Radiogenomics voor de reductie van complicaties
99
Transcript of Radiogenomics voor de reductie van complicaties
Radiogenomics voor de reductie van complicaties
bij de behandeling van borstkankerpatiënten
met radiotherapie
Lieselotte Depuydt
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Thierens H.
Vakgroep Medische basiswetenschappen
Academiejaar 2010-2011
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk
ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder
met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het
aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
20 mei 2011
Lieselotte Depuydt Prof. Dr. Thierens H.
Voorwoord
Een woord van dank is hier op zijn plaats voor iedereen die mij geholpen heeft met het
verwezenlijken van mijn thesis.
In de eerste plaats wil ik mijn promotor Prof. Dr. H. Thierens en mijn begeleidster S. De
Langhe bedanken voor de kans die zij mij gegeven hebben om deel uit te maken van hun
onderzoek.
In het bijzonder wil ik mijn dank betuigen aan S. De Langhe voor haar geduld, steun en hulp.
Dankzij jou heb ik verschillende technieken en methodes onder de knie gekregen. Je was
altijd bereid om mijn vragen te antwoorden. Ook het schrijven van mijn thesis was nooit
gelukt zonder jou. Verder wil ik ook J. Werbrouck bedanken om mij de SnapShot techniek
aan te leren.
Ook het volledig dienstpersoneel verdient een dankwoordje voor de aangename sfeer die zij
over de middag creëren.
In het bijzonder wil ik mijn mede-thesisstudenten bedanken om samen de laatste jaren mee te
maken. We hebben veel leuke momenten beleeft in het labo en het computerlokaal, maar we
hebben ook onze frustraties kunnen delen met elkaar.
Ook de “Biomedical Chicks” (Lizzie, Jules, Sofie en Flo) verdienen een dikke “mercie” voor
de vijf prachtige jaren samen. We zijn vrienden voor het leven geworden. Dankzij jullie zijn
de jaren voorbij gevlogen.
Tenslotte wil ik mijn vrienden en familie bedanken.
Mama en papa, bedank om mij door dik en dun te steunen.
Pieter, bedankt dat ik altijd op jou kon rekeren na een zware dag in het labo.
Bedankt!
Inhoudstabel Afkortingen ................................................................................................................................. I Samenvatting .............................................................................................................................. 1 Inleiding ..................................................................................................................................... 2
1. Borstkanker ........................................................................................................................ 2 2. Behandeling ........................................................................................................................ 2
2.1. Lumpectomie ............................................................................................................... 2 2.2. Radiotherapie .............................................................................................................. 2
3. Stralingsgeïnduceerde complicaties ................................................................................... 4 3.1. Acute effecten ............................................................................................................. 4 3.2. Late effecten ................................................................................................................ 5 3.3. Scoringssystemen ........................................................................................................ 5
4. Pathways betrokken bij het optreden van stralingsgeïnduceerde complicaties .................. 6 4.1. Herkenning van DNA breuken .................................................................................... 6 4.2. Herstel van DNA breuken ........................................................................................... 6 4.3. Melanogenese .............................................................................................................. 8
5. Inter- individuele variabiliteit van stralingsgeïnduceerde complicaties ............................. 8 6. Single Nucleotide Polymorfismen ..................................................................................... 9
6.1. ATM c.5557 G>A (rs1801516).................................................................................... 9 6.2. ATM c.-111 G>A (rs189037) .................................................................................... 10 6.3. XRCC1 c.1196G>A (rs25487) .................................................................................. 10 6.4. XRCC1 c.580C>T (rs1799782) ................................................................................. 10 6.5. XRCC1 c.8396G>A (rs25489) .................................................................................. 11 6.6. MSH3 c.3133A>G (rs26279) .................................................................................... 11 6.7. XRCC3 c.722C>T (rs861539) ................................................................................... 11 6.8. MC1R c.478C>T (rs1805008) ................................................................................... 12
7. Genome Wide Association Studie .................................................................................... 12 7. Probleem en doelstelling .................................................................................................. 12
Materiaal en methoden ............................................................................................................. 14 1. Introductie ........................................................................................................................ 14 2. Populatie ........................................................................................................................... 14 3. Scoring neveneffecten ...................................................................................................... 14 4. Dosimetrische gegevens ................................................................................................... 15 5. DNA purificatie (Gentra®Purgene Protocol)................................................................... 15 6. Concentratie- en kwaliteitsbepaling van het DNA ........................................................... 16 7. Polymerase Chain Reaction ............................................................................................. 17
7.1. Principe ...................................................................................................................... 17 7.2. PCR mix .................................................................................................................... 18 7.3. PCR Primers .............................................................................................................. 19 7.4. PCR controle ............................................................................................................. 19 7.5. Bereiding van TBE-buffer, ladingsbuffer en TE-buffer. ........................................... 20 7.5. Optimalisatie PCR ..................................................................................................... 20
8. SNP bepaling .................................................................................................................... 21 8.1. Restricion Fragment Lenght Polymorphism ............................................................. 21 8.2. High Resolution Melting analyse .............................................................................. 22 8.3. SnapShot analyse ....................................................................................................... 24
9. Kwaliteitscontrole ............................................................................................................ 25 10. Statistische Analyse ........................................................................................................ 26
Resultaten ................................................................................................................................. 27 1. Optimalisatie RFLP .......................................................................................................... 27
1.1. ATM c.5557G>A ....................................................................................................... 27 1.2 ATM c.-111G>A ......................................................................................................... 28 1.3. MSH3 c.3133A>G ..................................................................................................... 29 1.4. MC1R c.478C>T ....................................................................................................... 30 1.5. FGFR2 rs2981579 ..................................................................................................... 31 1.6. TOX rs3803662 ......................................................................................................... 32
2. Associatiestudie naar acute huidtoxiciteit ........................................................................ 33 2.1. Analyse van klinische factoren ................................................................................. 33 2.2. Analyse van dosimetrische factoren .......................................................................... 34 2.3. Analyse van de geselecteerde SNPs .......................................................................... 35
Discussie ................................................................................................................................... 39 1. Optimalisatie van het RFLP protocol ............................................................................... 39 2. Associatieanalyse van acute huidtoxiciteit ....................................................................... 39
2.1. Klinische factoren ..................................................................................................... 39 2.2. Dosimetrische factoren .............................................................................................. 41 2.3. SNP ............................................................................................................................ 42
Besluit ....................................................................................................................................... 47 Bijlage ......................................................................................................................................... I
I
Afkortingen
A Adenine
Ala Alanine
APE AP Endonuclease
Arg Arginine
Asn Asparagine
Asp Asparaginezuur
AT Ataxia Telengiectasia
ATM Ataxia Telengiectasia Mutated
BER Base Excision Repair
bp baseparen
BSA Bovine Serum Albunine
C Cytosine
CTCAE v3.0 Common Terminology Criteria for Adverse Effect
ddNTP dideoxynucleotide
dH2O Dnase en Rnase vrij gedestilleerd water
DMSO DiMethylSulfOxide
DNA Deoxyribonucleïnezuur
dNTP deoxyNTP
DSB Dubbelstrengbreuken
EDTA EthyleenDiamineTetraAcetaat
EtBr EthidumBromide
FGFR2 Fibroblast groeifactor receptor 2
FWD forward primer
G Guanine
Gln Glutamine
GWAS Genome Wide Association Studie
HE Heterozygoot
His Histidine
HO Homozygoot
HR Homologe Recombinatie
HRM High Resolution Melting
HWE Hardy-Weinberg Equilibrium
IMRT Intensiteitsgemoduleerde radiotherapie
LD Linkage Disequilibrium
LENT- SOMA Late Effects in Normal Tissue: Subjective, Objective, Magagment and
Analystical scale
MC1R Melanocortin 1 receptor
Met Methionine
MgCl2 Magnesiumdichloride
MM Master Mix
MMR Mismatch Repair
MSH MutS homoloog
II
NER Nucleotide Excision Repair
NHEJ Non Homologe End Joining
OR Odds Ratio
PCR Polymerase Chain Reaction
RE Restrictie-Enzym
REV reverse primer
RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphsm
RNA Ribonucleïnezuur
ROS Reactieve zuurstof radicalen
RT Radiotherapie
RTOG-EORTC Radiation Therapy Oncology Group/ European Organisation
for Research and Treatment of Cancer
SNP Single Nucleotide Polymorfisme
SPSS Statistical Package for the Social Sciences
SS SnapShot
SSB enkelstrengbreuken
T Thymine
Ta Annaelingstemperatuur
TBE Tris Boraat EDTA2NA
TE Tris EDTA
Thr Threonine
Tm smelttemperatuur
Trp Tryptofaan
U units
UZ Universitair ziekenhuis
V Volt
WT Wild Type
XRCC X-ray repair cross-complementing
1
Samenvatting
Borstkanker is de meest voorkomende kanker bij vrouwen en wordt in een vroeg stadium
behandeld met borstsparende chirurgie gevolgd door radiotherapie. De radiotherapie wordt
gebruikt om het risico op locoregionale terugkeer van de borstkanker te verhinderen.
Bestraling van de borst kan echter acute en late neveneffecten veroorzaken. Door gebruik te
maken van intensiteitsgemoduleerde radiotherapie is het risico op weefseltoxiciteit reeds
significant teruggebracht. Toch loopt nog 30% van de patiënten ernstige complicaties op. De
inter-individuele variabiliteit van stralingsgeïnduceerde complicatie wordt toegeschreven aan
dosimetrische, klinische en genetische factoren. In deze thesis wordt onderzocht of single
nucleotide polymorfismen geassocieerd zijn met stralingsgeïnduceerde acute huidtoxiciteit.
De genotypes van 80 borstkankerpatiënten worden bepaald voor volgende polymorfismen:
ATM c.5557G>A, ATM c.-111G>A, XRCC1 c.1196G>A, XRCC1 c.580C>T,
XRCC1c.839G>A, XRCC3 c.722C>T, MSH3 c.3133A>G, MC1R c.478C>T, FGFR2
rs2981579 en TOX3 rs3803662. De genotypering gebeurt via Restriction Fragment Lenght
Polymorfisme, High Resolution Melting en SnapShot analyse. Gedurende deze thesis worden
de RFLP protocol voor ATM c.5557G>A, ATM c.-111G>A, MCR1 c.478C>T, MSH3
c.3133G>A, FGFR2 rs2981579, en TOX rs3803662 geoptimaliseerd.
Voor de analyse van de polymorfismen werd er eerst naar confounding factoren gezocht.
Daaruit bleek dat klinische factoren als chemotherapie, hormonen, diabetes, roken, lokalisatie
van de tumor en borstvolume een invloed hebben op de cosmetische uitkomst na
radiotherapie. Er werd geen associatie gevonden met dosimetrische factoren. Tijdens de
univariate analyse tussen SNP en acute huidtoxiciteit werd ATM c.5557G>A geassocieerd met
een verlaagd risico op dermatitis en een verhoogd risico op borstoedeem. ATM c.-111G>A is
geassocieerd bevonden met oedeem van de borst. XRCC1 c.839G>A en XRCC3 c.722C> T
bleek geassocieerd te zijn met dermatitis en desquamatie. Uit de multivariate analyse werd
MSH3 c.3133G>A geassocieerd met dermatitis. Door de kleine populatiegrootte verloren
vorige associatie hun significantie na multivariate analyse, maar bleven de trends aanwezig.
Trefwoorden: SNP – acute huidtoxiciteit – IMRT - borstkanker
2
Inleiding
1. Borstkanker
Borstkanker is multi-factoriële ziekte waarbij een kwaadaardig gezwel ontstaat in de borst van
de patiënt. In 2006 registreerde het Vlaams Kankerregistratienetwerk 6489 nieuwe gevallen
van borstkanker en is daarmee de meest voorkomende kanker bij vrouwen. Mannen kunnen
eveneens borstkanker ontwikkelen, maar het risico bij de vrouw is 150 keer groter dan voor
een man. Zowel de behandeling als de overlevingskansen van borstkanker hangen sterk af van
het stadium waarin het ontdekt wordt, het histologisch subtype van de tumor en
patiëntgerelateerde factoren zoals leeftijd en menopausale status. Dankzij intensieve
screeningsprogramma’s zoals mammografie kan een borsttumor in een vroeg stadium ontdekt
worden waardoor de overlevingskansen sterk stijgen (vijfjaarsoverleving>90%) (1,2).
2. Behandeling
Borstsparende chirurgie of lumpectomie gevolgd door radiotherapie (RT) is de
standaardbehandeling voor borstkanker in een vroeg stadium.
2.1. Lumpectomie
Lumpectomie is een ingreep waarbij enkel de tumor en een marge gezond weefsel verwijderd
worden met behoud van de borst (2). Deze techniek geldt als een volwaardige vervanging van
mastectomie in termen van genezing en algemene overlevingscijfers met als grote voordeel
dat de borst gespaard blijft (3). Hoewel de borst behouden blijft, is het van belang om
voldoende aandacht te schenken aan het cosmetisch eindresultaat. Dit is een belangrijk
eindpunt bij de evaluatie van de behandelingsuitkomst. Men probeert gevoelens van
verminking, mutilatie en niet-vrouw zijn te vermijden, wat vaak voorkomt bij vrouwen die
een radicale mastectomie hebben ondergaan (4).
2.2. Radiotherapie
Na lumpectomie volgt RT met als doel het risico op lokale of regionale terugkeer van de
borsttumor te verminderen zodat de algemene overlevingskansen stijgen (5). Radiotherapie is
een niet invasieve behandeling die gebaseerd is op het induceren van DNA schade via
ioniserende straling (6). Het uiteindelijke doel van radiotherapie is de kankercellen bloot te
stellen aan een maximale dosis terwijl de schade aan het omliggend gezond weefsel beperkt
blijft. Deze dosis is gelimiteerd door ernstige complicaties die optreden in een kleine groep
3
van stralingssensitieve personen. Door deze beperking in dosis loopt een groot deel van de
patiënten een hogere stralingsdosis mis wat de algemene genezingskansen doet dalen. (7)
Intensiteitsgemoduleerde radiotherapie (IMRT) is een 3 dimensionele conformele
bestralingstechniek. Door de creatie van een concave dosis distributie en scherpe dosis
gradiënten, met behulp van de multi-leaf collimator, worden de kritische organen
afgeschermd, terwijl de tumor een hogere dosis ontvangt (8). Dankzij de verbeterde
homogeniteit van de dosisdistributie en het minder voorkomen van hotspots, is het risico op
weefseltoxiciteit veel lager in vergelijking met conventionele twee dimensionele RT (8,9,10).
De substantiële hoge kost, kwaliteitsverzekering, planning en uitvoering van IMRT zijn de
zwakheden van deze techniek (5). De patiënt kan ofwel in rug- of in buiklig gepositioneerd
worden.
2.2.1. Rugpositie
Bij deze standaard techniek wordt de patiënt bestraald in ruglig. Deze comfortabele positie is
gemakkelijk uit te voeren en vergt weinig tijd. Maar in deze positie zal de borst bewegen door
de ademhaling en ontstaan er borstplooien wat dosisinhomogeniteiten veroorzaken (11). Dit
treedt op bij vrouwen met een grote cupmaat en kan resulteren in een slechter cosmetisch
resultaat. Daarnaast wordt een groter borstvolume bestraald wat de dosis op het hart en de
longen doet stijgen. Dit kan op lange termijn long en harttoxiciteit veroorzaken.
Herpositioneren van de borst tijdens de verschillende bestralingen is vaak moeilijk (12).
2.2.2. Laterale buikpositie
De patiënt ligt in buiklig op een specifiek ontworpen tafel waarbij de borst naar beneden kan
hangen. Om het risico op contralaterale borstbestraling te voorkomen, draagt de patiënt een
unilaterale borsthouder om de gezonde borst verder van het stralingsveld te verwijderen.
In tegenstelling tot de rugpositie zal de borst van de patiënt gedurende de volledige therapie in
dezelfde positie blijven. Op die manier ontstaan er geen borstplooien en wordt een kleiner
volume van de longen en het hart bestraald. Tevens wordt de beweging van de borst door de
ademhaling sterk gereduceerd door immobilisatie van de thoraxwand. Daling van hotspots
kan het cosmetisch resultaat verbeteren en een verlaagde blootstelling van de risico-organen
kan het risico op late effecten van de long en het hart doen dalen (11). Dit zou duidelijk
merkbaar zijn bij vrouwen met een grote cupmaat (12,13). Om deze hypothese na te gaan
worden de patiënten van Universitair ziekenhuis (UZ) Gent met cupmaat C of meer in deze
studie gerandomiseerd tussen buik- en ruglig.
De opstelling van deze positie is echter moeilijk uit te voeren en wordt door de patiënt als
4
zeer onaangenaam ervaren. De immobilisatie op de tafel, de reproduceerbaarheid van positie
van de patiënt en de set-up accuraatheid laat vaak te wensen over (11).
3. Stralingsgeïnduceerde complicaties
Stralingsgeïnduceerde neveneffecten slaan op de ongewenste klinische en psychologische
reacties als gevolg van RT (14). Hoewel het optreden van stralingsgeïnduceerde
neveneffecten bij IMRT significant lager is in vergelijking met conventionele RT (5.8.9.10)
loopt nog steeds 30% van de patiënten ernstige complicaties op. Naast hart en longtoxiciteit,
speelt het grootste probleem zich af ter hoogte van de huid. De normale weefsel schade is een
dynamisch en progressief proces. De depositie van energie door RT resulteert in DNA schade
wat veranderingen in de micro-omgeving veroorzaakt via chemokines, inflammatoire en
fibrotische cytokines, veranderde cel interacties, influx van inflammatoire cellen en de
inductie van herstelprocessen (7). Deze stralinggeïnduceerde complicaties in de huid kan voor
meer dan 10% van de patiënten de therapie limiteren (15).
3.1. Acute effecten
Tijdens of tot 3 maand na de behandeling kunnen acute neveneffecten optreden. Deze
neveneffecten zijn vaak reversibel en typisch voor snel prolifererende weefsels als de huid,
gastro-intestinaal stelsel en hematopoiëtisch systeem. Deze acute reacties hangen niet af van
de stralingsdosis per fractie, maar zijn wel gevoelig voor de bestralingsduur. Tevens kunnen
ze het voorziene stralingsschema verstoren wat tot een beperking in stralingsdosis kan leiden
(7). De pathogenese van acute effecten beschreven binnen deze studie zijn dermatitis,
desquamatie, pruritus, oedeem van de borst en areola.
Figuur 1 De huid (16)
Dermatitis slaat op de ontsteking en roodheid van de huid (zie figuur 16) die zowel acuut als
chronisch kan optreden (17). Wanneer de stamcelpopulatie ter hoogte van de basale laag in de
huid verminderen, kan er droge desquamatie ontstaan. Dit wordt klinisch gekarakteriseerd
door jeuk en schilfering van de huid. Vernietiging van alle stamcellen van de basale laag kan
5
leiden tot vochtige desquamatie, met vrijkomen van wondvocht en blootstelling van de dermis
tot gevolg (18). Daarnaast kan door verhoogde hydrostatische druk in de capillairen, oedeem
of een overmatige ophoping van vocht in het onderhuids bindweefsel ontstaan (17). Al deze
symptomen gaan vaak gepaard met ernstige pijn.
3.2. Late effecten
Zes maanden tot vele jaren na de RT kunnen er late reacties optreden. Die zijn vaak blijvend
en gaan gepaard met ernstige pijn. Deze toxiciteit doet zich voor bij traag prolifererend
weefsel en kan de normale weefselfunctie schade toebrengen. De gevoeligheid is afhankelijk
van de stralingsdosis per fractie en minder afhankelijk aan de behandelingsduur. De late
effecten veroorzaken dosisbeperkingen als gevolg van de stralingstoxiciteit (7). Daarnaast zijn
late normale huidcomplicaties gecorreleerd met een slecht cosmetisch eindresultaat (3).
Retractie of atrofie, borstoedeem, ulceraties, telangiectasia, fibrosis, lymfe oedeem van de
arm, pigmentatieveranderingen en pijn kan optreden als chronische huidtoxiciteit.
Atrofie is het resultaat van gedaalde populatie dermale fibroblasten en verlaagde reabsorptie
van collageen vezels. De proliferatie van deze atypische fibroblasten is een respons op de
groeifactoren neergezet door het dens fibreus weefsel (18). Tevens kan fibrose optreden als
gevolg van proliferatie van de overlevende fibrocyten door groeifactoren vrijgezet tijdens
stralingsschade (7). Fibrose wordt gekarakteriseerd door de progressieve induratie,
oedeemvorming en verdikking van de dermis en het subcutaan weefsel. De schade blijkt het
grootst op plaatsen waar reeds eerder een schilferreactie optrad. Dit symptoom is
dosisafhankelijk en progressief (19). Atrofie en fibrosis zijn samen verantwoordelijk voor de
verharding en het krimpen van de bestraalde borst. Telangiectasia kan ontstaan wanneer in de
atrofische dermis een zone voorkomt waar verschillende prominente fijne gedilateerde
dunwandige bloedvaten zichtbaar zijn in de huid (18). Weefselverlies aan de oppervlakte van
het epitheel, die traag of niet aangevuld wordt door weefselvorming, leidt tot het ontstaan van
zweren of ulceratie. Deze wonden vertonen weinig of geen neiging tot genezing (17).
Hyperpigmentatie kan optreden door de stimulatie van epidermale melanocyten (18).
3.3. Scoringssystemen
De toxiciteit na RT kan met verschillende score systemen bepaald worden. Afhankelijk van
de ernst wordt er een graad aan de optredende neveneffecten toegekend. Gradatie van acute
toxiciteit kan door gebruik te maken de Common Terminology Criteria for Adverse Effect
(CTC) scoring system (20) of het Radiation Therapy Oncology Group/ European
6
Organisation for Research and Treatment of Cancer (RTOG-EORTC) system (21). Late
toxiciteit kan eveneens gescoord worden door CTC score of door het Late Effects in Normal
Tissue: Subjective, Objective, Magagment and Analystical scale (LENT-SOMA) (22) te
hanteren.
4. Pathways betrokken bij het optreden van stralingsgeïnduceerde complicaties
Bij blootstelling aan ioniserende straling ontstaan er DNA breuken via directe ionisatie van
het DNA of indirect via vrije reactieve zuurstof radicalen (ROS) die in de cel gevormd
worden door hydrolyse van water. Deze breuken worden door een herkenningsmechanisme
opgemerkt zodat in de cel een cascade van celcyclusstop, DNA herstel en apoptose wordt
geactiveerd (6). Tevens speelt melanogenese een rol bij het ontstaan van hyperpigmentatie
van de huid. Melanine wordt geproduceerd door melanocyten en leidt tot het opbouwen van
de pigmentatie van de huid (23). Hieronder volgt een overzicht.
4.1. Herkenning van DNA breuken
Ioniserende straling introduceert breuken in het DNA. Het ATM proteïne speelt een centrale
rol bij de herkenning van deze breuken (24). ATM is een serine threonine kinase dat
autofosforylatie ondergaat bij herkenning van DNA breuken. Dit veroorzaakt dimeer
dissociatie waardoor het kinase domein vrijkomt (25). Dit leidt tot fosforylatie van
downstreammoleculen betrokken bij celcycluscheckpoint-controle, apoptotische respons en
DNA herstel (26).
Mutaties in het ATM gen veroorzaken de autosomale recessieve ziekte Ataxia Telangiectasia
(AT) welke gekenmerkt wordt door cerebellaire degeneratie, immunodeficiëntie,
kankerpredispositie en stralingsovergevoeligheid (24). Ongeveer 1% van de algemene
bevolking zou drager zijn van zo een ATM mutatie (25). AT heterozygositeit zou geassocieerd
zijn met verhoogde klinische radiosensitiviteit (24,27). Dit werd echter niet teruggevonden
door verschillende onderzoeksgroepen (28,29). Dus kan AT heterozygositeit uitgesloten
worden als hoofdoorzaak van verhoogde klinische radiosensitiviteit (15).
4.2. Herstel van DNA breuken
Ioniserende straling veroorzaken ter hoogte van het DNA enkel- (SSB) en
dubbelstrengbreuken (DSB). SSB zijn enzymatisch gemakkelijk te herstellen (30). Dit kan
gebeuren door een aantal mechanismen: base excision repair (BER), nucleotide excision
repair (NER) en mismatch repair (MMR) (30). DSB daarentegen zijn letaal door vorming van
deleties, chromosomale translocaties en genomische instabiliteit wat kan leiden tot inductie
7
van tumorgenen (31). Deze breuken kunnen hersteld worden door homologe recombinatie
(HR) en non homologe end joining (NHEJ) (31). In het kader van deze studie word BER,
MMR en HR verder besproken.
