlees. in bv. worst of paté toch een mooie vleeskleur bekomen worden. PSE staat voor pale (bleek),
28
soft (zacht) en exudative (vochtafgevend) en komt voor bij vlees met een lage pH, wat wordt
veroorzaakt door stress voor het slachtproces. Ook bij bloedworsten kan hemoglobine of rode
bloedcellen gebruikt worden als alternatief voor vers bloed. Aangezien het om natuurlijke producten
gaat, dient er geen E-nummer vermeld te worden op de verpakking bij toevoeging van deze
supplementen (Vepro). De productfiche van het plasmapoeder is terug te vinden in bijlage.
De eigenschappen van het gebruikte plasmapoeder zijn opgesomd in tabel 3.
Tabel 3: Karakteristieken plasmapoeder, bron: Veos
Bij de productie van plasmapoeder wordt vertrokken van varkensbloed, dit wordt door middel van
centrifugatie gesplitst in plasma en bloedcellen. Er werden geen anti-stollingsmiddelen of andere
additieven toegevoegd. Vervolgens wordt het plasma verder verwerkt tot poeder. Dit
verwerkingsproces is schematisch weergegeven in onderstaande figuur. Naargelang het proces
vordert, stijgt het gehalte aan drogestof, en dus ook het eiwitgehalte.
Figuur 7: Schematische weergave van het productieproces van plasmapoeder met de verschillende processtappen, vertrekkende vanuit varkensbloed en afbeelding van het uiteindelijke plasmapoeder
(Veos)
Varkensbloed
Plasma
Concentraat
Poeder
Producteigenschappen
Eiwitgehalte; Kjeldahl-N-gehalte x 5,7 (%) 69
Vochtgehalte (%) 7
pH 10 %- oplossing bij 20 °C 9
Oplosbaarheid (%) 95
Gelsterkte (g/cm2) 250
Bacteriologie
Totaal aeroob kiemgetal (/g) < 100.000
E. coli (/10g) afwezig
Salmonella (/25g) afwezig
Sproeidrogen
n
Indampen
Centrifugatie
Bloedcellen
29
1.5 SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfaat - polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) is een scheidingsmethode
waarbij de eiwitten migreren op basis van hun moleculair gewicht.
Scheiding van moleculen met behulp van gel elektroforese is gebaseerd op het verschil in snelheid
van migratie van de moleculen door de gelmatrix dankzij een aangelegd elektrisch veld. Deze
migratiesnelheid is afhankelijk van de grootte, vorm en lading van de moleculen, de sterkte van het
elektrisch veld en de samenstelling en concentratie van de gelmatrix. Onderstaande tabel geeft een
beeld van de mogelijke matrices om een gel te vormen, de keuze wordt bepaald door de aard en
grootte van de te scheiden moleculen (Boyer, 2012).
Tabel 4: Keuze polymeer voor gelelektroforese naargelang de toepassing.
Polymeer Toepassingen
Cellulose en cellulose acetaat Koolhydraten en aminozuren
Polyacrylamide Eiwitten
Agarose DNA, RNA
Bij SDS-PAGE wordt gewerkt met gedenatureerde eiwitten met een gelijke negatieve lading afkomstig
van de SDS (1,4 g SDS per g eiwit). De sterkte van het elektrisch veld, de samenstelling en
concentratie van polyacrylamide zijn constant. Hierdoor is de migratiesnelheid bij SDS-PAGE enkel
nog afhankelijk van de grootte van de eiwitmoleculen.
Hoe groter het gehalte aan polyacrylamide, hoe kleiner de poriën van de gelmatrix. Een te hoog
gehalte zal er voor zorgen dat de moleculen worden tegengehouden en dus niet kunnen migreren
doorheen de gel. Een te lage concentratie zal dan weer als gevolg hebben dat alle moleculen zich
snel doorheen de gel zullen verplaatsen. Het gehalte aan polyacrylamide kan dus worden aangepast
om de scheiding te optimaliseren (tabel 5).
Tabel 5: Relatie % AA tot grootte van te scheiden moleculen
Moleculair gewicht proteïnen % polyacrylamide in scheidingsgel
< 10.000 > 15 %
10.000 – 80.000 10-15%
20.000 - 150.000 5-10 %
> 100.000 3-5 %
Aangezien de eiwitten een moleculair gewicht hebben van ongeveer 20.000 tot 80.000 Da (tabel 1 en
2) werd gekozen voor een gel met 7,5% polyacrylamide (AA). De 7,5 % AA geldt voor de
scheidingsgel, de stapelgel bestaat steeds uit slechts 4,5 % AA.
30
De polymerisatie van acrylamide en cross-linker N,N’-methyleen-bis-acrylamide (verhouding 37,5:1)
ontstaat met behulp van een initiator-katalysator systeem. Hierbij treedt ammmoniumpersulfaat (APS)
op als initiator en N,N,N’,N’-Tetramethylethyleendiamine (TEMED) als katalysator.
Bij discontinue gel elektroforese bestaat de gel uit twee delen, namelijk een onderste scheidingsgel en
een bovenste stapelgel. Deze gels verschillen in ionische sterkte, pH en % AA. De pI van glycine ligt
dicht bij de pH van de stapelgel (6,8), waardoor dit niet sterk negatief geladen is en dus ook niet snel
zal migrereren naar de positieve pool. De cholride-ionen daarentegen zijn wel sterk geladen, en ook
klein waardoor ze wel snel zullen migreren richting positieve pool. In de scheidingsgel bedraagt de pH
8,8, waardoor glycine wel negatief geladen wordt en dus sneller zal migreren naar de negatieve pool,
al wordt dit beperkt door de hogere concentratie aan polyacrylamide. Deze factoren zorgen ervoor dat
in de bovenste gellaag de bandjes geconcentreerd worden en de resolutie van de scheiding in de
onderste gel toeneemt.
1.6 IEF
Iso-elektrische focusering (IEF) is een scheidingstechniek waarbij de migratie van de eiwitten
doorheen de gel met pH-gradiënt wordt bepaald door hun iso-elektrisch punt (pI), dit is de pH waarbij
de eiwitten een nettolading hebben van nul ofwel neutraal geladen zijn (Amersham Biosciencces,
1998).
De nettolading van een eiwit is namelijk afhankelijk van de pH waarin het zich bevindt. Wanneer de pH
lager is dan de pI van het eiwit, zal het eiwit positief geladen zijn en dus migreren naar de negatieve
pool, de kathode. Bij een pH groter dan de pI van het eiwit, zal dit eiwit negatief geladen zijn en dus
migreren naar de positeve pool, de anode.
IEF bestaat uit 3 stappen: (1) de prefocusering waarbij de pH-gradiënt wordt gevormd, (2) appliciatie
van de stalen en (3) de eigenlijke focusering.
Definitie van % T en % C
De samenstelling van een polyacrylamidegel wordt weergegeven aan de hand van twee parameters:
1) % T = totale concentratie aan acrylamide
= [g (acryl + bis) / 100 ml] x 100
Deze waarde kan in de scheidingsgel varieren van 5 tot 20 % en determineert de poriegrootte.
De stapelgel heeft een zeer laag gehalte aan acrylamide (meestal 4 %T) aangezien hier een grote
poriegrootte gewenst is.
2) % C = gehalte aan crosslinker in het totale acrylamide
= [g (bis) / g (acryl + bis)] x 100
Het gehalte aan crosslinker bedraagt gemiddeld 2,6 % (1:37,5) voor alle gels.
31
1.7 2D elektroforese
Bij 2D elektroforese wordt IEF gecombineerd met SDS-PAGE. Hierbij worden de eiwitten eerst
gescheiden op basis van hun pI met behulp van IEF, vervolgens worden de eiwitten gescheiden op
basis van hun verschil in grootte met behulp van SDS-PAGE. Via deze methode is het dus mogelijk
om een onderscheid te maken tussen eiwitten met eenzelfde moleculair gewicht maar verschillend pI,
en tussen eiwitten met eenzelfde pI maar verschillend moleculair gewicht. Aangezien er van deze
methode geen gebruik werd gemaakt, wordt hier ook niet dieper op ingegaan in deze thesis.
1.8 Kleuren van de gel
Na uitvoering van SDS-PAGE, dient de gel volgende stappen te ondergaan om de bandjes te kleuren:
Wassen van de gel met water om de elektroforesebuffer te verwijderen
Fixatie van de gel door een behandeling met een zuur of alcohol om diffusie van de
eiwitbandjes te vermijden
Kleuring van de proteïnen door behandeling met de kleurstoffen
Ontkleuring van de gel om de overtollige kleurstof te verwijderen en zo de achtergrondkleur te
minimaliseren
Afhankelijk van het protocol kunnen er stappen tegelijk uitgevoerd worden of net meerdere
behandelingen nodig zijn per stap.
Er zijn zowel kleuringsmethoden voor alle proteïnen als voor specifieke subgroepen. Zo kunnen
glycoproteïnen en fosfoproteïnen specifiek gekleurd worden en zo de eiwitten worden geclassificeerd
op basis van hun typerende chemische verbinding (respectievelijk polysacchariden en fosfaatgroepen).
Wanneer een kleurstofbindende stof of kleurreactie kan worden ontworpen om één van deze
functionele groepen te detecteren, kan dit gebruikt worden als basis voor een specifieke gelkleuring.
Vervolgens kunnen de kleuringsmethden opgedeeld worden in colorimetrische en fluorescente
kleuringen, waarbij de colorimetrische kleuringen meteen met het blote oog waarneembaar zijn, en
zijn de fluorescentie kleuringen slechts na excitatie detecteerbaar met behulp van een transiluminator.
De detectiemethoden voor het totaal proteoom en voor de glycoproteïnen die in dit eindwerk werden
aangewend, worden besproken in paragraaf 1.9 en 1.10 (Thermo Fisher Scientific, 2015).
1.9 Detectie en kleuring van alle proteïnen
1.9.1 Colorimetrische kleuring: coomassie brilliant blauw (CBB)
De meest aangewende kleuringsmethode voor eiwitgels is de coomassie-kleuring omdat het een
eenvoudige methode is, een kant-en-klaar reagens is en de eiwitten niet chemisch worden gewijzigd.
Deze kleuring is wel minder precies dan zilverkleuringen en fluorescente kleuringen en wordt hierdoor
ook niet toegepast voor analytische gels (Dyballa & Metzger, 2009). Er zijn verschillende
32
samenstellingen van de kleuroplossingen terug te vinden in de literatuur waarbij gebruik gemaakt
wordt van de G-250 (colloïdale oplossing) of de R-250 kleuring.
Coomassie R-250 en G-250 (figuur 8) zijn twee chemische vormen van een gedisulfoneerde
trifenylmethaan verbinding die gewoonlijk wordt gebruikt als basis voor kleuroplossing voor detectie
van proteïnen na gelelektroforese en in Bradford-type reagentia voor eiwitkwantificering (Bradford,
1976). In deze benamingen staat de G voor “greenish” en R voor “reddish”, 250 is een maat voor de
kleurintensiteit. De R-250 (rood getinte) vorm mist twee methylgroepen die aanwezig zijn in de G-250
(groen getinte) vorm, ook wel gekend als colloïdale coomassie-kleurstof. R-250 is onoplosbaar in
water en dient bijgevolg eerst opgelost te worden in methanol. De G-250 vorm is wel licht oplosbaar in
water, maar wordt bij voorkeur ook eerst opgelost in methanol of ethanol.
Figuur 8: Moleculaire structuren, formule en moleculair gewicht van coomassie brilliant blauw kleuringen R-250 (links) en G-250 (rechts)
Meestal worden coomassie gelkleuringen en eiwitanalyse reagentia geformuleerd als zeer zure
oplossingen in 25 tot 50 % methanol. Onder zure omstandigheden bindt de kleurstof aan eiwitten via
basische aminozuren (hoofdzakelijk arginine, lysine en histidine), en het aantal coomassiecomplexen
gebonden aan elke eiwitmolecule is bij benadering evenredig met het aantal positieve ladingen op de
eiwitten, ongeveer 1,5-3 moleculen CBB/lading (Tal et al., 1985). Zoals bij alle kleuringen detecteert
coomassie blauw dus bepaalde eiwitten beter dan andere. Zo kunnen de meeste eiwitten
gedetecteerd worden vanaf 25 ng per band, maar sommige eiwitten al vanaf 8-10 ng. Omdat er geen
chemische modificatie optreedt, kunnen weggesneden eiwitbanden volledig ontkleurd worden en zo
de eiwitten teruggewonnen en hergebruikt worden voor analyse door bijvoorbeeld massaspectrometrie
of sequenering.
De eiwitbinding zorgt ervoor dat de kleurstof verandert van rood-bruin tot intens blauw, er vindt dus
een verschuiving plaats van de absorptiepiek van 465 nm naar 595 nm zoals weergegeven in figuur 9.
33
Figuur 9: Het absorptiespectrum van Coomassie Brilliant Blauw ongebonden (rode lijn) en eiwitgebonden (groene lijn). Na binding verschuift het absorptiemaximum van 465 nm naar 595 nm (Bradford, 1976).
1.9.2 Fluorescente kleuring: SYPRO Ruby
De SYPRO Ruby kleuring is een permanente kleuring bestaande uit een ruthenium-bevattend
organisch complex (figuur 10) dat niet-covalente interacties aangaat met eiwitten (Berggren et al.,
2000). Doordat deze kleuring niet enkel bindt met basische aminozuren is er minder variatie in
kleuring van eiwit tot eiwit dan bij andere proteïnekleuringen zoals bijvoorbeeld coomassiekleuringen.
Figuur 10: Structuur van SYPRO Ruby kleuring; een ruthenium-bevattend organisch complex (Demchenko, 2011).
