o Strategie: Verwijderen tumor, tumorcellen transfecteren en terug toedienen, behandeling met gancyclovirtrifosfaat (om DNA polymerase te inhiberen)

o Chemoprotectie In gezonde cellen genen aanbrengen waardoor ze bestand zijn tegen

chemotherapieo Tumorsuppresiegen

Vervang verloren gegaan gen

Forensische geneticaForensisch DNA onderzoek

Sporen: bloed, speeksel, sperma, haren Het DNA-onderzoek in één van de acht erkende en geaccrediteerde forensische

DNAlaboratoria in BelgieStappen

1. Sporenonderzoek en oriëntatietesten Groepen sporen

1. Lichaamsvloeistoffen: sperma, bloed, speeksel 2. Haren 3. Biologische contactsporen (huid onder nagels bij verdedigen) 4. Lichaamsvloeistoffen als vaginale secretie en zweet

2. DNA-isolatie DNA isolatie biologische sporen & referentiestalen gescheiden (2 laboranten)

Isolatie mbv. Silica membraan (bindt – geladen molecule Isolatie mbv. Proteïnase K (detergent = cellyse spermacellen)

3. DNA kwantificatie Bepaling concentratie met real-time PCR

Taqman probes Quantificatie nucleair DNA

4. PCR DNA-merkers en analyse Eigenschappen DNA onderzoeken op erfelijke merkers

STR (short tandem repeats PCR + Gelelectroforese genotypes bepalen voor 16 STR’s PCR + capillaire elektroforese

mtDNA: HV1 en HV2 hoog variabele regio’s op mitochondriaan DNA informative over 600-700 basen Sanger sequencing Wanneer mtDNA boven nuclair DNA?

Oude stalen Haren zonder wortel Voorouder afstammeling relatie onderzoeken

Nadelen mtDNA Bij match zijn alle maternale verwanten niet uit te sluiten = Kleine discriminatiekracht Groot gevaar voor contaminatie Omslachtig en arbeidsintensief

5. Interpreteren Vergelijken sporenprofielen en referentieprofielen Zuivere profielen

Alles komt wel of niet overseen Mengprofielen LOD score bepalen

6. Rapportering

7. Statische evaluatie

Toekomst gerechtelijk DNA onderzoekY-STR’s bepalen met hoge mutatiesnelheden

Om zo onderscheid te kunnen maken tussen mannelijke verwantenVoorspelling fenotype

Iriskleur: 37SNP’s Haarkleur: 46 SNP’s Lichaamslengte: 54 SNP’s Gezichtsvorm, kaalheid, haarmorfologie (5 genen)

Complexe geneticaMonogene ziektebeelden zeldzaam, meeste multifactorieel = meerdere genen = moeilijk bestuderenIs de eigenschap familiaal?

In familie vaak voorkomen van ziekte λ=familialiteit

λ= kansop ziekte∈familie (stamboom )kans opziekte∈gehele populatie

meest gebruikt is λs = λ siblings (broers/zussen), vaak hoog door genetische component maar ook door omgeving Familiaal is niet gelijk aan genetisch

Tweelingstudies veel onderzoek naar complexe ziekten mbv. Tweelingstudies

o vergelijking monozygoten en dizygoten hoe groter verschil concordantiegraad (tussen 0 en 1) (in hoeveel van totaal aantal tweelingen de ziekte in alletwee aanwezig is) hoe groter kans genetisch

concordantie = h2

o h2=VgVp

as

Vg = variantie door genen Vp= totale variantie Ve = variantie door omgeving

Beperkingen tweelingstudieso Omgeving MZ tweelingen kan meer gelijk zijn dan DZ tweelingen

Oplossing: Tweelingen die bij geboorte gescheiden zijno Intra-uteriene omstandigheden altijd gelijk studies naar invloed hormonen

prenataal is niet te onderzoekenAdoptiestudies2 manieren van aanpak

Individuen met ziekte bestudeer kinderen beschermt adoptie van de ziekte? Geadopteerde mensen met een ziekte in de familie is de ziekte familial?