4.2.1. Base excision repair
BER is verantwoordelijk voor het herstel van enkelstrengbreuken veroorzaakt door
ioniserende stralen, oxidatieve stress en DNA methylatie (32). Zodra er een fout in de DNA
sequentie wordt opgemerkt, knipt een glycosylase de beschadigde basen. Dit leidt tot een
basevrije deoxyribose (AP) plaats. Het AP endonuclease knipt de suikerfosfaatstreng ter
hoogte van de 3’ plaats, terwijl AP lyase dit doet ter hoogte van de 5’ plaats. DNA
polymerase β bouwt vervolgens de nieuwe nucleotiden in en DNA ligase III hecht de strengen
aan elkaar (6,31). Het scaffold proteïne XRCC1 is van belang voor de coördinatie van het
herstel. Interactie met ligase III, DNA polymerase β, poly (ADP-ribose) polymerase, PARP-1
en APE1 maakt XRCC1 proteïne noodzakelijk voor efficiënt herstel (32,33).
4.2.2. Mismatch repair mechanisme
Het MRR mechanisme is verantwoordelijk voor herstel van DNA fouten tijdens de replicatie.
Het MutSα complex gevormd door MSH2 en MSH6, herkent DNA lesies. Inserties en deletie
loops worden opgespoord door MutSβ complex dat samengesteld is uit MSH2 en MSH3. Na
recrutering van de MMR factoren en na degradatie van de sequentie volgend op de fout door
exonucleseI, kan de replicatie terug van start gaan met DNA polymerase β (31)
4.2.3. Homologe recombinatie
HR is een error free herstelmechanisme dat een homologe DNA sequentie als template
gebruikt. Tijdens de DSB processing creëert het MRN complex bestaand uit RAD50, Mre11
en Nbs1, een enkelstrengovergang door verder in de streng te knippen. Met behulp van
replication proteïne A, RAD52 en RAD54 polymeren, zal RAD51 ter hoogte van het
enkelstrengig DNA een nucleoproteïne filament vormen dat de intacte homologe DNA
sequentie opzoekt. Verschillende RAD51 paralogen zoals RAD51B, RAD51C, RAD51D,
XRCC2 en XRCC3 zijn medeverantwoordelijk voor de samenhechting van het RAD51
complex. Wanneer de zoektocht met succes voltooid is, zal RAD51 proteïne een joint
molecule genereren tussen het homoloog beschadigd en het intacte DNA. Een DNA
Polymerase zal de beschadigde DNA molecule verder verlengen zodat DNA ligase1 de
uiteinden kan ligeren (6.34).
8
4.3. Melanogenese
Pigmentatie van de huid wordt bepaald door 3 verschillende processen: de melanine synthese
door melanocyten, de doorschakeling van melanosomen die melanine bevatten naar
keratinocyten en de relatieve hoeveelheid eumelanine en pheomelanine. Deze drie parameters
worden gereguleerd door melanocortin 1 receptor (MC1R) (23). Activatie van de receptor
veroorzaakt een productieswitch van rode pheomelanine naar zwarte eumelanine.
Pheomelanine is geassocieerd met een blonde of rode haarkleur en een licht huidfenotype,
terwijl eumelanine geassocieerd is met donker of bruin haarkleur en een donker huidfenotype.
Pheomelanine speelt een rol in de UV geïnduceerde huidschade via vrij radicalen, terwijl
eumelanine eerder fotoprotectief werkt (23).
5. Inter- individuele variabiliteit van stralingsgeïnduceerde complicaties
Er heerst een inter-individuele variabiliteit van complicaties tussen de RT patiënten. De ernst
van deze neveneffecten hangt af van dosimetrische, klinische en genetische factoren.
Stralingsinhomogeniteiten kunnen beschouwd worden als de belangrijkste dosimetrische
factor omdat het hotspots creëert ter hoogte van de borst. Daarnaast kan het type straling, de
totale dosis, de veldgrootte, de grootte van de fractie en spectrale distributie ook een rol
spelen (7,15,18,24). Comorbiditeit zoals hypertensie en diabetes, de gebruikte chirurgische
techniek en chemotherapie, maar voornamelijk het borstvolume van de patiënt zijn klinische
factoren die kunnen bijdragen tot de variabiliteit van optreden van de neveneffecten. Ook
leeftijd, BMI en het rookgedrag kunnen van belang zijn (7,15,18,24).
Verschillende studies van zeldzame genetische syndromen als AT, Fanconi anemie, Nijmegen
breakage syndroom en Bloom syndroom suggereerden dat de genetische achtergrond
mogelijks aan de basis ligt van inter-individuele verschillen. Deze syndromen zijn gekend
voor hun stralingsgevoeligheid. De syndromen gaan gepaard met een mutatie in een gen dat
een rol speelt in detectie of herstel van DNA schade (15,24,35). Dit gaf aanleiding tot verder
onderzoek op genetisch vlak. Men kwam tot de vaststelling dat niet enkel sterke penetrante
mutaties in genen zoals bij de genetische syndromen de radiosensitiviteit bepalen, maar dat
ook een combinatie van laag penetrante polymorfismen van belang is (32,36,37).
Radiosensitiviteit kan dus gezien worden als een complex polygenetische eigenschap welke
het gevolg is van interacties tussen een aantal genen in verschillende cellulaire pathways
(15,24,35). De uitdaging is om variaties in de genen te identificeren die het complexe
cellulaire en klinisch fenotype beïnvloeden (24).
9
6. Single Nucleotide Polymorfismen
Men spreekt van een single nucleotide polymorfisme of SNP als de variatie een nucleotide
substitutie is waarvan het minst frequente allel een abundantie van 1% of meer heeft. SNPs
zijn verantwoordelijk voor meer dan 90% van de natuurlijke sequentie variatie in het
menselijk genoom (15).
Genetische variaties aanwezig in coderende regio’s van genen kunnen de functie of de
structuur van de gecodeerde proteïnen veranderen (37). De genexpressie kan gewijzigd
worden door een SNP dat gelegen is in een regulatorische regio (15). Polymorfismen
aanwezig in niet-coderende sequenties kunnen een effect hebben op de splicing of RNA
stabiliteit (15). De meeste SNPs zijn echter silent mutaties die geen direct effect hebben op de
genfunctie. Deze SNPs worden mogelijks generaties lang samen overgeërfd met
predisponerende allelen via linkage disequilibrium (LD) (37).
Voor de associatie met klinische stralingsgevoeligheid zijn genetische variaties geselecteerd
in genen die instaan voor de herkenning van DNA breuken, het herstel van DNA schade en
melanogenese waarvan de pathway reeds eerder besproken zijn. Op basis van
kandidaatgenstudies zijn volgende polymorfismen geselecteerd: ATM c.5557G>A, ATM c.-
111G>A, XRCC1 c.1196G>A, XRCC1 c.580C>T en XRCC1 c.839G>A, XRCC3 c.722C>T,
MSH3 c.3133G>A, MC1R c.478C>T.
6.1. ATM c.5557 G>A (rs1801516)
Ongeveer 17.5% van de Kaukasische populatie bezit een Adenine (A) in plaats van een
Guanine (G) op nucleotide positie 5557 in exon 39 van het ATM gen dat op chromosoom 11
gelegen is. Op eiwitniveau resulteert dit in een substitutie van Asparaginezuur (Asp) naar
Asparagine (Asn) ter hoogte van codon 1853 (39).
Er werd aangetoond dat borstkankerpatiënten die drager zijn van het A allel of Asn variant
geassocieerd zijn met de ontwikkeling van graad 3 fibrose (14,25,39). Dit is tegenstrijdig met
het onderzoek van Edvardsen et al (2007) (40) die een significante associatie vond tussen het
variant G allel en telangiectasia. Verder vond de onderzoeksgroep van Zschenker et al (41)
een significante associatie tussen het AA genotype en een verlaagd risico om fibrose te
ontwikkelen. Dit wijst eerder op een protectief effect van het A allel. Verder onderzoek
(27,42,43) vond geen significante associaties terug tussen het ATM polymorfisme en het
optreden van subcutane toxiciteit na RT bij borstkankerpatiënten.
10
6.2. ATM c.-111 G>A (rs189037)
De G>A substitutie ter hoogte van het -111 nucleotide is gelokaliseerd in de promotor regio
van het ATM gen. Het A allel heeft een allel frequentie van 49%. Aanwezigheid van het A
allel zou gepaard gaan met een gedaald RNA expressieniveau door het creëren van een
inhibitor site in de promotor regio van het ATM gen. Verlaagde expressie van het ATM gen
kan resulteren in verhoogde gevoeligheid voor ioniserende straling (44). Een studie
uitgevoerd op Japanse vrouwen toonde aan dat dit polymorfisme significant geassocieerd is
met een verhoogd risico op stralingsgeïnduceerde pneumonitis bij longkankerpatiënten (44).
6.3. XRCC1 c.1196G>A (rs25487)
XRCC1 c.1196G>A is een G>A substitutie gelegen in exon 10 van XRCC1 gen welke op
chromosoon 19 gelegen is. Dit veroorzaakt een Arginine (Arg) naar Glutamine (Gln)
substitutie ter hoogte van codon 399 (45). Het A allel is het minst voorkomende allel met een
frequentie van 46,8% in de Kaukasische populatie. De variatie is gelokaliseerd in het PARP-
bindingsdomein (32).
Dragers van het variant A allel zijn reeds significant geassocieerd bevonden met
telangiectasia (Giotopoulis) en fibrose (41). Dit in tegenstelling met een andere studie (46)
waar het wildtype GG genotype geassocieerd werd bevonden met fibrose. Tevens bleek dat
dragers van het variant A allel en het variant allel van APE1 c.444T>G een verlaagd risico
vertonen op acute huidtoxiciteit (36). Daartegenover zijn er een aantal studies (3,33,42,43,46)
die geen significante associatie konden aantonen tussen XRCC1 c1196G>A polymorfisme en
stralingstoxiciteit.
6.4. XRCC1 c.580C>T (rs1799782)
Op positie 580 in exon 6 van het XRCC1 gen kan er een C naar T allel verandering optreden.
Dit verandert het Arg aminozuur in een Tryptofaan (Trp) op codon 194 in het proteïne (47).
In de Kaukasische populatie heeft het T allel een minor allel frequentie van 9,2%. De variatie
komt voor in de linker regio dat het NH2-terminale domein van het centrale BRCT-I domein
scheidt (32).
Er werd aangetoond dat het variant T allel geassocieerd is met het risico op de ontwikkeling
van neveneffecten van RT (32). Dragers van het variant allel van XRCC1 c.580C>T en
XRCC1 c.1196G>A werden meer frequent teruggevonden in de radiosensitieve
borstkankerpatiënten (32) en werden significant geassocieerd bevonden met verhoogde acute
huidtoxiciteit (48). Dit werd tegengesproken door De Ruyck et al (2005) (49) die een
significant protectieve associatie observeerde tussen dragers van het variant allel en de
11
ontwikkeling van late RT reactie bij patiënten met cervicale of endometrium kankers (49). Er
werd geen associatie geobserveerd in een aantal studies (3,33,42) tussen dit polymorfisme en
normale weefselcomplicaties na RT.
6.5. XRCC1 c.8396G>A (rs25489)
In 4.4% van de Kaukasische populatie komt het XRCC1 c.8396G>A polymorfisme voor dat
een verandering induceert in het codon 280 van het XRCC1 proteïne waardoor Arg door
Histidine (His) vervangen wordt. Deze variatie is zoals XRCC1 c.580C>T gelegen in de linker
regio welke de NH2-terminale domein van het centrale BRCT-I domein scheidt (32).
Verschillende studies (3,32,39,50) konden geen associatie aantonen tussen het polymofisme
en stralingsgevoeligheid. In de studie van Brem et al 2006 (50) werd een associatie gevonden
tussen het XRCC1 haplotype bestaand uit het wildtype (WT) allel van XRCC1 c.1196G>A,
XRCC1c.580C>T en XRCC1c.8396G>A, en radioprotectie. Tevens werd een radioprotectief
effect teruggevonden bij prostaatkankerpatiënten die drager zijn van het variant A allel (51).
6.6. MSH3 c.3133A>G (rs26279)
MSH3 c.3133A>G induceert een missense verandering waardoor een Threonine (Thr) in
plaats van een Alanine (Ala) voorkomt ter hoogte van codon 1045 in het proteïne. In de
Kaukasische populatie komt het variant G allel 21.7% voor.
Recent onderzoek (48) stelde vast dat het risico op het ontwikkelen van acute toxiciteit
significant verhoogd is voor dragers van het variant A allel.
6.7. XRCC3 c.722C>T (rs861539)
De XRCC3 c.722C>T substitutie induceert een missense variatie in het proteïne wat op positie
241 een Thr in een Methionine (Met) verandert. Het T allel is het minor allel met een
frequentie van 41,7% in de Kaukasische populatie.
Volgens Andreassen et al(2003) (46) is het Thr/Thr genotype gecorreleerd met een verhoogd
risico op zowel subcutane fibrose als telangiectasia. Dit is tegenstrijdig met twee studies die
associatie aantoonden tussen dragers van variant allel; enerzijds met acute huidtoxiciteit bij
borstkanker patiënten (48) en anderzijds met de ontwikkeling van ernstige dyspaghie na RT
bij hoofd en halskanker patiënten (52). Verder vonden verschillende onderzoeken
(3,42,43,47,53) geen significante associatie terug tussen dit polymorfisme en RT
geïnduceerde weefselcomplicaties.
12
6.8. MC1R c.478C>T (rs1805008)
Bij 13.1% van de Kaukasische bevolking komt er een T allel voor in plaats van een C allel in
het MC1R gelokaliseerd op chromosoon 16 waardoor Arg op positie 160 in het eiwit
vervangen wordt door een Trp. Deze aminozuurwijziging is gelokaliseerd op het knooppunt
tussen een transmembranaire domein en een intracellulaire lus. Dit verstoort mogelijks de
membranaire lokalisatie van de receptor wat van belang is voor de intracellulaire
signaalsturing. Dit kan resulteren in een verlaagde functie van het gen (23). Het variant allel
sterk geassocieerd zijn met het roodhaarkleurfenotype. Dit huidfenotype is geassocieerd met
verhoogde gevoeligheid voor UV straling en predispositie voor huidkanker. Uit de studie van
Fogarty et al.(2010) bleek het T allel of Trp variant significant geassocieerd is met ernstige
acute nevenwerkingen als gevolg van radiotherapie (23).
7. Genome Wide Association Studie
Genoom Wide Association Studie (GWAS) is een lage kost high-throughput genotyperings-
methode als alternatief voor kandidaatgen studies. De studie maakt gebruik van het feit dat
SNPs in haplotypes geclusterd zijn via LD. De 11 miljoen SNP, die in het humaan genoom
bestaan, kunnen indirect gegenotypeerd worden via micro arrays met 250.000 tot 500.000
zorgvuldig uitgekozen representatieve tagging SNPs. Deze techniek biedt de mogelijkheid om
op zoek te gaan naar SNPs in genen waarvan de functie nog niet gekend is zodat de
genetische achtergrond van stralingsgevoeligheid verder ontrafeld kan worden. Het minpunt
aan GWAS is dat de studie een enorm grote studiepopulatie vereist om voldoende statistische
power te bereiken (54). Er zijn reeds een groot aantal GWAS uitgevoerd die de associatie
tussen SNPs en het risico op borstkanker onderzoeken. rs2981582 in het FGFR2 (55,56) en
rs3803662 in het TOX3 gen (55,56) worden telkens teruggevonden als predisponerende
factoren in de ontwikkelingvang borstkanker. Er wordt gesuggereerd dat er een overlap
bestaat tussen polymorfismen die geassocieerd zijn met de ontwikkeling van borstkanker en
stralingsgevoeligheid. Om deze reden worden beide SNPs opgenomen in deze studie.
7. Probleem en doelstelling
Deze studie kadert in een project met als doel het opstellen van een predictie model voor
acute huidtoxiciteit en fibrose op basis van dosimetrische (hotspots), klinische (borstvolume)
en genetische (SNP) risicofactoren. De bedoeling is een geïndividualiseerd behandelingsplan
op te stellen zodat de tumor respons maximaal is en de toxische nevenwerkingen minimaal
zijn. In deze studie wordt de associatie nagegaan tussen SNPs en het optreden van acute
huidtoxiciteit geïnduceerd door RT. De selectie van genetische veranderingen gebeurt op
13
basis van associaties tussen kankerpredispositie en stralingsgevoeligheid die terug te vinden
zijn in de literatuur. Onderdeel van deze studie is het optimaliseren van PCR-RFLP protocol
van enkele SNPs. De te onderzoeken SNPs zijn c.5557G>A en c.-111G>A in ATM,
c.1196G>A, c.580C>T en c.839G>A in XRCC1, XRCC3 c.722C>T, MSH3 c.3133A>G,
MC1R c.478C>T, FGFR2 rs2981579 en TOX3 rs3803662.
14
Materiaal en methoden
1. Introductie
Deze studie kadert in een multi-centrische translationele studie bestaand uit een
samenwerkingverband tussen het Universitair Ziekenhuis (UZ) te Gent en de Clinique et
Maternité Sainte Elisabeth te Namen. Elk ziekenhuis heeft als doel het verzamelen van
gegevens van 200 borstkankerpatiënten samen met een bloedstaal voor de bestraling. Voor
elke patiënt wordt een reeks van polymorfismen gedetermineerd met behulp van Restriction
Fragment Lenght Polymorphism (RFLP), High Resolution Melting (HRM) en SnapShot (SS)
analyse. Een overzicht van de geselecteerde SNPs zijn terug te vinden in bijlage A. In deze
studie wordt vervolgens gezocht naar de associatie tussen het optreden van huidtoxiciteit na
RT bij borstkankerpatiënten en de aanwezigheid van genetische variaties.
2. Populatie
De studiepopulatie bestaat uit 80 vrouwen (68 uit Gent, 12 uit Namen) vanaf achttien jarige
leeftijd, die een informatie en toestemmingsformulier ondertekend hebben. De behandeling
van de deelnemende borstkankerpatiënten bestaat uit lumpectomie gevolgd door
radiotherapie. Personen die een mastectomie, brachytherapie, bilaterale borstbestraling
ondergaan of reeds in het verleden bestraald zijn geweest, worden niet geïncludeerd. De
deelnemers moeten over een voldoende mentale conditie beschikken om de inhoud, het doel
en de mogelijke gevolgen van de studie te begrijpen. Patiënten die onwaarschijnlijk de studie
kunnen afmaken, worden als deelnemers geweigerd.
De gebruikte bestralingtechniek is IMRT. Het behandelingsplan van UZ Gent bestaat uit 15
fracties van 2.67 Gy met een boost van 4 fracties van 2.5 Gy. Bij personen met een cupmaat
kleiner dan C wordt de IMRT in ruglig uitgevoerd. Patiënten met een cupgrootte groter dan C
worden gerandomiseerd tussen rug- en buikpositie. Buiten het feit dat de patiënten enkel op
de rug bestraald worden, loopt het behandelingsplan van het Sint Elisabeth ziekenhuis
vergelijkbaar met dat van Gent.
3. Scoring neveneffecten
Samen met de patiëntgegevens wordt de gradatie van de huidtoxicieit opgeschreven in een
standaarformulier die weergegeven is in bijlage B. Noteren en bepalen van de gradatie van de
neveneffecten gebeurt elke week tijdens de radiotherapiebehandeling, 1 maand na het einde
van de behandeling en elke 6 maand tot 2 jaar na de behandeling. De acute toxiciteit wordt
15
gescoord op basis van het CTC score systeem. De chronische toxiciteit wordt gescoord met
het borstkanker specifiek LENT-SOMA schema. De bestraalde regio, de borst, wordt
ingedeeld in verschillende zones: de 4 borstkwadranten, de areola, de inframammaire plooi en
de axillaire regio. Tevens worden cosmetische veranderingen bepaald door de evaluatie van
de cosmesis (Harvard/WSABP/RTOGbrestcosmesisgradyscale) op basis van foto’s. De foto’s
worden genomen onder gestandaardiseerde omstandigheden (belichting, instellingen van de
camera) waarbij de patiënt een gestandaardiseerde positie aanneemt (zie figuur 2). De
cosmetische score wordt in deze studie niet opgenomen wegens gebrek aan voldoende lange
follow up. Acute toxiciteit wordt gedefinieerd als het optreden van graad 2 toxiciteit, na
correctie voor RT in 1 of meerdere zones van de borst.
Figuur 2 Standaardinstellingen foto
4. Dosimetrische gegevens
Tijdens de planning worden verschillende structuren (borstkwadranten, areola, infra-
mammaire plooi en axillaire regio) van de borst ingetekend. Dosisvolume histogrammen en
huiddosis van deze structuren worden berekend om de relatie tussen stralingsgeïnduceerde
neveneffecten en de ontvangen dosis na te gaan.
5. DNA purificatie (Gentra®Purgene Protocol)
Voor de start van de RT worden twee EDTA buisjes van 5ml vol bloed afgenomen. Het
genomisch DNA wordt geïsoleerd uit 3ml vol bloed volgens het Gentra®Puregen protocol.
Om de cellyse te starten wordt 3ml bloed afkomstig uit een EDTA buis toegevoegd aan 9ml
RBC lyse (Qiagen) zodat een één op drie verhouding wordt bekomen. Dit wordt enkele malen
omgekeerd tot alles goed gemengd is. Vervolgens worden de stalen gedurende 5min
geïncubeerd op kamertemperatuur en gecentrifugeerd gedurende 5 min aan 2000xg. Het
supernatans wordt verwijderd tot er 200µl vloeistof samen met het pellet overblijft. Na hevig
vortexen, om de cellen opnieuw op te lossen in de overblijvende vloeistof, wordt 3ml cellyse
16
oplossing (Qiagen) toegevoegd. De stalen kunnen gedurende 2 jaar op kamertemperatuur
bewaard worden.
Om de eiwitten te verwijderen wordt 1 ml proteïne precipitatie buffer (Qiagen) aan het
cellysaat toegevoegd. Nadat deze oplossing voor 20 sec aan een hoge snelheid is gevortext,
wordt dit voor 5min op ijs geïncubeerd. Vervolgens wordt het geheel gedurende 5 min
gecentrifugeerd aan 2000xg zodat de eiwitten in een stevig donkerbruin pellet neerslaan.
Indien dit niet het geval is worden bovenstaande stappen herhaald.
Vervolgens gaat DNA precipitatie van start door het supernatans, dat het DNA bevat, over te
gieten in 3ml 100% isopropanol (VWR® Prolabo®). De buisjes worden 50 maal omgedraaid
totdat er witte DNA draden zichtbaar zijn. De stalen worden gedurende 3 min aan 2000xg
gecentrifugeerd. Daarna wordt het supernatans afgegoten en wordt de rest van de vloeistof
boven een absorberend papier kort afgedruppeld. Vervolgens wordt 3ml 70% ethanol (Sigma-
Aldrich®) toegevoegd om het DNA pellet te wassen. De buisjes worden enkele malen
omgedraaid. Na centrifugatie gedurende 1 min aan 2000xg wordt het supernatans voorzichtig
afgegoten. Het DNA pellet wordt gedurende 10 min aan de lucht gedroogd.
Om de DNA te hydrateren wordt 500µl DNA hydratatie oplossing (Qiagen) toegevoegd en
wordt er zacht gevortext gedurende 5 sec. Het geheel wordt gedurende een uur op 65°C
geïncubeerd. Na een nacht op kamertemperatuur, worden de buisjes kort gecentrifugeerd en
kunnen deze op 4°C/-20°C bewaard worden.
6. Concentratie- en kwaliteitsbepaling van het DNA
De concentratie en de kwaliteit van het geïsoleerd DNA wordt bepaald met behulp van de
Trinean DropSense-96 Multichannel fotospectometer. Deze microplaat lezer is beschikbaar
op de afdeling Medische Genetica van het UZ gent. De spectrometer zal voor elk staal de
absorptie van de UV stralen berekenen om vervolgens de concentratie (ng/µl) af te leiden. De
kwaliteit van de stalen wordt bepaalt via de absorptieratio van 260nm op 280nm. Deze waarde
moet boven de 1.8 grens bedragen. Lager gelegen waarden duiden op contaminatie van
proteïnenfenolen of andere contaminanten in het staal. Voor verdere analyse wordt de
stockoplossing DNA verdund naar een werkoplossing met een concentratie van 25 ng/µl door
toevoeging van een hoeveelheid TE buffer (10mMol).
17
7. Polymerase Chain Reaction
7.1. Principe
De Polymerase Chain Reaction (PCR) reactie is een in vitro wetenschappelijke techniek in de
moleculaire biologie om een specifiek fragment DNA te amplificeren voor verdere analyse.
Deze methode is gebaseerd op een thermische cyclus, die bestaat uit verschillende fasen van
opwarming en afkoeling om het DNA te smelten en enzymatisch te repliceren. Specifieke
primers bakenen het DNA fragmentje, die de te onderzoeken polymorfe regio bevat, af om
selectief en herhaaldelijk te amplificeren.
De thermische cyclus van het algemeen PCR programma bestaat uit 3 stappen en wordt 35
maal herhaald: een denaturatie stap, een annealingstap en een elongatie stap.