De meeste proteïnen kunnen met deze methode worden gedetecteerd, inclusief glycoproteïnen, maar
ook moeilijk te kleuren proteïnen. Eventuele contaminatie van nucleïnezuren daarentegen wordt niet
meegekleurd. De SYPRO Ruby kleuring heeft een lage detectielimiet van 0,25 tot 2,5 ng.
Het is mogelijk om deze kleuring te combineren met andere kleuringen (vb. Pro-Q Emerald 300, 1.7.2)
om zo meer informatie te verkrijgen van eenzelfde gel.
34
In onderstaande figuur zijn de excitatie- en emissiemaxima weergegeven van de SYPRO Ruby
proteïne kleuring.
Figuur 11: Excitatie- (stippellijn) en emissie- (volle lijn) spectra van SYPRO Ruby proteïne kleuring met aanduiding van de pieken
1.10 Specifieke detectie en kleuring van glycoproteïnen
Deze specifieke kleuringen dienen uitgevoerd te worden alvorens de kleuring van de totale proteïnen.
1.10.1 Colorimetrische kleuring: Periodic acid-Schiff (PAS)
Deze methode is gebaseerd op oxidatie van de suikergroepen met perjoodzuur (HIO4). De ontstane
aldehydegroepen kunnen vervolgens reageren met het Schiff’s reagent, een aminebevattende
kleurstof. Een reductie kan tenslotte de kleurstof-eiwitbinding stabiliseren (Wako Pure Chemical
Industries, 2013). Het reactiemechanisme wordt voorgesteld in figuur 12. De kleur kan variëren van
rood tot blauw-paars. Naast kleuring van eiwitgels wordt de PAS-kleuring in combinatie met diastase
(α-amylase), een zetmeel- en glycogeenafbrekend enzym, ook vaak toegepast om weefsels te kleuren.
De detectielimiet hangt af van de mate van glycosylatie ne de grootte van het eiwit. Zo kan er tot 0,625
ng avidine en 0,16 µg mierikswortelperoxidase gedetecteerd worden per band in een SDS-PAGE gel.
De kleuring wordt op eiwitgels bij voorkeur uitgevoerd alvorens alle proteïnen te detecteren met
coomassie blauw (1.9.1) aangezien deze kleuringen beiden colorimetrisch zijn. De fluorescente
variant van deze kleuringsmethode, de Pro-Q Emerald kleuring, wordt besproken in hoofdstuk 1.10.2.
Flu
ore
scente
excitatie (
- -
- -)
Flu
ore
scente
em
issie
(--
----
-)
Golflengte (nm)
280
450
610
35
Figuur 12: Reactiemechanisme PAS-kleuring (Wako Pure Chemical Industries, 2013).
1.10.2 Fluorescente kleuring: Pro-Q Emerald 300
Deze kleuring wordt bij voorkeur uitgevoerd alvorens alle proteïnen te detecteren met SYPRO Ruby
(1.9.2) aangezien deze kleuringen beiden fluorescent zijn.
De detectielimiet bedraagt 0,5 ng glycoproteïne per band, afhankelijk van de aard en mate van
glycosylatie. Dit betekent dat deze detectiemethode ongeveer 50 keer gevoeliger is dan de PAS-
methode (1.10.1).
De Pro-Q Emerald 300 glycoproteïne kleuring reageert (net als het PAS-reagent) met perjodaat-
geoxideerde suikergroepen, waarbij een heldergroen fluorescent signaal ontstaat ter hoogte van de
glycoproteïnen (Mehta-D'souza, 2012). De excitatie is maximaal bij een golflengte van 280 nm en de
emissie is optimaal bij ongeveer 530 nm. In onderstaande figuur zijn de excitatie- en emissiemaxima
weergegeven van de Pro-Q Emerald 300 glycoproteïne kleuring en de SYPRO Ruby proteïne kleuring.
Figuur 13: Excitatie- (A) en emissie- (B) spectra van Pro-Q Emerald 300 glycoproteïnekleuring (volle lijnen) en SYPRO Ruby proteïne kleuring (stippellijnen) met aanduiding van de pieken.
Golflengte (nm) Golflengte (nm)
Flu
ore
scente
excitatie
Flu
ore
scente
em
issie
280 530
36
1.11 Affiniteitschromatografie
Chromatografie is de algemene benaming voor scheidingstechnieken waarbij de verschillende
componenten in een mengsel van elkaar worden gescheiden op basis van de affiniteit van de
componenten voor de mobiele en de stationaire fase. De scheiding kan gedetecteerd worden en
vervolgens gevisualiseerd in de vorm van een chromatogram. Voorbeelden van types chromatografie
zijn vloeistofchromatografie, gaschromatografie, ionenuitwisselingchromatografie en
affiniteitschromatografie (GE Lifesciences, 2007). Deze laatste wordt verder besproken aangezien
hiervan ook gebruik werd gemaakt in dit eindwerk.
Bij affiniteitschromatografie zal er een specifieke component aanwezig in het staal reversibel binden
(elektrostatische of hydrofobe interacties, Van Der Waals krachten en/of hydrogene bindingen) met de
stationaire fase waardoor deze gescheiden wordt van de andere compenenten aanwezig in het
mengsel. Deze techniek wordt vaak gebruikt voor complexe mengsels zoals bloed, plasma en urine.
Voorbeelden van biochemische interacties die toepassing vinden in affiniteitschromatografie zijn
enzym-substraat, antigen-antilichaam, hormoon-receptor en lectine-glycoproteïne, zoals hier werd
toegepast (GE Lifesciences, 2007). Onderstaande figuur stelt een chromatogram voor dat bekomen
kan worden na affiniteitschromatografie. Hierbij bestaat de eerste piek uit niet-gebonden componenten,
en zijn de tweede en derde piek eiwitten die werden tegengehouden maar verschillen in sterkte van
de binding, waarbij de eiwitten in de derde piek sterker gebonden waren aan de kolom dan de eiwitten
in de tweede piek, die sneller losgelaten werden. De eiwitconcentratie werd hier gemeten aan de hand
van de absorbantie bij een golflengte van 280 nm. De x-as stelt de opgevangen fracties voor.
Figuur 14: Voorbeeld chromatogram (Blaber, 1998)
Voor scheiding van glycoproteïnen met behulp van affiniteitschromatografie zijn er twee vaak
toegepaste mogelijkheden, namelijk lectinen en antilichamen. Deze hebben elk hun voor- en nadelen,
maar lectinen worden het vaakst aangewend aangezien ze goedkoper, beter gekarakteriseerd en
stabieler zijn (Cummings & Etzler, 2009).
37
Lectinen zijn suikerbindende proteïnen met een hoge specificiteit voor bepaalde suikereenheden. Ze
kunnen dus gebruikt worden om glycoproteïnen en hun functies te detecteren en analyseren. Lectinen
kunnen ook gelabeld worden door deze te binden aan probes (vb. mierikswortelperoxidase,
fluoroforen en biotine) voor specifieke analyses en detecties en kunnen geïmmobiliseerd worden door
binding aan een vaste drager (vb aan biotine via streptavidine). Lectinen speelden een sleutelrol in de
ontdekking dat de antigenen van de bloedgroepen ABO glycanen zijn (Varki et al., 2009).
De bindingsaffiniteit (Kd) van lectinen voor complexe glycanen ligt vaak in de range van 1 tot 10 µM.
Voor complexe glycoconjugaten kan de bindingsaffiniteit waarden van slechts enkele nanomolair
aannemen. De affiniteit van de meeste lectinen voor monosachariden daarentegen bevindt zich in het
millimolaire gebied (Varki et al., 2009).
Con-canavaline A is waarschijnlijk het meest gebruikte lectine. Dit lectine, een α-mannose/α-glucose-
bindend lectine, bindt aan N-glycanen. Dit lectine is het eerste waarvan de driedimensionele structuur
werd achterhaald (Edelman et al., 1972). De eiwitstructuur, een homotetrameer met 4 Ca2+
en Mn2+
-
ionen is weergegeven in onderstaande figuur (RSCB Protein data bank, 1999).
Figuur 15: Structuur van het lectine Con-canavaline A (ConA) met een resolutie van 2,4 Å (Hardman & Ainsworth, 1972)
Er werd reeds onderzoek uitgevoerd met deze techniek, bv. naar optimale scheiding van
glycoproteïnen in humaan plasma, dit met een gemixte kolom van ConA, tarwekiem agglutinine (WGA)
en jacaline (JAC) vanwege hun verschillende affiniteiten voor respectievelijkN-glycanen, GlcNAc en O-
gebonden glycoproteïnen welke elkaar aanvullen en samen dus nagenoeg alle glycoproteïnen kunnen
capteren (Kulloli et al., 2008; Yang & Hancock, 2004). Bij lectinekolommen bestaande uit ConA
werden problemen bij de elutie vastgesteld door te sterk gebonden glycoproteïnen, dit kon opgelost
worden door de ionenconcentratie en pH van de elutiebuffer aan te passen (Soper & Aird, 2007).
38
2. Materiaal en methoden
2.1 Staalname en –bewaring
Stalen Veos
Er werden stalen plasma, -concentraat en -poeder gecollecteerd van éénzelfde batch. Het plasma en -
concentraat werd verdeeld in eppendorfs (1,5 ml) en bewaard bij – 20 °C. Het poeder werd bewaard
bij kamertemperatuur. De bereiding, eigenschappen en toepassingen van dit poeder werd besproken
in hoofdstuk 1.3.4.
Stalen Sigma-Aldrich
Er werd plasmapoeder besteld van humaan, varkens-, runds- en kippenbloed met artikelnummers
respectievelijk P9523, P2891, P4639 en P3266. Deze stalen zijn bereid door het gecollecteerde bloed,
met antistollingsmiddel (9:1) te centrifugeren. Hierna werd het plasma gefilterd over een filter van 0,45
µm en vervolgens gevriesdroogd. De stalen bevatten in poedervorm telkens 3,8 % trisodium citraat,
een anti-stollingsproduct. Dit poeder werd na ontvangst heropgelost in water en vervolgens verdeeld
in eppendorfs (1,5 ml) en bewaard bij – 20 °C.
2.2 Bepaling eiwitgehalte
2.2.1 BIO-RAD DC eiwitanalyse
2.2.1.1 Reagentia
Reagentia A (BIO-RAD Laboratories): een alkalische oplossing van kopertartraat
Reagentia B (BIO-RAD Laboratories): een verdund Folin reagent
Gedestilleerd water
2.2.1.2 Apparatuur
Microtiterplaat (VWR International)
Spectrofotometer: model 680 microplate reader, (BIO-RAD Laboratories)
2.2.1.3 Standaarden en oplossingen
Er werd plasma, concentraat en poeder geleverd van varken. Deze stalen werden geleverd door Veos
(Zwevezele, België), producent van functionele eiwitten voor de vleesindustrie. Het plasmapoeder van
mens, kip, rund en kip is afkomstig van Sigma-Aldrich.
BSA (Sigma-Aldrich) werd in poedervorm aangekocht. Hieruit werd een stockoplossing bereid van 10
mg/ml in H2O. De kwantificatie van het eiwitgehalte in de plasmastalen werd bepaald aan de hand van
een ijklijn bestaande uit volgende verdunningen: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8 en 2,0
39
mg/ml in H2O. Voor deze standaarden werd vertrokken vanuit de stockoplossing. Een voorbeeld van
een BSA-standaardcurve is weergegeven in figuur 16.
Figuur 16: Voorbeeld BSA-standaardcurve via de BIO-RAD DC eiwitanalyse
2.2.1.4 Protocol
De Biorad DC eiwitanalyse is een colorimetrische methode voor de bepaling van de eiwitconcentratie
van eiwitoplossingen. De reactie is analoog aan de methode van Lowry, mits enkele aanpassingen.
Volgende twee stappen zorgen voor de kleurontwikkeling: de reactie tussen peptidebindingen van het
eiwit en koperionen (Cu2+
) afkomstig van de toegevoegde kopertartraatoplossing in een alkalisch
milieu (de Biureet-reactie), en de daaropvolgende reductie van het Folin reagens door het met koper
behandelde tyrosine en tryptofaan zorgen voor de karakteristiek blauwe kleur.
Er dient een kalibratiecurve opgesteld te worden van een proteïne standaardoplossing, bij voorkeur
van dezelfde proteïnesamenstelling als deze waarvan de concentratie dient bepaald te worden.
Aangezien dit meestal niet voor handen is, dient er gebruik te worden gemaakt van een eiwitoplossing
met een analoge kleurverandering. Bovine Serum Albumine (BSA) wordt hier vaak voor toegepast. De
eiwitconcentraties van onbekenden kunnen vervolgens bepaald worden aan de hand van deze curve.
De stalen worden verdund in verschillende mate zodanig dat de concentraties binnen het bereik van
de standaardcurve liggen.
In een microtiterplaat werd telkens 5 µl van de BSA-standaarden en verdunde stalen in drievoud
gepipetteerd, hieraan werd vervolgens 25 µl van oplossing A en 200 µl van oplossing B toegevoegd.
Na 15 à 60 min reactie bij kamertemperatuur werd de absorbantie gemeten bij 655 nm.
y = 0,1722x + 0,0173 R² = 0,9915
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0 0,5 1 1,5 2
Ab
sorb
anti
e
Concentratie BSA (mg/ml)
40
2.2.2 Wet van Lambert-Beer
Om de eiwitconcentratie in een staal snel te bepalen, kan gebruik gemaakt worden van de wet van
Lambert-Beer; A = ε x c x l, met A: absorbantie; ε: molaire extinctiecoëfficiënt in l/(mol x cm), c:
concentratie in mol/l; l: lengte in cm dat de lichtstraal heeft afgelegd, m. a. w. de doorsnede van de
cuvet.