Limitaties Gebrek aan informatie biologische ouders Privacy Selectieve plaatsing: agency kiest vaak plaats die qua omgeving gelijkaardig is

h2=VgVp

=2 (Cmz−Cdz )

Theoretische benadering1918: Fischer: Complexe eigenschappen als lengte en postuur worden door meerdere mendeliaanse factoren (genen) overgeërfd.Huidig: Na verschillende genoomwijde associatiestudies is dit bevestigd

Vb. Lichaamslengte o 80-90% heritabiliteit (grootste & kleinste verschilt 27 cm…) kleine bijdrage geneno 200 allelen betrokken

o Invloed van 1 SNP maar beperkt Discontinue kenmerken

o Ziekte is aan of afwezig Vatbaarheidsdistributie (liability) is normaal verdeeld raar bij discontinu Er is een vatbaarheidsdrempel (een natuurlijke drempel op een continu

variabel proces) meer aangetaste genen = ziek, minder is niet ziek Drempel kan verschillen voor mannen en vrouwen

Herhalingsrisico voor multifactoriële ziektenNiet zo makkelijk als voor monogene ziekten

Gebaseerd op empirische gegevens (stambomen) Herhalingsrisico’s variëren per populatie

o Verschil in genfrequentieso Verschil in omgevingsfactoren

Kenmerken herhalingsrisico1. HR neemt toe wanneer meer dan 1 familielid is aangetast2. HR neemt toe wanneer er een ernstigere variant aanwezig is

Ernstiger aangetast meer extreem gelegen op de vatbaarheidscurve3. HR is afhankelijk van het geslacht van de proband

Aangetast individu van minder vatbare geslacht ligt meer extreem op vatbaarheidscurve (meer zieke genen nodig voor ziekte)

4. HR vermindert sneller bij minder verwante familieleden Monogeen: 50% 1e graad, 25% 2e graad, 12,5% 3e graad Bij complexe ziekten daalt dit veel sneller

o Meerdere genen en omgevingsfactoren nodig5. De incidentie in eerstegraads verwanten is de vierkantswortel van de incidentie in de hele

populatie Vb. populatie incidentie = 1/100

incidentie eerste graad is 1/10Voorbeeld: Pylorische stenose

Sympotomeno Kort na geboorte:

Braken Constipatie Gewichtsverlies

o Oorzaak: vernauwing maaguitgang Incidentie

o 1/200 jongenso 1/1000 meisjes

HR hoger wanneer aangetaste kind meisje is

o Meerdere ziektegenen aanwezigo Wanneer tweede kind jongetje is,

nog hogere kans omdat er zoveel ziektegenen aanwezig zijn

o Moeder aangetast: kans op aangetast kind groter

Congenitale malformaties 1/50 geboortes Multifactorieel Voorbeeld: Neuraalbuis defecten

o Soorten Spina bifida Anencephalie Encefalocoele

o Incidentie 1-3/1000o Voorkomen door extra foliumzuur in

te nemen 50%

Identificatie genen multifactoriële aandoeningen

Associatiestudieso Verzamel groep patiënten en groep

controles

o Analyseer merkerso Test associatie (chi-kwadraat test) tussen merker en ziekteo Hele genoom testen?

Nee, ivm Linkage Disequilibrium ook merkers rondom het geassocieerde gen kunnen significant verband opleveren

Linkage Disequilibrium

o o

o Genotypes nabijgelegen SNP’s gecorreleerd door LDo SNP tagging

Bapalen van SNP genotypes aan de hand van nabijgelegen SNP’s =haplotype tagging Tag SNP’s al bepaald over heel

genoom = HapMap project

1e een A, dan daarna C, 2e een T, dan daarvoor A en erna G enz

Genoomwijdte Associatie studies GWASo Over hele genoom 500.000 SNP’s

verdeeld Volautomatisch – kits

meegeleverd edo Vroeger: uitgaande van vorige hypothese andere onderzoeker op zoek gaan in die

regioo Nadelen

Onderscheiden echte signalen tov vals positieven Multiple testing correctie Significante associatie dient bevestigd te worden in tweede

populatie Enkel frequente varianten

Missing Heritabilityo GWAS onderzoekt alleen frequente varianten met kleine bijdrage aan de ziekteo LOD zoekt niet frequente varianten met grote bijdrage aan ziekte (100%)

Lage allelfrequentie moeilijk te testen

OncogeneticaBehouden van genomische integriteitDagelijkse blootstelling aan schadelijke stoffen niet iedereen krijgt kanker herstelmechanismenOorzaken verlies integriteit

Foutenlast DNA replicatieo DNA polymerase maakt fouten

Bezit wel proofreading (controlemechanisme)o DNA mismatch herstel mist fouteno Gezamelijke foutenlast 1/109 nucleotiden

Endogene dreigingo Hydrolyseren van baseno Deaminatieso Oxidatieve reactieso Reactieve componenten vormen binding met DNAo Endogene defensielinie niet voldoende bescherming

Superoxide dismutase Katalase Glutathionperoxidase

Exogene mutageneno Straling (UV, ioniserende X stralen)o Chemisch

Alkylerende agantia Polycyclische aromatische koolwaterstoffen covalente binding DNA vorming DNA adducten