Tijdens de denaturatiestap wordt het DNA verhit tot 95°C zodat de waterstofbruggen tussen
de complementaire basen opgehoffen worden. Het dubbelstrengig DNA smelt in enkelstreng
DNA moleculen. Tijdens de annealingstap wordt een primerspecifieke temperatuur
aangehouden zodat de primers aan de complementaire regio van het enkelstreng DNA kunnen
binden. Deze annealing temperatuur (Ta) hangt af van de base samenstelling van de gekozen
primers. Tijdens deze stap zal het Taq polymerase vervolgens aan de primer template hybride
binden zodat de DNA synthese van start kan gaan. De elongatie stap gaat door bij een
temperatuur van 72°C zodat het Taq polymerase de DNA synthese optimaal kan uitvoeren.
Tabel 1 PCR programma
Algemeen programma Touchdownprogramma
95° 5 min 94° 2 min
95° 30 sec 94° 20 sec
Ta 30 sec 35 cycli Ta 15 sec 12 cycli
72° 30 sec -1° per cyclus
72° 1 min
72° 10 min
15° 10 min 94° 40 sec
Ta-12° 40 sec 24 cycli
72° 30 sec
72° 10 min
15° 10 min
Een alternatief voor het normaal programma is het het touchdown programma waarbij de
thermische cyclus opgesplitst is in 12 en 24 cycli. De eerste 12 cycli gaan door met een Ta die
18
elke cyclus met 1 graad daalt. De volgende 24 cycli gaan door met een Ta die 12°C lager ligt
dan de oorspronkelijke Ta. De verschillende programma’s worden ingesteld op het Bio-rad
c1000TM Thermal Cycler PCR toestel of GeneAmp®PCR Systeem 2700 van Applied
Biosystems.
De PCR protocols voor ATM c.5557G>A, XRCC1 c.1196A>G, XRCC1 c.580C>T en XRCC1
c.839G>A zijn reeds geoptimaliseerd binnen de onderzoeksgroep waarvan de PCR
programma’s weergegeven in tabel 2.
Tabel 2 PCR programma's van de geoptimaliseerde SNPs
Gen SNP Programma Ta (°C) Fragmentlengte (nt)
ATM c.5557G>A Algemeen 58 630
XRCC1 c.1196A>G Touchdown 69 849
c.580C>T
c.839G>A
Touchdown
Touchdown
67
69
504
849
7.2. PCR mix
Voor de bereiding van de PCR standaardmix weergegeven in tabel 3 wordt gebruik gemaakt
de KAPA Taq HotStart PCR kit van KAPA biosystem. Er wordt gewerkt in een totaalvolume
van 15µl (100mM). Deze kit bevat Buffer (5X), MgCl2 (25mM) en de 5U/µl KAP Taq
HotStart (500U). De dNTPs worden aangemaakt via het ultrapure dNTP set van Amensham
Pharmacia Biotech Inc. De stock dNTPs oplossing (10mM) wordt aangemaakt door van elke
dNTP stockoplossing 100µl toe te voegen aan 600µl Sigma H2O. De werkoplossing dNTP
(1mM) wordt bekomen door de stockoplossing 10 maal te verdunnen.
Tabel 3 Standaard PCR mix
Product Volume
dNTPs (1mM)† 3µl
Buffer (5X)* 3µl
MgCl2 (25mM)* 0.9µl
FWD (50µM)° 0.3µl
REV (50µM)° 0.3µl
Kappa Taq (0.6U)* 0.07µl
DNA (25ng/µl) 3µl
H2O‡ 4.43µl
Totaalvolume 15µl
†Amensham Pharmacia BiotechInc,*Kapa Biosystem,
°Integrated DNA Technologies®, ‡Sigma-Aldrich®
Door het DNA te vervangen door sigma water, wordt er een negatieve controle ingevoerd om
na te gaan of één van de reagentia gecontamineerd is.
19
7.3. PCR Primers
De referentie sequentie van het gen waarin de SNP gelegen is, is terug te vinden via NCBI
(57). Bij het manueel zoeken naar nieuwe primers dient deze aan een aantal voorwaarden te
voldoen. Er wordt gestreefd naar primers van 20 nucleotiden lang. De forward primer (FWD)
eindigt en de reverse primer (REV) begint met een C of G allel. De annaeling temperatuur van
de primer wordt berekend volgens de formule Ta ={(#T/A x 2)+(#G/C x4)}-2. Er wordt
getracht een primer te zoeken van 58°C zodat er een gelijk aantal C en G allelen ten opzichte
van A en T allelen aanwezig zijn in de primer. Van deze temperatuur kan afgeweken worden
afwijken zolang de FWD en REV dezelfde temperatuur hebben. Herhalingen van drie
dezelfde nucleotiden wordt best vermeden om hairpinvorming te vermijden. Een alternatief
voor primerselectie is het programma Primer3 Input version 0.4.0. (58). De primers worden
geleverd in poedervorm door Integrated DNA Technologies®. Deze worden tot een
concentratie van 250µM gebracht door een hoeveelheid 10mM TE buffer toe te voegen. De
werkoplossing van 50µM wordt bekomen door de stockoplossing vijf maal te verdunnen
(10µl stockoplossing+40µl 10mM TE buffer). De primers gebruikt voor de reeds
geoptimaliseerde SNP zijn terug te vinden in tabel 4.
Tabel 4 PCR Primers
Gen SNP Forward primer Reverse primer Lengte Ta
(5’ → 3’) (5’→3’) (nt) (°C)
ATM c.5557G>A TATGGTAATGGCCTAGACTG CATCAAGTACTATCCTAGGC 20 -20 58
XRCC1 c.1196A>G CTGGACTGCTGGGTCTGAG CTCCAGATTCCTGGCATTGC 19-20 69
c.839G>A CTGGACTGCTGGGTCTGAG CTCCAGATTCCTGGCATTGC 19-20 69
c.580C>T GTTCCGTGTGAAGGAGGAG CTTGGAGGTGCTGCCTATG 19-19 67
7.4. PCR controle
Om na te gaan of de PCR reactie geslaagd is en of de reactie niet gecontamineerd is, wordt
elektroforese uitgevoerd met een 1.5% agarose gel. Dit wordt gemaakt door 1.5g UltraPureTM
Agaraose (InvitrogenTM) aan 100ml TBE buffer (0.5X) toe te voegen. De agarose oplossing
wordt gedurende 2 min in de microgolf opgewarmd tot de vloeistof volledig doorzichtig is.
Vervolgens wordt de oplossing in de voorziene houder gegoten waarin een kam geplaatst is.
Na 30 min is de gel opgesteven om te laden. In het eerste laantje wordt 1.5µl 100bp DNA
Ladder (Quick-Load BioLabsInc.) geladen, de volgende laantjes worden telkens met 2µl PCR-
product, 1µl ladingsbuffer en 8µl Sigma water oppgevuld. Het elektroforesetoestel (Cosmo
Bio 135V) wordt ingesteld op 135Volt voor 27 min, waarna de gel voor 40 min gekleurd
20
wordt in een EthiumBromide (EtBr) (Gibco) bad, een 0.1% EtBr oplossing bestaand uit 1 liter
TBE buffer en 1 ml EtBr (500µg/ml). Vervolgens wordt de gel gevisualiseerd onder UV-licht
door deze op een UV plaat (UV Transilluminator,UPV) te plaatsen. Met behulp van de ladder
kan de grootte van elk fragment bepaald worden. Daarnaast wordt de negatieve controle
gecontroleerd op contaminatie.
7.5. Bereiding van TBE-buffer, ladingsbuffer en TE-buffer.
De stockoplossing (10X) van TBE buffer wordt bereid door 54g Tris (Sigma®), 27.5g Boraat
(Acros Organics) en 4.65g EDTA2Na (Sigma®) in 500ml dH2O op te lossen. Vervolgens
wordt de TBE stockoplossing (10x) 20 maal verdund om een TBE werkoplossing (0.5X) te
bekomen. Er wordt 50ml stockoplossing (10x) aan 950ml dH2O toegevoegd. TBE buffer
wordt gebruikt voor het maken van gels, voor de samenstelling van het EtBr oplossing (0.1%)
en voor het elektroforese bad.
De ladingsbuffer is samengesteld uit 500 µl glycerol, 250 µl broomfenolblauw (1%) en 250 µl
dH2O. Na de bereiding wordt het mengsel goed gevortexd en bewaard in 1.5 ml epjes op
-20°C. Glycerol wordt toegevoegd om het DNA te laten zakkenin de laantjes. Tevens zorgt de
broomfenolblauwkleurstof ervoor dat fragmenten zichtbaar zijn.
Door 6.05g Tris en 1.86g EDTA in 500ml dH2O op te lossen bekomt men de TE
stockoplossing (100mM). Vervolgens wordt de stockoplossing 10 maal te verdund om de TE
werkoplossing (10mM) te bekomen. De TE-buffer wordt gebruikt voor de bereiding van de
primers.
7.5. Optimalisatie PCR
In deze thesis wordt PCR protocol geoptimaliseerd voor MCR1 c.487C>T, ATM c. -111G>A,
FGFR2 c.110-12117T>C, TOX3 g.374T>C en MSH3 c.3133G>A.
De optimalisatie van een nieuwe SNP gaat van start door op zoek te gaan naar een nieuw
primerpaar zoals reeds eerder vermeld. Na bereiding van de standaardmix wordt een PCR
uitgevoerd met het algemeen programma met de berekende Ta van het primerpaar. Wanneer
overbodige amplificaties optreden kan een hogere annealing temperatuur ingesteld worden
zodat de primers minder mogelijkheden hebben om met aspecifieke regio’s te binden. De
condities kunnen nog verstrengd worden door het touchdownprogramma in te stellen. Er kan
ook overgeschakeld naar nieuwe PCR mix. Om het product specifieker te laten amplificeren
kan de concentratie MgCl2 verhoogd worden, of kan een hoeveelheid DMSO (Invitrogen)
toegevoegd worden om de denaturatie te bevorderen.
21
8. SNP bepaling
De genotypering van de geselecteerde SNP op patiëntmateriaal gebeurt via RFLP, HRM en
SS analyse.
8.1. Restricion Fragment Lenght Polymorphism
RFLP analyse is gebaseerd op digestie van het geamplificeerd DNA door een restrictie enzym
(RE). Door een enzym te selecteren met een herkenningssequentie die de polymorfe plaats
bevat, zal het RE in de aanwezigheid van het variant allel al dan niet knippen. Door de lengte
van het restrictie fragment te koppelen aan een allel wordt een genetische analyse uitgevoerd.
De keuze van het RE wordt bepaald met behulp van restriction mapper version 4 (59).
Invoeren van de sequentie van het PCR product geeft de mogelijke enzymen die ter hoogte
van de polymorfe plaats knippen. Verder bestaat de mogelijkheid om het restrictie proces
virtueel na te bootsen. Het gekozen enzym wordt geleverd door Biolabs®Inc. In de
bijgeleverde documenten staat de concentratie van RE, de incubatie temperatuur en de RE
specifieke NEBuffer vermeld. In tabel 5 zijn de RE weergeven van de reeds geoptimaliseerde
SNPs.
Tabel 5 Restrictie enzymen
SNP RE Aantal Units
NEBuffer Incubatietemperatuur Incubatietijd
XRCC1 c.1196A>G
HpaII 10U 1 37°C 3.5uur
XRCC1 c.580C>T
PvuII 10U 2 37°C 3uur
XRCC1 c.8396G>A
RsaI 10U 4
37°C 3uur
Standaard wordt er gewerkt met een totaalvolume van 30µl. Naast het volume RE dat tijdens
de optimalisatiestap bepaald wordt, wordt steeds 10% van het totaalvolume enzymspecifieke
buffer toegevoegd. Afhankelijk van de RE wordt Bovine Serum Albumine (BSA) bijgevoegd.
De digestmix wordt aangelengd met Sigma Water tot het gewenste totaalvolume bereikt
wordt. De samenstelling voor de digestmix van de reeds geoptimaliseerde SNPs zijn terug te
vinden in tabel 6.
Tabel 6 Digestmix
XRCC1 c.1196G>A
XRCC1 c.580C>T
XRCC1 c.8396G>A
dH2O* 16µl 19µl 19µl
PCR product 10µl 7µl 7µl
NEBuffer‡ 3µl 3µl 3µl
BSA‡ - - -
RE‡ 1µl (10U) 1µl (10U) 1µl (10U)
Digest volume 30 µl 30 µl 30 µl
* Sigma, ‡BioLabs Inc.
22
Voor de uitvoering van RFLP wordt de mix toegevoegd aan het PCR product. De ebjes
worden in het warmwaterbad geplaatst op een voor het enzym optimale temperatuur om
gedurende een vastgelegde periode te incuberen. Dit resulteert in verschillende restrictie
fragmenten. Deze fragmenten worden op basis van hun lengte gescheiden door elektroforese
met 2% agarosegel. Naast de 100bp DNA Ladder (Quick-Load BioLabsInc.) en het PCR
product (1µl ladingsbuffer, 2µl PCR product en 8 µH2O) wordt telkens 15µl digest product
geladen, nadat 3µl ladingsbuffer aan 30µl digestproduct is toegevoegd. Het
elektroforesetoestel (Cosmo Bio 135V) wordt voor minimum 40 minuten op 135Volt
ingesteld. De gel wordt gekleurd met EtBr (0.1%) en gevisualiseerd met UV-licht. Door het
PCR product te vergelijken met het digest product gaat men na of het restrictieproces volledig
is doorgegaan. Met behulp van de ladder wordt de grootte van de fragmentjes bepaald om de
genetische variatie op te sporen.
Voor de optimalisatie van RFLP worden verschillende condities getest door de hoeveelheid
PCR product te verlagen, de hoeveelheid units RE te verhogen en de incubatietijd te variëren
tot de verschillende fragmentjes zichtbaar zijn. Na optimalisatie van het PCR protocol van
ATM c.-111G>A, MSH3 c.3133A>G, MC1R c.478C>T, FGFR2 rs2981579 en TOX3
rs3803662, worden de digestcondities geoptimaliseerd.
8.2. High Resolution Melting analyse
HRM is een highthroughput methode gebruikt om genetische variaties te identificeren. De
methode is gebaseerd op PCR smelttechniek welke een DNA sequentie kan onderscheiden op
basis van hun compositie, lengte, GC inhoud of strengcomplementariteit. Het gewenste DNA
fragment wordt in aanwezigheid van een dubbelstrenig DNA bindende fluorescente
Meltdoctor HRM Dye (20X) geamplificeerd. De kleurstof bezit hoge fluorescentie wanneer
deze gebonden is met dubbelstreng DNA. Door een graduele uitsmelting van de resulterende
amplicons wordt de fluorescente kleurstof vrijgesteld en gedetecteerd door een optisch
systeem. De sequentievariatie wordt afgeleid uit de bekomen smeltcurves. De HRM mix en
het HRM programma voor de genotypering van XRCC3 c.722C>T zijn weergegeven in tabel
7 en 8. De HRM analyse wordt uitgevoerd met het 7500Fast Real-Time PCR system (Applied
Biosystems).
23
Tabel 7 XRCC3 c.722C>T
Product Volume (µl) Finale concentratie
AmpliTaq Gold® Buffer (10X)* 2 1X
MgCl (1.5mM)* 1.2 1.5mM
dNTP Mix (10mM)* 0.4 0.2mM
FWD† 1.2 300nM
REV† 1.2 300nM
Meltdoctor HRM Dye (20X)* 1 1X
AmpliTag Gold® 360 DNA polymerase (5U/µl)* 0.05 0.0125U/µl(0.25U)
dH2O‡ 11.95
DNA 1
Totaalvolume 20
*Applied Biosystems, †IDT, ‡Sigma
Tabel 8 HRM programma
Stadium Proces Temperatuur (°C) Tijd
Precyclische fase Enzymactivatie 95 10min
Cyclische fase (10 cycli) Denaratie 95 15sec
Annealing/Extensie 60 1min
Smeltcurve / dissociatie Denaturatie 95 10sec
Annealing 60 1min
HRM 95 15sec
Annealing 60 15sec
De analyse van de gegevens worden verwerkt met behulp van HRM software v2.0. (AB). De
fluorescentiegraad wordt in functie van de temperatuur uitgezet om het karakteristieke
smeltpatroon van het amplicon te bekomen waaruit de sequentievariatie wordt afgeleid. De
vorm van de smeltcurve hangt af van de thermische stabiliteit van het fragment dat bepaald
wordt door de sequentie. Homozygoten hebben dezelfde vorm van smeltcurve, maar zijn te
onderscheiden door een verschuiving in smelttemperatuur. Heterozygoten kunnen
onderscheiden worden door de vormverandering in de smeltcurve afkomstig van de
heteroduplexen. Om de variante genotypes van het wild type te kunnen onderscheiden, is er
voor elk genotype een gekend staal nodig. De smeltcurve voor de verschillende genotypes van
XRCC3 c.722C>T is weergegeven in figuur 3.
Figuur 3 XRCC3 c.722C>T Smeltcurve
24
8.3. SnapShot analyse
8.3.1. Principe
Het SS genotyperingsmethode is gebaseerd op extensie van een ongelabelde oligonucleotide
primer. De primer bindt de targetsequentie upstream of downstream van de te onderzoeken
SNP. Vervolgens wordt een fluorescent gelabeld dideoxy nucleotide (ddNTP) ingebouwd ter
hoogte van de polymorfe plaats. Het inbouwen van ddNTPs die een 3’hydroxyl groep missen,
maken het onmogelijk om andere nucleotides verder in te bouwen. Analyse van het
fluorescent signaal laat toe het genotype te bepalen. Deze techniek wordt toegepast voor de
genotypering van ATM c.5557G>A, de gebruikte SS primer is weergegeven in figuur 4.
Figuur 4 ATM c.5557G>A SS13 primer
8.3.2. SnapShot protocol
Het DNA fragment, dat het te onderzoeken polymorfisme bevat, wordt via PCR
geamplificeerd. Het PCR protocol van ATM c.5557G>A is terug te vinden in bijlage…
Het protocol van SS bestaat uit 3 stappen: het opzuiveren van het PCR product, de SS PCR
reactie en het opzuiveren van het SS product.
Het opzuiveren van het PCR product gebeurt door aan 5 µl PCR product, 1µl vSAP (usb) en
1µl vEXO (usb) toe te voegen. De vSAP verwijdert de overhangende eindjes. Terwijl vEXO
instaat voor de vernietiging van de fosfaatbindingen. De bewerking gaat door op ijs. De stalen
worden goed gevortexd en afgedraaid voor ze in het PCR toestel worden overgebracht. Het
EXP000 programma (zie tabel 9) wordt gestart. Bij afloop wordt de reactie onmiddellijk op ijs
gezet.
Tabel 9 SS PCR programma
De MasterMix (MM) nodig voor de SS PCR reactie bestaat uit 0.5µl primer, 1.25µl vRR mix
en 2.25µl H2O. De vRR mix wordt bekomen door de RRmix (ABI Prism SNaPshot multiplex
kit) 8 maal te verdunnen met Tris HCl MgCl2 (Sigma). Uiteindelijk wordt 4µl MM aan 2µl
opgezuiverd PCR product toegevoegd. De stalen worden in het PCR toestel geplaatsts waar
EXP000 programma SS Run programma
37°C 60 min 96°C 10 sec
75°C 15 min 50°C 5 sec 30 cycli
60°C 30 sec
25
het SSRun programma (tabel 9) wordt ingesteld. Opnieuw dient de reactie onmiddellijk op ijs
gezet worden tot de stalen volledig afgekoeld zijn na afloop van het PCR programma.
De laatste stap is het opzuiveren van het SSproduct. Aan elk staal wordt 1µl vSAP
toegevoegd. Het EXP000 programma wordt in het PCR toestel ingesteld. Naderhand worden
de stalen zachtjes gevortexd en gecentrifugeerd. Deze kunnen bewaard worden bij een
temperatuur van -20°C.
8.3.3. SS analyse
Fragmentanalyse gebeurt door de stalen te laden op de ABI3730xl Genetic Analyser. Voor de
analyse wordt gebruik gemaakt van de Peak Scanner Software v1.0 (AppliedBiosystems).
Voor elk staal wordt een grafiek verkregen waarbij de pieksterkte in functie van de lengte van
het fragment wordt uitgezet. Elk nucleotide heeft een andere kleur.
Voor de bepaling van ATM c.5557G>A gaf het gebruik van een REV het beste resultaat. Een
zwarte piek duidt op de aanwezigheid van een G allel op de polymorfe plaats. Een rood
fluorescente piek zal wijzen op de aanwezigheid van een A allel. Wanneer beide pieken
aanwezig zijn, duidt dit op een heterozygoot genotype. De verschillende genotypes zijn
weergegeven in figuur 5.
Figuur 5 Chromotogram van ATMc.5557G>A na SnapShot
9. Kwaliteitscontrole
Om te controleren of de genotypes juist bepaald zijn, wordt voor elke SNP ongeveer 15% van
alle stalen opnieuw genotypeerd. Wanneer het polymorfisme niet overeenkomt met de
oorspronkelijk gevonden genotype, wordt de reactie opnieuw overgedaan.
26
10. Statistische Analyse
In deze studie worden 5 eindpunten onderzocht namelijk dermatitis, desquamatie, oedeem van
de borst en arola en pruritus. Voor elk van deze eindpunten wordt er naar een associatie
gezocht met de geselecteerde genetische polymorfismen. Voor elk onderzochte complicatie
worden de borstkankerpatiënten opgedeeld in een groep met geen tot milde acute
huidtoxiciteit (CTC0-1) en een groep met matig tot ernstige huidtoxiciteit (CTC1-2). De groep
met geen tot milde acute huidtoxiciteit wordt als referentiegroep beschouwd.
Een univariate analyse gaat de invloed van mogelijke confoundingfactoren zoals klinische en
dosimetrische parameters na via Chi-Square of Mann-Witney U Test. Deze worden in
rekening gebracht voor verdere analyse indien deze betrokken lijken.
Om de associatie tussen de genetische polymorfismen en acute huidtoxiciteit te bepalen maakt
men gebruik van logistieke regressie analyse waarbij odds ratio’s met bijhorende p-waarden
worden bekomen. Vooraf wordt er getest of de SNP consistent zijn met het Hardy-Weinberg
Equilibrium (HWE) gebruikmakend van de geobserveerde genotypefrequenties en een Chi-
Square test.
De statische analyse wordt uitgevoerd met behulp van het SPSS v16.0 Software pakket.Een p-
waarde lager of gelijk aan 0.05 wijst op een statistische significante associatie. Een trend treed
op wanneer er een associatie aanwezig is zonder significantie. Odds Ratio (OR) >1 duiden op
een verhoogd risicoeffect, terwijl OR>1 op een protectief effect duiden.
27
Resultaten
1. Optimalisatie RFLP
Het RFLP protocol voor XRCC1 c.1196A>G, XRCC1 c.580C>T, XRCC1 c.839G>A en
XRCC3 c7022G>A zijn reeds binnen deze onderzoeksgroep geoptimaliseerd en zijn terug te
vinden in bijlage C. De PCR en RFLP reactie van ATM c.5557G>A, ATM c.-111G>A, MC1R
c.478C>T, MSH3 c.3133A>G, FGFR2 rs2981579, en TOX rs3803662 wordt binnen deze
studie geoptimaliseerd zodat men op een eenvoudige en goedkope manier aan genotypering
kan doen.
1.1. ATM c.5557G>A
Deze nucleotide verandering bezit geen knipplaats voor een RE. De SNP bevindt zich in een
zeer polymorfe regio van het ATM gen. Door deze complexiciteit is het onmogelijk om te
genotypering via HRM. Een gemodificeerde vorm van PCR, de Polymerase chain reaction
Mediated site Directed Mutagenesis (PSDM) techniek volgens Maillet et al (1999) (60) werd
toegepast.
Tabel 10 Primerpaar ATM c.5557G>A
SNP Primer nr. Primer sequentie Primerlengte (nt) Ta(°C)
ATM c.5557G>A FWD 188 5’-GATTCATGATATTTTACTCCAA-3’ 22 52
REV 189 5’-AAGACAGCTGGTGAAAAATC-3’ 20 54
Zoals op figuur 6 te zien is bouwt de PSDM techniek met behulp van de FWD188 (zie tabel
10) een knipplaats in voor het Ddel enzym. In aanwezigheid van ATM c.5557G ontstaat er de
CTNAG sequentie waardoor Ddel RE het PCR product van het 88bp in 2 fragmenten van
69bp en 19 bp kan knippen. Wanneer het A allel aanwezig is, ontstaat er geen knipplaats en
kan men de verschillende genotypes van elkaar onderscheiden.