Aan de hand van de extinctiecoëfficient van het eiwit en de gemeten absorbantie bij een golflengte
van 280 nm, kan de eiwitconcentratie in het staal geschat worden. Deze methode is niet zo
nauwkeurig maar wel zeer snel. De voorwaarden zijn dat er een blanco beschikbaar moet zijn en het
eiwit gekend moet zijn, dit omdat de extinctiecoëfficient geweten dient te zijn. Voordeel van deze
methode is dat het staal later kan hergebruikt worden voor eventuele verdere analysen aangezien er
geen reagentia aan werden toegevoegd. De benodigdheden zijn dan ook zeer beperkt, namelijk UV-
cuvetten (artikelnummer BR759200, Sigma-Aldrich) en een spectrofotometer (Lightwave II, WPA).
2.3 Scheiding van de plasmaproteïnen
2.3.1 SDS-PAGE
2.3.1.1 Bereiden van de gel
Apparatuur
Voor de bereiding van de gel zijn de benodigdheden weergegeven in figuur 17. De gel wordt gemaakt
tussen glasplaten met een tussenruimte gelijk aan de dikte van de gel, in dit geval 0,75 mm. Voordat
de gel gegoten wordt, wordt de onderste glasplaat aan de zijkant bevochtigd om de plaatjes aan
elkaar te “plakken”. Deze platen worden in een speciaal hiervoor ontwikkelde houder A geplaatst.
Deze houder wordt vervolgens in houder B geplaatst. Door gedestilleerd water tussen de glasplaten te
brengen wordt gecontroleerd of er geen lek is tussen de glasplaten en de houders. Wanneer er geen
lek blijkt te zijn, wordt het water van tussen de platen verwijderd en kan vervolgens de gel gegoten
worden. Bij een lek wordt voorgaande procedure herhaald totdat er geen lek meer is.
41
Figuur 17: Apparatuur voor SDS-PAGE; glasplaten, kammetjes, houders (A en B), elektroforesecel met houder, hulpstukken voor laden van de stalen en rechts het elektroforeseapparaat (BIO-RAD)
Oplossingen
a) Stock acrylamideoplossing ( % T = 30 %; % C = 2,7 w/w)
Voor deze oplossing wordt 73 g acrylamide samen met 2 g bis-acrylamide opgelost in water en
aangelengd tot 250 ml. Deze stockoplossing blijft enkele weken stabiel in bruin glas bij 4 °C.
b) Stock scheidingsgel buffer
0,2 g SDS en 9,1 g Tris base [2-amino-2-(hydroxymethyl)-propaan-1,3-diol] worden gelost in < 50 ml
water, waarna de pH naar 8,8 wordt gebracht met HCl en vervolgens verder aangelengd wordt met
water tot 50 ml. Voor gebruik dient de pH opnieuw gecontroleerd te worden. Deze stockoplossing (1,5
M) is maanden houdbaar bij 4 °C.
c) Stock stapelgel buffer
0,2 g SDS en 3,02 g Tris base worden gelost in < 50 ml water, waarna de pH naar 6,8 wordt gebracht
met HCl en vervolgens verder aangelengd wordt met water tot 50 ml. Voor gebruik dient de pH
opnieuw gecontroleerd te worden. Deze stockoplossing (0,5 M) is maanden houdbaar bij 4 °C.
d) Stock ammonium persulfaat (APS)
Voor deze oplossing wordt 1,0 g ammonium persulfaat opgelost in 10 ml water. Deze stockoplossing
blijft enkele weken stabiel in bruin glas bij 4 °C. Voor langere periodes wordt aangeraden om deze
oplossing in te vriezen.
e) TEMED: N,N,N’,N’-Tetramethylethyleendiamine
Methode
De samenstelling van de gels is weergegeven in tabel 6. Aangezien de scheidingsgel het onderste
deel is van de gel, wordt deze gel het eerst bereid.
Er wordt gestart met het mengen van de 30 % AA:Bis (1:37,5), het ultrapuur water en de
scheidingsbuffer. APS en TEMED worden als laatste tegelijk toegevoegd.
A
B
42
Na menging van de componenten wordt de acrylamideoplossing zo snel mogelijk tussen de platen
gebracht met een pipet van 1 ml tot ongeveer 2/3 van de ruimte tussen de platen gevuld is. Voor het
bekomen van een rechte scheiding wordt een kleine hoeveelheid isopropanol aangebracht boven op
de acrylamideoplossing.
Wanneer na ongeveer 20 minuten de polymerisatie volbracht is, kan de bovenstaande vloeistof
verwijderd worden en gestart worden met de bereiding van de stapelgel. Dit gebeurt op analoge wijze
als bij de scheidingsgel.
Er wordt gestart met het mengen van de 30 % AA:Bis (1:37,5), het ultrapuur water en de stacking
buffer. APS en TEMED worden als laatste tegelijk toegevoegd. Na menging van de componenten
wordt de acrylamideoplossing zo snel mogelijk tussen de platen gebracht met een pipet van 1 ml tot
de ruimte tussen de platen gevuld is. Tenslotte wordt de kam tussen de platen geplaatst om slotjes in
de gel te verkrijgen. Na polymerisatie is de gel klaar voor gebruik. De gel kan tot 2 weken bewaard
worden in runningbuffer bij een temperatuur van 4 °C.
Tabel 6: Samenstelling scheidings- en stapelgel voor SDS-PAGE, gel met 7,5 % AA en dikte 0,75 mm. De hoeveelheden zijn gebaseerd op 1 SDS-PAGE gel.
De scheidingsbuffer bestaat uit 1,5 M Tris-Hcl en heeft een pH van 8,8. De stapelbuffer bestaat uit 0,5 M Tris-HCl en heeft een pH van 6,8.
Scheidingsgel Stapelgel
30 % AA:BIS (1:37,5) 1,25 ml 0,375 ml
Buffer (Scheidingsbuffer of stapelbuffer) 1,25 ml 0,625 ml
Ultrapuur H2O 2,5 ml 1,5 ml
N,N,N’,N’-Tetramethylethyleendiamine (TEMED) 10 µl 10 µl
Ammonium persulfaat (APS) 25 µl 25 µl
2.3.1.2 Runnen van de gel
Oplossingen
a) Stock staalbuffer 9,5 ml
Ultrapuur water 4,8 ml
0,5 M Tris-Hcl buffer pH 6,8 1,2 ml
Glycerol 1,0 ml
10 % (w/v) SDS 2,0 ml
0,1 (w/v) bromofenolblauw 0,5 ml
b) Reducerende SDS staalbuffer 500 µl
β-mercaptoethanol 25 µl
Stock staalbuffer 475 µl
43
c) Runningbuffer / reservoirbuffer 2 l
Tris (0,025 M) 6,0 g
Glycine (0,192 M) 28,8 g
SDS (0,1 % w/v) 2,0 g
Deze oplossing zou een pH van ongeveer 8,3 moeten hebben zonder toevoegingen.
Standaarden
Mierikswortel peroxidase
Dit geglycosyleerd eiwit met een moleculair gewicht (MW) van 37 kDa werd gebruikt als positieve
controle. De concentratie van de stockoplossing bedraagt 2 mg/ml.
Sojaboon trypsine inhibitor (STI)
Dit niet-geglycosyleerd eiwit met een moleculair gewicht (MW) van 20 kDa werd gebruikt als negatieve
controle. De concentratie van de stockoplossing bedraagt 2 mg/ml.
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards (BIO-RAD)
Deze ladder bevat een mix van tien proteïnen met MM: 10; 15; 20; 25; 37; 50; 75; 100; 150; 250 kDa.
Deze eiwitten zijn reeds blauw gekleurd.
Candycane Glycoprotein Molecular Weight Standards (life technologies)
Deze ladder bevat een mix van acht proteïnen met MM: 14; 18; 29; 42; 66; 82; 97; 180 kDa. Deze
eiwitten zijn in volgorde van moleculair gewicht afwisselend wel en niet geglycosyleerd (tabel 7).
Tabel 7: Eiwitten aanwezig in de Candycane standaard met vermelding van de moleculaire gewichten en de glycosylatie, waarbij “X” wijst op een geglycosyleerd eiwit
Eiwit MM (Da) Glycoproteïne?
α1-macroglobuline 180 000 X
Fosforylase b 97 000
Glucose oxidase 82 000 X
Bovine Serum
albumine
66 000
α1-zuur
glycoproteïne
42 000 X
Koolstofanhydrase 29 000
Avidine 18 000 X
Lysosyme 14 000
Low Molecular Weight (LMW) (BIO-RAD)
Deze ladder bevat een mix van zes proteïnen met MM: 14,4; 21,5; 31; 45; 66,2; 97,4 kDa. De laatste
drie komen ook voor in de HMW-ladder (tabel 8).
44
High Molecular Weight (HMW) (BIO-RAD)
Deze ladder bevat een mix van vijf proteïnen met MM: 45; 66,2; 97,4; 116,25; 200 kDa. De eerste drie
komen ook voor in de LMW-ladder (tabel 8).
Tabel 8: Eiwitten aanwezig in LMW en HMW standaarden, met vermelding van MM.
Eiwit MM (Da) LMW HMW
Myosine 200 000 X
β-galactosidase 116 250 X
Fosforylase b 97 400 X X
Serum albumine 66 200 X X
Ovalbumine 45 000 X X
Koolstofanhydrase 31 000 X
Trypsine-inhibitor 21 500 X
Lysosyme 14 400 X
Staalvoorbereiding
De stalen worden verdund zodat de eiwitconcentratie ongeveer 1 mg/ml bedraagt. Vervolgens wordt
hiervan telkens 10 µl gemengd met 10 µl reducerende staalbuffer in een eppendorf van 1,5 ml. In de
bovenkant van elke eppendorf wordt met een (hete) naald een gaatje gemaakt. De stalen worden
gedurende 2 minuten gekookt zodat alle eiwitten met zekerheid gedenatureerd zijn.
Methode
De gel tussen de twee glasplaten wordt in de houder van de elektroforesecel gebracht. Wanneer er
slechts 1 gel gelopen wordt, dient de cel gesloten te worden met behulp van een bufferdam, dit is een
speciale sluitplaat. De cel wordt gevuld met runningbuffer en gecontroleerd op lekken. Wanneer er
een lek is, dient de constructie opnieuw in elkaar gezet te worden, of wordt de container gevuld met
runningbuffer totdat het vloeistofoppervlak gelijk loopt met dit in de cel. De kam wordt voorzichtig
verwijderd en de slotjes van de gel worden gevuld met 10 µl staal of standaard met behulp van een
micropipet. Wanneer de gel geladen is, wordt de elektoforesecel verbonden worden met het
elektroforese-apparaat. Het voltage wordt ingesteld op 180 V. De cel wordt onder spanning gehouden
totdat de tracking dye de onderkant van de gel heeft bereikt. Na de elektroforese wordt de gel tussen
de glasplaten uit de houder verwijderd. Vervolgens kan de gel van tussen de plaatjes verwijderd
worden en overgebracht in de gewenste oplossing voor verdere behandeling. De methoden voor
kleuren van de gel worden uitgelegd in hoofdstuk 2.4 en 2.5.
45
2.3.2 IEF
De pI’s van de meest voorkomende plasma-eiwitten liggen tussen pH 5,4 en pH 9 (tabel 1). Op basis
hiervan werd er gekozen voor gels met pH 3 tot 9 en pH 5 tot 8 (PhastGel, GE lifesciences). De
geprogrammeerde methode op het toestel die hiermee overeenstemt is methode 1.
Apparatuur
IEF-toestel “Phastsystem Separation and control unit” (Pharmacia) (figuur18)
Figuur 18: “Phastsystem Separation and control unit” (Pharmacia); toestel voor uitvoering van IEF
Staal applicator (figuur19)
Figuur 19: Phastgel Staal applicator (GE lifesciences) voor laden van de stalen
“Sample well stamp”: plaatje met relief om stalen op aan te brengen voordat deze op de
staalapplicator worden aangebracht (figuur 20).
Parafilm
Standaarden en oplossingen
Broad Range pl 4.45-9.6 (BIO-RAD)
De standaarden aanwezig in dit standaardmengsel zijn opgesomd in onderstaande tabel, met
vermelding van de pI-waarden.
Tabel 9: Standaarden aanwezig in Broad Range pl 4.45-9.6 (BIO-RAD), met vermelding van de pI-waarden
Standaard Kleur pI
Fycocyanine (3 banden) Blauw 4,45
4,65
4,75
β-Lactoglobuline B 5,1
46
Koolzuuranhydrase (rund) 6,0
Koolzuuranhydrase (humaan) 6,5
Equinemyoglobine (2 banden) Bruin 6,8
7,0
Humaan hemoglobine A Rood 7,1
Humaan hemoglobine C Rood 7,5
Lentil lectine (3 banden) 7,8
8,0
8,2
Cytochroom C Rood 9,6
Methode
De methode bestaat uit 3 stappen: (1) prefocussering; (2) aanbrengen van de stalen; (3) IEF.
Alvorens de precast IEF-gel aan te brengen dient het oppervlak gereinigd te worden, dit kan met
ethanol 70 %. Na een druppel H2O aan te brengen op dit oppervlak kan hierop de precast IEF-gel
gelegd worden op de hiervoor voorziene plaats. Vervolgens kan de methode (voor een gel met pH 3-9
is dit methode 1) gestart worden. Tijdens de prefocusering stap kunnen de stalen voorbereid worden
om te laden. Dit gebeurt door parafilm aan te drukken op het voorziene plaatje waarop de spots voor
de stalen zijn aangebracht in reliëf. Dit reliëf wordt overgenomen door de parafilm en kan vervolgens
gebruikt worden om telkens 3 µl staal op aan te brengen. De parafilm wordt telkens ververst waardoor
contaminatie vermeden wordt.
Figuur 20: Overbrengen van stalen van de “sample well stamp” naar de staal applicator.