Gevolgen DNA schade DNA leasie transcriptionele blokkade herstelsysteem: transcriptional coupled repair

niet opgelost activatie p53 apoptose

Instabiliteit van nucleotidensequentie en kanker Veranderingen/mutaties opsporen mbv. Sequencing

o Sanger sequencing Max 500 nucleotiden

o NGS Mismatch Repair Mechanismen (MMR)

o 2 fouten DNA polymerase: verkeerde base, verkeerd aantal baseno Microsatellieten

Korte herhalende sequenties (herhaling 1nt-2nt of complex patroon) Over heel genoom verspreid Functie onbekend Zorgen voor stutter bij DNA polymerase verhoogde kans op fouten MMR nodig voor herstel Microsatellietinstabiliteit belangrijke merker voor defecten MMR bij kanker Vb. Lynch syndroom

Hoog risico op vroegtijdige kanker (colon, rectum, maag, ovaria) Veel microsatellietinstabiliteit ontdekt

o Inactiverende mutaties MMR gevonden Base Exisie Repair (BER)

o Endogene DNA schade (geen helix schade)o Vb. MUTYH geassocieerde Polyposis

Autosomaal recessief Ontwikkeling benigne poliepen colon hoge kans op maligne tumoren MUTYH

Codeert een DNA glycosylase GC TA inversies Klinisch: vaak compound heterozygoot (2 verschillende mutaties op 2 allelen)

Minder ernstig dan FAP Nucleotide Exision Repair (NER)

o Herstellen multipele laesies aan 1 enkele DNA streng tgv. Exogene oorzakeno Geassocieerde aandoeningen

Xeroderma Pigmentosum Syndroom van Cockayne Trichothiodystrofie allen gekenmerkt door overgevoeligheid aan zonlicht

Vorming huidtumoren op jonge leeftijd

Dubbelstreng DNA breuken en ontstaan van translocaties in kanker2 types chromosomale translocaties

Specifieke structurele herstellingeno Frequento Essentieel voor ontwikkeling neoplasmen

Willekeurige chromosomale herschikkingeno Vaak gain/loss van grote segmenteno Vaak ontstaan van markerchromosomen

Dubbelstreng DNA breuken Kan fysiologisch zijn

o Isotypeswitching en somatische recombinatie Inductie door ioniserende straling

Herstel dubbelstrenginge DNA breuken Homologe recombinantie (10&)

o Complex, vereist meerdere eiwitteno Vereist informatie zusterchromatide (alleen tijdens S en G2 fase)o Fouten in herstelmechanismen

Ataxia telangietacsia Neurodegeneratieve aandoening

o Immuundeficiënties, groeiachterstand, rolstoelgebonden + verhoogde kans kanker

Verantwoordelijk gen: ATM Gelegen op chromosoom 11 Codeert voor eiwit die een sensor is voor dubbelstrengbreuken

BRCA1 en BRCA2 Non Homologous End Joining (NHEJ)

o Actief tijdens G1 fase van celcycluso Belangrijke fysische rol T & B lymfocyten (mechanismen voor variatie)

Euploïdie, Aneuploïdie en kanker Aneuploïdie: Niet kanker veroorzakend, wel fasciliterend Vaak aanwezig in solide tumoren Gevolg van chromosomale instabiliteit

Mitosespoel en delingsspoelcontrolepunt Checkpoint tijdens cyclus

o Controleert ruimtelijke oriëntatie chromosomen

Chromosomale instabiliteit en Microsatellietinstabiliteit MSI: diploïde tumoren – toenemende MSI CSI: aneuploïde tumoren – normale stabiliteit MSI

SNP array’s Verlies van heterozygositeit

o Verlies maternaal/paternaal allel in tumor

DysmorfieënDysmorfieën/ minor anomalies = ongewone uiterlijke kenmerken zonder serieuze medische ofcosmetische gevolgen voor de patient

Vaak familiaalMalformatie = primaire morfologische stoornis tgv. Een intrinsieke ontwikkelingsstoornis

Vb. schisis of polydactylieDysplasie = stoornis van de organisatie van cellen in weefselSequentie = primair defect met secundair structurele veranderingenDeformatie = verandering in vorm of positie van een normaal lichaamsdeel tgv. Mechanische krachten (klompvoet)DIsruptie = morfologisch defect van orgaan of lichaamsdeel door onderbreking van normale ontwikkeling door een factor van buitenaf (hydroplasie van een been door afsluiting bloedvat)Syndroom = patroon van multipele primaire malformaties met 1 oorzaak

Ogen Afstand Kleur Stand van de ogen (lateraal omhoog gericht = mongolide) Vorm

Mond Grootte Schisis (hazenlip) Macrostomie = horizontale spleet = jokermond

Oren Stand Vorm Aanhangsels, putjes

Handen en voeten Handlijnen Stand & vorm tenen en vingers

o Lengte vingers, kromming vingers Te veel/ te weinig vingers of tenen