Figuur 6 Principe van PSDM
De PSDM reactie wordt uitgevoerd volgens de werkwijze van Maillet et al. De PCR mix
bestaat uit 5µl DNA (25ng/µl), 5µl dNTP’s (1mM), 2.5µl buffer (5X) en 0.75µl MgCl2
(25mM), 0.5µl FWD (50µM) en 0.5µl REV (50µM), 0.12µl KAPATaq (0.6U) en wordt
28
aangevuld met sigma water tot een eindvolume van 25µl. Het PCR programma wordt
aangepast volgens Maillet et al (2010) (5 min op 94°C; 35 cycli van 30 sec op 94°C, 30 sec op
48°C, 30 sec op 72°C; 30sec op 72°C en 2 min op 15°C). Een Ta van 48°C gaf aspecifieke
amplificaties, daarom wordt deze verhoogd tot 56°C. Om de grootte van het kleine fragment
te bepalen wordt de doorlooptijd van het elektroforesetoestel ingesteld op 45 min en wordt er
een Low Molecular Weight DNA Ladder (biolabs) gebruikt (zie figuur 3).
Figuur 7 Low Molecular Weight DNA Ladder en ATM c.5557G>A PCR product
Het digestproces wordt experimenteel getest met verschillende digestmixen tot 14 units RE.
De optimale incubatie temperatuur voor DdeI is 37°C. Nadat verschillende doorlooptijden en
verschillende agarosegels (% agarose) uitgetest zijn om het verschil van 19bp te detecteren,
bleef het resultaat steeds een smeer van fragmenten. Uiteindelijk is er besloten om de PSDM
techniek stop te zetten en over te schakelen naar SnapShot techniek om de genotypes te
bepalen.
1.2 ATM c.-111G>A
Voor de optimalisatie van de PCR reactie van ATM c.-111G>A wordt er manueel naar een
primerpaar gezocht. De geselecteerde primers FWD181 en REV 182 (zie tabel 11) hebben
een Ta van 60°C en kunnen een PCR fragmentje van 288bp amplificeren.
Tabel 11 Primerpaar ATM c.-111G>A
SNP Primer nr. Primer sequentie Primerlengte (nt) Ta(°C)
ATM c.-111G>A FWD 181 5’-CTGCTTGGCGTTGCTTCTTC-3’ 20nt 60°C
REV 182 5’-TGCATGAGATTGGCGGTCTG-3’ 20nt 60°C
De standaard PCR mix wordt uitgetest met het algemeen PCR programma met een Ta van
60°C. Na gelelektroforese en EtBr kleuring is er een duidelijk fragmentje te zien ter hoogte
van 288bp. Vervolgens wordt via RestrictionMapper het RE SacII geselecteerd. Het RE knipt
in aanwezigheid van het WT G allel het PCR product in drie PCR fragmenten met een grootte
van 46, 114 en 128 bp. In aanwezigheid van het variant het A allel wordt het PCR fragment
29
geknipt in twee fragmenten van 128bp en 160 bp. De optimale incubatie temperatuur van
SacII is 37°C. Drie digestmixen worden bereid met 2, 4 en 6 units (U) RE. Voor elk mengsel
worden telkens twee stalen voor twee uur, vier uur en overnachting geïncubeerd. Via
gelelektroforese wordt het resultaat gecontroleerd. Het enzym heeft voor elke mix en
incubatietijd geknipt. Het onderscheid tussen WT en homozygoot variant genotype is
zichtbaar, maar het heterozygoot genotype niet. Om die reden wordt een nieuwe digestmix
bereid van 10U om na te gaan of het RE weldegelijk juist geknipt heeft. Dit wordt geladen in
een 2% agarose gel met een doorlooptijd van 85min, zodanig dat het verschil tussen de
fragmenten duidelijk zichtbaar wordt.
Figuur 8 ATM c.-111G>A: Optimalisatie digest
Op de gel (figuur 8) is een onderscheid te zien tussen de A/G hetero- en homozygoten voor
zowel 2U als 10U. Dit wijst erop dat de doorlooptijd van de gelelektroforese van belang is.
Voor de optimalisatie van het RFLP wordt een digestmix van 2U en een incubatietijd van
twee uur geselecteerd. Het volledig RFLP protocol is beschreven in bijlage D.
1.3. MSH3 c.3133A>G
Om de PCR reactie van MSH3 c.3133A>G te optimaliseren werd een primerpaar FWD194 en
REV195 (zie tabel 12) geselecteerd met Ta van 58°C. Eerst werd het algemeen PCR
programma van 58°C getest. Dit gaf het gewenste PCR product van 243bp, maar ook een
aspecifieke smeerrand ter hoogte van 1000bp die voor onduidelijkheden kunnen zorgen.
Daarom wordt de Ta verhoogd met stappen van 2°C tot 68°C. De smeer bleef hangen tot een
Ta van 68°C, welke geen amplificatie meer mogelijk maakt. Vervolgens werd gesleuteld aan
de PCR mix, toevoegen van 10% DMSO gaf een optimaal resultaat.
Tabel 12 Primers MSH3 c.3133G>A
SNP Primer nr. Primer sequentie Primerlengte (nt) Ta(°C)
MSH3 c.3133G>A FWD 194 5’-ACAGGCAAGTAGGAACAGTG-3' 20 58
FWD 236 5’-GTATGATTGTGCCACTGCAC-3' 20 58
REV 195 5’-TCTCCAGGAACATCTGCTAG-3’ 20 58
30
Het TseI RE knipt het PCR product in aanwezigheid van het variant G allel in fragmenten van
134bp, 57bp en 52bp en in aanwezigheid van het WT A allel in 191bp en 51bp fragmentjes.
Een digest werd uitgevoerd met 2, 4 en 6U RE waarvan telkens twee stalen voor een
incubatietijd van twee uur, vier uur en een overnachting in een warmwaterbad van 65°C zijn
geplaatst. Voor elk digestmix en incubatietijd zijn de homozygoten en heterozygoten af te
lezen, maar voor een digestmix van 2U na 4 uur incubatie is het resultaat het duidelijkst. De
splitsing is doorgegaan, maar de fragmenten wijken af van grootte. Het fragment van
theoretisch 191bp was bij onze analyse groter dan 200bp. Daar kon echter geen verklaring
voor gevonden worden. Dus werd er beslist om een nieuwe FWD uit te testen zodat er een
groter PCR fragment geamplificeerd werd.
De PCR reactie werd uitgevoerd met 1.5mM, 2mM en 2.5mM MgCl en 5% DMSO bij het
algemeen PCR programma met Ta van 58°C en 60°C en een touchdownprogramma van
58°C. Het optimale resultaat wordt bekomen met 1.5mM MgCl2 en een Ta van 60°C. Enkel
ter hoogte van 474bp is er een amplificatie te zien zonder smeer. De geoptimaliseerde
digestcondities worden getest voor het nieuwe PCR fragment. Het RE knipt het PCR product
in een fragment van 365bp, 57bp en 52bp indien het G allel aanwezig is en in een fragment
van 422bp en 52 bp indien het A allel aanwezig is. Op figuur 4 is er een duidelijk verschil in
genotypes te zien voor een incubatie op 65°C gedurende vier uur. Het RFLP protocol voor
MSH3 c.3133G>A is in bijlage D terug te vinden.
Figuur 9 MSH3 c.3133G>A: Digest (4U,4u) na PCR reactie met FOW 194 en REV 195 (boven)
1.4. MC1R c.478C>T
Voor de optimalisatie van MCR1 c.478C>T is een primerpaar weergegeven in tabel 13 met Ta
van 62°C geselecteerd om een PCR fragment van 274 bp te amplificeren.
Tabel 13 Primerpaar MCR1 c.478C>T
SNP Primer nr. Primer sequentie Primerlengte (nt) Ta(°C)
MCR1 c.478C>T FWD 190 5’-GACGTGATCACCTGCAGCTC-3’ 20 62
REV 191 5’-CCAGCATGTGGACGTACAGC-3’ 20 62
31
Met de PCR standaardmix wordt het algemeen PCR programma uitgetest voor Ta=62°C en
Ta=64°C. Het resultaat is een amplificatie van 274bp met een permanent aanwezig aspecifieke
smeer boven de 1000bp. Bij het uittesten van verschillende PCR programma is de smeer
verdwenen met een aangepast PCR programma waarbij de fasen van de cycli telkens 1 minuut
duren. SacII RE knipt het PCR product in een fragment van 156bp en 118bp in aanwezigheid
van WT C allel en indien het T allel aanwezig wordt er niet geknipt. De digestcondities zijn
uitgetest voor een digest mix van 2, 4 en 6U waarvan telkens twee stalen van elke mix voor
twee uur, vier uur en een overnacht geïncubeerd worden bij een temperatuur van 37°C.
Figuur 10 MCR1 c.478C>T: Optimalisatie digest
Bij een digestmix van 2U en een incubatietijd van vier uur zijn de verschillende genotypes het
duidelijkst van elkaar te onderscheiden. In de bijlage D kan het afgewerkte RFLP protocol
van MCR1 c.478C>T geraadpleegd worden.
1.5. FGFR2 rs2981579
Voor de optimalisatie van het RFLP protocol van FGFR2 rs2981579 worden twee primers
(zie tabel 14) met een Ta van 60°C geselecteerd die een PCR fragment van 768bp
overspannen.
Tabel 14 Primerpaar FGFR2 rs2981579
SNP Primer nr. Primer sequentie Primerlengte (nt) Ta(°C)
FGFR2 rs2981579 FWD 227 5’-AGCCAGAGTGTCAGAGAGAG-3’ 20 60
REV 228 5’-ATTCTGCTTCCTGCTGGTCG-3’ 20 60
Een PCR reactie wordt uitgevoerd met MgCl2 concentratie van 1.5mM, 2mM en 2.5mM en
5%DMSO. De PCR met 2.5mM MgCl2 uitgevoerd op 60°C bereikt het beste resultaat. Het
PstI RE knipt enkel in aanwezigheid van het C allel zodat fragmenten van 289 en 479 bp
ontstaan.
32
Figuur 11 FGFR2 rs2981579: Optimalisatie digest
De optimalisatie van de digestconditie wordt uitgetest met een digestmix van vier, zes en acht
U waarbij een duidelijk onderscheid op de gel weergegeven in figuur 11 tussen de homo- en
heterozygoten te zien is bij een digestmix van 4U na een incubatietijd van vier uur. Het
volledig uitgewerkt protocol van FGFR2 rs2981579 is terug te vinden in bijlage D.
1.6. TOX rs3803662
Om het fragment dat het te onderzoeken polymorfisme TOX3 rs3803662 flankeert, te
amplificeren word het primerpaar FWD 240 en REV 241 (zie tabel 15) geselecteerd.
Tabel 15 Primerpaar TOX rs3803662
SNP Primernummer. Primer sequentie Primerlengte (nt) Ta(°C)
TOX3 rs3803662 FWD 240 5’-TCCTTGGCTGTTCTGTGATC-3’ 20 58
REV 241 5’-CTGAACTCTTCACGATAAGC -3’ 20 58
Een PCR reactie wordt uitgevoerd met een Ta van 58°C om een fragment van 608bp te
amplificeren. Dit blijkt de ideale conditie om de PCR uit te voeren. Het BsmAI RE knipt het
PCR product in aanwezigheid van het C allel in een fragment van 484bp en 124bp.. In
aanwezigheid van het T allel wordt het PCR product in drie fragmenten geknipt nl. 298bp,
186bp en 124 bp.
Figuur 12 TOX3 rs3803662: Optimalisatie digest
De digestmix van 2, 4 en 6U worden voor twee uur, vier uur en een overnacht geïncubeerd op
55°C. De genotypes zijn het best te onderscheiden bij een digestmix van 4U na een
33
incubatietijd van twee uur. Het protocol van TOX3 rs3803662 is terug te vinden in bijlage D.
2. Associatiestudie naar acute huidtoxiciteit
Het klinisch eindpunt binnen deze studie is acute huidtoxiciteit. Dermatitis, desquamatie,
pruritus, oedeem van de borst en areola werden bij 80 borstkankerpatiënten gescoord. Van de
totale populatie ontwikkelde 37.5% dermatitis en 11.3% desquamatie. Oedeem van de borst
werd bij 10% van de vrouwen geobserveerd, terwijl oedeem van de areola bij 15%
voorkwam. Pruritus werd bij 2.5% van de vrouwen vastgesteld. Omdat er slechts 2 patiënten
pruritus ontwikkelden, werd de analyse naar een associatie met acute huidtoxiciteit
achterwege gelaten.
2.1. Analyse van klinische factoren
In bijlage E is een overzicht te zien van de resultaten van de univariate analyse van de
onderzochte klinische factoren. Significante associaties worden als confounders beschouwd
zodat deze in rekening worden gebracht tijdens de multivariate analyse van de SNP.
2.1.1. Univariate analyse van klinische factoren met het optreden van dermatitis
RT geïnduceerde dermatitis komt minder voor bij patiënten die chemotherapie (OR=0.28,
p=0.034) of target therapie (OR=0.19, p=0.091) zijn voorgeschreven. Dit is in tegenstelling
tot de patiënten die hormoontherapie (OR=2.46, p=0.095) volgen. Zij hebben een grotere kans
op de ontwikkeling dermatitis.
Het ontwikkelen van dermatitis is significant geassocieerd met een verlaagde luteïniserend
hormoon (LH) concentratie (p=0.039) en verlaagd follikel stimulerend hormoon (FSH)
concentratie (p=0.068). Lijders van diabetes mellitus zijn significant geassocieerd met een
hoger risico om dermatitis te ontwikkelen (OR=7.08, 0.052). Een trend wordt opgemerkt bij
vrouwen die een ovariectomie hebben ondergaan met een groter risico op optreden van
dermatitis dan bij vrouwen met een ovarium (OR=2.93, p=0.149).
Vrouwen met een borstcup groter of gelijk aan C hebben een verhoogde kans op ontwikkeling
van dermatitis ten opzichte van vrouwen met een kleinere borstcup (OR= 2.28, p=0.106). Het
histogram (figuur 13) toont aan dat naarmate de borstcup vergroot, er een duidelijke stijging
merkbaar is in het optreden van dermatitis. Er kan een toxiciteitgrens afgeleid worden tussen
de C- en D-cup (OR=4.33, p=0.029).
34
Figuur 13 Procentuele verdeling volgens borstcup voor het optreden van dermatitis
2.1.1. Univariate analyse van klinische factoren met het optreden van desquamatie
Het optreden van stralingsgeïnduceerde desquamatie komt significant vaker voor bij patiënten
die lijden aan diabetes (OR=6.19, p=0.042) of bij patiënten die reeds een ovariectomie
(OR=6.3, p=0.016) hebben ondergaan. Vrouwen die chemotherapie (p=0.048) doorstonden
ontwikkelen minder vaak desquamatie in vergelijking met de vrouwen die dit niet kregen. Dit
is terug in tegenstelling tot vrouwen die hormoontherapie (p=0.108) werd voorgeschreven.
2.1.2. Univariate analyse van klinische factoren met het optreden van oedeem van de borst
Het optreden van oedeem van de borst werd enkel significant geassocieerd bevonden met de
lokalisatie van de tumor. Als de tumor in de linker borst gelegen is de kans om oedeem te
ontwikkelen groter dan wanneer de tumor in de rechter borst gelokaliseerd is (OR=7.62,
p=0.034). Chemo komt terug minder vaak voor bij patiënten die borstoedeem ontwikkelen.
(p=0.064). Roken (OR= 1.53, p= 0.091) en hypertensie (OR=1.47, p=0.097) kunnen het risico
op borstoedeem verder verhogen.
2.1.2. Univariate analyse van klinische factoren met het optreden vanvan areola
Een verlaagde LH concentratie (p= 0.011) en FSH (p=0.046) concentratie in het bloed blijkt
significant geassocieerd te zijn met het ontwikkelen van oedeem ter hoogt van de areola. In
tegenstelling tot de hoge oestradiol waarden dat geassocieerd is met de ontwikkeling van arola
oedeem (p=0.02). Verder kan gesteld worden dat arela oedeem minder vaak voorkomt bij
patiënten die chemotherapie ondergingen (OR=0.28, p=0.102). Tevens hebben patiënten die
een boost met elektronen gekregen hebben minder kans om oedeem te ontwikkelen ten
opzichte van een boost met fotonen (0.069).
2.2. Analyse van dosimetrische factoren
Met betrekking tot dosimetrische factoren werd een univariate analyse uitgevoerd tussen de
voorgeschreven tumordosis (CTV_WBI) en acute huidtoxiciteit van de volledige borst. In het
35
overzicht van bijlage F zijn de gemiddelde tumordosissen voor beide groepen weergegeven.
De CTC0-1 en CTC2+ groep vertonen geen significante verschillen met betrekking tot de
tumordosis en de verschillende eindpunten van acute huidtoxiciteit. Tevens werd de
huidtoxiciteit (D) per kwadrant vergeleken met de gekregen huiddosis in dat kwadrant. Er
werden geen verschillen in dosis geobserveerd tussen de groep dat toxiciteit ontwikkeld en
deze die geen toxiciteit ontwikkelen.
2.3. Analyse van de geselecteerde SNPs
Het overzicht in bijlage G geeft de geobserveerde genotypes weer van de 10 geselecteerde
polymorfismen. Alle SNPs zijn consistent bevonden met het Hardy-Weinberg Equilibrium
(HWE). De minor allel frequenties en p-waarden voor HWE zijn weergegeven in bijlage H.
2.3.1. Dermatitis
De resultaten van de genotype analyse in verband met dermatitis zijn in bijlage I
weergegeven. Dragers van het heterozygoot genotype van ATM c.5557G>A werden
geassocieerd bevonden met een verlaagd risico op het ontwikkelen van dermatitis (OR=0.359,
p =0.102) in vergelijking met het WT. Het verlaagd risico kwam sterker tot uiting wanneer
het GA en AA genotype tot het WT (GG) werd vergeleken (OR=0.317, p=0.064). Hoewel de
resultaten van de heterozygoot vergelijking (OR=0.315, p=0.17) en het dominant model
(OR=0.241, p=0.084) minder significant zijn na correctie voor de confoundingfactoren blijft
de trend zichtbaar. Dragers van het variant A allel hebben een kleinere kans om dermatitis te
ontwikkelen na RT ten opzichte van dragers van het WT. De genotypefrequenties voor ATM
c.5557G>A zijn weergegeven in figuur 14.
Figuur 14 Risicoanalyse dermatitis: genotypefrequentie van ATM c.5557G>A (dominant model), XRCC1
c.839G>A, XRCC3 c.722C>T (recessief model), MSH3 c.3133A>G (dominant model)
36
Na analyse van het XRCC1 c.839G>A polymorfisme met betrekking tot dermatitis, is er een
significante associatie gevonden tussen de dragers van het GA allel en een verhoogd risico op
dermatitis ten opzichte van de dragers van het WT allel (OR=2.25, p=0.25). Na correctie van
de confounderfactors verdween de statistische significantie, maar de trend bleef aanwezig om
nog van een verhoogd risico effect van het GA genotype te spreken (OR=4.254, p=0.119).
Door afwezigheid van het variant homozygoot genotype is het niet mogelijk om het effect van
twee risicoallelen na te gaan. De genotypefrequenties van XRCC1 c.839G>A zijn in figuur 14
terug te vinden.
Analyse van XRCC3 c.722C>T en het risico op dermatitis toont een associatie aan tussen de
dragers van het TT genotype en een verhoogd risico op het optreden van dermatitis ten
opzicht van het WT (OR=3.68, p=0.057). Een gelijkaardig risico wordt teruggevonden
wanneer het TT genotype vergeleken wordt ten opzichte van het CC en CT genotype samen
(OR=3.2, p=0.064). Dit wijst op een recessief verhoogd effect van TT genotype voor
dermatitis. De trend is nog steeds aanwezig in de multivariate analyse, maar de homozygoot
variante vergelijking (OR=2.602, p= 0.334) en recessief model (OR=3.453, p=0.159) zijn
minder statistisch significant. In figuur 14 staan de genotypefrequenties van XRCC3
c.722C>T weergegeven.
Na de multivariate analyse van MSH3 c.3133A>G treedt er een significante associatie op
tussen de dragers van het AG genotype en een verhoogd risico om dermatitis te ontwikkelen
in vergelijking met de dragers van het WT (OR=6.494,p=0.024). Als in het dominant model
de dragers van het AG en GG genotype vergeleken worden met dragers van het AA genotype
wordt het verhoogd risico bij de aanwezigheid van het G allel bevestigd (OR=4.851,
p=0.042). Dit wijst op het dominant effect van het G allel met betrekking tot een verhoogd
risico op dermatitis.
2.3.2. Desquamatie
De resultaten met de betrekking tot de SNP analyse voor desquamatie zijn terug te vinden in
bijlage I. Daaruit blijkt dat het heterozygoot XRCC1 c.839G>A genotype geassocieerd is met
een verhoogd risico op het ontwikkelen van desquamatie in vergelijking met het GG WT
genotype (OR=4.214, p=0.077). Door afwezigheid van een homozygoot variant genotype in
de onderzoekspopulatie kan het effect van twee A allelen niet worden nagegaan. Multivariate
analyse van kon dit echter niet bevestigen (OR=0.986, p=0.992). De genotypefrequenties van
dit polymorfisme zijn afgebeeld in figuur 15.
37
Figuur 15 Risicoanalyse desquamatie: genotypefrequentie van XRCC1 c.839G>A,
XRCC3 c.722C>T (dominant model)
Dragers van het TT genotype van XRCC3 c.722C>T hebben een verhoogd risico op
desquamatie ten opzichte van de referentiegroep (OR=9.6, p=0.062). Dit wordt ook
teruggevonden wanneer het CT en TT genotype vergeleken wordt met het WT (OR=6.737,
p=0.079). Deze associatie toont aan dat de aanwezigheid van het variant XRCC3 c.722 T allel
de kans om desquamatie te ontwikkelen doet stijgen. Na de multivariate analyse bleef de trend
duidelijk aanwezig voor zowel de homozygoot variante vergelijking (OR=7.844, p=0.124) als
het dominant model (OR=5.166, p=0.147). Het XRCC3 c.722C>T genotypefrequentie is
voorgesteld in figuur 15.
2.3.3. Oedeem van de borst
De resultaten van analyse van de SNP naar een associatie met oedeem van de borst zijn
weergegeven in bijlage I. Uit de analyse naar het effect van het ATM 5557G>A polymorfisme
bleek dat dragers van het AA genotype een verhoogd risico hebben om oedeem van de borst
te ontwikkelen in vergelijking met het GG en GA genotype (OR=12.5, p= 0.094). Verder
onderzoek naar het recessief effect van het A variant bevestigt deze bevindingen (OR=11.167,
p= 0.102). Na correctie van de confounders gaat de significantie verloren, maar blijft de trend
aanwezig voor zowel de homogzygoot variant vergelijking (OR=4.49, p=0.3270.094) als het
recessief model (OR=4.20, p=0.388). Het ATM 5557G>A genotypefrequentie is weergegeven
in figuur 16.
Figuur 16 Risicoanalyse oedeem van de borst: genotypefrequentie van ATM c.5557G>A, ATM c.-111G>A
(recessief model), TOX3 rs3803662C>T (dominant model)
38
Verder werd er na analyse van het ATM c.-111G>A polymofisme een verhoogd risico op de
ontwikkeling van oedeem ter hoogte van de borst gevonden bij de dragers van het AA
genotype ten opzichte van dragers van het GG en GA genotype (OR=3.667, p=0.089). Verder
bleek een verhoogd risico aannemelijk wanneer het AA genotype met GG vergeleken werd
(OR=4.00, p=0.239). Voor de multivariate analyse waarbij de confoundingfactoren in
rekening werden gebracht bleef deze trend zichtbaar bij de homozygoot variant vergelijking
(OR=3.87, p=0.271) en het recessief model (OR=2.76, p=0.215). In figuur 16 staan de ATM
c.-111G>A genotypefrequenties weergegeven.
Uit de resultaten van de analyse met TOX3 rs3803662C>T bleek dat dragers van het CT
genotype een groter risico hebben om oedeem te ontwikkelen ter hoogte van de borst in
vergelijking met dragers van het CC genotype (OR=7.5, p=0.069). Er wordt eveneens een
associatie waargenomen tussen het CT en TT genotype ten opzichte van CC genotype
(OR=6.176, p=0.1). Dit wijst op een dominant verhoogd effect van het variant T allel op de
ontwikkeling van borstoedeem. De trend blijft aanwezig na correctie voor confounders voor
de heterozygoot variant genotype vergelijking (OR=7.36, p=0.082) en het dominant model
(OR=6.04, p=0.115). De genotypefrequenties van TOX3 rs3803662C>T zijn weergegeven in
figuur 16.
2.3.4. Oedeem van de areola
Resultaten van de univariate analyse tussen de SNPs en oedeem van de areola bevinden zich
in bijlage I. Er zijn geen significante associaties gevonden.
39
Discussie
Het doel van deze thesis is de associaties na te gaan tussen SNP en het optreden van acute
radiotoxiciteit ter hoogte van de huid. In het eerste onderdeel wordt het PCR-RFLP protocol
van enkele SNPs geoptimaliseerd. In het tweede onderdeel wordt de genotypes bepaald van
de 10 geselecteerde SNPs. Vervolgens wordt er gezocht naar de genetische susceptibiliteit
met betrekking tot dermatitis, desquamatie en oedeem van de borst en areola.