Door capillaire krachten zal er hiervan per staal 1 µl als het ware opgezogen worden door het
applicatiekammetje. Dit kammetje kan vervolgens geplaatst worden aan de anode, kathode of in het
midden. Er werd gekozen om de stalen in het midden van de gel te laden. Voor het plaatsen van het
kammetje dient de methode op pauze gezet te worden. 2 Vh voor de applicatie van de stalen gaat er
een alarm af ter waarschuwing.
De condities van de verschillende stappen voor de gebruikte methode zijn weergegeven in
onderstaande tabel (Amersham Biosciences).
47
Tabel 10: Condities van de verschillende stappen tijdens de IEF. Stap 1= prefocusering; stap 2= laden v.d. stalen; stap 3= IEF
Stap 1 2000 V 2,5 mA 3,5 W 15 °C 75 Vh
Stap 2 200 V 2,5 mA 3,5 W 15 °C 15 Vh
Stap 3 2000 V 2,5 mA 3,5 W 15 °C 410 Vh
De geprepareerde PhastGel IEF-gels (GE lifesciences) zijn homogene (5 % T, 3 % C) polyacrylamide
gels en bevatten 2-6 % farmalyt als amfolyt. Dit zorgt voor een stabiele en lineaire pH-gradiënt met
uniforme geleidbaarheid over de volledige pH-range, en laat veldsterktes toe hoger dan 500 V/cm
voor scheidingen met hoge resolutie (GE lifesciences).
2.3.3 Lectinekolom ConA
Er werd gekozen voor ConA in de vorm van een suspensie (Sigma-Aldrich). Het lectine zit hierin
ingebed in een matrix van 4 % cross-gelinkte agarose en is opgelost in een oplossing met pH 6,8
bestaande uit 1,0 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 en 0,02 % thimerosal. Uit 1 ml van deze
suspensie kan een kolom met een bedvolume van ongeveer 0,5 ml worden bereid.
De bindingscapaciteit is afhankelijk van het type eiwit. Zo zou er bijvoorbeeld 10 mg peroxidase
kunnen binden met 1 ml kolom. Hier dient rekening mee gehouden te worden voor de bepaling van de
mate waarin het eiwitstaal dient verdund te worden.
Apparatuur
Filters
Glazen kolom met filterbed
Oplossingen
Equilibratiebuffer
50 mM azijnzuur, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, NaOH, 1 mM MnCl2
Deze buffer dient op pH 6 gebracht te worden alvorens de MnCl2 wordt toegevoegd.
Elutiebuffer
100 mM azijnzuur, 250 mM methyl-α-D-mannopyranoside (M6882, Sigma-Aldrich, NaOH
Deze buffer dient op pH 4 gebracht te worden.
Beide buffers dienen voor gebruik gefilterd te worden (0,22 µm). De keuze van de equilibratie- en
elutiebuffer werd gebaseerd op een artikel (Soper & Aird, 2007).
Regeneratiebuffer pH 4,5
500 mM NaCl, 100 mM azijnzuur, NaOH
Regeneratiebuffer pH 8,5
500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl
48
De regeneratiebuffers werden gekozen op basis van de handleiding voor Con A SepharoseB van GE
Healthcare. Ook deze buffers werden gefilterd (0,22 µm) voor gebruik.
2.3.3.1 Bereiding kolom
Voorbereiding van het kolommedium
De suspensie dient eerst gewassen te worden met 10 bedvolumes equilibratiebuffer, wat dus
overeenkomt met 20 keer het volume aan suspensie. Dit gebeurt door, na samenvoeging van de
suspensie en buffer, dit geheel te mengen en vervolgens gedurende 5 min. te centrifugeren bij 4000 g.
Vervolgens wordt het supernatans verwijderd en wordt opnieuw buffer toegevoegd zodat er een
verhouding ontstaat van 75 % medium en 25 % buffer.
Pakken van de kolom
Alvorens hiermee gestart wordt, dient al het benodigde materiaal op de temperatuur gebracht te
worden waarbij de chromatografie zal plaatsvinden. Het eerder bereide kolommedium dient ontlucht te
worden. Ook de luchtbellen in de dode ruimten van de kolom dienen verwijderd te worden door deze
te vullen met equilibratiebuffer. Hierna kan de slurry overgebracht worden in de kolom. Dit dient te
gebeuren in een vloeiende beweging. Om vorming van luchtbellen te voorkomen wordt aangeraden
de slurry te gieten langs een glazen staaf die tegen de wand van de kolom wordt gehouden.
Vervolgens dient er equilibratiebuffer meteen aangebracht te worden op de kolom. Hierna is de kolom
klaar voor gebruik.
2.3.3.2 Gebruik
Voor gebruik worden alle oplossingen op kamertemperatuur gebracht. Vervolgens wordt voor een
scheiding van de eiwitten volgende stappen doorlopen:
Equilibratie
Het equilibreren van de kolom gebeurt mbv een kolomvolume equilibratiebuffer. Wanneer de kolom
bewaard werd in 20 % ethanol, dient dit eerst uit de kolom verwijderd te worden door er 2 à 3
kolomvolomes equilibratiebuffer te laten doorlopen.
Laden eiwitstaal
Het staal wordt verdund in de mate zodat het volume dat geladen wordt een hoeveelheid eiwit bevat
waarvan de geglycosyleerde fractie tegengehouden kan worden door de kolom.
Wassen
Het wassen van de kolom gebeurt mbv equilibratiebuffer. De niet-gebonden fractie zal samen met
deze buffer door de kolom lopen.
Elutie
De elutiebuffer zorgt ervoor dat de gebonden eiwitten worden losgelaten door de kolom.
49
Alle fracties worden opgevangen in eppendorfs in kleine volumes waarvan de absorbantie vervolgens
wordt gemeten bij een golflengte van 280 nm voor het opmaken van het chromatogram.
2.3.3.3 Bewaring
Indien de kolom later hergebruikt zal worden, dient deze eerst geregenereerd te worden door
afwisselend 2 à 3 kolomvolumes van de regeneratiebuffers met pH 8,5 en pH 4,5 te laten doorlopen,
dit dient drie maal te gebeuren, gevolgd door re-equilibratie met equilibratiebuffer.
De kolom wordt bewaard bij een temperatuur van 4 °C in equilibratiebuffer, eventueel met 20 %
ethanol.
2.4 Detectie glycoproteïnen
2.4.1 Colorimetrische kleuring: PAS-methode
Er werd gebruik gemaakt van de Pierce gylcoprotein staining kit van Lifetechnologies (zie bijlage).
2.4.1.1 Reagentia
50 % methanol
3 % azijnzuur
Oxidatiereagent
Kleurreagent
Reductiereagent
Ultrapuur water
2.4.1.2 Apparatuur
Schudtoestel
2.4.1.3 Protocol
Volgende stappen dienen onder de trekkast uitgevoerd te worden en er dient gebruik gemaakt te
worden van een schudtoestel.
1. Fixatie
De gel wordt gefixeerd door deze gedurende 30 min. onder te dompelen in 100 ml 50 %
methanol.
2. Wassen
De gel wordt gewassen door deze over te brengen in 100 ml 3 % azijnzuur gedurende 10 min.
Deze stap wordt één maal herhaald. De gel kan na deze stap eventueel overnacht bewaard
worden bij 4 °C.
50
3. Oxidatie van de koolhydraten
De gel wordt overgebracht in 25 ml oxiderende oplossing voor 15 min.
4. Wassen
De gel wordt drie maal gewassen in 100 ml 3 % azijnzuur, telkens gedurende 5 min.
5. Kleuren
De gel wordt overgebracht in 25 ml kleuroplossing voor 15 min.
Opm.: Wanneer er kristallen aanwezig zijn in de kleuroplossing, dienen deze door
centrifugatie verwijderd te worden. Enkel het supernatant mag dus gebruikt worden, de
kristallen dienen verwijderd te zijn. De oplossing mag niet verwarmd worden om de kristallen
te heroplossen.
6. Reductie
De gel wordt overgebracht in 25 ml reducerende oplossing voor 15 min.
7. Wassen
De gel wordt grondig gewassen met 3 % azijnzuur en vervolgens met ultrapuur water.
Glycoproteïnen zullen verschijnen als magentakleurige bandjes. De gel kan bewaard worden in 3 %
azijnzuur.
Onderstaande figuur vat dit protocol schematisch samen.
Figuur 21: Samenvatting protocol PAS-kleuring (Lifetechnologies, bewerkt)
2.4.2 Fluorescente kleuring: Pro-Q Emerald 300
Dit protocol is eveneens terug te vinden in bijlage.
1. Fixeer de gel in 50%
methanol (30 min.)
2. Was de gel in 3% azijn-
zuur (2 x 10 min.)
3. Voeg oxiderende oplossing
toe (15 min.)
4. Was de gel in 3%
azijnzuur (3 x 5 min.)
5. Voeg kleuroplossing toe
(15 min.)
6. Voeg reducerende oplossing
toe (5 min.)
7. Was de gel in 3% azijnzuur en
vervolgens met ultrapuur H2O
51
2.4.2.1 Reagentia
Fixatie-oplossing (50 % methanol en 5 % azijnzuur in dH2O)
Wasoplossing (3 % ijsazijn in dH2O)
Oxiderende oplossing (2,5 g perjoodzuur opgelost in 250 ml 3 % azijnzuur)
Kleuroplossing
2.4.2.2 Apparatuur
Schudtoestel
GelDoc toestel BIO-RAD
2.4.2.3 Protocol
Volgende stappen dienen onder de trekkast uitgevoerd te worden en er dient gebruik gemaakt te
worden van een schudtoestel.
1. Fixatie
De gel wordt gefixeerd door deze twee maal gedurende 30 min. onder te dompelen in 100 ml
fixatie-oplossing. Deze stap kan eventueel ook overnacht gebeuren.
2. Wassen
De gel wordt twee maal gewassen in 100 ml wasoplossing gedurende 10 à 20 min.
3. Oxidatie van de koolhydraten
De gel wordt overgebracht in 25 ml oxiderende oplossing gedurende 30 min.
4. Wassen
De gel wordt gewassen door deze onder te dompelen in 100 ml wasoplossing gedurende 5
min. Deze stap dient twee maal herhaald te worden.
5. Kleuren
De gel wordt overgebracht in 25 ml kleuroplossing gedurende 90 min. in het donker. De
kleuring is na 30 min. reeds detecteerbaar, na 120 min. is het signaal is maximaal.
6. Wassen
De gel wordt gewassen door deze twee maal onder te dompelen in 100 ml wasoplossing
gedurende telkens 15 min. Wanneer bij de visualisatie de achtergrondkleuring nog te hoog
blijkt, kan de gel een extra maal gewassen worden.
Voor visualisatie van het bandenpatroon van de geglycosyleerde eiwitten dient gebruik te worden
gemaakt van een 300 nm UV transiluminator (figuur 22).
52
Figuur 22: UV transiluminator met verschillende filters (BIO-RAD); toestel waarmee fluorescente kleuringen op SDS-PAGE gels kunnen gevisualiseerd worden en vervolgens verwerkt met de bijhorende
software; Imagelab.
2.5 Detectie proteïnen
2.5.1 Colorimetrische kleuring: Coomassie Briljant Blauw
Deze kleuring is zowel bruikbaar na SDS-PAGE als na IEF.
2.5.1.1 Reagentia
SDS-PAGE
dH2O
Kleuroplossing (3 g CBB R250 in wasoplossing, gefilterd voor gebruik)
Wasoplossing (45 % methanol, 10 % azijnzuur, 45 % dH2O)
IEF
Fixatieoplossing (20 % TCA)
Wasoplossing (3/1/6 methanol/azijnzuur/dH2O)
Kleuroplossing: 0,02 % CBB R , 0,1 % CuSO4 in wasoplossing
(voor 100 ml: 10 ml gefilterde stockoplossing*, 90 ml wasoplossing, 100 mg CuSO4)
*Bereiding stockoplossing:
1 tablet (PhastGel Blue R, Sigma-Aldrich) oplossen in 80 ml dH2O door 15 min. te
schudden, vervolgens 120 ml methanol toevoegen en opnieuw 2 à 3 min. schudden
2.5.1.2 Apparatuur
Schudtoestel
Plastic bakje voor reagentia te laten inwerken op de gel
53
2.5.1.3 Protocol
SDS-PAGE
Voor volgende stappen dient gebruik gemaakt te worden van een schudtoestel.
1. Reinigen
De gel wordt gereinigd in dH2O om overgebleven SDS te verwijderen aangezien dit
interfereert met de kleuring.
2. Fixatie + kleuren
De gel wordt overgebracht in 100 ml kleuroplossing gedurende 60 min.
3. Wassen
De gel wordt gewassen door deze twee maal gedurende 30 min. onder te dompelen in 100 ml
wasoplossing. Deze stap wordt herhaald totdat de overmaat niet gebonden kleurstof uit de
gelmatrix is weggewassen en er dus geen achtergrondkleur meer zichtbaar is.
IEF
Voor volgende stappen dient gebruik gemaakt te worden van een schudtoestel.
1. Fixatie
De gel wordt gefixeerd door deze gedurende 5 min. onder te dompelen in fixatieoplossing.
2. Wassen
De gel wordt gewassen door deze gedurende 2 min. onder te dompelen in wasoplossing.
3. Kleuren
De gel wordt overgebracht in kleuroplossing voor 10 min. bij een temperatuur van 50 °C.
4. Ontkleuren
De gel wordt ontkleurd door deze 10 min. onder te dompelen in wasoplossing bij een
temperatuur van 50 °C. Deze stap wordt herhaald totdat de overmaat niet gebonden kleurstof
uit de gelmatrix is weggewassen en er dus geen achtergrondkleur meer zichtbaar is.
2.5.2 Fluorescente kleuring: Sypro Ruby
Dit protocol is eveneens terug te vinden in bijlage.
2.5.2.1 Reagentia
Fixatieoplossing (50 % methanol en 7 % azijnzuur in dH2O)
Wasoplossing (10 % methanol en 7 % azijnzuur in dH2O)
Kleuroplossing
Ultrapuur water
2.5.2.2 Apparatuur
Schudtoestel
54
Plastic bakje voor reagentia te laten inwerken op de gel
GelDoc toestel BIO-RAD
2.5.2.3 Protocol
Volgende stappen dienen onder de trekkast uitgevoerd te worden en er dient gebruik gemaakt te
worden van een schudtoestel.
1. Fixatie
De gel wordt gefixeerd door deze twee maal gedurende 30 min. onder te dompelen in 100 ml
fixatie-oplossing.
2. Kleuren
De gel wordt overgebracht in 60 ml kleuroplossing overnacht.
3. Wassen
De gel wordt gewassen door deze gedurende 30 min. onder te dompelen in 100 ml
wasoplossing.
4. Reinigen
Voor visualisatie dient de gel minstens twee maal gedurende 5 min. gereinigd te worden in
ultrapuur water om zo schade aan de transiluminator te vermijden.
Voor visualisatie van het bandenpatroon van de geglycosyleerde eiwitten wordt gebruik gemaakt van
een 300 nm UV transiluminator (figuur 7).
55
3. Resultaten en discussie
De eerder besproken methoden voor scheiding en detectie van glycoproteïnen werden aangewend
om enerzijds de stalen te onderzoeken op gebied van eiwitconcentratie en –samenstelling, waarna er
een vergelijking kon gemaakt worden tussen de verschillende stalen. Eerst werden de eiwitgehaltes
van de verschillende stalen bepaald met de Biorad DC analyse, dit was noodzakelijk om de mate van
verdunning te bepalen om deze stalen later op de SDS-PAGE en IEF-gels te laden. Met deze
technieken konden de eiwitprofielen geanalyseerd en vergeleken worden. Vervolgens werd ook
getracht de glycoproteïnen te detecteren op de SDS-PAGE en IEF gels aan de hand van zowel
colorimetrische als fluorescente kleuringen. Tenslotte werd er gebruik gemaakt van een lectinekolom
bestaande uit geïmmobiliseerd ConA met de bedoeling om op deze manier de meeste glycoproteïnen
te scheiden van de andere proteïnen. Door meting van de absorbanties van de opgevangen fracties
werd er een chromatogram opgesteld. Vervolgens konden de eiwitsamenstellingen van de fracties
gecontroleerd worden door deze te analyseren m. b. v. SDS-PAGE.
3.1 Bepaling eiwitgehalte
Het eiwitgehalte van de stalen werd bepaald met de Biorad DC kit gebaseerd op de methode van
Lowry (beschreven in hoofdstuk 2.2.1).
De waarden van absorbantie met de overeenkomstige eiwitconcentraties berekend aan de hand van
de standaardcurve zijn weergegeven in onderstaande tabellen. De absorbanties die niet binnen het
gebied van de standaardcurve lagen, werden weggelaten.
3.1.1 Varkensplasma – stalen Veos
Plasma
Mate van verdunning
ABS(1)
ABS(2)
ABS(3)
Gem. ABS
Concentratie verdunning (mg/ml)
Concentratie staal (mg/ml)
100 x 0,235 0,221 0,223 0,226 0,643 64,3
50 x 0,357 0,371 0,364 0,364 1,32 65,9
25 x 0,570 0,599 0,635 0,601 2,48 62,1
64,1
Concentraat
Mate van verdunning
ABS(1)
ABS(2)
ABS(3)
Gem. ABS
Concentratie verdunning (mg/ml)
Concentratie staal (mg/ml)
500 x 0,173 0,184 0,177 0,178 0,405 2023
250 x 0,257 0,260 0,295 0,271 0,860 215
200 x 0,327 0,325 0,347 0,333 1,17 233
217
Poeder
De bekomen eiwitgehalten van het plasmapoeder variëren tussen de 700 en 850 mg/ml. Vanwege de
grote variatie tussen de resultaten, kunnen deze niet betrouwbaar geacht worden.
56
Op basis van deze metingen kan dus besloten worden dat de gemiddelde concentratie aan totaal eiwit
voor varkensplasma 64 mg/ml (6,4 % w/v) bedraagt en voor varkensconcentraat 217 mg/ml (21,7 %
w/v). Voor het eiwitgehalte van het varkensplasmapoeder wordt verondersteld dat dit 69 % w/v
bedraagt zoals vermeld staat in de productbeschrijving van de producent Veos (tabel 3).
Uit deze resultaten blijkt dat de concentratiefactor van plasma naar concentraat 3,39 bedraagt, dit
concentraat werd vervolgens nog 3,18 maal geconcentreerd tot poeder. De totale concentratiefactor
van plasma naar poeder bedraagt dus 10,78.
3.1.2 Plasmastalen Sigma-Aldrich
Rund
Mate van verdunning
ABS(1)
ABS(2)
ABS(3)
Gem. ABS
Concentratie verdunning (mg/ml)
Concentratie staal (mg/ml)
100 x 0,238 0,297 0,262 0,266 1,18 118
50 x 0,447 0,483 0,391 0,440 2,23 112
115
Humaan
Mate van verdunning
ABS(1)
ABS(2)
ABS(3)
Gem. ABS
Concentratie verdunning (mg/ml)
Concentratie staal (mg/ml)
200 x 0,127 0,111 0,104 0,114 0,266 53,1
100 x 0,169 0,155 0,177 0,167 0,585 58,5
55,8
Varken
Mate van verdunning
ABS(1)
ABS(2)
ABS(3)
Gem. ABS
Concentratie verdunning (mg/ml)
Concentratie staal (mg/ml)
200 x 0,162 0,140 0,175 0,159 0,537 107
100 x 0,252 0,263 0,268 0,261 1,15 115
50 x 0,343 0,402 0,453 0,399 1,99 99,3
107
Kip
Mate van verdunning
ABS(1)
ABS(2)
ABS(3)
Gem. ABS
Concentratie verdunning (mg/ml)
Concentratie staal (mg/ml)
100 x 0,124 0,115 0,125 0,121 0,310 31,0
50 x 0,150 0,171 0,167 0,163 0,559 28,0
29,5
Op basis van deze metingen kan dus besloten worden dat de gemiddelde concentratie aan totaal eiwit
voor plasma van rund, mens, varken en kip respectievelijk 115 mg/ml (11,5 % w/v), 56 mg/ml (5,6 %
w/v), 107 mg/ml (10,7 % w/v) en 30 mg/ml (3,0 % w/v) bedraagt.
57
Wanneer het varkensplasma van Veos wordt vergeleken met dit van Sigma-Aldrich, blijkt dat de
eiwitconcentratie in het staal van Sigma-Aldrich beduidend hoger ligt (107 mg/ml) dan in het staal
afkomstig van Veos (64,1 mg/ml).
3.2 Vergelijking eiwitprofielen
3.2.1 SDS-PAGE met coomassiekleuring
De plasmastalen (zowel van Veos als van Sigma-Aldrich) werden samen met standaarden geladen op
een SDS-PAGE gel en deze werd achteraf gekleurd met CBB. De posities en eiwitconcentraties van
de stalen en standaarden die op de gel werden geladen zijn weergegeven in onderstaande tabel.
Deze analyse laat toe de eiwitsamenstelling onderling te vergelijken.
De stalen werden zodanig verdund dat de eiwitconcentratie telkens 1 mg/ml bedroeg. Zo kunnen de
bekomen bandenpatronen vervolgens beter vergeleken worden.
Tabel 11: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor SDS-PAGE
Staal of standaard Afkomst Concentratie eiwit geladen
1 Precision Plus Protein standaard BIO-RAD (onverdund)
2 Plasma Veos 1 mg/ml
3 Concentraat Veos 1 mg/ml
4 Poeder Veos 1 mg/ml
5 BSA-standaard Sigma-Aldrich 0,5 mg/ml
6 Plasma rund Sigma-Aldrich 1 mg/ml
7 Plasma varken Sigma-Aldrich 1 mg/ml
8 Plasma mens Sigma-Aldrich 1 mg/ml
9 Plasma kip Sigma-Aldrich 1 mg/ml
10 HMW-ladder BIO-RAD (onverdund)
Het resultaat van de SDS-PAGE, na kleuring met CBB is weergegeven in figuur 23.
58
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figuur 23: SDS-PAGE gel gekleurd met CBB; bovenaan de figuur zijn de laantjes genummerd overeenkomend met tabel 11; links en rechts van de gel zijn de moleculaire gewichten aangeduid van de
geladen standaarden in laantje 1 en 10.
Algemeen
Ter hoogte van 66 kDa is er bij elk staal en ook bij de BSA-standaard een dikke band te zien (baantje
2 tot 9). Dit bandje bevat hoogstwaarschijnlijk het serum albumine, het voornaamste eiwit aanwezig in
bloedplasma. Bovendien werd op laantje nummer 5 BSA-standaard geladen, het serum albumine
afkomstig van rund en dit bevindt zich op dezelfde hoogte.
Vergelijking BSA-standaard (laan 5) en plasma rund (laan 6)
Opmerkelijk hierbij is dat op laantje 5 er bovenaan de gel ook lichte bandjes zichtbaar zijn, wat er op
wijst dat het niet om 100 % zuiver BSA gaat. Deze bandjes zijn nochtans niet zichtbaar op laantje 6
waar het rundsplasma werd geladen. Dit doet vermoeden dat deze eiwitten niet afkomstig zijn van
rundsplasma, maar een andere oorsprong hebben. Mogelijks zijn dit additieven die werden
toegevoegd om bijvoorbeeld de houdbaarheid en stabiliteit van het zuivere eiwit te doen toenemen.
Vergelijking stalen Veos (laan 2, 3 en 4)
De bandjes op laan 2, 3 en 4 komen sterk overeen, wat logisch is aangezien het hier om verdund
varkensplasma, concentraat en poeder van dezelfde afkomstgaat. Het is mogelijk dat er gedurende de
processing enkele eiwitten deels verloren zouden zijn gegaan, maar indien dat het geval zou zijn is dit
niet in de mate waarin dit zichtbaar is op deze gel.
Vergelijking stalen Sigma-Aldrich (laan 6, 7, 8 en 9)
Deze bandenpatronen zijn duidelijk verschillend. Dit was ook te verwachten aangezien het hier om
plasma gaat van 4 verschillende diersoorten. Laan 9 is het meest afwijkend, dit kan verklaard worden
door het feit at het hier om kippenplasma gaat, m.a.w. plasma afkomstig van gevogelte, terwijl de
overige stalen allen afkomstig zijn van zoogdieren, welke dus meer gerelateerd zijn aan elkaar. Het
varkensplasma in laantje 7 is het meest gelijkend met de stalen van Veos, die ook afkomstig zijn van
varken.
97,4 kDa
66,2 kDa
45,0 kDa
116,25 kDa
200,0 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
100 kDa
150 kDa
250 kDa
59
Troubleshooting
Op de gel zijn enkele gebreken zichtbaar, welke het resultaat negatief beïnvloeden:
Ongelijke breedte van de bandjes en schuine en gebroken bandenpatronen
Dit is te wijten aan een niet uniforme vorm van de slotjes, door luchtbellen of ontstane ongelijkheden
bij het verwijderen van het kammetje net voor het laden van de stelen voor de gelelektroforese.
Lichtgekleurde bandjes bij de Precision Plus Protein Standaard (laan 1)
De bovenste 3 laantjes zijn hier veel zwakker dan de onderste 3, dit is vermoedelijk te wijten aan de
CBB-kleuring die niet even sterk bindt aan elk eiwit. Aangezien dit zo is bij deze standaard, zal dit ook
het geval zijn bij de stalen, waardoor de resultaten een vertekend beeld kunnen geven.
Spots tussen laantjes (tussen laan 4 en 5; 5 en 6; 7 en 8; 8 en 9)
Dit fenomeen is het gevolg van het niet precies mikken van de pipet bij het laden van de stalen,
waardoor er een deel naast het slotje terecht komt. Dit komt sneller voor wanneer de slotjes niet lang
genoeg zijn, of er tussenschotten afgebroken werden bij het verwijderen van de kam.
Ijklijn
Met behulp van de moleculaire ladders (Precision Plus Protein Standard, laan 1 en HMW-standaard,
laan 10) kon er een ijklijn worden opgesteld. Deze ijklijn is weergegeven in onderstaande figuur.
Figuur 24: Iklijn SDS-PAGE gel aan de hand van moleculaire ladders waarbij het verband is weergegeven tussen de afgelegde afstand van de gescheiden eiwitten en de log van hun moleculaire gewichten, met
vermelding van de bekomen vergelijking en de waarde van R2.
Aan de hand van de bekomen vergelijking van deze standaardcurve, kunnen de moleculaire
gewichten geschat worden van de ongekende eiwitbanden van de stalen. Door omvorming van de
reactievergelijking kan het moleculair gewicht als volgt geschat worden:
y = -0,0967x + 2,4713 R² = 0,9748
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
0 2 4 6 8 10 12
Afs
tan
d (
cm)
Log (MM)
60
x = (y – 2,4713)/(-0,0967) met x = log(MM) en y = afstand (cm)
Wanneer dit toegepast wordt op laantje 4 van de gel, worden volgende waarden bekomen:
Figuur 25: Bandenpatroon plasmapoeder Veos bekomen met SDS-PAGE, 1 mg/ml geladen en gekleurd met CBB
Bij het vergelijken van deze bekomen waarden met de gegevens van de gekende plasmaproteïnen
(tabel 1), kan enkel het derde bandje met enige zekerheid benoemd worden met serum albumine, het
meest voorkomende plasma-eiwit met een moleculair gewicht van 66,8 kDa. De overige bandjes
komen niet overeen met een eiwit uit tabel 1. Een mogelijke reden hiervoor is dat vele eiwitten niet
exact volgens hun MM migreren. Posttranslationele modificaties zoals glycosylaties, onvolledige
denaturatie, … kunnen leiden tot beperkte afwijkingen op het verwachte migratiepatroon, wat
identificatie bemoeilijkt. Trypsinatie van uit gel geëlueerde eiwitten, gevolgd door MS/MS analyse kan
toegepast worden voor identificatie door vergelijking met gekende eiwitsequenties in databanken.