1. Optimalisatie van het RFLP protocol
Met uitzondering van ATM c.5557G>A, is het PCR-RFLP protocol van ATM c.-111G>A,
MCR1 c.478C>T, MSH3 c.3133G>A, FGFR2 rs2981579, en TOX rs3803662 polymorfisme
volledig geoptimaliseerd. Tijdens de optimalisatie van de condities voor PCR en digest zijn
bepaalde vaststellingen geconstateerd die de optimalisatiemethode van nieuwe SNP in de
toekomst mogelijks kunnen bevorderen.
Tijdens de optimalisatie van de PCR reactie wordt een eerste PCR reactie uitgetest met de
standaard PCR mix en het algemeen PCR programma met de berekende primerspecifieke Ta.
Als het gewenste resultaat uitblijft, kan men vervolgens meer systematisch te werk door
verschillende PCR mixen van 1.5mM, 2mM, 2.5mM MgCl2 en 5% DMSO bij verschillende
Ta uit te testen. Op deze manier kan men sneller en efficiënter de gewenste PCR condities
bereiken. Voor de optimalisatie van RFLP doet men er goed aan om primers te selecteren die
een PCR product van minimum 400bp amplificeren. Dit heeft als voordeel dat na digest de
geknipte fragmenten voldoende groot zijn waardoor er minder problemen kunnen optreden
omtrent de zichtbaarheid van de fragmenten en de doorlooptijd van gelelektroforese.
2. Associatieanalyse van acute huidtoxiciteit
2.1. Klinische factoren
Uit de analyse van deze thesis leidt men af dat zowel dermatitis, desquamatie en oedeem van
de borst en areola minder vaak voorkomen bij vrouwen die chemotherapie hebben gevolgd.
De chemotherapie die de borstkankerpatiënten ontvangen is FEC. Deze chemo is een
combinatie 5-fluorouracyl, epirubicin en cyclophosphamide. De therapie wordt gegeven
alvorens de tumor wordt weggenomen. Dit kan een verklaring zijn waarom chemotherapie
niet gepaard gaat met meer gevallen van toxiciteit(61).
40
Patiënten met een human epidermale groeifactor (HER2/Neu) positieve borstkanker krijgen
herceptine (Trastuzumab) voorgeschreven. Uit een studie van Halyard et al (2009) (62) bleek
dat een herceptinekuur niet geassocieerd was met verhoogde acute huidreacties. Dit is in
overeenstemming met de resultaten in deze studie. Er dient wel rekening gehouden worden
met het feit dat slechts 9 patiënten targettherapie werden voorgeschreven waarvan slechts
patiënt dermatitis ontwikkeld.
Afhankelijk of het tumorweefsel positief is voor ER of PR wordt hormoontherapie
voorgeschreven om het endocrien systeem te moduleren. Tamoxifen wordt toegediend aan
premenopausale borstkankerpatienten. Deze competitieve antagonist van de ER remt de groei
en metastase van de tumor. De aromatase inhibitoren zoals Anastrozole, exemastane en
Letrozole worden voorgeschreven aan postmenopausale vrouwen. Deze drug inhibeert de
oestrogeen synthese (63). In de studie van Azria et al 2004 (64) toont men aan dat Tamoxifen
een verhogend effect heeft op late subcutane borstfibrose. Volgens Valakh et al(2010) (65)
treed er geen verschil op voor in incidentie van acute dermatitis of fibrosis tussen de
aromataseinhibitorgroep en tamoxifengroep. Deze bevindingen leunen aan bij onze studie
waar hormoontherapie in het algemeen een verhogend effect.
Verlaagde waarden van het LH en FSH zijn in onze studie geassocieerd met een verhoogd
risico op de ontwikkeling van dermatitis en oedeem van de areola. Terwijl hoge waarden van
oestradiol gecorreleerd zijn aan een verhoging van oedeem ter hoogte van de areola. Hieruit
kan men afleiden dat hormonen een rol spelen in de respons van normale huidcomplicatie na
RT. Deze hypothese zal in de toekomst verder onderzocht moeten worden.
Ovariectomie wordt in deze studie gecorreleerd met een verhoogd risico om dermatitis te
ontwikkelen. Het wegnemen van de eierstokken heeft eveneens in invloed op de
hormoonspiegel van de vrouw.
Diabeten worden in deze studie geassocieerd aan een groter risico op desquamatie van de
borst. Reeds weinig is er geschreven over de invloed van diabetes met betrekking tot
radiotoxiciteit van de huid. Diabetes wordt wel geassocieerd met parenchymale complicatie
bij borstkankerpatiënten die een borstreconstructie hebben ondergaan na RT (66).
In deze studie hebben vrouwen met een borstcup groter of gelijk aan D hebben een hogere
kans om dermatitis te ontwikkelen. Late neveneffecten zijn reeds sterk geassocieerd met een
grotere borstcup (67,68). Naarmate de borsten in volume toenemen, stijgt de kans om
borstplooien en dosisinhomogeniteiten ontwikkelen waardoor er een grotere kans is op het
ontwikkelen van huidtoxiciteit (67).
41
Het optreden van oedeem van de borst is significant geassocieerd met een tumor in de linker
borst. Door de keuze en planning van de radiotherapie wordt de contralaterale borst
afgeschermd (69). Afscherming van de long en het hart uit het stralingsveld is ook een
belangrijke factor waardoor er mogelijks voor een andere stralingstechniek en planning
uitgevoerd wordt naargelang de lokalisatie van de tumor.
In deze studie wordt roken gecorreleerd aan een verhoogd effect van oedeem van de borst.
Lilla et al (2007) (70) associeert het rookgedrag met significante stijgen van het risico op
telangiectasia. Tijdens het roken van een sigaret wordt de patiënt aan een reeks carcinogenen
blootgesteld. Tabakscarcinogenen kunnen DNA schade induceren waardoor het cytotoxisch
effect van ioniserende straling stijgt met een verhoogd risico op stralingsgeïnduceerde
normale weefselcomplicaties tot gevolg (70).
Ook hypertensie kan een verhoging van borstoedeem veroorzaken. Lilla et al (2007) (70)
observeerde een verhoogd risico op telangiectasia onder de patiënten met hypertensie. Het
effect van hypertensie wijdt de onderzoeksgroep eerder toe aan de ingenomen medicatie dan
hypertensie zelf. Verschillende diuretica en inhibitors van angiotensine converterend enzym
hebben een gekend fototoxisch effect en kunnen radiosensitiviteit verhogen.
Zowel elektonen als fotonen worden gebruikt om een boost te geven. In de praktijk resulteert
het gebruik van fotonen in een betere locoregionale controle ten opzichte van de elektronen.
De elektronen zetten hun energie af ter hoogte van de huid, terwijl de fotonen dieper
penetreren. Het is dan ook aannemelijk dat het risico op acute en late huidtoxiteit stijgt met
het gebruik van elektronen. Huang et al. (2006) (71) concludeerde dat het gebruik van
fotonen, het risico op telangiectasia doet dalen. De publicatie vermeld dat vochtige
desquamatie en telangiectasia frequenter optreden bij patiënten die een elektronentherapie
hebben ontvangen. Het cosmetisch eindresultaat met elektronen is bovendien veel lager in
vergelijking van het gebruik met fotonen (68). De bevindingen van deze studie waar een boost
van elektronen het risico op oedeem doet verlagen is te wijten aan de kleine
onderzoekspopulatie.
2.2. Dosimetrische factoren
Zowel voor de tumordosis als voor de huiddosis per kwadrant met betrekking tot acute
huidtoxiciteit werd er geen associatie gevonden. De bevindingen van onze thesis zijn
inconsistent met de literatuur (7) waar de totale dosis, de dosis per fractie, het bestraald
volume en dosisinhomogeniteiten een effect hebben op het cosmetisch resultaat van de borst.
Door de dataset te vergroten was het mogelijk om de te toxiciteit te correleren met gekregen
42
dosis in dat kwadrant. De huiddosis in een bepaald kwadrant werd niet gecorreleerd bevonden
met het optreden van toxiciteit in dat kwadrant. Een verklaring kan gegeven worden aan de
techniek waarmee de complexe dosisdistributie van de huid te berekend wordt.
2.3. SNP
Tijdens de univariate analyse van de SNP met het optreden van acute huidtoxiciteit zijn er
duidelijke trends ontdekt met borderline significantie. Wanneer een multivariate analyse werd
uitgevoerd op de gevonden associaties ging de statistische significantie met uitzondering van
MSH3 c.3133A>G verloren. De totale populatiegrootte (n=80) van deze studie is reeds zeer
klein om voldoende significantie aan te tonen tijdens de univariate analyse. Wanneer er
vervolgens een multivariate analyse wordt uitgevoerd zal de populatiegrootte nog meer
inkrimpen, want enkel de borstkankerpatiënten waarvan de volledige data ter beschikking is
kan worden geanalyseerd.
2.3.1. ATM c.5557G>A
In deze studie werd de aanwezigheid van het variant A allel geassocieerd bevonden met een
verlaagd risico om dermatitis te ontwikkelen. Deze data leunen aan bij de resultaten van
Zschenker et al (2010) (41). Hoewel er in die studie geen significante associatie gevonden
werd met het ATM c.5557G>A, werd er wel een trend opgemerkt tussen het heterozygoot of
homozygoot variant genotype en een verlaagd risico om fibrose te ontwikkelen.
Niettemin vond de meerderheid van de studies een correlatie tussen het variante genotype en
een verhoogd risico op neveneffecten na RT. In het onderzoek Angele et al (2003) (25) zijn de
ATM c.5557G>A homozygoot varianten significant geassocieerd met stralingsgeïnduceerde
neveneffecten. Verder vond de onderzoeksgroep van Ho et al (2006) (72) een corellatie tussen
de aanwezigheid van het A variant allel en radiosensitiviteit. Wat in een latere studie
bevestigd werd door de zelfde onderzoeksgroep (2007) (14) nl. dat borstkankerpatienten die
dragers zijn van het variant ATM c.5557 A allel een statistische verhoogde kans maken om
Graad 2-4 late neveneffecten te ontwikkelen ten opzichte van de dragers van het WT allel.
Eveneens wordt er in de studie van Andreassen et al (2006) (39) gesuggereerd dat er een
associatie bestaat tussen het ATM codon 1853 Asn/Asp en Asn/Asn genotype met de
ontwikkeling van graad 3 fibrose bij borstkankerpatiënten behandeld met RT. Niettemin werd
deze associatie met fibrose niet teruggevonden in een later onderzoek (42). De gevonden
associatie die terug te vinden zijn in de literatuur slaan eerder op late neveneffecten zodat het
effect van ATM c.5557G>A op de late huidtoxiciteit de moeite loont om op het einde van het
43
project te onderzoeken (39). Met betrekking tot de ontwikkeling van oedeem van de borst
blijkt dat het risico bij de dragers van het homozygoot variant AA genotype verhoogd is ten
opzichte van de dragers van het GA en AA genotype. Betreffende het onderzoek van de
invloed van SNP op oedeem, blijkt dat wij de eerste onderzoeksgroep zijn die deze correlatie
nagaat. Verder kon er in deze studie geen associatie aangetoond worden met desquamatie of
oedeem van de areola.
De invloed van ATM op stralingsgeïnduceerde neveneffecten kan veroorzaakt zijn door de
aminozuurverandering die ontstaat door de subsitutie. Deze kan mogelijks de structuur van
het ATM proteïne beïnvloeden waardoor zijn herstelfunctie verandert (39).
2.3.2. ATM c.-111G>A
Uit de resultaten van deze studie kwam een associatie naar voor tussen ATM c.-111G>A en
oedeem van de borst en areola. Dragers van het AA genotype hebben een verhoogd risico om
oedeem te ontwikkelen ten opzichte van de dragers van het GG en GA genotype. Dit geldt
zowel voor oedeem van de borst als van de areola. Deze studie kon echter geen associatie met
dermatitis of desquamatie aantonen. In de literatuur is weinig tot geen onderzoek gedaan naar
de invloed van het ATM c.-111G>A polymorfisme met betrekking tot oedeem. Wel is reeds in
de studie van Zhang et al (2010) (44) een associatie gevonden met deze variatie en een
verhoogd risico van stralingsgeïnduceerde pneumonitis. Tevens is het polymorfisme
onderzocht naar een correlatie met late stralingseffecten, maar geen associatie werd gevonden
(42).
Het ATM -111G>A polymorfisme is centraal gelegen in de promotor regio van het ATM gen,
waardoor een G naar A allel verandering mogelijks een effect heeft op de ATM
transcriptionele activiteit. Verder wordt gesuggereerd dat het variant polymorfisme een
invloed heeft op de interactie met bepaalde transcriptiefactoren. De A allel substitutie zou een
transcriptionele inhibitor bindende site creëren waardoor de RNA expressie van het ATM zou
reduceren (44).
2.3.3. XRCC1 c.1196G>A
Uit de resultaten van deze thesis bleek dat er geen associatie aanwezig is tussen XRCC1
c.1196G>A en het optreden van acute huidtoxiciteit. Deze bevindingen zijn consistent met
reeds eerder gepubliceerde studies (33,36,43,47) die eveneens geen associatie vonden met
stralingsgeïnduceerde acute huidtoxiciteit. Met betrekking tot acute toxiciteit vond Moullan et
al (2003) (32) ook geen associatie met het XRCC1 c.1196G>A op zich, maar het variant allel
44
van deze SNP wordt wel in combinatie met het XRCC1 c.580 variant T allel meer frequent
teruggevonen bij de stralingssentitieve borstkankerpatienten. Hoewel er in deze studie geen
correlatie van het XRCC1 c.1996G>C is aangetoond, is verder onderzoek naar het effect op
late huidtoxiciteit van belang. Andreassen et al (2003) (46) toonde reeds aan dat het Arg/Arg
genotype in het XRCC1 codon 399 geassocieerd is met een verhoogd risico op
stralingsgeïnduceerde fibrose, maar niet op telangiectasia. Tevens ontdekte Zschenker et al
(2010) (41) een trend waar de patiënten met een variant allel in het XRCC1 c.1996G>A een
hoger risico hebben op fibrose in vergelijking met het WT genotype. Terwijl Giotopoulos et al
(2007) (72) net een associatie gevonden had met XRCC1 c.1196G>A en een verhoogd risico
op telangiectasia, maar niet met fibrose. Er zijn ook studies (3,42) die geen associaties
konden aantonen met betrekking tot late effecten.
2.3.4. XRCC1 c.580C>T
Uit de resultaten van XRCC1 c.580C>T met betrekking tot acute huidtoxiciteit kon er geen
associatie afgeleid worden. Deze bevindingen zijn inconsistent met de studie Moullan et al
(2003) (32) waar het XRCC1 c.580 T allel geassocieerd bevonden is met het risico om
neveneffecten na RT te ontwikkelen. Hoewel er door Andreassen et (2006) (42) en Chang-
Claude et al (2009) (3) nog geen associaties zijn gevonden met late huidtoxiciteit effecten,
kan er binnen deze studie verder naar associaties gezocht worden.
2.3.5. XRCC1 c.839G>A
Het XRCC1 c.839 GA genotype is in deze studie significant geassocieerd bevonden met de
ontwikkeling op dermatitis. Tevens is er ook een associatie gevonden tussen het variant
heterozygoot genotype en het optreden van desquamatie. Het vermoeden dat de XRCC1 c.839
G>A mogelijks ook een rol kan spelen bij de ontwikkeling van neveneffecten bij
borstkankerpatiënten na RT werd bevestigd. Deze hypothese werd gevormd na een gevonden
significant associatie van Langsenlehner et al (2011) (51). waarbij het XRCC1 c.839 A allel
een verlaagd effect heeft op de hoge graad late toxiciteit bij prostaatkankerpatiënten. Ook de
resultaten van Burri et al (2008) (74) waaruit blijkt dat prostaatkankerpatiënten met een
XRCC1 c.839GA genoptype een grotere kans hebben om erectiele dysfunctie te ontwikkelen
suggereren dat het XRCC1 polymorfisme mogelijks een rol speelt bij de neveneffecten na RT
Het XRCC1 c.839 polymorfisme veroorzaakt een niet synonieme aminozuurwijziging. Er
wordt namelijk een aromatische His ingewisseld voor een alifatisch Arg welke mogelijks
geassocieerd is met een verlaagde herstelactiviteit van het XRCC1 proteïne (51)Verder is er
45
geen verband gevonden met het krijgen van oedeem.
Er is reeds onderzoek(42,3) gedaan naar het effect van deze variatie op late huidtoxiciteit als
fibrose en telangiectasia, maar er kon geen associatie gedetecteerd worden.
2.3.6. XRCC3 c.722C>T
De resultaten van de regressie analyse tonen aan dat er een associatie aanwezig is tussen het
XRCC3 c.722C>T variant en een verhoogd risico op dermatitis. Dragers van het homozygoot
variant genotype hebben een groter risico om dermatitis te ontwikkelen in vergelijking met
het CC en CT genotype. Deze bevindingen bevestigen de resultaten van Mangoni et al (2010)
(48) die een verhoogde stralingsgevoeligheid detecteerde bij de dragers van het variant
XCRCC3 c.722 T allel met betrekking tot acute huidreacties. Niettemin zijn de gevonden
associatie van deze studie tegenstrijdig met de resultaten van Werbrouck et al (2009) (52)
waar er geen significante associatie van het polymorfisme kon aangetoond worden met
dermatitis bij patiënten met hoofd en halskanker. Bovendien kon Popanda et al (2006) (53) en
Sterpone et al (2010) (47) ook geen significante relatie terugvinden bij borstkankerpatiënten
met betrekking tot stralingsgeïnduceerde acute neveneffecten.
Verder is er door Andreassen et al (2003) (46) aangetoond dat het Thr/Thr genotype in
XRCC3 codon 241 gecorreleerd is met een verhoogd risico op zowel subcutane fibrose als
telangiectasia.
Het XRCC3 c.722C>T variant is gelokaliseerd in een non-conservatieve polymorfe regio, de
aminozuurwijziging kan de functie van het XRCC3 proteïne wijzigen. Er is echter aangetoond
dat de aanwezigheid van dit variant allel de HR herstel van chromosomale DSB niet
verstoord. Het kan dus zijn dat het XRCC3 c. 722T allel niet verantwoordelijk is voor het
geobserveerde klinisch effect, maar in LD staat met andere polymorfismen. (52).
2.3.6. MC1R c.478C>T
In deze thesis kon er geen associatie aangetoond worden tussen MC1R c.478C>T en acute
huidtoxiciteit. Dit is tegenstrijdig met de gevonden resultaten van Fogarty et al (2010) (23).
De frequentie van allelen coderend voor het rood haarkleur fenotype zijn in de studie
significant verhoogd bij de patiëntengroep met onverwachte ernstige acute stralingseffecten.
Acute stralingsgevoeligheid kwam voornamelijk voor bij de dragers van het MC1R c.478
variant T allel. Voor late stralingeffecten werd er geen associatie gevonden met MC1R
c.478C>T.
46
2.3.7. MSH3 c.3133A>G
Voor het MSH3 c.3133A>G polymorfisme is er een significante associatie gevonden na de
multivariate analyse. Dragers van het AG genotype hebben een verhoogde kans om dermatitis
te ontwikkelen in vergelijking met de WT. Dezelfde bevindingen zijn teruggevonden bij het
onderzoek van Mangoni et al. (2010) (48). Een verklaring voor het verhoogd
stralingsgevoeligheid kan te wijten zijn aan de aminozuurverandering die geïntroduceerd
wordt. Dit kan een invloed hebben op de structuur of de functie van het herstelproteïne.
2.3.8.GWAS
In deze thesis kon er geen associatie aangetoond worden tussen FGFR2 rs2981579C>T en het
optreden van acute huidtoxiciteit. Tijdens de GWAS (55,56) is er namelijk gezocht naar een
associatie met borstkanker en zijn de SNP gescreend voor een immense populatie, terwijl
onze studie slecht met een beperkt aantal deelnemers werkt om een associatie wordt gezocht
naar stralingsgevoeligheid. Dragers van het TOX3 rs3803662 daarentegen zijn in deze studie
geassocieerd bevonden aan oedeem van de borst. De aanwezigheid van het variant T allel doet
het risico op borstoedeem verhogen. Door gebrek aan publicaties omtrent de SNPs en
borstoedeem konden de gevonden bevindingen niet gestaafd worden met andere resultaten.
Een verklaring voor deze associatie kan gegeven worden aan het feit dat het TOX3 gen een
HMG box bezit. Dit kan er op wijzen dat de functie van het TOX3 proteïne betrokken is bij de
buiging en ontwinding van de DNA en chromatine structuur die van belang is bij het herstel
van DNA breuken (75)
47
Besluit
In deze studie is er een trend opgemerkt tussen het ATM c.5557G>A polymorfisme met
dermatitis en oedeem van de borst. Daaruit blijkt dat de dragers van het AG en AA genotype
een verlaagd risico hebben om dermatitis te ontwikkelen, terwijl het risico op borstoedeem
voor de dragers van het AA genotype hoger is. Tijdens de analyse van ATM c. -111G>A is
een verhoogd risico op oedeem van de borst gecorrleerd met het AA genotype. Het XRCC1
c.839 GA genotype is significant geassocieerd bevonden met een verhoogd risico op
dermatitis en desquamatie. De analyse van XRCC3 c.722C>T toont aan dat de aanwezigheid
van het variant T allel een reccesief verhoogd effect heeft op dermatitis en een dominant
verhoogd effect heeft op desquamatie. Na de multivariate analyse is de aanwezigheid van het
MSH3 c.3133 G allel significant geassocieerd bevonden met een verhoogd optreden van
dermatitis. Voor het TOX3 rs3803662 polymorfisme bezit het T allel een dominant verhogend
effect met betrekking tot oedeem ontwikkeling van de borst.
Hoewel de onderzoekspopulatie in deze studie beperkt is, slaagt men er toch in om trends op
te sporen. Niettemin zijn bijkomende studies met grotere onderzoekspopulatie nodig om de
resultaten te bevestigen. Met deze kandidaatgenstudie bevestigen we de assumptie dat
radiosensitiviteit een complexe polygenetische ziekte is. Om het moleculair mechanisme
achter stralingsgevoeligheid verder te ontrafelen is er nood aan GWAS om allelische
interacties te bestuderen en om nieuwe SNPs te ontdekken in genen waarvan de functie nog
niet gekend is. Met deze genetisch risicofactoren kan in combinatie met dosimetrische
(hotspots) en klinische (borstvolume) factoren een predictiemodel opgesteld worden voor
acute en late huidtoxiciteit. Door de stralingsensitieve personen te identificeren kan een
geïndividualiseerd RT behandelingsplan opgesteld worden met een maximale tumorrespons
en minimale toxische wreking.
48
Referentielijst (1) www.kankerregister.org (2) http://www.tegenkanker.be/borstkanker (3) Chang-Claude J, Ambrosone CB, Lilla C, Kropp S, Helmbold I, von Fournier D, Haase W, Sautter-Bihl ML, Wenz F, Schmezer P, Popanda O (2009). Genetic polymorphisms in DNA repair and damage response genes and late normal tissue complications of radiotherapy for breast cancer. Br J Cancer 100(10):1680-6. (4) Munshi A, Kakkar S, Bhutani R, Jalali R, Budrukkar A, Dinshaw KA (2009). Factors influencing cosmetic outcome in breast conservation. Clin Oncol (R Coll Radiol) 21(4):285-93. (5) Veldeman L, Madani I, Hulstaert F, De Meerleer G, Mareel M, De Neve W (2008). Evidence behind use of intensity-modulated radiotherapy: a systematic review of comparative clinical studies. Lancet Onco l9(4):367-375. (6) Vral A (2009-2010). Cursus Radiobiologie 1e master biomedische wetenschappen. ugent (7) Barnett GC, West CM, Dunning AM, Elliott RM, Coles CE, Pharoah PD, Burnet NG (2009). Normal tissue reactions to radiotherapy: towards tailoring treatment dose by genotype. Nat Rev Cancer 9(2):134-142. (8) Staffurth J (2010) A review of the clinical evidence for intensity-modulated radiotherapy. Clin Oncol (R Coll Radiol) 22(8):643-57. (9) Coles CE, Moody AM, Wilson CB, Burnet NG (2005). Reduction of radiotherapy-induced late complications in early breast cancer: the role of intensity-modulated radiation therapy and partial breast irradiation. Part II--Radiotherapy strategies to reduce radiation-induced late effects. Clin Oncol (R Coll Radiol) 17(2):98-110. (10) Pignol JP, Olivotto I, Rakovitch E, Gardner S, Sixel K, Beckham W, Vu TT, Truong P, Ackerman I, Paszat L (2008). A multicenter randomized trial of breast intensity-modulated radiation therapy to reduce acute radiation dermatitis. J Clin Oncol 1;26(13):2085-92. (11) Veldeman L, Speleers B, Bakker M, Jacobs F, Coghe M, De Gersem W, Impens A, Nechelput S, De Wagter C, Van den Broecke R, Villeirs G, De Neve W (2010). Preliminary results on setup precision of prone-lateral patient positioning for whole breast irradiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys 78(1):111-118. (12) Buijsen J, Jager JJ, Bovendeerd J, Voncken R, Borger JH, Boersma LJ, Murrer LH, Lambin P(2007). Prone breast irradiation for pendulous breasts. Radiother Oncol 82(3):337-340. (13) Goodman KA, Hong L, Wagman R, Hunt MA, McCormick B (2004). Dosimetric analysis of a simplified intensity modulation technique for prone breast radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1;60(1):95-102. (14) Ho AY, Fan G, Atencio DP, Green S, Formenti SC, Haffty BG, Iyengar P, Bernstein JL, Stock RG, Cesaretti JA, Rosenstein BS (2007). Possession of ATM sequence variants as predictor for late normal tissue responses in breast cancer patients treated with radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 69(3):677-84. (15) Andreassen CN, Alsner J, Overgaard J (2002). Does variability in normal tissue reactions after radiotherapy have a genetic basis--where and how to look for it? Radiother Oncol 64(2):131-40. (16) Bracke M (2010-2011). Curcus Kanker 1e master biomedische wetenschappen. ugent (17) Coëlho. Zakwoordenboek der Geneeskunde. ELSEVIER Gezondheidszor (18) Harper JL, Franklin LE, Jenrette JM, Aguero EG (2004). Skin toxicity during breast irradiation: pathophysiology and management. South Med J 97(10):989-993. (19) Archambeau JO, Pezner R, Wasserman T (1995). Pathophysiology of irradiated skin and breast. Int J Radiat Oncol Biol Phys 31(5):1171-1185. (20) http://ctep.cancer.gov/forms/CTAEv3.pdf (21) Cox JD, Stetz J, Pajak TF(1995). Toxicity criteria of the Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) and the European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC). Int J Radiat Oncol Biol Phys 31(5):1341-1346. (22) http://www.christie.nhs.uk/pro/depts/clinonc/lent_soma/docs/BreastObjV6doc.pdf (23) Fogarty GB, Muddle R, Sprung CN, Chen W, Duffy D, Sturm RA, McKay MJ(2010). Unexpectedly severe acute radiotherapy side effects are associated with single nucleotide polymorphisms of the melanocortin-1 receptor. Int J Radiat Oncol Biol Phys77(5):1486-92. (24) Popanda O, Marquardt JU, Chang-Claude J, Schmezer P(2009). Genetic variation in normal tissue toxicity induced by ionizing radiation. Mutat Res 667(1-2):58-69. (25) Angèle S, Romestaing P, Moullan N, Vuillaume M, Chapot B, Friesen M, Jongmans W, Cox DG, Pisani P, Gérard JP, Hall J (2003). ATM haplotypes and cellular response to DNA damage: association with breast cancer risk and clinical radiosensitivity. Cancer Res. 63(24):8717-8725 (26) Lee JH, Paull TT (2007). Activation and regulation of ATM kinase activity in response to DNA double-strand breaks. Oncogene. 26(56):7741-7748. (27) Bremer M, Klöpper K, Yamini P, Bendix-Waltes R, Dörk T, Karstens JH (2003). Clinical radiosensitivity in breast cancer patients carrying pathogenic ATM gene mutations: no observation of increased radiation-induced acute or late effects. Radiother Oncol 69(2):155-160. (28) Appleby JM, Barber JB, Levine E, Varley JM, Taylor AM, Stankovic T, Heighway J, Warren C, Scott D (1997). Absence of mutations in the ATM gene in breast cancer patients with severe responses to radiotherapy. Br J Cancer 76(12):1546-1549. (29) Oppitz U, Bernthaler U, Schindler D, Sobeck A, Hoehn H, Platzer M, Rosenthal A, Flentje M (1999).
49
Sequence analysis of the ATM gene in 20 patients with RTOG grade 3 or 4 acute and/or late tissue radiation side effects. Int J Radiat Oncol Biol Phys 44(5):981-988. (30) Sterpone S, Cozzi R (2010). Influence of XRCC1 Genetic Polymorphisms on Ionizing Radiation-Induced DNA Damage and Repair. J Nucleic Acids pii: 780369. (31) Bourguignon MH, Gisone PA, Perez MR, Michelin S, Dubner D, Giorgio MD, Carosella ED (2005). Genetic and epigenetic features in radiation sensitivity Part I: cell signalling in radiation response. Eur J Nucl Med Mol Imaging 32(2):229-46. (32) Moullan N, Cox DG, Angèle S, Romestaing P, Gérard JP, Hall J (2003). Polymorphisms in the DNA repair gene XRCC1, breast cancer risk, and response to radiotherapy. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 12(11 Pt 1):1168-74. (33) Zhou L, Xia J, Li H, Dai J, Hu Y (2010). Association of XRCC1 variants with acute skin reaction after radiotherapy in breast cancer patients. Cancer Biother Radiopharm 25(6):681-5. (34) Jackson SP (2002). Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis 23(5):687-96. (35) Andreassen CN (2010). Searching for genetic determinants of normal tissue radiosensitivity--are we on the right track? Radiother Oncol 97(1):1-8. (36) Chang-Claude J, Popanda O, Tan XL, Kropp S, Helmbold I, von Fournier D, Haase W, Sautter-Bihl ML, Wenz F, Schmezer P, Ambrosone CB (2005). Association between polymorphisms in the DNA repair genes, XRCC1, APE1, and XPD and acute side effects of radiotherapy in breast cancer patients. Clin Cancer Res 11(13):4802-9. (37) Fernet M, Hall J (2004). Genetic biomarkers of therapeutic radiation sensitivity. DNA Repair (Amst) 3(8-9):1237-43. (38) Syvänen AC (2001). Accessing genetic variation: genotyping single nucleotide polymorphisms. Nat Rev Genet 2(12):930-42. (39) Andreassen CN, Overgaard J, Alsner J, Overgaard M, Herskind C, Cesaretti JA, Atencio DP, Green S, Formenti SC, Stock RG, Rosenstein BS (2006). ATM sequence variants and risk of radiation-induced subcutaneous fibrosis after postmastectomy radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 64(3):776-83. (40) Edvardsen H, Tefre T, Jansen L, Vu P, Haffty BG, Fosså SD, Kristensen VN, Børresen-Dale AL (2007). Linkage disequilibrium pattern of the ATM gene in breast cancer patients and controls; association of SNPs and haplotypes to radio-sensitivity and post-lumpectomy local recurrence. Radiat Oncol 2:25. (41) Zschenker O, Raabe A, Boeckelmann IK, Borstelmann S, Szymczak S, Wellek S, Rades D, Hoeller U, Ziegler A, Dikomey E, Borgmann K (2010). Association of single nucleotide polymorphisms in ATM, GSTP1, SOD2, TGFB1, XPD and XRCC1 with clinical and cellular radiosensitivity. Radiother Oncol. 97(1):26-32. (42) Andreassen CN, Alsner J, Overgaard M, Sørensen FB, Overgaard J (2006). Risk of radiation-induced subcutaneous fibrosis in relation to single nucleotide polymorphisms in TGFB1, SOD2, XRCC1, XRCC3, APEX and ATM--a study based on DNA from formalin fixed paraffin embedded tissue samples. Int J Radiat Biol 82(8):577-86. (43) Andreassen CN, Alsner J, Overgaard J, Herskind C, Haviland J, Owen R, Homewood J, Bliss J, Yarnold J (2005).TGFB1 polymorphisms are associated with risk of late normal tissue complications in the breast after radiotherapy for early breast cancer. Radiother Oncol 75(1):18-21. (44) Zhang L, Yang M, Bi N, Fang M, Sun T, Ji W, Tan W, Zhao L, Yu D, Lin D, Wang L (2010). ATM polymorphisms are associated with risk of radiation-induced pneumonitis. Int J Radiat Oncol Biol Phys 77(5):1360-8 (45) Sterpone S, Mastellone V, Padua L, Novelli F, Patrono C, Cornetta T, Giammarino D, Donato V, Testa A, Cozzi R 2010). Single-nucleotide polymorphisms in BER and HRR genes, XRCC1 haplotypes and breast cancer risk in Caucasian women. J Cancer Res Clin Oncol 136(4):631-6. (46) Andreassen CN, Alsner J, Overgaard M, Overgaard J (2003). Prediction of normal tissue radiosensitivity from polymorphisms in candidate genes. Radiother Oncol 69(2):127-35. (47) Sterpone S, Cornetta T, Padua L, Mastellone V, Giammarino D, Testa A, Tirindelli D, Cozzi R, Donato V (2010). DNA repair capacity and acute radiotherapy adverse effects in Italian breast cancer patients. Mutat Res 684(1-2) (48) Mangoni M, Bisanzi S, Carozzi F, Sani C, Biti G, Livi L, Barletta E, Costantini AS, Gorini G (2010). Association between Genetic Polymorphisms in the XRCC1, XRCC3, XPD, GSTM1, GSTT1, MSH2, MLH1, MSH3, and MGMT Genes and Radiosensitivity in Breast Cancer Patients. Int J Radiat Oncol Biol Phys. (49) De Ruyck K, Van Eijkeren M, Claes K, Morthier R, De Paepe A, Vral A, De Ridder L, Thierens H (2005). Radiation-induced damage to normal tissues after radiotherapy in patients treated for gynecologic tumors: association with single nucleotide polymorphisms in XRCC1, XRCC3, and OGG1 genes and in vitro chromosomal radiosensitivity in lymphocytes. Int J Radiat Oncol Biol Phys 62(4):1140-9. (50) Brem R, Cox DG, Chapot B, Moullan N, Romestaing P, Gérard JP, Pisani P, Hall J (2006). The XRCC1 -77T->C variant: haplotypes, breast cancer risk, response to radiotherapy and the cellular response to DNA damage. Carcinogenesis 27(12):2469-74. (51) Langsenlehner T, Renner W, Gerger A, Hofmann G, Thurner EM, Kapp KS, Langsenlehner (2011). Association between single nucleotide polymorphisms in the gene for XRCC1 and radiation-induced late toxicity in prostate cancer patients. Radiother Oncol 98(3):387-93.
50
(52) Werbrouck J, De Ruyck K, Duprez F, Veldeman L, Claes K, Van Eijkeren M, Boterberg T, Willems P, Vral A, De Neve W, Thierens H (2009). Acute normal tissue reactions in head-and-neck cancer patients treated with IMRT: influence of dose and association with genetic polymorphisms in DNA DSB repair genes. Int J Radiat Oncol Biol Phys 73(4):1187-95. (53) Popanda O, Tan XL, Ambrosone CB, Kropp S, Helmbold I, von Fournier D, Haase W, Sautter-Bihl ML, Wenz F, Schmezer P, Chang-Claude J (2006). Genetic polymorphisms in the DNA double-strand break repair genes XRCC3, XRCC2, and NBS1 are not associated with acute side effects of radiotherapy in breast cancer patients. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 15(5):1048-50. (54) Andreassen CN (2010). Searching for genetic determinants of normal tissue radiosensitivity--are we on the right track? Radiother Oncol 97(1):1-8. (55)Turnbull et (2010). Genome-wide association study identifies five new breast cancer susceptibility loci. Nat Genet. 42(6):504-7 (56) Easton DF et al (2007). Genome-wide association study identifies novel breast cancer susceptibility loci. Nature 447(7148):1087-93. (57) http://www.ncbi.nlm.nih.gov (58) http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ (59) http://www.restrictionmapper.org/ (60) Maillet P, Vaudan G, Chappuis P, Sappino A (1999). PCR-mediated detection of a polymorphism in the ATM gene. Mol Cell Probes. 13(1):67-69. (61) De Ruyck Kima PhD, Sabbe Nickb MSc, Oberije Caryc PhD, Vandecasteele Katriend MD, Thas Olivierb PhD, De Ruysscher Dirkc MD PhD, Lambin Philippec MD PhD, Van Meerbeeck Jane MD PhD, De Neve Wilfriedd MD PhD, Thierens Huberta PhD. Development of a multi-component prediction model for acute esophagitis in lung cancer patients receiving chemo-radiotherapy. Accepted for publication. (62) Halyard MY, Pisansky TM, Dueck AC, Suman V, Pierce L, Solin L, Marks L, Davidson N, Martino S, Kaufman P, Kutteh L, Dakhil SR, Perez EA (2009). Radiotherapy and adjuvant trastuzumab in operable breast cancer: tolerability and adverse event data from the NCCTG Phase III Trial N9831. J Clin Oncol 27(16):2638-44 (63) van de Velde CJ, Verma S, van Nes JG, Masterman C, Pritchard KI (2010). Switching from tamoxifen to aromatase inhibitors for adjuvant endocrine therapy in postmenopausal patients with early breast cancer. Cancer Treat Rev 36(1):54-62. (64) Azria D, Gourgou S, Sozzi WJ, Zouhair A, Mirimanoff RO, Kramar A, Lemanski C, Dubois JB, Romieu G, Pelegrin A, Ozsahin M(2004). Concomitant use of tamoxifen with radiotherapy enhances subcutaneous breast fibrosis in hypersensitive patients. Br J Cancer 91(7):1251-60. (65) Valakh V, Trombetta MG, Werts ED, Labban G, Khalid MK, Kaminsky A, Parda D (2010). Influence of Concurrent Anastrozole on Acute and Late Side Effects of Whole Breast Radiotherapy. Am J Clin Oncol. (66) Albino FP, Koltz PF, Ling MN, Langstein HN (2010) .Irradiated autologous breast reconstructions: effects of patient factors and treatment variables. Plast Reconstr Surg. 2010 Jul;126(1):12-6. (67) Twardella D, Popanda O, Helmbold I, Ebbeler R, Benner A, von Fournier D, Haase W, Sautter-Bihl ML, Wenz F, Schmezer P, Chang-Claude J (2003). Personal characteristics, therapy modalities and individual DNA repair capacity as predictive factors of acute skin toxicity in an unselected cohort of breast cancer patients receiving radiotherapy. Radiother Oncol 69(2):145-53. (68) Johansen J, Overgaard J, Rose C, Engelholm SA, Gadeberg CC, Kjaer M, Kamby C, Juul-Christensen J, Blichert-Toft M, Overgaard M; Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) and the DBCG Radiotherapy Committee(2002). Cosmetic outcome and breast morbidity in breast-conserving treatment--results from the Danish DBCG-82TM national randomized trial in breast cancer. Acta Oncol 41(4):369-80. (69) Burmeister J, Alvarado N, Way S, McDermott P, Bossenberger T, Jaenisch H, Patel R, Washington T (2008). Assessment and minimization of contralateral breast dose for conventional and intensity modulated breast radiotherapy. Med Dosim 3(1):6-13. (70) Lilla C, Ambrosone CB, Kropp S, Helmbold I, Schmezer P, von Fournier D, Haase W, Sautter-Bihl ML, Wenz F, Chang-Claude J (2007). Predictive factors for late normal tissue complications following radiotherapy for breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2007 Nov;106(1):143-50. (71) Huang EY, Chen HC, Sun LM, Fang FM, Hsu HC, Hsiung CY, Huang YJ, Wang CY, Wang CJ (2006). Multivariate analyses of locoregional recurrences and skin complications after postmastectomy radiotherapy using electrons or photons. Int J Radiat Oncol Biol Phys 65(5):1389-96. (72) Ho AY, Atencio DP, Peters S, Stock RG, Formenti SC, Cesaretti JA, Green S, Haffty B, Drumea K, Leitzin L, Kuten A, Azria D, Ozsahin M, Overgaard J, Andreassen CN, Trop CS, Park J, Rosenstein BS (2006). Genetic predictors of adverse radiotherapy effects: the Gene-PARE project. Int J Radiat Oncol Biol Phys 65(3):646-55. (73) Giotopoulos G, Symonds RP, Foweraker K, Griffin M, Peat I, Osman A, Plumb M (2007). The late radiotherapy normal tissue injury phenotypes of telangiectasia, fibrosis and atrophy in breast cancer patients have distinct genotype-dependent causes. Br J Cancer 96(6):1001-7. (74) Burri RJ, Stock RG, Cesaretti JA, Atencio DP, Peters S, Peters CA, Fan G, Stone NN, Ostrer H, Rosenstein BS (2008). Association of single nucleotide polymorphisms in SOD2, XRCC1 and XRCC3 with susceptibility for the development of adverse effects resulting from radiotherapy for prostate cancer. Radiat Res 170(1):49-59 (75) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?term=TOX3
Bijlage
I
Bijlage A: Overzicht van de geselecteerde SNPs
SNP
SNP Substitutie Codon RS code
ATM c. 5557 G>A Asp1853Asn rs1801516
c.-111 G>A - rs189037
XRCC1 c.1196 G>A Arg399Gln rs25487
c.580 C>T Arg194Trp rs1799782
c. 839 G>A Arg280His rs25489
XRCC3 c.722 C>T Thr241Met rs861539
MSH3 c.3133 A>G Ala1045Thr rs26279
MC1R c.478 C>T Arg160Trp rs1805008
FGFR2 g.25638 T>C - rs2981579
TOX3 g.374 T>C - rs 26279
I
Bijlage B: Standaardformulier
Patient ID: _______________________
Patient ID: _______________________
Medication: (type, dose, number of administrations) (special attention to statins, amiodarone !!!!)
________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
Personal history BRCA 1/2? positive / negative / unknown / under investigation?
Do you still have menstruations? yes / no Last menstruation in which year?
__________
Did you have menstruations before chemo? yes / no / no chemo
during chemo? yes / no / no chemo
Smoking? yes / no For how many years? ________
How many sigarettes a day (average)? ________
Stopped in which year? ________
Alcohol? yes / no How many consumptions every week (average)?
_______
Stopped in which year? __________
Diabetes? yes / no Hypertension? yes / no
Ovariectomy? yes / no
Amiodarone? yes / no Stop before radiotherapy? yes / no
Family history: (specify relation to patient and age)
Breast carcinoma? yes / no Ovarian cancer? yes / no Other diseases (specify)? ___________________________________________________
Patient characteristics: Date of Birth (dd/mm/yyyy): _____________ Bra-size (European, f.e. 85B):
_________
II
Patient ID: _______________________
Tumor Localisation: left / right SEQ / IEQ / SIQ / IIQ / peri-areolar / other: ______________ Number of lesions: ____ Size (largest lesion): ______ cm Grade: I / II / III / Unknown Histology: invasive: ductular / lobular / both / other: ____________________________
in situ: ductular / lobular / both / other: ____________________________
Estrogen receptor: negative / positive ( _____%) / unknown Progesteron receptor: negative / positive ( _____%) / unknown Lymphovascular invasion: yes / no / unknown Perineural invasion: yes / no / unknown Her-2/Neu: immunohistochemistry: negative / positive ( 1+ / 2+ / 3+ ) / unknown
Surgery Date (dd/mm/yyyy): _________ Procedure: tumorectomy / quadrantectomy / segmentectomy / other: __________________ Margins: involved / not involved: ______mm Closest margin: ___________________ Additional resection: yes / no Date (dd/mm/yyyy): ____________ Margin: involved / not involved: ______mm Closest margin: ___________________ Reconstruction: yes / no Date: _________ Tissue expander: yes / no Date: ________ Sentinel Node Biopsy: yes / no Date: __________ ____ involved / ____ resected nodes
Remarks: _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________
III
Patient ID: _______________________
Hormone therapy: yes / no Date of first administration (dd/mm/yyyy): _______________ tamoxifen / aromatase inhibitor / other: ________________________________________ Product? ________________________________________
Chemotherapy: yes / no Type and number of cycles? __________________________________________________ Interval between cycles? _____________________________________________________ Date of first administration (dd/mm/yyyy)? ____________ Date of last administration (dd/mm/yyyy)? _____________
Targeted therapy: yes / no Trastuzumab / lapatinib / other: _______________________________________________ Type and number of cycles? __________________________________________________ Interval between cycles? _____________________________________________________ Date of first administration (dd/mm/yyyy)? ____________
Remarks: _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ __________________________________________________________________
IV
Patient ID: _______________________
Radiotherapy: Whole breast start date (dd/mm/yyyy): _______________ end date (dd/mm/yyyy):
_______________ LINAC: ______________ Energy: _______ MV
fractionation: ___ x ___ Gy ____ time(s) a day ____ times a week
number of beams: _____ leafs: yes / no
intensity-modulation: wedges/ segments/ electronic compensators Boost: yes / no start date (dd/mm/yyyy): _______________ end date (dd/mm/yyyy):
_______________ photons / electrons LINAC: ______________ Energy: _____ Mev / MV
fractionation: ___ x ___ Gy ____ time(s) a day ____ times a week
number of beams: _____ leafs: yes / no
intensity-modulation: wedges/ segments/ electronic compensators Supraclav: yes / no start date (dd/mm/yyyy): _______________ end date (dd/mm/yyyy):
_______________
LINAC: ______________ Energy: _______ MV
fractionation: ___ x ___ Gy ____ time(s) a day ____ times a week
number of beams: _____ leafs: yes / no
intensity-modulation: wedges/ segments/ electronic compensators Axilla: yes / no start date (dd/mm/yyyy): _______________ end date (dd/mm/yyyy):
_______________
LINAC: ______________ Energy: _______ MV
fractionation: ___ x ___ Gy ____ time(s) a day ____
V
Acute skin toxicity Start Wee
k 1 Week 2
Week 3
Week 4
Week 5
Week 6
1 month after RT
Date
Cumulative dose (Gy)
Dermatitis (CTCAEv3)
SEQ
IEQ
SIQ
IIQ
Areola
IM fold
Axilla
SC
IC
Desquamation 0 = none 1 = dry 2 = moist
SEQ
IEQ
SIQ
IIQ
Areola
IM fold
Axilla
SC
IC
Pruritus/itching (CTCAEv3)
Oedema
Breast
Peri-areolar
Pain (CTCAEv3) SEQ: superior external breast quadrant IEQ: inferior external breast quadrant SIQ: superior internal breast quadrant IIQ: inferior internal quadrant IM: inframammary (caudal of palpable breast tissue) Axilla: lateral of palpable breast tissue SC: supraclavicular (cranial of the most cranial part of the sternoclavicular joint) IC = infraclavicular (cranial of palpable breast tissue, caudal of the most cranial part of the sternoclavicular joint) CTCAEv3 Toxicity Grade 0 Grade 1 Grade 2 Grade 3 Grade 4
Dermatitis associated with radiation
None Faint erythema or dry desquamation
Moderate to brisk erythema; patchy moist desquamation, mostly confined to skin folds and creases; moderate edema
Moist desquamation other than skin folds and creases, bleeding induced by minor trauma or abrasion
Skin necrosis or ulceration of full thickness dermis; spontaneous bleeding from involved site
Pruritus/itching None Mild or localized Intense or widespread Intense or widespread and interfering with ADL
_
Oedema None Asymptomatic Symptomatic Secondary dysfunction _
Pain None Mild pain not interfering with function
Moderate pain; pain or analgesics interfering with function, but not interfering with ADL
Severe pain; pain or analgesics severely interfering with ADL
Disabling
VI
Date Dose
(Gy
Local treatment and follow-up notes
VII
Patient ID: _______________________
Chronic skin toxicity and cosmesis
If LENT SOMA scale ≠ 0, please indicate where the changes are apparent (f.e. atrophy in SEQ, ulceration in inframammary fold): ___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
Before RT
1 month
6 month
s
12 month
s
18 month
s
24 months
Date
Retraction or atrophy
Management of atrophy
Breast oedema
Management of breast oedema
Ulceration
Management of ulcer
Telangiectasia
Post-radiation fibrosis
Arm lymphoedema
Management of arm lymphoedema
Pigmentation change
Pain
Management of pain
Cosmetic score
Global
Appearance of surgical scar
Breast size
Breast shape
Nipple position
Shape of areola
Skin color
VIII
LENT SOMA scale
Cosmetic score (Harvard/NSABP/RTOG Breast Cosmesis Grading Scale: 1- excellent: When compared to the untreated breast, there is minimal or no difference in the size or shape of the treated
breast. The way the breast feels (its texture) is the same or slightly different. There may be thickening, scar tissue, or fluid accumulation within the breast, but not enough to change the appearance.
2- good: There is a slight difference in the size or shape of the treated breast as compared to the opposite breast or the original appearance of the treated breast. There may be some mild reddening or darkening of the breast. The thickening or scar tissue within the breast causes only a mild change in the shape or size.
3- fair: Obvious difference in the size and shape of the treated breast. This change involves one-quarter or less of the breast. There can be moderate thickening or scar tissue of the skin and the breast, and there may be obvious color changes.
4- poor: Marked change in the appearance of the treated breast involving more than one-quarter of the breast tissue. The skin changes may be obvious and detract from the appearance of the breast. Severe scarring and
thickening of the breast, which clearly alters the appearance of the breast, may be found.