3.2.2 SDS-PAGE met SYPRO-Ruby kleuring
De eiwitprofielen van plasma, concentraat en poeder afkomstig van varkensbloed (Veos), werden
telkens in twee verschillende verdunningen geanalyseerd aan de hand van een SDS-PAGE gel
waarbij de eiwitbanden gekleurd werden met de fluorescente SYPRO Ruby kleuring. In tabel 12 staat
de volgorde weergegeven van de geladen stalen en standaarden, met vermelding van de verdunning.
2,4 cm x = (2,4 – 2,4713)/(-0,0967) = 2,24 MM = 173,5 kDa
5,7 cm x = (5,7 – 2,4713)/(-0,0967) = 1,92 MM = 83,2 kDa
6,7 cm x = (6,7 – 2,4713)/(-0,0967) = 1,82 MM = 66,6 kDa
7,9 cm x = (7,9 – 2,4713)/(-0,0967) = 1,71 MM = 51,0 kDa
61
Tabel 12: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor SDS-PAGE met vermelding van de verdunning; vb : 100 staat voor 100 keer verdund.
Verdunningsfactor Eindconcentratie
1 Mierikswortel peroxidase / 0,5 mg/ml
2 STI proteïne / 1 mg/ml
3 Candycane ladder / /
4 Plasma 200 0,32 mg/ml
5 Plasma 100 0,64 mg/ml
6 Concentraat 400 0,54 mg/ml
7 Concentraat 200 1,08 mg/ml
8 Poeder 2000 0,35 mg/ml
9 Poeder 1000 0,69 mg/ml
10 LMW-ladder / /
Het resultaat van de gel is weergegeven in figuur 26. Op deze figuur werden de gekende moleculaire
gewichten van de Candycane ladder (3de
laantje) en de LMW-ladder (10de
laantje) aangeduid
respectievelijk links en rechts naast de figuur (Figuur 26).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figuur 26: Resultaat SYPRO-Ruby kleuring op SDS-PAGE gel met diverse stalen en standaarden (tabel 12)
Bij de bandenpatronen van de stalen valt ook hier op dat deze sterk op elkaar gelijken. De variatie
tussen plasma, concentraat en poeder kan als verwaarloosbaar beschouwd worden, enkel het
verschil in concentraties is zichtbaar.
Vergelijking met SDS-PAGE gekleurd met CBB
Bij vergelijking van figuren 23 en 26 vallen er meerdere verschillen op, deze worden geïllustreerd door
de bandenpatronen van het plasmapoeder (Veos) naast elkaar te leggen (figuur 27).
97,4 kDa
66,2 kDa
45,0 kDa
31,0 kDa
97,0 kDa
82,0 kDa
66,0 kDa
42,0 kDa
29,0 kDa
62
Als referentiepunt wordt de sterkste band genomen, het serum albumine.
Deze band ligt bij de eerste gel verder, dit is te wijten aan het feit dat de
gelelektroforese hier langer werd gelopen en de eiwitten dus verder konden
migreren. Bovendien is het bandenpatroon gekleurd met CBB wat verder uit
elkaar gerokken, wat ook kan verklaard worden door een verschillende
elektroforeseduur of andere elektroforesecondities. Het hiernaast afgebeelde
laantje van de met SYPRO-Ruby gekleurde gel, werd geladen met 1000 x
verdund plasmapoeder, wat overeenkomt met een eiwitconcentratie van 0,69
mg/ml. Bovendien is het patroon van 2000 x verdund plasmapoeder (0,35
mg/ml) ook nog zeer duidelijk bij de SYPRO Ruby-kleuring. Dit wijst erop dat
de fluorescente kleuring een hogere detectie geeft dan de kleuring met CBB,
waar een concentratie van 1 mg/ml werd geladen. Er is ook een duidelijk
verschil in bandenpatroon merkbaar. Zo zijn er op het laantje bij de SYPRO
Ruby-kleuring meer eiwitbandjes gekleurd, terwijl er bij CBB slechts enkele
banden zichtbaar zijn, maar deze in verhouding wel sterker gekleurd zijn in
vergelijking met de analoge banden bij de SYPRO Ruby-kleuring.
3.2.3 IEF
Er werd, naast vergelijking van de eiwitprofielen op basis van verschil in moleculair gewicht, ook een
vergelijking gemaakt tussen de eiwitprofielen van de stalen op basis van het verschil in pI-waarde. Dit
laatste gebeurde door de eiwitten te scheiden m.b.v. IEF.
Eerste IEF; pH 3-9
De eerste gel die gebruikt werd bezit een lineaire pH-gradiënt van pH 3 tot 9. De stalen werden
geladen in het midden van de gel. De volgorde van de stalen en standaarden en hun geladen
concentratie zijn weergegeven in tabel 8.
Tabel 13: Volgorde van de stalen en standaarden IEF-gel met vermelding van de concentratie. Er werd telkens ongeveer 1 µl op de IEF-gel geladen.
Laantje Staal Concentratie
1 IEF standaarden “Broad Range”
pI 4,45-9,6 (BIO-RAD)
/
2 Varkensplasma Veos 25 mg/ml
3 Varkensplasma Sigma-Aldrich 25 mg/ml
4 BSA 10 mg/ml
5 Rundsplasma Sigma-Aldrich 25 mg/ml
6 Humaan plasma Sigma-Aldrich 25 mg/ml
7 Kippenplasma Sigma-Aldrich 25 mg/ml
Figuur 27: Vergelijking bandenpatroon plasmapoeder Veos op twee verschillende gels na SDS-PAGE; links 1 mg/ml geladen en gekleurd met CBB; rechts 1000 x verdund en gekleurd met SYPRO-Ruby
63
8 IEF standaarden “Broad Range”
pI 4,45-9,6 (BIO-RAD)
/
Deze gel werd gekleurd met coomassie briljant blauw R-250 (figuur 28, links). Er werd ook een tweede
IEF-gel gelopen met analoge positie van stalen en standaarden, deze gel werd eerst gekleurd met
PAS-kleuring, wat geen zichtbaar resultaat gaf. Vervolgens werd deze gel ook gekleurd met
coomassie briljant blauw R-250 (figuur 28, rechts). Op deze gel is de roze schijn, afkomstig van de
PAS-kleuring nog zichtbaar.
Bij de vergelijking van beide gels kan opnieuw opgemerkt worden dat de bandenpatronen over het
algemeen zeer analoog zijn, zoals verwacht werd. De banden bij de eerste gel (figuur 26, links) zijn
wel duidelijker te onderscheiden van de achtergrond. Voor de analyse van de scheiding m.b.v. IEF zal
er dus gekeken worden naar de eerste gel (figuur 29). De bandjes van de stalen zijn over het
algemeen niet sterk afgelijnd, wat wel het geval is bij de standaarden, maar vormen eerder een smeer.
Dit is mogelijks te wijten aan het feit dat er veel eiwitten een pI hebben dat dicht bij elkaar ligt.
Bovendien vormt het BSA (laan 4) ook een brede smeer, ook al gaat dit om een nagenoeg puur eiwit.
Dit kan onder andere te wijten zijn aan een verschillende graad van post-translationele modificaties.
Figuur 28: IEF-gels met pH 3-9, beiden gekleurd met CBB R-250. De rechtergel werd vooraf gekleurd met PAS-kleuring. De volgorde en concentraties van stalen en standaarden zijn weer te vinden in tabel 13
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
64
Wanneer er gekeken wordt naar het bandenpatroon van de standaarden (laan 1 en 8), blijkt hieruit dat
de pH-gradient niet lineair van 3 tot 9 loopt zoals verwacht en aangeduid staat links van figuur 27. Dit
kan te wijten zijn aan het zogenoemde plateau fenomeen (Finlayson & Chrambach, 1971) of aan een
kathodische drift (Righetti & Drysdale, 1971), twee fenomenen met beide een andere pH-gradiënt dan
verwacht als gevolg. De geladen standaarden konden dus ook niet met zekerheid worden benoemd,
de vermoedelijke toekenning van de gekende eiwitten is aangegeven rechts van de figuur. Het is
bijgevolg dus ook moeilijk om aan de eiwitbanden van de stalen een betrouwbare pI toe te kennen.
Hieruit volgt dat de eiwitten aanwezig in de stalen ook niet kunnen benoemd worden.
De stalen (laan 2,3, 5, 6 en 7) vertonen allen een bandenpatroon verspreid over de lengte van de gel,
al bezit het kippenplasma (laan 7) minder eiwitten met een lage pI. Bij laantje 2, 3, 5 en 6 is er
bovenaan de gel telkens een brede band zichtbaar die vermoedelijk het serum albumine is, aangezien
de BSA-standaard (laantje 4) hiermee ongeveer gelijk loopt. Bij het kippenplasma (laan 7) is er een
fijnere en duidelijker afgelijnde band zichtbaar, al loopt hier ook wel een smeer naar onderen. In dit
laantje is er ook nog een licht, fijn afgelijnd bandje te zien op de hoogte van ongeveer pH 5 wat niet
zichtbaar is bij de andere stalen. Deze zaken bewijzen dat het plasmaproteoom van gevogelte toch
duidelijk verschillend is dan dit van zoogdieren, en dat dit verschil kan aangetoond worden m.b.v. IEF.
1 2 3 4 5 6 7 8
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
Lentil lectine (7,8; 8,0; 8,2)
Humaan hemoglobine C (7,5)
Humaan hemoglobine A (7,1)
Koolzuuranhydrase mens (6,5)
Koolzuuranhydrase rund (6,0)
β-lactoglobuline B (5,1)
Equinemyoglobine (6,8; 7,0)
Fycocyanine (4,45; 4,65; 4,75)
Cytochroom C (9,6)
Figuur 29: Resultaat IEF met pH-gradiënt van pH 3 tot 9, gekleurd met CBB R-250, met links van de figuur aanduiding van de pH-gradiënt en rechts de aanduiding van de standaarden met
vermelding van de bijhorende pI-waarden. De volgorde en concentratie van de geladen stalen en standaarden is weergegeven in tabel 13.
65
Tweede IEF; pH 5-8
Er werd een volgende IEF uitgevoerd met een gel met een lineaire pH-gradiënt van pH 5 tot 8 (tabel
14).
Tabel 14: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor IEF met vermelding van de verdunning/concentratie
Laantje Staal Mate van verdunning/Concentratie
1 Plasma kip (Sigma-Aldrich) Onverdund
2 Plasma mens (Sigma-Aldrich) 2x verdund
3 Plasma varken (Sigma-Aldrich) 3x verdund
4 Plasma rund (Sigma-Aldrich) 4x verdund
5 BSA-standaard (Sigma-Aldrich) 10 mg/ml
6 IEF standaarden “Broad Range”
pI 4,45-9,6 (BIO-RAD)
/
De stalen (laan 1-4) werden zodanig verdund zodat de eiwitconcentratie ongeveer 25 mg/ml bedraagt.
Het resultaat van de IEF is te zien op figuur 30.
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
7,2
7,4
7,6
7,8
8,0
β-lactoglobuline B (5,1)
Koolzuuranhydrase rund (6,0)
Humaan hemoglobine C (7,5)
Lentil lectine (7,8; 8,0; 8,2)
Humaan hemoglobine A (7,1)
Koolzuuranhydrase mens (6,5)
Figuur 30: Resultaat IEF met pH-gradiënt van pH 5 tot 8, gekleurd met CBB R-250, met links van de figuur aanduiding van de pH-gradiënt en rechts de aanduiding van de standaarden met vermelding van de bijhorende pI-waarden. De volgorde en concentratie van de geladen stalen en standaarden is weergegeven in tabel 14.
66
Deze gel is in vergelijking met de vorige (figuur 28) duidelijker dankzij de sterker afgelijnde
bandenpatronen. Vooral bovenaan de gel zijn er hier bandjes zichtbaar die op de vorige gel niet
konden worden onderscheiden. Dit is te danken aan de kleinere range (pH 5-8 i.p.v. pH 3-9).
Op deze gel is bovendien de pH-gradiënt wel correct. De eiwitten van de ladder die hierdoor met
grotere zekerheid benoemd konden worden zijn op figuur 29 aangeduid met een groene lijn.
Volgende standaarden werden niet gedetecteerd:
Phycocyanine (4,45; 4,65; 4,75)
Dit is te wijten aan het feit dat de pI-waarden van dit eiwitten niet binnen de range liggen van
de gebruikte IEF-gel
Cytochroom C (9,6)
Ook dit eiwit is niet zichtbaar op de gel omdat de pI buiten de pH-range ligt.
Equine myoglobine (6,8; 7,0)
De reden waarom deze bandjes niet zichtbaar zijn is onduidelijk. Vermoedelijk liggen deze
tegen de bandjes van het hemoglobine aan of zijn deze te zwak gekleurd waardoor deze niet
te onderscheiden zijn van de achtergrond.
Er zijn ook enkele bandjes (aangeduid met rood, figuur 29) zichtbaar in de gebruikte ladder welke
hierin normaal gezien niet aanwezig zijn. Deze ladder bevat dus degradatieproducten van de
aanwezige standaarden of is gecontamineerd.
Uit de bekomen resultaten kan besloten worden dat SDS-PAGE de voorkeur geniet voor analyse van
de eiwitprofielen van plasma aangezien deze patronen duidelijker waren dan deze bekomen na IEF.