0 1 2 3 4
Retraction or atrophy
Nil 10%-25% >25%-40% >40%-75% Whole breast
Management of atrophy
None - - - Surgical management
Breast oedema
None Asymptomatic Symptomatic Secondary dysfunction
-
Management of breast oedema
No intervention
- - Medical intervention
Surgical intervention
Ulceration None Epidermal ≤ 1 cm2
Dermal > 1 cm2 Subcutaneous Necrosis/exposed
bone
Management of ulcer
No intervention
- Medical intervention
Surgical intervention/ wound debridement
Surgical intervention/ mastectomy
Telangiectasia None Minimal (< 1 per cm
2)
Moderate (1-4 per cm
2)
Severe (> 4 per cm
2)
-
Post-radiation fibrosis
None Barely palpable/increased density
Definite increased density & firmness
Marked density, retraction & fixation
-
Arm lymphoedema
None 2-4 cm increase > 4-6 cm increase
> 6 cm increase
Useless arm/angiosarcoma
Management of arm lymphoedema
No oedema - Elastic stocking/elevate arm
Intensive physiotherapy, compression wrapping
Surgical intervention/ amputation
Pigmentation change
None Transitory, slight Permanent, marked
- -
0 1 2 3 4
Pain None Mild pain not interfering with function
Moderate pain; pain or analgesics interfering with function, but not interfering with ADL
Severe pain; pain or analgesics severely interfering with ADL
Disabling
Management of pain
None Topical analgesics
Oral, non-narcotic analgesics
Oral, mild opioids Oral, strong opioids
I
Bijlage C : Geoptimaliseerde protocols
1. ATM CODON 1853
a) PCR
Primers: Forward : ATM/83.190F (P99) (5' TATGGTAATGGCCTAGACTG 3') Reverse : ATM/83.850R (P100) (5' CATCAAGTACTATCCTAGGC 3') PCR mix: Standaard PCR conditions : Algemeen 58°C PCR fragment size: 630 nt b) Snapshot
Primer : SS13
c) PCR voor HRM
Work in 15µl using K-Taq as polymerase Primers : Forward ATM/83480F (5' GACTGTACTTCCATACTTGAT 3') (P105) Reverse ATM/83643R (5' GAATACCTGAATCCAAGTTTG 3') (P106) PCR mix: Standard PCR conditions: General 58°C PCR fragment size: 164 nt
Conc totaal Conc/PCR reactie µl/PCR reactie
dNTP 1 mM 0,2 mM 3
Buffer 5x 1x 3
MgCl2 25mM 1,5mM 0,9
Forward primer 50µM 1µM 0,3
Reverse primer 50µM 1µM 0,3
Kappa Taq 0,6U 0,07
LC Green 1,25
dH2O 3,18
DNA 100-200ng 3
Add 1.25µl LC green per sample (subtract it from the total amount of H2O) Geïsoleerd DNA: 100ng/µl
II
2. XRCC1 c. 1196G>A en c.839G>A a) PCR
Primers : 3 & 4 PCR mix : Standard PCR conditions :Touchdown program starting by 69°C PCR fragment size : 849 nt b) Digest 280 Arg/His 399 Arg/Gln Enzyme : RsaI Enzyme : HpaII Incubation : 37°C for minimal 3 hours Incubation : 37°C for minimal 3,5 hours
Digest volume 30 µl Digest volume 30 µl
dH2O 19 µl dH2O 16 µl PCR product 7 µl PCR product 10 µl Buffer 3 µl Buffer 3 µl
1.1.1.1.1 RsaI
(10U)
1 µl 1.1.1.1.2 HpaII
(10U)
1 µl
Expected digest product 280 : Expected digest product 399 :
GG : 100 / 150 / 600 GG : 70 / 320 / 460 GA : 100 / 150 / 600 / 700 GA : 70 / 320 / 460 / 530 AA : 150 / 700 AA : 320 / 530
Agarose gel run : run on 2% Agarose gel Agarose gel picture 280 : Agarose gel picture 399 :
Positive controls : Positive controls : Heterozygous variant : GA : H034 Heterozygous variant : GA : H008 Homozygous variant : AA : / Homozygous variant : AA : H012
GG GA GG GG GG GG GA GG GA
GG GA GA GG GG AA GA AA GA
GG GA GG GG GG GG GA GG GA
III
3. XRCC1 c.580G>A a) PCR
Primers : 1 & 2 PCR mix : Standard PCR conditions : Touchdown program starting by 67°C PCR fragment size : 504 nt b) Digest
Enzyme : PvuII Positive controls : Heterozygous variant : CT : H007 Incubation : 37°C for minimal 3 hours Homozygous variant : TT : RT35
Digest volume 30 µl
dH2O 19 µl PCR product 7 µl Buffer 3 µl
1.1.1.1.3 PvuII 1 µl
Expected digest product :
CC : 74 / 430 CT : 74 / 370 / 430 TT : 74 / 370
Agarose gel run : run on 2% Agarose gel Agarose gel picture :
CT CC CT TT CC CT CC CC CC CC CC CC
IV
4. XRCC3 c.722C>T a) PCR Mix
Primers: Forward : 5’-GGCCAGGCATCTGCAGTC-3’ P124 Tm=63.0°C 18bp Reverse : 5’-CTCACCTGGTTGATGCACAG-3’ P122 Tm =60.3°C 20bp Fragment: 87 bp %GC=66 Mix: General 20 µl
1 reactie
(µl) Finale conc
Buffer (10x) 2 1x
MgCl2 (25mM) 1,2 1.5 mM
dNTP Mix (10mM) 0,4 0.2 mM
F primer (P124) 1,2 300 nM
R primer (P122) 1,2 300 nM
Meltdoctor HRM Dye (20x) 1 1x
AmpliTaq Gold DNA Polymerase (5U/µl)
0,05 0.0125U/µl
(0,25U)
dH2O 11,95
DNA 1
Meltdoctor dye vervangen door 0.6 µl SYTO-9 (50µM) (12.35 µl dH2O). b) PCR/HRM program
Stage Step Temp Time
Holding Enzyme activation 95°C 10 min
Cycling (40 cycles) Denature 95°C 15 sec
Anneal/Extend 60°C 1 min
Melt curve/dissociation
Denature 95°C 10 sec
Anneal 60°C 1 min
High Resolution melting
95°C 15 sec
Anneal 60°C 15 sec
I
Bijlage D: Resultaten optimalisatie RFLP protocol
1. ATM c. -111G>A a) Primers: 181 & 182 b) PCR programma
Step Temp Time
95°C 5 min
Denaturation 95°C 30 sec
Primer annealing 60°C 30 sec 35 cycli
Extension 72°C 30 sec
72°C 10 min
Hold 15°C 10 min
c) PCR Mix
3 µl dNTP (1 mM) 3 µl Buffer (5X) 0.9 µl MgCl2 (25mM) 0.3 µl forward primer (50 µM) 0.3 µl reverse primer (50 µM) 0.07 µl Kappa Taq (0.6U) 3 µl DNA (25 ng/µl), totaalvolume van 15 µl (4.43 µl) d) Digest
Enzyme: SacII Incubation: 37°C for 2 hours
Digest volume 30 µl
dH2O 16,9 µl
PCR product 10 µl
NEBuffer 4 3 µl
SacII 0,1 µl
Expected digest product: GG: 46/114/128 GA: 46/114/128/160 AA: 128/160
II
2. MSH3 c.3133A>G
a) Primers: 236 & 195 b) PCR programma
Step Temp Time
95°C 5 min
Denaturation 95°C 30 sec
Primer annealing 60°C 30 sec 35 cycli
Extension 72°C 30 sec
72°C 10 min
Hold 15°C 10 min
c) PCR Mix 3 µl dNTP (1 mM) 3 µl Buffer (5X) 0.9 µl MgCl2 (25mM) 0.3 µl forward primer (50 µM) 0.3 µl reverse primer (50 µM) 0.07 µl Kappa Taq (0.6U) 3 µl DNA (25 ng/µl), totaalvolume van 15 µl (4.43 µl) d) Digest
Enzyme: TseI Incubation: 65°C for 4 hours
Digest volume 30 µl
dH2O 15.66 µl
PCR product 10 µl
NEBuffer 3 3 µl
TseI
1,34 µl (4U)
Expected digest product GG: 365/57/52 GA: 422/365/57/52 AA: 422/52
III
3. MC1R c.478C>T
a) Primers: 190 &191 b) PCR programma
Step Temp Time
95°C 5 min
Denaturation 95°C 1min
Primer annealing 62°C 1min 35 cycli
Extension 72°C 1min
72°C 10 min
Hold 15°C 10 min
c) PCR Mix
3 µl dNTP (1 mM) 3 µl Buffer (5X) 0.9 µl MgCl2 (25mM) 0.3 µl forward primer (50 µM) 0.3 µl reverse primer (50 µM) 0.07 µl Kappa Taq (0.6U) 3 µl DNA (25 ng/µl), totaalvolume van 15 µl (4.43 µl) d) Digest
Enzyme: SacII Incubation: 37°C for 4 hours
Digest volume 30 µl
dH2O 16,9 µl
PCR product 10 µl
NEBuffer 4 3 µl
SacII 0,1 µl
Expected digest product: CC: 156/118 CT: 274/156/118 TT: 274
IV
4. FGFR2 rs2981579C>T
a) Primers: 227&228 b) PCR programma
Step Temp Time
95°C 5 min
Denaturation 95°C 30 sec
Primer annealing 60°C 30 sec 35 cycli
Extension 72°C 30 sec
72°C 10 min
Hold 15°C 10 min
c) PCR Mix
3 µl dNTP (1 mM) 3 µl Buffer (5X) 1.5 µl MgCl2 (25mM) 0.3 µl forward primer (50 µM) 0.3 µl reverse primer (50 µM) 0.07 µl Kappa Taq (0.6U) 3 µl DNA (25 ng/µl), totaalvolume van 15 µl (3.83 µl) d) Digest
Enzyme: PstI Incubation: 37°C for 4 hours
Digest volume 30 µl
dH2O 16,68 µl
PCR product 10 µl
NEBuffer 3 3 µl
BSA PstI
0.3 µl 0,02 µl (4U)
Expected digest product: CC: 289/479 CT:289/479/768 CC: 768
V
5. TOX3 rs3803662C>T
a) Primers: 240 & 241 b) PCR programma
Step Temp Time
95°C 5 min
Denaturation 95°C 30 sec
Primer annealing 58°C 30 sec 35 cycli
Extension 72°C 30 sec
72°C 10 min
Hold 15°C 10 min
c) PCR Mix
3 µl dNTP (1 mM) 3 µl Buffer (5X) 0.9 µl MgCl2 (25mM) 0.3 µl forward primer (50 µM) 0.3 µl reverse primer (50 µM) 0.07 µl Kappa Taq (0.6U) 3 µl DNA (25 ng/µl), totaalvolume van 15 µl (4.43 µl) d) Digest
Enzyme: BsmAI Incubation: 55°C for 2 hours
Digest volume 30 µl
dH2O 16,2 µl
PCR product 10 µl
NEBuffer 4 3 µl
BsmAI
0,8 µl (4U)
Expected digest product: TT: 298/186/124 TC: 484/298/186/124 CC: 484/124
I
Bijlage E: Univariate analyse tussen klinische factoren en radiotoxiciteit 1.Univariate analyse van de klinische factoren met betrekking tot dermatitis en desquamatie Dermatitis Desquamatie
CTC0-1 CTC2+ OR p-waarde CTC0-1 CTC2+ OR p-waarde
BRCA status 0 6 (12,0) 6 (20,0) 10 (14,1) 2 (22,2)
1 11 (22,0) 3 (10,0) 0,27 0,127 14 (19,7) 0 / 0,112
missing 33 (66,0) 21 (70,0) 47 (66,2) 7 (77,8)
BMI 24,95 26,39 0,582 25,35 26,38 0,649
missing 10 (20,0) 7 (23,3) 16 (22,5) 1 (1,4)
Borst Cup A-cup 3 (6,0) 0 3 (4,2) 0
B-cup 18 (36,0) 8 (26,7) 24 (33,8) 2 (22,2)
C-cup 18 (36,0) 10 (33,3) 25 (35,2) 3 (33,3)
D-cup 4 (8,0) 8 (26,7)) 9 (12,7) 3 (33,3) /
E-cup 1 (2,0) 2 (6,7) 0,14 2 (2,8) 1 (11,1) 0,327
missing 6 (12,0) 2 (6,7) 8 (11,3) 0
Menstruatie 0 41 (83,7) 27 (90,0) 60 (84,5) 8 (88,9)
1 7 (14,3) 3 (10,0) 0,65 0,431 10 (14,1) 1 (11,1) 0,75 0,796
missing 1 (2,0) 0 1 (1,4) 0
Roken 0 34 (68,0) 17 (56,7) 46 (64,8) 5 (55,6)
1 15 (30,0) 13 (43,3) 1,73 0,251 24 (33,8) 4 (44,4) 1,53 0,549
missing 1 (2,0) 0 1 (1,4) 0
Diabetes 0 46 (92,0) 26 (86,7) 65 (91,5) 7 (77,8)
1 1 (2,0) 4 (13,3) 7,08 0,052 3 (4,2) 2 (22,2) 6,19 0,042*
missing 3 (6,0) 0 3 (4,2) 0
Hypertensie 0 35 (70,0) 21 (70,0) 50 (70,4) 6 (66,7)
1 11 (22,0) 9 (30,0) 1,36 0,556 17 (23,9) 3 (33,3) 1,47 0,611
missing 4 (8,0) 0 4 (5,6) 0
Ovariectomie 0 44 (88,0) 25 (83,3) 63 (88,7) 6 (66,7)
1 3 (6,0) 5 (16,7) 2,93 0,149 5 (7,0) 3 (33,3) 6,3 0,016*
missing 3 (6,0) 0 3 (4,2) 0
Lokalisatie rechts 23 (46,0) 15 (50,0) 32 (45,1) 6 (66,7)
links 26 (52,0) 15 (50,0) 0,88 0,792 38 (53,5) 3 (33,3) 0,42 0,236
missing 1 (2,0) 0 1 (1,4) 0
Prone/Supine ruglig 46 (92,0) 29 (96,7) 66 (93,0) 9 (100,0)
buiklig 4 (8,0) 1 (3,3) 0,4 0,404 5 (7,0) 0 / 0,411
missing 0 0 0 0
Boost 0 10 (20,0) 5 (16,7) 14 (19,7) 1 (11,1)
1 40 (80,0) 25 (83,3) 1,25 0,712 57 (80,3) 8 (88,9) 1,96 0,533
missing 0 0 0 0
Boost fotonen 32 (64,0) 20 (66,7) 44 (62,0) 8 (88,9)
electronen 8 (16,0) 5 (16,7) 1 1 13 (18,3) 0 / 0,131
missing 10 (20,0) 5 (16,7) 14 (19,7) 1 (11,1)
Hormoontherapie 0 13 (26,0) 3 (12,0) 16 (22,5) 0
1 37 (74,0) 21 (84,0) 2,46 0,095 54 (76,0) 9 (90,0) / 0,108
missing 0 1 (4,0) 1 (1,4) 0
Chemotherapie 0 32 (64,0) 25 (83,3) 48 (67,6) 9 (100,0)
1 18 (36,0) 4 (13,3) 0,28 0,034* 22 (31,0) 0 / 0,048*
missing 0 1 (3,3) 1 (1,4) 0
Targeted therapie 0 42 (84,0) 28 (93,3) 61 (85,9) 9 (90,0)
1 8 (16,0) 1 (3,3) 0,19 0,091 9 (12,7) 0 / 0,253
missing 0 1 (3,3) 1 (1,4) 0
LH U/L 30,05 22,08 0,039* 27,82 20,75 0,183
missing 11 (22,0) 5 (16,7) 15 (21,1) 1 (11,1)
FSH U/L 55,72 42,48 0,068 51,59 43,25 0,477
missing 11 (22,0) 5 (16,7) 15 (21,1) 1 (11,1)
Oestradiol ng/L 33,45 42,63 0,573 36,22 42,25 0,495
missing 12 (24,0) 6 (20,0) 17 (23,9) 1 (11,1)
* p-waarde < 0,05
II
Dermatitis Desquamatie
CTC0-1 CTC2+ OR p-waarde CTC0-1 CTC2+ OR p-waarde
ER negatief 7 (14,0) 3 (10,0) 10 (14,1) 0
positief 41 (82,0) 26 (86,7) 1,48 0,592 58 (81,7) 9 (100,0) / 0,217
missing 2 (4,0) 1 (3,3) 3 (4,2) 0
PR negatief 9 (18,0) 4 (13,3) 12 (16,9) 1 (11,1)
positief 38 (76,0) 25 (83,8) 0,549 55 (77,5) 8 (88,9) / 0,611
missing 3 (6,0) 1 (3,3) 1,48 4 (5,6) 0
Tumorgraad Graad 1 6 (12,0) 9 (3,0) 12 (16,9) 3 (33,3)
Graad 2 22 (44,0) 14 (46,7) 32 (45,1) 4 (44,4)
Graad 3 17 (34,0) 6 (20,0) 0,112 21 (29,6) 2 (22,2) 0,56
missing 5 (10,0) 1 (3,3) 6 (8,5) 0
* p-waarde < 0,05
III
2.Univariate analyse van de klinische factoren met betrekking tot oedeem van de borst en areola Oedeem Borst Oedema Areola
CTC0-1 CTC2+ OR p-waarde CTC0-1 CTC2+ OR p-waarde
BRCA status 0 10 (13,9) 2 (25,0) 10 (14,7) 2 (16,7)
1 14 (19,4) 0 / 0,112 13 (19,1) 1 (8,3) 0,38 0,449
missing 48 (66,7) 6 (75,0) 45 (66,2) 9 (75,0)
BMI 25,73 23,75 0,788 25,43 25,67 0,958
missing 17 (23,6) 0 17 (25,0) 0
Borst Cup A-cup 3 (4,2) 0 3 (4,4) 0
B-cup 24 (33,3) 2 (25,0) 21 (30,9) 5 (41,7)
C-cup 25 (34,7) 3 (37,5) 26 (38,2) 2 (16,7)
D-cup 11 (15,3) 1 (12,5) 9 (13,2) 3 (25,0) 0,546
E-cup 2 (2,8) 1 (12,5) 0,79 2 (2,9) 1 (8,3)
missing 7 (9,7) 1 (12,5) 7 (10,3) 1 (8,3)
Menstruatie 0 61 (84,7) 7 (87,5) 59 (86,8) 9 (75,0)
1 10 (13,9) 1 (12,5) 0,087 0,902 8 (11,8) 3 (25,0) 2,46 0,229
missing 1 (1,4) 0 1 (1,5) 0
Roken 0 48 (66,7) 3 (37,5) 44 (64,7) 7 (58,3)
1 23 (31,9) 5 (62,5) 1,53 0,091 23 (33,8) 5 (41,7) 1,37 0,625
missing 1 (1,4) 0 1 (1,5) 0
Diabetes 0 66 (91,7) 6 (75,0) 62 (91,2) 10 (83,3)
1 4 (5,6) 1 (12,5) 3,48 0,38 4 (5,9) 1 (8,3) 1,55 0,718
missing 2 (2,8) 1 (12,5) 2 (2,9) 1 (8,3)
Hypertensie 0 49 (68,0) 7 (87,5) 46 (67,6) 10 (83,3)
1 20 (27,8) 0 / 0,097 19 (27,9) 1 (8,3) 0,24 0,161
missing 3 (3,7) 1 (12,5) 3 (4,4) 1 (8,3)
Ovariectomie 0 61 (84,7) 8 (100,0) 57 (83,8) 12 (100)
1 8 (11,1) 0 / 0,309 8 (11,8) 0 / 0,199
missing 3 (4,2) 0 3 (4,4) 0
Lokalisatie° rechts 37 (51,4) 1 (12,5) 34 (50,0) 4 (33,3)
links 34 (47,2) 7 (87,5) 7,62 0,034* 33 (48,5) 8 (66,7) 2,06 0,266
missing 1 (1,4) 0 1 (1,5) 0
Prone/Supine ruglig 67 (93,1) 8 (100,0) 63 (92,6) 12 (100,0)
buiklig 5 (6,9) 0 / 0,441 5 (7,4) 0 / 0,332
missing 0 0 0 0
Boost 0 13 (18,1) 2 (25,0) 14 (20,6) 1 (8,3)
1 59 (81,9) 6 (75,0) 0,66 0,633 54 (79,4) 11 (91,7) 2,85 0,316
missing 0 0 0 0
Boost fotonen 46 (63,9) 6 (75,0) 41 (60,3) 11 (91,7)
electronen 13 (18,1) 0 / 0,199 13 (19,1) 0 / 0,069
missing 13 (18,1) 2 (25,0) 14 (20,6) 1 (8,3)
Hormoontherapie 0 15 (20,8) 1 (12,5) 15 (22,1) 1 (8,3)
1 56 (77,8) 7 (87,5) 0,21 0,565 52 (76,5) 11 (91,7) 0,39 0,265
missing 1 (1,4) 0 1 (1,5) 0
Chemotherapie 0 49 (68,1) 8 (100,0) 46 (67,7) 11 (91,7)
1 22 (30,6) 0 / 0,064 21 (30,9) 1 (8,3) 0,28 0,102
missing 1 (1,4) 0 1 (1,5) 0
Targeted therapie 0 62 (86,1) 8 (100,0) 58 (85,3) 12 (100,0)
1 9 (12,5) 0 / 0,285 9 (13,2) 0 0,2 0,177
missing 1 (1,4) 0 1 (1,5) 0
LH 52,27 30,2 0,071 28,9 16,3 0,011*
missing 13 (18,0) 3 (37,5) 14 (20,6) 2 (16,7)
FSH 27,85 16,2 0,075 53,66 33,7 0,046*
missing 13 (18,0) 3 (37,5) 14 (20,6) 2 (16,7)
Oestradiol 35,79 50,8 34,79 50
missing 15 (20,8) 3 (37,5) 15 (22,1) 3 (25,0)
ER negatief 9 (12,5) 1 (12,5) 9 (13,2) 1 (8,3)
positief 60 (83,3) 7 (87,5) 1,05 0,965 56 (82,4) 11 (91,7) 0,2 0,602
missing 3 (4,2) 0 3 (4,4) 0
PR negatief 11 (15,3) 2 (25,0) 11 (16,2) 2 (16,7)
positief 57 (79,2) 6 (75,0) 0,58 0,531 53 (77,9) 10 (83,3) 1,04 0,965
missing 4 (5,6) 0 4 (5,9) 0
* p-waarde < 0,05
IV
Oedeem Borst Oedema Areola
CTC0-1 CTC2+ OR p-waarde CTC0-1 CTC2+ OR p-waarde
Tumorgraad Graad 1 14 (19,4) 1 (12,5) 14 (20,6) 1 (8,3)
Graad 2 32 (44,4) 4 (50,0) 29 (42,6) 7 (58,3)
Graad 3 20 (27,8) 3 (37,5) 0,823 19 (27,9) 4 (33,3) 0,52
missing 6 (8,3) 0 6 (8,8) 0
* p-waarde < 0,05
V
3. Boxplot van de meest significant bevonden klinische factoren 3.1. Boxplot van het optreden van dermatitis
Dermatitis
LH 0 Gemiddelde 30,05
SD 16,31
1 Gemiddelde 22,08
SD 12,95
Dermatitis
FSH 0 Gemiddelde 55,72
SD 29,96
1 Gemiddelde 42,48
SD 27,45
VI
3.2 Boxplot van het optreden Oedeem in de borst
Oedeem Borst
LH 0 Gemiddelde 52,27
SD 29,87
1 Gemiddelde 30,2
SD 14,7
Oedeem borst
FSH 0 Gemiddelde 27,85
SD 15,67
1 Gemiddelde 16,2
SD 7,79
VII
3.3 Boxplot van het optreden van Oedeem in de areola
Oedeem Areola
LH 0 Gemiddelde 28,9
SD 15,68
1 Gemiddelde 16,3
SD 9,07
Oedeem Areola
FSH 0 Gemiddelde 53,66
SD 29,85
1 Gemiddelde 33,7