3.2.3.1 Bepaling gehalte glycoproteïnen m.b.v. combinatie van
fluorescente kleuringen: Pro-Q Emerald 300 en SYPRO-Ruby
De eerder besproken SDS-PAGE gel, gekleurd met de SYPRO-Ruby kleuring (3.1.2), werd eerder
reeds gekleurd met de Pro-Q Emerald 300 kleuring. Deze zorgt voor detectie van de glycoproteïnen
door enkel deze specifiek te kleuren. Bij het bekijken van de bandenpatronen van enerzijds de Pro-Q
Emerald 300 en anderzijds de SYPRO-Ruby zou vervolgens duidelijk moeten zijn welke eiwitten er
geglycosyleerd zijn en welke niet doordat de Pro-Q Emerald 300 kleuring enkel de glycoproteïnen
kleurt.
Figuur 31 geeft dezelfde gel weer met de twee fluorescente kleuringen.
67
Pro-Q Emerald 300 SYPRO Ruby
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figuur 31: SDS-PAGE gel gekleurd met Pro-Q Emerald 300 (links) en vervolgens met SYPRO Ruby (rechts) Zie tabel 12 voor de volgorde en geladen concentraties van de stalen en standaarden.
Bij vergelijking van de bandenpatronen valt op dat alle bandjes die gedetecteerd worden met de
SYPRO-Ruby kleuring, ook gekleurd werden door de Pro-Q Emerald 300. Meer zelfs, de Pro-Q
Emerald 300 kleuring detecteert meer banden dan de SYPRO-Ruby, wat wijst op een hogere
gevoeligheid. Hieruit kan niet besloten worden dat alle plasmaproteïnen gegelycosyleerd zijn, want
ook de niet-geglycosyleerde eiwitten die aanwezig zijn in de standaarden, werden gedetecteerd door
de Pro-Q Emerald kleuring. Bij deze detectie is er dus iets fout gelopen waardoor er geen conclusies
uit kunnen worden getrokken omtrent het al dan niet geglycosyleerd zijn van bepaalde plasma-eiwitten.
De gevoeligheid van de Pro-Q Emerald 300 kleuring heeft ook een negatieve keerzijde, er is namelijk
een sterke achtergrondvervuiling zichtbaar. Dit ondanks het feit dat er steeds met poedervrije
handschoenen werd gewerkt en het oppervlak van het GelDoc-toestel waar de gel op wordt geplaatst
voor de visualisatie, steeds voor en na gebruik gereinigd werd. Deze reiniging gebeurt met 70 %
ethanol, wat vermoedelijk dus niet al de kleurstof zal verwijderen. Er werden alternatieve reinigingen
uitgevoerd, jammer genoeg zonder resultaat. Ook het papier waarmee gereinigd wordt, geeft een
kleursignaal, en dus mogen hiervan ook geen resten achterblijven op de plaat. De handschoenen
zorgen tenslotte ook voor contaminatie, dit is met zekerheid te zeggen aangezien de gel op
onderstaande figuur eerst nagenoeg geen vlekken vertoonde, maar na contact met de gebruikte
handschoenen wel duidelijke vingerafdrukken vertoonde (figuur 32).
.
Figuur 32: SDS-PAGE gel gekleurd met Pro-Q Emerald 300 en sterk gecontamineerd na contact met handschoenen.
68
3.2.3.2 Bepaling gehalte glycoproteïnen m.b.v. combinatie van
colorimetrische kleuringen: PAS-kleuring en CBB R-250
Kleuring van de geglcosyleerde eiwitten met behulp van PAS is niet geslaagd. Er waren namelijk geen
bandjes zichtbaar na de kleuring, ook niet bij de standaarden. Dit zowel bij gels na SDS-PAGE als
IEF-gels. Bijgevolg konden er dus ook hier geen conclusies worden getrokken door beide kleuringen
op eenzelfde gel te vergelijken.
3.3 Lectinekolom ConA
In dit experiment werd getracht een methode op punt te stellen om de plasma-eiwitten te scheiden in
een geglycosyleerde en een niet-geglycosyleerde fractie met behulp van affiniteitschromatografie,
meerbepaald met een lectinekolom bestaande uit geïmmobiliseerd ConA. Dit lectine heeft een
specificiteit voor N-glycanen en bindt dus aan de meeste glycoproteïnen.
Er werd een lectinekolom met een bedvolume van 1 ml bereid volgens de methode beschreven in
2.3.3. Er worden drie uitgevoerde experimenten besproken. Deze worden benoemd naargelang de
samenstelling van de stalen of standaarden die op de kolom werden geladen.
5 mg BSA en 5 mg ovalbumine, opgelost in 1 ml equilibratiebuffer
Er werd gekozen voor BSA en ovalbumine omdat BSA normaal gezien een niet geglycosyleerd eiwit is,
en ovalbumine wel. Ovalbumine zou dus tegengehouden moeten worden door de ConA-kolom,
aangezien het om een N-geglycosyleerd eiwit gaat. Bovendien zijn dit beide plasma-eiwitten,
weliswaar van een verschillende bron; respectievelijk rund en kip.
Na het laden van het staal werd de kolom gewassen met 10 ml equilibratiebuffer en tenslotte werd er
20 ml elutiebuffer geladen om de glycoproteïnen die werden weerhouden door de kolom te elueren.
Dit gebeurde telkens in stappen van 5 ml. De fracties van de flow-through (niet gebonden fractie
tijdens het laden van het staal), het wassen en de elutie werden opgevangen en het eiwitgehalte werd
geschat door de absorbantie te meten bij een golflengte van 280 nm, zoals uitgelegd in 2.6. Met deze
gegevens kon een chromatogram werden opgesteld. Voor de berekening van de eiwitconcentratie,
vertrekkende van de absorbantie bij 280 nm, werd er vermenigvuldigd met factor 1,45. Aangezien er
met een eiwitmengsel werd gewerkt, kon de molaire extinctiecoëfficiënt hiervoor namelijk niet gebruikt
worden en werd de factor 1,45 gebruikt als alternatieve waarde.
Het bekomen chromatogram is weergegeven in onderstaande figuur.
69
Figuur 33: Chromatogram van ConA-kolom na lading van 5 mg BSA en 5 mg ovalbumine. Per fractie werd ongeveer 1 ml opgevangen. De eerste twee fracties zijn flow-through (FT); fractie 3 tot 13 zijn het wassen
(W) van de kolom en de overige fracties zijn de elutie (E).
Er zijn twee pieken duidelijk te onderscheiden, de eerste piek is beduidend groter dan de tweede piek.
Dit wijst er op dat er veel meer eiwitten werden doorgelaten door de kolom dan er werden weerhouden.
Nochtans werd er evenveel ovalbumine als BSA geladen (5 mg van beide). Dit betekent daarom niet
dat er slechts een klein gehalte van de eiwitten geglycosyleerd was. Meer waarschijnlijk is dat de
kolom verzadigd was en er dus glycoproteïnen door de kolom zijn gelopen tijdens het laden en het
wassen van de kolom omdat deze niet meer konden binden aan het ConA-lectine.
Om te achterhalen wat de eiwitsamenstelling is van de fracties ter hoogte van de pieken, werden de
eerste 4 fracties – deze bevatten de flow-through en de eerste drie wasfracties- en de eerste drie
elutiefracties – deze komen overeen met de tweede piek - op een SDS-PAGE gel geladen en
gekleurd met CBB R-250. Onderstaande tabel geeft de volgorde weer van de stalen en standaarden.
Het resultaat is weergegeven in figuur 34.
Tabel 15: Volgorde van stalen en standaarden geladen op gel voor SDS-PAGE met vermelding van de concentratie (mg/ml).
Staal of standaard Concentratie eiwit geladen
1 Precision Plus Protein standaard (onverdund)
2 Fractie 2 – flow-through 1 mg/ml
3 Fractie 3 – wassen 1 mg/ml
4 Fractie 4 – wassen 1 mg/ml
5 Fractie 5 – wassen 1 mg/ml
6 Fractie 14 – elutie 0,09 mg/ml
7 Fractie 15 – elutie 0,17 mg/ml
8 Fractie 16 – elutie 0,08 mg/ml
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 5 10 15 20 25 30 35
Co
nce
ntr
atie
eiw
it (
mg/
ml)
Fractie
FT W E
70
9 BSA 0,5 mg/ml
10 Ovalbumine 1 mg/ml
De fracties met een eiwitconcentratie groter dan 1 mg/ml werden verdund zodanig dat de concentratie
1 mg/ml bedroeg. De fracties met een lagere eiwitconcentratie werden onverdund op de gel geladen.
Op de gel is duidelijk zichtbaar dat fracties 2 tot 5 (laan 2 tot 5: laden + wasen) zowel ovalbumine als
een groot gehalte BSA bevatten. De volgende twee laantjes (fractie 14 en 15: elutie) bevatten ook
beide eiwitten, maar de proportie van BSA is wel relatief kleiner. Laan 8 (fractie 16: elutie) tenslotte
lijkt enkel ovalbumine te bevatten, of bevat een zodanig laag gehalte BSA dat dit niet detecteerbaar is
met de gebruikte methode. Dit wijst er op dat zowel BSA als ovalbumine weerhouden zijn de kolom en
vervolgens werden geëlueerd met slechts een heel beperkte aanrijking van ovalbumine in de
elutiefracties. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat het BSA (deels) geglycosyleerd kan zijn.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figuur 34: SDS-PAGE gel gekleurd met CBB, volgorde en concentratie van geladen stalen en standaarden zijn vermeld in tabel 15.
0,5 mg ovalbumine opgelost in 5 ml equilibratiebuffer
Bij deze scheiding werd er enkel geglycosyleerd eiwit geladen en een 10x kleinere hoeveelheid met
de bedoeling dat de kolom niet verzadigd zou geraken. Vervolgens werd de kolom gewassen met 10
ml equilibratiebuffer en geëlueerd met 10 ml elutiebuffer. Wanneer al het eiwit zou weerhouden
kunnen worden door de kolom, zou er geen eerste piek zichtbaar zijn bij de flow-through en het
wassen van de kolom maar enkel bij de elutie.
Op het chromatogram (onderstaande figuur) zijn opnieuw twee pieken te onderscheiden, maar de
pieken zijn veel kleiner dan bij de vorige scheiding. Er zijn ook sterke schommelingen in concentratie
zichtbaar, waardoor de pieken ook veel minder uitgesproken zijn. Vanwege negatieve waarden bij het
meten van de absorbantie, gaat de grafiek bovendien tussen de twee pieken onder het nulpunt, wat in
71
realiteit onmogelijk is. Deze zaken wijzen op een grote foutmarge. Bovendien is op het einde van de
metingen nog niet al het eiwit geëlueerd. Er zou dus langer geëlueerd moeten worden.
Figuur 35: Chromatogram van ConA-kolom na lading van 0,5 mg ovalbumine. Per fractie werd ongeveer 1 ml opgevangen. De eerste vijf fracties zijn flow-through (FT); fractie 6 tot 16 zijn het wassen (W) van de
kolom en de overige fracties zijn de elutie (E).
Uit deze resultaten blijkt duidelijk dat de kwaliteit van de kolom bij hergebruik sterk achteruit gaat, ook
al werd deze bewaard zoals werd voorgeschreven, namelijk bij 4 °C in een oplossing van 20 %
ethanol in equilibratiebuffer. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat de capacitiet van de kolom is
afgenomen en de kolom dus sneller verzadigd was. Dit kan vermoedelijk te wijten zijn aan de
ouderdom van de kolom, slijtage door het eerder gebruik of door aantasting van de ConA door de
buffers en de 20 % ethanol waarin de kolom werd bewaard tussen de analyses.
Een belangrijke opmerking is dat de chromatogrammen gebaseerd zijn op eiwitconcentraties, welke
berekend worden uit de absorbanties bij 280 nm. De blanco waar automatisch (door de
absorbantiemeter) mee rekening werd gehouden, bestaat eerst uit equilibratiebuffer en vanaf de elutie
uit elutiebuffer. Ook al werd er niet met gradiëntelutie gewerkt, toch zal er een overgangsfase zijn
tussen het wassen en elueren van de kolom waarbij er fracties zijn waarvan het oplosmiddel bestaat
uit een mengsel van beide buffers. Aangezien er een verschil in absorbantie bestaat tussen beide
buffers, zorgt dit voor afwijkende resultaten. Dit zou dus de negatieve waarden kunnen verklaren.
Aangezien er enkel met ovalbumine werd gewerkt en niet met een eiwitmengsel, konden de
eiwitgehaltes van de opgevangen fracties voor dit experiment wel berekend worden m.b.v. de molaire
extinctiecoëfficiënt van ovalbumine.
De oorspronkelijke kolom met een volume van 1 ml werd hierna uitgebreid met ongeveer 2 ml, waarna
de kolom een totaalvolume heeft van ongeveer 3 ml. Dit met als doel om de capaciteit van de kolom te
doen toenemen.
-0,02
-0,01
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0 5 10 15 20 25 30
Co
nce
ntr
atie
(m
g/m
l)
Fractie
FT W E
72
2 mg ovalbumine opgelost in 2 ml equilibratiebuffer.
Na het laden van het staal werd de kolom gewassen met 10 ml equilibratiebuffer en vervolgens
geëlueerd met 20 ml elutiebuffer. Op het chromatogram, figuur 33, zijn er weer twee pieken zichtbaar,
bovendien is de tweede piek nu groter. Dit wijst er op dat de kolomcapaciteit inderdaad is toegenomen
dankzij de uitbreiding van de kolom. De eerste piek wijst er wel op dat er opnieuw eiwitten door de
kolom gelopen zijn die dus niet werden weerhouden, ook al werd er enkel geglycosyleerd eiwit
geladen. Dit is niet zo verwonderlijk aangezien er vier keer zoveel eiwit werd geladen terwijl de kolom
slechts drie keer vergroot is in volume, en bij de vorige scheiding ook niet al het eiwit werd
weerhouden.