SD 21,76
VIII
Oedeem Areola
Oestradiol 0 Gemiddelde 34,79
SD 21,46
1 Gemiddelde 50
SD 22,18
I
Bijlage F: Univariate analyse tussen dosimetrische factoren en radiotoxiciteit
1. Univariate analyse tussen de voorgeschreven tumordosis en radiotoxiciteit van de borst
Dermatitis Desquamatie Oedeem Borst Oedeem Areola
CTC0-1* CTC2+* p-waarde CTC0-1* CTC2+* p-waare CTC0-1* CTC2+* p-waarde CTC0-1* CTC2+* p-waarde
CTV WBI D0 50,91 51,26 0,62 51,6 51,38 0,74 50,86 53 0,85 50,5 53,5 0,22
CTV WBI D2 48,91 49,36 0,64 48,97 49,75 0,74 48,95 50,75 0,95 47,59 51,38 0,48
CTVWBI D5 48,26 48,84 0,46 48,35 49,25 0,99 48,34 50,25 0,92 47,97 50,88 0,32
CTV WBI D10 47,48 48,05 0,6 47,59 48,38 0,86 47,53 49,75 0,66 47,24 49,88 0,22
CTV WBI D15 46,56 47,11 0,81 46,65 47,5 0,94 46,6 48,75 0,76 46,35 48,75 0,42
CTV WBI D20 45,56 46,42 0,6 45,79 46,63 0,91 45,73 48 0,55 45,44 48,13 0,17
CTV WBI D95 23,91 29,73 0,16 26,17 28,12 0,99 26,84 23,75 0,66 26,41 27,13 0,99
CTV WBI D98 20,3 25,84 0,11 22,64 23,5 0,89 23,18 19,25 0,58 22,85 22,63 0,94
CTV WBI D100 14,39 16,42 0,21 15,35 15,13 0,58 15,61 12,5 0,66 15,56 14,25 0,89
CTV WBI Dmean 38,52 40,1 0,49 39,09 39,88 0,74 39,08 40,75 0,52 38,82 41 0,3
* gemiddelde tumordosis
2. Univariate analyse tussen de huiddosis per quadrant en de radiotoxiciteit per quadrant
Dermatitis Desquamatie Oedeem
CTC0-1* CTC2+* p-waarde CTC0-1* CTC2+* p-waarde CTC0-1* CTC2+* p-waarde
D0 43,45 45,54 0,648 43,68 42,25 0,677 43,65 45,67 0,298
D2 41 42,06 0,6 41,21 40,25 0,85 41,26 42,97 0,223
D4 40,06 41,16 0,556 40,27 39,75 0,997 40,34 41,93 0,194
D5 39,65 40,81 0,516 39,87 39,75 0,974 39,95 41,57 0,185
D6 39,32 40,41 0,6 39,53 39 0,953 9,63 41,2 0,19
D8 38,66 39,71 0,719 38,85 38,63 0,94 39,01 40,57 0,16
D10 38,1 39,21 0,665 38,31 37,88 0,925 38,49 39,93 0,15
Dmean 27,95 28,43 0,972 28,07 26,37 0,394 28,51 28,47 0,71
*gemiddelde huiddosis
I
Bijlage G: Resultaten van de genotypering
1. Resultaten van de genotypering
Code ATM ATM XRCC1 XRCC3 MSH3 MC1R FGFR2 TOX3
c.5557G>A c.-111G>A c.1196G>A c.580G>A c.839G>A c.722C>T c.3133A>G c.478C>T rs2981579C>T rs3803662C>T
BC001 GA GA GA CT GG CC AA CT CC CC
BC002 GG AA GG CC GG CC GA CC CT CT
BC003 GG GA GA CC GG CC AA CC TT CC
BC004 GG AA GA CC GG CT AA CC CT CT
BC005 GG AA GG CT GG CT AA CC CT TT
BC006 GA GA AA CC GG CC GA CC CC CT
BC007 GG GG GA CT GG CC GG CC CT CT
BC008 GG GA GG CC GG CC AA CC CT CT
BC009 GG GA AA CC GG CC AA CC CC CT
BC010 GA GA GG CC GG CT AA CC CT CC
BC011 GG GA GG CC GG TT AA CT TT CT
BC012 GG GG GA CC GG CC GA CC CC CT
BC013 GG GA GA CC GG CC AA CC CT TT
BC014 GG GA GG CT GG CT GA CT CT CT
BC015 GG AA GG CC GG CT GA CC CT CC
BC016 GG GG GA CT GG CC AA CC TT CT
BC017 GG GG GG CC GG CT AA CC CC CT
BC018 GG GG GA CC GG CC AA CC CT CT
BC019 GG GG GA CC GG CT GA CC CT CC
BC020 GG GA GG CC GG CT GG CC CT CC
BC021 GA GA AA CC GG CC AA CC CC CT
BC022 GG GG AA CC GG CC AA CC CT TT
BC023 GA GA AA CC GG CT AA CT CC CC
BC024 GA AA GA CC GG CC GA CC CT CT
BC025 GG GA GA CC GG CT GA CC CT CC
BC026 GG GA GG CC GG CC AA CC CT CC
BC027 GA GA GA CC GG CC GG CC CC CT
BC028 GG GA GA CC GG TT AA CC CC CT
BC029 GA GA GA CC GG TT AA CC CC CT
BC030 GA AA GA CC GA CC AA CC TT CC
BC031 GG AA GA CT GG CT AA CC TT CC
BC032 GG GA GG CT GG CC GA CC CC CC
BC033 GA GG GG CC GA CT AA CC CT CT
BC034 GG GA GG CC GA CC GA CC CT TT
BC035 GG GG GA CC GG CT AA CC CT CC
BC036 GA GA GG CC GA CT GA CC TT CC
BC037 GG GA AA CC GG CT - CC CT CC
BC038 GG AA GA CC GG CC - CC CC CT
BC039 AA AA AA CC GG CT AA CC TT TT
BC040 GG GG GA CC GG CT GA CC CT CC
BC041 GG GG AA CC GG TT AA CC CC TT
BC042 GG GG AA CC GG TT GA CC TT CT
BC043 AA AA GG CC GG CT - CC TT CT
BC044 GA GA GG CC GG CT AA CT CC CT
BC045 GG AA GA CC GG CC GA CC CT CC
BC046 GG GA GG CC GG CC AA CC CT CT
BC047 GG GG GG CC GA CT GA CC CT CT
II
Code ATM ATM XRCC1 XRCC3 MSH3 MC1R FGFR2 TOX3
c.5557G>A c.-111G>A c.1196G>A c.580G>A c.839G>A c.722C>T c.3133A>G c.478C>T rs2981579C>T rs3803662C>T
BC048 GG GA GG CC GG CC AA CC CT CC
BC049 GG GA AA CC GG TT AA CC CT CC
BC050 GA GA GG CT GG CC GA CC TT CT
BC051 GG GA GG CC GA TT GA CC CC CC
BC052 GA GA GA CC GG CC GA CC CC CT
BC053 GA AA AA CC GG CT GA CC CT CC
BC054 GG GG GG CC GG CT AA CC CC CT
BC055 GA AA GG CC GG CT AA CC CC CC
BC056 GG GA GG CC GG TT AA CC CC CC
BC057 GG AA GG CT GG CC GA CC CT CC
BC058 GA GA GG CC GG CT GA CC CT CT
BC059 GG GA GA CC GG CC AA CC CT CT
BC060 GA GA AA CC GG CT AA CT TT TT
BC061 GA GG GA CC GG TT AA CC CC CT
BC062 GG GG GA CC GG CT GA CT CC CT
BC063 GG AA AA CC GG CC GA CC TT CT
BC064 GG GG GA CC GG TT GA CC CT CC
BC065 GG GA AA CC GG CT AA CC CT CT
BC066 GG GG GA CC GG CC GA CC CT CT
BC067 GG AA GG CC GA CT GA CC CT CC
BC068 GG AA AA CC GG TT AA CC CC CT
BC069 GA GA GA CC GG CC AA CT CT CC
BC070 GG GA GG CT GG CT AA CC CT CT
BC071 GG GA GG CC GA CT AA CC CT CT
BC072 GG GG GG CT GG CC AA CT TT CT
BC073 GG GA GA CC GG CT AA CC CC CC
BC074 GG GA GG CC GG CC AA CC CT CC
BC075 GA GA GA CC GG CT AA CC CT CT
BC076 GG GG GG CC GG CC GA CC CT CC
BC077 GG AA GA CC GG CC AA CC CT CT
BC078 GG AA AA CC GG TT AA CC TT TT
BC079 GA AA GA CC GG CC AA CC TT CC
BC080 GA AA GG CC GG CC GA CC TT CC
BC081 GG GA GA CT GG CT AA CC CT CC
BC082 GG GG GG CC GG CT GA CC TT CT
BC083 GG GA GA CC GG TT GA CC CT CT
BC084 GG GA GG CC GA TT AA CC CT CT
BC085 GG GG GA CC GG CT GA CC TT CC
BC086 GA GA GA CC GG CC GA CC CC CC
BC087 AA AA GA CC GG CT GA CC TT CC
BC088 - AA GA CC GG CT GA CC TT CC
BC089 GG GG AA CC GG TT AA CC TT CC
BC090 GG AA AA CC GG CT GG CT CT CT
BC091 GG AA GG CC - CC GA CT TT CC
BC092 GG GA GA CC GG CT AA CC CT CC
BC093 GG GG GG CC GG TT GA CC CT CC
BC094 GA GA GG CC GG CC AA CC CC CT
BC095 GG GA GG CC GG CT AA CT CT CC
BC096 GG GA GG CC GG CC - CC CC CC
BC097 - GA GA CC GA CC AA CC CT CC
III
Code ATM ATM XRCC1 XRCC3 MSH3 MC1R FGFR2 TOX3
c.5557G>A c.-111G>A c.1196G>A c.580G>A c.839G>A c.722C>T c.3133GA>G c.478C>T rs2981579C>T rs3803662C>T
BC098 GG AA GG CC GG CC GA CC CC CT
BC099 GG AA GG CC GA CT GA CC CT CT
BC100 GG - GA CC GG TT AA CC CT CC
BC101 - AA AA CC - TT - CC - -
BC102 - AA GG CC - CT - CT - -
BC103 - GA GG CT - CC - CC - -
BC104 - GG - CC - CT - CC - -
BC105 - GA GA CC - TT - CC - -
BC106 - GA GA CC - CT - CC - -
BC107 - GA AA CC - CT - CC - -
BC108 - GA GA CC - CT - CC - -
BC109 - GA GA CC - CT - CC - -
BC110 - GA GG CC - CC - CC - -
I
Bijlage H: Hardy-Weinberg Equilibrium
Hardy-Weinberg Equilibrium
SNP maf p-waarde*
ATM c.5557G>A 0,16 0,917
ATM c.-111G>A 0,52 0,958
XRCC1 c.1196G>A 0,38 0,319
XRCC1 c.580G>A 0,06 0,811
XRCC1 c.839G>A 0,06 0,843
XRCC3 c.722C>T 0,38 0,455
MSH3 c.3133G>A 0,76 0,7
MC1R c.478C>T 0,32 0,672
FGFR2
rs2981579C>T 0,48 0,975
TOX3
rs3803662C>T 0,06 0,815
* als p-waarde > 0,05 dan consistent met HWE
I
Bijlage I : Analyse tussen SNPs en radiotoxiciteit
1. Analyse tussen SNPs en Dermatitis
Dermatitis
CTC0-1 (%) CTC2+ (%) OR p-waarde OR† p-waarde†
ATM c.5557G>A GG 31 (64,6) 23 (85,2)
GA 15 (31,3) 4 (14,8) 0,359 0,102 0,315 0,17
AA 2 (4,2) 0 0 0,999 0 0,999
GG 31 (64,6) 23
GA+AA 17 (35,4) 4 0,317 0,064 0,241 0,084
GG+GA 46 (95,8) 27
AA 2 (4,2) 0 0 0,999 0 0,999
ATM c.-111G>A GG 10 (20,8) 6 (20,0)
GA 28 (58,3) 15 (50,0) 0,893 0,852 0,45 0,345
AA 10 (20,8) 9 (30,0) 1,5 0,557 0,384 0,364
GG 10 6
GA+AA 38 24 1,053 0,929 0,433 0,306
GG+GA 38 21
AA 10 9 1,629 0,361 0,691 0,66
XRCC1 c.1196G>A GG 21 (42,9) 13 (44,8)
GA 19 (38,8) 11 (37,9 0,935 0,897 1,329 0,716
AA 9 (18,4) 5 (17,2) 0,897 0,87 1,433 0,733
GG 21 13
GA+AA 28 16 0,923 0,865 1,357 0,677
GG+GA 40 24
AA 9 5 0,926 0,9 1,233 0,828
XRCC1 c.839G>A GG 45 (93,8) 20 (74,0)
GA 3 (6,3) 7 (25,9) 5,25 0,025* 4,254 0,119
AA 0 0
XRCC1 c.580C>T CC 43 (87,8) 27 (90,0)
CT 6 (12,2) 3 (10,0) 0,796 0,761 1,529 0,787
TT 0 0
XRCC3 c.722C>T CC 23 (46,9) 10 (33,3)
CT 21 (42,9) 12 (40,0) 1,314 0,602 0,613 0,533
TT 5 (10,2) 8 (26,7) 3,68 0,057 2,602 0,334
CC 23 10
CT+TT 26 20 1,769 0,236 0,935 0,925
CC+CT 44 22
TT 5 8 3,2 0,064 3,453 0,159
MSH3 c.3133A>G AA 28 (60,9) 14 (51,9)
AG 14 (30,4) 13 (48,1) 1,857 0,221 6,494 0,024*
GG 4 (8,7) 0 0 0,999 0 1
AA 28 14
AG + GG 18 13 1,444 0,453 4,851 0,042*
AA +AG 42 27
GG 4 0 0 0,999 0 1
MC1R c.478C>T CC 41 (83,7) 27 (90,0)
CT 8 (16,3) 3 (10,0) 0,569 0,435 0,794 0,832
TT 0 0
FGFR2 rs2981579C>T CC 14 (28,8) 7 (25,9)
CT 24 (49) 17 (63,0) 1,417 0,535 1,166 0,855
TT 11 (22,5) 3 (11,1) 0,545 0,448 0,415 0,43
CC 14 7
CT+TT 35 20 1,143 0,805 0,937 0,936
CC+CT 38 24
TT 11 3 0,432 0,231 0,37 0,279
†gecorrigeerd voor Borst Cup, Diabetes, Hormoontherapie, Chemotherapie, Targettherapie, LH, FSH
* p-waarde < 0,05
II
Dermatitis
CTC0-1 (%) CTC2+ (%) OR p-waarde OR† p-waarde†
TOX3 rs3803662C>T CC 26 (53,1) 10 (37,0)
CT 20 (40,8) 14 51,9) 1,82 0,24 1,373 0,665
TT 3 (6,1) 3 (11,1) 2,6 0,287 3,749 0,325
CC 26 10
CT+TT 23 17 1,922 0,183 1,558 0,529
CC+CT 46 24
TT 3 3 1,917 0,446 3,144 0,37
†gecorrigeerd voor Borst Cup, Diabetes, Hormoontherapie, Chemotherapie, Targettherapie, LH, FSH
III
2. Analyse tussen SNPs en Desquamatie Desquamatie
CTC0-1 (%) CTC2+ (%) OR p-waarde OR† p-waarde†
ATM c.5557G>A GG 46 (69,7) 8 (88,9)
GA 18 (27,3) 1 (11,1) 0,319 0,298 0,526 0,584
AA 2 (3,0) 0 0 0,999 0 0,999
GG 46 8
GA+AA 20 1 0,288 0,255 0,451 0,496
GG+GA 64 9
AA 2 0 0 0,999 0 0,999
ATM c.-111G>A GG 15 (21,7) 1 (11,1)
GA 38 (55,1) 5 (55,6) 1,974 0,55 1,496 0,737
AA 16 (23,2) 3 (33,3) 2,812 0,393 0,812 0,892
GG 15 1
GA+AA 54 8 2,222 0,468 1,302 0,523
GG+GA 53 6
AA 16 3 1,656 0,508 0,591 0,658
XRCC1 c.1196G>A GG 29 (42,0) 5 (55,6)
GA 27 (39,1) 3 (33,3) 0,644 0,572 0,66 0,636
AA 13 (18,8) 1 (11,1) 0,446 0,481 1,49 0,914
GG 29 5
GA+AA 40 4 0,58 0,445 0,736 0,71
GG+GA 56 8
AA 13 1 0,538 0,575 1,45 0,758
XRCC1 c.839G>A GG 59 (89,4) 6 (66,7)
GA 7 (10,6) 3 (33,3) 4,214 0,077 0,986 0,992
AA 0 0
XRCC1 c.580C>T CC 61 (87,1) 9 (100)
CT 9 (12,9) 0 0 0,999 0 0,999
TT 0 0
XRCC3 c.722C>T CC 32 (45,7) 1 (11,1)
CT 28 (40,0) 5 (55,6) 5,714 0,122 4,368 0,211
TT 10 (14,3) 3 (33,3) 9,6 0,062 7,844 0,124
CC 32 1
CT+TT 38 8 6,737 0,079 5,166 0,147
CC+CT 60 6
TT 10 3 3 0,162 2,995 0,258
MSH3 c.3133A>G AA 37 (57,8) 5 (33,3)
AG + GG 23 (35,9) 4 (26,7) 1,287 0,727 0,92 0,922
GG 4 (6,3) 6 (40,0) 0 0,999 0 0,999
AA 37 5
AG + GG 27 4 1,096 0,898 0,786 0,774
AA +AG 60 9
GG 4 6 0 0,999 0 0,999
MC1R c.478C>T CC 60 (85,7) 8 (88,9)
CT 10 (14,3) 1 (11,1) 0,75 0,796 1,056 0,964
TT 0 0
FGFR2 rs2981579C>T CC 19 (28,6) 2 (22,2)
CT 35 (52,2) 6 (66,7) 1,629 0,573 0,836 0,857
TT 13 (19,4) 1 (11,1) 0,731 0,806 0,763 0,839
CC 19 2
CT+TT 48 7 1,395 0,7 0,817 0,831
CC+CT 54 8 0
TT 13 1 0,519 0,553 0,854 0,894
†gecorrigeerd voor Diabetes, Ovariectomie, Chemotherapie
IV
Desquamatie
CTC0-1 (%) CTC2+ (%) OR p-waarde OR† p-waarde†
TOX3 rs3803662C>T CC 33 (49,3) 3 (33,3)
CT 28 (41,8) 6 (66,7) 2,357 0,254 2,099 0,396
TT 6 (9,0) 0 0 0,999 0 0,999
CC 33 3
CT+TT 34 6 1,941 0,375 1,767 0,51
CC+CT 61 9
TT 6 0 0 0,999 0 0,999
†gecorrigeerd voor Diabetes, Ovariectomie, Chemotherapie
V
3. Analyse tussen SNPs en Oedeem van de borst Oedeem Borst
CTC0-1 (%) CTC2+ (%) OR p-waarde OR† p-waarde†
ATM c.5557G>A GG 50 (73,5) 4 (57,1)
GA 17 (25,0) 2 (28,8) 1,471 0,672 1,23 0,828
AA 1 (1,5) 1 (14,3) 12,5 0,094 4,49 0,327
GG 50 4
GA+AA 18 3 2,083 0,366 1,60 0,584
GG+GA 67 6
AA 1 1 11,167 0,102 4,20 0,338
ATM c.-111G>A GG 15 (21,4) 1 (12,5)
GA 40 (57,1) 3 (37,5) 1,125 0,921 1,62 0,697
AA 15 (21,4) 4 (50,0) 4 0,239 3,87 0,271
GG 15 1
GA+AA 55 7 1,909 0,559 2,43 0,440
GG+GA 55 4
AA 15 4 3,667 0,089 2,76 0,215
XRCC1 c.1196G>A GG 31 (44,3) 3 (37,5)
GA 26 (37,1) 4 (50,05) 1,59 0,567 1,25 0,798
AA 13 (18,6) 1 (12,5) 0,795 0,848 0,98 0,974
GG 31 3
GA+AA 39 5 1,325 0,715 1,78 0,843
GG+GA 57 7
AA 13 1 0,626 0,674 0,85 0,891
XRCC1 c.839G>A GG 59 (86,8) 6 (87,7)
GA 9 (13,2) 1 (14,3) 1,093 0,938 0,93 0,954
AA 0 0
XRCC1 c.580C>T CC 63 (88,7) 7 (87,5)
CT 8 (11,3) 1 (12,5) 1,125 0,917 2,24 0,534
TT 0 0
XRCC3 c.722C>T CC 31 (43,7) 2 (25,0)
CT 28 (39,4) 5 (62,5) 2,768 0,245 1,80 0,527
TT 12 (17,0) 1 (12,5) 1,292 0,84 1,60 0,729
CC 31 2
CT+TT 40 6 2,325 0,321 1,76 0,530
CC+CT 59 7
TT 12 1 0,702 0,751 1,11 0,729
MSH3 c.3133A>G AA 38 (56,7) 4 (66,7)
AG 26 (38,8) 1 (16,7 0,365 0,38 0,25 0,242
GG 3 (4,5) 1 (16,7) 3,167 0,364 2,47 0,526
AA 38 4
AG + GG 29 2 0,655 0,639 0,45 0,405
AA +AG 64 5
GG 3 1 4,267 2,44 3,94 0,320
MC1R c.478C>T CC 61 (85,9) 7 (87,5)
CT 10 (14,1) 1 (12,5) 0,871 0,902 0,84 0,886
TT 0 0
FGFR2 rs2981579C>T CC 20 (29,0) 1 (14,3)
CT 36 (52,2) 5 (71,4) 2,778 0,366 2,69 0,403
TT 13 (18,8) 1 (14,3) 1,538 0,768 1,23 0,892
CC 20 1
CT+TT 49 6 2,449 0,421 2,44 0,485
CC+CT 56 6
TT 13 1 0,718 0,768 0,59 0,649
†gecorrigeerd voor Chemotherapie, Lokalisatie
VI
Oedeem Borst
CTC0-1 (%) CTC2+ (%) OR p-waarde OR† p-waarde†
TOX3 rs3803662C>T CC 35 (52,2) 1 (14,3)
CT 26 (38,8) 6 (85,7) 7,5 0,069 7,36 0,082
TT 6 (9,0) 0 0 0,999 0,00 0,994
CC 35 1
CT+TT 34 6 6,176 0,1 6,04 0,115
CC+CT 63 7
TT 6 0 0 0,999 0,00 0,999
†gecorrigeerd voor Chemotherapie, Lokalisatie
VII
4. Univariate analyse tussen SNPs en Oedeem van de areola Oedeem Areola
CTC0-1 (%) CTC2+ (%) OR p-waarde OR† p-waarde†
ATM c.5557G>A GG 47 (72,3) 7 (70)
GA 16 (24,6) 3 (30) 1,259 0,758 1,59 0,588
AA 2 (3,1) 0 0 0,999 0,00 0,999
GG 47 7
GA+AA 18 3 1,119 0,88 1,26 0,787
GG+GA 63 10
AA 2 0 0 0,999 0,00 0,994
ATM c.-111G>A GG 14 (21,2) 2 (16,7)
GA 38 (57,6) 5 (41,7) 0,921 0,927 3,21 0,404
AA 14 (21,2) 5 (41,7) 2,5 0,318 5,22 0,24
GG 14 2
GA+AA 52 10 1,346 0,721 3,54 0,353
GG+GA 52 7
AA 14 5 2,653 0,138 1,92 0,468
XRCC1 c.1196G>A GG 30 (44,8) 4 (36,4)
GA 24 (35,8) 6 (54,5) 1,875 0,37 2 0,42
AA 13 (19,4) 1 (9,1) 0,577 0,637 1,07 0,995
GG 30 4
GA+AA 37 1,419 0,603 1,72 0,507
GG+GA 52 10
AA 14 1 0,415 0,422 0,75 0,808
XRCC1 c.839G>A GG 56 (86,2) 56 (86,2)
GA 9 (13,8) 9 (13,8) 0,691 0,74 0,645 0,71
AA 0 0
XRCC1 c.580C>T CC 59 (88,1) 59 (88,1)
CT 8 (11,9) 8 (11,9) 0,67 0,719 1,67 6,686
TT 0 0
XRCC3 c.722C>T CC 29 (43,3) 4 (33,3)
CT 27 (40,3) 6 (50,0) 1,611 0,495 0,72 0,709
TT 11 (16,4) 2 (16,7) 1,319 0,768 2 0,515
CC 29 4
CT+TT 38 8 1,526 0,522 0,99 0,986
CC+CT 56 10
TT 11 2 1,018 0,983 2,35 0,388
MSH3 c.3133A>G AA 35 (55,6) 7 (70,0)
AG 24 (38,1) 3 (30,0) 0,625 0,525 0,49 0,415
GG 4 (6,3) 0 0 0,999 0,00 0,999
AA 35 7
AG + GG 28 3 0,536 0,396 0,45 0,356
AA +AG 59 10
GG 4 0 0 0,999 0,00 0,9999
MC1R c.478C>T CC 57 (85,1) 11 (91,7)
CT 10 (15,0) 1 (8,3) 0,518 0,55 0,00 0,999
TT 0 0
FGFR2 rs2981579C>T CC 19 (28,8) 2 (20,0)
CT 33 (50,0) 8 (80,0) 2,303 0,321 2,34 0,385
TT 14 (21,2) 0 0 0,999 0,00 0,408
CC 19 2
CT+TT 47 8 1,617 0,565 1,19 0,851
CC+CT 52 10
TT 14 0 0 0,999 0,00 0,998
VIII
Oedeem Areola
CTC0-1 (%) CTC2+ (%) OR p-waarde OR† p-waarde†
TOX3 rs3803662C>T CC 32 (48,5) 4 (40,0)
CT 29 (43,9) 5 (50,0) 1,379 0,654 0,70 0,738
TT 5 (7,6) 1 (1,0) 1,6 0,699 0,90 0,943
CC 32 4
CT+TT 34 6 1,412 0,618 0,78 0,756
CC+CT 61 9
TT 5 1 1,356 0,792 1,04 0,979
†gecorrigeerd voor LH, FSH, Oestradiol