Figuur 36: Chromatogram van ConA-kolom na lading van 2 mg ovalbumine. Per fractie werd ongeveer 1 ml opgevangen. De eerste twee fracties zijn flow-through (FT); fractie 3 tot 13 zijn het wassen (W) van de
kolom en de overige fracties zijn de elutie (E).
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Co
nce
ntr
atie
eiw
it (
mg/
ml)
Fractie
FT W E
73
Conclusie
De eiwitgehalten van het varkensplasma en -concentraat verkregen van Veos konden volgens de BIO-
RAD DC eiwitanalyse bepaald worden en bedragen respectievelijk 64 mg/ml (6,4 %) en 217 mg/ml
(21,7 %). De resultaten van het plasmapoeder waren zeer variabel. Volgens de productfiche van Veos
bestaat dit poeder voor 69 % uit eiwit. Voor de plasmastalen van Sigma-Aldrich werden eiwitgehaltes
bekomen van 56 mg/ml (5,6 %), 107 mg/ml (10,7 %), 115 mg/ml (11,5 %) en 30 mg/ml (3,0 %) voor
respectievelijk humaan, varkens-, runds- en kippenplasma. Er blijkt dus toch een verschil te zijn
tussen het varkensplasma van Veos en dit van Sigma-Aldrich, buiten het feit dat er bij Sigma-Aldrich
ook een anti-stollingsmiddel (trisodium citraat) werd toegevoegd, terwijl er bij Veos geen additieven
werden toegevoegd.
De eiwitprofilering van de verschillende stalen gebeurde door detectie van de proteïnen, na scheiden
van de eiwitten m.b.v. SDS-PAGE en IEF. De beste resultaten werden bekomen met SDS-PAGE.
Hierbij blijkt de detectie met de fluorescente kleuring SYPRO-Ruby betere resultaten te geven t.o.v.
coomassie briljant blauw R-250 vanwege de hogere gevoeligheid. Voor detectie van de
glycoproteïnen zou de combinatie van deze kleuring met de Pro-Q Emerald 300 ideaal moeten zijn
aangezien het om twee precieze fluorescente kleuringen gaat, al konden hier nog geen correcte
resultaten mee worden bekomen. De resultaten van de standaarden kwamen hierbij namelijk niet
overeen met de verwachtingen. Een bijkomend voordeel van de fluorescente kleuringen is dat de
resultaten via het GelDoc toestel hiervan eenvoudig verwerkt kunnen worden aan de hand van de
hiervoor ontwikkelde software, namelijk het programma “Imagelab”. Dit biedt tal van mogelijkheden
zoals bijvoorbeeld bepaling van de verhouding glycoproteïnen tot het volledig proteoom, aan de hand
van de fluorimetrische signaalsterktes van de eiwitbanden, welke densitometrische vergelijking van de
bandenpatronen toelaat.
De scheiding met behulp van lectinekolommen dient nog verder geoptimaliseerd te worden. Dit kan
door gebruik te maken van meerdere lectines. Deze kunnen dan samengebracht worden in een
gemengde kolom, of er kunnen kolommen van verschillende lectines in serie geplaatst worden,
waarbij de niet weerhouden eiwitten telkens door een volgende kolom kunnen worden gestuurd. Op
deze manier worden de eiwitten niet enkel opgedeeld in wel en niet geglycosyleerd, maar ook op
basis van welk eiwit aan welk lectine bindt. Elk lectine heeft namelijk een andere specificiteit. De
combinatie van de lectinen ConA, tarwekiem agglutinine (WGA) en jacaline (JAC) bleken het meest
geschikt voor scheiding van plasmaproteïnen vanwege de combinatie van de affiniteit voor
respectievelijk N-glycanen, GlcNAc en O-gebonden glycoproteïnen (Kullolli et al., 2008; Yang &
Hancock, 2004;Tachibana et al., 2005).
74
De efficiënte van de scheiding met één of meerdere, al dan niet gemengde lectinekolommen kan
gecontroleerd worden door de eiwitsamenstelling van verscheidene fracties te analyseren m.b.v. SDS-
PAGE, waarbij de gel gekleurd kan worden met de fluorescente Pro-Q Emerald 300 en SYPRO-Ruby
kleuring. Wanneer de scheiding geslaagd is zouden bij de fracties van de flow-through en het wassen
van de kolom enkel eiwitbandjes zichtbaar mogen zijn met de SYPRO-Ruby kleuring, en bij de fracties
van de elutie zouden al de aanwezige eiwitten geglycosyleerd moeten zijn en bijgevolg dus oplichten
met de Pro-Q Emerald 300 kleuring.
75
Referenties
Ayoubi T. A. & Van De Ven W. J. (1996) Regulation of gene expression by alternative promoters.
FASEB Journal, 10(4), p 453-60.
Amersham Biosciences (1998) Guide to Isoelectric Focusing.
Berggren, K., Chernokalskaya E., Steinberg T. H., Kemper C., Lopez M. F., Diwu Z., Haugland R. P. &
Patton W. F. (2000) Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional
sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis,
21, p 2509-2521.
Bradford, M. M. (1976). "Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding". Analytical Biochemistry 72: 248–254.
Cummings R. D. & Etzler M. E. (2009) Antibodies and lectins in glycan analysis. Essentials of
Glycobiology, 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Blaber M. (1998) Lecture 32: Protein Purification: Running the Experiment, Resolving Peaks.
Geraadpleegd op 6 februari, 2015 van http://www.mikeblaber.org/oldwine/bch5425/lect32/lect32.htm.
Burda P. & Aebi M. (1999) The dolichol pathway of N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta.
1426, 239-57.
Dean L. (2005) Blood Groups and Red Cell Antigens. National Center for Biotechnology Information
(US). Geraadpleegd via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2263/ op 5 maart 2015
Demchenko A. P. (2011) Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology III, Applications
in Sensing and Imaging. Springer Series on Fluorescence 10(1).
Dell A. & Morris H. R. (2001) Glycoprotein structure determination by mass spectrometry. Science.
291, 2351-6.
Dempski R. E., & Imperiali B. (2002) Oligosaccharyl transferase: Gatekeeper to the secretory pathway.
Curr Opin Chem Biol. 6, 844-50.
Dyballa N. & Metzger S. (2009) Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in
Polyacrylamide Gels. Journal of Visualized Experiments (30), 1431.
Edelman GM, Cunningham BA, Reede GN, Becher JW, Waxdal MJ, Wang JL (1972) The covalent
and three-dimensional structure of concanavalin A. Proc Natl Acad Sci USA 69:2580–2584
Finlayson G. R. & A. Chrambach A. (1971) Isoelectric focusing in polyacrylamide gel and its
preparative application. Analytical Biochemistry 40(2), 292-311
76
Fraeyman N.F., Dello C.D. & Belpaire F.M. (1988) Alpha 1-acid glycoprotein concentration and
molecular heterogeneity: relationship to oxprenolol binding in serum from healthy volunteers and
patients with lung carcinoma or cirrhosis. British Journal of clinical pharmacology Jun;25(6):733-40
GE lifesciences (2007) Con A Sepharose 4B. Affinity Chromatography
Gemmill T. R. & Trimble R. B. (1999) Overview of N- and O-linked oligosaccharide structures found in
various yeast species. Biochim Biophys Acta. 1426, 227-37.
Hardman, K.D., Ainsworth, C.F. (1972) Structure of concanavalin A at 2.4-A resolution. Biochemistry,
11, 4910-4919
Hirabayashi J. (2008) Concept, strategy and realization of lectin-based glycan profiling. J Biochem.
144(2), 139-47
Hsieh, S. Y., Chen R. K., Pan Y. H. & Lee H. L. (2006), Systematical evaluation of the effects of
sample collection procedures on low-molecular-weight serum/plasma proteome profiling. Proteomics,
6: 3189–3198. doi: 10.1002/pmic.200500535
Jensen O. N. (2004) Modification-specific proteomics: Characterization of post-translational
modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 8, 33-41.
Kapitany R. A., Zebrowski E. J. (1973) A high resolution PAS stain for polyacrylamide gel
electrophoresis. Analytical biochemistry.
Kulloli M., Hancock W. S. & Hincapie M. (2008) Preparation of a high-performance multi-lectin affinity
chromatography (HP-M-LAC) adsorbent for the analysis of human plasma glycoproteïns. Journal of
Separation Science. 31, 2733-2739.
Lamarre-Vincent N. & Hsieh-Wilson L. C. (2003) Dynamic glycosylation of the transcription factor
CREB: A potential role in gene regulation. J Am Chem Soc. 125, 6612-3.
Lechner J. & Wieland F. (1989) Structure and biosynthesis of prokaryotic glycoproteins. Annu Rev
Biochem. 58, 173-94.
Lundblad R. (2003) Considerations for the use of blood plasma and serum for proteomic analysis. The
Internet Journal of Genomics and Proteomics. Vol 1, nr 2.
Luque-Garcia J.L., Neubert T. A. (2007) Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker
identification by mass spectrometry. Journal of chromatography. 1153(1-2):259-76.
Messner P. (1997) Bacterial glycoproteins. Glycoconj J. 14, 3-11.
Mehta-D'souza P. (2012) Detection of glycoproteins in polyacrylamide gels using Pro-Q Emerald 300
dye, a fluorescent periodate Schiff-base stain. Methods in molecular biology. 869:561-6.
77
Pan S., Chen R., Aebersold R. & Brentnall T. A. (2011) Mass spectrometry based glycoproteomics
from a proteomics perspective. Molecular Cell Proteomics. 10.
Righetti P. & Drysdale J. W. (1971) Isoelectric focusing in polyacrylamide gels. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure 236(1), 17-28.
Roth J. (2002) Protein N-glycosylation along the secretory pathway: Relationship to organelle
topography and function, protein quality control, and cell interactions. 102, 285-303.
Rudd P. M. & Dwek R. A. (1997) Glycosylation: Heterogeneity and the 3D structure of proteins.
Biochemistry and Molecular Biology. 32, 1-100.
Soper A. S. & Aird S. D. (2007) Elution of tightly bound solutes from concanavalin A Sepharose
Factors affecting the desorption of cottonmouth venom glycoproteins. Journal of Chromatography
1154(1-2) p 308-318.
Spiro R. G. (2002) Protein glycosylation: Nature, distribution, enzymatic formation, and disease
implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12, 43R-56R.
Tachibana K., Sachiko Nakamura S., Wang H., Iwasaki H., Tachibana K., Maebara K., Cheng L.,
Hirabayashi J. & Narimatsu H. (2005) Elucidation of binding specificity of Jacalin toward O-
glycosylated peptides: quantitative analysis by frontal affinity chromatography. Oxford Journals Vol
16(1) p. 46-53.
Tal M., Silberstein A. & Nusser E. (1985) Why does Coomassie Brilliant Blue R interact differently with
different proteins? A partial answer. Journal of Biological Chemistry.
Thermo Fisher Scientific (2015) Protein gel stains. Geraadpleegd op 15 maart, 2015 van
https://www.lifetechnologies.com/be/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-
center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/protein-gel-stains.html
Thermo Fisher Scientific (2015) Overview of Post-Translational Modifications (PTMs). Geraadpleegd
op 12 maart, 2015 van https://www.thermofisher.com/be/en/home/life-science/protein-biology/protein-
biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-post-
translational-modification.html.
Trombetta E. S. (2003) The contribution of N-glycans and their processing in the endoplasmic
reticulum to glycoprotein biosynthesis. Glycobiology. 13, 77R-91R.
Tuck M. K., Chan D. W., Chia D., Godwin A. K., Grizzle W. E., Krueger K. E., Rom W., Sanda M.,
Sorbara L., Stass S., Wang W., Brenner D. E. (2009) Standard operating procedures for serum and
plasma collection: early detection research network consensus statement standard operating
procedure integration working group. Journal of Proteome Results. 8, p 113–117.
78
Van-Seuningen I. & Davril M. (1992) A rapid periodic acid-Schiff staining procedure for the detection of
glycoproteins using the phastsystem.
Varki A., Cummings R. D., Esko J. D., Freeze H. H., Stanley P., Bertozzi C. R., Hart G. W., Etzler M.
E., (2009) Essentials of Glycobiology. 2nd edition (45).
Wormald M. R., Petrescu A. J., Pao Y. L., Glithero A., Elliott T. & Dwek R. A. (2002) Conformational
studies of oligosaccharides and glycopeptides: Complementarity of NMR, X-ray crystallography, and
molecular modelling. Chem Reviews (102), p 371-86.
Wako Pure Chemical Industries (2013) Polysaccharide Staining. Pathology Research G-2. p 16.
Walsh C. (2006) Posttranslational modification of proteins : Expanding nature's inventory. Englewood,
Colo.: Roberts and Co. Publishers. xxi, p 490.
WHO. (2002) Use of anticoagulants in diagnostic laboratory investigations. Stability of blood, plasma
and serum samples.
Xu W, Chen L. & Shao R. (2014) Influence of glycation of plasma proteins in diabetes on the binding
interaction with polyphenols. Curr Drug Metab. 15(1), p116-9.
Zini R., Riant P., Barré J. & Tillement J. (1990) Disease-Induced Variations in Plasma Protein Levels
Implications for Drug Dosage Regimens (Part I). Clinical Pharmacokinetics. Volume 19(2), p 147-159.
79
Bijlagen
Productinformatie plasmapoeder Vepro ......................................... Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd.
Protocol SYPRO Ruby .......................................................................................................................... 81
Protocol PAS-kleuring .................................................................... Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd.
Protocol Pro-Q Emerald 300 ........................................................ Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd.1